JP6977965B2 - Ovarian cancer histological differentiation method - Google Patents
Ovarian cancer histological differentiation method Download PDFInfo
- Publication number
- JP6977965B2 JP6977965B2 JP2017207640A JP2017207640A JP6977965B2 JP 6977965 B2 JP6977965 B2 JP 6977965B2 JP 2017207640 A JP2017207640 A JP 2017207640A JP 2017207640 A JP2017207640 A JP 2017207640A JP 6977965 B2 JP6977965 B2 JP 6977965B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene
- adenocarcinoma
- expression
- clear cell
- genes
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Description
本発明は、卵巣癌組織型鑑別方法に関する。 The present invention relates to a method for differentiating ovarian cancer histology.
卵巣癌は初期症状の乏しく進行されてから発見されることが多いため、婦人科悪性腫瘍の中では予後不良であることが知られている。卵巣癌の基本治療は手術療法であるが、その主たる進展様式が腹膜播種であるため手術療法で完治する場合が少なく、多くの症例が化学療法の対象となる。1980年代より白金製剤を中心とした化学療法が導入され、1990年代に入りタキサン製剤を併用してから卵巣癌に対する奏効率が明らかに上昇し、白金製剤（カルボプラチン）+タキサン製剤（パクリタキセル）の化学療法が卵巣癌における標準化学療法となっている。
卵巣癌は、表層上皮性・間質性腫瘍、胚細胞腫瘍、性索間質性腫瘍の３つに大きく分類される。そのうち表層上皮性・間質性腫瘍の卵巣癌は、漿液性腺癌、明細胞腺癌、粘液性腺癌、類内膜腺癌の主に４つの組織型が含まれ、これらの組織型はそれぞれ性質や特徴が異なるため、卵巣癌の治療においては組織型の特定が重要であり、組織型に沿った治療が望ましい。特に、上記の４つの組織型のうち、明細胞腺癌は最も治療が困難な疾患である。卵巣癌の中で最も頻度が高い漿液性腺癌（欧米では約８０%、日本では約４０％）は化学療法に対する反応が良く、治療効果も期待できる。一方、明細胞腺癌の発症頻度は欧米では低いが（数％）日本では高く（約２４％）、進行症例では明細胞腺癌患者は漿液性腺癌患者よりも有意に予後不良である。その主な理由の1つに、化学療法に対する薬剤応答性が低いことが挙げられる。このことから、明細胞腺癌は標準治療とは別の治療法の開発が進められている。
通常、臨床現場においては手術検体を病理組織学検査することにより卵巣癌の組織型の特定が行われている。しかしながら、明細胞腺癌のうち乳頭状の増殖を示す症例は、その形状が漿液性腺癌と非常に類似している。よって、そのような症例においては病理組織学的に漿液性腺癌と明細胞腺癌とを区別することが困難な場合もある。また両者が混在している場合があり、腫瘍の性格がどちらを強く反映しているかを判別し難い場合もある。明細胞腺癌の個別化医療を考慮すると、より正確に両者を診断する必要がある。
近年、卵巣癌の予後や分類をするために、遺伝子発現やタンパク質発現に着目した遺伝子マーカーによる解析手法が検討されてきている。例えば、特許文献１では、上皮性卵巣癌鑑別マーカーとして癌細胞に特異的な糖タンパク質を検出する手法を開示している。また、特許文献２では、特定のマイクロＲＮＡの発現レベルと測定することにより化学療法介入に抵抗性である卵巣癌を診断する方法を開示している。
このように病理組織学的手法によらずに、卵巣癌の組織型の鑑別することのできる手法の開発が望まれていた。しかしながら、これまでに、卵巣癌における漿液性腺癌と明細胞腺癌とを明確に鑑別可能な遺伝子マーカーについては報告がない。
Ovarian cancer is known to have a poor prognosis among gynecologic malignancies because it is often found after it has progressed with few initial symptoms. The basic treatment for ovarian cancer is surgical therapy, but since the main mode of progression is peritoneal dissemination, it is rarely completely cured by surgical therapy, and many cases are targeted for chemotherapy. Chemotherapy centered on platinum preparations was introduced in the 1980s, and the response rate to ovarian cancer clearly increased after the combined use of taxane preparations in the 1990s. Chemotherapy of platinum preparations (carboplatin) + taxane preparations (paclitaxel) The therapy has become the standard chemotherapy for ovarian cancer.
Ovarian cancer is broadly classified into three types: superficial epithelial / interstitial tumor, germ cell tumor, and sex cord-gonadal tumor. Of these, ovarian cancers of superficial epithelial and interstitial tumors include four main histological types: serous adenocarcinoma, clear cell adenocarcinoma, mucinous adenocarcinoma, and endometrioid adenocarcinoma. It is important to identify the histological type in the treatment of ovarian cancer, and treatment according to the histological type is desirable. In particular, among the above four histological types, clear cell adenocarcinoma is the most difficult disease to treat. Serous adenocarcinoma (about 80% in Europe and the United States, about 40% in Japan), which is the most common ovarian cancer, has a good response to chemotherapy and can be expected to have a therapeutic effect. On the other hand, the incidence of clear cell adenocarcinoma is low in Europe and the United States (several percent) but high in Japan (about 24%), and in advanced cases, patients with clear cell adenocarcinoma have a significantly worse prognosis than patients with serous adenocarcinoma. One of the main reasons for this is poor drug responsiveness to chemotherapy. For this reason, the development of a treatment method different from the standard treatment for clear cell adenocarcinoma is underway.
Usually, in clinical practice, the histopathological examination of surgical specimens is performed to identify the histological type of ovarian cancer. However, clear cell adenocarcinomas with papillary growth are very similar in shape to serous adenocarcinoma. Therefore, in such cases, it may be difficult to distinguish between serous adenocarcinoma and clear cell adenocarcinoma pathologically. In addition, both may be mixed, and it may be difficult to determine which one is strongly reflected by the character of the tumor. Considering personalized medicine for clear cell adenocarcinoma, it is necessary to diagnose both more accurately.
In recent years, in order to determine the prognosis and classification of ovarian cancer, analysis methods using gene markers focusing on gene expression and protein expression have been studied. For example, Patent Document 1 discloses a method for detecting a glycoprotein specific to cancer cells as a marker for differentiating epithelial ovarian cancer. In addition,
As described above, it has been desired to develop a method capable of differentiating the histological type of ovarian cancer without using a histopathological method. However, so far, there is no report on a genetic marker that can clearly distinguish between serous adenocarcinoma and clear cell adenocarcinoma in ovarian cancer.
本発明は、卵巣癌において、漿液性腺癌と明細胞腺癌とを鑑別可能な方法を提供することにある。 The present invention is to provide a method capable of distinguishing serous adenocarcinoma from clear cell adenocarcinoma in ovarian cancer.
本発明者らは、上記の課題を解決するため、複数の漿液性腺癌患者と明細胞腺癌患者から摘出された癌組織に対して、網羅的遺伝子発現解析技術を用いて遺伝子発現プロファイルを取得し、漿液性腺癌と明細胞腺癌との間で発現レベルに大きく差のある29種の遺伝子群を見出した。そして、被験者の試料中におけるこれらの遺伝子の発現レベルを測定することによって、卵巣癌における組織型のうち、漿液性腺癌と明細胞腺癌とを容易かつ正確に鑑別できる方法を開発した。
そこで、本発明者らは、29種の遺伝子のうちどの遺伝子を用いれば漿液性腺癌と明細胞腺癌とを精度高く鑑別できるのかを調べるため、29種の遺伝子のうち各試料間で遺伝子の発現レベルのばらつきが少ない7種の遺伝子を特定した。さらに、本発明者らは、漿液性腺癌および明細胞腺癌の間における遺伝子の発現レベルの差について遺伝子発現のスコア化を試み、当該スコア化によりいずれの遺伝子を選択すべきかについてさらに検討を重ねた。その結果、本発明者らは、上記7種の遺伝子のうちで遺伝子発現スコアの高かった3種の遺伝子（GLRX遺伝子、GDF15遺伝子、および、GABARAPL1遺伝子）の遺伝子発現スコアの合計値を満たすように29種より遺伝子を選択することで、精度高く漿液性腺癌と明細胞腺癌とを鑑別可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。本発明は、当該知見に基づくものであって、以下を提供する。
In order to solve the above problems, the present inventors obtained gene expression profiles for cancer tissues excised from a plurality of serous adenocarcinoma patients and clear cell adenocarcinoma patients by using a comprehensive gene expression analysis technique. However, we found 29 gene groups with large differences in expression levels between serous adenocarcinoma and clear cell adenocarcinoma. Then, by measuring the expression level of these genes in the sample of the subject, we developed a method that can easily and accurately distinguish between serous adenocarcinoma and clear cell adenocarcinoma among the histological types in ovarian cancer.
Therefore, in order to investigate which of the 29 genes should be used to accurately distinguish between serous adenocarcinoma and clear cell adenocarcinoma, the present inventors have selected genes among each sample of the 29 genes. Seven genes with little variation in expression levels were identified. Furthermore, the present inventors attempted to score gene expression for differences in gene expression levels between serous adenocarcinoma and clear cell adenocarcinoma, and further investigated which gene should be selected based on the scoring. rice field. As a result, the present inventors so as to satisfy the total value of the gene expression scores of the three genes (GLRX gene, GDF15 gene, and GABARAPL1 gene) having the highest gene expression scores among the above seven genes. By selecting genes from 29 species, we found that it is possible to distinguish between serous adenocarcinoma and clear cell adenocarcinoma with high accuracy, and completed the present invention. The present invention is based on this finding and provides the following.
すなわち、本発明は、
〔１〕卵巣癌患者由来の被検試料において遺伝子の発現プロファイルを得て、当該発現プロファイルに基づいて漿液性腺癌または明細胞腺癌のいずれの組織型であるのかを鑑別する方法であって、
PPP1R3B遺伝子、TOB1遺伝子、RBPMS遺伝子、A4GALT遺伝子、RIMKLB遺伝子、GABARAPL1遺伝子、GLRX遺伝子、GSTM3遺伝子、LAMB1遺伝子、DNER遺伝子、ARG2遺伝子、TMEM101遺伝子、GDF15遺伝子、C12orf75遺伝子、DLX5遺伝子、AOC1遺伝子、ANXA4遺伝子、FBLN1遺伝子、TSPAN1遺伝子、APOL1遺伝子、FXYD2遺伝子、GPX3遺伝子、DEFB1遺伝子、FLJ43606遺伝子、LRIG1遺伝子、LYPD1遺伝子、CRIP1遺伝子、UQCRH遺伝子、および、IGF2遺伝子からなる群より選択される少なくとも３つの遺伝子を含む遺伝子セットにおける各遺伝子の発現レベルを測定する工程であって、
前記遺伝子セットに含まれる各遺伝子の遺伝子発現スコアの合計値が、GLRX遺伝子、GDF15遺伝子、および、GABARAPL1遺伝子の遺伝子発現スコアの合計値と同等または合計値以上となるように各遺伝子が選択されたものである工程
を含む、鑑別方法に関する。
また、本発明の鑑別方法は、一実施の形態において、
〔２〕上記〔１〕に記載の鑑別方法であって、
前記遺伝子発現スコアが、漿液性腺癌患者由来の試料および明細胞腺癌患者由来の試料間における特定の遺伝子の発現レベルの差の大きさであることを特徴とする。
また、本発明の鑑別方法は、一実施の形態において、
〔３〕上記〔２〕に記載の鑑別方法であって、
前記遺伝子セットに含まれる遺伝子の組み合わせが、下記表に記載される遺伝子発現スコアを参照して、合計が7.006と同等または7.006以上になるように少なくとも３つの遺伝子が選択されたものであることを特徴とする。
〔４〕上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の鑑別方法であって、
前記遺伝子セットに含まれる少なくとも一つの遺伝子が、PPP1R3B遺伝子、TOB1遺伝子、RBPMS遺伝子、GABARAPL1遺伝子、GLRX遺伝子、GSTM3遺伝子、および、GDF15遺伝子からなる群より選択されることを特徴とする。
また、本発明の鑑別方法は、一実施の形態において、
〔５〕上記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の鑑別方法であって、
前記遺伝子セットに含まれる遺伝子の全てが、PPP1R3B遺伝子、TOB1遺伝子、RBPMS遺伝子、GABARAPL1遺伝子、GLRX遺伝子、GSTM3遺伝子、および、GDF15遺伝子からなる群より選択されることを特徴とする。
また、本発明の鑑別方法は、一実施の形態において、
〔６〕上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の鑑別方法であって、
前記遺伝子セットがGLRX遺伝子、GDF15遺伝子およびGABARAPL1遺伝子を含むことを特徴とする。
また、本発明の鑑別方法は、一実施の形態において、
〔７〕上記〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の鑑別方法であって、
前記遺伝子セットにおける各遺伝子の発現プロファイルと、漿液性腺癌患者または明細胞腺癌患者由来の試料における対応する遺伝子セットにおける各遺伝子の発現プロファイルとを比較することにより、前記被検試料の組織型を鑑別することを特徴とする。
また、本発明の鑑別方法は、一実施の形態において、
〔８〕上記〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の鑑別方法であって、
前記遺伝子セットにおける各遺伝子の発現プロファイルと、漿液性腺癌患者または明細胞腺癌患者由来の試料における対応する遺伝子セットにおける各遺伝子の発現プロファイルとを比較することにより、前記被検試料が、比較した組織型卵巣癌の遺伝子の発現プロファイルと同等の遺伝子の発現プロファイルを有する場合に比較した組織型の卵巣癌であると評価するか、または、比較した組織型卵巣癌の遺伝子の発現プロファイルと異なる遺伝子の発現プロファイルを有する場合に比較した組織型の卵巣癌ではないと評価することを特徴とする。
また、本発明の鑑別方法は、一実施の形態において、
〔９〕上記〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の鑑別方法であって、
前記遺伝子セットにおける各遺伝子の発現プロファイルをクラスタ分析することにより前記被検試料の組織型を鑑別することを特徴とする。
また、本発明の鑑別方法は、一実施の形態において、
〔１０〕上記〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の鑑別方法であって、
被検試料における前記遺伝子セットの各遺伝子の定量的な発現プロファイルを、所定の閾値と比較することにより組織型を鑑別することを特徴とする。
That is, the present invention
[1] A method for obtaining an expression profile of a gene in a test sample derived from a patient with ovarian cancer and distinguishing whether it is a histological type of serous adenocarcinoma or clear cell adenocarcinoma based on the expression profile.
PPP1R3B gene, TOB1 gene, RBPMS gene, A4GALT gene, RIMKLB gene, GABARAPL1 gene, GLRX gene, GSTM3 gene, LAMB1 gene, DNER gene, ARG2 gene, TMEM101 gene, GDF15 gene, C12orf75 gene, DLX5 gene, AOC1 gene, ANXA4 gene , FBLN1 gene, TSPAN1 gene, APOL1 gene, FXYD2 gene, GPX3 gene, DEFB1 gene, FLJ43606 gene, LRIG1 gene, LYPD1 gene, CRIP1 gene, UQCRH gene, and at least 3 genes selected from the group consisting of IGF2 gene. A step of measuring the expression level of each gene in the included gene set.
Each gene was selected so that the total value of the gene expression scores of each gene included in the gene set was equal to or greater than the total value of the gene expression scores of the GLRX gene, GDF15 gene, and GABARAPL1 gene. It relates to a discrimination method including a step of being a thing.
Further, the discrimination method of the present invention is, in one embodiment,.
[2] The discrimination method according to the above [1].
The gene expression score is characterized by the magnitude of the difference in the expression level of a specific gene between a sample derived from a patient with serous adenocarcinoma and a sample derived from a patient with clear cell adenocarcinoma.
Further, the discrimination method of the present invention is, in one embodiment,.
[3] The discrimination method according to the above [2].
It is determined that at least three genes are selected so that the combination of genes contained in the gene set is equal to or greater than 7.006 in total by referring to the gene expression scores shown in the table below. It is a feature.
[4] The discrimination method according to any one of the above [1] to [3].
It is characterized in that at least one gene included in the gene set is selected from the group consisting of PPP1R3B gene, TOB1 gene, RBPMS gene, GABARAPL1 gene, GLRX gene, GSTM3 gene, and GDF15 gene.
Further, the discrimination method of the present invention is, in one embodiment,.
[5] The discrimination method according to any one of the above [1] to [4].
All of the genes included in the gene set are selected from the group consisting of PPP1R3B gene, TOB1 gene, RBPMS gene, GABARAPL1 gene, GLRX gene, GSTM3 gene, and GDF15 gene.
Further, the discrimination method of the present invention is, in one embodiment,.
[6] The discrimination method according to any one of the above [1] to [5].
The gene set is characterized by containing the GLRX gene, the GDF15 gene and the GABARAPL1 gene.
Further, the discrimination method of the present invention is, in one embodiment,.
[7] The discrimination method according to any one of the above [1] to [6].
By comparing the expression profile of each gene in the gene set with the expression profile of each gene in the corresponding gene set in a sample derived from a serous adenocarcinoma patient or a clear cell adenocarcinoma patient, the histological type of the test sample can be determined. It is characterized by distinguishing.
Further, the discrimination method of the present invention is, in one embodiment,.
[8] The discrimination method according to any one of the above [1] to [7].
The test samples were compared by comparing the expression profile of each gene in the gene set with the expression profile of each gene in the corresponding gene set in a sample derived from a patient with serous or clear cell adenocarcinoma. A gene that is evaluated as having a histological ovarian cancer compared to that having a gene expression profile equivalent to the gene expression profile of the histological ovarian cancer, or a gene different from the genetic expression profile of the compared histological ovarian cancer. It is characterized by evaluating that it is not a histological type of ovarian cancer as compared with the case of having an expression profile of.
Further, the discrimination method of the present invention is, in one embodiment,.
[9] The discrimination method according to any one of the above [1] to [8].
It is characterized in that the histological type of the test sample is differentiated by cluster analysis of the expression profile of each gene in the gene set.
Further, the discrimination method of the present invention is, in one embodiment,.
[10] The discrimination method according to any one of the above [1] to [9].
It is characterized in that the histological type is differentiated by comparing the quantitative expression profile of each gene of the gene set in the test sample with a predetermined threshold value.
また、本発明は、別の態様として
〔１１〕卵巣癌患者由来の被検試料において、漿液性腺癌または明細胞腺癌のいずれの組織型であるのかを鑑別するための鑑別マーカーセットであって、
前記鑑別マーカーセットは、PPP1R3B遺伝子、TOB1遺伝子、RBPMS遺伝子、A4GALT遺伝子、RIMKLB遺伝子、GABARAPL1遺伝子、GLRX遺伝子、GSTM3遺伝子、LAMB1遺伝子、DNER遺伝子、ARG2遺伝子、TMEM101遺伝子、GDF15遺伝子、C12orf75遺伝子、DLX5遺伝子、AOC1遺伝子、ANXA4遺伝子、FBLN1遺伝子、TSPAN1遺伝子、APOL1遺伝子、FXYD2遺伝子、GPX3遺伝子、DEFB1遺伝子、FLJ43606遺伝子、LRIG1遺伝子、LYPD1遺伝子、CRIP1遺伝子、UQCRH遺伝子、および、IGF2遺伝子からなる群より選択される少なくとも３つの遺伝子の組み合わせを含み、
前記鑑別マーカーセットに含まれる各遺伝子の遺伝子発現スコアの合計値が、GLRX遺伝子、GDF15遺伝子、および、GABARAPL1遺伝子の遺伝子発現スコアの合計値以上となるように各遺伝子が選択されたものである、鑑別マーカーセットに関する。
ここで、本発明の鑑別マーカーセットは、一実施の形態において、
〔１２〕上記〔１１〕に記載の鑑別マーカーセットであって、
前記遺伝子セットに含まれる各遺伝子のmRNAの発現レベルが測定されることを特徴とする。
また、本発明のマーカー遺伝子セットは、一実施の形態において、
〔１３〕上記〔１１〕に記載の鑑別マーカーセットであって
前記鑑別マーカーセットは、PPP1R3B遺伝子、TOB1遺伝子、RBPMS遺伝子、A4GALT遺伝子、RIMKLB遺伝子、GABARAPL1遺伝子、GLRX遺伝子、GSTM3遺伝子、LAMB1遺伝子、DNER遺伝子、ARG2遺伝子、TMEM101遺伝子、GDF15遺伝子、C12orf75遺伝子、DLX5遺伝子、AOC1遺伝子、ANXA4遺伝子、FBLN1遺伝子、TSPAN1遺伝子、APOL1遺伝子、FXYD2遺伝子、GPX3遺伝子、DEFB1遺伝子、FLJ43606遺伝子、LRIG1遺伝子、LYPD1遺伝子、CRIP1遺伝子、UQCRH遺伝子、および、IGF2遺伝子からなる群より選択される少なくとも３つの遺伝子によりコードされるmRNAの組み合わせである、鑑別マーカーセット。
Further, as another aspect, the present invention is a differential marker set for differentiating whether the histological type is serous adenocarcinoma or clear cell adenocarcinoma in a test sample derived from [11] ovarian cancer patient. ,
The differential marker set includes PPP1R3B gene, TOB1 gene, RBPMS gene, A4GALT gene, RIMKLB gene, GABARAPL1 gene, GLRX gene, GSTM3 gene, LAMB1 gene, DNER gene, ARG2 gene, TMEM101 gene, GDF15 gene, C12orf75 gene, DLX5 gene. , AOC1 gene, ANXA4 gene, FBLN1 gene, TSPAN1 gene, APOL1 gene, FXYD2 gene, GPX3 gene, DEFB1 gene, FLJ43606 gene, LRIG1 gene, LYPD1 gene, CRIP1 gene, UQCRH gene, and IGF2 gene. Contains at least a combination of three genes
Each gene is selected so that the total value of the gene expression scores of each gene included in the differential marker set is equal to or greater than the total value of the gene expression scores of the GLRX gene, the GDF15 gene, and the GABARAPL1 gene. Regarding the identification marker set.
