JP6974358B2 - Ｈｐｖ ｌ２ペプチドの免疫原性の改善 - Google Patents

Description

本発明は、HPV16のL2ポリペプチドのアミノ酸20〜50に対応する多数のヒトパピローマウイルス(HPV) L2 N末端ペプチドを含む免疫原性ポリペプチドであって、前記HPV L2 N末端ペプチドは、少なくとも2つの異なるHPV遺伝子型に由来するL2 N末端ペプチドである免疫原性ポリペプチドに関する。本発明は、医薬における使用のための、及びHPV感染症に対するワクチン接種における使用のための前記免疫原性ポリペプチドにも関する。さらに、本発明は、免疫原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び同ポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関する。さらに、本発明は、本発明の免疫原性ポリペプチドと関連するキット、方法、及び使用に関する。

子宮頸がんは、全世界の女性にとって2番目に高頻度のがんである。臨床試験及び分子試験により、高リスク型と呼ばれる特定の型のヒトパピローマウイルス(HPV)が、この疾患の病原体であることが判明した。子宮頸がん予防用の2つの抗HPVワクチンが、メルク社(Gardasil(商標))、及びグラクソスミスクライン社(Cervarix(商標))により最近認可されている(Schmiedeskamp et al, (2006), Ann Pharmacother, 40: 1344-1352)。両ワクチンは、抗原として、ウイルス様粒子(VLP)の形態のメジャーカプシドタンパク質L1に依存する(Roden et al., (2006), Nat Rev Cancer, 6: 753-763);該ワクチンは、L1-VLPがその起源とするHPV型から保護するが、最も密接に関連するHPV型を除き、いずれに対しても概ね効力を有さない。2つの最も顕著な高リスク型であるHPV16型及び18型は、両ワクチンの主要な標的であるものの、HPV31型及び45型に対する部分的な交差防御に関するエビデンスが存在する(Muller and Gissmann, (2007), Dis Markers, 23: 331-336; Huh and Roden, (2008), Gynecol Oncol, 109: S48-56によりレビューされている)。L1に基づくワクチンの交差防御能力は限定的であり、これが、改善したワクチン接種戦略の開発に向けられた努力が継続している主な理由であり、L1中和エピトープのHPV型特異性を反映しているようである(Giroglou et al., (2001), Vaccine, 19: 1783-1793)。

マイナーカプシドタンパク質L2に対する抗体もまた、HPV感染症を中和し、そして様々な非同族ビリオンを交差中和することが多くの場合可能であるが、その効力は異なる(Kondo et al. (2007), Virology, 358: 266-272; Gambhira, R., (2007), J Virol, 81: 13927-13931)。L2のN末端領域は、標的細胞の表面上にある、今でも未同定の二次受容体と相互作用し(Yang et al. (2003), J Virol, 77: 3531-3541)、またこの相互作用は、抗L2抗体によりブロックされ得る。HPV-細胞表面相互作用に関与するL2領域の正確な同一性には、なおも議論の余地がある。これは、アミノ酸(aa) 108〜120個から構成される領域として最初に提案され、またこの特定のL2領域を標的とする抗体は、実際、低力価ではあるものの、ウイルス感染症をin vitroでブロックすることが明らかにされた(Kawana et al. (2001), Vaccine, 19: 1496-1502; Kawana et al. (2001b), J Virol, 75: 2331-2336)。後続する実験では、aa 1〜88領域内(Pastrana et al. (2005), Virology, 337: 365-372)、並びにaa 11〜200及びaa 18〜144から構成されるより長いN末端延長領域内(Kondo loc. cit)で、追加の中和エピトープが同定された。これらのN末端エピトープのうち、おそらく最も特筆すべきものとして、aa 17〜36の間に位置するエピトープが挙げられる。これは、HPV16中和及び防御モノクローナル抗体(RG-1)の標的、並びに延長されたバージョンのL2で免疫したウサギ及びヒトから得た血清に見出される中和活性の主要な決定要素(aa 1〜88、11〜200、又は完全長タンパク質)として同定された(Gambhira, 2007, loc cit.)。L2アミノ酸18及び19の、又はアミノ酸20及び21の突然変異により、細胞表面へのL2結合及びウイルス感染の両方が阻止されることが判明しているので(Yang, R., et al. (2003), J. Virol. 77: 3531-3541)、RG-1抗体により認識されるエピトープは、HPV16 L2の表面結合モチーフとオーバーラップしているものと結論付けられた。

最も関連性のある(交差)中和エピトープ(複数可)について正確な知見を欠くことに加えて、HPV予防用ツールとしてL2を使用する際の主な問題は、L1-VLPと比較して、L2タンパク質及びそのペプチドの不良な免疫原性である。HPV16 L2ペプチド(17〜36)と、広く認識されているTヘルパーエピトープ、及びToll様受容体リガンドのジパルミトイル-S-グリセリルシステインとの化学的カップリングにより、免疫原性の実質的な増加が、近年報告されている(Alphs et al. (2008), Proc Natl Acad Sci U S A, 105: 5850-5855)。或いは、L2ペプチドが、アデノウイルス表面タンパク質(WO2008/140474)、又はその他のHPVタンパク質と融合すると免疫原性が増加した(WO2002/070004、de Jong et al. (2002), Vaccine, 20(29-30): 3456-3464)。また、様々な遺伝子型に由来するペプチドを含む多量体L2ワクチンも使用された(Jagu et al. (2013), PLOS One 8(1): e55538)。

WO2002/070004

Schmiedeskamp et al, (2006), Ann Pharmacother, 40: 1344-1352 Roden et al., (2006), Nat Rev Cancer, 6: 753-763 Muller and Gissmann, (2007), Dis Markers, 23: 331-336 Huh and Roden, (2008), Gynecol Oncol, 109: S48-56 Giroglou et al., (2001), Vaccine, 19: 1783-1793 Kondo et al. (2007), Virology, 358: 266-272 Gambhira, R., (2007), J Virol, 81: 13927-13931 Yang et al. (2003), J Virol, 77: 3531-3541 Kawana et al. (2001), Vaccine, 19: 1496-1502 Kawana et al. (2001b), J Virol, 75: 2331-2336 Pastrana et al. (2005), Virology, 337: 365-372 Alphs et al. (2008), Proc Natl Acad Sci U S A, 105: 5850-5855 de Jong et al. (2002), Vaccine, 20(29-30): 3456-3464 Jagu et al. (2013), PLOS One 8(1): e55538

ペプチドの免疫原性を増加させるための最近開発された代替戦略は、単一コピーの構造を強いる能力を有するスキャフォールドタンパク質としてのチオレドキシン(Trx)の使用、並びにその表面に露出した活性部位ループに挿入された多量体(タンデムに反復した)ペプチドエピトープの使用に依存する(Moretto et al. (2007), J Biol Chem, 282, 11436-11445)。この戦略もまた、免疫化のためのHPV L2ペプチドを提供するのに使用されている(WO2010/070052)。スキャフォールドタンパク質としてのチオレドキシンについて、古細菌(Archaebacteria)由来のTrxバリアントを使用することにより、抗宿主チオレドキシン抗体の誘導が有意に低下し得ることが判明した(Canali et al. (2014), Scientific Reports 4, Art. No 4729:1)。

したがって、L1ポリペプチドはきわめて免疫原性であるが、該ポリペプチドに対する抗体が示す交差防御能力は限定的に過ぎない一方、L2ポリペプチドに対する抗体は、様々なHPV遺伝子型を交差中和する能力を有する。しかし、L2ポリペプチドが有する免疫原性は限定的に過ぎない。

したがって、きわめて免疫原性であり、また上記のような欠点を有さずに、様々なHPV遺伝子型の交差中和を可能にする免疫原性ポリペプチドが大いに必要とされる。本発明の根底にある技術的問題は、上記必要性に適合する手段及び方法の提供として理解され得る。該技術的問題は、特許請求の範囲及び下記の本明細書において特徴づけられる実施形態により解決される。

したがって、本発明は、HPV16のL2ポリペプチドのアミノ酸20〜50に対応する、多数のヒトパピローマウイルス(HPV) L2 N末端ペプチドを含む免疫原性ポリペプチドであって、前記HPV L2 N末端ペプチドは、少なくとも2つの異なるHPV遺伝子型に由来するL2 N末端ペプチドである免疫原性ポリペプチドに関する。

以下で使用される場合、用語「有する(have)」、「含む(comprise)」、若しくは「含む(include)」、又はそれらの任意の文法的変化形は、排他的でないように使用される。したがって、これらの用語は、この文脈に記載されている実体の中に、これらの用語により提示された対象物に加えて、さらなる対象物が存在しない状況、及び1つ以上のさらなる対象物が存在する状況の両方を意味し得る。一例として、「AはBを有する」、「AはBを含む(comprise)」、及び「AはBを含む(include)」という表現は、Bに加えて、Aにはその他の要素が存在しない状況(すなわち、Aはもっぱら及び排他的にBからからなる状況)、並びにBに加えて、1つ以上のさらなる要素、例えば要素C、要素C及びDが、又はさらなる要素等さえも実体Aの中に存在する状況の両方を意味し得る。

さらに、以下で使用する場合、用語「好ましくは」、「より好ましくは」、「最も好ましくは」、「詳細には」、「より詳細には」、「具体的には」、「より具体的には」、又は類似の用語は、さらにほかの可能性を制限することなく、任意の特徴とともに使用される。したがって、これらの用語によって提示された特徴は、任意の特徴であって、けっして請求の範囲を制限するものではない。本発明は、当業者には明らかなように、代わりとなる特徴を用いて実施することができる。同様に、「本発明の実施形態において」又は同様の表現によって提示される特徴は、本発明の他の実施形態について制限を受けることなく、本発明の範囲について制限を受けることなく、そしてこのように提示された特徴と、本発明の他の任意の、若しくは非任意の特徴とを組み合わせる可能性について制限を受けることなしに、任意の特徴であると意図される。さらに、特に別段の指示のない限り、「約」という用語は、関係領域において一般に認められている技術的な正確さを有する表示値に関するものであって、好ましくは表示値±20%、より好ましくは±10%、最も好ましくは±5%に関する。

用語「免疫原性ポリペプチド」は、本明細書で使用する場合、本明細書で規定する多数のL2 N末端配列を含む、好ましくは非天然型のポリペプチドに関する。本明細書で参照する免疫原性ポリペプチドは、本明細書で規定する、少なくとも多数のヒトパピローマウイルス(HPV) L2 N末端ペプチドを含む。本明細書において以下で規定するように、免疫原性ポリペプチドは、好ましくは、スキャフォールドポリペプチド、例えば、チオレドキシン、免疫エンハンサー、オリゴマー化ドメイン等のさらなるドメインを含み得る。好ましくは、前記ドメインは、非共有結合により連結しており、また最大10^-6mol/l、より好ましくは最大10^-7mol/l、最も好ましくは最大10^-8mol/lの解離定数を有する。より好ましくは、少なくとも2つのドメインが、好ましくはペプチド結合により共有結合している。最も好ましくは、免疫原性ポリペプチドのすべてのドメインは、好ましくはペプチド結合により共有結合している。すなわち、好ましくは、免疫原性ポリペプチドは、アミノ酸の連続した鎖を有するポリペプチドである。したがって、好ましくは、免疫原性ポリペプチドは、単一のオープンリーディングフレームによりコードされる。好ましくは、免疫原性ポリペプチドは、免疫原性ポリペプチドが被験体内で体液性免疫応答及び/又は細胞性免疫応答を誘導する、より好ましくは被験体内で体液性免疫応答を誘導するという生物学的機能を有する。最も好ましくは、免疫原性ポリペプチドは、少なくとも1個、より好ましくは少なくとも3個、なおもより好ましくは少なくとも8個、最も好ましくは少なくとも10個のHPV遺伝子型に対して免疫性を誘導するという生物学的機能を有する。