Here, the differential marker set of the present invention is, in one embodiment,.
[12] The differential marker set according to the above [11].
It is characterized in that the expression level of mRNA of each gene contained in the gene set is measured.
In addition, the marker gene set of the present invention, in one embodiment,
[13] The differential marker set according to [11] above, wherein the differential marker set includes PPP1R3B gene, TOB1 gene, RBPMS gene, A4GALT gene, RIMKLB gene, GABARAPL1 gene, GLRX gene, GSTM3 gene, LAMB1 gene, and DNER. Gene, ARG2 gene, TMEM101 gene, GDF15 gene, C12orf75 gene, DLX5 gene, AOC1 gene, ANXA4 gene, FBLN1 gene, TSPAN1 gene, APOL1 gene, FXYD2 gene, GPX3 gene, DEFB1 gene, FLJ43606 gene, LRIG1 gene, LYPD1 gene, A differential marker set that is a combination of mRNAs encoded by at least three genes selected from the group consisting of the CRIP1 gene, the UQCRH gene, and the IGF2 gene.
また、本発明は、別の態様として
〔１４〕卵巣癌患者由来の被検試料において、漿液性腺癌または明細胞腺癌のいずれの組織型であるのかを鑑別するためのキットであって、
前記キットは、PP1R3B遺伝子、TOB1遺伝子、RBPMS遺伝子、A4GALT遺伝子、RIMKLB遺伝子、GABARAPL1遺伝子、GLRX遺伝子、GSTM3遺伝子、LAMB1遺伝子、DNER遺伝子、ARG2遺伝子、TMEM101遺伝子、GDF15遺伝子、C12orf75遺伝子、DLX5遺伝子、AOC1遺伝子、ANXA4遺伝子、FBLN1遺伝子、TSPAN1遺伝子、APOL1遺伝子、FXYD2遺伝子、GPX3遺伝子、DEFB1遺伝子、FLJ43606遺伝子、LRIG1遺伝子、LYPD1遺伝子、CRIP1遺伝子、UQCRH遺伝子、および、IGF2遺伝子からなる群より選択される少なくとも３つの遺伝子を含む遺伝子セットにおける各遺伝子の発現レベルを測定する手段を含み、
前記遺伝子セットに含まれる各遺伝子の遺伝子発現スコアの合計値が、GLRX遺伝子、GDF15遺伝子、および、GABARAPL1遺伝子の遺伝子発現スコアの合計値以上となるように各遺伝子が選択されたものである、キットに関する。
ここで、本発明のキットは、一実施の形態において、
〔１５〕上記〔１４〕に記載のキットであって、前記各遺伝子の発現レベルを測定する手段が、各遺伝子に対するプライマー、プローブ、または、それらの標識物からなる群より選択される少なくとも一つの手段であることを特徴とする。
また、本発明のキットは、一実施の形態において、
〔１６〕上記〔１５〕に記載のキットであって、PCR用、マイクロアレイ用、または、RNAシークエンス用である、キット。
また、本発明は、別の態様として、
〔１７〕上記〔１〕〜〔１０〕のいずれかに記載の鑑別方法の結果に基づいて
前記卵巣癌患者に対して、漿液性腺癌または明細胞腺癌に対する有効量の抗癌剤を投与する工程を含む、治療方法に関する。
Further, another aspect of the present invention is a kit for discriminating between [14] a test sample derived from an ovarian cancer patient and having a histological type of serous adenocarcinoma or clear cell adenocarcinoma.
The kit includes PP1R3B gene, TOB1 gene, RBPMS gene, A4GALT gene, RIMKLB gene, GABARAPL1 gene, GLRX gene, GSTM3 gene, LAMB1 gene, DNER gene, ARG2 gene, TMEM101 gene, GDF15 gene, C12orf75 gene, DLX5 gene, AOC1. At least selected from the group consisting of genes, ANXA4 gene, FBLN1 gene, TSPAN1 gene, APOL1 gene, FXYD2 gene, GPX3 gene, DEFB1 gene, FLJ43606 gene, LRIG1 gene, LYPD1 gene, CRIP1 gene, UQCRH gene, and IGF2 gene. Including means for measuring the expression level of each gene in a gene set containing three genes.
A kit in which each gene is selected so that the total value of the gene expression scores of each gene included in the gene set is equal to or greater than the total value of the gene expression scores of the GLRX gene, the GDF15 gene, and the GABARAPL1 gene. Regarding.
Here, the kit of the present invention, in one embodiment,
[15] At least one of the kits according to [14] above, wherein the means for measuring the expression level of each gene is selected from the group consisting of primers, probes, or labels thereof for each gene. It is characterized by being a means.
Further, the kit of the present invention, in one embodiment,
[16] The kit according to the above [15], which is for PCR, for microarrays, or for RNA sequencing.
Further, the present invention is another aspect of the present invention.
[17] A step of administering to the ovarian cancer patient an effective amount of an anticancer agent for serous adenocarcinoma or clear cell adenocarcinoma based on the result of the differentiation method according to any one of the above [1] to [10]. Including, regarding treatment methods.
本発明の方法によれば、卵巣癌患者由来の試料が、漿液性腺癌と明細胞腺癌とのいずれであるのかを鑑別することが可能となる。 According to the method of the present invention, it is possible to distinguish between serous adenocarcinoma and clear cell adenocarcinoma as a sample derived from an ovarian cancer patient.
１．漿液性腺癌および明細胞腺癌を区別可能な鑑別マーカー
１−１．概要
本発明の第１の態様は漿液性腺癌および明細胞腺癌を区別可能な鑑別マーカーである。本発明の鑑別マーカーは、少なくとも29種の遺伝子群からなり、被験者の試料中におけるその発現レベルを測定することで、卵巣癌の組織型のうち、漿液性腺癌または明細胞腺癌のいずれの組織型卵巣癌であるのかを正確に鑑別することができる。
1. 1. Differentiating markers that can distinguish between serous adenocarcinoma and clear cell adenocarcinoma 1-1. Overview The first aspect of the present invention is a differential marker that can distinguish between serous adenocarcinoma and clear cell adenocarcinoma. The differential marker of the present invention consists of at least 29 gene groups, and by measuring the expression level in the sample of the subject, any tissue of serous adenocarcinoma or clear cell adenocarcinoma among the histological types of ovarian cancer. It is possible to accurately distinguish whether it is type ovarian cancer.
１−２．定義
「卵巣癌」は、卵巣に発生する上皮性悪性腫瘍であり、漿液性腺癌、明細胞腺癌、粘液性腺癌、類内膜腺癌の組織型を含むことが知られている。
「漿液性腺癌」は、卵巣癌全体の約４０％を占めており一番頻度が高く、抗癌剤の感受性が高いため、抗癌剤治療が適した組織型卵巣癌である。一方、「明細胞腺癌」は、欧米では数％であるが、特に日本人における発症率が高い（約２４％）組織型であることが知られており、抗癌剤が効きにくいことが知られている。
本明細書において「鑑別遺伝子群」とは、PPP1R3B遺伝子、TOB1遺伝子、RBPMS遺伝子、A4GALT遺伝子、RIMKLB遺伝子、GABARAPL1遺伝子、GLRX遺伝子、GSTM3遺伝子、LAMB1遺伝子、DNER遺伝子、ARG2遺伝子、TMEM101遺伝子、GDF15遺伝子、C12orf75遺伝子、DLX5遺伝子、AOC1遺伝子、ANXA4遺伝子、FBLN1遺伝子、TSPAN1遺伝子、APOL1遺伝子、FXYD2遺伝子、GPX3遺伝子、DEFB1遺伝子、FLJ43606遺伝子、LRIG1遺伝子、LYPD1遺伝子、CRIP1遺伝子、UQCRH遺伝子、および、IGF2遺伝子からなる。
本明細書において「鑑別マーカー」は、「鑑別遺伝子群」に含まれる遺伝子と関連するマーカーであり、表層上皮性・間質性腫瘍に分類される卵巣癌の組織型について、漿液性腺癌と明細胞腺癌とを鑑別することのできるバイオマーカーをいう。本発明において、バイオマーカーは特に鑑別遺伝子群に含まれる各遺伝子の転写産物（mRNA）またはそのcDNAである。
本明細書において、「遺伝子発現スコア」とは、「鑑別遺伝子群」に含まれる各遺伝子において定まるスコアであり、漿液性腺癌患者由来の試料および明細胞腺癌患者由来の試料間における遺伝子の発現レベルの差の大きさを示す。より具体的には、特定の遺伝子について、漿液性腺癌患者群由来の複数の試料における発現プロファイルの平均値と、明細胞腺癌患者群由来の複数の試料における発現プロファイルの平均値との差の絶対値として求めることができる。
本明細書において「遺伝子の発現レベル」とは、鑑別遺伝子の発現プロファイル、転写産物量、発現強度又は発現頻度をいう。ここでいう遺伝子の発現レベルは、鑑別遺伝子の野生型遺伝子の発現レベルに限らず、点突然変異遺伝子等の変異遺伝子の発現レベルも含み得る。また、鑑別遺伝子の発現を示す転写産物には、スプライスバリアントのような異型転写産物（バリアント）及びそれらの断片も含み得る。変異遺伝子、転写産物、又はその断片に基づく情報であっても本発明における遺伝子の発現プロファイルの構築が可能だからである。遺伝子の発現レベルは、鑑別マーカーを構成する遺伝子群の転写産物、すなわちmRNA量等の測定により測定値として得ることができる。
なお、好ましい実施の形態において、遺伝子の発現プロファイルの測定は、mRNAの測定である。
本明細書において「測定値」とは、遺伝子発現レベルの測定方法によって得られた値である。測定値は、試料中のmRNA量等をng（ナノグラム）やμg（マイクログラム）等の容量で表した絶対値であってもよいし、また対照値に対する吸光度や標識分子による蛍光強度等で表した相対値であってもよい。
なお、各遺伝子の発現レベルの測定値は測定方法にもよるが、例えば、共通のサンプル（以下「共通リファレンス」という。）に対する相対比として算出することができる。発現比を算出する際の共通リファレンスは、比較する試料間の測定条件において同じであればどのようなものでも構わない。例えば、特定の細胞株でもよく、複数の細胞株を混合したものでもよい。または、市販のユニバーサルリファレンスや、公知のハウスキーピング遺伝子またはそれらの組み合わせを共通リファレンスとして用いることもできる。
本明細書において「鑑別」とは、表層上皮性・間質性腫瘍に分類される卵巣癌罹患歴のある被験者由来の試料について、漿液性腺癌または明細胞腺癌のいずれの組織型に属するものであるかを鑑別すること、または、いずれの組織型に属する可能性が高いか鑑別することをいう。
1-2. Definition "Ovarian cancer" is an epithelial malignant tumor that develops in the ovary and is known to include histological types of serous adenocarcinoma, clear cell adenocarcinoma, mucinous adenocarcinoma, and endometrial adenocarcinoma.
"Serous adenocarcinoma" is a histological ovarian cancer that is suitable for anticancer drug treatment because it accounts for about 40% of all ovarian cancers, is the most frequent, and is highly sensitive to anticancer drugs. On the other hand, "clear cell adenocarcinoma" is a few percent in Europe and the United States, but it is known that it is a histological type with a particularly high incidence (about 24%) in Japanese, and it is known that anticancer drugs are difficult to work. ing.
As used herein, the term "differential gene group" refers to the PPP1R3B gene, TOB1 gene, RBPMS gene, A4GALT gene, RIMKLB gene, GABARAPL1 gene, GLRX gene, GSTM3 gene, LAMB1 gene, DNER gene, ARG2 gene, TMEM101 gene, and GDF15 gene. , C12orf75 gene, DLX5 gene, AOC1 gene, ANXA4 gene, FBLN1 gene, TSPAN1 gene, APOL1 gene, FXYD2 gene, GPX3 gene, DEFB1 gene, FLJ43606 gene, LRIG1 gene, LYPD1 gene, CRIP1 gene, UQCRH gene, and IGF2 gene. Consists of.
In the present specification, the "differential marker" is a marker associated with a gene included in the "differential gene group", and the histological type of ovarian cancer classified into superficial epithelial / interstitial tumor is defined as serous adenocarcinoma. A biomarker that can be distinguished from cell adenocarcinoma. In the present invention, the biomarker is, in particular, a transcript (mRNA) of each gene contained in a group of differential genes or a cDNA thereof.
In the present specification, the "gene expression score" is a score determined for each gene included in the "differential gene group", and the expression of a gene between a sample derived from a serous adenocarcinoma patient and a sample derived from a clear cell adenocarcinoma patient. Indicates the magnitude of the level difference. More specifically, for a specific gene, the difference between the average value of the expression profile in multiple samples derived from the serous adenocarcinoma patient group and the average value of the expression profile in multiple samples derived from the clear cell adenocarcinoma patient group. It can be obtained as an absolute value.
As used herein, the term "gene expression level" refers to the expression profile, transcript amount, expression intensity or expression frequency of a differential gene. The expression level of the gene referred to here is not limited to the expression level of the wild-type gene of the differential gene, but may include the expression level of a mutant gene such as a point mutation gene. In addition, the transcript showing the expression of the differential gene may also include atypical transcripts (variants) such as splicing variants and fragments thereof. This is because the expression profile of the gene in the present invention can be constructed even with information based on a mutant gene, a transcript, or a fragment thereof. The expression level of the gene can be obtained as a measured value by measuring the transcript of the gene cluster constituting the differential marker, that is, the amount of mRNA or the like.
In a preferred embodiment, the measurement of the gene expression profile is the measurement of mRNA.
As used herein, the "measured value" is a value obtained by a method for measuring a gene expression level. The measured value may be an absolute value in which the amount of mRNA in the sample is expressed by a volume such as ng (nanogram) or μg (microgram), or is expressed by the absorbance with respect to the control value, the fluorescence intensity of the labeled molecule, or the like. It may be a relative value.
The measured value of the expression level of each gene depends on the measuring method, but can be calculated as a relative ratio to a common sample (hereinafter referred to as "common reference"), for example. The common reference for calculating the expression ratio may be any as long as it is the same in the measurement conditions between the samples to be compared. For example, it may be a specific cell line or a mixture of a plurality of cell lines. Alternatively, a commercially available universal reference, a known housekeeping gene or a combination thereof can be used as a common reference.
As used herein, the term "differential" means a sample derived from a subject with a history of ovarian cancer classified as superficial epithelial or interstitial tumor and belongs to either serous adenocarcinoma or clear cell adenocarcinoma histological type. It means to distinguish whether it belongs to or to which tissue type is likely to belong to.
１−３．構成
本態様の鑑別マーカーは、PPP1R3B遺伝子、TOB1遺伝子、RBPMS遺伝子、A4GALT遺伝子、RIMKLB遺伝子、GABARAPL1遺伝子、GLRX遺伝子、GSTM3遺伝子、LAMB1遺伝子、DNER遺伝子、ARG2遺伝子、TMEM101遺伝子、GDF15遺伝子、C12orf75遺伝子、DLX5遺伝子、AOC1遺伝子、ANXA4遺伝子、FBLN1遺伝子、TSPAN1遺伝子、APOL1遺伝子、FXYD2遺伝子、GPX3遺伝子、DEFB1遺伝子、FLJ43606遺伝子、LRIG1遺伝子、LYPD1遺伝子、CRIP1遺伝子、UQCRH遺伝子、および、IGF2遺伝子の29種の鑑別遺伝子群より選択される。卵巣癌患者由来の試料を鑑別する際には、これら29種の「鑑別遺伝子群」より少なくとも3種の遺伝子を含む遺伝子セットを選択して、当該試料における各遺伝子の発現を測定する。
なお、好ましい一実施の形態においては、遺伝子セットに含まれる少なくとも一つの遺伝子が、PPP1R3B遺伝子、TOB1遺伝子、RBPMS遺伝子、GABARAPL1遺伝子、GLRX遺伝子、GSTM3遺伝子、および、GDF15遺伝子からなる群より選択される。前記に列挙される7種の遺伝子は、鑑別遺伝子群に含まれる他の遺伝子と比べて、個体間における遺伝子の発現レベルのばらつきが少ない。よって、これらの遺伝子の発現レベルを測定することにより、より精度高く卵巣癌の組織型を鑑別することができる。よって、より好ましい一実施の形態においては、遺伝子セットに含まれる全ての遺伝子が、PPP1R3B遺伝子、TOB1遺伝子、RBPMS遺伝子、GABARAPL1遺伝子、GLRX遺伝子、GSTM3遺伝子、および、GDF15遺伝子からなる群より選択される。
1-3. Configuration The differential markers of this embodiment are PPP1R3B gene, TOB1 gene, RBPMS gene, A4GALT gene, RIMKLB gene, GABARAPL1 gene, GLRX gene, GSTM3 gene, LAMB1 gene, DNER gene, ARG2 gene, TMEM101 gene, GDF15 gene, C12orf75 gene, 29 types of DLX5 gene, AOC1 gene, ANXA4 gene, FBLN1 gene, TSPAN1 gene, APOL1 gene, FXYD2 gene, GPX3 gene, DEFB1 gene, FLJ43606 gene, LRIG1 gene, LYPD1 gene, CRIP1 gene, UQCRH gene, and IGF2 gene It is selected from the differential gene group. When differentiating a sample derived from an ovarian cancer patient, a gene set containing at least 3 kinds of genes is selected from these 29 kinds of "differential gene clusters", and the expression of each gene in the sample is measured.
In one preferred embodiment, at least one gene included in the gene set is selected from the group consisting of PPP1R3B gene, TOB1 gene, RBPMS gene, GABARAPL1 gene, GLRX gene, GSTM3 gene, and GDF15 gene. .. The seven genes listed above have less variation in gene expression levels among individuals than other genes included in the differential gene cluster. Therefore, by measuring the expression level of these genes, the histological type of ovarian cancer can be differentiated with higher accuracy. Thus, in a more preferred embodiment, all genes included in the gene set are selected from the group consisting of the PPP1R3B gene, TOB1 gene, RBPMS gene, GABARAPL1 gene, GLRX gene, GSTM3 gene, and GDF15 gene. ..
上述のように、本態様の鑑別マーカーは、3種以上29種以下の鑑別遺伝子群に含まれる遺伝子の組み合わせで構成される。通常、本態様の鑑別マーカーは、構成する遺伝子の種類が多いほど漿液性腺癌と明細胞腺癌とのいずれの組織型であるのかについての鑑別精度が高くなる。
本明細書において鑑別マーカーは、原則的にはDNA（cDNA）で示す塩基配列からなる遺伝子であるが、その遺伝子の発現時に転写産物として生じ、RNA配列からなるmRNA及びそれらの部分断片もマーカーである遺伝子の発現を反映するため間接的に鑑別マーカーとなり得る。
ここで、「鑑別遺伝子群」より少なくとも3種の遺伝子を選択する方法は、各遺伝子の遺伝子発現スコアに基づいて選択することができる。具体的には、選択した遺伝子の組み合わせにおける遺伝子発現スコアの合計値が、GLRX遺伝子、GDF15遺伝子、および、GABARAPL1遺伝子の遺伝子発現スコアの合計値と同等またはそれ以上となるように、各遺伝子の遺伝子発現スコアを参照して組み合わせを選択する。このとき、「鑑別遺伝子群」より選択される少なくとも3種の遺伝子の組み合わせは、その遺伝子発現スコアの合計値が、GLRX遺伝子、GDF15遺伝子、および、GABARAPL1遺伝子の遺伝子発現スコアの合計値と同等またはそれ以上である限りにおいて限定されず、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、15種、16種、17種のあらゆる遺伝子の組み合わせを含む。遺伝子の選択方法は、遺伝子発現スコアの高い遺伝子から選択する方が好ましいが、特にそのような形態に限定されない。
また、好ましい一実施の形態は、鑑別遺伝子群より選択される遺伝子の組み合わせにおける遺伝子発現スコアの合計値が、GLRX遺伝子、GDF15遺伝子、および、GABARAPL1遺伝子の遺伝子発現スコアの合計値以上となる形態である。
なお、特定の遺伝子の遺伝子発現スコアは、上述のように、特定の遺伝子に関して、漿液性腺癌患者群由来の複数の試料における発現レベルの平均値と、明細胞腺癌患者群由来の複数の試料における特定の遺伝子の発現レベルの平均値との差の絶対値として求めることができる。
As described above, the differential marker of this embodiment is composed of a combination of genes contained in a group of differential genes of 3 or more and 29 or less. Usually, the more the types of genes constituting the differentiating marker of this embodiment, the higher the accuracy of differentiating between serous adenocarcinoma and clear cell adenocarcinoma.
In the present specification, the differential marker is a gene consisting of a base sequence represented by DNA (cDNA) in principle, but it is generated as a transcript when the gene is expressed, and mRNA consisting of an RNA sequence and its partial fragments are also markers. It can indirectly serve as a differential marker because it reflects the expression of a gene.
Here, the method of selecting at least three kinds of genes from the "differential gene group" can be selected based on the gene expression score of each gene. Specifically, the gene of each gene so that the total value of the gene expression scores in the selected combination of genes is equal to or higher than the total value of the gene expression scores of the GLRX gene, the GDF15 gene, and the GABARAPL1 gene. Select a combination by referring to the expression score. At this time, the total value of the gene expression scores of the combination of at least three genes selected from the "differential gene group" is equal to or equal to the total value of the gene expression scores of the GLRX gene, the GDF15 gene, and the GABARAPL1 gene. Not limited to more than that, 3 types, 4 types, 5 types, 6 types, 7 types, 8 types, 9 types, 10 types, 11 types, 12 types, 13 types, 14 types, 15 types, 16 types. Species, including all 17 gene combinations. The gene selection method is preferably selected from genes having a high gene expression score, but is not particularly limited to such a form.
Further, in a preferred embodiment, the total value of the gene expression scores in the combination of genes selected from the differential gene group is equal to or higher than the total value of the gene expression scores of the GLRX gene, the GDF15 gene, and the GABARAPL1 gene. be.
As described above, the gene expression score of a specific gene is the average value of the expression level in a plurality of samples derived from a serous adenocarcinoma patient group and a plurality of samples derived from a clear cell adenocarcinoma patient group for a specific gene. It can be obtained as an absolute value of the difference from the average value of the expression level of a specific gene in.
下記に限定されないが、一実施の形態において、「鑑別遺伝子群」に含まれる各遺伝子の遺伝子発現スコアは、一実施の形態においては、下記表２に記載されるとおりである。このとき、GLRX遺伝子、GDF15遺伝子、および、GABARAPL1遺伝子の遺伝子発現スコアの合計値は7.006となる。すなわち、下記表２の遺伝子発現スコアを参照して「鑑別遺伝子群」より遺伝子の組み合わせを選択する場合、遺伝子発現スコアの合計値が7.006と同等またはそれ以上となるように「鑑別遺伝子群」より少なくとも3種の遺伝子の組み合わせを選択することができる。ここで、遺伝子発現スコアの合計値が7.006と同等であるとは、遺伝子発現スコアの合計値が6.9以上を含む。好ましい実施の形態においては、鑑別遺伝子群より選択される遺伝子の組み合わせにおける遺伝子発現スコアの合計値は7.006以上である。
また、上記の表２中の遺伝子発現スコアを参照する際、鑑別遺伝子群より選択される遺伝子の組み合わせにおいて遺伝子発現スコアの合計値を、８以上、９以上、１０以上とすることにより、鑑別の精度がより高まるため好ましい。当該遺伝子スコアの合計値を１１〜５０以上（例えば、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、２０以上、２５以上、３０以上、３５以上、４０以上、４５以上、５０以上）とするとさらに鑑別の精度が高まり好ましい。一方で、鑑別遺伝子群より選択される少なくとも３遺伝子以上の組み合わせについて、遺伝子発現スコアの合計値が、GLRX遺伝子、GDF15遺伝子、および、GABARAPL1遺伝子の遺伝子発現スコアの合計値より下回る場合、例えば６未満であった場合、臨床に耐えうる精度を担保できなかった。
Although not limited to the following, the gene expression scores of each gene included in the “differential gene cluster” in one embodiment are as shown in Table 2 below in one embodiment. At this time, the total value of the gene expression scores of the GLRX gene, the GDF15 gene, and the GABARAPL1 gene is 7.006. That is, when selecting a gene combination from the "differential gene group" with reference to the gene expression score in Table 2 below, from the "differential gene group" so that the total value of the gene expression scores is equal to or higher than 7.006. You can choose a combination of at least three genes. Here, the fact that the total value of the gene expression score is equivalent to 7.006 includes the total value of the gene expression score of 6.9 or more. In a preferred embodiment, the total gene expression score for the combination of genes selected from the differential gene cluster is 7.006 or higher.
Further, when referring to the gene expression score in Table 2 above, the total value of the gene expression scores in the combination of genes selected from the differentiated gene group is set to 8 or more, 9 or more, or 10 or more for differentiation. This is preferable because the accuracy is higher. The total value of the gene score is 11 to 50 or more (for example, 11 or more, 12 or more, 13 or more, 14 or more, 15 or more, 20 or more, 25 or more, 30 or more, 35 or more, 40 or more, 45 or more, 50 or more). Then, the accuracy of discrimination is further improved, which is preferable. On the other hand, for combinations of at least 3 genes selected from the differential gene cluster, if the total gene expression score is lower than the total gene expression scores of the GLRX gene, GDF15 gene, and GABARAPL1 gene, for example, less than 6. In that case, it was not possible to guarantee clinically acceptable accuracy.
また下記表３に、２９遺伝子の全長塩基配列またはプローブの配列番号の対応を示す。下記表３においてAは鑑別遺伝子の全長塩基配列の配列番号を、Bはプローブに用いた塩基配列の配列番号を示す。
また、本明細書中、特定の配列番号で示される塩基配列を含む遺伝子というとき、当該塩基配列と70％以上（好ましくは75％以上、80％以上、85％以上、より好ましくは90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、又は99％以上）の塩基同一性を有する塩基配列からなる遺伝子であって、かつ、対象遺伝子の機能を保持する遺伝子を含む。
例えば、一実施の形態において、本発明に用いられるLRIG1遺伝子を配列番号２５で示される塩基配列を含む遺伝子と特定するとき、配列番号２５に示される塩基配列と70％以上（好ましくは75％以上、80％以上、85％以上、より好ましくは90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、又は99％以上）の塩基同一性を有する塩基配列からなる遺伝子であって、LRIG1遺伝子の機能を保持する遺伝子を含む。なお、本明細書において「塩基同一性」とは、二つの塩基配列を整列（アラインメント）し、必要に応じてギャップを導入して、両塩基配列の塩基一致度が最も高くなるようにしたときの、遺伝子の全塩基数に対する比較するヌクレオチドの塩基配列中の同一塩基数の割合（％）をいう。
このような塩基配列を含む遺伝子の具体的な例として、同一アミノ酸配列をコードする縮重コドンを含む塩基配列からなる遺伝子、各遺伝子の各種変異体（バリアント）や点突然変異遺伝子等の変異遺伝子、及びチンパンジー等の他種生物のオルソログ遺伝子が挙げられる。
Further, in the present specification, when a gene containing a base sequence represented by a specific sequence number is referred to, 70% or more (preferably 75% or more, 80% or more, 85% or more, more preferably 90% or more) of the base sequence is used. , 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more), and includes a gene having a base sequence and retaining the function of the target gene.
For example, in one embodiment, when the LRIG1 gene used in the present invention is specified as a gene containing the base sequence shown by SEQ ID NO: 25, it is 70% or more (preferably 75% or more) with the base sequence shown by SEQ ID NO: 25. , 80% or more, 85% or more, more preferably 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more). It contains a gene that retains the function of the LRIG1 gene. In addition, in this specification, "base identity" means when two base sequences are aligned and a gap is introduced as necessary so that the degree of base matching between the two base sequences is the highest. Refers to the ratio (%) of the same number of bases in the base sequence of the nucleotide to be compared with respect to the total number of bases of the gene.
Specific examples of genes containing such base sequences include genes consisting of base sequences containing degenerate codons encoding the same amino acid sequence, various variants (variants) of each gene, and mutant genes such as point mutation genes. , And ortholog genes of other species such as chimpanzees.
また、本明細書中、特定の配列番号で示される塩基配列を含む遺伝子というとき、前記遺伝子の部分塩基配列に相補的な塩基配列からなるヌクレオチド断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸で酵素活性を保持するヌクレオチドも含まれる。「ストリンジェントな条件」とは、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味する。一般に、低塩濃度で、かつ高温であるほど高ストリンジェントな条件となる。低ストリンジェントな条件とは、例えば、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、1×SSC、0.1％ SDS、37℃程度で洗浄する条件であり、より厳しくは0.5×SSC、0.1％ SDS、42℃〜50℃程度で洗浄する条件である。さらに厳しい高ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば50℃〜70℃、55℃〜68℃、又は65℃〜68℃で、0.1×SSC及び0.1% SDSで洗浄する条件である。一般に高ストリンジェントな条件が好ましい。前記SSC、SDS及びに温度の組み合わせは、例示に過ぎない。当業者は、前記SSC、SDS及びに温度に加えて、プローブ濃度、プローブ塩基長、ハイブリダイゼーション時間等のその他の条件を適宜組み合わせてハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定することもできる。 Further, in the present specification, a gene containing a base sequence represented by a specific SEQ ID NO: is a nucleic acid that hybridizes with a nucleotide fragment consisting of a base sequence complementary to the partial base sequence of the gene under stringent conditions. Nucleotides that retain enzymatic activity are also included. By "stringent condition" is meant a condition in which a non-specific hybrid is not formed. Generally, the lower the salt concentration and the higher the temperature, the higher the stringent condition. The low stringent condition is, for example, a condition of washing at 1 × SSC, 0.1% SDS, about 37 ° C in the washing after hybridization, and more severely, 0.5 × SSC, 0.1% SDS, 42 ° C to 50. It is a condition to wash at about ℃. More stringent high stringent conditions are those that are washed after hybridization, for example, at 50 ° C to 70 ° C, 55 ° C to 68 ° C, or 65 ° C to 68 ° C, with 0.1 × SSC and 0.1% SDS. be. Generally, high stringent conditions are preferred. The combination of SSC, SDS and temperature is only an example. Those skilled in the art can also determine the stringency of hybridization by appropriately combining other conditions such as the probe concentration, the probe base length, and the hybridization time in addition to the temperature of the SSC, SDS, and the like.
２．漿液性腺癌と明細胞腺癌との鑑別方法
２−１．概要
本発明の別の態様は、被験者の卵巣癌における組織型のうち、漿液性腺癌と明細胞腺癌とを鑑別する方法である。なお、本発明の鑑別する方法は、病理組織学的検査等との併用が可能であるため、一実施の形態においては、鑑別を補助する方法と言い換えることもできる。
本発明の鑑別方法は、被験者から採取された試料中に含まれる鑑別マーカーの発現プロファイルを得て、該発現プロファイルに基づいて該被験者における卵巣癌の組織型が、漿液性腺癌であるか、又は、明細胞腺癌であるかを鑑別する方法である。「鑑別マーカーの発現プロファイル」とは、鑑別マーカーを構成する各遺伝子の発現レベルに関する情報をいう。本明細書では、特に複数の鑑別遺伝子の発現レベルに関する情報を含む。一般に、取得する遺伝子の発現プロファイルが多いほど精度の高い鑑別が可能となる。
2. 2. Method for Differentiating Serous Adenocarcinoma from Clear Cell Adenocarcinoma 2-1. Overview Another aspect of the present invention is a method for differentiating serous adenocarcinoma from clear cell adenocarcinoma among the histological types of ovarian cancer of a subject. Since the method for differentiating the present invention can be used in combination with a histopathological examination or the like, in one embodiment, it can be paraphrased as a method for assisting the differentiating.
In the differentiation method of the present invention, an expression profile of a differential marker contained in a sample collected from a subject is obtained, and based on the expression profile, the histological type of ovarian cancer in the subject is serous adenocarcinoma or serous adenocarcinoma. , Is a method of distinguishing whether it is clear cell adenocarcinoma. The "expression profile of a differential marker" refers to information regarding the expression level of each gene constituting the differential marker. This specification specifically includes information on the expression levels of multiple differential genes. In general, the larger the expression profile of the gene to be acquired, the more accurate the differentiation becomes possible.
２−２．測定方法
本発明の鑑別方法は、鑑別遺伝子群に含まれる少なくとも3種の遺伝子の発現レベルを測定する工程を必須の工程として含む。以下、測定方法について具体的に説明をする。
2-2. Measurement method The differentiation method of the present invention includes, as an essential step, the step of measuring the expression level of at least three kinds of genes contained in the differentiation gene group. Hereinafter, the measurement method will be specifically described.
「測定工程」とは、被験者から採取された試料において鑑別マーカーの発現レベルを測定してその測定値を得る工程である。鑑別マーカーの発現の測定は、各鑑別マーカーにおける単位量あたりの発現レベルを測定することが好ましい。
本明細書において「被験者」とは、試料を提供し、検査に供されるヒト個体をいう。被験者は、卵巣癌罹患歴のある個体又は卵巣癌罹患の疑いのある個体のいずれであってもよい。ここでいう「卵巣癌罹患歴のある個体」とは、現在卵巣癌に罹患している患者、及び過去卵巣癌に罹患した卵巣癌既往歴者を含む。明細胞腺癌のうち乳頭状の増殖を示す症例においては、病理組織学的に漿液性腺癌と明細胞腺癌とを区別することが困難であることから、病理組織学的に漿液性腺癌または明細胞腺癌のいずれかの疑いがあると診断された患者又は卵巣癌既往歴者は、被験者として好適である。
本明細書において「漿液性腺癌患者」とは、卵巣癌のうちの漿液性腺癌に罹患している患者のことをいう。特に、被験者または明細胞腺癌患者由来の試料との比較のため、試料を提供するものをいう場合がある。また、本明細書において「明細胞腺癌患者」とは、卵巣癌のうちの明細胞腺癌に罹患している患者のことをいう。特に、被験者または漿液性腺癌患者由来の試料との比較のため、試料を提供するものをいう場合がある。
本態様で用いる「被験者」、「漿液性腺癌患者」および「明細胞腺癌患者」は、性別、年齢、身長、体重等の身体的条件や、人数は特に制限はされないが、比較対象とされる「漿液性腺癌患者」および「明細胞腺癌患者」は、被験体と年齢、身長、及び体重等の身体的条件が同一又は近似であることが好ましい。なお、本明細書では複数の「漿液性腺癌患者」または「明細胞腺癌患者」からなる集団を「漿液性腺癌患者群」または「明細胞腺癌患者群」と称する。
The "measurement step" is a step of measuring the expression level of the differential marker in the sample collected from the subject and obtaining the measured value. For the measurement of the expression of the differential marker, it is preferable to measure the expression level per unit amount of each differential marker.
As used herein, the term "subject" refers to a human individual who provides a sample and is subjected to an examination. The subject may be either an individual with a history of ovarian cancer or an individual with suspected ovarian cancer. The term "individual with a history of ovarian cancer" as used herein includes a patient currently suffering from ovarian cancer and a person having a history of ovarian cancer having previously suffered from ovarian cancer. In cases of clear cell adenocarcinoma showing papillary growth, it is histopathologically difficult to distinguish between serous adenocarcinoma and clear cell adenocarcinoma, so histopathologically serous adenocarcinoma or Patients diagnosed with any suspicion of clear cell adenocarcinoma or those with a history of ovarian cancer are suitable as subjects.
As used herein, the term "serous adenocarcinoma patient" refers to a patient suffering from serous adenocarcinoma among ovarian cancers. In particular, it may refer to a sample provided for comparison with a sample derived from a subject or a patient with clear cell adenocarcinoma. Further, as used herein, the term "clear cell adenocarcinoma patient" refers to a patient suffering from clear cell adenocarcinoma among ovarian cancers. In particular, it may refer to a sample provided for comparison with a sample derived from a subject or a patient with serous adenocarcinoma.
The "subject", "serous adenocarcinoma patient" and "clear cell adenocarcinoma patient" used in this embodiment are not particularly limited in physical conditions such as gender, age, height and weight, and the number of people is not particularly limited, but they are compared. It is preferable that the “serosal adenocarcinoma patient” and the “clear cell adenocarcinoma patient” have the same or similar physical conditions as the subject, such as age, height, and weight. In this specification, a group consisting of a plurality of "serous adenocarcinoma patients" or "clear cell adenocarcinoma patients" is referred to as a "serous adenocarcinoma patient group" or a "clear cell adenocarcinoma patient group".
本明細書において「試料」とは、前記被験者から採取され、本態様の鑑別方法に供されるものであって、例えば、組織、細胞、体液又は腹腔洗浄液が該当する。ここでいう「組織」及び「細胞」は、被験者のいずれの部位由来でもよいが、好ましくは生検により採取された、又は手術により切除された検体、より具体的には卵巣組織又は卵巣細胞である。特に好ましくは生検により採取された卵巣癌細胞又は卵巣癌罹患の疑いのある卵巣組織又は卵巣細胞である。なお、これらの組織又は細胞は、ホルマリン固定後パラフィンに包埋されたもの（FFPE：Formalin-Fixed Paraffin Embedded)でもよい。また、ここでいう「体液」とは、被験者から採取された液体状の生体試料をいう。例えば、血液（血清、血漿及び間質液を含む）、髄液（脳脊髄液）、尿、リンパ液、消化液、腹水、胸水、神経根周囲液、各組織若しくは細胞の抽出液等が挙げられる。好ましくは血液である。 As used herein, the term "sample" is taken from the subject and used in the discrimination method of this embodiment, and corresponds to, for example, a tissue, a cell, a body fluid, or a peritoneal lavage fluid. The "tissue" and "cell" referred to here may be derived from any part of the subject, but preferably a sample collected by biopsy or excised by surgery, more specifically, ovarian tissue or ovarian cells. be. Particularly preferred are ovarian cancer cells or ovarian tissue or ovarian cells suspected of having ovarian cancer collected by biopsy. In addition, these tissues or cells may be those embedded in paraffin after formalin fixation (FFPE: Formalin-Fixed Paraffin Embedded). The term "body fluid" as used herein refers to a liquid biological sample collected from a subject. Examples thereof include blood (including serum, plasma and interstitial fluid), cerebrospinal fluid (cerebrospinal fluid), urine, lymph, digestive fluid, ascites, pleural fluid, perineural fluid, and extracts of tissues or cells. .. Blood is preferred.
試料の採取は、組織又は細胞であれば、生検又は手術による外科的摘出により入手すればよい。また、体液であれば、当該分野の公知の方法に基づいて行なえばよい。例えば、血液やリンパ液であれば公知の採血方法に従えばよい。本態様の鑑別方法において必要となる試料の量は、特に限定するものではない。組織又は細胞であれば少なくとも10μg、好ましくは少なくとも0.1mgあれば望ましいが、生検材料でも構わない。また血液、又はリンパ液のような体液であれば、少なくとも0.1mL、好ましくは少なくとも1mL、より好ましくは少なくとも10mLの容量があればよい。試料は、鑑別マーカーの測定が可能なように、必要に応じて調製、処理することができる。例えば、試料が組織又は細胞であれば、ホモジナイズ処理や細胞溶解処理、遠心や濾過による夾雑物除去、プロテアーゼインヒビターの添加等が挙げられる。これらの処理の詳細についてはGreen & Sambrook, Molecular Cloning, 2012, Fourth Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Pressに詳しく記載されており、参考にすることができる。 The sample may be obtained by biopsy or surgical removal by surgery if it is a tissue or cell. Further, if it is a body fluid, it may be carried out based on a method known in the art. For example, in the case of blood or lymph, a known blood collection method may be followed. The amount of sample required for the discrimination method of this embodiment is not particularly limited. If it is a tissue or cell, it is preferably at least 10 μg, preferably at least 0.1 mg, but a biopsy material may be used. Further, in the case of a body fluid such as blood or lymph, a volume of at least 0.1 mL, preferably at least 1 mL, and more preferably at least 10 mL may be sufficient. The sample can be prepared and processed as needed so that the differential marker can be measured. For example, if the sample is a tissue or a cell, homogenization treatment, cytolysis treatment, removal of impurities by centrifugation or filtration, addition of a protease inhibitor, or the like can be mentioned. Details of these processes can be found in Green & Sambrook, Molecular Cloning, 2012, Fourth Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press for reference.
本明細書において「単位量」とは、任意に定められる試料の量をいう。例えば、容量（μL、mLで表される）や重量（μg、mg、gで表される）が該当する。単位量は特に特定しないが、一連の鑑別方法で測定される単位量は一定とすることが好ましい。本工程で測定に供される被験者由来の試料と、比較する漿液性腺癌患者または明細胞腺癌患者由来の試料の単位量を一定とすることでより正確な鑑別が可能となる。特に、鑑別マーカーの発現レベルを絶対値として測定する際には、単位量を一定にする必要がある。 As used herein, the term "unit amount" refers to an arbitrarily determined amount of sample. For example, volume (represented by μL, mL) and weight (represented by μg, mg, g) are applicable. Although the unit amount is not particularly specified, it is preferable that the unit amount measured by a series of discrimination methods is constant. More accurate discrimination is possible by keeping the unit amount of the sample derived from the subject to be measured in this step and the sample derived from the serous adenocarcinoma patient or the clear cell adenocarcinoma patient to be compared constant. In particular, when measuring the expression level of the differential marker as an absolute value, it is necessary to keep the unit amount constant.
以下、遺伝子の転写産物の測定方法について具体的に説明をする。なお、遺伝子の転写産物の測定方法は公知である。以下では、特開２０１６−１３０８１号公報の遺伝子の転写産物又は翻訳産物の測定方法に関する記載を参照または引用して記載する。なお、以下では代表的な遺伝子の転写産物又は翻訳産物の測定方法を説明するが、これらの方法に限定されず、公知の測定方法を用いることができる。 Hereinafter, a method for measuring a transcript of a gene will be specifically described. A method for measuring a transcript of a gene is known. Hereinafter, the description regarding the method for measuring a transcript or translation product of a gene in JP-A-2016-13081 will be referred to or cited. In the following, a method for measuring a transcription product or a translation product of a typical gene will be described, but the method is not limited to these methods, and a known measurement method can be used.