好ましくは、免疫原性ポリペプチドという用語には、本明細書に記載する特定の免疫原性ポリペプチドのバリアントが含まれる。本明細書で使用する場合、用語「ポリペプチドバリアント」は、少なくとも本明細書で規定するポリペプチドを含む任意の化学分子に関し、該化学分子は、表示の活性を有するが、本明細書に示す前記ポリペプチドとは構造が異なる。好ましくは、ポリペプチドバリアントは、本明細書で規定するポリペプチドに含まれる、25〜500個、より好ましくは30〜300個、最も好ましくは35〜150個の連続したアミノ酸のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するペプチドを含む。さらに、上記ポリペプチドのさらなるポリペプチドバリアントも包含される。そのようなポリペプチドバリアントは、特定のポリペプチドと少なくとも同一の必須の生物学的活性を有する。その上、本明細書に記載のポリペプチドバリアントは、少なくとも1つのアミノ酸置換、欠失、及び/又は付加によって異なるアミノ酸配列を有するが、バリアントのアミノ酸配列は依然として、好ましくは、特定のポリペプチドのアミノ酸配列と、少なくとも50%、60%、70%、80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、又は99%同一であることが理解される。2つのアミノ酸配列間の同一性の程度は、当技術分野で周知のアルゴリズムによって判定することができる。好ましくは、同一性の程度は、2つの最適にアラインされた配列を、比較ウィンドウにわたって比較することによって判定されるが、この比較ウィンドウ内のアミノ酸配列の断片は、最適アラインメントのために比較される配列と比べて、付加又は欠失(例えばギャップ又はオーバーハング)を含んでいる可能性がある。パーセンテージは、好ましくはペプチドの全長にわたって、マッチする位置の数を得るために、同一のアミノ酸残基が2つの配列にともに出現する位置の数を求め、そのマッチする位置の数を、ウィンドウ内の位置の総数で割り、結果の数値に100を掛けて、配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。比較のための最適な配列アラインメントは、Smith及びWatermanのローカルホモロジーアルゴリズム(1981)によって、Needleman及びWunschのホモロジーアラインメントアルゴリズム(1970)によって、Pearson及びLipmanの類似性検索法(1988)によって、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実行(Wisconsin Genetics Software Packageより、GAP、BESTFIT、BLAST、PASTA、及びTFASTA、Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI)によって、又は外観検査によって、実行することができる。比較する2つの配列を特定したら、GAP及びBESTFITを使用して最適なアラインメントを決定し、それから同一性の程度を決定することが好ましい。ギャップウェイト(gap weight)に5.00、及びギャップウェイトレングス(gap weight length)に0.30のデフォルト値を用いることが好ましい。上記ポリペプチドバリアントは、アレルバリアント、又はその他の任意の種特異的ホモログ、パラログ、又はオルソログに由来し得る。その上、本明細書に記載のポリペプチドバリアントには、特定のポリペプチド又は上記のタイプのポリペプチドバリアントの断片を、これらの断片及び/又はバリアントが上記の生物活性を有する限り含める。そのような断片は、例えば、ポリペプチドの分解生成物又はスプライスバリアントであり得る、又はそれに由来し得る。リン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、SUMO化、若しくはミリスチル化等の翻訳後修飾により異なるバリアント、非天然アミノ酸を含むことで異なるバリアント、及び/又はペプチドミメティックであることにより異なるバリアントがさらに含まれる。さらに、本発明の免疫原性ポリペプチドバリアントは、好ましくは少なくとも1つのドメインが本明細書に記載するドメインのバリアントであるバリアントを含む。

本明細書で使用する場合、用語「パピローマウイルス」(PV)は、哺乳動物、好ましくは家畜、より好ましくはウシ及びウマ、最も好ましくはヒトの皮膚及び粘膜に感染するパピローマウイルス科(papillomaviridae)のウイルスファミリーに由来するDNAウイルスに関する。ヒトPV (HPV)の場合、110を超えるHPV遺伝子型が記載されている(de Villiers, E. M., C. Fauquet, T. R. Broker, H. U. Bernard, and H. zur Hausen. 2004. Classification of papillomaviruses. Virology 324:17-27)。約50のHPV遺伝子型が、粘膜に感染することが公知である。このような粘膜性の遺伝子型は、そのがんとの疫学的関連性に基づき3つの異なる群に分類される:「低リスク」ヒトパピローマウイルス(LR-HPV)、「高リスク」ヒトパピローマウイルス(HR-HPV)、及び「推定高リスク」ヒトパピローマウイルス(pHR-HPV)。また、HR-HPVは、外陰部、肛門、膣、陰茎、及び口腔咽頭のがん、並びに膣上皮内の新生物、肛門上皮内の新生物、外陰部上皮内の新生物、及び陰茎上皮内の新生物の原因となり得ることも公知である。好ましくは、HPVは、粘膜のHPVであり、より好ましくは、本発明のHPVは、高リスクHPV遺伝子型(HR-HPV)であり、子宮頸がん発症の主要原因である。好ましくは、HPVは、HPV 31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73、及び82であり、より好ましくはHPV 6、16、18、31、33、35、39、45、51、56、59、及び82であり、最も好ましくはHPV 6、16、18、31、33、35、51、及び59である。

用語「L2 N末端ペプチド」とは、HPV L2ポリペプチドのN末端に生ずるペプチドのアミノ酸配列を有するペプチドを意味する。HPV L2ポリペプチドは、当技術分野において公知である。完全長L2ポリペプチドは、パピローマウイルスの2つのカプシドタンパク質のうちの1つであり、またマイナーカプシドタンパク質とも呼ばれる。メジャーカプシドタンパク質L1とともに、完全長L2ポリペプチドは、ウイルスカプシドを形成する。L2 N末端ペプチドは、本発明の文脈において、HPV L2ポリペプチドのうち、L2ポリペプチドのアミノ酸20〜50、好ましくはアミノ酸20〜38に対応する。当業者には当然のことであるが、好ましい免疫原性エピトープは類似した配列を共有するものの、様々なHPV遺伝子型のL2ポリペプチドは、配列変異に起因して必ずしも正確にコリニアではない。したがって、アミノ酸に番号を付与する場合、HPV16 L2アミノ酸配列内の対応するアミノ酸の位置に対応するアミノ酸位置が多くの場合参照される。したがって、好ましくは、L2 N末端ペプチドは、本発明の文脈において、HPV16のL2ポリペプチドのアミノ酸20〜50、好ましくはアミノ酸20〜38に対応する。HPV16のL2ポリペプチドのアミノ酸20〜50に対応する好ましいL2 N末端ペプチドは、配列番号1 (HPV16)、配列番号2 (HPV18)、配列番号3 (HPV45)、配列番号4 (HPV31)、配列番号5 (HPV33)、配列番号6 (HPV35)、配列番号7 (HPV59)、配列番号8 (HPV56)、配列番号9 (HPV51)、配列番号10 (HPV39)、配列番号11 (HPV82)、又は配列番号12 (HPV6)のアミノ酸配列を有するペプチドである。HPV16のL2ポリペプチドのアミノ酸20〜38に対応する好ましいL2 N末端ペプチドは、配列番号13 (HPV 16)、配列番号14 (HPV 18)、配列番号15 (HPV 45)、配列番号16 (HPV31)、配列番号17 (HPV33)、配列番号18 (HPV35)、配列番号19 (HPV59)、配列番号20 (HPV56)、配列番号21 (HPV51)、配列番号22 (HPV39)、配列番号23 (HPV82)、又は配列番号24 (HPV6)の配列を有するペプチドである。

好ましくは、L2 N末端ペプチドという用語には、本明細書でこれまでに規定した特定のN2末端ペプチドのバリアントが含まれる。より好ましくは、N2末端ペプチドのバリアントは、HPV L2 N末端ペプチド1個当たり最大2個、好ましくは最大1個のアミノ酸の欠失(複数可)、挿入(複数可)、及び/又は置換(複数可)を含むバリアントである。より好ましくは、N2末端ペプチドのバリアントは、HPV L2 N末端ペプチド1個当たり最大2個、好ましくは最大1個のアミノ酸置換(複数可)、好ましくは保存的置換を含むバリアントである。

用語「多数のHPV L2 N末端ペプチド」は、少なくとも3個、好ましくは少なくとも5個、より好ましくは7、8、9、10、11、又は12個、なおいっそうより好ましくは7、8、又は9個、最も好ましくは8個のHPV L2 N末端ペプチドの数に関する。好ましくは、前記多数とは、3〜11個、好ましくは5〜10個、より好ましくは7〜9個、最も好ましくは8個のHPV L2 N末端ペプチドの数である。好ましくは、免疫原性ポリペプチドは、前記HPV L2 N末端ペプチドそれぞれについて、その3個のコピー、より好ましくは2個のコピー、最も好ましくは1個のコピーを含む。

好ましくは、前記免疫原性ポリペプチドに含まれる、少なくとも2個、より好ましくは少なくとも5個、最も好ましくは少なくとも8個のHPV L2 N末端ペプチドは、同一でない。したがって、好ましくは、前記免疫原性ポリペプチド内のHPV L2 N末端ペプチドは、少なくとも2個、より好ましくは少なくとも5個、なおいっそうより好ましくは7、8、9、10、11、又は12個、最も好ましくは8個の異なるHPV遺伝子型に由来するL2 N末端ペプチドである。好ましくは、前記免疫原性ポリペプチド内のHPV L2 N末端ペプチドは、HPV遺伝子型6、16、18、31、33、35、39、45、51、56、59、及び82のL2 N末端ペプチド、又はHPV L2 N末端ペプチド1個当たり最大2個、好ましくは最大1個のアミノ酸置換(複数可)を含むそのバリアントを含む。より好ましくは、前記免疫原性ポリペプチド内のHPV L2 N末端ペプチドは、HPV遺伝子型6、16、18、31、33、35、39、45、51、56、59、及び82のL2 N末端ペプチドを含む。やはり好ましくは、HPV L2 N末端ペプチドは、HPV遺伝子型6、16、18、31、33、35、51、及び59のL2 N末端ペプチド、又はHPV L2 N末端ペプチド1個当たり最大2個、好ましくは最大1個のアミノ酸置換(複数可)を含むそのバリアントを含む。より好ましくは、前記免疫原性ポリペプチド内のHPV L2 N末端ペプチドは、HPV遺伝子型6、16、18、31、33、35、51、及び59のL 2N末端ペプチドを含む。