鑑別遺伝子の転写産物の測定は、mRNA量の測定であっても、またmRNAから逆転写されて得られたcDNA量の測定であってもよい。一般に遺伝子の転写産物の測定には、上記の遺伝子の塩基配列の全部又は一部を含むヌクレオチドをプライマー又はプローブに用いて、遺伝子の発現レベルを絶対値又は相対値として測定する方法が採用される。
本態様のプライマー又はプローブは、通常、DNA、RNA等の天然核酸で構成される。安定性が高く、合成が容易で低廉なDNAは特に好ましい。また、必要に応じて天然核酸と化学修飾核酸や擬似核酸を組み合わせることもできる。化学修飾核酸や擬似核酸には、例えば、PNA(Peptide Nucleic Acid)、LNA(Locked Nucleic Acid;登録商標)、メチルホスホネート型DNA、ホスホロチオエート型DNA、2'-O-メチル型RNA等が挙げられる。また、プライマー及びプローブは、蛍光物質及び／又はクエンチャー物質、又は放射性同位元素（例えば、32P、33P、35S）等の標識物質、あるいはビオチン若しくは（ストレプト）アビジン、又は磁気ビーズ等の修飾物質を用いて標識又は修飾してもよい。標識物質は、限定されず、市販のものを用いることができる。例えば、蛍光物質であればFITC、Texas、Cy3、Cy5、Cy7、Cyanine3、Cyanine5、Cyanine7、FAM、HEX、VIC、フルオレサミン及びその誘導体、及びローダミン及びその誘導体等を用いることができる。クエンチャー物質であれば、AMRA、DABCYL、BHQ-1、BHQ-2、又はBHQ-3等を用いることができる。プライマー及びプローブにおける標識物質の標識位置は、その修飾物質の特性や、使用目的に応じて適宜定めればよい。一般的には、5’又は3’末端部に修飾されることが多い。また、一つのプライマー及びプローブ分子が一以上の標識物質で標識されていても構わない。これらの物質のヌクレオチドへの標識は公知の方法で行うことができる。
プライマー又はプローブとして用いるヌクレオチドは、上記鑑別マーカーを構成する各遺伝子のセンス鎖、又はアンチセンス鎖からなるヌクレオチドのいずれであってもよい。
プライマー又はプローブの塩基長は特に限定しない。プローブの場合、後述するハイブリダイゼーション法に使用するのであれば、少なくとも10塩基長以上から遺伝子全長、好ましくは15塩基長以上から遺伝子全長、より好ましくは30塩基長以上から遺伝子全長、さらに好ましくは50塩基長以上から遺伝子全長であり、マイクロアレイに使用するのであれば、10〜200塩基長、好ましくは20〜150塩基長、より好ましくは30〜100塩基長である。一般にプローブは長いほどハイブリダイゼーション効率が上昇し、感度は高くなる。一方、プローブは短いほど感度は低くなるが、逆に特異性が上昇する。プローブの具体的な例として、表２のBにおいて配列番号３０〜５８で示す塩基配列からなる80塩基のヌクレオチドが挙げられる。一方、プライマーの場合、フォワードプライマー及びリバースプライマーのそれぞれが10〜50bp、好ましくは15〜30bpあればよい。
上記したプライマー又はプローブの調製は当業者に既知であり、例えば、前述のGreen & Sambrook, Molecular Cloning（2012）に記載された方法に準じて調製することができる。また、核酸合成受託メーカーに配列情報を提供し、委託製造することも可能である。
鑑別遺伝子の転写産物の測定は、公知の核酸検出・定量方法であればよく、特に限定はしない。例えば、ハイブリダイゼーション法、又は核酸増幅法が挙げられる。
「ハイブリダイゼーション法」とは、検出すべき標的核酸の塩基配列の全部又は一部に相補的な塩基配列を有する核酸断片をプローブとして用い、その核酸と該プローブ間の塩基対合を利用して、標的核酸若しくはその断片を検出、定量する方法である。本態様で標的核酸は、鑑別マーカーを構成する各遺伝子のmRNA若しくはcDNA、又はその断片が該当する。一般にハイブリダイゼーション法は、非特異的にハイブリダイズする目的外の核酸を排除するためストリンジェントな条件で行うことが好ましい。前述の低塩濃度かつ高温下の高ストリンジェントな条件はより好ましい。ハイブリダイゼーション法には、検出手段の異なるいくつかの方法が知られているが、例えば、ノザンブロット法（ノザンハイブリダイゼーション法）、マイクロアレイ法、表面プラズモン共鳴法又は水晶振動子マイクロバランス法が好適である。
「ノザンブロット法」は、遺伝子の発現を解析する最も一般的な方法で、試料より調製した全RNA又はmRNAを変性条件下でアガロースゲル若しくはポリアクリルアミドゲル等による電気泳動によって分離し、フィルターに転写（ブロッティング）した後に、標的RNAに特異的な塩基配列を有するプローブを用いて、標的核酸を検出する方法である。プローブを蛍光色素や放射性同位元素のような適当なマーカーで標識することで、例えば、ケミルミ（化学発光）撮影解析装置（例えば、ライトキャプチャー；アトー社）、シンチレーションカウンター、イメージングアナライザー（例えば、FUJIFILM社：BASシリーズ）等の測定装置を用いて標的核酸を定量することも可能である。ノザンブロット法は、当該分野において周知著名な技術であり、例えば、前述のGreen, M.R. and Sambrook, J.（2012）を参照すればよい。
「マイクロアレイ法」は、基板上に標的核酸の塩基配列の全部若しくは一部に相補的な核酸断片をプローブとして小スポット状に高密度で配置、固相化したマイクロアレイ又はマイクロチップに標的核酸を含む試料を反応させて、基盤スポットにハイブリダイズした核酸を蛍光等によって検出する方法である。標的核酸は、mRNAのようなRNA、又はcDNAのようなDNAのいずれであってもよい。検出、定量には、標的核酸等のハイブリダイゼーションに基づく蛍光等をマイクロプレートリーダーやスキャナにより検出、測定することによって達成できる。測定した蛍光強度により、mRNA量若しくはcDNA量又はレファレンスmRNA（参照mRNA）に対するそれらの存在比を決定することができる。マイクロアレイ法も当該分野において周知の技術である。例えば、DNAマイクロアレイ法（DNAマイクロアレイと最新PCR法（2000年）村松正明、那波宏之監修、秀潤社）等を参照すればよい。
「表面プラズモン共鳴（SPR：Surface Plasmon Resonance）法」とは、金属薄膜へ照射したレーザー光の入射角度を変化させると特定の入射角度（共鳴角）において反射光強度が著しく減衰するという表面プラズモン共鳴現象を利用して、金属薄膜表面上の吸着物を極めて高感度に検出、定量する方法である。本発明においては、例えば、金属薄膜表面に標的核酸の塩基配列に相補的な配列を有するプローブを固定化し、その他の金属薄膜表面部分をブロッキング処理した後、被験体又は健常体若しくは健常体群から採取された試料を金属薄膜表面に流通させることによって標的核酸とプローブの塩基対合を形成させて、サンプル流通前後の測定値の差異から標的核酸を検出、定量することができる。表面プラズモン共鳴法による検出、定量は、例えば、Biacore社で市販されるSPRセンサを利用して行なうことができる。本技術は、当該分野において周知である。例えば、永田和弘、及び半田宏, 生体物質相互作用のリアルタイム解析実験法, シュプリンガー・フェアラーク東京, 東京, 2000を参照すればよい。
「水晶振動子マイクロバランス（QCM: Quarts Crystal Microbalance）法」とは、水晶振動子に取り付けた電極表面に物質が吸着するとその質量に応じて水晶振動子の共振周波数が減少する現象を利用して、共振周波数の変化量によって極微量な吸着物を定量的に捕らえる質量測定法である。本方法による検出、定量も、SPR法と同様に市販のQCMセンサを利用して、例えば、電極表面に固定した標的核酸の塩基配列に相補的な配列を有するプローブと被験体又は健常体若しくは健常体群から採取された試料中の標的核酸との塩基対合によって標的核酸を検出、定量することができる。本技術は、当該分野において周知であり、例えば、Christopher J. et al., 2005, Self-Assembled Monolayers of a Form of Nanotechnology, Chemical Review,105:1103-1169や森泉豊榮，中本高道，(1997) センサ工学，昭晃堂を参照すればよい。
「核酸増幅法」とは、フォワード／リバースプライマーを用いて、標的核酸の特定の領域を核酸ポリメラーゼによって増幅させる方法をいう。例えば、PCR法（RT-PCR法を含む）、NASBA法、ICAN法、LAMP（登録商標）法（RT-LAMP法を含む）が挙げられる。好ましくはPCR法である。核酸増幅法を用いた遺伝子の転写産物の測定方法には、リアルタイムRT-PCR法のような定量的核酸増幅法が使用される。リアルタイムRT-PCR法には、さらに、SYBR（登録商標）Green等を用いるインターカレーター法、Taqman（登録商標）プローブ法、デジタルPCR法、及びサイクリングプローブ法が知られているが、いずれの方法であってもよい。これらはいずれも公知の方法であり、当該技術分野における適当なプロトコルにも記載されているので、それらを参照すればよい。
リアルタイムRT-PCR法で遺伝子の転写産物を定量する方法について、以下で一例を挙げて簡単に説明をする。リアルタイムRT-PCR法は、試料中のmRNAから逆転写反応によって調製されたcDNAを鋳型として、PCRの増幅産物が特異的に蛍光標識される反応系で、増幅産物に由来する蛍光強度を検出する機能の備わった温度サイクラー装置を用いてPCRを行う核酸定量方法である。反応中の標的核酸の増幅産物量をリアルタイムでモニタリングして、その結果をコンピュータで回帰分析する。増幅産物を標識する方法としては、蛍光標識したプローブを用いる方法（例えば、TaqMan（登録商標）PCR法）と、2本鎖DNAに特異的に結合する試薬を用いるインターカレーター方法とがある。TaqMan（登録商標）PCR法は、5’末端部がクエンチャー物質で、また3’末端部が蛍光色素で修飾されたプローブを用いる。通常は、5’末端部のクエンチャー物質が3’末端部の蛍光色素を抑制しているが、PCRが行われるとTaqポリメラーゼのもつ5’→3’エキソヌクレアーゼ活性により当該プローブが分解され、それによってクエンチャー物質の抑制が解除されるため蛍光を発するようになる。その蛍光量は、増幅産物の量を反映する。増幅産物が検出限界に到達するときのサイクル数（CT）と初期鋳型量とは逆相関の関係にあることから、リアルタイム測定法ではCTを測定することによって初期鋳型量を定量している。数段階の既知量の鋳型を用いてCTを測定し、検量線を作製すれば、未知試料の初期鋳型量の絶対値を算出することができる。RT-PCRで使用する逆転写酵素は、例えば、M-MLV RTase、ExScript RTase（TaKaRa社）、Super Script II RT（Thermo Fisher Scientific社）等を使用することができる。
リアルタイムPCRの反応条件は、一般に、公知のPCR法を基礎として、増幅する核酸断片の塩基長及び鋳型用核酸の量、並びに使用するプライマーの塩基長及びTm値、使用する核酸ポリメラーゼの至適反応温度及び至適pH等により変動するため、これらの条件に応じて適宜定めればよい。一例として、通常、変性反応を94〜95℃で5秒〜5分間、アニーリング反応を50〜70℃で10秒〜1分間、伸長反応を68〜72℃で30秒〜3分間行い、これを１サイクルとして15〜40サイクルほど繰り返して伸長反応を行うことができる。前記メーカー市販のキットを使用する場合には、原則としてキットに添付のプロトコルに従って行えばよい。
リアルタイムPCRで用いられる核酸ポリメラーゼは、DNAポリメラーゼ、特に熱耐性DNAポリメラーゼである。このような核酸ポリメラーゼは、様々な種類のものが市販されており、それらを利用することもできる。例えば、前記Applied Biosystems TaqMan MicroRNA Assays Kit（Thermo Fisher Scientific社）に添付のTaq DNAポリメラーゼが挙げられる。特にこのような市販のキットには、添付のDNAポリメラーゼの活性に最適化されたバッファ等が添付されているので有用である。
The measurement of the transcript of the differential gene may be a measurement of the amount of mRNA or a measurement of the amount of cDNA obtained by reverse transcription from mRNA. Generally, for the measurement of a transcript of a gene, a method of measuring the expression level of the gene as an absolute value or a relative value by using a nucleotide containing all or a part of the base sequence of the above gene as a primer or a probe is adopted. ..
The primer or probe of this embodiment is usually composed of a natural nucleic acid such as DNA or RNA. DNA that is highly stable, easy to synthesize, and inexpensive is particularly preferred. Further, if necessary, a natural nucleic acid can be combined with a chemically modified nucleic acid or a pseudo-nucleic acid. Examples of the chemically modified nucleic acid and pseudo-nucleic acid include PNA (Peptide Nucleic Acid), LNA (Locked Nucleic Acid; registered trademark), methylphosphonate-type DNA, phosphorothioate-type DNA, 2'-O-methyl-type RNA and the like. In addition, the primer and probe may be a fluorescent substance and / or a quencher substance, a labeling substance such as a radioisotope (for example, 32P, 33P, 35S), or a modifying substance such as biotin or (streptavidin) avidin, or magnetic beads. It may be labeled or modified using. The labeling substance is not limited, and commercially available substances can be used. For example, as a fluorescent substance, FITC, Texas, Cy3, Cy5, Cy7, Cyanine3, Cyanine5, Cyanine7, FAM, HEX, VIC, fluorescamine and its derivatives, rhodamine and its derivatives and the like can be used. As long as it is a quencher substance, AMRA, DABCYL, BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3 and the like can be used. The labeling position of the labeling substance in the primer and the probe may be appropriately determined according to the characteristics of the modifying substance and the purpose of use. In general, it is often modified to the 5'or 3'end. Further, one primer and probe molecule may be labeled with one or more labeling substances. Labeling of these substances on nucleotides can be performed by known methods.
The nucleotide used as the primer or probe may be either the sense strand of each gene constituting the differential marker or the nucleotide consisting of the antisense strand.
The base length of the primer or probe is not particularly limited. In the case of a probe, if it is used in the hybridization method described later, it is at least 10 bases long or longer to the full length of the gene, preferably 15 bases or longer to the full length of the gene, more preferably 30 bases or longer to the full length of the gene, and further preferably 50 bases or longer. The total length of the gene is from the base length or more, and if it is used for a microarray, it is 10 to 200 base lengths, preferably 20 to 150 base lengths, and more preferably 30 to 100 base lengths. Generally, the longer the probe, the higher the hybridization efficiency and the higher the sensitivity. On the other hand, the shorter the probe, the lower the sensitivity, but conversely, the higher the specificity. Specific examples of the probe include 80 base nucleotides consisting of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 30 to 58 in Table 2B. On the other hand, in the case of a primer, each of the forward primer and the reverse primer may be 10 to 50 bp, preferably 15 to 30 bp.
The preparation of the above-mentioned primers or probes is known to those skilled in the art and can be prepared, for example, according to the method described in Green & Sambrook, Molecular Cloning (2012) described above. It is also possible to provide sequence information to a nucleic acid synthesis contract manufacturer and perform contract manufacturing.
The measurement of the transcript of the differential gene may be performed by a known nucleic acid detection / quantification method, and is not particularly limited. For example, a hybridization method or a nucleic acid amplification method can be mentioned.
The "hybridization method" uses a nucleic acid fragment having a base sequence complementary to all or part of the base sequence of the target nucleic acid to be detected as a probe, and utilizes the base pairing between the nucleic acid and the probe. , A method for detecting and quantifying a target nucleic acid or a fragment thereof. In this embodiment, the target nucleic acid corresponds to mRNA or cDNA of each gene constituting a differential marker, or a fragment thereof. In general, the hybridization method is preferably performed under stringent conditions in order to eliminate unintended nucleic acids that hybridize non-specifically. The above-mentioned low salt concentration and high stringent conditions under high temperature are more preferable. As the hybridization method, several methods with different detection means are known, and for example, Northern blotting (Northern hybridization method), microarray method, surface plasmon resonance method, or quartz crystal microbalance method is preferable. ..
The "Northern blot method" is the most common method for analyzing gene expression. Total RNA or mRNA prepared from a sample is separated by electrophoresis on an agarose gel or polyacrylamide gel under denaturing conditions, and transferred to a filter ( This is a method of detecting a target nucleic acid using a probe having a base sequence specific to the target RNA after blotting). By labeling the probe with a suitable marker such as a fluorescent dye or radioactive isotope, for example, a chemiluminescent analyzer (eg, Light Capture; Atto), a scintillation counter, an imaging analyzer (eg, FUJIFILM). : It is also possible to quantify the target nucleic acid using a measuring device such as BAS series). The Northern Blotting method is a well-known and well-known technique in the art, and for example, the above-mentioned Green, MR and Sambrook, J. (2012) may be referred to.
In the "microarray method", a nucleic acid fragment complementary to all or part of the base sequence of a target nucleic acid is arranged as a probe at high density in a small spot on a substrate, and the target nucleic acid is contained in a solidified microarray or microchip. This is a method of reacting a sample and detecting a nucleic acid hybridized to a substrate spot by fluorescence or the like. The target nucleic acid may be either RNA such as mRNA or DNA such as cDNA. Detection and quantification can be achieved by detecting and measuring fluorescence based on hybridization of a target nucleic acid or the like with a microplate reader or a scanner. The measured fluorescence intensity can be used to determine the amount of mRNA or cDNA or their abundance to reference mRNA (reference mRNA). The microarray method is also a well-known technique in the art. For example, the DNA microarray method (DNA microarray and latest PCR method (2000), supervised by Masaaki Muramatsu, Hiroyuki Nawa, Shujunsha) and the like may be referred to.
The "Surface Plasmon Resonance (SPR) method" is a surface plasmon resonance in which the reflected light intensity is significantly attenuated at a specific incident angle (resonance angle) when the incident angle of the laser light irradiated to the metal thin film is changed. This is a method of detecting and quantifying adsorbents on the surface of a metal thin film with extremely high sensitivity by utilizing the phenomenon. In the present invention, for example, a probe having a sequence complementary to the base sequence of the target nucleic acid is immobilized on the surface of the metal thin film, the surface portion of the other metal thin film is blocked, and then the subject or a healthy body or a healthy body group is used. By circulating the collected sample on the surface of a metal thin film, a base pairing between the target nucleic acid and the probe can be formed, and the target nucleic acid can be detected and quantified from the difference in the measured values before and after the sample is distributed. Detection and quantification by the surface plasmon resonance method can be performed by using, for example, an SPR sensor commercially available from Biacore. This technique is well known in the art. See, for example, Kazuhiro Nagata and Hiroshi Handa, Real-time Analytical Experimentals for Biological Interactions, Springer Fairlark Tokyo, Tokyo, 2000.
The "Quartz Crystal Microbalance (QCM) method" utilizes the phenomenon that when a substance is adsorbed on the surface of an electrode attached to a crystal oscillator, the resonance frequency of the crystal oscillator decreases according to its mass. This is a mass measurement method that quantitatively captures a very small amount of adsorbate according to the amount of change in the resonance frequency. Similar to the SPR method, the detection and quantification by this method also uses a commercially available QCM sensor, for example, a probe having a sequence complementary to the base sequence of the target nucleic acid immobilized on the electrode surface and the subject, or a healthy body or a healthy body. The target nucleic acid can be detected and quantified by base pairing with the target nucleic acid in the sample collected from the body group. This technology is well known in the art, for example, Christopher J. et al., 2005, Self-Assembled Monolayers of a Form of Nanotechnology, Chemical Review, 105: 1103-1169, Toyoe Morizumi, Takamichi Nakamoto, ( 1997) See Sensor Engineering, Shokodo.
The "nucleic acid amplification method" refers to a method of amplifying a specific region of a target nucleic acid by a nucleic acid polymerase using a forward / reverse primer. For example, the PCR method (including the RT-PCR method), the NASBA method, the ICAN method, and the LAMP® method (including the RT-LAMP method) can be mentioned. The PCR method is preferable. A quantitative nucleic acid amplification method such as a real-time RT-PCR method is used as a method for measuring a gene transcript using a nucleic acid amplification method. Further, as the real-time RT-PCR method, an intercalator method using SYBR (registered trademark) Green or the like, a Taqman (registered trademark) probe method, a digital PCR method, and a cycling probe method are known, and any of these methods can be used. There may be. All of these are known methods and are also described in appropriate protocols in the art, so you can refer to them.
The method of quantifying the transcript of a gene by the real-time RT-PCR method will be briefly described below with an example. The real-time RT-PCR method is a reaction system in which the amplification product of PCR is specifically fluorescently labeled using cDNA prepared by reverse transcription reaction from the mRNA in the sample, and the fluorescence intensity derived from the amplification product is detected. This is a nucleic acid quantification method in which PCR is performed using a functional temperature cycler device. The amount of amplification product of the target nucleic acid in the reaction is monitored in real time, and the result is subjected to regression analysis by computer. Methods for labeling the amplification product include a method using a fluorescently labeled probe (for example, TaqMan (registered trademark) PCR method) and an intercalator method using a reagent that specifically binds to double-stranded DNA. The TaqMan® PCR method uses a probe with a 5'end modified with a quencher and a 3'end modified with a fluorescent dye. Normally, the 5'end quencher substance suppresses the 3'end fluorescent dye, but when PCR is performed, the probe is degraded by the 5'→ 3'exonuclease activity of Taq polymerase. As a result, the suppression of the quencher substance is released, and the fluorescence is emitted. The amount of fluorescence reflects the amount of amplification product. Since the number of cycles (CT) when the amplification product reaches the detection limit and the initial template amount are inversely related, the real-time measurement method quantifies the initial template amount by measuring CT. By measuring CT using a known amount of templates in several stages and preparing a calibration curve, the absolute value of the initial template amount of an unknown sample can be calculated. As the reverse transcriptase used in RT-PCR, for example, M-MLV RTase, ExScript RTase (TaKaRa), Super Script II RT (Thermo Fisher Scientific) and the like can be used.
The reaction conditions of real-time PCR are generally based on a known PCR method, the base length of the nucleic acid fragment to be amplified, the amount of nucleic acid for the template, the base length and Tm value of the primer to be used, and the optimum reaction of the nucleic acid polymerase to be used. Since it varies depending on the temperature, optimum pH, etc., it may be appropriately determined according to these conditions. As an example, the denaturation reaction is usually carried out at 94-95 ° C for 5 seconds to 5 minutes, the annealing reaction is carried out at 50 to 70 ° C for 10 seconds to 1 minute, and the extension reaction is carried out at 68 to 72 ° C for 30 seconds to 3 minutes. The elongation reaction can be repeated for about 15 to 40 cycles as one cycle. When using a kit commercially available from the manufacturer, in principle, the protocol attached to the kit may be followed.
The nucleic acid polymerase used in real-time PCR is a DNA polymerase, especially a heat resistant DNA polymerase. Various types of such nucleic acid polymerases are commercially available, and they can also be used. For example, Taq DNA polymerase attached to the Applied Biosystems TaqMan MicroRNA Assays Kit (Thermo Fisher Scientific) can be mentioned. In particular, such a commercially available kit is useful because it comes with a buffer optimized for the activity of the attached DNA polymerase.
２−３．鑑別方法
本発明の鑑別方法は、上記のようにして測定した鑑別マーカーの発現プロファイルをもとに、被験試料が漿液性腺癌または明細胞腺癌のいずれに属するものであるのかを鑑別する。鑑別マーカーは、漿液性腺癌または明細胞腺癌との間で発現レベルに有意な差がある遺伝子であり、それらを組み合わせた遺伝子セットの発現プロファイルについて漿液性腺癌患者または明細胞腺癌患者由来の試料と比較することで、被験試料がどちらの組織型の卵巣癌であるのかを鑑別することが可能となる。
すなわち、本発明の鑑別方法は、被験試料の鑑別遺伝子群より選択される遺伝子セットにおける各遺伝子の発現プロファイルと、漿液性腺癌患者または明細胞腺癌患者由来の試料における対応する遺伝子セットにおける各遺伝子の発現プロファイルとを比較することにより、被検試料の組織型を鑑別する。
被験試料に対して比較対象となる漿液性腺癌患者または明細胞腺癌患者由来の試料の遺伝子セットに含まれる各遺伝子の発現プロファイルは、予め測定したものを用いてもよいし、または、新たに漿液性腺癌患者または明細胞腺癌患者由来の試料について遺伝子セットに含まれる各遺伝子の発現レベルを測定したものを用いても良い。
よって、本発明の鑑別方法は、一実施の形態において、漿液性腺癌患者または明細胞腺癌患者由来の試料において、遺伝子セットに含まれる各遺伝子の発現レベルを測定する工程をさらに含む。この工程により得られた発現プロファイルと被験試料の発現プロファイルとを比較することができる。漿液性腺癌患者または明細胞腺癌患者由来の試料は、それぞれ一つずつの試料でもよいし、二つ以上の試料を用いてもよい。試料の数が多いほど、試料ごとの個体差を平均化でき、鑑別の精度が高まるので好ましい。
2-3. Differentiation method In the differentiation method of the present invention, whether the test sample belongs to serous adenocarcinoma or clear cell adenocarcinoma is differentiated based on the expression profile of the differential marker measured as described above. Differentiating markers are genes with significant differences in expression levels between serous or clear cell adenocarcinoma, and the expression profile of the combined gene set is derived from serous or clear cell adenocarcinoma patients. By comparing with the sample, it becomes possible to distinguish which histological type of ovarian cancer the test sample has.
That is, in the differentiation method of the present invention, the expression profile of each gene in the gene set selected from the differentiation gene group of the test sample and each gene in the corresponding gene set in the sample derived from the serous adenocarcinoma patient or the clear cell adenocarcinoma patient. By comparing with the expression profile of the test sample, the histological type of the test sample is differentiated.
As the expression profile of each gene contained in the gene set of the sample derived from the serous adenocarcinoma patient or the clear cell adenocarcinoma patient to be compared with the test sample, a pre-measured one may be used, or a new one may be used. A sample derived from a patient with serous adenocarcinoma or a patient with clear cell adenocarcinoma may be used by measuring the expression level of each gene contained in the gene set.
Therefore, the differentiation method of the present invention further comprises, in one embodiment, measuring the expression level of each gene contained in the gene set in a sample derived from a serous adenocarcinoma patient or a clear cell adenocarcinoma patient. The expression profile obtained by this step can be compared with the expression profile of the test sample. The samples derived from the serous adenocarcinoma patient or the clear cell adenocarcinoma patient may be one sample each, or two or more samples may be used. The larger the number of samples, the more the individual difference for each sample can be averaged and the accuracy of discrimination is improved, which is preferable.
本発明の一実施の形態においては、被験試料の遺伝子セットにおける各遺伝子の発現プロファイルと、漿液性腺癌患者または明細胞腺癌患者由来の試料における対応する遺伝子セットにおける各遺伝子の発現プロファイルとを比較した際に、被検試料が、比較した組織型卵巣癌の遺伝子の発現プロファイルと同等の遺伝子の発現プロファイルを有する場合に比較した組織型の卵巣癌であると鑑別するか、または、比較した組織型卵巣癌の遺伝子の発現プロファイルと異なる遺伝子の発現プロファイルを有する場合に比較した組織型の卵巣癌ではないと鑑別することができる。
例えば、被験試料と漿液性腺癌患者由来試料とにおける発現プロファイルを比較した際、互いに同等の遺伝子の発現プロファイルを有していると判断された場合には、被験試料は、漿液性腺癌であると鑑別することができる。また、被験試料と明細胞腺癌患者由来試料とにおける発現プロファイルを比較した際、互いに同等の遺伝子の発現プロファイルを有していると判断された場合には、被験試料は、明細胞腺癌であると鑑別することができる。一方で、被験試料と漿液性腺癌患者由来試料とにおける発現プロファイルを比較した際、互いに異なる遺伝子の発現プロファイルを有していると判断された場合には、被験試料は、漿液性腺癌ではないと鑑別することができる。また、被験試料と明細胞腺癌患者由来試料とにおける発現プロファイルを比較した際、互いに異なる遺伝子の発現プロファイルを有していると判断された場合には、被験試料は、明細胞腺癌ではないと鑑別することができる。
ここで、「同等の遺伝子の発現プロファイルを有する」とは、遺伝子セットに含まれる各遺伝子の発現プロファイルが類似していることをいう。また、「異なる遺伝子の発現プロファイルを有する」とは、遺伝子セットに含まれる各遺伝子の発現プロファイルが類似していないことをいう。
遺伝子セットにおける各遺伝子の発現プロファイルが同等であるか異なっているかについて鑑別する具体的な手法は、公知の方法を採用することができる。以下に限定されないが、例えば、（ｉ）階層的クラスタリング分析に基づいて被験試料を漿液性腺癌または明細胞腺癌へ分類する方法、（ｉｉ）遺伝子の発現レベルの比較により評価する方法、（ｉｉｉ）閾値の設定により被験試料が漿液性腺癌または明細胞腺癌のいずれに属するか鑑別する方法などを挙げることができる。
In one embodiment of the invention, the expression profile of each gene in the gene set of the test sample is compared with the expression profile of each gene in the corresponding gene set in a sample derived from a patient with serous adenocarcinoma or a patient with clear cell adenocarcinoma. When the test sample has a gene expression profile equivalent to the gene expression profile of the compared histological ovarian cancer, it is differentiated from the histological ovarian cancer compared to the case, or the compared tissue. It can be differentiated that it is not a histological type of ovarian cancer as compared with the case where the gene expression profile of the type ovarian cancer is different from the expression profile of the gene.
For example, when comparing the expression profiles of the test sample and the sample derived from a patient with serous adenocarcinoma, if it is determined that they have the same gene expression profiles as each other, the test sample is considered to be serous adenocarcinoma. Can be distinguished. In addition, when comparing the expression profiles of the test sample and the sample derived from the clear cell adenocarcinoma patient, if it is determined that they have the same gene expression profiles as each other, the test sample is clear cell adenocarcinoma. It can be identified as being present. On the other hand, when comparing the expression profiles of the test sample and the sample derived from the patient with serous adenocarcinoma, if it is determined that the test sample has different gene expression profiles, the test sample is not serous adenocarcinoma. Can be distinguished. In addition, when comparing the expression profiles of the test sample and the sample derived from a clear cell adenocarcinoma patient, if it is determined that the test sample has different gene expression profiles, the test sample is not clear cell adenocarcinoma. Can be distinguished from.
Here, "having an equivalent gene expression profile" means that the expression profile of each gene contained in the gene set is similar. Further, "having different gene expression profiles" means that the expression profiles of each gene contained in the gene set are not similar.
A known method can be adopted as a specific method for discriminating whether the expression profiles of each gene in the gene set are equivalent or different. For example, but not limited to, (i) a method of classifying a test sample into serous adenocarcinoma or clear cell adenocarcinoma based on hierarchical clustering analysis, (ii) a method of evaluating by comparison of gene expression levels, (iiii). ) A method of distinguishing whether the test sample belongs to serous adenocarcinoma or clear cell adenocarcinoma by setting a threshold value can be mentioned.
（ｉ）階層的クラスタリング分析
本発明の鑑別方法は、一実施の形態において、被験試料の遺伝子セットにおける各遺伝子の発現プロファイルをクラスタ分析することにより被検試料の組織型を鑑別することができる。
より具体的には、被験試料において測定した遺伝子セットの発現プロファイルは、漿液性腺癌患者および明細胞腺癌患者由来の試料における対応する遺伝子セットの発現プロファイルと比較して階層的クラスタ分析を行うことができる。階層的クラスタリング分析により被験試料の組織型を鑑別する際には、被験試料における遺伝子セットの発現プロファイルに加えて、漿液性腺癌患者および明細胞腺癌患者由来の試料における遺伝子セットの発現プロファイルが必要となる。階層的クラスタ分析の手法は公知であり、本発明における好ましい実施形態においては、ユークリッド距離による群平均法によるクラスタ分析である。クラスタ分析には公知のソフトウェアを用いることができ、以下に限定されないが、例えば、市販のソフトウェアとしてExpressionView Pro software（MicroDiagnostic）を用いることができる。
階層的クラスタ分析を行うことで、被験試料と、漿液性腺癌患者由来の試料と、明細胞腺癌患者由来の試料とからなる階層構造（樹形図）を描くことができ、漿液性腺癌のクラスタと、明細胞腺癌患の２つのクラスタに大きく分けることができる。これにより、被験試料がいずれの組織型のクラスタに分類されるのか確認することができ、いずれの組織型である可能性が高いかを鑑別することが可能となる。
(I) Hierarchical clustering analysis In one embodiment, the differentiation method of the present invention can differentiate the histological type of a test sample by cluster analysis of the expression profile of each gene in the gene set of the test sample.
More specifically, the expression profile of the gene set measured in the test sample should be subjected to hierarchical cluster analysis in comparison with the expression profile of the corresponding gene set in the samples derived from patients with serous adenocarcinoma and clear cell adenocarcinoma. Can be done. When differentiating the histological type of a test sample by hierarchical clustering analysis, in addition to the expression profile of the gene set in the test sample, the expression profile of the gene set in the samples derived from patients with serous adenocarcinoma and clear cell adenocarcinoma is required. It becomes. The method of hierarchical cluster analysis is known, and in a preferred embodiment of the present invention, it is cluster analysis by the group averaging method based on the Euclidean distance. Known software can be used for cluster analysis, and, for example, ExpressionView Pro software (MicroDiagnostic) can be used as commercially available software, but is not limited to the following.
By performing hierarchical cluster analysis, it is possible to draw a hierarchical structure (dendrogram) consisting of a test sample, a sample derived from a serous adenocarcinoma patient, and a sample derived from a clear cell adenocarcinoma patient. It can be roughly divided into two clusters, one is a cluster and the other is a clear cell adenocarcinoma. This makes it possible to confirm which tissue type the test sample is classified into, and to distinguish which tissue type is likely to be.
（ｉｉ）遺伝子の発現レベルの比較により評価する方法
また、一実施の形態においては、被検試料における遺伝子セットに含まれる各遺伝子の組み合わせの遺伝子の発現レベルの合計値と、漿液性腺癌患者または明細胞腺癌患者由来の試料における当該遺伝子の発現レベルの合計値とを比較することにより、被験試料の組織型を評価することができる。
以下に限定されないが、一形態を挙げて説明すると、漿液性腺癌患者群および明細胞腺癌患者群における遺伝子の発現レベルの合計値を群散布図として作図して、被験試料における遺伝子セットの遺伝子の発現レベルの合計値がどこにプロットされるかを確認する。プロットされた位置により、被験試料がいずれの組織型卵巣癌に属する可能性が高いか評価することができる。
なお、遺伝子の発現レベルの合計値を鑑別に用いる際、LRIG-1、LYPD1、CRIP1、UQCRH、IGF2の5遺伝子については得られた発現レベルの値を反転して用いる。例えば、遺伝子の発現レベルについてマイクロアレイ等の方法により得られた各遺伝子の発現量の合計値を利用する際には、LRIG-1、LYPD1、CRIP1、UQCRH、IGF2の5遺伝子の発現量（例えば、共通リファレンスに対するLog2比）に対して−1を乗じて反転した値を求め、反転した値と他の遺伝子の発現量との合計値を算出する。
(Ii) Method for evaluation by comparison of gene expression levels In one embodiment, the total value of the gene expression levels of each gene combination contained in the gene set in the test sample and the serous adenocarcinoma patient or The histological type of the test sample can be evaluated by comparing it with the total expression level of the gene in the sample derived from a clear cell adenocarcinoma patient.
Not limited to the following, but to explain one morphology, the total value of gene expression levels in the serous adenocarcinoma patient group and the clear cell adenocarcinoma patient group is plotted as a group scatter diagram, and the gene of the gene set in the test sample is plotted. See where the total expression level of is plotted. The plotted positions can be used to assess which histological ovarian cancer the test sample is likely to belong to.
When the total expression level of genes is used for differentiation, the obtained expression level values are inverted and used for the five genes LRIG-1, LYPD1, CRIP1, UQCRH, and IGF2. For example, when using the total expression level of each gene obtained by a method such as a microarray for the expression level of a gene, the expression level of 5 genes of LRIG-1, LYPD1, CRIP1, UQCRH, and IGF2 (for example, Multiply -1 by the Log2 ratio to the common reference) to obtain the inverted value, and calculate the total value of the inverted value and the expression levels of other genes.
（ｉｉｉ）閾値の設定により鑑別する方法
また、一実施の形態においては、被検試料における遺伝子セットの発現プロファイルを、所定の閾値と比較することにより組織型を鑑別することができる。
ここで、「所定の閾値」とは、漿液性腺癌患者群および明細胞腺癌患者群由来の試料における鑑別マーカーの発現プロファイルに基づく所定のカットオフ値をいう。カットオフ値の設定は、例えば、以下のようにして設定することができるが、これに限定されない。すなわち、漿液性腺癌患者群および明細胞腺癌患者群由来の試料について鑑別マーカーの遺伝子の発現レベルを測定し、各試料について遺伝子の発現レベルの合計値を算出する。そして、漿液性腺癌患者群または明細胞腺癌患者群由来の試料における遺伝子の発現レベルの合計値からROC曲線を作成することにより所定のカットオフ値を導くことができる。カットオフ値を設定することにより、当該カットオフ値を超えるか否かで、いずれの組織型卵巣癌である可能性が高いか鑑別することができる。
「ROC曲線(Receiver Operating Characteristic curve、受信者動作特性曲線)」は、縦軸を真陽性率（TPF: True Positive Fraction）、すなわち感度、横軸を偽陽性率（FPF: False Positive Fraction）、すなわち（１−特異度）とし、検査結果のどの値を所見ありと判断するかの閾値、つまりカットオフポイント(cutoff point)を媒介変数として変化させてプロットしていくことで作成される。特異度とは、陰性者を正確に陰性と判断する率である。
作成したROC曲線からカットオフ値を設定する方法は、基本的に感度、特異度をともに高める（1に近づくようする）ように設定することができる。そのためには、カットオフ値がROC曲線上で点(0,1)に最も近い点を与える値に設定すればよい。最も好ましい実施の形態においては、漿液性腺癌患者群由来の試料と明細胞腺癌患者群由来の試料とを明確に鑑別可能なカットオフ値とすることである。
上記のように所定の閾値を設定した場合、当該閾値と被験者由来の試料における遺伝子セットの発現プロファイルとの比較は、当該閾値と被験試料における特定の鑑別マーカーの組み合わせについての遺伝子の発現レベルの合計値とを比較すればよい。
(Iii) Method for Discriminating by Setting Thresholds Further, in one embodiment, the histological type can be discriminated by comparing the expression profile of the gene set in the test sample with a predetermined threshold value.
Here, the "predetermined threshold value" refers to a predetermined cutoff value based on the expression profile of the differential marker in the samples derived from the serous adenocarcinoma patient group and the clear cell adenocarcinoma patient group. The cutoff value can be set, for example, as follows, but the cutoff value is not limited to this. That is, the expression level of the differential marker gene is measured for the samples derived from the serous adenocarcinoma patient group and the clear cell adenocarcinoma patient group, and the total value of the gene expression level is calculated for each sample. Then, a predetermined cutoff value can be derived by creating an ROC curve from the total value of gene expression levels in a sample derived from a serous adenocarcinoma patient group or a clear cell adenocarcinoma patient group. By setting a cutoff value, it is possible to distinguish which histological type ovarian cancer is most likely to be, depending on whether or not the cutoff value is exceeded.
In the "ROC curve (Receiver Operating Characteristic curve)", the vertical axis is the true positive rate (TPF: True Positive Fraction), that is, the sensitivity, and the horizontal axis is the false positive rate (FPF: False Positive Fraction), that is. It is created by setting (1-specificity) and plotting by changing the threshold value of which value of the test result is judged to have a finding, that is, the cutoff point as an intermediary variable. Specificity is the rate at which a negative person is accurately judged to be negative.
The method of setting the cutoff value from the created ROC curve can basically be set to increase both sensitivity and specificity (to approach 1). For that purpose, the cutoff value may be set to a value that gives the point closest to the point (0,1) on the ROC curve. In the most preferred embodiment, the cutoff value is such that the sample derived from the serous adenocarcinoma patient group and the sample derived from the clear cell adenocarcinoma patient group can be clearly distinguished.
When a predetermined threshold is set as described above, the comparison between the threshold and the expression profile of the gene set in the sample derived from the subject is the sum of the expression levels of the gene for the combination of the threshold and the specific differential marker in the test sample. Just compare it with the value.
２−３．効果
本態様の鑑別方法によれば、生検や手術により摘出した検体を調べることで、その検体が漿液性腺癌か明細胞腺癌かを鑑別することができる。正診率の高い本態様の鑑別方法によって、いずれの組織型卵巣癌であるかの診断することが可能となり、再発リスクや治療法の判断を考慮し、対応できる利点がある。
また、従来、卵巣癌は、病理学的診断に基づいて組織型を判断されていたが、特に乳頭状に増殖した明細胞腺癌は漿液性腺癌と区別することが非常に困難であり、診断結果を判断する医師の差や病院間により異なる判断が生じていた。しかし、本態様の罹患鑑別方法によれば、漿液性腺癌であるか明細胞腺癌であるかの診断を補助するより正確な客観的なデータを提供することができる。
2-3. Effect According to the differentiation method of this embodiment, it is possible to distinguish whether the sample is serous adenocarcinoma or clear cell adenocarcinoma by examining the sample removed by biopsy or surgery. The differentiation method of this embodiment, which has a high accuracy rate, makes it possible to diagnose which histological type of ovarian cancer is, and has an advantage that it can be dealt with in consideration of the risk of recurrence and the judgment of the treatment method.
In addition, conventionally, the histological type of ovarian cancer has been determined based on pathological diagnosis, but it is very difficult to distinguish clear cell adenocarcinoma that has grown papillary from serous adenocarcinoma, and the diagnosis is made. Different judgments were made depending on the doctors who judge the results and the hospitals. However, the disease differentiation method of this embodiment can provide more accurate and objective data to assist in the diagnosis of serous adenocarcinoma or clear cell adenocarcinoma.
３．卵巣癌患者由来の被検試料において、漿液性腺癌または明細胞腺癌のいずれの組織型であるのかを鑑別するためのキット
３−１．概要
本発明の別の態様は、漿液性腺癌または明細胞腺癌のいずれの組織型であるのかを鑑別するための試薬（鑑別用試薬）である。本態様の鑑別用試薬は、例えば卵巣癌に罹患している被験者由来の試料に適用することで、その被験者の卵巣癌が漿液性腺癌であるか、明細胞腺癌であるかを鑑別することができる。
３−１−１．構成
本態様の鑑別用試薬は、鑑別マーカーを構成する鑑別遺伝子群の転写産物、すなわちmRNA又はcDNAを検出するためのプローブ又はプライマーセットを含む。これらの具体的な構成については、測定工程の欄に記載している。例えば、鑑別マーカーを構成する4種の鑑別遺伝子群の転写産物を検出する場合、鑑別用キットは、対応する遺伝子の転写産物を検出可能な4種のプローブ群を含むことができる。
本態様の鑑別用試薬が上記のようなプローブの場合、鑑別用試薬は、各プローブを基板上に固定したDNAマイクロアレイ又はDNAマイクロチップの状態で提供することもできる。各プローブを固定する基板の素材は、限定はしないが、ガラス板、石英板、シリコンウェハー等が通常使用される。基板の大きさは、例えば、3.5mm×5.5mm、18mm×18mm、22mm×75mmなどが挙げられるが、これはプローブのスポット数やそのスポットの大きさなどに応じて様々に設定することができる。プローブは、1スポットあたり通常0.1μg〜0.5μgのヌクレオチドが用いられる。ヌクレオチドの固定化方法には、ヌクレオチドの荷電を利用してポリリジン、ポリ-L-リジン、ポリエチレンイミン、ポリアルキルアミン等のポリ陽イオンで表面処理した固相担体に静電結合させる方法や、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基などの官能基を導入した固相表面に、アミノ基、アルデヒド基、SH基、ビオチンなどの官能基を導入したヌクレオチドを共有結合により結合させる方法が挙げられる。
３−２．効果
本態様の鑑別用キットを用いて、卵巣癌罹患歴のある被験者に適用することで、当該卵巣癌が、漿液性腺癌または明細胞腺癌のいずれの組織型に属する卵巣癌であるのかを客観的かつ正確に鑑別することができる。
本発明の検出キットは、鑑別マーカーの検出に必要な他の試薬、例えば、バッファや二次抗体、検出及び結果鑑別に用いる説明書を含んでいてもよい。
４．鑑別結果に基づいた治療方法
本発明は、別の態様として、上記に記載の鑑別方法により漿液性腺癌であるか、明細胞腺癌であるかを鑑別した被験者に対して、当該鑑別結果に基づいて抗癌剤を投与する治療方法を提供する。
すなわち、本発明の鑑別方法により、漿液性腺癌であると鑑別された被験者に対しては、漿液性腺癌に有効な抗癌剤を有効量投与する。一方で、本発明の鑑別方法により、明細胞腺癌であると鑑別された被験者に対しては、明細胞腺癌に有効な抗癌剤を有効量投与する。
漿液性腺癌や明細胞腺癌に有効な抗癌剤（例えば、パクリタキセル、シスプラチン、カルボプラチン、ドセタキセル）やその組み合わせ、投与方法、投与量等は公知であり、当業者であれば適宜、組織型に対応した化学療法を実施することができる。
3. 3. Kit 3-1 for differentiating whether the histological type is serous adenocarcinoma or clear cell adenocarcinoma in a test sample derived from an ovarian cancer patient. Overview Another aspect of the present invention is a reagent (differentiation reagent) for differentiating whether the tissue type is serous adenocarcinoma or clear cell adenocarcinoma. By applying the differential reagent of this embodiment to, for example, a sample derived from a subject suffering from ovarian cancer, it is possible to discriminate whether the subject's ovarian cancer is serous adenocarcinoma or clear cell adenocarcinoma. Can be done.