好ましくは、免疫原性ポリペプチドは、HPV遺伝子型6、16、18、31、33、35、39、45、51、56、59、及び82のL2 N末端ペプチド、又はHPV L2 N末端ペプチド1個当たり最大2個、好ましくは最大1個のアミノ酸置換(複数可)を含むそのバリアントをもっぱら含む、好ましくはそれらからなる。より好ましくは、免疫原性ポリペプチドは、HPV遺伝子型6、16、18、31、33、35、51、及び59のL2 N末端ペプチドのそれぞれについて、その1個のコピーをもっぱら含む、好ましくはそれらからなる、又はHPV L2 N末端ペプチド1個当たり最大2個、好ましくは最大1個のアミノ酸置換(複数可)を含む、多数のHPV L2 N末端ペプチドを含む前記ポリペプチドのバリアントである。本明細書で使用する場合、特定のL2 N末端ペプチドを「もっぱら含む免疫原性ポリペプチド」という用語は、表示するL2 N末端ペプチドを含むが、表示されないL2 N末端ペプチドをさらに含まない免疫原性ポリペプチドに関係する。当然のことながら、該用語は、したがって、前記免疫原性ポリペプチドが、非L2 N末端ペプチド要素、好ましくはポリペプチドドメインをさらに含むことを除外しない。したがって、好ましくは、HPV遺伝子型6、16、18、31、33、35、51、及び59のL2 N末端ペプチドをもっぱら含む免疫原性ポリペプチドは、HPV遺伝子型6、16、18、31、33、35、51、及び59の任意数のL2 N末端ペプチドを含み得るが、その他のHPV遺伝子型のL2 N末端ペプチドを含まない。なおいっそうより好ましくは、免疫原性ポリペプチドは、HPV遺伝子型6、16、18、31、33、35、39、45、51、56、59、及び82のL2 N末端ペプチドをもっぱら含む、好ましくはそれらからなる。なおもより好ましくは、免疫原性ポリペプチドは、HPV遺伝子型6、16、18、31、33、35、51、及び59のL2 N末端ペプチドをもっぱら含む、好ましくはそれらからなる。最も好ましくは、免疫原性ポリペプチドは、HPV遺伝子型6、16、18、31、33、35、51、及び59のL2 N末端ペプチドそれぞれについて、その1個のコピーをもっぱら含む、好ましくはそれらからなる。好ましくは、免疫原性ポリペプチドは、HPV16-18-31-33-35-39-45-51-56-59-82の配列でHPV L2 N末端ペプチドを含み、より好ましくはHPV16-18-31-33-35-6-51-59の配列でHPV L2 N末端ペプチドを含む。より好ましくは、免疫原性ポリペプチドは、HPV16-18-31-33-35-39-45-51-56-59-82の配列で、HPV L2 N末端ペプチドそれぞれについてその1個のコピーを含むペプチドのコピー1個を含み、最も好ましくは、免疫原性ポリペプチドは、HPV16-18-31-33-35-6-51-59の配列で、HPV L2 N末端ペプチドそれぞれについて、その1個のコピーを含むペプチドのコピー1個を含む。好ましくは、免疫原性ポリペプチドは、HPV遺伝子型(複数可)39、45、56、及び/又は82のL2 N末端ペプチドを欠いている。

好ましくは、HPV L2 N末端ペプチドは、直接連続した配列で免疫原性ポリペプチド内に含まれる、すなわち、介在するアミノ酸を含まない。より好ましくは、免疫原性ポリペプチド内のHPV L2 N末端ペプチドは、1つ以上のリンカー配列により分離しており、前記リンカー配列は、介在された各L2 N末端ペプチドについて同一であっても、又は異なってもよい。好ましくは、リンカーは、プロリン(P)及びグリシン(G)残基からなる5、3、又は2個のアミノ酸からなる。より好ましくは、免疫原性ポリペプチド内のHPV L2 N末端ペプチドは、GGP及び/又はGGGPリンカー配列により分離している。

好ましくは、多数のHPV L2 N末端ペプチドはアミノ酸配列を含み、より好ましくは、多数のHPV L2 N末端ペプチドは、配列番号25若しくは26、好ましくは配列番号25のアミノ酸配列からなる、又は、HPV L2 N末端ペプチド1個当たり最大2個、好ましくは最大1個のアミノ酸置換(複数可)を含む前記配列のバリアントである。より好ましくは、多数のHPV L2 N末端ペプチドはアミノ酸配列を含み、より好ましくは、多数のHPV L2 N末端ペプチドは、配列番号25又は26から選択されるアミノ酸配列、好ましくは配列番号25のアミノ酸配列からなる。したがって、好ましくは、免疫原性ポリペプチドは、配列番号25若しくは26、好ましくは配列番号25のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなる、又は前記配列のバリアントである。より好ましくは、免疫原性ポリペプチドは、配列番号25又は26、好ましくは配列番号25のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなる。

好ましくは、免疫原性ポリペプチドは、オリゴマー化ドメインをさらに含む。用語「オリゴマー化ドメイン」は、その従来の意味で使用され、そして前記ドメインを含むポリペプチドは、凝集する傾向を有するという特性を有するポリペプチドに関する。好ましくは、オリゴマー化ドメインの分離した分子としての解離定数は、最大10^-4mol/l、より好ましくは最大10^-5mol/l、最も好ましくは少なくとも10^-6mol/lである。認識される通り、凝集する分子の数は、選択されたオリゴマー化ドメインの種類に特に依存する。好適なオリゴマー化ドメインは、当技術分野において公知である。好ましくは、免疫原性ポリペプチドは、(i) C4-結合タンパク質の、好ましくは哺乳動物のC4-結合タンパク質の、より好ましくはヒト又はマウスのC4-結合タンパク質の、最も好ましくはマウスのC4-結合タンパク質のオリゴマー化ドメイン; (ii)エンカプスリン(encapsulin)ポリペプチド、好ましくは好熱性古細菌由来のエンカプスリンポリペプチド、より好ましくはパイロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)のエンカプスリンポリペプチド; (iii)フェリチンポリペプチド、好ましくは好熱性古細菌由来のフェリチンポリペプチド、より好ましくはパイロコッカス・フリオサスのフェリチンポリペプチド;及び(iv) 2つの異なるニワトリのC4-結合タンパク質のハイブリッドポリペプチド、好ましくは特にWO2007/062819 A2に記載されているようなIMX313ポリペプチド又はそのバリアント、最も好ましくはIMX313Tポリペプチド(配列番号60、好ましくは配列番号61によりコードされる)のうちの少なくとも1つのオリゴマー化ドメインを含む。好ましくは、オリゴマー化ドメインは、配列番号55の配列(P.フリオサスのエンカプスリン)を含むか、又は配列番号56の配列(P.フリオサスのフェリチン)を含む。

また好ましくは、免疫原性ポリペプチドは、好ましくは前記免疫原性ポリペプチドのN末端及び/又はC末端に免疫原性のエンハンサーをさらに含む。免疫原性のエンハンサーとして機能するペプチド配列は、当技術分野において原則的に公知である。好ましくは、免疫原性のエンハンサーは、CD4+T-ヘルパーエピトープであり、好ましくは(i)三日熱マラリア原虫(Plasmodium vivax)スポロゾイト周囲タンパクのカルボキシル領域に由来するp25; (ii)破傷風毒素に由来するp2ペプチド; (iii)破傷風毒素に由来するp30ペプチド;及び(iv) Pan HLA-DR反応性エピトープ(PADRE)のうちの少なくとも1つを含むエピトープである。より好ましくは、免疫原性のエンハンサーは、配列番号57 (PADRE)、配列番号58 (p30)、及び/又は配列番号59 (p25)のアミノ酸配列を含むペプチドを含み、好ましくはそれらからなる。また好ましくは、免疫原性のエンハンサーは、インテグリン結合モチーフとして公知のアミノ酸配列RGDを含むペプチドである。

好ましい実施形態では、多数のL2 N末端ペプチドは、チオレドキシンポリペプチド中に含まれる。L2 N末端ペプチドを含めるのに好適なチオレドキシンポリペプチドは、WO2010/070052より、当技術分野において公知である。好ましくは、チオレドキシンは、哺乳動物の、より好ましくはヒト、細菌、又は古細菌のチオレドキシンである。より好ましくは、チオレドキシンは、好ましくは好熱性古細菌に由来する、好ましくはパイロコッカス・フリオサス又はメタノセータ・サーモフィラ(Methanosaeta thermophila)の古細菌チオレドキシンである。したがって、チオレドキシンは、好ましくは配列番号50の核酸配列によりコードされる配列番号49のアミノ酸配列(ヒトチオレドキシン)を有する、若しくはそのバリアントである;又は好ましくは配列番号48の核酸配列によりコードされる配列番号47のアミノ酸配列(マウスチオレドキシン)を有する、若しくはそのバリアントである;又は好ましくは配列番号46の核酸配列によりコードされる配列番号45のアミノ酸配列(大腸菌(E. coli)チオレドキシン)を有する、若しくはそのバリアントであるのが好ましい。チオレドキシンは、好ましくは配列番号54の核酸配列によりコードされる配列番号53のアミノ酸配列(P.フリオサスチオレドキシン)を有する、若しくはそのバリアントである;又は好ましくは配列番号52の核酸配列によりコードされる配列番号51のアミノ酸配列(M.サーモフィラチオレドキシン)を有する、若しくはそのバリアントであるのがより好ましい。当業者には理解されるように本発明のチオレドキシンは、L2 N末端ペプチドのためのスキャフォールドとなる生物学的活性を有するが、酸化還元活性は不要である。したがって、本発明によれば、上記チオレドキシンの1つに対して少なくとも50%の配列同一性を有するチオレドキシンのバリアントが、免疫原性ポリペプチドにおける使用に適する。好ましくは、多数のL2 N末端ペプチドは、WO2010/070052に詳細に記載されるように、チオレドキシンの提示部位に挿入される。

好ましくは、チオレドキシン、及び/又はオリゴマー化ドメイン、及び/又は免疫原性のエンハンサーは、ヒトポリペプチド、好ましくはヒトゲノムのアセンブリGRCh38.p7において同定された任意のヒトポリペプチドに対して、50%未満、より好ましくは35%未満、なおいっそうより好ましくは25%未満、最も好ましくは20%未満のアミノ酸配列同一性を有する。より好ましくは、チオレドキシン及び/又はオリゴマー化ドメインは、ヒトポリペプチド、好ましくはヒトゲノムのアセンブリGRCh38.p7において同定された任意のヒトポリペプチドに対して、50%未満、より好ましくは35%未満、なおいっそうより好ましくは25%未満、最も好ましくは20%未満のアミノ酸配列同一性を有する。また好ましくは、チオレドキシン、及び/又はオリゴマー化ドメイン、及び/又は免疫原性のエンハンサーは、古細菌ポリペプチドに由来するポリペプチドである。より好ましくは、チオレドキシン及び/又はオリゴマー化ドメインは、古細菌ポリペプチドに由来するポリペプチドである。

理解されるように、上記ドメインは、実質的に任意の方法で組み合わせることも可能である。好ましい組み合わせは、以下：
- 好ましくは配列番号28の核酸配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる配列番号27のアミノ酸配列を含む免疫原性ポリペプチド、
- 好ましくは配列番号30の核酸配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる配列番号29のアミノ酸配列を含む免疫原性ポリペプチド、
- 好ましくは配列番号32の核酸配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる配列番号31のアミノ酸配列を含む免疫原性ポリペプチド、
- 配列番号33のアミノ酸配列を含む免疫原性ポリペプチド
- 好ましくは配列番号35の核酸配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる配列番号34のアミノ酸配列を含む免疫原性ポリペプチド、
- 好ましくは配列番号37の核酸配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる配列番号36のアミノ酸配列を含む免疫原性ポリペプチド、
- 配列番号38のアミノ酸配列を含む免疫原性ポリペプチド、
- 好ましくは配列番号40の核酸配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる配列番号39のアミノ酸配列を含む免疫原性ポリペプチド、
- 好ましくは配列番号42の核酸配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる配列番号41のアミノ酸配列を含む免疫原性ポリペプチド、
- 好ましくは配列番号44の核酸配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる配列番号43のアミノ酸配列を含む免疫原性ポリペプチド
である。