3-1-1. Composition The differential reagent of this embodiment contains a probe or primer set for detecting a transcript of a group of differential genes constituting a differential marker, that is, mRNA or cDNA. These specific configurations are described in the column of measurement process. For example, when detecting a transcript of four different gene groups constituting a differential marker, the differential kit can include four probe groups capable of detecting the transcript of the corresponding gene.
When the discrimination reagent of this embodiment is a probe as described above, the discrimination reagent can also be provided in the form of a DNA microarray or DNA microchip in which each probe is immobilized on a substrate. The material of the substrate on which each probe is fixed is not limited, but a glass plate, a quartz plate, a silicon wafer, or the like is usually used. The size of the substrate is, for example, 3.5 mm × 5.5 mm, 18 mm × 18 mm, 22 mm × 75 mm, etc., which can be set in various ways according to the number of spots of the probe and the size of the spots. .. The probe is usually 0.1 μg to 0.5 μg of nucleotides per spot. As a method for immobilizing a nucleotide, a method using the charge of the nucleotide to electrostatically bond it to a solid phase carrier surface-treated with a polycation such as polylysine, poly-L-lysine, polyethyleneimine, or polyalkylamine, or amino. Examples thereof include a method in which a nucleotide having a functional group such as an amino group, an aldehyde group, an SH group or a biotin is covalently bonded to a solid phase surface into which a functional group such as a group, an aldehyde group or an epoxy group has been introduced.
3-2. Effect By applying the differential kit of this embodiment to subjects with a history of ovarian cancer, it is possible to determine whether the ovarian cancer belongs to the histological type of serous adenocarcinoma or clear cell adenocarcinoma. It can be identified objectively and accurately.
The detection kit of the present invention may include other reagents necessary for the detection of the differential marker, such as a buffer or a secondary antibody, and instructions used for detection and result discrimination.
4. Therapeutic method based on the differentiation result As another aspect, the present invention is based on the differentiation result for a subject who has differentiated whether it is serous adenocarcinoma or clear cell adenocarcinoma by the differentiation method described above. To provide a therapeutic method for administering an anticancer drug.
That is, an effective amount of an anticancer agent effective for serous adenocarcinoma is administered to a subject identified as having serous adenocarcinoma by the differentiation method of the present invention. On the other hand, an effective amount of an anticancer agent effective for clear cell adenocarcinoma is administered to a subject who has been identified as clear cell adenocarcinoma by the differentiation method of the present invention.
Antineoplastic agents effective for serous adenocarcinoma and clear cell adenocarcinoma (for example, paclitaxel, cisplatin, carboplatin, docetaxel), combinations thereof, administration methods, dosages, etc. are known, and those skilled in the art appropriately respond to histological types. Chemotherapy can be performed.
（実施例１．RNA 調製）
卵巣癌患者のうち漿液性腺癌（３９検体）、または、明細胞腺癌（１８検体）に罹患する患者より、卵巣癌の一部を外科的に採取した。採取した手術検体は凍結用保存チューブに入れ、液体窒素で凍結させた。凍結検体は、ISOGEN（Nippon Gene Co., Ltd., Tokyo, Japan）を用いてtotal RNAを抽出した。125μg以上のtotal RNAを取得できたサンプルは引き続き、MicroPoly(A)purist Kit（Ambion, Austin, TX, USA）を用いてpoly(A)+RNAを精製した。
ヒト共通リファレンスRNAは、22種類のヒト癌細胞株（A431、A549、AKI、HBL-100、HeLa、HepG2、HL60、IMR-32、Jurkat、K562、KP4、MKN7、NK-92、Raji、RD、Saos-2、SK-N-MC、SW-13、T24、U251、U937およびY79）から抽出したtotal RNAまたは精製したpoly(A)+RNAを等量混合したものを使用した。total RNAを等量混合したもの、または、精製したpoly(A)+RNAを等量混合したもののいずれを共通リファレンスとして用いるかは、解析対象のサンプルの調製方法と一致させた。
(Example 1. RNA preparation)
A part of ovarian cancer was surgically collected from patients suffering from serous adenocarcinoma (39 samples) or clear cell adenocarcinoma (18 samples) among ovarian cancer patients. The collected surgical specimens were placed in a freezing storage tube and frozen in liquid nitrogen. For frozen samples, total RNA was extracted using ISOGEN (Nippon Gene Co., Ltd., Tokyo, Japan). Samples that were able to obtain total RNA of 125 μg or more were subsequently purified with poly (A) + RNA using the MicroPoly (A) purist Kit (Ambion, Austin, TX, USA).
22 human cancer cell lines (A431, A549, AKI, HBL-100, HeLa, HepG2, HL60, IMR-32, Jurkat, K562, KP4, MKN7, NK-92, Raji, RD, Total RNA extracted from Saos-2, SK-N-MC, SW-13, T24, U251, U937 and Y79) or an equal mixture of purified poly (A) + RNA was used. Whether to use an equal amount of total RNA or an equal amount of purified poly (A) + RNA as a common reference was consistent with the method for preparing the sample to be analyzed.
（実施例２．網羅的遺伝子発現解析）
poly(A)+RNAを用いた遺伝子発現プロファイル取得（「システム1」と名付ける）に使用するDNAマイクロアレイは、ヒト由来の転写産物に対応する31,797種類の合成DNA（80 mers）（MicroDiagnostic, Tokyo, Japan）をカスタムアレイヤーでスライドガラス上にアレイ化したものを用いた。一方、total RNAを用いた遺伝子発現プロファイル取得（「システム2」と名付ける）のためのDNAマイクロアレイは、ヒト由来の転写産物に対応する14,400種類の合成DNA（80 mers）（MicroDiagnostic）をカスタムアレイヤーでスライドガラス上にアレイ化したものを用いた。
検体由来のRNAは、システム1の場合は2μgのpoly(A)+RNAから、システム2の場合は5 μgのtotal RNAからSuperScript II（Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA）およびCyanine 5-dUTP（Perkin-Elmer Inc.）を用いて標識cDNAを合成した。同様に、ヒト共通リファレンスRNAは、2μgのpoly(A)+RNAまたは5μgのtotal RNAからSupreScript IIおよびCyanine 3-dUTP（Perkin-Elmer Inc.）を用いて標識cDNAを合成した。
マイクロアレイとのハイブリダイゼーションは、Labeling and Hybridization kit（MicroDiagonostic）を用いて行なった。
マイクロアレイとのハイブリダイゼーション後の蛍光強度は、GenePix 4000B Scanner（Axon Instruments, Inc., Union city, CA, USA）を用いて測定した。また、検体由来Cyanine-5標識cDNAの蛍光強度をヒト共通リファレンス由来Cyanine-3標識cDNAの蛍光強度で徐することにより発現比（検体由来Cyanine-5標識cDNAの蛍光強度／ヒト共通リファレンス由来Cyanine-3標識cDNAの蛍光強度）を算出した。さらに、GenePix Pro 3.0 software（Axon Instruments, Inc.,）を用いて、算出した発現比にノーマライゼーションファクターを乗じてノーマライズを行なった。次に発現比をLog2に変換し、変換した値をLog2比（Log2 ratio）と名付けた。なお、発現比の変換はExcel software（Microsoft, Bellevue, WA, USA）およびMDI gene expression analysis software package（MicroDiagnostic）を用いて行なった。
(Example 2. Comprehensive gene expression analysis)
The DNA microarray used for gene expression profile acquisition using poly (A) + RNA (named "System 1") is a combination of 31,797 synthetic DNAs (80 mers) (MicroDiagnostic, Tokyo,) corresponding to human-derived transcripts. Japan) was used as an array on a slide glass with a custom layer. On the other hand, the DNA microarray for gene expression profile acquisition (named "
Specimen-derived RNA is from 2 μg poly (A) + RNA for
Hybridization with a microarray was performed using a Labeling and Hybridization kit (MicroDiagonostic).
The fluorescence intensity after hybridization with the microarray was measured using a GenePix 4000B Scanner (Axon Instruments, Inc., Union city, CA, USA). In addition, the expression ratio (fluorescence intensity of Cyanine-5-labeled cDNA derived from the sample / Cyanine- derived from the common reference for humans) was increased by gradually adjusting the fluorescence intensity of the Cyanine-5-labeled cDNA derived from the sample to the fluorescence intensity of the Cyanine-3 labeled cDNA derived from the human common reference. Fluorescence intensity of 3-labeled cDNA) was calculated. Furthermore, using GenePix Pro 3.0 software (Axon Instruments, Inc.,), the calculated expression ratio was multiplied by the normalization factor for normalization. Next, the expression ratio was converted to Log2, and the converted value was named the Log2 ratio. The expression ratio was converted using Excel software (Microsoft, Bellevue, WA, USA) and MDI gene expression analysis software package (MicroDiagnostic).
（実施例３．統計分析）
漿液性腺癌と明細胞腺癌とを鑑別可能なマーカー遺伝子候補を絞り込むため、漿液性腺癌由来の検体と明細胞腺癌由来の検体とにおけるLog2比のデータを用いて次のi)〜iii)の順にデータ処理を行なった。
i) 漿液性腺癌39検体および明細胞腺癌18検体のうち1検体以上で蛍光強度が検出限界以下の遺伝子を除いた
ii) スチューデントのt検定（両側検定）によって漿液性腺癌群と明細胞腺癌群の統計的な差を検定し、有意と判断したp<1.0×10-5に該当する遺伝子を抽出した
iii) 遺伝子ごとに、漿液性腺癌群および明細胞腺癌群におけるLog2比の平均値を算出した。漿液性腺癌群と明細胞腺癌群との平均値の差の絶対値が、2.0以上の29遺伝子を鑑別マーカー遺伝子候補として抽出した。全検体を用いて、抽出した29遺伝子の発現レベルを測定し、クラスタ分析を行なった。なお、全検体における29遺伝子の発現レベルの結果を表４〜９に示す。また、クラスタ分析はExpressionView Pro software（MicroDiagnostic）を用い、ユークリッド距離による群平均法にて行なった。クラスタ分析の結果を図１に記載する。図１に示すように、抽出した29遺伝子の発現プロファイルに基づいて階層的クラスタ分析を行ったところ、漿液性腺癌群を主とするクラスタと明細胞腺癌群を主とするクラスタの２つのクラスタを形成した。
In order to narrow down the marker gene candidates that can distinguish between serous adenocarcinoma and clear cell adenocarcinoma, the following i) to iii) are used using the Log2 ratio data between the sample derived from serous adenocarcinoma and the sample derived from clear cell adenocarcinoma. Data processing was performed in the order of.
i) Genes with fluorescence intensity below the detection limit were excluded from 1 or more of 39 serous adenocarcinoma and 18 clear cell adenocarcinoma.
ii) The statistical difference between the serous adenocarcinoma group and the clear cell adenocarcinoma group was tested by Student's t-test (two-sided test), and the genes corresponding to p <1.0 × 10 -5 judged to be significant were extracted.
iii) For each gene, the average Log2 ratio in the serous adenocarcinoma group and the clear cell adenocarcinoma group was calculated. Twenty-nine genes with an absolute difference between the mean values of the serous adenocarcinoma group and the clear cell adenocarcinoma group of 2.0 or more were extracted as differential marker gene candidates. Using all the samples, the expression levels of the extracted 29 genes were measured and cluster analysis was performed. The results of the expression levels of 29 genes in all the samples are shown in Tables 4-9. The cluster analysis was performed by the Euclidean distance group averaging method using ExpressionView Pro software (MicroDiagnostic). The results of the cluster analysis are shown in FIG. As shown in FIG. 1, when a hierarchical cluster analysis was performed based on the expression profile of the extracted 29 genes, two clusters, a cluster mainly composed of serous adenocarcinoma group and a cluster mainly composed of clear cell adenocarcinoma group, were performed. Formed.
（実施例４．Construction of gene expression scoring system）
鑑別マーカー候補29遺伝子を利用した漿液性腺癌と明細胞腺癌とを区別するスコアリングシステムの構築を試みた。最初に、鑑別マーカー候補29遺伝子のうち、明細胞腺癌群でLog2比が低い5遺伝子（LRIG-1, LYPD1, CRIP1, UQCRH, IGF2）について、−1を乗じて＋に反転した。数値を反転した5遺伝子と残りの24遺伝子のLog2比を総和して検体毎にスコアの合計値を算出した。左からスコア値の小さい順に並べ替えてスコアリングシステムとした（図２）。スコアリングシステムの診断精度を検証するために、ROC（Receiver Operating Characteristic curve）曲線を用いて、ROC曲線下面積（AUC:area under the curve）を求めた（図３）。また、感度・特異度曲線を作成し、至適カットオフ値を求めた（図３）。また、症例別に群散布図を作成した（図４）。ROC曲線、群散布図の作成はStatFlex ver.6.0 software（Artech Co., Ltd., Osaka, Japan）を用いて行ない、至適カットオフ値の設定は、感度と特異度の和が最大となる値とした（以下、至適カットオフ値の設定は同様とした）。その結果、群散布図において、漿液性腺癌群または明細胞腺癌群のそれぞれの組織型卵巣癌に属する検体の合計値の平均を組織型ごとに求めたところ、漿液性腺癌は合計値の平均値が1.9487となり、一方で明細胞腺癌の合計値の平均値が74.9497となり、互いの群は、P=2.1488×10-10で有意差を有していた。
このように、漿液性腺癌と明細胞腺癌とでは、上記に列挙した鑑別マーカー候補遺伝子である29遺伝子の発現プロファイルの合計値に有意な差を有しており、これらの遺伝子の組み合わせにおける発現プロファイルを測定・比較することで、対象となる卵巣癌試料がいずれの組織型であるのか鑑別することができる。
また、ROC曲線において、AUCは0.9444となり、また、感度・特異度曲線においては、至適カットオフ値は19.2648に定まり、このとき感度および特異度は89.7%となった（図３）。
(Example 4. Construction of gene expression scoring system)
We attempted to construct a scoring system that distinguishes between serous adenocarcinoma and clear cell adenocarcinoma using 29 differential marker candidates. First, among the 29 differential marker candidate genes, 5 genes (LRIG-1, LYPD1, CRIP1, UQCRH, IGF2) with a low Log2 ratio in the clear cell adenocarcinoma group were multiplied by -1 and inverted to +. The total score was calculated for each sample by summing up the Log2 ratios of the 5 genes with inverted values and the remaining 24 genes. The scoring system was created by rearranging from the left in ascending order of score value (Fig. 2). In order to verify the diagnostic accuracy of the scoring system, the area under the curve (AUC) was calculated using the ROC (Receiver Operating Characteristic curve) curve (Fig. 3). In addition, a sensitivity / specificity curve was created and the optimum cutoff value was obtained (Fig. 3). In addition, a group scatter plot was created for each case (Fig. 4). The ROC curve and group scatter plot are created using StatFlex ver.6.0 software (Artech Co., Ltd., Osaka, Japan), and the optimum cutoff value is set to maximize the sum of sensitivity and specificity. It was set as a value (hereinafter, the setting of the optimum cutoff value was the same). As a result, in the group scatter chart, the average of the total values of the specimens belonging to each histological type ovarian cancer of the serous adenocarcinoma group or the clear cell adenocarcinoma group was obtained for each histological type. The value was 1.9487, while the average total value of clear cell adenocarcinoma was 74.9497, and the groups had a significant difference at P = 2.1488 × 10 -10.
As described above, there is a significant difference in the total expression profile of 29 genes, which are the differential marker candidate genes listed above, between serous adenocarcinoma and clear cell adenocarcinoma, and the expression in the combination of these genes is significant. By measuring and comparing the profiles, it is possible to distinguish which histological type the target ovarian cancer sample has.
In the ROC curve, the AUC was 0.9444, and in the sensitivity / specificity curve, the optimum cutoff value was set to 19.2648, at which time the sensitivity and specificity were 89.7% (Fig. 3).
（実施例５．遺伝子セットの検討１）
上記実施例において、鑑別マーカー候補29遺伝子は、漿液性腺癌と明細胞腺癌とで発現に有意な差を有する遺伝子群であることを見出した。よって、これらの遺伝子のいずれかを用いることで、漿液性腺癌と明細胞腺癌群とのどちらの組織型卵巣癌に属するかを鑑別することが可能である。そこで、少なくとも、いくつの遺伝子の組み合わせを用いれば漿液性腺癌と明細胞腺癌とを高い感度および特異度で区別可能であるのかについて検討した。
まず、鑑別マーカー候補29遺伝子について、遺伝子発現スコアを下記のようにして算出した。すなわち、上記実施例２で得られた各遺伝子のLog2比について、漿液性腺癌群または明細胞腺癌群のそれぞれの組織型サンプル群ごとに平均値を算出した。次に、算出した各遺伝子のLog2比の平均値について、漿液性腺癌群と明細胞腺癌群との間で差（絶対値）を求めた。この差（絶対値）を、各遺伝子の「遺伝子発現スコア」とした。各遺伝子の「遺伝子発現スコア」を下記表１０に示す。
In the above example, it was found that the 29 differential marker candidate genes are a group of genes having a significant difference in expression between serous adenocarcinoma and clear cell adenocarcinoma. Therefore, by using any of these genes, it is possible to distinguish between serous adenocarcinoma and clear cell adenocarcinoma group, which belongs to histological ovarian cancer. Therefore, at least how many gene combinations can be used to distinguish between serous adenocarcinoma and clear cell adenocarcinoma with high sensitivity and specificity.
First, the gene expression scores of the 29 differential marker candidates were calculated as follows. That is, for the Log 2 ratio of each gene obtained in Example 2 above, an average value was calculated for each histological sample group of the serous adenocarcinoma group or the clear cell adenocarcinoma group. Next, the difference (absolute value) between the serous adenocarcinoma group and the clear cell adenocarcinoma group was calculated for the calculated average value of the Log 2 ratio of each gene. This difference (absolute value) was used as the "gene expression score" of each gene. The "gene expression score" of each gene is shown in Table 10 below.
次に、前記２９遺伝子の中からより鑑別に有用かつばらつきの少ない遺伝子群を特定するために、漿液性腺癌群の標準偏差が1未満、かつ、明細胞腺癌群の標準偏差が1.5未満である遺伝子群（７遺伝子）を抽出した（表１１）。図５に示すように、抽出した７遺伝子の発現プロファイルに基づいて階層的クラスタ分析を行ったところ、漿液性腺癌群を主とするクラスタと明細胞腺癌群を主とするクラスタの２つのクラスタを形成した。また、７遺伝子のスコア値を算出しスコア値の高い順に並び替えた（図６）。さらに、７遺伝子のLog2比の合計値を求め、その分布を群散布図として作図した（図７）。Log2比の合計値を算出する際、LRIG-1、LYPD1、CRIP1、UQCRH、IGF2の5遺伝子のLog2比については−1を乗じて反転した値を求め、反転した値と他の遺伝子のLog2比との合計値を算出した（なお、以下の実施例においても同様に、Log2比の合計値を算出する際、LRIG-1、LYPD1、CRIP1、UQCRH、IGF2の5遺伝子のLog2比については−1を乗じて反転した値を用いた）。漿液性腺癌群または明細胞腺癌群のそれぞれの組織型卵巣癌に属する検体の合計値の平均を組織型ごとに求めたところ、漿液性腺癌は合計値の平均値が−1.6402となり、一方で明細胞腺癌の合計値の平均値が13.6458となり、互いの群は、P=1.1607×10-10で有意差を有していた。また、ROC曲線において、AUCは0.9573となり、また、感度・特異度曲線において至適カットオフ値は3.5717に定まり、このとき感度および特異度は89.7%となった（図８）。
次に、前記７遺伝子の中から遺伝子発現スコアの高かったものから遺伝子を複数個選択していき、実施例４で得られたデータに基づき、感度および特異度が89％以上となるカットオフ値を設定可能な最低個数の遺伝子の組み合わせを求めた。
その結果、前記７遺伝子の中から遺伝子発現スコアの高かった順に、GLRX遺伝子、GDF15遺伝子およびGABARAPL1遺伝子の３つの遺伝子を選択することで、上記条件を満たすことを見出した。漿液性腺癌群および明細胞腺癌群に属する各検体についてGLRX遺伝子、GDF15遺伝子およびGABARAPL1遺伝子の３つの遺伝子のLog2比の合計値を求め、その分布を群散布図として作図した（図９）。漿液性腺癌群または明細胞腺癌群のそれぞれの組織型卵巣がんに属する検体の合計値の平均を組織型ごとに求めたところ、漿液性腺癌は合計値の平均値が−1.9373となり、一方で明細胞腺癌の合計値の平均値が5.0687となり、互いの群は、P=4.129×10-10で有意差を有していた。
また、ROC曲線において、AUCは0.9573となり、また、感度・特異度曲線においては、至適カットオフ値は1.3432に定まり、このとき感度および特異度は89.7%となった（図１０）。
このように、漿液性腺癌と明細胞腺癌とでは、GLRX遺伝子、GDF15遺伝子およびGABARAPL1遺伝子の発現レベルの合計値に有意な差を有しており、これらの遺伝子の組み合わせにおける発現レベルを測定することで、対象となる卵巣癌試料がいずれの組織型であるのか鑑別することができる。
Next, a plurality of genes having a high gene expression score were selected from the above 7 genes, and based on the data obtained in Example 4, a cutoff value having a sensitivity and specificity of 89% or more was obtained. The minimum number of gene combinations that can be set was determined.
As a result, it was found that the above conditions were satisfied by selecting three genes, GLRX gene, GDF15 gene and GABARAPL1 gene, in descending order of gene expression score from the above seven genes. For each sample belonging to the serous adenocarcinoma group and the clear cell adenocarcinoma group, the total value of the Log 2 ratios of the three genes GLRX gene, GDF15 gene and GABARAPL1 gene was obtained, and the distribution was plotted as a group scatter plot (Fig. 9). .. When the average of the total values of the specimens belonging to each histological ovarian cancer in the serous adenocarcinoma group or the clear cell adenocarcinoma group was calculated for each histological type, the average value of the total values for serous adenocarcinoma was -1.9373, while The average value of the total values of clear cell adenocarcinoma was 5.0687, and the groups had a significant difference at P = 4.129 × 10 -10.
In the ROC curve, the AUC was 0.9573, and in the sensitivity / specificity curve, the optimum cutoff value was set at 1.3432, at which time the sensitivity and specificity were 89.7% (Fig. 10).
Thus, there is a significant difference in the total expression levels of the GLRX gene, GDF15 gene and GABARAPL1 gene between serous adenocarcinoma and clear cell adenocarcinoma, and the expression level in the combination of these genes is measured. Therefore, it is possible to distinguish which histological type the target ovarian cancer sample has.
（実施例６．遺伝子セットAの検討２）
次に、実施例５と同様の高い確度で漿液性腺癌と明細胞腺癌とを鑑別可能な他の遺伝子の組み合わせについて検討した。
複数個の遺伝子の組み合わせの選択は、上記実施例５に記載する「遺伝子発現スコア」に基づいて行った。具体的には、GLRX遺伝子、GDF15遺伝子およびGABARAPL1遺伝子の３つの遺伝子の「遺伝子発現スコア」の合計である7.006以上となる値を基準に、鑑別マーカー候補29遺伝子から複数個の遺伝子を選択した。
遺伝子発現スコアの合計が7.006以上となるように、LYPD1遺伝子、CRIP1遺伝子、LRIG1遺伝子およびA4GALT遺伝子を選択し（遺伝子発現スコアの合計は8.637832）、これらの遺伝子発現の測定結果より、漿液性腺癌と明細胞腺癌とを鑑別可能であるか検証した。
具体的には、漿液性腺癌群および明細胞腺癌群に属する各検体についてLYPD1遺伝子、CRIP1遺伝子、LRIG1遺伝子およびA4GALT遺伝子のLog2比の合計値を求め、その分布を群散布図として作図した（図１１）。漿液性腺癌群または明細胞腺癌群のそれぞれの組織型卵巣癌に属する検体の合計値の平均を組織型ごとに求めたところ、漿液性腺癌は合計値の平均値が-3.4530となり、一方で明細胞腺癌の合計値の平均値が5.1849となり、互いの群は、P=6.128×10-12で有意差を有していた。
また、ROC曲線において、AUCは0.9501となり、また、感度・特異度曲線において至適カットオフ値は2.2401に定まり、このとき感度および特異度は94.4%となった（図１２）。
また、LYPD1遺伝子、CRIP1遺伝子、LRIG1遺伝子およびA4GALT遺伝子の発現プロファイルに基づいて階層的クラスタ分析を行ったところ、漿液性腺癌群を主とするクラスタと明細胞腺癌群を主とするクラスタの２つのクラスタを形成し、２９遺伝子（実施例３）や７遺伝子（実施例５）の発現プロファイルに基づく階層的クラスタ分析とほぼ同様の結果を得ることができた。
このように、漿液性腺癌と明細胞腺癌とでは、LYPD1遺伝子、CRIP1遺伝子、LRIG1遺伝子およびA4GALT遺伝子の発現レベルの合計値に有意な差を有しており、これらの遺伝子の組み合わせにおける発現レベルを測定することで、対象となる卵巣癌試料がいずれの組織型であるのか鑑別することができる。
(Example 6. Examination of gene set A 2)
Next, a combination of other genes capable of distinguishing serous adenocarcinoma and clear cell adenocarcinoma with the same high accuracy as in Example 5 was examined.
The selection of the combination of a plurality of genes was performed based on the "gene expression score" described in Example 5 above. Specifically, a plurality of genes were selected from 29 differential marker candidates based on a value of 7.006 or higher, which is the total of the "gene expression scores" of the three genes, the GLRX gene, the GDF15 gene, and the GABARAPL1 gene.
Select the LYPD1 gene, CRIP1 gene, LRIG1 gene and A4GALT gene so that the total gene expression score is 7.006 or higher (total gene expression score is 8.637732). It was verified whether it could be distinguished from clear cell adenocarcinoma.
Specifically, the total value of the Log 2 ratios of the LYPD1 gene, CRIP1 gene, LRIG1 gene and A4GALT gene was obtained for each sample belonging to the serous adenocarcinoma group and the clear cell adenocarcinoma group, and the distribution was plotted as a group scatter plot. (Fig. 11). When the average of the total values of the specimens belonging to each histological ovarian cancer in the serous adenocarcinoma group or the clear cell adenocarcinoma group was calculated for each histological type, the average value of the total values of serous adenocarcinoma was -3.4530, while the average value was -3.4530. The average total value of clear cell adenocarcinoma was 5.1849, and the groups had a significant difference at P = 6.128 × 10 -12.
In the ROC curve, the AUC was 0.9501, and in the sensitivity / specificity curve, the optimum cutoff value was set to 2.2401. At this time, the sensitivity and specificity were 94.4% (Fig. 12).
In addition, a hierarchical cluster analysis was performed based on the expression profiles of the LYPD1 gene, CRIP1 gene, LRIG1 gene, and A4GALT gene. Two clusters were formed, and almost the same results as the hierarchical cluster analysis based on the expression profiles of 29 genes (Example 3) and 7 genes (Example 5) could be obtained.
Thus, there is a significant difference in the total expression levels of the LYPD1 gene, CRIP1 gene, LRIG1 gene and A4GALT gene between serous adenocarcinoma and clear cell adenocarcinoma, and the expression level in the combination of these genes. By measuring, it is possible to distinguish which histological type the target ovarian cancer sample has.
（実施例７．遺伝子セットBの検討３）
また、高い確度で漿液性腺癌と明細胞腺癌とを鑑別可能な他の遺伝子の組み合わせについても検討した。
遺伝子発現スコアの合計が7.006以上となるように、ANXA4遺伝子、LAMB1遺伝子およびAPOL1遺伝子を選択し（遺伝子発現スコアの合計は7.648277）、これらの遺伝子発現の測定結果より、漿液性腺癌と明細胞腺癌とを鑑別可能であるか検証した。
具体的には、漿液性腺癌群および明細胞腺癌群に属する各検体についてANXA4遺伝子、LAMB1遺伝子およびAPOL1遺伝子のLog2比の合計値を求め、その分布を群散布図として作図した（図１３）。漿液性腺癌群または明細胞腺癌群のそれぞれの組織型卵巣癌に属する検体の合計値の平均を組織型ごとに求めたところ、漿液性腺癌は合計値の平均値が0.9036となり、一方で明細胞腺癌の合計値の平均値が8.5519となり、互いの群は、P=2.685×10-10で有意差を有していた。
また、ROC曲線において、AUCは0.9331となり、また、感度・特異度曲線においては、至適カットオフ値は5.2992に定まり、このとき感度および特異度は88.9%となった（図１４）。
また、ANXA4遺伝子、LAMB1遺伝子およびAPOL1遺伝子の発現プロファイルに基づいて階層的クラスタ分析を行ったところ、漿液性腺癌群を主とするクラスタと明細胞腺癌群を主とするクラスタの２つのクラスタを形成し、２９遺伝子（実施例３）や７遺伝子（実施例５）の発現プロファイルに基づく階層的クラスタ分析とほぼ同様の結果を得ることができた。
このように、漿液性腺癌と明細胞腺癌とでは、ANXA4遺伝子、LAMB1遺伝子およびAPOL1遺伝子の発現レベルの合計値に有意な差を有しており、これらの遺伝子の組み合わせにおける発現レベルを測定することで、対象となる卵巣癌試料がいずれの組織型であるのか鑑別することができる。
(Example 7. Examination of gene set B 3)
We also investigated combinations of other genes that can distinguish serous adenocarcinoma from clear cell adenocarcinoma with high accuracy.
Select the ANXA4 gene, LAMB1 gene and APOL1 gene so that the total gene expression score is 7.006 or higher (total gene expression score is 7.648277), and based on the measurement results of these gene expressions, serous adenocarcinoma and clear cell adenocarcinoma It was verified whether it could be distinguished from cancer.
Specifically, the total value of the Log 2 ratios of the ANXA4 gene, LAMB1 gene and APOL1 gene was obtained for each sample belonging to the serous adenocarcinoma group and the clear cell adenocarcinoma group, and the distribution was plotted as a group scatter plot (Fig. 13). ). When the average of the total values of the specimens belonging to each histological ovarian cancer in the serous adenocarcinoma group or the clear cell adenocarcinoma group was calculated for each histological type, the average value of the total values of serous adenocarcinoma was 0.9036, while it was clear. The average total value of cell adenocarcinoma was 8.5519, and the groups had a significant difference at P = 2.685 × 10 -10.
In the ROC curve, the AUC was 0.9331, and in the sensitivity / specificity curve, the optimum cutoff value was set to 5.2992, at which time the sensitivity and specificity were 88.9% (Fig. 14).
In addition, when a hierarchical cluster analysis was performed based on the expression profiles of the ANXA4 gene, LAMB1 gene, and APOL1 gene, two clusters, a cluster mainly composed of serous adenocarcinoma group and a cluster mainly composed of clear cell adenocarcinoma group, were found. It was formed, and almost the same results as the hierarchical cluster analysis based on the expression profiles of 29 genes (Example 3) and 7 genes (Example 5) could be obtained.
Thus, there is a significant difference in the total expression levels of the ANXA4 gene, LAMB1 gene and APOL1 gene between serous adenocarcinoma and clear cell adenocarcinoma, and the expression level in the combination of these genes is measured. Therefore, it is possible to distinguish which histological type the target ovarian cancer sample has.
（実施例８．遺伝子セットCの検討４）
また、高い確度で漿液性腺癌と明細胞腺癌とを鑑別可能な他の遺伝子の組み合わせについても検討した。
遺伝子発現スコアの合計が7.006以上となるように、FXYD2遺伝子、GPX3遺伝子およびTMEM101遺伝子を選択し（遺伝子発現スコアの合計は9.911373）、これらの遺伝子発現の測定結果より、漿液性腺癌と明細胞腺癌とを鑑別可能であるか検証した。
具体的には、漿液性腺癌群および明細胞腺癌群に属する各検体についてFXYD2遺伝子、GPX3遺伝子およびTMEM101遺伝子のLog2比の合計値を求め、その分布を群散布図として作図した（図１５）。漿液性腺癌群または明細胞腺癌群のそれぞれの組織型卵巣癌に属する検体の合計値の平均を組織型ごとに求めたところ、漿液性腺癌は合計値の平均値が0.3106となり、一方で明細胞腺癌の合計値の平均値が10.2220となり、互いの群は、P=2.782×10-8で有意差を有していた。
また、ROC曲線において、AUCは0.9331となり、また、感度・特異度曲線においては、至適カットオフ値は3.6064に定まり、このとき感度および特異度は88.9%となった（図１４）。
また、 FXYD2遺伝子、GPX3遺伝子およびTMEM101遺伝子の発現プロファイルに基づいて階層的クラスタ分析を行ったところ、漿液性腺癌群を主とするクラスタと明細胞腺癌群を主とするクラスタの２つのクラスタを形成し、２９遺伝子（実施例３）や７遺伝子（実施例５）の発現プロファイルに基づく階層的クラスタ分析とほぼ同様の結果を得ることができた。
このように、漿液性腺癌と明細胞腺癌とでは、FXYD2遺伝子、GPX3遺伝子およびTMEM101遺伝子の発現レベルの合計値に有意な差を有しており、これらの遺伝子の組み合わせにおける発現レベルを測定することで、対象となる卵巣癌試料がいずれの組織型であるのか鑑別することができる。
(Example 8. Examination of gene set C 4)
We also investigated combinations of other genes that can distinguish serous adenocarcinoma from clear cell adenocarcinoma with high accuracy.
Select the FXYD2 gene, GPX3 gene and TMEM101 gene so that the total gene expression score is 7.006 or higher (total gene expression score is 9.911373), and based on the measurement results of these gene expressions, serous adenocarcinoma and clear cell adenocarcinoma. It was verified whether it could be distinguished from cancer.
Specifically, the total value of the Log 2 ratios of the FXYD2 gene, GPX3 gene, and TMEM101 gene was obtained for each sample belonging to the serous adenocarcinoma group and the clear cell adenocarcinoma group, and the distribution was plotted as a group scatter plot (Fig. 15). ). When the average of the total values of the specimens belonging to each histological ovarian cancer in the serous adenocarcinoma group or the clear cell adenocarcinoma group was calculated for each histological type, the average value of the total values of serous adenocarcinoma was 0.3106, while it was clear. The average total value of cell adenocarcinoma was 10.2220, and the groups had a significant difference at P = 2.782 × 10 -8.
In the ROC curve, the AUC was 0.9331, and in the sensitivity / specificity curve, the optimum cutoff value was set to 3.6064, and at this time, the sensitivity and specificity were 88.9% (Fig. 14).
In addition, when a hierarchical cluster analysis was performed based on the expression profiles of the FXYD2 gene, GPX3 gene, and TMEM101 gene, two clusters, a cluster mainly composed of serous adenocarcinoma group and a cluster mainly composed of clear cell adenocarcinoma group, were found. It was formed, and almost the same results as the hierarchical cluster analysis based on the expression profiles of 29 genes (Example 3) and 7 genes (Example 5) could be obtained.
Thus, there is a significant difference in the total expression levels of the FXYD2 gene, GPX3 gene and TMEM101 gene between serous adenocarcinoma and clear cell adenocarcinoma, and the expression level in the combination of these genes is measured. Therefore, it is possible to distinguish which histological type the target ovarian cancer sample has.
（実施例９．遺伝子セットDの検討５）
また、高い確度で漿液性腺癌と明細胞腺癌とを鑑別可能な他の遺伝子の組み合わせについても検討した。
遺伝子発現スコアの合計が7.006以上となるように、DLX5遺伝子、UQCRH遺伝子およびARG2遺伝子を選択し（遺伝子発現スコアの合計は7.541611）、これらの遺伝子発現の測定結果より、漿液性腺癌と明細胞腺癌とを鑑別可能であるか検証した。
具体的には、漿液性腺癌群および明細胞腺癌群に属する各検体についてDLX5遺伝子、UQCRH遺伝子およびARG2遺伝子のLog2比の合計値を求め、その分布を群散布図として作図した（図１７）。漿液性腺癌群または明細胞腺癌群のそれぞれの組織型卵巣癌に属する検体の合計値の平均を組織型ごとに求めたところ、漿液性腺癌は合計値の平均値が0.26930となり、一方で明細胞腺癌の合計値の平均値が7.8109となり、互いの群は、P=3.901×10-10で有意差を有していた。
また、ROC曲線において、AUCは0.9388となり、また、感度・特異度曲線においては、至適カットオフ値は4.0090に定まり、このとき感度および特異度は88.9%となった（図１８）。
また、DLX5遺伝子、UQCRH遺伝子およびARG2遺伝子の発現プロファイルに基づいて階層的クラスタ分析を行ったところ、漿液性腺癌群を主とするクラスタと明細胞腺癌群を主とするクラスタの２つのクラスタを形成し、２９遺伝子（実施例３）や７遺伝子（実施例５）の発現プロファイルに基づく階層的クラスタ分析とほぼ同様の結果を得ることができた。
このように、漿液性腺癌と明細胞腺癌とでは、DLX5遺伝子、UQCRH遺伝子およびARG2遺伝子の発現レベルの合計値に有意な差を有しており、これらの遺伝子の組み合わせにおける発現レベルを測定することで、対象となる卵巣癌試料がいずれの組織型であるのか鑑別することができる。
(Example 9. Examination of gene set D 5)
We also investigated combinations of other genes that can distinguish serous adenocarcinoma from clear cell adenocarcinoma with high accuracy.
Select the DLX5 gene, UQCRH gene, and ARG2 gene so that the total gene expression score is 7.006 or higher (total gene expression score is 7.541611), and based on the measurement results of these gene expressions, serous adenocarcinoma and clear cell adenocarcinoma. It was verified whether it could be distinguished from cancer.
Specifically, the total value of the Log 2 ratios of the DLX5 gene, UQCRH gene, and ARG2 gene was obtained for each sample belonging to the serous adenocarcinoma group and the clear cell adenocarcinoma group, and the distribution was plotted as a group scatter plot (Fig. 17). ). When the average of the total values of the specimens belonging to each histological ovarian cancer in the serous adenocarcinoma group or the clear cell adenocarcinoma group was calculated for each histological type, the average value of the total values of serous adenocarcinoma was 0.26930, while it was clear. The average total value of cell adenocarcinoma was 7.8109, and the groups had a significant difference at P = 3.901 × 10 -10.
In the ROC curve, the AUC was 0.9388, and in the sensitivity / specificity curve, the optimum cutoff value was set to 4.0090, and at this time, the sensitivity and specificity were 88.9% (Fig. 18).
In addition, when a hierarchical cluster analysis was performed based on the expression profiles of the DLX5 gene, UQCRH gene, and ARG2 gene, two clusters, a cluster mainly composed of serous adenocarcinoma group and a cluster mainly composed of clear cell adenocarcinoma group, were found. It was formed, and almost the same results as the hierarchical cluster analysis based on the expression profiles of 29 genes (Example 3) and 7 genes (Example 5) could be obtained.
Thus, there is a significant difference in the total expression levels of the DLX5 gene, UQCRH gene, and ARG2 gene between serous adenocarcinoma and clear cell adenocarcinoma, and the expression level in the combination of these genes is measured. Therefore, it is possible to distinguish which histological type the target ovarian cancer sample has.
（実施例１０．遺伝子セットEの検討６）
また、高い確度で漿液性腺癌と明細胞腺癌とを鑑別可能な他の遺伝子の組み合わせについても検討した。
遺伝子発現スコアの合計が7.006以上となるように、FBLN1遺伝子、AOC1遺伝子およびTSPAN1遺伝子を選択し（遺伝子発現スコアの合計は8.076977）、これらの遺伝子発現の測定結果より、漿液性腺癌と明細胞腺癌とを鑑別可能であるか検証した。
具体的には、漿液性腺癌群および明細胞腺癌群に属する各検体についてFBLN1遺伝子、AOC1遺伝子およびTSPAN1遺伝子のLog2比の合計値を求め、その分布を群散布図として作図した（図１９）。漿液性腺癌群または明細胞腺癌群のそれぞれの組織型卵巣癌に属する検体の合計値の平均を組織型ごとに求めたところ、漿液性腺癌は合計値の平均値が-1.8339となり、一方で明細胞腺癌の合計値の平均値が6.0301となり、互いの群は、P=3.829×10-7で有意差を有していた。
また、ROC曲線において、AUCは0.88178となり、また、感度・特異度曲線においては、至適カットオフ値は0.3689に定まり、このとき感度および特異度は82.1%となった（図２０）。
また、FBLN1遺伝子、AOC1遺伝子およびTSPAN1遺伝子の発現プロファイルに基づいて階層的クラスタ分析を行ったところ、漿液性腺癌群を主とするクラスタと明細胞腺癌群を主とするクラスタの２つのクラスタを形成し、２９遺伝子（実施例３）や７遺伝子（実施例５）の発現プロファイルに基づく階層的クラスタ分析とほぼ同様の結果を得ることができた。
このように、漿液性腺癌と明細胞腺癌とでは、FBLN1遺伝子、AOC1遺伝子およびTSPAN1遺伝子の発現レベルの合計値に有意な差を有しており、これらの遺伝子の組み合わせにおける発現レベルを測定することで、対象となる卵巣癌試料がいずれの組織型であるのか鑑別することができる。
(Example 10. Examination of gene set E 6)
We also investigated combinations of other genes that can distinguish serous adenocarcinoma from clear cell adenocarcinoma with high accuracy.
Select the FBLN1 gene, AOC1 gene and TSPAN1 gene so that the total gene expression score is 7.006 or higher (total gene expression score is 8.076977), and based on the measurement results of these gene expressions, serous adenocarcinoma and clear cell adenocarcinoma. It was verified whether it could be distinguished from cancer.
Specifically, the total value of the Log 2 ratios of the FBL N1 gene, AOC1 gene, and TSPAN1 gene was obtained for each sample belonging to the serous adenocarcinoma group and the clear cell adenocarcinoma group, and the distribution was plotted as a group scatter plot (Fig. 19). ). When the average of the total values of the specimens belonging to each histological ovarian cancer in the serous adenocarcinoma group or the clear cell adenocarcinoma group was calculated for each histological type, the average value of the total values of serous adenocarcinoma was -1.8339, while the average value was -1.8339. The average total value of clear cell adenocarcinoma was 6.0301, and the groups had a significant difference at P = 3.829 × 10 -7.
In the ROC curve, the AUC was 0.88178, and in the sensitivity / specificity curve, the optimum cutoff value was set to 0.3689, and at this time, the sensitivity and specificity were 82.1% (Fig. 20).