用語「被験体」は、本明細書で使用する場合、動物、好ましくは脊椎動物、より好ましくは哺乳動物、特にウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、及びヤギ等の家畜、又はラット、マウス、及びモルモット等の実験動物に関する。最も好ましくは、被験体はヒトである。

有益なことに、本発明の基礎となる研究において、多数の非同一的なHPV L2 N末端ペプチドを含むポリペプチドは、HPVに対する改善された免疫性を誘導し、そして特に、改善された交差免疫性を媒介することが判明した。この効果は、8〜11個のHPV遺伝子型に由来するペプチドを含むポリペプチドにおいて特に顕著であり、8個の遺伝子型に由来するペプチドを含むポリペプチドが、驚くべきことに最良の性能を有した。

上記定義は、必要な変更を加えて下記に適用される。下記でさらになされる追加の定義及び説明もまた、必要な変更を加えて本明細書に記載されているすべての実施形態に適用される。

本発明はさらに、医薬における使用のための本発明の免疫原性ポリペプチドに関する。本発明は、HPV感染症に対するワクチン接種における使用のための本発明の免疫原性ポリペプチドにも関する。

用語「HPV感染症に対するワクチン接種」は、本明細書で使用する場合、好ましくは、様々なHPV遺伝子型に対する免疫応答を誘発するために、本明細書に規定する化合物を投与することに関する。したがって、ワクチン接種は、免疫系を刺激し、そして様々なHPV遺伝子型を有する感染症に対する免疫性を確立する、又は改善する。好ましくは、本発明によるワクチン接種は、ヒトパピローマウイルス遺伝子型6、16、18、31、33、35、51、及び59による感染症に対する免疫性を確立又は改善し得る。好ましくは、本発明によるワクチンは、少なくともヒトパピローマウイルス遺伝子型5、6、11、16、18、31、33、35、39、45、51、及び59による感染症に対する免疫性も確立又は改善し得る。好ましい実施形態では、本発明によるワクチン接種は、ヒトパピローマウイルス遺伝子型31、35、及び51による感染症に対する免疫性を確立又は改善し得る。本発明によるワクチンは、特に本明細書に別途規定するさらなる成分を含み得るものと理解される。当業者は、ワクチン接種しても、ワクチン接種を受けたすべての被験体において、有意な免疫応答を誘発するとは限らないことを理解する。また、ワクチン接種は、ワクチン接種を受けたすべての被験体において、感染症を防止するのに有効であるとは限らないものとやはり理解される。但し、該用語は、コホート又は集団の被験体の一部、好ましくは統計的に有意な一部は、有効にワクチン接種されることを要求する。ある一部分が統計上有意であるかどうかは、当業者により、例えば、信頼区間の決定、p値の決定、スチューデントt検定、マン・ホイットニー検定等の周知の様々な統計学的評価ツールを用いてすぐに判定できる。好ましい信頼区間は、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%である。p値は、好ましくは、0.1、0.05、0.01、0.005、又は0.0001である。好ましくは、治療は、与えられたコホート若しくは集団の被験体のうち、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、又は少なくとも90%において有効であるべきである。

好ましくは、ワクチン接種は、好ましくは免疫原性ポリペプチドの投与と同時のアジュバントの投与をさらに含む。より好ましくは、免疫原性ポリペプチド及びアジュバントは、投与の際に共通混合物中に含まれる。したがって、好ましくは、免疫原性ポリペプチド及びアジュバントは、投与前に混合される。好ましくは、アジュバントは、(i)アラム及びToll様受容体4 (TLR4)アンタゴニスト、好ましくは合成モノホスホリルリピドA (MPLA)、並びに/又は(ii)スクアレンベースの水中油型ナノエマルジョン、好ましくはAddaVax(商標)を含む。

好ましくは、本発明のHPV感染症に対するワクチン接種は、被験体において体液性免疫応答を誘導する、すなわち、好ましくはHPV L2ポリペプチドを認識する、好ましくは特異的に認識する抗体の産生を誘導する。用語「特異的に認識する」は、特定の分子種に特異的に結合する結合物質、例えば抗体の特性として当業者は理解するが、一方、同一の化学的分類に属する分子に由来するその他の分子、例えばタンパク質は認識されない、又は認識されてもその程度はより低い。好ましくは、HPV L2ポリペプチドを特異的に認識する抗体の、HPV L2ポリペプチドに対する結合定数は、任意の非HPV L2ポリペプチドに対するより、少なくとも1/100、より好ましくは少なくとも1/1000、最も好ましくは少なくとも1/10000低い。好ましくは、HPV L2ポリペプチドを特異的に認識する抗体は、HPVカプシドを特異的に認識する抗体である。好ましくは、HPV L2ポリペプチドを特異的に認識する抗体は、HPVカプシドを中和する抗体である。好ましくは、HPV感染症に対するワクチン接種は、被験体において、体液性免疫応答及び細胞性免疫応答を誘導する。

したがって、本発明は、HPV L2ポリペプチドを特異的に認識する抗体の生成における使用のための、本発明による免疫原性ポリペプチドにも関する。

さらに、本発明は、本発明による免疫原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。

本明細書で使用する場合、ポリヌクレオチドという用語は、好ましくは、具体的に示すポリヌクレオチドのバリアントを含む。より好ましくは、ポリヌクレオチドという用語は、特定の示されたポリヌクレオチドに関する。本明細書で使用される「ポリヌクレオチドバリアント」という用語は、その配列が上記の特定の核酸配列から、少なくとも1つのヌクレオチド置換、付加、及び/又は欠失によって導き出され得ることを特徴とする核酸配列を含む、本明細書に関係するポリヌクレオチドのバリアントに関するが、このポリヌクレオチドバリアントはその特定のポリヌクレオチドについて規定された活性を有するべきである。さらに、本発明に基づき参照されるポリヌクレオチドバリアントは、少なくとも1つのヌクレオチドの置換、欠失、及び/又は付加に起因して異なる核酸配列を有するべきであると理解される。好ましくは、前記ポリヌクレオチドバリアントは、特定のポリヌクレオチドのオルソログ、パラログ、又は別のホモログである。同様に好ましくは、前記ポリヌクレオチドバリアントは、特定のポリヌクレオチドの天然に存在するアレルである。ポリヌクレオチドバリアントはまた、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、上記の特定のポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができる核酸配列を含むポリヌクレオチドも包含する。このストリンジェントな条件は当業者に知られており、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6に見出すことができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい例は、約45℃、6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(=SSC)中でのハイブリダイゼーション条件、及びその後50〜65℃、0.2×SSC、0.1% SDSでの1回以上の洗浄ステップである。当業者は承知しているように、これらのハイブリダイゼーション条件は、核酸のタイプに応じて異なり、例えば有機溶媒が存在する場合、バッファーの温度及び濃度について異なる。例えば、「標準的なハイブリダイゼーション条件」下で、0.1×〜5×SSCの濃度の水性バッファー(pH7.2)において、温度は42℃〜58℃の間で核酸のタイプに応じて異なる。有機溶媒が上記バッファー中に存在する、例えば50%ホルムアミドの場合、標準条件下の温度は、約42℃である。DNA:DNAハイブリッド用のハイブリダイゼーション条件は、好ましくは、例えば0.1×SSCで20℃〜45℃であり、好ましくは30℃〜45℃の間である。DNA:RNAハイブリッド用のハイブリダイゼーション条件は、好ましくは、例えば0.1×SSCで30℃〜55℃であり、好ましくは45℃〜55℃の間である。上記ハイブリダイゼーション温度は、例えば、長さが約100 bp(=塩基対)でG + C含量が50%の核酸について、ホルムアミド非存在下で決定される。上記、又は以下のテキスト等のテキストを参照することによって、必要なハイブリダイゼーション条件を決定する方法が当業者に知られている:Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989; Hames and Higgins (Ed.) 1985, "Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach", IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (Ed.) 1991, "Essential Molecular Biology: A Practical Approach", IRL Press at Oxford University Press, Oxford。或いは、ポリヌクレオチドバリアントは、混合オリゴヌクレオチドプライマーに基づくDNA増幅等のPCRベースの技術によって、すなわち本発明のポリペプチドの保存ドメインに対する変性プライマーを使用して取得可能である。ポリペプチドの保存ドメインは、本発明のポリヌクレオチドの核酸配列、又はポリペプチドのアミノ酸配列とその他の生物の配列との配列比較によって特定することができる。鋳型として、細菌、真菌、又は植物由来、好ましくは動物由来のDNA又はcDNAを使用することができる。さらに、バリアントは、具体的に指示される核酸配列に対して、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一である核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む。その上、具体的に指示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドも包含される。パーセント同一性の値は、アミノ酸又は核酸の配列全領域にわたり計算されることが好ましい。異なる配列を比較するために、様々なアルゴリズムに基づく一連のプログラムが当業者に利用可能である。これに関連して、Needleman及びWunschのアルゴリズム又はSmith及びWatermanのアルゴリズムは、特に信頼できる結果を与える。配列アラインメントを実行するために、PileUpプログラム(J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151-153)、又はGapプログラム及びBestFitプログラム[Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48; 443-453 (1970))及びSmith and Waterman (Adv. Appl. Math. 2; 482-489 (1981))]が使用され、これらはGCGソフトウェアパケット(Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991))の一部である。パーセント(%)単位で上記に挙げた配列同一性の値は、好ましくは、以下の設定を用いて、配列領域全体にわたりGAPプログラムを使用して決定されるべきであるが、この設定は、特に指示のない限り、配列アラインメントの標準設定として常に使用されるものとする;Gap Weight: 50、Length Weight: 3、Average Match: 10.000、及びAverage Mismatch: 0.000。

具体的に指示される核酸配列のいずれかの断片を含むポリヌクレオチドもまた、本発明のバリアントポリヌクレオチドとして包含される。断片は、特定の活性をなおも有する免疫原性ポリペプチドをなおもコードするものとする。したがって、コードされる免疫原性ポリペプチドは、前記生物学的活性をもたらす本発明の免疫原性ポリペプチドのドメインを含み得る、又はそのドメインからなり得る。本明細書で意味するところの断片は、好ましくは、特定の核酸配列のいずれか1つの少なくとも50、少なくとも100、少なくとも250、又は少なくとも500個の連続したヌクレオチドを含み、又は特定のアミノ酸配列のいずれか1つの少なくとも20、少なくとも30、少なくとも50、少なくとも80、少なくとも100、又は少なくとも150個の連続したアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードする。

本発明のポリヌクレオチドは、上記核酸配列からなる、実質的にからなる、又はそれを含む。したがって、該ポリヌクレオチドは、さらなる核酸配列も含有し得る。特に、本発明のポリヌクレオチドは、融合タンパク質をコードし得、ここで、融合タンパク質の一方のパートナーは、上記で引用した核酸配列によりコードされる免疫原性ポリペプチドである。そのような融合タンパク質は、追加パートとして、発現をモニターするためのポリペプチド(例えば、緑色、黄色、青色、若しくは赤色の蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼ等)、又は精製を目的としたとき、検出可能なマーカー若しくは補助的な指標として役立ち得る、いわゆる「タグ」を含み得る。様々な目的のためのタグが、当技術分野において周知されており、また本明細書に別途記載されている。

本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、単離されたポリヌクレオチドとして(すなわち、その天然の環境から単離された)、又は遺伝的に改変された形態で提供されるべきである。ポリヌクレオチドは、好ましくはcDNAを含むDNAであるか、又はRNAである。該用語は、一本鎖並びに二本鎖ポリヌクレオチドを包含する。さらに、好ましくは、天然に存在する修飾ポリヌクレオチド、例えばグリコシル化若しくはメチル化されたポリヌクレオチド等、又は人工的な修飾ポリヌクレオチド、例えばビオチン化されたポリヌクレオチド等を含む、化学的に修飾されたポリヌクレオチドもまた含まれる。

さらに、本発明は、本発明によるポリヌクレオチドを含むベクターに関する。

用語「ベクター」には、好ましくは、ファージ、プラスミド、ウイルス、又はレトロウイルスベクターの他、人工染色体、例えば細菌又は酵母菌の人工染色体等が包含される。さらに、該用語は、標的構築物をゲノムDNA内にランダムに又は部位特異的に組み込むのを可能にする標的構築物にも関する。そのような標的構築物は、好ましくは、以下に詳記するような相同的又は非相同的組換えのために、十分な長さのDNAを含む。本発明のポリヌクレオチドを包含するベクターは、好ましくは、宿主内で繁殖及び/又は選択するための選択マーカーをさらに含む。ベクターは、当技術分野において周知の様々な技法により宿主細胞に組み込まれ得る。例えば、プラスミドベクターは、沈殿物、例えばリン酸カルシウムの沈殿物若しくは塩化ルビジウムの沈殿物等、又は荷電した脂質を含む複合体、又は炭素に基づくクラスター、例えばフラーレン等内に導入可能である。或いは、プラスミドベクターはヒートショック又はエレクトロポレーション技術により導入され得る。ベクターがウイルスである場合、ウイルスは、宿主細胞に適用する前に、適切なパッケージング細胞株を使用してin vitroでパッケージされ得る。レトロウイルスベクターは、複製コンピテント又は複製欠損であり得る。後者の場合、ウイルスの繁殖は、一般的に補完宿主/細胞においてのみ生ずる。好ましい実施形態では、ベクターは細菌ベクターであり、好ましくはp15A複製開始点を有する、及び/又はカナマイシン耐性遺伝子を担持する。

より好ましくは、本発明のベクター内で、ポリヌクレオチドは、原核細胞若しくは真核細胞、又はその単離された分画内での発現を可能にする発現制御配列と機能可能に連結している。前記ポリヌクレオチドの発現は、好ましくは翻訳可能なmRNAへのポリヌクレオチドの転写を含む。真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞内での発現を確実にする調節エレメントは、当技術分野において周知されている。調節エレメントは、好ましくは、転写の開始を確実にする制御配列、並びに任意に、転写の終結及び転写産物の安定化を確実にするポリAシグナルを含む。追加の調節エレメントは、転写エンハンサー並びに翻訳エンハンサーを含み得る。原核生物宿主細胞内での発現を可能にする考え得る調節エレメントは、例えば、大腸菌内lac、trp、又はtacプロモーターを含み、そして真核生物宿主細胞内での発現を可能にする調節エレメントの例として、酵母菌内AOX1又はGAL1プロモーター、又は哺乳動物細胞及びその他の動物細胞内CMV-、SV40-、RSV-プロモーター(ラウス肉腫ウイルス)、CMV-エンハンサー、SV40-エンハンサー、若しくはグロビンイントロンが挙げられる。さらに、誘導可能な発現制御配列は、本発明に包含される発現ベクターで使用され得る。そのような誘導可能なベクターは、tet若しくはlacオペレーター配列、又はヒートショック若しくはその他の環境因子により誘導可能な配列を含み得る。好適な発現制御配列は、当技術分野において周知されている。転写の開始に関係するエレメントの他に、そのような調節エレメントは、ポリヌクレオチドの下流に転写終結シグナル、例えばSV40-ポリA部位又はtk-ポリA部位等も含み得る。この文脈において、好適な発現ベクター、例えば、Okayama-Berg cDNA発現ベクターpcDV1(Pharmacia社)、pBluescript(Stratagene社)、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(InVitrogene社)、又はpSPORT1(GIBCO BRL社)が当技術分野で公知である。好ましくは、前記ベクターは、発現ベクター、及び遺伝子伝達又は標的化ベクターである。ウイルス、例えばレトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、又はウシパピローマウイルスに由来する発現ベクターが、本発明のポリヌクレオチド又はベクターを標的対象細胞集団中に送達するのに使用され得る。当業者に周知の方法を使用して、組換えウイルスベクターを構築することができる;例えば、Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y.及びAusubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.(1994)に記載の技術を参照。好ましい実施形態では、ベクターは、tacプロモーターの制御下で免疫原性ポリペプチドをコードする核酸配列を担持する細菌発現ベクターである。したがって、より好ましくは、前記ベクターは、機能的lacインヒビターをコードする発現可能な遺伝子をコードする遺伝子をさらに担持する。

したがって、好ましい実施形態では、ベクターは、好ましくは、p15A複製開始点を有し、tacプロモーターの制御下で、カナマイシン耐性遺伝子、機能的lacインヒビターをコードし、及び免疫原性ポリペプチドをコードする発現可能な遺伝子をコードする遺伝子を担持する細菌発現ベクターである。より好ましくは、ベクターは、配列番号82の配列を含むベクターである。

本発明は、本発明によるポリヌクレオチド、及び/又は本発明によるベクターを含む宿主細胞にも関する。

本明細書で使用する場合、用語「宿主細胞」は、本発明のポリヌクレオチド及び/又はベクターを受け入れ、そして好ましくはそれを維持する能力を有する任意の細胞に関する。より好ましくは、宿主細胞は、前記ポリヌクレオチド及び/又はベクター上でコードされる本発明の免疫原性ポリペプチドを発現する能力を有する。好ましくは、細胞は、細菌細胞、より好ましくは当技術分野において公知の一般的な研究用細菌系統の細胞、最も好ましくは大腸菌属(Escherichia)系統、特に大腸菌(E.coli)系統である。また好ましくは、宿主細胞は、真核細胞、好ましくは酵母菌細胞、例えば、パン酵母系統の細胞であるか、又は動物細胞である。より好ましくは、宿主細胞は、昆虫細胞、又は哺乳動物細胞、特にマウス若しくはラットの細胞である。最も好ましくは、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。

本発明は、本発明による免疫原性ポリペプチド、本発明によるポリヌクレオチド、本発明によるベクター、及び/又は本発明による宿主細胞、並びに製薬上許容される担体を含む医薬組成物にさらに関する。

用語「医薬組成物」は、本明細書で使用する場合、製薬上許容される形態の本発明の1つ又は複数の化合物、及び製薬上許容される担体を含む組成物に関する。本発明の化合物は、製薬上許容される塩として製剤化することができる。許容される塩は、アセテート、メチルエステル、HCl、スルフェート、塩化物等を含む。医薬組成物は、好ましくは、局所的又は全身的に投与される。薬物投与のために通常用いられる好適な投与経路は、経口、静脈内、又は非経口投与、並びに吸入である。好ましくは、本発明の医薬組成物は、非経口経路により、好ましくは皮下、筋肉内、又は腹腔内に投与される。被験体がヒトである場合、投与は筋肉内であるのが好ましい。しかし、ポリヌクレオチド化合物は、ウイルスベクター、ウイルス、又はリポソームを使用することにより、遺伝子治療アプローチにおいても投与され得るが、また局所的に、例えば、軟膏としても投与され得る。さらに、化合物は、共通する医薬組成物内の、又は分離した医薬組成物としてのその他の薬物と組み合わせて投与され得るが、前記分離した医薬組成物はキットの部分の形態で提供され得る。特に、アジュバントの同時投与は、本明細書に別途規定するように想定内である。好ましくは、免疫原性ポリペプチド、ポリヌクレオチド、及び医薬組成物は、凍結乾燥形態で提供される。

化合物は、好ましくは、従来手順に基づき、薬物を標準的な製薬担体と組み合わせることにより調製される従来型の剤形で投与される。この手順は、成分を、適宜、混合、造粒、及び圧縮、又は溶解して、所望の製剤にすることを含み得る。製薬上許容される担体又は希釈剤の形態及び特徴は、それと組み合わされる活性成分の量、投与経路、及びその他の周知の変動要素により規定されるものと理解されるだろう。

担体(複数可)は、製剤のその他の成分と適合するという意味で、及びそのレシピエントに有害でないという意味で、許容可能でなければならない。使用される製薬担体は、例えば、固体、ゲル、又は液体であることができる。固体担体の例として、ラクトース、白土、スクロース、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸等が挙げられる。液体担体の例として、リン酸緩衝生理食塩水、シロップ、ピーナッツ油及びオリーブ油等の油、水、乳剤、様々な種類の湿潤剤、滅菌溶液等が挙げられる。同様に、担体又は希釈剤には、モノステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリル等の当業者によく知られている時間遅延材料を、単独で、又はワックスとともに含めることができる。前記の好適な担体は、上記の担体及び当技術分野で周知の他の担体を含み、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvaniaを参照されたい。

希釈剤(複数可)が、免疫原性ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、又は宿主細胞、及び潜在的なさらなる製薬上活性な成分の生物学的活性に影響を及ぼさないように選択されるのが好ましい。このような希釈剤の例として、蒸留水、生理食塩水、リンゲル液、ブドウ糖液、及びハンクス液が挙げられる。それに加えて、医薬組成物又は製剤は、その他の担体、アジュバント、又は無毒性、非治療的、非免疫原性安定剤等も含み得る。

治療上有効な用量は、本明細書で言及される状態を予防、改善、又は治療する、本発明の医薬組成物に使用される化合物の量を表す。化合物の治療効果及び毒性は、細胞培養又は実験動物において、標準的な製薬手順により、例えばED50(集団の50%で治療上有効な用量)、及び/又はLD50(集団の50%に対して致死的な用量)を決定することにより決定することができる。治療効果と毒性作用の用量比が治療指数であって、それは比率LD50/ED50として表すことができる。

投与レジメンは、好ましくは、本明細書で別途記載される方法のいずれか1つにしたがって、好ましくは関連する臨床的要因を考慮しながら主治医によって決定される。医学分野でよく知られているように、一人の患者への投与量は、患者の体格、体表面積、年齢、投与される個別の化合物、性別、投与時期及び投与経路、全身健康状態、及び同時に投与されるその他の薬物を含む、多くの要因に依存し得る。経過は、定期的な評価によってモニターすることができる。典型的な用量は、例えば、好ましくは1日当たり、1〜10000μgの範囲であり得る。しかしながら、特に上記要因を考慮すれば、この例示された範囲より下又は上の用量が想定される。一般的に、医薬組成物を定期的に投与するようなレジメンは、1日当たり1μg〜10mg単位の範囲であるべきである。レジメンが連続注入である場合、やはり、それぞれ、1時間につき、体重1キログラム当たり1μg〜10mg単位の範囲であるべきである。しかし、被験体及び投与様式に応じて、物質の投与量は、体重1kg当たり約0.01mg〜体重1kg当たり約10mgを提供するために、広範囲にわたり変化し得るのが好ましい。本明細書で言及される医薬組成物及び製剤は、本明細書に記載の疾患又は病態を治療又は予防するために、少なくとも1回投与される。しかしながら、前記医薬組成物は、2回以上、例えば1日1回〜4回、無制限の日数まで投与することができる。

特定の医薬組成物は、医薬分野でよく知られた方法で調製され、また少なくとも1つの免疫原性ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、又は宿主細胞を、混合物中の活性化合物、さもなければ製薬上許容される担体又は希釈剤と付随する活性化合物として含む。それらの特定の医薬組成物を作製するために、活性化合物(複数可)は通常、担体又は希釈剤と混合されるか、或いはカプセル、分包、カシェ剤、薬包紙、又はその他の好適な容器若しくは送達媒体に封入又は被包される。その結果得られる製剤は、投与様式に適合し、すなわち錠剤、カプセル剤、坐剤、液剤、懸濁剤等の形をとる。推奨投与量は、検討されるレシピエントに応じた用量調節を予期するために、処方説明書若しくは使用説明書において指示されるべきである。

本発明は、本発明による免疫原性ポリペプチド及びアジュバントを含むキットにさらに関する。

さらに、本発明は、
(a)前記被験体を、本発明による免疫原性ポリペプチド、本発明によるポリヌクレオチド、本発明によるベクター、及び/又は本発明による宿主細胞と接触させること、並びに
(b)これにより、HPV感染症に対して前記被験体にワクチン接種すること
を含む、HPV感染症に対して被験体にワクチン接種する方法に関する。

本発明のワクチン接種する方法は、好ましくは、in vivoでの方法である。さらに、該方法は、上記で明記したステップに付加してステップを含み得る。例えば、さらなるステップは、例えば、前記被験体を、本明細書で別途規定するようなアジュバントと接触させること、及び/又は免疫応答を増強するために、本発明の化合物との前記接触を反復することと関連し得る。ワクチン接種する方法では、被験体は、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。

さらに、本発明は、
(a)被験体を、本発明による免疫原性ポリペプチド、本発明によるポリヌクレオチド、本発明によるベクター、及び/又は本発明による宿主細胞と接触させること、並びに
(b)前記被験体の体液から前記被験体より生成された抗体を回収すること、及び/又は前記被験体から、前記抗体を産生する細胞を回収すること
を含む、HPV L2ポリペプチドに対する抗体を生産する方法に関する。

本発明の抗体を生産する方法は、好ましくはヒト以外の被験体上で実施されるin vivoでの方法であるのが好ましい。好ましくは、ヒト以外の被験体は、方法の実施後に屠殺される。さらに、方法は、上記で明記したステップに付加して、ステップを含み得る。例えば、さらなるステップは、例えば、回収された抗体を精製すること、又は周知の方法に基づき、回収された細胞を融合させて、モノクローナル抗体を産生する細胞株を生成することと関連し得る。また、方法ステップの1つ以上は、自動化された機器によっても実施され得る。

上記を踏まえ、下記の実施形態が好ましい:
1. HPV16のL2ポリペプチドのアミノ酸20〜50に対応する、多数のヒトパピローマウイルス(HPV) L2 N末端ペプチドを含む免疫原性ポリペプチドであって、前記HPV L2 N末端ペプチドが、少なくとも2つの異なるHPV遺伝子型に由来するL2 N末端ペプチドである前記免疫原性ポリペプチド。

2.前記多数が、少なくとも3個、好ましくは少なくとも5個、より好ましくは7、8、9、10、11、又は12個、なおいっそうより好ましくは7、8、又は9個、最も好ましくは8個のHPV L2 N末端ペプチドの数である、実施形態1に記載の免疫原性ポリペプチド。

3.前記多数が、3〜11個、好ましくは5〜10個、より好ましくは7〜9個、最も好ましくは8個のHPV L2 N末端ペプチドの数である、実施形態1又は2に記載の免疫原性ポリペプチド。

4.前記HPV L2 N末端ペプチドが、HPV16のL2ポリペプチドのアミノ酸20〜38に対応するペプチドである、実施形態1〜3のいずれか1つに記載の免疫原性ポリペプチド。

5.前記HPV L2 N末端ペプチドが、少なくとも4個、好ましくは少なくとも5個、より好ましくは7、8、9、10、11、若しくは12個、最も好ましくは8個の異なるHPV遺伝子型に由来するL2 N末端ペプチドであるか、又はHPV L2 N末端ペプチド1個当たり最大2個、好ましくは最大1個のアミノ酸置換を含むそのバリアントである、実施形態1〜4のいずれか1つに記載の免疫原性ポリペプチド。

6.前記HPV L2 N末端ペプチドが、少なくとも4個、好ましくは少なくとも5個、より好ましくは7、8、9、10、11、又は12個、最も好ましくは8個の異なるHPV遺伝子型に由来するL2 N末端ペプチドである、実施形態1〜5のいずれか1つに記載の免疫原性ポリペプチド。

7.前記HPV L2 N末端ペプチドが、HPV遺伝子型6、16、18、31、33、35、39、45、51、56、59、及び82のL2 N末端ペプチド、又はHPV L2 N末端ペプチド1個当たり最大2個、好ましくは最大1個のアミノ酸置換を含むそのバリアントを含み、好ましくは、前記HPV L2 N末端ペプチドが、HPV遺伝子型6、16、18、31、33、35、51、及び59のL2 N末端ペプチド、又はHPV L2 N末端ペプチド1個当たり最大2個、好ましくは最大1個のアミノ酸置換を含むそのバリアントを含む、実施形態1〜6のいずれか1つに記載の免疫原性ポリペプチド。

8.前記HPV L2 N末端ペプチドが、HPV遺伝子型6、16、18、31、33、35、39、45、51、56、59、及び82のL2 N末端ペプチドを含み、好ましくは前記HPV L2 N末端ペプチドが、HPV遺伝子型6、16、18、31、33、35、51、及び59のL2 N末端ペプチドを含む、実施形態1〜7のいずれか1つに記載の免疫原性ポリペプチド。

9.前記HPV L2 N末端ペプチドそれぞれについて、その3個のコピー、より好ましくは2個のコピー、最も好ましくは1個のコピーを含む、実施形態1〜8のいずれか1つに記載の免疫原性ポリペプチド。

10. HPV遺伝子型6、16、18、31、33、35、39、45、51、56、59、及び82のL2 N末端ペプチド、又はHPV L2 N末端ペプチド1個当たり最大2個、好ましくは最大1個のアミノ酸置換を含むそのバリアントをもっぱら含む、好ましくはそれらからなる、実施形態1〜9のいずれか1つに記載の免疫原性ポリペプチド。

11. HPV遺伝子型6、16、18、31、33、35、39、45、51、56、59、及び82のL2 N末端ペプチドをもっぱら含む、好ましくはそれらからなる、実施形態1〜10のいずれか1つに記載の免疫原性ポリペプチド。

12. HPV遺伝子型6、16、18、31、33、35、51、及び59のL2 N末端ペプチドそれぞれについて、その1個のコピーをもっぱら含む、好ましくはそれらからなる、又はHPV L2 N末端ペプチド1個当たり最大2個、好ましくは最大1個のアミノ酸置換を含む、多数のHPV L2 N末端ペプチドを含む前記ポリペプチドのバリアントである、実施形態1〜11のいずれか1つに記載の免疫原性ポリペプチド。

13. HPV遺伝子型6、16、18、31、33、35、51、及び59のL2 N末端ペプチドそれぞれについて、その1個のコピーをもっぱら含む、好ましくはそれらからなる、実施形態1〜12のいずれか1つに記載の免疫原性ポリペプチド。

14. HPV 16-18-31-33-35-39-45-51-56-59-82の配列で、より好ましくはHPV 16-18-31-33-35-6-51-59の配列で、好ましくは直接連続した配列で、より好ましくは5、3、又は2個のアミノ酸リンカーにより分離している前記HPV L2 N末端ペプチドを含む、実施形態1〜13のいずれか1つに記載の免疫原性ポリペプチド。

15.前記多数のHPV L2 N末端ペプチドが、配列番号25若しくは26を含む、好ましくはそれからなる、又はHPV L2 N末端ペプチド1個当たり最大2個、好ましくは最大1個のアミノ酸置換を含む、前記免疫原性ポリペプチドのバリアントである、実施形態1〜14のいずれか1つに記載の免疫原性ポリペプチド。

16.配列番号25又は26のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、実施形態1〜15のいずれか1つに記載の免疫原性ポリペプチド。

17. HPV遺伝子型(複数可)39、45、56、及び/又は82のL2 N末端ペプチドを欠いている、実施形態1〜16のいずれか1つに記載の免疫原性ポリペプチド。

18.オリゴマー化ドメインをさらに含み、好ましくは前記オリゴマー化ドメインが、
(i) C4-結合タンパク質の、好ましくは哺乳動物のC4-結合タンパク質の、より好ましくはヒト又はマウスのC4-結合タンパク質の、最も好ましくはマウスのC4-結合タンパク質のオリゴマー化ドメイン、
(ii)エンカプスリンポリペプチド、好ましくは好熱性古細菌由来のエンカプスリンポリペプチド、より好ましくはパイロコッカス・フリオサスのエンカプスリンポリペプチド、
(iii)フェリチンポリペプチド、好ましくは好熱性古細菌由来のフェリチンポリペプチド、より好ましくはパイロコッカス・フリオサスのフェリチンポリペプチド、及び
(iv) 2つの異なるニワトリのC4-結合タンパク質のハイブリッドポリペプチド、好ましくはIMX313Tポリペプチド
のうちの少なくとも1つである、実施形態1〜17のいずれか1つに記載の免疫原性ポリペプチド。

19.前記オリゴマー化ドメインが、配列番号55又は56を含む、好ましくはそれからなる、実施形態1〜18のいずれか1つに記載の免疫原性ポリペプチド。

20.好ましくは、前記免疫原性ポリペプチドのN末端及び/又はC末端に免疫原性のエンハンサーをさらに含む、実施形態1〜19のいずれか1つに記載の免疫原性ポリペプチド。

21.前記免疫原性のエンハンサーが、CD4+Tヘルパーエピトープであるか、又はアミノ酸配列RGDを含むペプチドである、実施形態20に記載の免疫原性ポリペプチド。

22.前記CD4+Tヘルパーエピトープが、
(i)三日熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパクのカルボキシル領域に由来するp25、
(ii)破傷風毒素に由来するp2ペプチド、
(iii)破傷風毒素に由来するp30ペプチド、及び
(iv) Pan HLA-DR反応性エピトープ(PADRE)
のうちの少なくとも1つを含む、実施形態21に記載の免疫原性ポリペプチド。

23.前記CD4+Tヘルパーエピトープが、配列番号57を含む、好ましくはそれからなる、実施形態21又は22に記載の免疫原性ポリペプチド。

24.前記多数のHPV L2 N末端ペプチドが、チオレドキシンポリペプチドに含まれる、実施形態1〜23のいずれか1つに記載の免疫原性ポリペプチド。

25.前記チオレドキシンが、ヒト、細菌、又は古細菌のチオレドキシンである、実施形態1〜24のいずれか1つに記載の免疫原性ポリペプチド。

26.前記チオレドキシンが、好熱性古細菌、好ましくはパイロコッカス・フリオサスのチオレドキシンであり、好ましくは配列番号53の配列を有する、実施形態1〜25のいずれか1つに記載の免疫原性ポリペプチド。

27.前記多数のHPV L2 N末端ペプチドが、前記チオレドキシンの提示部位内に含まれる、実施形態1〜26のいずれか1つに記載の免疫原性ポリペプチド。

28.融合ポリペプチドであり、好ましくは前記免疫原性ポリペプチドの要素が、アミノ酸配列内で連続している、実施形態1〜27のいずれか1つに記載の免疫原性ポリペプチド。

29.医薬における使用のための、実施形態1〜28のいずれか1つに記載の免疫原性ポリペプチド。

30. HPV感染症に対するワクチン接種における使用のための、実施形態1〜28のいずれか1つに記載の免疫原性ポリペプチド。

31.前記ワクチン接種が、少なくともHPV遺伝子型6、16、18、31、33、35、51、及び59感染症に対するワクチン接種であり、好ましくは、少なくともHPV遺伝子型5、6、11、16、18、31、33、35、39、45、51、及び59感染症に対するワクチン接種である、実施形態27の使用のための免疫原性ポリペプチド。

32.前記ワクチン接種が、HPV遺伝子型31、35、及び51感染症に対するワクチン接種である、実施形態30又は31の使用のための免疫原性ポリペプチド。

33.前記ワクチン接種が、アジュバントを投与するステップをさらに含み、前記アジュバントが、好ましくは(i)アラム及びToll様受容体4 (TLR4)アンタゴニスト、好ましくは合成モノホスホリルリピドA (MPLA)、並びに/又は(ii)スクアレンに基づく水中油型ナノエマルジョン、好ましくはAddaVax (商標)を含む、実施形態30〜32のいずれか1つの使用のための免疫原性ポリペプチド。

34. HPV L2ポリペプチドを特異的に認識する抗体の生成における使用のための、実施形態1〜28のいずれか1つに記載の免疫原性ポリペプチド。

35.実施形態1〜28のいずれか1つに記載の免疫原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。

36.実施形態35に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。

37.実施形態35に記載のポリヌクレオチド、及び/又は実施形態36に記載のベクターを含む宿主細胞。

38.実施形態1〜28のいずれか1つに記載の免疫原性ポリペプチド、実施形態35に記載のポリヌクレオチド、実施形態36に記載のベクター、及び/又は実施形態37に記載の宿主細胞、並びに製薬上許容される担体を含む医薬組成物。

39.実施形態1〜28のいずれか1つに記載の免疫原性ポリペプチド及びアジュバントを含むキットであって、前記アジュバントが、好ましくは(i)アラム及びToll様受容体4 (TLR4)アンタゴニスト、好ましくは合成モノホスホリルリピドA (MPLA)、並びに/又は(ii)スクアレンに基づく水中油型ナノエマルジョン、好ましくはAddaVax(商標)を含む前記キット。

40. HPV感染症に対して被験体にワクチン接種する方法であって、
(a)前記被験体を、実施形態1〜28のいずれか1つに記載の免疫原性ポリペプチド、実施形態35に記載のポリヌクレオチド、実施形態36に記載のベクター、及び/又は実施形態37に記載の宿主細胞と接触させること、並びに
(b)これにより、HPV感染症に対して前記被験体をワクチン接種すること
を含む前記方法。

41.実施形態40の被験体にワクチン接種する方法であって、アジュバントを投与することをさらに含み、前記アジュバントが、好ましくは(i)アラム及びToll様受容体4 (TLR4)アンタゴニスト、好ましくは合成モノホスホリルリピドA (MPLA)、並びに/又は(ii)スクアレンに基づく水中油型ナノエマルジョン、好ましくはAddaVax(商標)を含む前記方法。

42. HPV L2ポリペプチドに対する抗体を生産する方法であって、
(a)被験体を、実施形態1〜28のいずれか1つに記載の免疫原性ポリペプチド、実施形態35に記載のポリヌクレオチド、実施形態36に記載のベクター、及び/又は実施形態37に記載の宿主細胞と接触させること、並びに
(b)前記被験体の体液から前記被験体より生成された抗体を回収すること、及び/又は前記被験体から前記抗体を産生する細胞を回収すること
を含む前記方法。
本発明のさらなる様々な実施形態を以下に示す。
１．HPV16のL2ポリペプチドのアミノ酸20〜50に対応する、多数のヒトパピローマウイルス(HPV) L2 N末端ペプチドを含む免疫原性ポリペプチドであって、前記HPV L2 N末端ペプチドが、少なくとも4個、好ましくは少なくとも5個、より好ましくは7、8、9、10、11、若しくは12個、最も好ましくは8個の異なるHPV遺伝子型に由来するL2 N末端ペプチであるか、又はHPV L2 N末端ペプチド1個当たり最大2個、好ましくは最大1個のアミノ酸置換を含むそのバリアントである前記免疫原性ポリペプチド。
２．前記多数が、5〜10個、好ましくは7〜9個、最も好ましくは8個のHPV L2 N末端ペプチドの数である、上記1に記載の免疫原性ポリペプチド。
３．前記HPV L2 N末端ペプチドが、HPV16のL2ポリペプチドのアミノ酸20〜38に対応するペプチドである、上記1又は2に記載の免疫原性ポリペプチド。
４．前記HPV L2 N末端ペプチドが、少なくとも5個、好ましくは7、8、9、10、11、又は12個、最も好ましくは8個の異なるHPV遺伝子型に由来するL2 N末端ペプチドである、上記1〜3のいずれかに記載の免疫原性ポリペプチド。
５．HPV 16-18-31-33-35-39-45-51-56-59-82の配列で、より好ましくはHPV 16-18-31-33-35-6-51-59の配列で、好ましくは直接連続した配列で、より好ましくは5、3、又は2個のアミノ酸リンカーにより分離している前記HPV L2 N末端ペプチドを含む、上記1〜4のいずれかに記載の免疫原性ポリペプチド。
６．前記多数のHPV L2 N末端ペプチドが、配列番号25若しくは26を含む、好ましくはそれからなる、又はHPV L2 N末端ペプチド1個当たり最大2個、好ましくは最大1個のアミノ酸置換を含む前記免疫原性ポリペプチドのバリアントである、上記1〜5のいずれかに記載の免疫原性ポリペプチド。
７．オリゴマー化ドメインをさらに含み、好ましくは前記オリゴマー化ドメインが、
(i) C4-結合タンパク質の、好ましくは哺乳動物のC4-結合タンパク質の、より好ましくはヒト又はマウスのC4-結合タンパク質の、最も好ましくはマウスのC4-結合タンパク質のオリゴマー化ドメイン、
(ii)エンカプスリンポリペプチド、好ましくは好熱性古細菌由来のエンカプスリンポリペプチド、より好ましくはパイロコッカス・フリオサスのエンカプスリンポリペプチド、
(iii)フェリチンポリペプチド、好ましくは好熱性古細菌由来のフェリチンポリペプチド、より好ましくはパイロコッカス・フリオサスのフェリチンポリペプチド、及び
(iv) 2つの異なるニワトリのC4-結合タンパク質のハイブリッドポリペプチド、好ましくはIMX313Tポリペプチド
のうちの少なくとも1つである、上記1〜6のいずれかに記載の免疫原性ポリペプチド。
８．好ましくは、前記免疫原性ポリペプチドのN末端及び/又はC末端に免疫原性のエンハンサーをさらに含む、上記1〜7のいずれかに記載の免疫原性ポリペプチド。
９．前記多数のHPV L2 N末端ペプチドが、チオレドキシンポリペプチドに含まれる、上記1〜8のいずれかに記載の免疫原性ポリペプチド。
１０．医薬における使用のための、上記1〜8のいずれかに記載の免疫原性ポリペプチド。
１１．HPV感染症に対するワクチン接種における使用のための、上記1〜8のいずれかに記載の免疫原性ポリペプチド。
１２．上記1〜8のいずれかに記載の免疫原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
１３．上記12に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
１４．上記12に記載のポリヌクレオチド、及び/又は上記13に記載のベクターを含む宿主細胞。
１５．上記1〜8のいずれかに記載の免疫原性ポリペプチド及びアジュバントを含むキットであって、前記アジュバントが、好ましくは(i)アラム及びToll様受容体4 (TLR4)アンタゴニスト、好ましくは合成モノホスホリルリピドA (MPLA)、並びに/又は(ii)スクアレンに基づく水中油型ナノエマルジョン、好ましくはAddaVax(商標)を含む前記キット。
１６．HPV L2ポリペプチドに対する抗体を生成する方法であって、
(a)被験体を、上記1〜8のいずれかに記載の免疫原性ポリペプチド、上記12に記載のポリヌクレオチド、上記13に記載のベクター、及び/又は上記14に記載の宿主細胞と接触させること、並びに
(b)前記被験体の体液から前記被験体より生成された抗体を回収すること、及び/又は前記被験体から前記抗体を産生する細胞を回収すること
を含む前記方法。
１７．上記1〜11のいずれかに記載の免疫原性ポリペプチド、上記12に記載のポリヌクレオチド、上記13に記載のベクター、及び/又は上記14に記載の宿主細胞、並びに製薬上許容される担体を含む医薬組成物。

本明細書で引用されたすべての参考文献は、その開示内容全体及び本明細書において具体的に記載された開示内容に関して、参照により本明細書に組み込まれる。

マウスにおける、Padre配列を含む様々な免疫原性ポリペプチドによる中和抗体力価の誘導を示す図である。ヘテロマーのPfTrx-8mer及びPfTrx-11mer構築物を、PfTrx-ホモトリマーの混合物(Mix 16/18/51)と比較した。パネルは、A) HPV16、B) HPV18、C) HPV31、D) HPV45、E) HPV33、F) HPV51、G) HPV35、H) HPV52、及びI) HPV58に対して、マウスにおいて測定された中和力価の力価を示す。示した各数値は、マウス1匹を表し、水平ラインは平均値を表す。 図１−１の続きである。 図１−１の続きである。 図１−１の続きである。 図１−１の続きである。 マウスにおける、IMX配列を含む様々な免疫原性ポリペプチドによる中和抗体力価の誘導を示す図である。ホモトリマーのHPV16 L2 N末端ペプチドを、IMX融合体として、PfTrx融合体として、又はIMX及びPfTrxの両方を含有する融合タンパク質として使用した。パネルは、A) HPV16、B) HPV18、及びC) HPV45に対する、マウスにおいて測定された中和力価の力価を示す。示した各数値は、マウス1匹を表し、水平ラインは平均値を表す。 図２−１の続きである。 アジュバントの比較を示す図である。ホモトリマーのHPV16 L2 N末端ペプチドを含有し、及びIMXをさらに含む又は含まないPfTrxを、抗原(Trx-L2-IMX、pfTrx-L2-IMX、及びTrx-L2)として使用した、A)及びB。さらに、構築物を、8mer及び11mer混合構築物と比較した、C)〜G)。パネルは、マウス9〜10匹において測定された、A) HPV16、B) HPV18; C) HPV16、D) HPV18、E) HPV33、F) HPV51、及びG) HPV58に対する中和力価の力価を示す。A/M:アラム/MPLA。示した各数値は、マウス1匹を表し、水平ラインは平均値を表す。 図３−１の続きである。 図３−１の続きである。 図３−１の続きである。 マウスにおける、IMX配列を含む様々な免疫原性ポリペプチドによる中和抗体力価の誘導を示す図である。ホモトリマーのHPV16 L2 N末端ペプチドを、ヘテロマーのPfTrx-8mer及びPfTrx-11mer構築物と比較した。パネルは、マウスにおいて測定された、A) HPV16、B) HPV18、C) HPV31、D) HPV33、E) HPV35、F) HPV39、G) HPV45、H) HPV51、I) HPV52、及びK) HPV58に対する中和力価の力価を示す。示した各数値は、マウス1匹を表し、水平ラインは平均値を表す。 図４−１の続きである。 図４−１の続きである。 図４−１の続きである。 図４−１の続きである。 示すような様々な免疫原性ポリペプチドによる中和抗体力価の誘導を示す図である。パネルは、マウスにおいて測定された、A) HPV16、B) HPV18、C) HPV31、D) HPV33、E) HPV35、F) HPV39、G) HPV45、H) HPV51、I) HPV52、及びK) HPV58に対する中和力価の力価を示す。示した各数値は、マウス1匹を表し、水平ラインは平均値を表す。 図５−１の続きである。 図５−１の続きである。 図５−１の続きである。 図５−１の続きである。 本発明による免疫原性ポリペプチドのアミノ酸配列を示す図である。A) 11merヘテロマーポリペプチド(配列番号25)、B) 8merヘテロマーポリペプチド(配列番号26)、C) P.フリオサスチオレドキシンに含まれる11merヘテロマーポリペプチド(配列番号27、A) P.フリオサスチオレドキシンに含まれる11merヘテロマーポリペプチド(配列番号29)。 偽ウイルス粒子に基づく中和アッセイ(PBNA)におけるマウス(N=10; A))及びモルモット(N=2;B))由来の血清の中和力価を示す図である。使用した抗原は、PfTrx 8mer-IMX3T3 (配列番号43)であった。各ドットは、動物1匹から回収した血清について得られた数値を表す。 L2増強型偽ウイルス粒子に基づく中和アッセイ(L2-PBNA)における、マウス(N=10; A))及びモルモット(N=2; B))に由来する血清の中和力価を示す図である。使用した抗原は、PfTrx 8mer-IMX3T3 (配列番号43)であった。各ドットは、動物1匹から回収した血清について得られた数値を表す。

[実施例]
下記の実施例は、本発明を説明するに過ぎない。実施例が、本発明の範囲を限定するものと一切解釈してはならない。

実施例1：免疫原の生成及び免疫
実験では、様々な構築物を使用した:PfTrx8merは、HPV 16-18-31-33-35-6-51-59の配列で、HPV16のL2ポリペプチドのアミノ酸20〜38に対応するHPV L2 N末端ペプチドを有する、P.フリオサスチオレドキシンである。PfTrx11merは、HPV 16-18-31-33-35-39-45-51-56-59-82の配列で、HPV16のL2ポリペプチドのアミノ酸20〜38に対応するHPV L2 N末端ペプチドを有する、P.フリオサスチオレドキシンである。Mix 16/31/51という用語は、HPV16、HPV31、及びHPV51にそれぞれ由来するHPV16のL2ポリペプチドのアミノ酸20〜38に対応する、3つのHPV16 L2 N末端同一ペプチドを含むP.フリオサスチオレドキシン混合物に関する。名称「Padre」を含む免疫原は、追加のPadre配列を含み、名称「imx」を含む免疫原は、追加のimxドメインを含んだ。比較では、ホモトリマー又はモノマーのHPV16 L2 N末端ペプチドを含む対応する構築物を使用した(配列番号62〜81)。

示すような構築物は、テキストより公知の方法に基づく標準的な組換えDNA技術及び分子クローニング法と、それに後続する本明細書で以下に記載するような大腸菌(E. coli)内産生及び精製により取得した。免疫原性ポリペプチドを本質的に以前記載の通り(WO2010/070052)、及び本明細書で以下に記載するように取得した。

6〜8週齢の雌BALB/cマウスをCharles River Laboratories社から購入し、そして特定の病原体を含まない条件下、動物施設内で保管した。アジュバントと混合した抗原を用いて、2週間の間隔で、マウスを4回、筋肉内免疫した。アラム/MPLA実験では、抗原20μgを、水酸化アルミニウム(Brenntag社)50μg、及び合成モノホスホリルリピドA (MPLA、AvantiLipids社)10μgでアジュバント化した。モンタニドISA720 (Seppic社、フランス)及びAddavax(商標) (InvivoGen社)の場合、抗原20μgを、50%V/Vのアジュバントと混合した。標準プロトコールに基づき、モルモットを免疫した。

実施例2：偽ウイルス粒子に基づく中和アッセイ
偽ウイルス粒子に基づく中和アッセイ(PBNA)を、本質的にWO2011/151335の記載に従い実施した。要するに、稀釈された血清50μlを、稀釈された偽ウイルス粒子50μlと混ぜ合わせ、そして室温で20分間インキュベートした。次に、HeLa T細胞(2.5×10⁵細胞/ml)50μlを、偽ウイルス粒子-抗体混合物に添加し、そして加湿インキュベーター内、37℃で48時間インキュベートした。分泌されたガウシアルシフェラーゼの量を、ガウシアグロウジュースキット(Gaussia glow juice kit) (PJK社、ドイツ)を使用して、製造業者の指示に従い、細胞培養培地10μl中で測定した。サンプルの光発光を、基質添加から15分後に測定した。

抗L1抗体に対して本質的に同一の感度を有するが、抗L2抗体に対する感度は顕著に増加しているL2増強型偽ウイルス粒子に基づく中和アッセイ(L2-PBNA)では、Day et al.(2012), Clinical and Vaccine Immunology 19(7):1075の記載に本質的に従い、PBNAを改変した。要するに、L2-PBNAでは、HPV偽ウイルス粒子を細胞外マトリックスに結合させ、そしてフューリンで処理し、より良好なL2曝露を引き起こした。この処理を実施した後に限り、実際のPBNAを実施する。マウス及びモルモットの血清を用いたL2-PBNAの結果を図8に示す。

実施例3：IMX-Trx-L2(20-38)8-merワクチンの生産及び精製
細菌を形質転換し、そして組換え抗原の発現をIPTG媒介により誘導(30℃、一晩)するのに、標準手順を使用した。誘導された細菌細胞を超音波溶解し、遠心分離(10,000×g、15分)により可溶性分画を回収し、凍結/解凍サイクルを上清に1回適用し、及び上記と同様の追加の遠心分離ステップを実施した後、可溶化された細菌溶解物を、25mMのトリス-HCl、pH7.5、100mMのNaCl中、流速1.0ml/分で平衡化したヘパリン-アフィニティークロマトグラフィーカラム(Hi-Trap Heparin、GE Healthcare社)に供した。代表的な中規模スケールの調製では、細菌培養物500mlに由来する可溶性溶解物50mlを1mlのHi-Trap Heparinカラムに適用し、開始バッファー内で0.1M〜2.0M NaCl、30mlのリニアグラジエントを用いて溶出させた。溶出したタンパク質のSDS-PAGE解析により明らかなように(天然型のMW: 248,339;サブユニットのMW: 35,477)、ヘパリン-アフィニティー分画では、単一ステップでほぼ90%の抗原精製を実現した。必要な場合には、さらなる精製(実質的にほぼ均質な100%レベルまで)を、流速0.7ml/分で25mMトリス/HCl-150mM NaClにおいて平衡化され、ランするSuperdex200カラム(24ml; GE Healthcare社)上でのゲル濾過クロマトグラフィーにより実施した。

Claims (16)

1. HPV16のL2ポリペプチドのアミノ酸20〜38に対応する、少なくとも8個のヒトパピローマウイルス(HPV) L2ペプチドを含む融合ポリペプチドである免疫原性ポリペプチドであって、前記HPV L2ペプチドが、少なくとも8個の異なるHPV遺伝子型に由来するL2ペプチドであるか、又はHPV L2ペプチド1個当たり最大2個のアミノ酸置換を含むそのバリアントである前記免疫原性ポリペプチド。
2. 前記融合ポリペプチドが、8、9、10、11又は12個のHPV L2ペプチドを含む、請求項1に記載の免疫原性ポリペプチド。
3. 前記HPV L2ペプチドのそれぞれの1コピーを含む、請求項1又は2に記載の免疫原性ポリペプチド。
4. HPV 16-18-31-33-35-6-51-59の配列でHPV L2ペプチドを含む融合ポリペプチドからなる、請求項1〜3のいずれか一記載の免疫原性ポリペプチド。
5. HPV 16-18-31-33-35-39-45-51-56-59-82の配列でHPV L2ペプチドを含む融合ポリペプチドからなる、請求項1〜3のいずれか一項に記載の免疫原性ポリペプチド。
6. 前記融合ポリペプチドが、配列番号25若しくは26を含む、又はHPV L2ペプチド1個当たり最大2個のアミノ酸置換を含む前記免疫原性ポリペプチドのバリアントである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の免疫原性ポリペプチド。
7. 前記融合ポリペプチドがオリゴマー化ドメインをさらに含み、前記オリゴマー化ドメインが、
   (i) C4-結合タンパク質のオリゴマー化ドメイン、
   (ii)エンカプスリンポリペプチド、
   (iii)フェリチンポリペプチド、及び
   (iv) 2つの異なるニワトリのC4-結合タンパク質のハイブリッドポリペプチド、
   のうちの少なくとも1つである、請求項1〜6のいずれか一項に記載の免疫原性ポリペプチド。
8. 免疫原性のエンハンサーをさらに含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の免疫原性ポリペプチド。
9. 前記少なくとも8個のHPV L2ペプチドが、チオレドキシンポリペプチドに含まれる、請求項1〜8のいずれか一項に記載の免疫原性ポリペプチド。
10. 医薬における使用のための、請求項1〜8のいずれか一項に記載の免疫原性ポリペプチド。
11. 
    HPV感染症に対するワクチン接種における使用のための、請求項1〜8のいずれか一項に記載の免疫原性ポリペプチド。
12. 請求項1〜8のいずれか一項に記載の免疫原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
13. 請求項12に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
14. 請求項12に記載のポリヌクレオチド、及び/又は請求項13に記載のベクターを含む宿主細胞。
15. 請求項1〜8のいずれか一項に記載の免疫原性ポリペプチド及びアジュバントを含むキットであって、前記アジュバントが、(i)アラム及びToll様受容体4 (TLR4)アンタゴニスト、及び/又は(ii)スクアレンに基づく水中油型ナノエマルジョンを含む前記キット。
16. 請求項1〜11のいずれか一項に記載の免疫原性ポリペプチド、請求項12に記載のポリヌクレオチド、請求項13に記載のベクター、及び/又は請求項14に記載の宿主細胞、並びに製薬上許容される担体を含む医薬組成物。
    

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