In addition, when a hierarchical cluster analysis was performed based on the expression profiles of the FBLN1 gene, AOC1 gene, and TSPAN1 gene, two clusters, a cluster mainly composed of serous adenocarcinoma group and a cluster mainly composed of clear cell adenocarcinoma group, were found. It was formed, and almost the same results as the hierarchical cluster analysis based on the expression profiles of 29 genes (Example 3) and 7 genes (Example 5) could be obtained.
Thus, there is a significant difference in the total expression levels of the FBLN1 gene, AOC1 gene and TSPAN1 gene between serous adenocarcinoma and clear cell adenocarcinoma, and the expression level in the combination of these genes is measured. Therefore, it is possible to distinguish which histological type the target ovarian cancer sample has.
（実施例１１．遺伝子セットFの検討７）
また、高い確度で漿液性腺癌と明細胞腺癌とを鑑別可能な他の遺伝子の組み合わせについても検討した。
遺伝子発現スコアの合計が7.006以上となるように、C12orf75遺伝子、DNER遺伝子およびRIMKLB遺伝子を選択し（遺伝子発現スコアの合計は8.127428）、これらの遺伝子発現の測定結果より、漿液性腺癌と明細胞腺癌とを鑑別可能
であるか検証した。
具体的には、漿液性腺癌群および明細胞腺癌群に属する各検体についてC12orf75遺伝子、DNER遺伝子およびRIMKLB遺伝子のLog2比の合計値を求め、その分布を群散布図として作図した（図２１）。漿液性腺癌群または明細胞腺癌群のそれぞれの組織型卵巣癌に属する検体の合計値の平均を組織型ごとに求めたところ、漿液性腺癌は合計値の平均値が-1.3507となり、一方で明細胞腺癌の合計値の平均値が6.7768となり、互いの群は、P=1.245×10-8で有意差を有していた。
また、ROC曲線において、AUCは0.8803となり、また、感度・特異度曲線においては、至適カットオフ値は1.1226に定まり、このとき感度および特異度は88.9%となった（図２２）。
また、C12orf75遺伝子、DNER遺伝子およびRIMKLB遺伝子の発現プロファイルに基づいて階層的クラスタ分析を行ったところ、漿液性腺癌群を主とするクラスタと明細胞腺癌群を主とするクラスタの２つのクラスタを形成し、２９遺伝子（実施例３）や７遺伝子（実施例５）の発現プロファイルに基づく階層的クラスタ分析とほぼ同様の結果を得ることができた。
このように、漿液性腺癌と明細胞腺癌とでは、C12orf75遺伝子、DNER遺伝子およびRIMKLB遺伝子の発現レベルの合計値に有意な差を有しており、これらの遺伝子の組み合わせにおける発現レベルを測定することで、対象となる卵巣癌試料がいずれの組織型であるのか鑑別することができる。
(Example 11. Examination of gene set F 7)
We also investigated combinations of other genes that can distinguish serous adenocarcinoma from clear cell adenocarcinoma with high accuracy.
Select the C12orf75 gene, DNER gene and RIMKLB gene so that the total gene expression score is 7.006 or higher (total gene expression score is 8.127428), and based on the measurement results of these gene expressions, serous adenocarcinoma and clear cell adenocarcinoma. It was verified whether it could be distinguished from cancer.
Specifically, the total value of the Log 2 ratios of the C12orf75 gene, DNER gene, and RIMKLB gene was obtained for each sample belonging to the serous adenocarcinoma group and the clear cell adenocarcinoma group, and the distribution was plotted as a group scatter plot (Fig. 21). ). When the average of the total values of the specimens belonging to each histological ovarian cancer in the serous adenocarcinoma group or the clear cell adenocarcinoma group was calculated for each histological type, the average value of the total values of serous adenocarcinoma was -1.3507, while the average value was -1.3507. The average value of the total values of clear cell adenocarcinoma was 6.7768, and the groups of each other had a significant difference at P = 1.245 × 10 -8.
In the ROC curve, the AUC was 0.8803, and in the sensitivity / specificity curve, the optimum cutoff value was set to 1.1226, at which time the sensitivity and specificity were 88.9% (Fig. 22).
In addition, when a hierarchical cluster analysis was performed based on the expression profiles of the C12orf75 gene, DNER gene, and RIMKLB gene, two clusters, a cluster mainly composed of serous adenocarcinoma group and a cluster mainly composed of clear cell adenocarcinoma group, were found. It was formed, and almost the same results as the hierarchical cluster analysis based on the expression profiles of 29 genes (Example 3) and 7 genes (Example 5) could be obtained.
Thus, there is a significant difference in the total expression levels of the C12orf75 gene, DNER gene and RIMKLB gene between serous adenocarcinoma and clear cell adenocarcinoma, and the expression level in the combination of these genes is measured. Therefore, it is possible to distinguish which histological type the target ovarian cancer sample has.
（実施例１２．追加検体を用いた追加試験）
上記の実施例１等で用いた検討とは別に、さらに検証用の漿液性腺癌19検体および明細胞腺癌7検体を用意し、これらの検体についても高い確度で漿液性腺癌と明細胞腺癌とを鑑別可能か検証した。
具体的には、追加の検証用検体について上記実施例１および２に記載の方法と同様にしてRNA調製および網羅的遺伝子発現解析を行った。
追加検体について得られた鑑別マーカー29遺伝子に関するマイクロアレイデータを上記の実施例１等で用いた検体のマイクロアレイデータに加えてユークリッド距離による群平均法のクラスタ分析を行った。その結果を図２３Ａに示す。また、上記実施例４に記載のスコアリングシステムに基づいてマイクロアレイデータを並び替えたものを図２３Ｂに示す。
図２３ＡおよびＢに示すように、追加の検証用検体については１００％の確度で漿液性腺癌と明細胞腺癌とを鑑別することができた。
(Example 12. Additional test using additional sample)
In addition to the studies used in Example 1 and the like above, 19 samples of serous adenocarcinoma and 7 samples of clear cell adenocarcinoma for verification were prepared, and these samples were also prepared with high accuracy for serous adenocarcinoma and clear cell adenocarcinoma. It was verified whether it was possible to distinguish between.
Specifically, RNA preparation and comprehensive gene expression analysis were performed on additional verification samples in the same manner as in the methods described in Examples 1 and 2 above.
The microarray data on the
As shown in FIGS. 23A and 23B, serous adenocarcinoma and clear cell adenocarcinoma could be differentiated with 100% accuracy for the additional validation specimens.
（実施例１３．追加検体を用いた追加試験２）
実施例１２の追加の検証用検体（漿液性腺癌19検体および明細胞腺癌7検体）について、鑑別マーカー7遺伝子（PPP1R3B遺伝子、TOB1遺伝子、RBPMS遺伝子、GABARAPL1遺伝子、GLRX遺伝子、GSTM3遺伝子、GDF15遺伝子）に関するマイクロアレイデータを上記の実施例１等で用いた検体のマイクロアレイデータに加えてユークリッド距離による群平均法のクラスタ分析を行った。その結果を図２４Ａに示す。また、スコアリングシステムに基づいてマイクロアレイデータを並び替えたものを図２４Ｂに示す。
図２４ＡおよびＢに示すように、追加の検証用検体については１００％の確度で漿液性腺癌と明細胞腺癌とを鑑別することができた。
(Example 13. Additional test using additional sample 2)
For the additional validation specimens of Example 12 (19 serous adenocarcinoma and 7 clear cell adenocarcinoma), 7 differential marker genes (PPP1R3B gene, TOB1 gene, RBPMS gene, GABARAPL1 gene, GLRX gene, GSTM3 gene, GDF15 gene) ) Was added to the microarray data of the sample used in Example 1 and the like described above, and cluster analysis by the group averaging method based on the Euclidean distance was performed. The results are shown in FIG. 24A. Further, FIG. 24B shows a rearrangement of the microarray data based on the scoring system.
As shown in FIGS. 24A and 24B, serous adenocarcinoma and clear cell adenocarcinoma could be differentiated with 100% accuracy for the additional validation specimens.
（実施例１４．追加検体を用いた追加試験３）
実施例１２の追加の検証用検体（漿液性腺癌19検体および明細胞腺癌7検体）について、鑑別マーカー3遺伝子（GLRX遺伝子、GDF15遺伝子、GABARAPL1遺伝子）に関するマイクロアレイデータを上記の実施例１等で用いた検体のマイクロアレイデータに加えてユークリッド距離による群平均法のクラスタ分析を行った。その結果を図２５Ａに示す。また、スコアリングシステムに基づいてマイクロアレイデータを並び替えたものを図２５Ｂに示す。
図２５ＡおよびＢに示すように、追加の検証用検体については１００％の確度で漿液性腺癌と明細胞腺癌とを鑑別することができた。
(Example 14. Additional test using additional sample 3)
For the additional verification specimens of Example 12 (19 specimens of serous adenocarcinoma and 7 specimens of clear cell adenocarcinoma), microarray data on 3 differential marker genes (GLRX gene, GDF15 gene, GABARAPL1 gene) were obtained in Example 1 above. In addition to the microarray data of the sample used, cluster analysis of the group averaging method by Euclidean distance was performed. The results are shown in FIG. 25A. Further, FIG. 25B shows the rearrangement of the microarray data based on the scoring system.
As shown in FIGS. 25A and 25B, serous adenocarcinoma and clear cell adenocarcinoma could be differentiated with 100% accuracy for the additional validation specimens.
Claims (11)
PPP1R3B遺伝子、TOB1遺伝子、RBPMS遺伝子、A4GALT遺伝子、RIMKLB遺伝子、GABARAPL1遺伝子、GLRX遺伝子、GSTM3遺伝子、LAMB1遺伝子、DNER遺伝子、ARG2遺伝子、TMEM101遺伝子、GDF15遺伝子、C12orf75遺伝子、DLX5遺伝子、AOC1遺伝子、ANXA4遺伝子、FBLN1遺伝子、TSPAN1遺伝子、APOL1遺伝子、FXYD2遺伝子、GPX3遺伝子、DEFB1遺伝子、FLJ43606遺伝子、LRIG1遺伝子、LYPD1遺伝子、CRIP1遺伝子、UQCRH遺伝子、および、IGF2遺伝子からなる群より選択される少なくとも３つの遺伝子を含む遺伝子セットにおける各遺伝子の発現レベルを測定する工程であって、
前記遺伝子セットに含まれる各遺伝子の遺伝子発現スコアの合計値が、GLRX遺伝子、GDF15遺伝子、および、GABARAPL1遺伝子の遺伝子発現スコアの合計値と同等または合計値以上となるように各遺伝子が選択されたものであり、かつ
前記発現レベルの測定が前記遺伝子セットに含まれる各遺伝子のmRNAの発現レベルの測定である工程
を含み、
前記遺伝子発現スコアが、漿液性腺癌患者由来の試料および明細胞腺癌患者由来の試料間における特定の遺伝子の発現レベルの差の大きさである、鑑別を補助する方法。 It is a method of obtaining an expression profile of a gene in a test sample derived from an ovarian cancer patient and assisting in differentiating whether it is a histological type of serous adenocarcinoma or clear cell adenocarcinoma based on the expression profile.
PPP1R3B gene, TOB1 gene, RBPMS gene, A4GALT gene, RIMKLB gene, GABARAPL1 gene, GLRX gene, GSTM3 gene, LAMB1 gene, DNER gene, ARG2 gene, TMEM101 gene, GDF15 gene, C12orf75 gene, DLX5 gene, AOC1 gene, ANXA4 gene , FBLN1 gene, TSPAN1 gene, APOL1 gene, FXYD2 gene, GPX3 gene, DEFB1 gene, FLJ43606 gene, LRIG1 gene, LYPD1 gene, CRIP1 gene, UQCRH gene, and at least 3 genes selected from the group consisting of IGF2 gene. A step of measuring the expression level of each gene in the included gene set.
Each gene was selected so that the total value of the gene expression scores of each gene included in the gene set was equal to or greater than the total value of the gene expression scores of the GLRX gene, GDF15 gene, and GABARAPL1 gene. Monodea is, and
It looks including the step is the measurement of the expression level of mRNA for each gene measured in the expression level is included in the gene set,
A method for assisting differentiation , wherein the gene expression score is the magnitude of the difference in the expression level of a specific gene between a sample derived from a patient with serous adenocarcinoma and a sample derived from a patient with clear cell adenocarcinoma.
前記遺伝子発現スコアが測定した蛍光強度の数値のｌｏｇ２値の合計であり、かつ、
前記遺伝子セットに含まれる遺伝子の組み合わせが、下記表に記載される遺伝子発現スコアを参照して、合計が7.006と同等または7.006以上になるように少なくとも３つの遺伝子が選択されたものである、鑑別を補助する方法。
The gene expression score is the sum of the log2 values of the measured fluorescence intensities, and
Differentiation in which at least three genes are selected so that the combination of genes contained in the gene set is equal to or greater than 7.006 in total by referring to the gene expression scores shown in the table below. How to assist.
前記遺伝子セットに含まれる少なくとも一つの遺伝子が、PPP1R3B遺伝子、TOB1遺伝子、RBPMS遺伝子、GABARAPL1遺伝子、GLRX遺伝子、GSTM3遺伝子、および、GDF15遺伝子からなる群より選択される、鑑別を補助する方法。 A method for assisting the discrimination according to claim 1 or 2.
A method for assisting differentiation, wherein at least one gene contained in the gene set is selected from the group consisting of PPP1R3B gene, TOB1 gene, RBPMS gene, GABARAPL1 gene, GLRX gene, GSTM3 gene, and GDF15 gene.
前記遺伝子セットに含まれる遺伝子の全てが、PPP1R3B遺伝子、TOB1遺伝子、RBPMS遺伝子、GABARAPL1遺伝子、GLRX遺伝子、GSTM3遺伝子、および、GDF15遺伝子からなる群より選択される、鑑別を補助する方法。 A method for assisting the discrimination according to any one of claims 1 to 3.
A method for assisting differentiation, in which all of the genes included in the gene set are selected from the group consisting of PPP1R3B gene, TOB1 gene, RBPMS gene, GABARAPL1 gene, GLRX gene, GSTM3 gene, and GDF15 gene.
前記遺伝子セットがGLRX遺伝子、GDF15遺伝子およびGABARAPL1遺伝子を含む、鑑別を補助する方法。 A method for assisting the discrimination according to any one of claims 1 to 4.
A method of assisting differentiation, wherein the gene set comprises the GLRX gene, the GDF15 gene and the GABARAPL1 gene.
前記遺伝子セットにおける各遺伝子の発現プロファイルと、漿液性腺癌患者または明細胞腺癌患者由来の試料における対応する遺伝子セットにおける各遺伝子の発現プロファイルとを比較する工程を含む、鑑別を補助する方法。 A method for assisting the discrimination according to any one of claims 1 to 5.
A method of assisting differentiation comprising comparing the expression profile of each gene in the gene set with the expression profile of each gene in the corresponding gene set in a sample derived from a patient with serous or clear cell adenocarcinoma.
前記遺伝子セットにおける各遺伝子の発現プロファイルをクラスタ分析する工程を含む、鑑別を補助する方法。 A method for assisting the discrimination according to any one of claims 1 to 6.
A method for assisting differentiation, comprising a step of cluster analysis of the expression profile of each gene in the gene set.
被検試料における前記遺伝子セットの各遺伝子の定量的な発現プロファイルを、所定の閾値と比較する工程を含む、鑑別を補助する方法。 A method for assisting the discrimination according to any one of claims 1 to 7.
A method of assisting differentiation, comprising the step of comparing the quantitative expression profile of each gene of the gene set in a test sample with a predetermined threshold.
あるのかを鑑別するためのキットであって、It is a kit for distinguishing whether it exists,
前記キットは、PP1R3B遺伝子、TOB1遺伝子、RBPMS遺伝子、A4GALT遺伝子、RIMKLB遺伝子、GABARAPL1遺伝子、GLRX遺伝子、GSTM3遺伝子、LAMB1遺伝子、DNER遺伝子、ARG2遺伝子、TMEM101遺伝子、GDF15遺伝子、C12orf75遺伝子、DLX5遺伝子、AOC1遺伝子、ANXA4遺伝子、FBLN1遺伝子、TSPAN1遺伝子、APOL1遺伝子、FXYD2遺伝子、GPX3遺伝子、DEFB1遺伝子、FLJ43606遺伝子、LRIG1遺伝子、LYPD1遺伝子、CRIP1遺伝子、UQCRH遺伝子、および、IGF2遺伝子からなる群より選択される少なくとも３つの遺伝子を含む遺伝子セットにおける各遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルを測定する手段を含み、 The kit includes PP1R3B gene, TOB1 gene, RBPMS gene, A4GALT gene, RIMKLB gene, GABARAPL1 gene, GLRX gene, GSTM3 gene, LAMB1 gene, DNER gene, ARG2 gene, TMEM101 gene, GDF15 gene, C12orf75 gene, DLX5 gene, AOC1. At least selected from the group consisting of genes, ANXA4 gene, FBLN1 gene, TSPAN1 gene, APOL1 gene, FXYD2 gene, GPX3 gene, DEFB1 gene, FLJ43606 gene, LRIG1 gene, LYPD1 gene, CRIP1 gene, UQCRH gene, and IGF2 gene. Including means for measuring the expression level of mRNA of each gene in a gene set containing three genes.
前記遺伝子セットに含まれる各遺伝子の遺伝子発現スコアの合計値が、GLRX遺伝子、GDF15遺伝子、および、GABARAPL1遺伝子の遺伝子発現スコアの合計値以上となるように各遺伝子が選択されたものである、キット。 A kit in which each gene is selected so that the total value of the gene expression scores of each gene included in the gene set is equal to or greater than the total value of the gene expression scores of the GLRX gene, the GDF15 gene, and the GABARAPL1 gene. ..
前記各遺伝子の発現レベルを測定する手段が、各遺伝子に対するプライマー、プローブ、または、それらの標識物からなる群より選択される少なくとも一つの手段である、キット。 A kit, wherein the means for measuring the expression level of each gene is at least one means selected from the group consisting of primers, probes, or labels thereof for each gene.
PCR用、マイクロアレイ用、または、RNAシークエンス用である、キット。 A kit for PCR, microarrays, or RNA sequencing.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2017207640A JP6977965B2 (en) | 2017-10-26 | 2017-10-26 | Ovarian cancer histological differentiation method |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2017207640A JP6977965B2 (en) | 2017-10-26 | 2017-10-26 | Ovarian cancer histological differentiation method |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2019076068A JP2019076068A (en) | 2019-05-23 |
| JP6977965B2 true JP6977965B2 (en) | 2021-12-08 |
Family
ID=66626104
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2017207640A Active JP6977965B2 (en) | 2017-10-26 | 2017-10-26 | Ovarian cancer histological differentiation method |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP6977965B2 (en) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116855605A (en) * | 2023-06-13 | 2023-10-10 | 中国医学科学院北京协和医院 | Application of AOC1 as marker for distinguishing ovarian clear cell carcinoma and high-grade serous carcinoma |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010102195A2 (en) * | 2009-03-06 | 2010-09-10 | The Johns Hopkins University | Annexin a11 and associated genes as biomarkers for cancer |
| JP5224308B2 (en) * | 2010-02-22 | 2013-07-03 | 公立大学法人横浜市立大学 | Proteins specifically expressed in ovarian clear cell adenocarcinoma and their applications |
| GB201409479D0 (en) * | 2014-05-28 | 2014-07-09 | Almac Diagnostics Ltd | Molecular diagnostic test for cancer |
| KR101583673B1 (en) * | 2014-02-28 | 2016-01-08 | 이화여자대학교 산학협력단 | DLX5, a marker for predicting the response to anti-cancer drug in a patient with ovarian cancer |
| WO2016004387A1 (en) * | 2014-07-02 | 2016-01-07 | H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. | Gene expression signature for cancer prognosis |
-
2017
- 2017-10-26 JP JP2017207640A patent/JP6977965B2/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2019076068A (en) | 2019-05-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6190434B2 (en) | Gene expression markers to predict response to chemotherapeutic agents | |
| JP6285009B2 (en) | Composition for prognosis detection and determination of prostate cancer and method for detection and determination | |
| EP2390370B1 (en) | A method for predicting the response of a tumor in a patient suffering from or at risk of developing recurrent gynecologic cancer towards a chemotherapeutic agent | |
| JP2007507222A (en) | Gene expression markers for predicting response to chemotherapy | |
| US20230366034A1 (en) | Compositions and methods for diagnosing lung cancers using gene expression profiles | |
| JP2008520251A (en) | Methods and systems for prognosis and treatment of solid tumors | |
| US20110319282A1 (en) | Methods and kits for the diagnosis and the staging of colorectal cancer | |
| JP2011525106A (en) | Markers for diffuse B large cell lymphoma and methods of use thereof | |
| WO2021015084A1 (en) | Distinguishing marker gene set, method and kit each for distinguishing or classifying subtype of breast cancer | |
| CN110229899B (en) | Plasma marker combinations for early diagnosis or prognosis prediction of colorectal cancer | |
| JP6977965B2 (en) | Ovarian cancer histological differentiation method | |
| US20210079479A1 (en) | Compostions and methods for diagnosing lung cancers using gene expression profiles | |
| JP7411979B2 (en) | internal standard gene | |
| JP2023142853A (en) | Method for determining risk of recurrence or progression to muscle invasive bladder cancer of non-muscle invasive bladder cancer, and marker gene used for the same | |
| WO2022210783A1 (en) | Follicular thyroid cancer-specific marker | |
| JP2023045648A (en) | Method and kit for determining of hormone therapy sensitivity in prostate cancer patient | |
| JP2021093955A (en) | Methods and kits for detecting intraductal papillary mucinous carcinoma or pancreatic cancer | |
| CN113322325A (en) | Application of gene group as detection index in oral squamous cell carcinoma diagnosis | |
| EP3426797A1 (en) | Method for determining the risk of recurrence of an estrogen receptor-positive and her2-negative primary mammary carcinoma under an endocrine therapy |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20201006 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20210804 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210903 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20211015 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20211026 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20211101 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6977965 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |