JP6971419B2 - クローディン６を標的とする多重特異性抗原結合分子およびその使用 - Google Patents

クローディン６を標的とする多重特異性抗原結合分子およびその使用 Download PDF

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Description

本開示は、クローディン6を標的とする多重特異性抗原結合分子およびその使用等に関する。
クローディンファミリーは、4つの膜貫通ドメインを有し、タイトジャンクションを構成する、分子量およそ23 kDの細胞膜タンパク質のファミリーである。クローディンファミリーは、ヒトおよびマウスにおいて24種類のメンバーを含み、クローディンファミリーの各メンバーは、各上皮細胞型に応じて非常にユニークな発現パターンを示すことが公知である（非特許文献1〜非特許文献4）。上皮細胞のシートにおいては、物質が細胞間隙に漏出（拡散）するのを防ぐようにある機構が働き、タイトジャンクションと呼ばれる細胞間接着システムは、この漏出を防ぐ機構において「バリア」としての中心的役割を実際に果たすことが示されている。
タイトジャンクション分子クローディン6（CLDN6）は、クローディンファミリータンパク質のメンバーであり、正常な生体組織では転写的に発現していない（非特許文献5および非特許文献6）が、卵巣がん、NSCLC、および胃がんなどの複数種類のがんでは発現上昇を示す（非特許文献7〜非特許文献9）。
抗CLDN6抗体に関して、CLDN6に対する単一特異性抗体は、CLDN6陽性がん細胞株に対してADCC活性または内部移行活性を有することが報告されている（特許文献1〜特許文献5）。これまでに、6PHU3と名付けられた、CLDN6を標的とするT細胞リダイレクティング二重特異性抗体が、抗CD3/抗CLDN6特異性を有する二重特異性sc(Fv)2形式を用いて作られている（特許文献6〜特許文献7）。前臨床評価において、6PHU3は、in vitroおよびin vivoでがん細胞の強力な殺傷を示すことが報告されている（非特許文献10）。
WO2009/087978 WO2011/057788 WO2012/003956 WO2012/156018 WO2015/069794 WO2014/075697 WO2014/075788
Furuse and Tsukita, TRENDS in Cell Biology 2006, 16: 181 Wilcox, et al., Cell 2001, 104: 165 Rahner, et al., GASTROENTEROLOGY 2001, 120: 411 Morita, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96: 511 Dev Dyn. 2004 Oct;231(2):425-31. Am J Physiol Renal Physiol. 2006 Dec;291(6):F1132-41. Int J Cancer. 2014 Nov 1;135(9):2206-14. Histopathology. 2012 Dec;61(6):1043-56. J Gastrointest Cancer. 2010 Mar;41(1):52-9. Oncoimmunology. 2015 Oct 29;5(3):e1091555.
本開示の目的は、標的がん細胞、特に、がん細胞などのCLDN6発現細胞にT細胞を効率的かつ特異的に動員することができ、かつCLDN6発現細胞を含有する標的がん組織に対するT細胞の細胞傷害活性を通じてがんを治療することができる、多重特異性抗原結合分子；該抗原結合分子を産生するための方法；および該抗原結合分子を有効成分として含む医薬組成物を提供することである。本発明はまた、先行技術の多重特異性抗原結合分子が有し得る有害毒性の懸念または副作用を回避しつつ、より効率的にT細胞依存性細胞傷害を誘導する多重特異性抗原結合分子を得るための方法も提供する。
具体的には、本開示は、CD3およびCD137（4-1BB）に結合することができるが、CD3とCD137に同時には結合しない（すなわち、CD3およびCD137にデュアル(dual)結合性であるが、同時ではない）、第1の抗原結合部分と、がん組織に特異的に発現している分子、特にクローディン6（CLDN6）に結合することができる第2の抗原結合部分とを含む、抗原結合分子を提供する。
有利なことに、本開示の多重特異性抗原結合分子は、CD3への結合能力に加えてCD137へのデュアル結合能力を有することによって、CD3のみに結合するT細胞動員二重特異性抗体と比較して、CD3シグナル伝達に加えて共刺激因子CD137の相乗的なシグナル伝達が寄与する、増強されたT細胞依存性細胞傷害活性を示す。加えて、CD3およびCD137への抗原結合分子の結合は同時ではない（すなわち、CD3とCD137に同時には結合しない）ことから、同じ抗原結合分子による、異なる免疫細胞（例えば、T細胞）上に発現しているCD3および/またはCD137への同時結合は生じず、それによって、T細胞上に発現しているCD3および第2の分子（例えば、CD137）に同時に結合することができる従来の多重特異性抗原結合分子をin vivoで投与した場合に有害反応を担うと考えられる異なる免疫細胞間の望ましくない架橋を原因とする全身毒性の懸念が回避される。
加えて、本発明者らは、CD3に対する本開示の抗原結合分子のデュアル結合活性に悪影響を与えずにCD137に対する結合活性をエンジニアリングおよび改善することによって、1000個を超えるバリアントの中から、がん抗原（CLDN6）依存的様式で腫瘍に対して優れたT細胞依存性細胞傷害活性を示す、特定の軽鎖相補性決定領域（LCDR）または軽鎖可変領域（VL）と共に特定の重鎖相補性決定領域（HCDR）または重鎖可変領域（VH）を含む抗原結合分子を選択した。1つの局面において、本発明者らは驚くべきことに、選択された抗原結合分子は、最適なCD3およびCD137結合プロファイルに変えることによって、毒性が低い、強力なT細胞依存性細胞傷害活性を示すことを見出した。
最後に、多重特異性抗体の開発における共通の課題は、臨床上十分な量および純度での多重特異性抗体構築物の産生であり、これは、正しく組み合わされた構築物の収量を低減させ、かつ所望の多重特異性抗体の分離を困難にするおそれがある多数の非機能性副生成物をもたらす、異なる特異性の抗体重鎖と軽鎖との同時発現時のミスペアリングに起因する。1つの局面において、本開示は、入念な抗体エンジニアリングおよび分子形式設計（定常領域における荷電性変異、VH/VL交換、およびFc領域選択を含む）により、良好な抗がん有効性および低毒性と好適な安定性、製造性/生産性、および構造均一性とを併せ持つ、T細胞の活性化およびリダイレクティングのために設計された多重特異性抗原結合分子を提供する。
すべての上述の努力の結果として、抗原結合分子およびその医薬組成物は、種々のがん、特に、CLDN6陽性腫瘍などのCLDN6に関連するがんを治療するための免疫療法において使用するために、CLDN6を発現する細胞を標的とするのに用いることができる。
より具体的には、本開示は以下を提供する：
[1-1]（i）CD3およびCD137に結合することができるが、CD3とCD137に同時には結合しない、第1の抗原結合部分；および
（ii）クローディン6（CLDN6）に結合することができる第2の抗原結合部分
を含む、多重特異性抗原結合分子。
[2-1]（i）CD3およびCD137に結合することができるが、CD3とCD137に同時には結合しない、第1の抗原結合部分；および
（ii）クローディン6（CLDN6）に結合することができる第2の抗原結合部分
を含む、多重特異性抗原結合分子であって、
第1の抗原結合部分が、以下の（a1）〜（a4）：
（a1）配列番号：9の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：15のCDR 2、および配列番号：21のCDR 3を含む、第1の抗体可変領域、ならびに配列番号：31のCDR 1、配列番号：35のCDR 2、および配列番号：39のCDR 3を含む、第2の抗体可変領域；
（a2）配列番号：10の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：16のCDR 2、および配列番号：22のCDR 3を含む、第1の抗体可変領域、ならびに配列番号：31のCDR 1、配列番号：35のCDR 2、および配列番号：39のCDR 3を含む、第2の抗体可変領域；
（a3）配列番号：11の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：17のCDR 2、および配列番号：23のCDR 3を含む、第1の抗体可変領域、ならびに配列番号：32のCDR 1、配列番号：36のCDR 2、および配列番号：40のCDR 3を含む、第2の抗体可変領域；
（a4）配列番号：12の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：18のCDR 2、および配列番号：24のCDR 3を含む、第1の抗体可変領域、ならびに配列番号：32のCDR 1、配列番号：36のCDR 2、および配列番号：40のCDR 3を含む、第2の抗体可変領域
のいずれか1つを含む、多重特異性抗原結合分子。
[2-2] 第2の抗原結合部分が、以下の（b1）〜（b3）：
（b1）配列番号：8の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：14のCDR 2、および配列番号：20のCDR 3を含む、第3の抗体可変領域、ならびに配列番号：30のCDR 1、配列番号：34のCDR 2、および配列番号：38のCDR 3を含む、第4の抗体可変領域；
（b2）配列番号：7の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：13のCDR 2、および配列番号：19のCDR 3を含む、第3の抗体可変領域、ならびに配列番号：29のCDR 1、配列番号：33のCDR 2、および配列番号：37のCDR 3を含む、第4の抗体可変領域；
（b3）配列番号：29の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：33のCDR 2、および配列番号：37のCDR 3を含む、第3の抗体可変領域、ならびに配列番号：7のCDR 1、配列番号：13のCDR 2、および配列番号：19のCDR 3を含む、第4の抗体可変領域
のいずれか1つを含む、[2-1]の多重特異性抗原結合分子。
[2-3]（i）CD3およびCD137に結合することができるが、CD3とCD137に同時には結合しない、第1の抗原結合部分；および
（ii）クローディン6（CLDN6）に結合することができる第2の抗原結合部分
を含む、多重特異性抗原結合分子であって、
第2の抗原結合部分が、以下の（b1）〜（b3）：
（b1）配列番号：8の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：14のCDR 2、および配列番号：20のCDR 3を含む、第3の抗体可変領域、ならびに配列番号：30のCDR 1、配列番号：34のCDR 2、および配列番号：38のCDR 3を含む、第4の抗体可変領域；
（b2）配列番号：7の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：13のCDR 2、および配列番号：19のCDR 3を含む、第3の抗体可変領域、ならびに配列番号：29のCDR 1、配列番号：33のCDR 2、および配列番号：37のCDR 3を含む、第4の抗体可変領域；
（b3）配列番号：29の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：33のCDR 2、および配列番号：37のCDR 3を含む、第3の抗体可変領域、ならびに配列番号：7のCDR 1、配列番号：13のCDR 2、および配列番号：19のCDR 3を含む、第4の抗体可変領域
のいずれか1つを含む、多重特異性抗原結合分子。
[2-4] 第1および/または第2の抗原結合部分に含まれる抗体可変領域が、ヒト抗体フレームワークまたはヒト化抗体フレームワークを含む、[2-1]〜[2-3]のいずれか1つの多重特異性抗原結合分子。
[2-5]（i）CD3およびCD137に結合することができるが、CD3とCD137に同時には結合しない、第1の抗原結合部分；および
（ii）クローディン6（CLDN6）に結合することができる第2の抗原結合部分
を含む、多重特異性抗原結合分子であって、
第1の抗原結合部分が、以下の（c1）〜（c4）：
（c1）配列番号：3のアミノ酸配列を含む第1の抗体可変領域、および配列番号：27のアミノ酸配列を含む第2の抗体可変領域；
（c2）配列番号：4のアミノ酸配列を含む第1の抗体可変領域、および配列番号：27のアミノ酸配列を含む第2の抗体可変領域；
（c3）配列番号：5のアミノ酸配列を含む第1の抗体可変領域、および配列番号：28のアミノ酸配列を含む第2の抗体可変領域；
（c4）配列番号：6のアミノ酸配列を含む第1の抗体可変領域、および配列番号：28のアミノ酸配列を含む第2の抗体可変領域
のいずれか1つを含む、多重特異性抗原結合分子。
[2-6] 第2の抗原結合部分が、以下の（d1）〜（d3）：
（d1）配列番号：2のアミノ酸配列を含む第3の抗体可変領域、および配列番号：26のアミノ酸配列を含む第4の抗体可変領域；
（d2）配列番号：1のアミノ酸配列を含む第3の抗体可変領域、および配列番号：25のアミノ酸配列を含む第4の抗体可変領域；
（d3）配列番号：25のアミノ酸配列を含む第3の抗体可変領域、および配列番号：1のアミノ酸配列を含む第4の抗体可変領域
のいずれか1つを含む、[2-5]の多重特異性抗原結合分子。
[2-7]（i）CD3およびCD137に結合することができるが、CD3とCD137に同時には結合しない、第1の抗原結合部分；および
（ii）クローディン6（CLDN6）に結合することができる第2の抗原結合部分
を含む、多重特異性抗原結合分子であって、
第2の抗原結合部分が、以下の（d1）〜（d3）：
（d1）配列番号：2のアミノ酸配列を含む第3の抗体可変領域、および配列番号：26のアミノ酸配列を含む第4の抗体可変領域；
（d2）配列番号：1のアミノ酸配列を含む第3の抗体可変領域、および配列番号：25のアミノ酸配列を含む第4の抗体可変領域；
（d3）配列番号：25のアミノ酸配列を含む第3の抗体可変領域、および配列番号：1のアミノ酸配列を含む第4の抗体可変領域
のいずれか1つを含む、多重特異性抗原結合分子。
[2-8]（i）CD3に結合する第1の抗原結合部分；および
（ii）クローディン6（CLDN6）に結合する第2の抗原結合部分
を含む、多重特異性抗原結合分子であって、
第1の抗原結合部分が、以下の（a1）〜（a4）：
（a1）配列番号：9の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：15のCDR 2、および配列番号：21のCDR 3を含む、第1の抗体可変領域、ならびに配列番号：31のCDR 1、配列番号：35のCDR 2、および配列番号：39のCDR 3を含む、第2の抗体可変領域；
（a2）配列番号：10の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：16のCDR 2、および配列番号：22のCDR 3を含む、第1の抗体可変領域、ならびに配列番号：31のCDR 1、配列番号：35のCDR 2、および配列番号：39のCDR 3を含む、第2の抗体可変領域；
（a3）配列番号：11の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：17のCDR 2、および配列番号：23のCDR 3を含む、第1の抗体可変領域、ならびに配列番号：32のCDR 1、配列番号：36のCDR 2、および配列番号：40のCDR 3を含む、第2の抗体可変領域；
（a4）配列番号：12の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：18のCDR 2、および配列番号：24のCDR 3を含む、第1の抗体可変領域、ならびに配列番号：32のCDR 1、配列番号：36のCDR 2、および配列番号：40のCDR 3を含む、第2の抗体可変領域
のいずれか1つを含む、多重特異性抗原結合分子。
[2-9] 第2の抗原結合部分が、以下の（b1）〜（b3）：
（b1）配列番号：8の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：14のCDR 2、および配列番号：20のCDR 3を含む、第3の抗体可変領域、ならびに配列番号：30のCDR 1、配列番号：34のCDR 2、および配列番号：38のCDR 3を含む、第4の抗体可変領域；
（b2）配列番号：7の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：13のCDR 2、および配列番号：19のCDR 3を含む、第3の抗体可変領域、ならびに配列番号：29のCDR 1、配列番号：33のCDR 2、および配列番号：37のCDR 3を含む、第4の抗体可変領域；
（b3）配列番号：29の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：33のCDR 2、および配列番号：37のCDR 3を含む、第3の抗体可変領域、ならびに配列番号：7のCDR 1、配列番号：13のCDR 2、および配列番号：19のCDR 3を含む、第4の抗体可変領域
のいずれか1つを含む、[2-8]の多重特異性抗原結合分子。
[2-10]（i）CD3に結合する第1の抗原結合部分；および
（ii）クローディン6（CLDN6）に結合する第2の抗原結合部分
を含む、多重特異性抗原結合分子であって、
第2の抗原結合部分が、以下の（b1）〜（b3）：
（b1）配列番号：8の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：14のCDR 2、および配列番号：20のCDR 3を含む、第3の抗体可変領域、ならびに配列番号：30のCDR 1、配列番号：34のCDR 2、および配列番号：38のCDR 3を含む、第4の抗体可変領域；
（b2）配列番号：7の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：13のCDR 2、および配列番号：19のCDR 3を含む、第3の抗体可変領域、ならびに配列番号：29のCDR 1、配列番号：33のCDR 2、および配列番号：37のCDR 3を含む、第4の抗体可変領域；
（b3）配列番号：29の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：33のCDR 2、および配列番号：37のCDR 3を含む、第3の抗体可変領域、ならびに配列番号：7のCDR 1、配列番号：13のCDR 2、および配列番号：19のCDR 3を含む、第4の抗体可変領域
のいずれか1つを含む、多重特異性抗原結合分子。
[2-11] 第1および/または第2の抗原結合部分に含まれる抗体可変領域が、ヒト抗体フレームワークまたはヒト化抗体フレームワークを含む、[2-8]〜[2-10]のいずれか1つの多重特異性抗原結合分子。
[2-12]（i）CD3に結合する第1の抗原結合部分；および
（ii）クローディン6（CLDN6）に結合する第2の抗原結合部分
を含む、多重特異性抗原結合分子であって、
第1の抗原結合部分が、以下の（c1）〜（c4）：
（c1）配列番号：3のアミノ酸配列を含む第1の抗体可変領域、および配列番号：27のアミノ酸配列を含む第2の抗体可変領域；
（c2）配列番号：4のアミノ酸配列を含む第1の抗体可変領域、および配列番号：27のアミノ酸配列を含む第2の抗体可変領域；
（c3）配列番号：5のアミノ酸配列を含む第1の抗体可変領域、および配列番号：28のアミノ酸配列を含む第2の抗体可変領域；
（c4）配列番号：6のアミノ酸配列を含む第1の抗体可変領域、および配列番号：28のアミノ酸配列を含む第2の抗体可変領域
のいずれか1つを含む、多重特異性抗原結合分子。
[2-13] 第2の抗原結合部分が、以下の（d1）〜（d3）：
（d1）配列番号：2のアミノ酸配列を含む第3の抗体可変領域、および配列番号：26のアミノ酸配列を含む第4の抗体可変領域；
（d2）配列番号：1のアミノ酸配列を含む第3の抗体可変領域、および配列番号：25のアミノ酸配列を含む第4の抗体可変領域；
（d3）配列番号：25のアミノ酸配列を含む第3の抗体可変領域、および配列番号：1のアミノ酸配列を含む第4の抗体可変領域
のいずれか1つを含む、[2-12]の多重特異性抗原結合分子。
[2-14]（i）CD3に結合する第1の抗原結合部分；および
（ii）クローディン6（CLDN6）に結合する第2の抗原結合部分
を含む、多重特異性抗原結合分子であって、
第2の抗原結合部分が、以下の（d1）〜（d3）：
（d1）配列番号：2のアミノ酸配列を含む第3の抗体可変領域、および配列番号：26のアミノ酸配列を含む第4の抗体可変領域；
（d2）配列番号：1のアミノ酸配列を含む第3の抗体可変領域、および配列番号：25のアミノ酸配列を含む第4の抗体可変領域；
（d3）配列番号：25のアミノ酸配列を含む第3の抗体可変領域、および配列番号：1のアミノ酸配列を含む第4の抗体可変領域
のいずれか1つを含む、多重特異性抗原結合分子。
[2-15]（i）CD137に結合する第1の抗原結合部分；および
（ii）クローディン6（CLDN6）に結合する第2の抗原結合部分
を含む、多重特異性抗原結合分子であって、
第1の抗原結合部分が、以下の（a1）〜（a4）：
（a1）配列番号：9の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：15のCDR 2、および配列番号：21のCDR 3を含む、第1の抗体可変領域、ならびに配列番号：31のCDR 1、配列番号：35のCDR 2、および配列番号：39のCDR 3を含む、第2の抗体可変領域；
（a2）配列番号：10の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：16のCDR 2、および配列番号：22のCDR 3を含む、第1の抗体可変領域、ならびに配列番号：31のCDR 1、配列番号：35のCDR 2、および配列番号：39のCDR 3を含む、第2の抗体可変領域；
（a3）配列番号：11の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：17のCDR 2、および配列番号：23のCDR 3を含む、第1の抗体可変領域、ならびに配列番号：32のCDR 1、配列番号：36のCDR 2、および配列番号：40のCDR 3を含む、第2の抗体可変領域；
（a4）配列番号：12の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：18のCDR 2、および配列番号：24のCDR 3を含む、第1の抗体可変領域、ならびに配列番号：32のCDR 1、配列番号：36のCDR 2、および配列番号：40のCDR 3を含む、第2の抗体可変領域
のいずれか1つを含む、多重特異性抗原結合分子。
[2-16] 第2の抗原結合部分が、以下の（b1）〜（b3）：
（b1）配列番号：8の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：14のCDR 2、および配列番号：20のCDR 3を含む、第3の抗体可変領域、ならびに配列番号：30のCDR 1、配列番号：34のCDR 2、および配列番号：38のCDR 3を含む、第4の抗体可変領域；
（b2）配列番号：7の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：13のCDR 2、および配列番号：19のCDR 3を含む、第3の抗体可変領域、ならびに配列番号：29のCDR 1、配列番号：33のCDR 2、および配列番号：37のCDR 3を含む、第4の抗体可変領域；
（b3）配列番号：29の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：33のCDR 2、および配列番号：37のCDR 3を含む、第3の抗体可変領域、ならびに配列番号：7のCDR 1、配列番号：13のCDR 2、および配列番号：19のCDR 3を含む、第4の抗体可変領域
のいずれか1つを含む、[2-15]の多重特異性抗原結合分子。
[2-17]（i）CD137に結合する第1の抗原結合部分；および
（ii）クローディン6（CLDN6）に結合する第2の抗原結合部分
を含む、多重特異性抗原結合分子であって、
第2の抗原結合部分が、以下の（b1）〜（b3）：
（b1）配列番号：8の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：14のCDR 2、および配列番号：20のCDR 3を含む、第3の抗体可変領域、ならびに配列番号：30のCDR 1、配列番号：34のCDR 2、および配列番号：38のCDR 3を含む、第4の抗体可変領域；
（b2）配列番号：7の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：13のCDR 2、および配列番号：19のCDR 3を含む、第3の抗体可変領域、ならびに配列番号：29のCDR 1、配列番号：33のCDR 2、および配列番号：37のCDR 3を含む、第4の抗体可変領域；
（b3）配列番号：29の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：33のCDR 2、および配列番号：37のCDR 3を含む、第3の抗体可変領域、ならびに配列番号：7のCDR 1、配列番号：13のCDR 2、および配列番号：19のCDR 3を含む、第4の抗体可変領域
のいずれか1つを含む、多重特異性抗原結合分子。
[2-18] 第1および/または第2の抗原結合部分に含まれる抗体可変領域が、ヒト抗体フレームワークまたはヒト化抗体フレームワークを含む、[2-15]〜[2-17]のいずれか1つの多重特異性抗原結合分子。
[2-19]（i）CD137に結合する第1の抗原結合部分；および
（ii）クローディン6（CLDN6）に結合する第2の抗原結合部分
を含む、多重特異性抗原結合分子であって、
第1の抗原結合部分が、以下の（c1）〜（c4）：
（c1）配列番号：3のアミノ酸配列を含む第1の抗体可変領域、および配列番号：27のアミノ酸配列を含む第2の抗体可変領域；
（c2）配列番号：4のアミノ酸配列を含む第1の抗体可変領域、および配列番号：27のアミノ酸配列を含む第2の抗体可変領域；
（c3）配列番号：5のアミノ酸配列を含む第1の抗体可変領域、および配列番号：28のアミノ酸配列を含む第2の抗体可変領域；
（c4）配列番号：6のアミノ酸配列を含む第1の抗体可変領域、および配列番号：28のアミノ酸配列を含む第2の抗体可変領域
のいずれか1つを含む、多重特異性抗原結合分子。
[2-20] 第2の抗原結合部分が、以下の（d1）〜（d3）：
（d1）配列番号：2のアミノ酸配列を含む第3の抗体可変領域、および配列番号：26のアミノ酸配列を含む第4の抗体可変領域；
（d2）配列番号：1のアミノ酸配列を含む第3の抗体可変領域、および配列番号：25のアミノ酸配列を含む第4の抗体可変領域；
（d3）配列番号：25のアミノ酸配列を含む第3の抗体可変領域、および配列番号：1のアミノ酸配列を含む第4の抗体可変領域
のいずれか1つを含む、[2-19]の多重特異性抗原結合分子。
[2-21]（i）CD137に結合する第1の抗原結合部分；および
（ii）クローディン6（CLDN6）に結合する第2の抗原結合部分
を含む、多重特異性抗原結合分子であって、
第2の抗原結合部分が、以下の（d1）〜（d3）：
（d1）配列番号：2のアミノ酸配列を含む第3の抗体可変領域、および配列番号：26のアミノ酸配列を含む第4の抗体可変領域；
（d2）配列番号：1のアミノ酸配列を含む第3の抗体可変領域、および配列番号：25のアミノ酸配列を含む第4の抗体可変領域；
（d3）配列番号：25のアミノ酸配列を含む第3の抗体可変領域、および配列番号：1のアミノ酸配列を含む第4の抗体可変領域
のいずれか1つを含む、多重特異性抗原結合分子。
[2-22]以下の（c1）〜（c4）：
（c1）配列番号：3のアミノ酸配列を含む第1の抗体可変領域、および配列番号：27のアミノ酸配列を含む第2の抗体可変領域；
（c2）配列番号：4のアミノ酸配列を含む第1の抗体可変領域、および配列番号：27のアミノ酸配列を含む第2の抗体可変領域；
（c3）配列番号：5のアミノ酸配列を含む第1の抗体可変領域、および配列番号：28のアミノ酸配列を含む第2の抗体可変領域；
（c4）配列番号：6のアミノ酸配列を含む第1の抗体可変領域、および配列番号：28のアミノ酸配列を含む第2の抗体可変領域
のいずれか1つを含む、多重特異性抗原結合分子。
[2-23] 以下の（d1）〜（d3）：
（d1）配列番号：2のアミノ酸配列を含む第3の抗体可変領域、および配列番号：26のアミノ酸配列を含む第4の抗体可変領域；
（d2）配列番号：1のアミノ酸配列を含む第3の抗体可変領域、および配列番号：25のアミノ酸配列を含む第4の抗体可変領域；
（d3）配列番号：25のアミノ酸配列を含む第3の抗体可変領域、および配列番号：1のアミノ酸配列を含む第4の抗体可変領域
のいずれか1つをさらに含む、[2-22]の多重特異性抗原結合分子。
[2-24]以下の（d1）〜（d3）：
（d1）配列番号：2のアミノ酸配列を含む第3の抗体可変領域、および配列番号：26のアミノ酸配列を含む第4の抗体可変領域；
（d2）配列番号：1のアミノ酸配列を含む第3の抗体可変領域、および配列番号：25のアミノ酸配列を含む第4の抗体可変領域；
（d3）配列番号：25のアミノ酸配列を含む第3の抗体可変領域、および配列番号：1のアミノ酸配列を含む第4の抗体可変領域
のいずれか1つを含む、多重特異性抗原結合分子。
[2-25]以下の（a1）〜（a4）：
（a1）配列番号：9の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：15のCDR 2、および配列番号：21のCDR 3を含む、第1の抗体可変領域、ならびに配列番号：31のCDR 1、配列番号：35のCDR 2、および配列番号：39のCDR 3を含む、第2の抗体可変領域；
（a2）配列番号：10の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：16のCDR 2、および配列番号：22のCDR 3を含む、第1の抗体可変領域、ならびに配列番号：31のCDR 1、配列番号：35のCDR 2、および配列番号：39のCDR 3を含む、第2の抗体可変領域；
（a3）配列番号：11の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：17のCDR 2、および配列番号：23のCDR 3を含む、第1の抗体可変領域、ならびに配列番号：32のCDR 1、配列番号：36のCDR 2、および配列番号：40のCDR 3を含む、第2の抗体可変領域；
（a4）配列番号：12の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：18のCDR 2、および配列番号：24のCDR 3を含む、第1の抗体可変領域、ならびに配列番号：32のCDR 1、配列番号：36のCDR 2、および配列番号：40のCDR 3を含む、第2の抗体可変領域
のいずれか1つを含む、多重特異性抗原結合分子。
[2-26] 以下の（b1）〜（b3）：
（b1）配列番号：8の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：14のCDR 2、および配列番号：20のCDR 3を含む、第3の抗体可変領域、ならびに配列番号：30のCDR 1、配列番号：34のCDR 2、および配列番号：38のCDR 3を含む、第4の抗体可変領域；
（b2）配列番号：7の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：13のCDR 2、および配列番号：19のCDR 3を含む、第3の抗体可変領域、ならびに配列番号：29のCDR 1、配列番号：33のCDR 2、および配列番号：37のCDR 3を含む、第4の抗体可変領域；
（b3）配列番号：29の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：33のCDR 2、および配列番号：37のCDR 3を含む、第3の抗体可変領域、ならびに配列番号：7のCDR 1、配列番号：13のCDR 2、および配列番号：19のCDR 3を含む、第4の抗体可変領域
のいずれか1つをさらに含む、[2-25]の多重特異性抗原結合分子。
[2-27]以下の（b1）〜（b3）：
（b1）配列番号：8の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：14のCDR 2、および配列番号：20のCDR 3を含む、第3の抗体可変領域、ならびに配列番号：30のCDR 1、配列番号：34のCDR 2、および配列番号：38のCDR 3を含む、第4の抗体可変領域；
（b2）配列番号：7の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：13のCDR 2、および配列番号：19のCDR 3を含む、第3の抗体可変領域、ならびに配列番号：29のCDR 1、配列番号：33のCDR 2、および配列番号：37のCDR 3を含む、第4の抗体可変領域；
（b3）配列番号：29の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：33のCDR 2、および配列番号：37のCDR 3を含む、第3の抗体可変領域、ならびに配列番号：7のCDR 1、配列番号：13のCDR 2、および配列番号：19のCDR 3を含む、第4の抗体可変領域
のいずれか1つを含む、多重特異性抗原結合分子。
[3-1]（iii）天然型ヒトIgG1 Fcドメインと比較して、ヒトFcγ受容体に対する低下した結合親和性を示すFcドメイン
をさらに含む、[1-1]〜[2-27]のいずれか1つの多重特異性抗原結合分子。
[3-2] 前記Fcドメインが、安定に会合することができる第1のFc領域サブユニットおよび第2のFc領域サブユニットで構成される、[3-1]の多重特異性抗原結合分子。
[3-3] 前記Fcドメインが、以下の（e1）または（e2）：
（e1）349位にCys、366位にSer、368位にAla、および407位にValを含む、第1のFc領域サブユニット、ならびに354位にCysおよび366位にTrpを含む第2のFc領域；
（e2）439位にGluを含む第1のFc領域サブユニット、および356位にLysを含む第2のFc領域
を含み、該アミノ酸位置が、EUインデックスによりナンバリングされる、[3-2]の多重特異性抗原結合分子。
[3-4] 第1および/または第2のFc領域サブユニットが、以下の（f1）または（f2）：
（f1）234位にAlaおよび235位にAla；
（f2）234位にAla、235位にAla、および297位にAla
を含み、該アミノ酸位置が、EUインデックスによりナンバリングされる、[3-2]または[3-3]の多重特異性抗原結合分子。
[3-5] 前記Fcドメインが、天然型ヒトIgG1 Fcドメインと比較して、ヒトFcRnに対するより強力なFcRn結合親和性をさらに示す、[3-2]〜[3-4]のいずれか1つの多重特異性抗原結合分子。
[3-6] 第1および/または第2のFc領域サブユニットが、428位にLeu、434位にAla、438位にArg、および440位にGluを含み、該アミノ酸位置が、EUインデックスによりナンバリングされる、[3-5]の多重特異性抗原結合分子。
[3-7] 第1の抗原結合部分の第1の抗体可変領域が第1の重鎖定常領域に融合されており、第1の抗原結合部分の第2の抗体可変領域が第1の軽鎖定常領域に融合されており、第2の抗原結合部分の第3の抗体可変領域が第2の重鎖定常領域に融合されており、第2の抗原結合部分の第4の抗体可変領域が第2の軽鎖定常領域に融合されており、
該定常領域が、以下の（g1）〜（g7）：
（g1）配列番号：74のアミノ酸配列を含む第1の重鎖定常領域、配列番号：87のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖定常領域、配列番号：73のアミノ酸配列を含む第2の重鎖定常領域、および配列番号：88のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖定常領域；
（g2）配列番号：74のアミノ酸配列を含む第1の重鎖定常領域、配列番号：85のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖定常領域、配列番号：81のアミノ酸配列を含む第2の重鎖定常領域、および配列番号：86のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖定常領域；
（g3）配列番号：79のアミノ酸配列を含む第1の重鎖定常領域、配列番号：72のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖定常領域、配列番号：80のアミノ酸配列を含む第2の重鎖定常領域、および配列番号：89のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖定常領域；
（g4）配列番号：83のアミノ酸配列を含む第1の重鎖定常領域、配列番号：87のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖定常領域、配列番号：82のアミノ酸配列を含む第2の重鎖定常領域、および配列番号：88のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖定常領域；
（g5）配列番号：83のアミノ酸配列を含む第1の重鎖定常領域、配列番号：85のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖定常領域、配列番号：84のアミノ酸配列を含む第2の重鎖定常領域、および配列番号：86のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖定常領域；
（g6）配列番号：77のアミノ酸配列を含む第1の重鎖定常領域、配列番号：72のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖定常領域、配列番号：78のアミノ酸配列を含む第2の重鎖定常領域、および配列番号：89のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖定常領域；
（g7）配列番号：75のアミノ酸配列を含む第1の重鎖定常領域、配列番号：72のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖定常領域、配列番号：76のアミノ酸配列を含む第2の重鎖定常領域、および配列番号：89のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖定常領域
のいずれか1つである、[2-1]〜[2-27]のいずれか1つの多重特異性抗原結合分子。
[4-1] 4本のポリペプチド鎖を含む多重特異性抗原結合分子であって、該4本のポリペプチド鎖が、以下の（h01）〜（h18）：
（h01）配列番号：41のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：50のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）、ならびに配列番号：54のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：68のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）；
（h02）配列番号：41のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：50のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）、ならびに配列番号：55のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：68のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）；
（h03）配列番号：42のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：51のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）、ならびに配列番号：56のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：69のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）；
（h04）配列番号：42のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：51のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）、ならびに配列番号：57のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：69のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）；
（h05）配列番号：44のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：52のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）、ならびに配列番号：60のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：70のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）；
（h06）配列番号：44のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：52のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）、ならびに配列番号：61のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：70のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）；
（h07）配列番号：45のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：50のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）、ならびに配列番号：62のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：68のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）；
（h08）配列番号：45のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：50のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）、ならびに配列番号：63のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：68のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）；
（h09）配列番号：46のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：51のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）、ならびに配列番号：64のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：69のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）；
（h10）配列番号：46のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：51のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）、ならびに配列番号：65のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：69のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）；
（h11）配列番号：47のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：52のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）、ならびに配列番号：66のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：70のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）；
（h12）配列番号：47のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：52のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）、ならびに配列番号：67のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：70のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）；
（h13）配列番号：48のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：53のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）、ならびに配列番号：56のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：71のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）；
（h14）配列番号：48のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：53のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）、ならびに配列番号：57のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：71のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）；
（h15）配列番号：49のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：53のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）、ならびに配列番号：64のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：71のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）；
（h16）配列番号：49のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：53のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）、ならびに配列番号：65のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：71のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）；
（h17）配列番号：43のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：52のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）、ならびに配列番号：58のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：70のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）；および
（h18）配列番号：43のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：52のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）、ならびに配列番号：59のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：70のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）
のいずれか1つである、多重特異性抗原結合分子。
[4-2]（i）鎖3に含まれる抗体可変領域および鎖4に含まれる抗体可変領域が、
CD3およびCD137に結合することができるが、CD3とCD137に同時には結合しない、第1の抗原結合部分
を形成し；
（ii）鎖1に含まれる抗体可変領域および鎖2に含まれる抗体可変領域が、
クローディン6（CLDN6）に結合することができる第2の抗原結合部分
を形成し；
（iii）鎖1に含まれる抗体Fc領域サブユニットおよび鎖3に含まれる抗体Fc領域サブユニットが、Fcドメインを形成する、
[4-1]の多重特異性抗原結合分子。
[4-3]（i）鎖3に含まれる抗体可変領域および鎖4に含まれる抗体可変領域が、
CD3に結合する第1の抗原結合部分
を形成し；
（ii）鎖1に含まれる抗体可変領域および鎖2に含まれる抗体可変領域が、
クローディン6（CLDN6）に結合する第2の抗原結合部分
を形成し；
（iii）鎖1に含まれる抗体Fc領域サブユニットおよび鎖3に含まれる抗体Fc領域サブユニットが、Fcドメインを形成する、
[4-1]の多重特異性抗原結合分子。
[4-4]（i）鎖3に含まれる抗体可変領域および鎖4に含まれる抗体可変領域が、
CD137に結合する第1の抗原結合部分
を形成し；
（ii）鎖1に含まれる抗体可変領域および鎖2に含まれる抗体可変領域が、
クローディン6（CLDN6）に結合する第2の抗原結合部分
を形成し；
（iii）鎖1に含まれる抗体Fc領域サブユニットおよび鎖3に含まれる抗体Fc領域サブユニットが、Fcドメインを形成する、
[4-1]の多重特異性抗原結合分子。
[5-1] 第2の抗原結合部分がヒトCLDN6に結合することができる、[1-1]〜[3-7]または[4-4]のいずれか1つの多重特異性抗原結合分子。
[5-2] 第2の抗原結合部分が、配列番号：196または197に規定されるヒトCLDN6に結合することができる、[1-1]〜[3-7]または[4-4]のいずれか1つの多重特異性抗原結合分子。
[5-3] 第2の抗原結合部分がヒトCLDN9に実質的に結合しない、[1-1]〜[3-7]または[4-4]のいずれか1つの多重特異性抗原結合分子。
[5-4] 第2の抗原結合部分がヒトCLDN4に実質的に結合しない、[1-1]〜[3-7]または[4-4]のいずれか1つの多重特異性抗原結合分子。
[5-5] 第2の抗原結合部分がヒトCLDN3に実質的に結合しない、[1-1]〜[3-7]または[4-4]のいずれか1つの多重特異性抗原結合分子。
[5-6] 第2の抗原結合部分が、配列番号：205に規定されるCLDN6変異体に実質的に結合しない、[1-1]〜[3-7]または[4-4]のいずれか1つの多重特異性抗原結合分子。
[6-1] [1-1]〜[5-6]のいずれか1つの多重特異性抗原結合分子をコードする、単離された核酸。
[6-2] [6-1]の核酸を含む、宿主細胞。
[6-3]多重特異性抗原結合分子が産生されるように、[6-2]の宿主細胞を培養する段階を含む、多重特異性抗原結合分子を産生する方法。
[6-4] 宿主細胞の培養から多重特異性抗原結合分子を回収する段階をさらに含む、[6-3]の方法。
[7-1] [1-1]〜[5-6]のいずれか1つの多重特異性抗原結合分子と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
[7-2]がんの治療および/または予防に用いられる、[7-1]記載の医薬組成物。
[7-3]前記がんがCLDN6発現細胞を含む、[7-2]記載の医薬組成物。
[7-4]前記がんが、卵巣がん、非小細胞肺がん、胃がん、肝がん、子宮内膜がん、または胚細胞性腫瘍である、[7-2]または[7-3]の医薬組成物。
[7-5] 医薬の製造における、[1-1]〜[5-6]のいずれか1つの多重特異性抗原結合分子の使用。
[7-6]がんの治療および/または予防のための医薬の製造における、[1-1]〜[5-6]のいずれか1つの多重特異性抗原結合分子の使用。
[7-7] CLDN6発現細胞を含むがんの治療および/または予防のための医薬の製造における、[1-1]〜[5-6]のいずれか1つの多重特異性抗原結合分子の使用。
[7-8]卵巣がん、非小細胞肺がん、胃がん、肝がん、子宮内膜がん、または胚細胞性腫瘍の治療および/または予防のための医薬の製造における、[1-1]〜[5-6]のいずれか1つの多重特異性抗原結合分子の使用。
[7-9] [1-1]〜[5-6]のいずれか1つの多重特異性抗原結合分子の有効量を個体に投与する段階を含む、がんを有する個体を治療する方法。
[7-10]前記がんがCLDN6発現細胞を含む、[7-9]の方法。
[7-11]前記がんが、卵巣がん、非小細胞肺がん、胃がん、肝がん、子宮内膜がん、または胚細胞性腫瘍である、[7-9]または[7-10]の方法。
[7-12]少なくとも[1-1]〜[5-6]のいずれか1つの多重特異性抗原結合分子と、使用説明書とを含む、がんの治療および/または予防において使用するためのキット。
[7-13]前記がんがCLDN6発現細胞を含む、[7-12]のキット。
[7-14]前記がんが、卵巣がん、非小細胞肺がん、胃がん、肝がん、子宮内膜がん、または胚細胞性腫瘍である、[7-12]のキット。
CD137上のH0868L0581 Fab接触領域のエピトープを示す。CD137アミノ酸配列におけるエピトープマッピング（黒色：H0868L0581から3.0オングストロームよりも近い、縞：4.5オングストロームよりも近い）。 CD137上のH0868L0581 Fab接触領域のエピトープを示す。結晶構造におけるエピトープマッピング（暗灰色の球：H0868L0581から3.0オングストロームよりも近い、薄灰色の棒：4.5オングストロームよりも近い）。 様々な抗体フォーマットを図示する。表4の各Fv領域のアノテーション、ならびに表4、表5、および表6の命名規則。（a）FAST-Igを利用することによる1+1二重特異性抗体；（b）CrossMabテクノロジーを利用することによる1+1二重特異性抗体を図示する図。 ヒトCLDNファミリータンパク質（CLDN3、CLDN4、CLDN6、およびCLDN9）に対する抗CLDN6/CD3二重特異性抗体（CS2961および6PHU3/TR01）の結合活性を示す。BaF3トランスフェクタント（hCLDN6/BaF、hCLDN3/BaF、hCLDN4/BaF、およびhCLDN9/BaF）に対する抗CLDN6/CD3二重特異性抗体の結合活性を15μg/mlの濃度でフローサイトメーターによって調べ、ヒストグラムとしてプロットした。KLH/TR01を陰性対照として用いた。 LDHアッセイによるT細胞依存性細胞傷害の評価を示す。 ヒトCLDN9とヒトCLDN6のアミノ酸配列アライメントを示す。ヒトCLDN9およびヒトCLDN6は、N末端残基（29位のMet/Leu)を除いて、細胞外ドメイン1においてほぼ同じ配列を含む。細胞外ドメイン2において、2つのアミノ酸が、ヒトCLDN9とヒトCLDN6とで異なる（145位のArg/Leuおよび156位のGlu/Leu）。 LDHアッセイによる、種々のがん細胞株に対する抗体（PPU4135）のT細胞依存性細胞傷害の評価結果を示す。 xCELLigenceアッセイによる、種々のがん細胞株に対する抗体（CS3348、PPU4135、およびPPU4136）のリアルタイム細胞増殖阻害アッセイの結果を示す。 CLDN6発現ヒト細胞株（OVCAR3およびNCI-H1435）およびCLDN6陰性細胞株（5637）との共培養下での、抗体（CS3348、PPU4135、PPU4136、PPU4137、およびPPU4138）によるCD3結合を通じたT細胞の活性化を示す。陰性対照としてKLH/TR01を用いた。 CLDN6発現ヒト細胞株（OVCAR3およびNCI-H1435）およびCLDN6陰性細胞株（5637）との共培養下での、抗体（CS3348、PPU4134、PPU4135、PPU4136、PPU4137、およびPPU4138）によるCD137結合を通じたNFκBの活性化を示す。陰性対照としてKLH/TR01を用いた。 NCI-H1435/HuNOGマウスモデルを用いた、1 mg/kgの用量での抗体（CS3348、PPU4134、PPU4135、PPU4136、PPU4137、およびPPU4138）のin vivo抗腫瘍効果を示す。 OV-90/HuNOGマウスモデルを用いた、0.05 mg/kgおよび0.2 mg/kgの用量での抗体（CS3348およびPPU4135）のin vivo抗腫瘍効果を示す。 CS3348またはPPU4135の投与によって媒介されるAST、ALT、GLDH（肝酵素）、ALP、TBIL、GGT、TBA（肝胆道障害パラメーター）、およびCRP（炎症マーカー）レベルの変化を示す。
本明細書において記載または参照される技法および手順は、概して十分に理解されており、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3d edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.；Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., (2003))；the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)：PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995))、Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual、およびAnimal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987))；Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984)；Methods in Molecular Biology, Humana Press；Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press；Animal Cell Culture (R.I. Freshney), ed., 1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press；Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons；Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987)；PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994)；Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991)；Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)；Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997)；Antibodies (P. Finch, 1997)；Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989)；Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000)；Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)；The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)；ならびにCancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993) に記載される広く利用されている方法論などの従来の方法論を使用して当業者によって一般的に用いられるものである。
以下の定義および詳細な説明は、本明細書において説明する本開示の理解を容易にするために提供される。
定義
アミノ酸
本明細書において、アミノ酸は、1文字コードもしくは3文字コードまたはその両方、例えば、Ala/A、Leu/L、Arg/R、Lys/K、Asn/N、Met/M、Asp/D、Phe/F、Cys/C、Pro/P、Gln/Q、Ser/S、Glu/E、Thr/T、Gly/G、Trp/W、His/H、Tyr/Y、Ile/I、またはVal/Vによって記載される。
アミノ酸の改変
抗原結合分子のアミノ酸配列中のアミノ酸改変（本明細書において「アミノ酸置換」または「アミノ酸変異」とも記載される）のためには、部位特異的変異誘発法（Kunkelら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492））および重複伸長PCRなどの公知の方法が適宜採用され得る。さらに、非天然アミノ酸に置換するためのアミノ酸改変方法として、いくつかの公知の方法もまた採用され得る（Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249；およびProc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (11), 6353-6357）。例えば、終止コドンの1つであるUAGコドン（アンバーコドン）の相補的アンバーサプレッサーtRNAに非天然アミノ酸が結合したtRNAを含む無細胞翻訳系 (Clover Direct (Protein Express)) を用いることが適切である。
本明細書において、アミノ酸改変の部位を記載する際の用語「および／または」の意味は、「および」と「または」が適切に組み合わされたあらゆる組合せを含む。具体的には、例えば、「33位、55位、および／または96位のアミノ酸が置換される」は、アミノ酸改変の以下のバリエーションを含む：(a) 33位、(b) 55位、(c) 96位、(d) 33位および55位、(e) 33位および96位、(f) 55位および96位、ならびに (g) 33位、55位、および96位のアミノ酸。
さらに、本明細書において、アミノ酸の改変を示す表現として、特定の位置を表す数字の前および後に、それぞれ改変前および改変後のアミノ酸の1文字コードまたは3文字コードを示す表現が、適宜使用され得る。例えば、抗体可変領域中に含まれるアミノ酸を置換する際に用いられるN100bLまたはAsn100bLeuという改変は、100b位（Kabatナンバリングによる）におけるAsnの、Leuによる置換を表す。すなわち、数字はKabatナンバリングによるアミノ酸の位置を示し、数字の前に記載される1文字または3文字のアミノ酸コードは置換前のアミノ酸を示し、数字の後に記載される1文字または3文字のアミノ酸コードは置換後のアミノ酸を示す。同様に、抗体定常領域中に含まれるFc領域のアミノ酸を置換する際に用いられるP238DまたはPro238Aspという改変は、238位（EUナンバリングによる）におけるProの、Aspによる置換を表す。すなわち、数字はEUナンバリングによるアミノ酸の位置を示し、数字の前に記載される1文字または3文字のアミノ酸コードは置換前のアミノ酸を示し、数字の後に記載される1文字または3文字のアミノ酸コードは置換後のアミノ酸を示す。
ポリペプチド
本明細書で用いられる用語「ポリペプチド」は、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）によって直鎖状に連結された単量体（アミノ酸）で構成される分子を指す。用語「ポリペプチド」は、2アミノ酸以上の任意の鎖を指し、特定の長さの産物を指すものではない。よって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または2アミノ酸以上の鎖を指すために用いられる任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義内に含まれ、用語「ポリペプチド」は、これらの用語のいずれかの代わりにまたは相互に交換可能に用いられてもよい。用語「ポリペプチド」はまた、限定されないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基/ブロッキング基による誘導体化、タンパク質切断、または非天然アミノ酸による修飾を含む、ポリペプチドの発現後修飾の産物を指すことも意図する。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源に由来してもよく、または組換え技術によって産生されてもよいが、必ずしも指定の核酸から翻訳される必要はない。それは、化学合成を含む、任意の方法で生成されてもよい。本明細書において記載されるポリペプチドは、約3アミノ酸以上、5アミノ酸以上、10アミノ酸以上、20アミノ酸以上、25アミノ酸以上、50アミノ酸以上、75アミノ酸以上、100アミノ酸以上、200アミノ酸以上、500アミノ酸以上、1,000アミノ酸以上、または2,000アミノ酸以上のサイズのものであってもよい。ポリペプチドは規定された三次元構造を有し得るが、それらは必ずしもそのような構造を有する必要はない。規定された三次元構造を有するポリペプチドは、折り畳まれたと称され、規定された三次元構造をもたないが多数の異なる立体構造をとり得るポリペプチドは、折り畳まれていないと称される。
パーセント (％) アミノ酸配列同一性
参照ポリペプチド配列に対する「パーセント (％) アミノ酸配列同一性」は、最大のパーセント配列同一性を得るように配列を整列させてかつ必要ならギャップを導入した後の、かつ、いかなる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとしたときの、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の、百分率比として定義される。％アミノ酸配列同一性を決める目的のアラインメントは、当該技術分野における技術の範囲内にある種々の方法、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN、またはMegalign (DNASTAR) ソフトウェアなどの、公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用することにより達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列のアラインメントをとるための適切なパラメーターを決定することができる。しかしながら、本明細書における目的のために、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムであるALIGN-2を使用して生成される。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムは、ジェネンテック社の著作であり、そのソースコードは米国著作権庁 (U.S. Copyright Office, Wasington D.C., 20559) に使用者用書類と共に提出され、米国著作権登録番号TXU510087として登録されている。ALIGN-2プログラムは、ジェネンテック社 (Genentech, Inc., South San Francisco, California) から公に入手可能であるし、ソースコードからコンパイルしてもよい。ALIGN-2プログラムは、Digital UNIX V4.0Dを含むUNIXオペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルされる。すべての配列比較パラメーターは、ALIGN-2プログラムによって設定され、変動しない。アミノ酸配列比較にALIGN-2が用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Aの、所与のアミノ酸配列Bへの、またはそれとの、またはそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、所与のアミノ酸配列Bへの、またはそれとの、またはそれに対する、ある％アミノ酸配列同一性を有するまたは含む所与のアミノ酸配列A、ということもできる）は、次のように計算される：分率X／Yの100倍。ここで、Xは配列アラインメントプログラムALIGN-2によって、当該プログラムのAおよびBのアラインメントにおいて同一である一致としてスコアされたアミノ酸残基の数であり、YはB中のアミノ酸残基の全数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと等しくない場合、AのBへの％アミノ酸配列同一性は、BのAへの％アミノ酸配列同一性と等しくないことが、理解されるであろう。別段特に明示しない限り、本明細書で用いられるすべての％アミノ酸配列同一性値は、直前の段落で述べたとおりALIGN-2コンピュータプログラムを用いて得られるものである。
組換えの方法および構成
例えば、米国特許第4,816,567号に記載されるとおり、抗体および抗原結合分子は組換えの方法や構成を用いて製造することができる。1つの態様において、本明細書に記載の抗体をコードする、単離された核酸が提供される。そのような核酸は、抗体のVLを含むアミノ酸配列および／またはVHを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖および／または重鎖）をコードしてもよい。さらなる態様において、このような核酸を含む1つまたは複数のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。さらなる態様において、このような核酸を含む宿主細胞が提供される。このような態様の1つでは、宿主細胞は、(1)抗体のVLを含むアミノ酸配列および抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または、(2)抗体のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第1のベクターと抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第2のベクターを含む（例えば、形質転換されている）。1つの態様において、宿主細胞は、真核性である（例えば、チャイニーズハムスター卵巣 (CHO) 細胞）またはリンパ系の細胞（例えば、Y0、NS0、Sp2/0細胞））。1つの態様において、抗体の発現に好適な条件下で、上述のとおり当該抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養すること、および任意で、当該抗体を宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から回収することを含む、本開示の多重特異性抗原結合分子を作製する方法が提供される。
本明細書において記載される抗体の組換え製造のために、（例えば、上述したものなどの）抗体をコードする核酸を単離し、さらなるクローニングおよび／または宿主細胞中での発現のために、1つまたは複数のベクターに挿入する。そのような核酸は、従来の手順を用いて容易に単離および配列決定されるだろう（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることで）。
抗体をコードするベクターのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞は、本明細書に記載の原核細胞または真核細胞を含む。例えば、抗体は、特にグリコシル化およびFcエフェクター機能が必要とされない場合は、細菌で製造してもよい。細菌での抗体断片およびポリペプチドの発現に関して、例えば、米国特許第5,648,237号、第5,789,199号、および第5,840,523号を参照のこと。（加えて、大腸菌 (E. coli) における抗体断片の発現について記載したCharlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp.245-254も参照のこと。）発現後、抗体は細菌細胞ペーストから可溶性フラクション中に単離されてもよく、またさらに精製することができる。
原核生物に加え、部分的なまたは完全なヒトのグリコシル化パターンを伴う抗体の産生をもたらす、グリコシル化経路が「ヒト化」されている菌類および酵母の株を含む、糸状菌または酵母などの真核性の微生物は、抗体コードベクターの好適なクローニングまたは発現宿主である。Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)および Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006) を参照のこと。
多細胞生物（無脊椎生物および脊椎生物）に由来するものもまた、グリコシル化された抗体の発現のために好適な宿主細胞である。無脊椎生物細胞の例は、植物および昆虫細胞を含む。昆虫細胞との接合、特にSpodoptera frugiperda細胞の形質転換に用いられる、数多くのバキュロウイルス株が同定されている。
植物細胞培養物も、宿主として利用することができる。例えば、米国特許第5,959,177号、第6,040,498号、第6,420,548号、第7,125,978号、および第6,417,429号（トランスジェニック植物で抗体を産生するための、PLANTIBODIES（商標）技術を記載）を参照のこと。
脊椎動物細胞もまた宿主として使用できる。例えば、浮遊状態で増殖するように適応された哺乳動物細胞株は、有用であろう。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、SV40で形質転換されたサル腎CV1株 (COS-7)；ヒト胎児性腎株（Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977) などに記載の293または293細胞）；仔ハムスター腎細胞 (BHK)；マウスセルトリ細胞（Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980) などに記載のTM4細胞）；サル腎細胞 (CV1)；アフリカミドリザル腎細胞 (VERO-76)；ヒト子宮頸部癌細胞 (HELA)；イヌ腎細胞 (MDCK)；Buffalo系ラット肝細胞 (BRL 3A)；ヒト肺細胞 (W138)；ヒト肝細胞 (Hep G2)；マウス乳癌 (MMT 060562)；TRI細胞（例えば、Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982) に記載）；MRC5細胞；および、FS4細胞などである。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、DHFR- CHO細胞 (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)) を含むチャイニーズハムスター卵巣 (CHO) 細胞；およびY0、NS0、およびSp2/0などの骨髄腫細胞株を含む。抗体産生に好適な特定の哺乳動物宿主細胞株の総説として、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003) を参照のこと。
本明細書において記載される抗原結合分子の組換え産生は、抗原結合分子全体または抗原結合分子の一部を含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む1つまたは複数のベクターを含む（例えば、それによって形質転換されている）宿主細胞を用いることによって、上記に記載されたものと同様の方法で行うことができる。
抗原結合分子および多重特異性抗原結合分子
本明細書で用いられる用語「抗原結合分子」は、抗原結合部位を含む任意の分子、または抗原に対する結合活性を有する任意の分子を指し、約5アミノ酸以上の長さを有するペプチドまたはタンパク質などの分子をさらに指し得る。ペプチドおよびタンパク質は、生物に由来するものに限定されず、例えば、それらは、人工的に設計された配列から産生されたポリペプチドであってもよい。それらは、天然ポリペプチド、合成ポリペプチド、組換えポリペプチド等のいずれかであってもよい。スキャフォールドとしてα/βバレルなどの公知の安定な立体構造を含み、分子の一部が抗原結合部位になる、スキャフォールド分子もまた、本明細書において記載される抗原結合分子の一態様である。
「多重特異性抗原結合分子」は、2つ以上の抗原に特異的に結合する抗原結合分子を指す。用語「二重特異性」は、抗原結合分子が、少なくとも2種類の異なる抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。用語「三重特異性」は、抗原結合分子が少なくとも3種類の異なる抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。
特定の態様において、本出願の多重特異性抗原結合分子は、三重特異性抗原結合分子、すなわち、3種類の異なる抗原に特異的に結合することができる、つまり、CD3またはCD137のいずれか一方に結合することができるが、両方の抗原に同時には結合せず、かつCLDN6に特異的に結合することができる、三重特異性抗原結合分子である。
1つの局面において、本開示は、
（i）CD3およびCD137に結合することができるが、CD3とCD137に同時には結合しない、第1の抗原結合部分；および
（ii）クローディン6（CLDN6）、好ましくはヒトCLDN6に結合することができる第2の抗原結合部分
を含む、多重特異性抗原結合分子を提供する。
1つの局面において、本開示は、
（iii）天然型ヒトIgG1 Fcドメインと比較して、ヒトFcγ受容体に対する低下した結合親和性を示すFcドメイン
をさらに含む、多重特異性抗原結合分子を提供する。
本開示の多重特異性抗原結合分子の構成成分は、種々の構成において相互に融合させることができる。例示的な構成を図3に図示する。特定の態様において、多重特異性抗原結合分子は、安定に会合することができる第1のFc領域サブユニットおよび第2のFc領域サブユニットで構成されるFcドメインを含む。
上記態様のいずれかによれば、多重特異性抗原結合分子の構成成分（例えば、 抗原結合部分、Fcドメイン）は、直接的に、または種々のリンカー、特に、本明細書において記載されているかまたは当技術分野において公知である1つもしくは複数のアミノ酸、典型的には約2〜20個のアミノ酸を含むペプチドリンカーを通じて、融合させてもよい。適切な非免疫原性ペプチドリンカーには、例えば、(G4S)n、(SG4)n、(G4S)n、またはG4(SG4)nペプチドリンカーが含まれ、ここで、nは概して1〜10、典型的には2〜4の数である。
1つの局面において、本開示は、
（i）CD3およびCD137に結合することができるが、CD3とCD137に同時には結合しない、第1の抗原結合部分；および
（ii）クローディン6（CLDN6）に結合することができる第2の抗原結合部分
を含む、多重特異性抗原結合分子であって、第1の抗原結合部分の第1の抗体可変領域が第1の重鎖定常領域に融合されており、第1の抗原結合部分の第2の抗体可変領域が第1の軽鎖定常領域に融合されており、第2の抗原結合部分の第3の抗体可変領域が第2の重鎖定常領域に融合されており、第2の抗原結合部分の第4の抗体可変領域が第2の軽鎖定常領域に融合されている、多重特異性抗原結合分子を提供する。
1つの局面において、本開示は、
（i）CD3およびCD137に結合することができるが、CD3とCD137に同時には結合しない、第1の抗原結合部分；および
（ii）クローディン6（CLDN6）に結合することができる第2の抗原結合部分
を含む、多重特異性抗原結合分子であって、第1の抗原結合部分の第1の抗体可変領域が第1の重鎖定常領域に融合されており、第1の抗原結合部分の第2の抗体可変領域が第1の軽鎖定常領域に融合されており、第2の抗原結合部分の第3の抗体可変領域が第2の重鎖定常領域に融合されており、第2の抗原結合部分の第4の抗体可変領域が第2の軽鎖定常領域に融合されており、該定常領域が、以下の（g1）〜（g7）：
（g1）配列番号：74のアミノ酸配列を含む第1の重鎖定常領域、配列番号：87のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖定常領域、配列番号：73のアミノ酸配列を含む第2の重鎖定常領域、および配列番号：88のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖定常領域；
（g2）配列番号：74のアミノ酸配列を含む第1の重鎖定常領域、配列番号：85のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖定常領域、配列番号：81のアミノ酸配列を含む第2の重鎖定常領域、および配列番号：86のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖定常領域；
（g3）配列番号：79のアミノ酸配列を含む第1の重鎖定常領域、配列番号：72のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖定常領域、配列番号：80のアミノ酸配列を含む第2の重鎖定常領域、および配列番号：89のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖定常領域；
（g4）配列番号：83のアミノ酸配列を含む第1の重鎖定常領域、配列番号：87のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖定常領域、配列番号：82のアミノ酸配列を含む第2の重鎖定常領域、および配列番号：88のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖定常領域；
（g5）配列番号：83のアミノ酸配列を含む第1の重鎖定常領域、配列番号：85のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖定常領域、配列番号：84のアミノ酸配列を含む第2の重鎖定常領域、および配列番号：86のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖定常領域；
（g6）配列番号：77のアミノ酸配列を含む第1の重鎖定常領域、配列番号：72のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖定常領域、配列番号：78のアミノ酸配列を含む第2の重鎖定常領域、および配列番号：89のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖定常領域；
（g7）配列番号：75のアミノ酸配列を含む第1の重鎖定常領域、配列番号：72のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖定常領域、配列番号：76のアミノ酸配列を含む第2の重鎖定常領域、および配列番号：89のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖定常領域
のいずれか1つである、多重特異性抗原結合分子を提供する。
1つの局面において、本開示は、4本のポリペプチド鎖を含む多重特異性抗原結合分子であって、該4本のポリペプチド鎖が、以下の（h01）〜（h18）：
（h01）配列番号：41のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：50のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）、ならびに配列番号：54のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：68のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）；
（h02）配列番号：41のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：50のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）、ならびに配列番号：55のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：68のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）；
（h03）配列番号：42のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：51のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）、ならびに配列番号：56のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：69のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）；
（h04）配列番号：42のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：51のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）、ならびに配列番号：57のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：69のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）；
（h05）配列番号：44のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：52のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）、ならびに配列番号：60のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：70のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）；
（h06）配列番号：44のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：52のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）、ならびに配列番号：61のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：70のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）；
（h07）配列番号：45のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：50のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）、ならびに配列番号：62のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：68のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）；
（h08）配列番号：45のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：50のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）、ならびに配列番号：63のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：68のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）；
（h09）配列番号：46のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：51のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）、ならびに配列番号：64のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：69のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）；
（h10）配列番号：46のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：51のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）、ならびに配列番号：65のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：69のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）；
（h11）配列番号：47のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：52のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）、ならびに配列番号：66のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：70のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）；
（h12）配列番号：47のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：52のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）、ならびに配列番号：67のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：70のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）；
（h13）配列番号：48のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：53のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）、ならびに配列番号：56のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：71のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）；
（h14）配列番号：48のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：53のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）、ならびに配列番号：57のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：71のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）；
（h15）配列番号：49のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：53のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）、ならびに配列番号：64のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：71のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）；
（h16）配列番号：49のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：53のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）、ならびに配列番号：65のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：71のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）；
（h17）配列番号：43のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：52のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）、ならびに配列番号：58のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：70のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）；
（h18）配列番号：43のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：52のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）、ならびに配列番号：59のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：70のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）
のいずれか1つである、多重特異性抗原結合分子を提供する。
ピログルタミル化
抗体が細胞において発現した場合、抗体は翻訳後に修飾されることが知られている。翻訳後修飾の例としては、重鎖のC末端にあるリジンの、カルボキシペプチダーゼによる切断；重鎖および軽鎖のN末端にあるグルタミンまたはグルタミン酸の、ピログルタミル化によるピログルタミン酸への修飾；グリコシル化；酸化；脱アミド；および糖化が挙げられ、そのような翻訳後修飾は種々の抗体で生じることが公知である（Journal of Pharmaceutical Sciences, 2008, Vol. 97, p. 2426-2447）。
本開示の多重特異性抗原結合分子には、翻訳後修飾を受けている多重特異性抗体も含まれる。翻訳後修飾を受ける本開示のその多重特異性抗原結合分子の例としては、重鎖可変領域のN末端でのピログルタミル化および/または重鎖のC末端でのリジンの欠失を受けている多重特異性抗体が挙げられる。当分野において、N末端でのピログルタミル化およびC末端でのリジンの欠失によるそのような翻訳後修飾が、抗体の活性に何ら影響を有さないことは公知である（Analytical Biochemistry, 2006, Vol. 348, p. 24-39）。
抗原結合部分
本明細書で用いられる用語「抗原結合部分」は、抗原に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。1つの態様において、抗原結合部分は、それが結合している実体（例えば、第2の抗原結合部分）を、標的部位、例えばがん抗原（CLDN6）を発現する特定の種類の腫瘍細胞へと方向付けることができる。別の態様において、抗原結合部分は、その標的抗原、例えばT細胞受容体複合体抗原（CD3）または共刺激分子CD137を通じてシグナル伝達を活性化することができる。抗原結合部分には、本明細書においてさらに定義される抗体およびその断片が含まれる。具体的な抗原結合部分としては、抗体重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域を含む、抗体の抗原結合ドメインまたは抗体可変領域が挙げられる。特定の態様において、抗原結合部分は、本明細書においてさらに定義されかつ当技術分野において公知である抗体定常領域を含んでもよい。有用な重鎖定常領域には、5つのアイソタイプ：α、δ、ε、γ、またはμのいずれかが含まれる。有用な軽鎖定常領域には、2つのアイソタイプ：κおよびλのいずれかが含まれる。
抗原結合部分等に関して、本明細書で用いられる用語「第1の」、「第2の」、「第3の」、および「第4の」は、2種類以上の種類別の部分等が存在する場合に区別するという利便性のために用いられる。これらの用語の使用は、別段明示しない限り、多重特異性抗原結合分子の特定の順序または向きを付与することを意図しない。
CD3およびCD137に結合することができるがCD3とCD137に同時には結合しない抗原結合部分
本明細書において記載される多重特異性抗原結合分子は、CD3およびCD137に結合することができるが、CD3とCD137に同時には結合しない、少なくとも1つの抗原結合部分（本明細書において「デュアル抗原結合部分」または「第1の抗原結合部分」または「Dual-Ig」または「Dual-Fab」とも称される）を含む。特定の態様において、多重特異性抗原結合分子は、CD3およびCD137に特異的に結合することができるが、CD3とCD137に同時には結合しない、2つ以下の抗原結合部分を含む。1つの態様において、多重特異性抗原結合分子は、CD3またはCD137に結合するが、CD3とCD137に同時には結合しない、一価の結合をもたらす。
特定の態様において、デュアル抗原結合部分（「第1の抗原結合部分」）は概して、Fab分子、特に従来のFab分子である。特定の態様において、デュアル抗原結合部分（「第1の抗原結合部分」）は、抗体軽鎖および重鎖可変領域（VLおよびVH）を含むドメインである。抗体軽鎖および重鎖可変領域を含むそのようなドメインの適切な例としては、「単鎖Fv（scFv）」、「単鎖抗体」、「Fv」、「単鎖Fv2（scFv2）」、「Fab」、「F(ab')2」等が挙げられる。
特定の態様において、デュアル抗原結合部分（「第1の抗原結合部分」）は、CD3の部分ペプチドの全体または一部に特異的に結合する。特定の態様において、CD3はヒトCD3またはカニクイザルCD3、特にヒトCD3である。特定の態様において、第1の抗原結合部分は、ヒトCD3およびカニクイザルCD3に対して交差反応性である（すなわち、それらに特異的に結合する）。いくつかの態様において、第1の抗原結合部分は、CD3のεサブユニット、特に、配列番号：170（NP_000724.1）（括弧内にRefSeq登録番号を示す）に示されるCD3のヒトCD3εサブユニットに特異的に結合することができる。いくつかの態様において、第1の抗原結合部分は、真核細胞の表面上に発現しているCD3ε鎖に特異的に結合することができる。いくつかの態様において、第1の抗原結合部分は、T細胞の表面上に発現しているCD3ε鎖に結合する。
特定の態様において、CD137はヒトCD137である。いくつかの態様において、本開示の抗原結合分子の好適な例には、以下からなる群より選択される抗体によって結合されるヒトCD137エピトープと同じエピトープに結合する抗原結合分子が含まれる：
SPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGC配列（配列番号：182）を含む領域を認識する抗体、
DCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGC配列（配列番号：181）を含む領域を認識する抗体、
LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAEC配列（配列番号：183）を含む領域を認識する抗体、および
ヒトCD137タンパク質中のLQDPCSNCPAGTFCDNNRNQIC配列（配列番号：180）を含む領域を認識する抗体。
特定の態様において、デュアル抗原結合部分（「第1の抗原結合部分」）は、以下の抗体可変領域（a1）〜（a4）：
（a1）配列番号：9の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：15のCDR 2、および配列番号：21のCDR 3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：31のCDR 1、配列番号：35のCDR 2、および配列番号：39のCDR 3を含む軽鎖可変領域；
（a2）配列番号：10の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：16のCDR 2、および配列番号：22のCDR 3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：31のCDR 1、配列番号：35のCDR 2、および配列番号：39のCDR 3を含む軽鎖可変領域；
（a3）配列番号：11の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：17のCDR 2、および配列番号：23のCDR 3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：32のCDR 1、配列番号：36のCDR 2、および配列番号：40のCDR 3を含む軽鎖可変領域；
（a4）配列番号：12の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：18のCDR 2、および配列番号：24のCDR 3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：32のCDR 1、配列番号：36のCDR 2、および配列番号：40のCDR 3を含む軽鎖可変領域
のいずれか1つを含む。
特定の態様において、デュアル抗原結合部分（「第1の抗原結合部分」）は、ヒト抗体フレームワークまたはヒト化抗体フレームワークを含む抗体可変領域を含む。
特定の態様において、デュアル抗原結合部分（「第1の抗原結合部分」）は、以下の（c1）〜（c4）：
（c1）配列番号：3のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（c2）配列番号：4のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（c3）配列番号：5のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：28のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（c4）配列番号：6のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：28のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
のいずれか1つを含む。
1つの態様において、デュアル抗原結合部分（「第1の抗原結合部分」）は、配列番号：3に対して少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である重鎖可変領域配列、および配列番号：27に対して少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である軽鎖可変領域配列を含む。
1つの態様において、デュアル抗原結合部分（「第1の抗原結合部分」）は、配列番号：4に対して少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である重鎖可変領域配列、および配列番号：27に対して少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である軽鎖可変領域配列を含む。
1つの態様において、デュアル抗原結合部分（「第1の抗原結合部分」）は、配列番号：5に対して少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である重鎖可変領域配列、および配列番号：28に対して少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である軽鎖可変領域配列を含む。
1つの態様において、デュアル抗原結合部分（「第1の抗原結合部分」）は、配列番号：6に対して少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である重鎖可変領域配列、および配列番号：28に対して少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である軽鎖可変領域配列を含む。
特定の態様において、デュアル抗原結合部分（「第1の抗原結合部分」）は、以下の（j01）〜（j18）：
（j01）配列番号：54のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：68のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）；
（j02）配列番号：55のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：68のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）；
（j03）配列番号：56のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：69のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）；
（j04）配列番号：57のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：69のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）；
（j05）配列番号：60のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：70のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）；
（j06）配列番号：61のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：70のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）；
（j07）配列番号：62のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：68のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）；
（j08）配列番号：63のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：68のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）；
（j09）配列番号：64のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：69のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）；
（j10）配列番号：65のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：69のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）；
（j11）配列番号：66のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：70のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）；
（j12）配列番号：67のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：70のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）；
（j13）配列番号：56のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：71のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）；
（j14）配列番号：57のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：71のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）；
（j15）配列番号：64のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：71のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）；
（j16）配列番号：65のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：71のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）；
（j17）配列番号：58のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：70のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）；
（j18）配列番号：59のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：70のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）
のいずれか1つを含む。
本開示の多重特異性抗原結合分子には、翻訳後修飾を受けている多重特異性抗体も含まれる。翻訳後修飾を受ける本開示のその多重特異性抗原結合分子の例としては、重鎖可変領域のN末端でのピログルタミル化および/または重鎖のC末端でのリジンの欠失を受けている多重特異性抗原結合分子が挙げられる。当分野において、N末端でのピログルタミル化およびC末端でのリジンの欠失によるそのような翻訳後修飾が、抗体の活性に何ら影響を有さないことは公知である（Analytical Biochemistry, 2006, Vol. 348, p. 24-39）。
CLDN6に結合することができる抗原結合部分
本明細書において記載される多重特異性抗原結合分子は、CLDN6に結合することができる少なくとも1つの抗原結合部分を含む（本明細書において「CLDN6抗原結合部分」または「第2の抗原結合部分」とも称される）。特定の態様において、多重特異性抗原結合分子は、CLDN6に結合することができる1つの抗原結合部分を含む。
特定の態様において、CLDN6抗原結合部分（「第2の抗原結合部分」）は概して、Fab分子、特に従来のFab分子である。特定の態様において、CLDN6抗原結合部分（「第2の抗原結合部分」）は、抗体軽鎖および重鎖可変領域（VLおよびVH）を含むドメインである。抗体軽鎖および重鎖可変領域を含むそのようなドメインの適切な例としては、「単鎖Fv（scFv）」、「単鎖抗体」、「Fv」、「単鎖Fv2（scFv2）」、「Fab」、「F(ab')2」等が挙げられる。
特定の態様において、CLDN6抗原結合部分（「第2の抗原結合部分」）は、CLDN6の部分ペプチドの全体または一部に特異的に結合する。特定の態様において、CLDN6はヒトCLDN6またはカニクイザルCLDN6またはマウスCLDN6、特にヒトCLDN6である。特定の態様において、CLDN6抗原結合部分（「第2の抗原結合部分」）は、ヒトCLDN6およびカニクイザルCLDN6に対して交差反応性である（すなわち、それらに特異的に結合する）。
特定の態様において、CLDN6抗原結合部分（「第2の抗原結合部分」）は、CLDN6の第1の細胞外ドメイン（配列番号：196または197のアミノ酸29〜81）またはCLDN6の第2の細胞外ドメイン（配列番号：196または197のアミノ酸138〜159）に特異的に結合する。特定の態様において、CLDN6抗原結合部分（「第2の抗原結合部分」）は、真核細胞の表面上に発現しているヒトCLDN6に特異的に結合する。特定の態様において、CLDN6に対する結合活性は、がん細胞の表面上に発現しているCLDN6タンパク質に対する結合活性である。
特定の態様において、CLDN6抗原結合部分（「第2の抗原結合部分」）は、ヒトCLDN9に実質的に結合しない。
特定の態様において、CLDN6抗原結合部分（「第2の抗原結合部分」）は、ヒトCLDN4に実質的に結合しない。
特定の態様において、CLDN6抗原結合部分（「第2の抗原結合部分」）は、ヒトCLDN3に実質的に結合しない。
特定の態様において、CLDN6抗原結合部分（「第2の抗原結合部分」）は、配列番号：205に規定されるCLDN6変異体に実質的に結合しない。
特定の態様において、CLDN6抗原結合部分（「第2の抗原結合部分」）は、クロスオーバーFab分子、すなわち、Fab重鎖およびFab軽鎖の可変領域または定常領域のいずれかが交換されているFab分子である。
特定の態様において、CLDN6抗原結合部分（「第2の抗原結合部分」）は、以下の抗体可変領域（b1）または（b2）：
（b1）配列番号：8の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：14のCDR 2、および配列番号：20のCDR 3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：30のCDR 1、配列番号：34のCDR 2、および配列番号：38のCDR 3を含む軽鎖可変領域；
（b2）配列番号：7の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：13のCDR 2、および配列番号：19のCDR 3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号：29のCDR 1、配列番号：33のCDR 2、および配列番号：37のCDR 3を含む軽鎖可変領域
を含む。
特定の態様において、CLDN6抗原結合部分（「第2の抗原結合部分」）は、ヒト抗体フレームワークまたはヒト化抗体フレームワークを含む抗体可変領域を含む。
特定の態様において、CLDN6抗原結合部分（「第2の抗原結合部分」）は、以下の（d1）または（d2）：
（d1）配列番号：2のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：26のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（d2）配列番号：1のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：25のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む。
1つの態様において、CLDN6抗原結合部分（「第2の抗原結合部分」）は、配列番号：2に対して少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である重鎖可変領域配列、および配列番号：26に対して少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である軽鎖可変領域配列を含む。
1つの態様において、CLDN6抗原結合部分（「第2の抗原結合部分」）は、配列番号：1に対して少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である重鎖可変領域配列、および配列番号：25に対して少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である軽鎖可変領域配列を含む。
特定の態様において、CLDN6抗原結合部分（「第2の抗原結合部分」）は、以下の（k01）〜（k09）：
（k01）配列番号：41のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：50のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）；
（k02）配列番号：42のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：51のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）；
（k03）配列番号：44のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：52のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）；
（k04）配列番号：45のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：50のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）；
（k05）配列番号：46のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：51のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）；
（k06）配列番号：47のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：52のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）；
（k07）配列番号：48のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：53のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）；
（k08）配列番号：49のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：53のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）；
（k09）配列番号：43のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：52のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）
のいずれか1つを含む。
本開示の多重特異性抗原結合分子には、翻訳後修飾を受けている多重特異性抗体も含まれる。翻訳後修飾を受ける本開示のその多重特異性抗原結合分子の例としては、重鎖可変領域のN末端でのピログルタミル化および/または重鎖のC末端でのリジンの欠失を受けている多重特異性抗体が挙げられる。当分野において、N末端でのピログルタミル化およびC末端でのリジンの欠失によるそのような翻訳後修飾が、抗体の活性に何ら影響を有さないことは公知である（Analytical Biochemistry, 2006, Vol. 348, p. 24-39）。
抗原
本明細書で用いられる用語「抗原」は、抗原結合部分が結合するポリペプチド巨大分子上の部位（例えば、連続した一続きのアミノ酸、または非連続アミノ酸の別々の領域から構成される立体構造）を指し、抗原結合部分-抗原複合体を形成する。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面上に、ウイルス感染細胞の表面上に、他の疾患細胞の表面上に、免疫細胞の表面上に、血清中に遊離した状態で、および/または細胞外基質（ECM）中に見出すことができる。別段示さない限り、本明細書において抗原と称されるタンパク質（例えば、CD3、CD137、CLDN6）は、霊長類（例えば、ヒト）およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物供給源由来のタンパク質の任意の天然形態であり得る。特定の態様において、抗原はヒトCD3、ヒトCD137、またはヒトCLDN6である。本明細書において特定のタンパク質への言及がなされる場合、該用語は、「全長」の、プロセシングを受けていないタンパク質、ならびに細胞中でのプロセシングによって生じるタンパク質の任意の形態を包含する。該用語はまた、タンパク質の天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアントまたは対立遺伝子バリアントも包含する。
特定の態様において、本明細書において記載される多重特異性抗原結合分子は、異なる種のCD3、CD137、またはCLDN6の間で保存されているCD3、CD137、またはCLDN6のエピトープに結合する。特定の態様において、本出願の多重特異性抗原結合分子は、三重特異性抗原結合分子、すなわち、3種類の異なる抗原に特異的に結合することができる、つまり、CD3またはCD137のいずれか一方に結合することができるが、両方の抗原に同時には結合せず、かつCLDN6に特異的に結合することができる、三重特異性抗原結合分子である。
クローディン6（CLDN6）および他のクローディンファミリータンパク質
本明細書で用いられる用語「CLDN6」は、別段示さない限り、霊長類（例えば、ヒト）およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物供給源由来の任意の天然型クローディン6を指す。ヒトCLDN6（hCLDN6）のアミノ酸配列は配列番号：196または197に示され、マウスCLDN6（mCLDN6）のアミノ酸配列は配列番号：201に示される。
CLDN6以外のクローディンファミリーには、CLDN3、CLDN4、およびCLDN9などの多くの他のタンパク質が存在する。ヒトCLDN3（hCLDN3）、ヒトCLDN4（hCLDN4）、およびヒトCLDN9（hCLDN9）のアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号：199、200、および198に示される。マウスCLDN3（mCLDN3）、マウスCLDN4（mCLDN4）、およびマウスCLDN9（mCLDN9）のアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号：203、204、および202に示される。
CD3
特定の態様において、多重特異性抗原結合分子は、CD3の部分ペプチドの全体または一部に特異的に結合する。特定の態様において、CD3はヒトCD3またはカニクイザルCD3、特にヒトCD3である。特定の態様において、多重特異性抗原結合分子は、ヒトCD3およびカニクイザルCD3に対して交差反応性である（すなわち、それらに特異的に結合する）。いくつかの態様において、多重特異性抗原結合分子は、CD3のεサブユニット、特に、配列番号：170（NP_000724.1）（括弧内にRefSeq登録番号を示す）に示されるCD3のヒトCD3εサブユニットに特異的に結合することができる。いくつかの態様において、多重特異性抗原結合分子は、真核細胞の表面上に発現しているCD3ε鎖に特異的に結合することができる。いくつかの態様において、多重特異性抗原結合分子は、T細胞の表面上に発現しているCD3ε鎖に結合する。
CD137
特定の態様において、CD137はヒトCD137である。いくつかの態様において、本開示の抗原結合分子の好適な例には、以下からなる群より選択される抗体によって結合されるヒトCD137エピトープと同じエピトープに結合する抗原結合分子が含まれる：
SPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGC配列（配列番号：182）を含む領域を認識する抗体、
DCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGC配列（配列番号：181）を含む領域を認識する抗体、
LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAEC配列（配列番号：183）を含む領域を認識する抗体、および
ヒトCD137タンパク質中のLQDPCSNCPAGTFCDNNRNQIC配列（配列番号：180）を含む領域を認識する抗体。
抗原結合ドメイン
用語「抗原結合ドメイン」は、抗原の一部またはすべてに特異的に結合しかつそれに相補的である領域を含む抗体の一部を指す。抗原結合ドメインは、例えば、1つまたは複数の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）によってもたらされてもよい。好ましくは、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（VL）および抗体重鎖可変領域（VH）の両方を含む。そのような好ましい抗原結合ドメインには、例えば、「単鎖Fv（scFv）」、「単鎖抗体」、「Fv」、「単鎖Fv2（scFv2）」、「Fab」、および「F(ab')2」が含まれる。抗原結合ドメインはまた、シングルドメイン抗体によってもたらされてもよい。
シングルドメイン抗体
本明細書において、用語「シングルドメイン抗体」は、該ドメインがそれ単独で抗原結合活性を発揮できる限りは、その構造によって限定されない。一般的な抗体、例えば、IgG抗体は、可変領域がVHおよびVLのペアリングによって形成されている状態で抗原結合活性を示すのに対して、シングルドメイン抗体のそれ自体のドメイン構造は、別のドメインとのペアリングなしにそれ単独で抗原結合活性を発揮できることが公知である。通常、シングルドメイン抗体は、比較的低い分子量を有し、単量体の形態で存在する。
シングルドメイン抗体の例としては、これらに限定されないが、軽鎖を生来欠いているラクダ科の動物のVHHおよびサメVNARなどの抗原結合分子、および抗体VHドメインの全体もしくは一部または抗体VLドメインの全体もしくは一部を含有する抗体断片が挙げられる。抗体VHドメインまたは抗体VLドメインの全体または一部を含有する抗体断片であるシングルドメイン抗体の例としては、これらに限定されないが、米国特許第6,248,516号B1などに記載されているようなヒト抗体VHまたはヒト抗体VLを起源とする、人工的に調製したシングルドメイン抗体が挙げられる。本発明のいくつかの態様において、1つのシングルドメイン抗体は、3種類のCDR（CDR1、CDR2、およびCDR3）を有する。
シングルドメイン抗体は、シングルドメイン抗体を産生できる動物から、またはシングルドメイン抗体を産生できる動物の免疫化によって、得ることができる。シングルドメイン抗体を産生できる動物の例としては、これらに限定されないが、ラクダ科の動物、およびシングルドメイン抗体を生じさせることができる遺伝子を保有するトランスジェニック動物が挙げられる。ラクダ科の動物には、ラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダ、およびグアナコ等が含まれる。シングルドメイン抗体を生じさせることができる遺伝子を保有するトランスジェニック動物の例としては、これらに限定されないが、国際公開公報番号WO2015/143414および米国特許公報番号US2011/0123527 A1に記載のトランスジェニック動物が挙げられる。該動物から得られたシングルドメイン抗体のフレームワーク配列は、ヒト化シングルドメイン抗体を得るために、ヒト生殖系列配列またはそれに類似する配列に変換されてもよい。ヒト化シングルドメイン抗体（例えば、ヒト化VHH）もまた、本発明のシングルドメイン抗体の一態様である。
あるいは、シングルドメイン抗体は、シングルドメイン抗体を含有するポリペプチドライブラリからELISAまたはパニング等によって得ることができる。シングルドメイン抗体を含有するポリペプチドライブラリの例としては、これらに限定されないが、種々の動物またはヒトから得られたナイーブ抗体ライブラリ（例えば、Methods in Molecular Biology 2012 911 (65-78)；およびBiochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics 2006 1764: 8 (1307-1319)）、種々の動物の免疫化によって得られた抗体ライブラリ（例えば、Journal of Applied Microbiology 2014 117: 2 (528-536)）、および種々の動物またはヒトの抗体遺伝子から調製した合成抗体ライブラリ（例えば、Journal of Biomolecular Screening 2016 21: 1 (35-43); Journal of Biological Chemistry 2016 291:24 (12641-12657)；およびAIDS 2016 30: 11 (1691-1701)）が挙げられる。
可変領域
用語「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗体を抗原へと結合させることに関与する、抗体の重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然型抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれVHおよびVL）は、通常、各ドメインが4つの保存されたフレームワーク領域 (FR) および3つの超可変領域 (HVR) を含む、類似の構造を有する。（例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007) 参照。）1つのVHまたはVLドメインで、抗原結合特異性を与えるに充分であろう。さらに、ある特定の抗原に結合する抗体は、当該抗原に結合する抗体からのVHまたはVLドメインを使ってそれぞれVLまたはVHドメインの相補的ライブラリをスクリーニングして、単離されてもよい。例えばPortolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993)； Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991) 参照。
HVRまたはCDR
本明細書で用いられる用語「超可変領域」または「HVR」は、配列において超可変であり（「相補性決定領域」または「CDR」(complementarity determining region)）、および／または構造的に定まったループ（「超可変ループ」）を形成し、および／または抗原接触残基（「抗原接触」）を含む、抗体の可変ドメインの各領域を指す。超可変領域（HVR）は、「相補性決定領域」（CDR）とも称され、これらの用語は、本明細書では、抗原結合領域を形成する可変領域の部分に関して相互に交換可能に用いられる。通常、抗体は6つのHVRを含む：VHに3つ（H1、H2、H3）、およびVLに3つ（L1、L2、L3）である。本明細書での例示的なHVRは、以下のものを含む：
(a) アミノ酸残基26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2)、および96-101 (H3)のところで生じる超可変ループ (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))；
(b) アミノ酸残基24-34 (L1)、50-56 (L2)、89-97 (L3)、31-35b (H1)、50-65 (H2)、 および95-102 (H3)のところで生じるCDR (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))；
(c) アミノ酸残基27c-36 (L1)、46-55 (L2)、89-96 (L3)、30-35b (H1)、47-58 (H2)、および93-101 (H3) のところで生じる抗原接触 (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996))；ならびに、
(d) HVRアミノ酸残基46-56 (L2)、47-56 (L2)、48-56 (L2)、49-56 (L2)、26-35 (H1)、26-35b (H1)、49-65 (H2)、93-102 (H3)、および94-102 (H3)を含む、(a)、(b)、および／または(c)の組合せ。
別段示さない限り、HVR残基および可変ドメイン中の他の残基（例えば、FR残基）は、本明細書では上記のKabatらに従ってナンバリングされる。
HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3は、それぞれ、「H-CDR1」、「H-CDR2」、「H-CDR3」、「L-CDR1」、「L-CDR2」、および「L-CDR3」とも記載される。
CD3およびCD137に結合することができる
本開示の抗体可変領域が「CD3およびCD137に結合することができる」かどうかは、当技術分野において公知の方法によって判定することができる。
これは、例えば、電気化学発光法（ECL法）によって判定することができる（BMC Research Notes 2011, 4:281）。
具体的には、例えば、ビオチン標識された被験抗原結合分子の、CD3およびCD137に結合することができる領域、例えば、Fab領域から構成される低分子抗体、またはその一価抗体（通常の抗体が有する2つのFab領域のうち1つが欠けている抗体）を、sulfo-tag（Ru錯体）で標識されたCD3またはCD137と混合し、混合物をストレプトアビジン固定化プレート上に添加する。この操作において、ビオチン標識された被験抗原結合分子は、プレート上のストレプトアビジンに結合する。sulfo-tagから光を発生させ、その発光シグナルを、Sector Imager 600または2400（MSD K.K.）などを用いて検出し、それによって、CD3またはCD137に対する被験抗原結合分子の上述の領域の結合を確認することができる。
あるいは、このアッセイは、ELISA、FACS（蛍光活性化細胞選別）、ALPHAScreen（増幅発光近接ホモジニアスアッセイスクリーン）、表面プラズモン共鳴（SPR）現象に基づくBIACORE法などによって実施されてもよい（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010）。
具体的には、アッセイは、例えば、表面プラズモン共鳴（SPR）現象に基づく相互作用解析機器であるBiacore（GE Healthcare Japan Corp.）を用いて実施することができる。Biacore解析機器には、Biacore T100、T200、X100、A100、4000、3000、2000、1000、またはCなどの任意の機種が含まれる。CM7、CM5、CM4、CM3、C1、SA、NTA、L1、HPA、またはAuチップなどの任意のBiacore用センサーチップを、センサーチップとして用いることができる。プロテインA、プロテインG、プロテインL、抗ヒトIgG抗体、抗ヒトIgG-Fab、抗ヒトL鎖抗体、抗ヒトFc抗体、抗原タンパク質、または抗原ペプチドなどの、本開示の抗原結合分子を捕捉するためのタンパク質を、アミンカップリング、ジスルフィドカップリング、またはアルデヒドカップリングなどのカップリング法によって、センサーチップ上に固定化する。その上にCD3またはCD137をアナライトとしてインジェクトし、相互作用を測定してセンサーグラムを取得する。この操作において、CD3またはCD137の濃度は、アッセイサンプルの相互作用の強さ（例えば、KD）に従って数μMから数pMの範囲内で選択することができる。
あるいは、CD3またはCD137を、抗原結合分子の代わりにセンサーチップ上に固定化して、次に、評価したい抗体サンプルを相互作用させてもよい。本開示の抗原結合分子の抗体可変領域がCD3またはCD137に対する結合活性を有するかどうかを、相互作用のセンサーグラムから算出された解離定数（KD）値に基づいて、または抗原結合分子サンプルの作用前のレベルを上回る、作用後のセンサーグラムの増加の程度に基づいて、確認することができる。いくつかの態様において、目的の抗原（すなわち、CD3またはCD137）に対する本開示の抗体可変領域の結合活性または親和性を、例えば、Biacore T200機器（GE Healthcare）またはBiacore 8K機器（GE Healthcare）を用いて、37℃（CD137について）または25℃（CD3について）で評価する。抗ヒトFc（例えば、GE Healthcare）を、アミンカップリングキット（例えば、GE Healthcare）を用いてCM4センサーチップのすべてのフローセル上に固定化する。抗原結合分子または抗体可変領域を、抗Fcセンサー表面上に捕捉し、次いで、抗原（CD3またはCD137）をフローセル上にインジェクトする。抗原結合分子または抗体可変領域の捕捉レベルは、200レゾナンスユニット（RU）を目指してもよい。組換えヒトCD3またはCD137を、2倍段階希釈によって調製した400〜25 nMでインジェクトし、その後解離させてもよい。すべての抗原結合分子または抗体可変領域およびアナライトは、20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05％ Tween 20、0.005％ NaN3を含有するACES pH 7.4において調製する。センサー表面は、サイクル毎に3M MgCl2で再生する。結合親和性は、例えば、Biacore T200 Evaluation software, version 2.0（GE Healthcare）またはBiacore 8K Evaluation software（GE Healthcare）を用いて、データをプロセシングし、1:1結合モデルにフィットさせることによって決定する。本開示の抗原結合ドメインの特異的結合活性または親和性を評価するために、KD値を算出する。
ALPHAScreenは、2種類のビーズ（ドナーおよびアクセプター）を用いるALPHAテクノロジーによって、以下の原理に基づいて実施される：ドナービーズに結合した分子とアクセプタービーズに結合した分子との間の生物学的相互作用によりこれら2つのビーズが近接して位置する時にのみ、発光シグナルが検出される。レーザーによって励起されたドナービーズ中のフォトセンシタイザーは、周辺の酸素を励起状態の一重項酸素に変換する。一重項酸素は、ドナービーズ周辺に拡散し、それに近接して位置するアクセプタービーズに到達すると、それによってビーズにおける化学発光反応を引き起こし、最終的に光が放出される。ドナービーズに結合した分子とアクセプタービーズに結合した分子との間の相互作用がない場合には、ドナービーズによって産生される一重項酸素がアクセプタービーズに到達しない。したがって、化学発光反応は起きない。
その間の相互作用を観察する物質の一方（リガンド）を、センサーチップの金薄膜上に固定する。金薄膜とガラスとの境界面で全反射するように、センサーチップの裏側から光を当てる。結果として、反射光の一部に、反射強度が低下した部位（SPRシグナル）が形成される。その間の相互作用を観察する物質の他方（アナライト）を、センサーチップの表面上にインジェクトする。アナライトがリガンドに結合すると、固定化されているリガンド分子の質量が増加して、センサーチップ表面上の溶媒の屈折率が変化する。この屈折率の変化により、SPRシグナルの位置がシフトする（逆に、結合した分子が解離すると、シグナルは元の位置に戻る）。Biacoreシステムは、シフトの量、すなわち、センサーチップ表面上の質量変化を縦座標にプロットし、質量の時間依存的変化をアッセイデータとして表示する（センサーグラム）。センサーチップ表面上に捕捉されたリガンドに結合したアナライトの量（アナライトを相互作用させた前後でのセンサーグラム上でのレスポンスの変化の量）を、センサーグラムから決定することができる。しかし、結合量はリガンドの量にも依存するため、比較は、実質的に同じ量のリガンドの量を用いる条件下で行わなければならない。キネティクス、すなわち、会合速度定数（ka）および解離速度定数（kd）は、センサーグラムの曲線から決定することができ、一方、親和性（KD）は、これらの定数の比から決定することができる。阻害アッセイもまた、BIACORE法において好適に用いられる。阻害アッセイの例は、Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010に記載されている。
CD3とCD137（4-1BB）に同時には結合しない
用語「CD3とCD137（4-1BB）に同時（at the same time）には結合しない」または「CD3とCD137（4-1BB）に同時（simultaneously）には結合しない」は、本開示の抗原結合部分または抗体可変領域が、CD3と結合している状態ではCD137に結合できず、逆に、抗原結合部分または抗体可変領域が、CD137と結合している状態ではCD3に結合できないことを意味する。ここで、「CD3とCD137に同時には結合しない」という句には、CD3を発現する細胞とCD137を発現する細胞とを架橋しないこと、または、各々が異なる細胞上で発現しているCD3とCD137に同時には結合しないことも含まれる。この句にはさらに、CD3およびCD137が可溶性タンパク質のように細胞膜上に発現していないか、または両方が同じ細胞上に存在する時には、可変領域が、CD3とCD137の両方に同時に結合することができるが、各々が異なる細胞上で発現しているCD3とCD137には同時には結合することができない場合も含まれる。そのような抗体可変領域は、これらの機能を有している限り、特に限定されない。その例には、所望の抗原に結合するようにそのアミノ酸の一部を改変した、IgG型の抗体可変領域に由来する可変領域が含まれ得る。改変されるアミノ酸は、例えば、CD3またはCD137に結合する抗体可変領域における、その改変が抗原に対する結合を喪失させないアミノ酸から選択される。
ここで、「異なる細胞上で発現している」という句は、単に、抗原が別々の細胞上で発現していることを意味する。そのような細胞の組み合わせは、例えば、T細胞と別のT細胞のように同じ種類の細胞であってもよいし、またはT細胞とNK細胞のように異なる種類の細胞であってもよい。
本開示の抗原結合分子が「CD3とCD137に同時には結合しない」かどうかは、抗原結合分子がCD3およびCD137の両方に対する結合活性を有することを確認すること；次いで、この結合活性を有する可変領域を含む抗原結合分子に、CD3またはCD137のいずれかを予め結合させること；および次いで、上述の方法によってもう1つのものに対するその結合活性の有無を判定すること、によって確認することができる。あるいは、これはまた、ELISAプレート上またはセンサーチップ上に固定化されたCD3またはCD137のいずれかに対する抗原結合分子の結合が、溶液中へのもう1つのものの添加によって阻害されるかどうかを判定することによって、確認することもできる。いくつかの態様において、本開示の抗原結合分子のCD3またはCD137のいずれかに対する結合は、もう1つに対する抗原結合分子の結合によって、少なくとも50％、好ましくは60％以上、より好ましくは70％以上、より好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上、またはいっそうより好ましくは95％以上阻害される。
1つの局面において、1つの抗原（例えば、CD3）を固定化している間に、CD3に対する抗原結合分子の結合の阻害を、先行技術において公知の方法（すなわち、ELISA、BIACOREなど）によって、他の抗原（例えば、CD137）の存在下で決定することができる。別の局面において、CD137を固定化している間に、CD137に対する抗原結合分子の結合の阻害もまた、CD3の存在下で決定することができる。上述の2つの局面のうちのいずれか1つが実施される時に、結合が、少なくとも50％、好ましくは60％以上、好ましくは70％以上、さらに好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上、またはいっそうより好ましくは95％以上阻害されるならば、本開示の抗原結合分子は、CD3とCD137に同時には結合しないと判定される。
いくつかの態様において、アナライトとしてインジェクトされる抗原の濃度は、固定化される他の抗原の濃度よりも少なくとも1倍、2倍、5倍、10倍、30倍、50倍、または100倍高い。
好ましい様式において、アナライトとしてインジェクトされる抗原の濃度は、固定化される他の抗原の濃度よりも100倍高く、結合は、少なくとも80％阻害される。
1つの態様において、抗原結合分子のCD137（固定化）結合活性についてのKD値に対する抗原結合分子のCD3（アナライト）結合活性についてのKD値の比（KD(CD3)/ KD(CD137)）を算出し、CD137（固定化）濃度よりもKD値の比（KD(CD3)/ KD(CD137)）の10倍、50倍、100倍、または200倍高い、CD3（アナライト）濃度を、上記の競合測定のために用いることができる。（例えば、KD値の比が0.1である場合は、1倍、5倍、10倍、または20倍高い濃度を選択することができる。さらに、KD値の比が10である場合は、100倍、500倍、1000倍、または2000倍高い濃度を選択することができる。）
1つの局面において、1つの抗原（例えば、CD3）を固定化している間に、CD3に対する抗原結合分子の結合シグナルの減弱を、先行技術において公知の方法（すなわち、ELISA、ECLなど）によって、他の抗原（例えば、CD137）の存在下で決定することができる。別の局面において、CD137を固定化している間に、CD137に対する抗原結合分子の結合シグナルの減弱もまた、CD3の存在下で決定することができる。上述の2つの局面のうちのいずれか1つが実施される時に、結合シグナルが、少なくとも50％、好ましくは60％以上、好ましくは70％以上、さらに好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上、またはいっそうより好ましくは95％以上減弱されるならば、本開示の抗原結合分子は、CD3とCD137に同時には結合しないと判定される。
いくつかの態様において、アナライトとしてインジェクトされる抗原の濃度は、固定化される他の抗原の濃度よりも少なくとも1倍、2倍、5倍、10倍、30倍、50倍、または100倍高い。
好ましい様式において、アナライトとしてインジェクトされる抗原の濃度は、固定化される他の抗原の濃度よりも100倍高く、結合は、少なくとも80％阻害される。
1つの態様において、抗原結合分子のCD137（固定化）結合活性についてのKD値に対する抗原結合分子のCD3（アナライト）結合活性についてのKD値の比（KD(CD3)/ KD(CD137)）を算出し、CD137（固定化）濃度よりもKD値の比（KD(CD3)/ KD(CD137)）の10倍、50倍、100倍、または200倍高い、CD3（アナライト）濃度を、上記の測定のために用いることができる。（例えば、KD値の比が0.1である場合は、1倍、5倍、10倍、または20倍高い濃度を選択することができる。さらに、KD値の比が10である場合は、100倍、500倍、1000倍、または2000倍高い濃度を選択することができる。）
具体的には、例えば、ECL法を用いる場合、ビオチン標識された被験抗原結合分子、sulfo-tag（Ru錯体）で標識されたCD3、および標識されていないCD137を準備する。被験抗原結合分子が、CD3およびCD137に結合することができるが、CD3とCD137に同時には結合しない場合、被験抗原結合分子と標識されたCD3との混合物をストレプトアビジン固定化プレート上に添加すること、およびその後の発光によって、sulfo-tagの発光シグナルが、標識されていないCD137の非存在下で検出される。対照的に、発光シグナルは、標識されていないCD137の存在下で減少する。この発光シグナルの減少を定量して、相対的な結合活性を決定することができる。この解析は、標識されたCD137および標識されていないCD3を用いて、同様に実施され得る。
ALPHAScreenの場合、被験抗原結合分子は、競合するCD137の非存在下でCD3と相互作用して、520〜620 nmのシグナルを生成する。タグ付けされていないCD137は、被験抗原結合分子との相互作用についてCD3と競合する。競合の結果として引き起こされる蛍光の減少を定量し、それによって相対的な結合活性を決定することができる。スルホ-NHS-ビオチンなどを用いたポリペプチドのビオチン化は、当技術分野において公知である。例えば、CD3をコードするポリヌクレオチドとGSTをコードするポリヌクレオチドとをインフレームで融合すること；および、結果として生じた融合遺伝子を、その発現が可能なベクターを保有する細胞などによって発現させ、その後グルタチオンカラムを用いて精製することを含む、適宜採用される方法によって、CD3をGSTでタグ付けすることができる。得られたシグナルは、好ましくは、例えば、非線形回帰解析に基づく一部位競合（one-site competition）モデルに適合したソフトウェアGRAPHPAD PRISM（GraphPad Software, Inc., San Diego）用いて解析される。この解析は、タグ付けされたCD137およびタグ付けされていないCD3を用いて、同様に解析され得る。
あるいは、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を用いた方法が用いられてもよい。FRETとは、励起エネルギーが、近接して位置する2つの蛍光分子の間で互いに、電子共鳴によって直接移動する現象である。FRETが起こると、ドナー（励起状態を有する蛍光分子）の励起エネルギーがアクセプター（ドナーの近くに位置するもう1つの蛍光分子）に移動するため、ドナーから放射される蛍光が消失し（正確には、蛍光の寿命が短縮し）、代わりにアクセプターから蛍光が放射される。この現象の使用によって、CD3とCD137に同時に結合するか否かを解析することができる。例えば、蛍光ドナーを有するCD3および蛍光アクセプターを有するCD137が、被験抗原結合分子に同時に結合すると、ドナーの蛍光は消失し、一方、アクセプターから蛍光が放射される。そのため、蛍光波長の変化が観察される。そのような抗体は、CD3とCD137に同時に結合するものと確認される。他方で、CD3、CD137、および被験抗原結合分子の混合が、CD3と結合した蛍光ドナーの蛍光波長を変化させないならば、この被験抗原結合分子は、CD3およびCD137に結合することができるが、CD3とCD137に同時には結合しない抗原結合ドメインとみなすことができる。
例えば、ビオチン標識された被験抗原結合分子を、ドナービーズ上のストレプトアビジンに結合させ、一方、グルタチオンSトランスフェラーゼ（GST）でタグ付けされたCD3を、アクセプタービーズに結合させる。被験抗原結合分子は、競合する第2の抗原の非存在下でCD3と相互作用して、520〜620 nmのシグナルを生成する。タグ付けされていない第2の抗原は、被験抗原結合分子との相互作用についてCD3と競合する。競合の結果として引き起こされる蛍光の減少を定量し、それによって相対的な結合活性を決定することができる。スルホ-NHS-ビオチンなどを用いたポリペプチドのビオチン化は、当技術分野において公知である。例えば、CD3をコードするポリヌクレオチドとGSTをコードするポリヌクレオチドとをインフレームで融合すること；および、結果として生じた融合遺伝子を、その発現が可能なベクターを保有する細胞などによって発現させ、その後グルタチオンカラムを用いて精製することを含む、適宜採用される方法によって、CD3をGSTでタグ付けすることができる。得られたシグナルは、好ましくは、例えば、非線形回帰解析に基づく一部位競合モデルに適合したソフトウェアGRAPHPAD PRISM（GraphPad Software, Inc., San Diego）を用いて解析される。
タグ付けは、GSTタグ付けに限定されず、ヒスチジンタグ、MBP、CBP、Flagタグ、HAタグ、V5タグ、c-mycタグなどであるがそれらに限定されない、任意のタグで実施されてもよい。被験抗原結合分子のドナービーズへの結合は、ビオチン-ストレプトアビジン反応を用いた結合に限定されない。特に、被験抗原結合分子がFcを含む場合、可能な方法には、ドナービーズ上のプロテインAまたはプロテインGなどのFc認識タンパク質を介して被験抗原結合分子を結合させることが含まれる。
また、CD3およびCD137が、可溶性タンパク質のように細胞膜上に発現していない時、または両方が同じ細胞上に存在する時には、可変領域が、CD3とCD137に同時に結合することができるが、各々が異なる細胞上で発現しているCD3とCD137に同時には結合することができない場合もまた、当技術分野において公知の方法によってアッセイすることができる。
具体的には、CD3およびCD137に対する同時の結合を検出するためのECL-ELISAにおいて陽性であると確認されている被験抗原結合分子をまた、CD3を発現する細胞およびCD137を発現する細胞と混合する。被験抗原結合分子は、抗原結合分子およびこれらの細胞が互いに同時に結合しない限り、異なる細胞上で発現しているCD3とCD137に同時には結合することができないことが示され得る。このアッセイは、例えば、細胞ベースのECL-ELISAによって実施することができる。CD3を発現する細胞を、予めプレート上に固定化する。被験抗原結合分子をそれに結合させた後に、CD137を発現する細胞をプレートに添加する。CD137を発現する細胞上でのみ発現している異なる抗原は、この抗原に対するsulfo-tagで標識された抗体を用いて検出される。抗原結合分子が、それぞれ2つの細胞上で発現している2つの抗原に同時に結合する場合は、シグナルが観察される。抗原結合分子がこれらの抗原に同時には結合しない場合は、いかなるシグナルも観察されない。
あるいは、このアッセイは、ALPHAScreen法によって実施されてもよい。被験抗原結合分子を、ドナービーズに結合したCD3を発現する細胞およびアクセプタービーズに結合したCD137を発現する細胞と混合する。抗原結合分子が、それぞれ2つの細胞上で発現している2つの抗原に同時に結合する場合は、シグナルが観察される。抗原結合分子がこれらの抗原に同時には結合しない場合は、シグナルは観察されない。
あるいは、このアッセイは、Octet相互作用解析法によって実施されてもよい。最初に、ペプチドタグを付加したCD3を発現する細胞を、ペプチドタグを認識するバイオセンサーに結合させる。CD137を発現する細胞および被験抗原結合分子を、ウェルに入れて、相互作用について解析する。抗原結合分子が、それぞれ2つの細胞上で発現している2つの抗原に同時に結合する場合は、被験抗原結合分子およびCD137を発現する細胞のバイオセンサーへの結合によって引き起こされる大きな波長シフトが観察される。抗原結合分子がこれらの抗原に同時には結合しない場合は、被験抗原結合分子のみのバイオセンサーへの結合によって引き起こされる小さな波長シフトが観察される。
結合活性に基づくこれらの方法の代わりに、生物活性に基づくアッセイが実施されてもよい。例えば、CD3を発現する細胞およびCD137を発現する細胞を、被験抗原結合分子と混合して培養する。それぞれ2つの細胞上で発現している2つの抗原は、抗原結合分子がこれらの2つの抗原に同時に結合する場合は、被験抗原結合分子を介して相互に活性化される。そのため、抗原のそれぞれの下流のリン酸化レベルの増加などの活性化シグナルの変化を、検出することができる。あるいは、サイトカインの産生が、活性化の結果として誘導される。そのため、産生されるサイトカインの量を測定し、それによって、2つの細胞に同時に結合するか否かを確認することができる。あるいは、CD137を発現する細胞に対する細胞傷害活性が、活性化の結果として誘導される。あるいは、レポーター遺伝子の発現が、活性化の結果として、CD137またはCD3のシグナル伝達経路の下流で活性化されるプロモーターによって誘導される。そのため、細胞傷害活性または産生されるレポータータンパク質の量を測定し、それによって、2つの細胞に同時に結合するか否かを確認することができる。
Fab分子
「Fab分子」は、免疫グロブリンの重鎖のVHおよびCH1ドメイン（「Fab重鎖」）ならびに軽鎖のVLおよびCLドメイン（「Fab軽鎖」）からなるタンパク質を指す。
融合される
「融合される」は、構成成分（例えば、Fab分子およびFcドメインサブユニット）が、直接的に、または1つもしくは複数のペプチドリンカーを介して、ペプチド結合によって連結されることを意味する。
「クロスオーバー」Fab
「クロスオーバー」Fab分子（「Crossfab」とも呼ばれる）は、Fab重鎖およびFab軽鎖の可変領域または定常領域のいずれかが交換されている、Fab分子を意味し、すなわち、クロスオーバーFab分子は、軽鎖可変領域および重鎖定常領域で構成されたペプチド鎖と、重鎖可変領域および軽鎖定常領域で構成されたペプチド鎖とを含む。明確にするために記すと、Fab軽鎖およびFab重鎖の可変領域が交換されているクロスオーバーFab分子では、重鎖定常領域を含むペプチド鎖が、本明細書において、クロスオーバーFab分子の「重鎖」と称される。反対に、Fab軽鎖およびFab重鎖の定常領域が交換されているクロスオーバーFab分子では、重鎖可変領域を含むペプチド鎖が、本明細書において、クロスオーバーFab分子の「重鎖」と称される。
「従来の」Fab
それに対して、「従来の」Fab分子は、その天然の形式でのFab分子、すなわち、重鎖の可変領域および定常領域で構成された重鎖（VH-CH1）、ならびに軽鎖の可変領域および定常領域で構成された軽鎖（VL-CL）を含むFab分子を意味する。用語「免疫グロブリン分子」は、天然に存在する抗体の構造を有するタンパク質を指す。例えば、IgGクラスの免疫グロブリンは、ジスルフィド結合で結合された2つの軽鎖および2つの重鎖で構成された、約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各重鎖は、N末端からC末端へ、可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（VH）と、その後に続く重鎖定常領域とも呼ばれる3種類の定常ドメイン（CH1、CH2、およびCH3）とを有する。同様に、各軽鎖は、N末端からC末端へ、可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（VL）と、その後に続く軽鎖定常領域とも呼ばれる定常軽鎖（CL）ドメインとを有する。免疫グロブリンの重鎖は、α（IgA）、δ（IgD）、ε（IgE）、γ（IgG）、またはμ（IgM）と呼ばれる5つのタイプのうちの1つに割り当てられてもよく、それらの一部は、サブタイプ、例えば、γ1（IgG1）、γ2（IgG2）、γ3（IgG3）、γ4（IgG4）、α1（IgA1）、およびα2（IgA2）にさらに分類されてもよい。免疫グロブリンの軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、κおよびλと呼ばれる2つのタイプのうちの1つに割り当てられもよい。免疫グロブリンは、免疫グロブリンヒンジ領域を介して連結された、2つのFab分子およびFcドメインから本質的になる。
親和性
「親和性」は、分子（例えば、抗原結合分子または抗体）の結合部位1個と、分子の結合パートナー（例えば、抗原）との間の、非共有結合的な相互作用の合計の強度を指す。別段示さない限り、本明細書で用いられる「結合親和性」は、ある結合対のメンバー（例えば、抗原結合分子と抗原、または抗体と抗原）の間の１：１相互作用を反映する、固有の結合親和性を指す。分子Xの、そのパートナーYに対する親和性は、一般的に、解離速度定数と会合速度定数（それぞれkoffおよびkon）との比である、解離定数（KD）により表すことができる。したがって、速度定数の比が同じままである限り、等価の親和性は異なる速度定数を含んでもよい。親和性は、本明細書に記載のものを含む、当技術分野において公知の確立した方法によって測定することができる。親和性を測定するための具体的な方法は、表面プラズモン共鳴（SPR）である。
親和性を決定する方法
特定の態様において、本明細書で提供される抗原結合分子または抗体は、その抗原に対して、≦1μM、≦120nM、≦100nM、≦80nM、≦70nM、≦50nM、≦40nM、≦30nM、≦20nM、≦10nM、≦2nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nMまたは≦0.001nM（例えば、10-8M以下、10-8M〜10-13M、10-9M〜10-13M）の解離定数 (KD) を有する。特定の態様において、CD3、CD137、またはCLDN6に対する、抗体／抗原結合分子のKD値は、1〜40、1〜50、1〜70、1〜80、30〜50、30〜70、30〜80、40〜70、40〜80、または60〜80nMの範囲内に入る。
1つの態様において、KDは、放射性標識抗原結合測定法 (radiolabeled antigen binding assay: RIA) によって測定される。1つの態様において、RIAは、目的の抗体のFabバージョンおよびその抗原を用いて実施される。例えば、抗原に対するFabの溶液中結合親和性は、非標識抗原の漸増量系列の存在下で最小濃度の (125I) 標識抗原によりFabを平衡化させ、次いで結合した抗原を抗Fab抗体でコーティングされたプレートにより捕捉することによって測定される。（例えば、Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999) を参照のこと）。測定条件を構築するために、MICROTITER（登録商標）マルチウェルプレート (Thermo Scientific) を50mM炭酸ナトリウム (pH9.6) 中5μg/mlの捕捉用抗Fab抗体 (Cappel Labs) で一晩コーティングし、その後に室温（およそ23℃）で2〜5時間、PBS中2％ (w/v) ウシ血清アルブミンでブロックする。非吸着プレート (Nunc #269620) において、100 pMまたは26 pMの [125I]-抗原を、（例えば、Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997) における抗VEGF抗体、Fab-12の評価と同じように）目的のFabの段階希釈物と混合する。次いで、目的のFabを一晩インキュベートするが、このインキュベーションは、平衡が確実に達成されるよう、より長時間（例えば、約65時間）継続され得る。その後、混合物を、室温でのインキュベーション（例えば、1時間）のために捕捉プレートに移す。次いで溶液を除去し、プレートをPBS中0.1％のポリソルベート20（TWEEN-20（登録商標））で8回洗浄する。プレートが乾燥したら、150μl/ウェルのシンチラント（MICROSCINT-20（商標）、Packard）を添加し、TOPCOUNT（商標）ガンマカウンター (Packard) においてプレートを10分間カウントする。最大結合の20％以下を与える各Fabの濃度を、競合結合アッセイにおいて使用するために選択する。
別の態様によれば、Kdは、BIACORE（登録商標）表面プラズモン共鳴アッセイを用いて測定される。例えば、BIACORE（登録商標）-2000またはBIACORE（登録商標）-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) を用いる測定法が、およそ10反応単位 (response unit: RU) の抗原が固定されたCM5チップを用いて25℃で実施される。1つの態様において、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ (CM5、BIACORE, Inc.) は、供給元の指示に従いN-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミドヒドロクロリド (EDC) およびN-ヒドロキシスクシンイミド (NHS) を用いて活性化される。抗原は、およそ10反応単位 (RU) のタンパク質の結合を達成するよう、5μl/分の流速で注入される前に、10mM酢酸ナトリウム、pH4.8を用いて5μg/ml（およそ0.2μM）に希釈される。抗原の注入後、未反応基をブロックするために1Mエタノールアミンが注入される。キネティクスの測定のために、25℃、およそ25μl/分の流速で、0.05％ポリソルベート20（TWEEN-20（商標））界面活性剤含有PBS (PBST) 中のFabの2倍段階希釈物 (0.78nM〜500nM) が注入される。会合速度 (kon) および解離速度 (koff) は、単純な1対1ラングミュア結合モデル（BIACORE（登録商標）評価ソフトウェアバージョン3.2）を用いて、会合および解離のセンサーグラムを同時にフィッティングすることによって計算される。平衡解離定数 (Kd) は、koff/kon比として計算される。例えば、Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999) を参照のこと。上記の表面プラズモン共鳴アッセイによってオン速度が106M-1s-1を超える場合、オン速度は、分光計（例えばストップフロー式分光光度計 (Aviv Instruments) または撹拌キュベットを用いる8000シリーズのSLM-AMINCO（商標）分光光度計 (ThermoSpectronic)）において測定される、漸増濃度の抗原の存在下でのPBS、pH7.2中20nMの抗抗原抗体（Fab形態）の25℃での蛍光発光強度（励起=295nm；発光=340nm、バンドパス16nm）の増加または減少を測定する蛍光消光技術を用いることによって決定され得る。
抗原結合分子または抗体の親和性を測定する上記の方法に従って、当業者は、様々な抗原に対する他の抗原結合分子または抗体の親和性測定を行うことができる。
抗体
本明細書で用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、所望の抗原結合活性を示す限りは、これらに限定されるものではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）および抗体断片を含む、種々の抗体構造を包含する。
抗体のクラス
抗体の「クラス」は、抗体の重鎖に備わる定常ドメインまたは定常領域のタイプを指す。抗体には5つの主要なクラスがある：IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMである。そして、このうちいくつかはさらにサブクラス（アイソタイプ）に分けられてもよい。例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2である。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインを、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ぶ。
別段示さない限り、軽鎖定常領域中のアミノ酸残基は、本明細書ではKabatらに従ってナンバリングされ、重鎖定常領域中のアミノ酸残基のナンバリングは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されているような、EUインデックスとも呼ばれる、EUナンバリングシステムに従う。
フレームワーク
「フレームワーク」または「FR」は、超可変領域 (HVR) 残基以外の、可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのFRは、通常4つのFRドメイン：FR1、FR2、FR3、およびFR4からなる。それに応じて、HVRおよびFRの配列は、通常次の順序でVH（またはVL）に現れる：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
ヒトコンセンサスフレームワーク
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンVLまたはVHフレームワーク配列の選択群において最も共通して生じるアミノ酸残基を示すフレームワークである。通常、ヒト免疫グロブリンVLまたはVH配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからである。通常、配列のサブグループは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3におけるサブグループである。1つの態様において、VLについて、サブグループは上記のKabatらによるサブグループκIである。1つの態様において、VHについて、サブグループは上記のKabatらによるサブグループIIIである。
キメラ抗体
用語「キメラ」抗体は、重鎖および／または軽鎖の一部分が特定の供給源または種に由来する一方で、重鎖および／または軽鎖の残りの部分が異なった供給源または種に由来する抗体を指す。同様に、用語「キメラ抗体可変ドメイン」は、重鎖および／または軽鎖可変領域の一部分が特定の供給源または種に由来する一方で、重鎖および／または軽鎖可変領域の残りの部分が異なった供給源または種に由来する抗体可変領域を指す。
ヒト化抗体
「ヒト化」抗体は、非ヒトHVRからのアミノ酸残基およびヒトFRからのアミノ酸残基を含む、キメラ抗体を指す。ある態様では、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、当該可変領域においては、すべてのもしくは実質的にすべてのHVR（例えばCDR）は非ヒト抗体のものに対応し、かつ、すべてのもしくは実質的にすべてのFRはヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含んでもよい。抗体（例えば、非ヒト抗体）の「ヒト化された形態」は、ヒト化を経た抗体を指す。「ヒト化抗体可変領域」は、ヒト化抗体の可変領域を指す。
ヒト抗体
「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞によって産生された抗体またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コード配列を用いる非ヒト供給源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を備える抗体である。このヒト抗体の定義は、非ヒトの抗原結合残基を含むヒト化抗体を、明確に除外するものである。「ヒト抗体可変領域」は、ヒト抗体の可変領域を指す。
ポリヌクレオチド（核酸）
本明細書で相互に交換可能に使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、DNAおよびRNAを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは塩基、および／またはそれらのアナログ、またはDNAもしくはRNAポリメラーゼによってまたは合成反応によってポリマーに組み込まれ得る任意の物質であり得る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびそれらのアナログなどの修飾ヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチドの配列に、非ヌクレオチド成分が割り込んでいてもよい。ポリヌクレオチドは、標識へのコンジュゲーションなどの、合成後になされる修飾を含み得る。他のタイプの修飾は、例えば、「キャップ」、1つまたは複数の天然に存在するヌクレオチドとアナログとの置換、ヌクレオチド間修飾、例えば、非荷電連結（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミド酸、カルバメート等）および荷電連結（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）を伴うもの、例えばタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ-L-リジン等）などのペンダント部分を含むもの、インターカレート剤（例えば、アクリジン、ソラレン等）を伴うもの、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属等）を含むもの、アルキル化剤を含むもの、修飾連結（例えば、アルファアノマー核酸等）や非修飾形態のポリヌクレオチドを伴うものを含む。さらに、通常糖に存在する任意のヒドロキシル基は、例えば、ホスホネート基、ホスフェート基によって置き換えられ得、標準的な保護基によって保護され得、もしくはさらなるヌクレオチドへのさらなる連結を生成するよう活性化され得、または固体もしくは半固体支持体にコンジュゲートされ得る。5’および3’末端のOHは、リン酸化またはアミンもしくは1〜20炭素原子の有機キャップ基部分で置換され得る。他のヒドロキシルもまた、標準的な保護基に誘導体化され得る。ポリヌクレオチドはまた、例えば以下のものを含む、当技術分野で一般に公知となっているリボースまたはデオキシリボース糖の類似形態を含み得る：2'-O-メチル-、2'-O-アリル-、2'-フルオロ-、または2'-アジド-リボース、炭素環式糖アナログ、α-アノマー糖、アラビノースまたはキシロースまたはリキソースなどのエピマー糖、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式アナログ、およびメチルリボシドなどの塩基性ヌクレオシドアナログ。1つまたは複数のホスホジエステル結合は、代替の連結基によって置き換えられ得る。これらの代替の連結基は、これらに限定されるものではないが、ホスフェートが以下のものによって置き換えられている態様を含む：P(O)S（「チオエート」）、P(S)S（「ジチオエート」）、(O)NR2（「アミデート」）、P(O)R、P(O)OR'、CO、またはCH2（「ホルムアセタール」）、ここで、各RまたはR'は独立してH、または、任意でエーテル（-O-）連結、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、もしくはアラルジルを含む置換もしくは非置換アルキル（1〜20C）である。ポリヌクレオチド中のすべての連結が同一である必要はない。上記の説明は、RNAおよびDNAを含む本明細書で言及されるすべてのポリヌクレオチドに適用される。
単離された（核酸）
「単離された」核酸分子は、そのもともとの環境の成分から分離されたものを指す。単離された核酸分子はさらに、その核酸分子を通常含む細胞の中に含まれた核酸分子を含むが、その核酸分子は染色体外に存在しているかまたは本来の染色体上の位置とは異なる染色体上の位置に存在している。
ベクター
本明細書で用いられる用語「ベクター」は、それが連結されたもう1つの核酸を増やすことができる、核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、および、それが導入された宿主細胞のゲノム中に組み入れられるベクターを含む。あるベクターは、自身が動作的に連結された核酸の、発現をもたらすことができる。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」とも称される。ベクターは、ウイルスまたはエレクトロポレーションを用いて宿主細胞に導入することができる。しかしながら、ベクターの導入は、in vitroでの方法に限定されない。例えば、ベクターは、インビボでの方法を用いて対象に直接導入することもできる。
宿主細胞
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養物」は、相互に交換可能に用いられ、外来核酸を導入された細胞（そのような細胞の子孫を含む）を指す。宿主細胞は「形質転換体」および「形質転換細胞」を含み、これには初代の形質転換細胞および継代数によらずその細胞に由来する子孫を含む。子孫は、親細胞と核酸の内容において完全に同一でなくてもよく、変異を含んでいてもよい。オリジナルの形質転換細胞がスクリーニングされたまたは選択された際に用いられたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異体子孫も、本明細書では含まれる。
特異性
「特異的」とは、1つまたは複数の結合パートナーに特異的に結合する分子が、該パートナー以外の分子に対して何ら有意な結合を示さないことを意味する。さらに、「特異的」はまた、抗原結合部位が、抗原中に含まれる複数のエピトープのうちの特定のエピトープに特異的である場合にも用いられる。抗原結合分子が抗原に特異的に結合する場合、それは「抗原結合分子が、抗原に／抗原に対して特異性を有する／示す」とも記載される。抗原結合部位が結合するエピトープが複数の異なる抗原中に含まれる場合、該抗原結合部位を含む抗原結合分子は、該エピトープを有する様々な抗原に結合し得る。
抗体断片
「抗体断片」は、完全抗体が結合する抗原に結合する当該完全抗体の一部分を含む、当該完全抗体以外の分子を指す。抗体断片の例は、これらに限定されるものではないが、Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2、ダイアボディ、線状抗体、単鎖抗体分子（例えば、scFv）、およびシングルドメイン抗体を含む。特定の抗体断片についての総説として、Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003) を参照のこと。scFv断片の総説として、例えば、Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994)；加えて、WO93/16185；ならびに米国特許第5,571,894号および第5,587,458号を参照のこと。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含みin vivoにおける半減期の長くなったFabおよびF(ab')2断片についての論説として、米国特許第5,869,046号を参照のこと。ダイアボディは、二価または二重特異的であってよい、抗原結合部位を2つ伴う抗体断片である。例えば、EP404,097; WO1993/01161; Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003); Hollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993) 参照。トリアボディ (triabody) やテトラボディ (tetrabody) も、Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003) に記載されている。シングルドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインのすべてもしくは一部分、または軽鎖可変ドメインのすべてもしくは一部分を含む、抗体断片である。特定の態様において、シングルドメイン抗体は、ヒトシングルドメイン抗体である（Domantis, Inc., Waltham, MA；例えば、米国特許第6,248,516号B1参照）。抗体断片は、これらに限定されるものではないが、本明細書に記載の、完全抗体のタンパク質分解的消化、組換え宿主細胞（例えば、大腸菌またはファージ）による産生を含む、種々の手法により作ることができる。
可変断片（Fv）
本明細書において、用語「可変断片（Fv）」は、抗体の軽鎖可変領域（VL）と抗体の重鎖可変領域（VH）とのペアから構成される抗体由来の抗原結合部位の最小単位を指す。1988年にSkerraとPluckthunは、細菌のシグナル配列の下流に抗体遺伝子を挿入し大腸菌中で当該遺伝子の発現を誘導することによって、均一でかつ活性な抗体が大腸菌のペリプラズム画分から調製され得ることを見出した（Science (1988) 240 (4855), 1038-1041）。ペリプラズム画分から調製されたFvにおいては、抗原に結合するような様式でVHとVLが会合している。
scFv、単鎖抗体、およびsc(Fv) 2
本明細書において、用語「scFv」、「単鎖抗体」、および「sc(Fv)2」はいずれも、重鎖および軽鎖に由来する可変領域を含むが、定常領域を含まない、単一ポリペプチド鎖の抗体断片を指す。一般に、単鎖抗体は、抗原結合を可能にすると思われる所望の構造の形成を可能にする、VHドメインとVLドメインの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。単鎖抗体は、「The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore, eds., Springer-Verlag, New York, 269-315 (1994)」においてPluckthunによって詳細に考察されている。同様に、国際公開公報WO1988/001649、米国特許第4,946,778号および同第5,260,203号を参照のこと。特定の態様において、単鎖抗体は、二重特異性でありかつ／またはヒト化され得る。
scFvはFvを形成するVHとVLとがペプチドリンカーによって共に連結された単鎖低分子量抗体である（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85 (16), 5879-5883）。当該ペプチドリンカーによってVHとVLとが近接した状態に保持され得る。
sc(Fv)2は、2つのVLと2つのVHの4つの可変領域がペプチドリンカー等のリンカーによって連結され一本鎖を形成する単鎖抗体である（J Immunol. Methods (1999) 231 (1-2), 177-189）。この2つのVHと2つのVLは異なるモノクローナル抗体に由来してもよい。そのようなsc(Fv)2としては、例えば、Journal of Immunology (1994) 152 (11), 5368-5374に開示されるような、単一抗原中に存在する2つのエピトープを認識する二重特異性sc(Fv)2が好適に挙げられる。sc(Fv)2は、当業者に公知の方法によって製造され得る。例えば、sc(Fv)2は、scFvをペプチドリンカー等のリンカーで連結することによって製造され得る。
本明細書において、sc(Fv)2は、一本鎖ポリペプチドのN末端を基点としてVH、VL、VH、VL（［VH］-リンカー-［VL］-リンカー-［VH］-リンカー-［VL］）の順に並んでいる2つのVH単位および2つのVL単位を含む。2つのVH単位と2つのVL単位の順序は上記の構成に限定されず、どのような順序で並べられていてもよい。構成の例を以下に列挙する。
［VL］-リンカー-［VH］-リンカー-［VH］-リンカー-［VL］
［VH］-リンカー-［VL］-リンカー-［VL］-リンカー-［VH］
［VH］-リンカー-［VH］-リンカー-［VL］-リンカー-［VL］
［VL］-リンカー-［VL］-リンカー-［VH］-リンカー-［VH］
［VL］-リンカー-［VH］-リンカー-［VL］-リンカー-［VH］
sc(Fv)2の分子形態についてはWO2006/132352においても詳細に記載されている。当業者であればこれらの記載に従って、本明細書で開示されるポリペプチド複合体を製造するために所望のsc(Fv)2を適宜調製することが可能である。
さらに本開示の抗原結合分子または抗体に、PEG等の担体高分子や抗がん剤等の有機化合物をコンジュゲートしてもよい。あるいは、糖鎖が所望の効果をもたらすように、糖鎖付加配列が抗原結合分子または抗体に好適に挿入される。
抗体の可変領域の連結に使用するリンカーは、遺伝子工学により導入され得る任意のペプチドリンカー、合成リンカー、および例えばProtein Engineering, 9 (3), 299-305, 1996に開示されるリンカーを含む。しかしながら、本開示においてはペプチドリンカーが好ましい。ペプチドリンカーの長さは特に限定されず、目的に応じて当業者が適宜選択することが可能である。長さは、好ましくは5アミノ酸以上（特に限定されないが、上限は通常、30アミノ酸以下、好ましくは20アミノ酸以下）であり、特に好ましくは15アミノ酸である。sc(Fv)2に3つのペプチドリンカーが含まれる場合には、それらの長さはすべて同じであってもよいし異なってもよい。
例えば、そのようなペプチドリンカーには以下のものが含まれる：
Ser、
Gly-Ser、
Gly-Gly-Ser、
Ser-Gly-Gly、
Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号：171）、
Ser-Gly-Gly-Gly（配列番号：172）、
Gly-Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号：173）、
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly（配列番号：174）、
Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号：175）、
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly（配列番号：176）、
Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号：177）、
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly（配列番号：178）、
(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号：173）)n、および
(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly（配列番号：174）)n。
ここでnは1以上の整数である。ペプチドリンカーの長さや配列は目的に応じて当業者が適宜選択することができる。
合成リンカー（化学架橋剤）は、ペプチドの架橋に通常用いられており、例としては、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）、ジスクシンイミジルスベレート（DSS）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（BS3）、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（DSP）、ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（DTSSP）、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（EGS）、エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）（スルホ−EGS）、ジスクシンイミジル酒石酸塩（DST）、ジスルホスクシンイミジル酒石酸塩（スルホ−DST）、ビス［2-（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（BSOCOES）、およびビス［2-（スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（スルホ-BSOCOES）が挙げられる。これらの架橋剤は市販されている。
4つの抗体可変領域を連結するには、通常、3つのリンカーが必要となる。用いられるリンカーは、同じ種類のものであっても異なる種類のものであってもよい。
Fab、F(ab') 2 、およびFab'
「Fab」は、1本の軽鎖、ならびに1本の重鎖のCH1ドメインおよび可変領域からなる。Fab分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成できない。
「F(ab')2」または「Fab」は、免疫グロブリン（モノクローナル抗体）をペプシンおよびパパイン等のプロテアーゼで処理することにより製造され、免疫グロブリン（モノクローナル抗体）を2本の各H鎖のヒンジ領域間に存在するジスルフィド結合の近くで消化することによって生成される抗体断片を指す。例えばパパインは、IgGを、2本の各H鎖のヒンジ領域間に存在するジスルフィド結合の上流で切断し、VL（L鎖可変領域）およびCL（L鎖定常領域）を含むL鎖がVH（H鎖可変領域）およびCHγ1（H鎖定常領域中のγ1領域）を含むH鎖断片とそれらのC末端領域でジスルフィド結合により連結されている、相同な2つの抗体断片を生成する。これら2つの相同な抗体断片はそれぞれFab'と呼ばれる。
「F(ab')2」は、2本の軽鎖、ならびにジスルフィド結合が2本の重鎖間で形成されるようにCH1ドメインおよびCH2ドメインの一部分の定常領域を含む2本の重鎖からなる。本明細書において開示されるF(ab')2は、次のように好適に製造され得る。所望の抗原結合部位を含むモノクローナル全部抗体等を、ペプシン等のプロテアーゼで部分消化し、Fc断片をプロテインAカラムに吸着させることにより除去する。プロテアーゼは、pH等の適切な設定酵素反応条件下で選択的にF(ab')2をもたらすように全部抗体を切断し得るものである限り、特に限定はされない。例えば、そのようなプロテアーゼにはペプシンおよびフィシンが含まれる。
Fc領域
本発明において、用語「Fc領域」または「Fcドメイン」は、抗体分子中の、ヒンジまたはその一部、ならびにCH2およびCH3ドメインからなる断片を含む領域を指す。IgGクラスのFc領域は、例えば、システイン226（EU ナンバリング（本明細書においてEUインデックスとも称される））からC末端まで、またはプロリン230（EUナンバリング）からC末端までの領域を意味するが、それに限定されない。Fc領域は、好ましくは、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4モノクローナル抗体を、ペプシンなどのタンパク質分解酵素で部分消化した後に、プロテインAカラムまたはプロテインGカラムに吸着された画分を再溶出することによって取得することができる。そのようなタンパク質分解酵素は、適宜設定される酵素の反応条件（例えば、pH）の下で制限的にFabまたはF(ab')2を形成するように全長抗体を消化することができる限り、特に限定されない。その例には、ペプシンおよびパパインが含まれ得る。
本発明において、例えば、天然型IgGに由来するFc領域を、本開示の「Fc領域」として用いることができる。ここで、天然型IgGとは、天然に見出されるIgGと同一のアミノ酸配列を含有し、免疫グロブリンγ遺伝子により実質的にコードされる抗体のクラスに属するポリペプチドを意味する。天然型ヒトIgGとは、例えば、天然型ヒトIgG1、天然型ヒトIgG2、天然型ヒトIgG3、または天然型ヒトIgG4を意味する。天然型IgGにはまた、自然発生的にそれに由来するバリアントなども含まれる。遺伝子多型に基づく複数のアロタイプ配列が、ヒトIgG1、ヒトIgG2、ヒトIgG3、およびヒトIgG4抗体の定常領域としてSequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242に記載されており、それらはいずれも、本開示において用いることができる。特に、ヒトIgG1の配列は、EUナンバリング356〜358位のアミノ酸配列として、DELまたはEEMを有してもよい。
いくつかの態様において、多重特異性抗原結合分子のFcドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含むポリペプチド鎖の対からなる。例えば、免疫グロブリンG（IgG）分子のFcドメインは、その各サブユニットがCH2およびCH3 IgG重鎖定常ドメインを含む、二量体である。Fcドメインの2つのサブユニットは、相互に安定的に会合することができる。1つの態様において、本明細書において記載される多重特異性抗原結合分子は、1つ以下のFcドメインを含む。
本明細書において記載される1つの態様において、多重特異性抗原結合分子のFcドメインはIgG Fcドメインである。特定の態様において、FcドメインはIgG1 Fcドメインである。別の態様において、FcドメインはIgG1 Fcドメインである。さらなる特定の態様において、FcドメインはヒトIgG1 Fc領域である。
1つの局面において、本開示は、
（iii）天然型ヒトIgG1 Fcドメインと比較して、ヒトFcγ受容体に対する低下した結合親和性を示すFcドメイン
をさらに含む多重特異性抗原結合分子であって、該Fcドメインが、安定に会合することができる第1のFc領域サブユニットおよび第2のFc領域サブユニットで構成される、多重特異性抗原結合分子を提供する。
1つの局面において、本開示は、
（iii）天然型ヒトIgG1 Fcドメインと比較して、ヒトFcγ受容体に対する低下した結合親和性を示すFcドメイン
をさらに含む多重特異性抗原結合分子であって、該Fcドメインが、以下の（e1）または（e2）：
（e1）349位にCys、366位にSer、368位にAla、および407位にValを含む、第1のFc領域サブユニット、ならびに354位にCysおよび366位にTrpを含む第2のFc領域；
（e2）439位にGluを含む第1のFc領域サブユニット、および356位にLysを含む第2のFc領域
を含み、該アミノ酸位置が、EUインデックスによりナンバリングされる、多重特異性抗原結合分子を提供する。
1つの局面において、本開示は、
（iii）天然型ヒトIgG1 Fcドメインと比較して、ヒトFcγ受容体に対する低下した結合親和性を示すFcドメイン
をさらに含む多重特異性抗原結合分子であって、該Fcドメインに含まれる第1および/または第2のFc領域サブユニットが、以下の（f1）または（f2）：
（f1）234位にAlaおよび235位にAla；
（f2）234位にAla、235位にAla、および297位にAla
を含み、該アミノ酸位置が、EUインデックスによりナンバリングされる、多重特異性抗原結合分子を提供する。
1つの局面において、本開示は、
（iii）天然型ヒトIgG1 Fcドメインと比較して、ヒトFcγ受容体に対する低下した結合親和性を示すFcドメイン
をさらに含む多重特異性抗原結合分子であって、該Fcドメインが、天然型ヒトIgG1 Fcドメインと比較して、ヒトFcRnに対するより強力なFcRn結合親和性をさらに示す、多重特異性抗原結合分子を提供する。
1つの局面において、本開示は、
（iii）天然型ヒトIgG1 Fcドメインと比較して、ヒトFcγ受容体に対する低下した結合親和性を示すFcドメイン
をさらに含む多重特異性抗原結合分子であって、該Fcドメインに含まれる第1および/または第2のFc領域サブユニットが、428位にLeu、434位にAla、438位にArg、および440位にGluを含み、該アミノ酸位置が、EUインデックスによりナンバリングされる、多重特異性抗原結合分子を提供する。
低下したFc受容体（Fcγ受容体）結合活性を有するFc領域
特定の態様において、本明細書において記載される多重特異性抗原結合分子のFcドメインは、天然型IgG1 Fcドメインと比較して、Fc受容体に対する低下した結合親和性を示す。1つのそのような態様において、Fcドメイン（または該Fcドメインを含む多重特異性抗原結合分子）は、天然型IgG1 Fcドメイン（または天然型IgG1 Fcドメインを含む多重特異性抗原結合分子）と比較して、50％未満、好ましくは20％未満、より好ましくは10％未満、および最も好ましくは5％未満のFc受容体に対する結合親和性を示す。1つの態様において、Fcドメイン（または該Fcドメインを含む多重特異性抗原結合分子）は、Fc受容体に実質的に結合しない。特定の態様において、Fc受容体はFcγ受容体である。1つの態様において、Fc受容体はヒトFc受容体である。1つの態様において、Fc受容体は活性化Fc受容体である。特定の態様において、Fc受容体は、活性化ヒトFcγ受容体、より具体的にはヒトFcγ RIIIa、Fcγ RI、またはFcγ RIIa、最も具体的にはヒトFcγ RIIIaである。
特定の態様において、多重特異性抗原結合分子のFcドメインは、Fc受容体に対するFcドメインの結合親和性を低下させる1つまたは複数のアミノ酸変異を含む。典型的には、同じ1つまたは複数のアミノ酸変異が、Fcドメインの2つのサブユニットの各々に存在する。1つの態様において、アミノ酸変異は、Fc受容体に対するFcドメインの結合親和性を低下させる。1つの態様において、アミノ酸変異は、Fc受容体に対するFcドメインの結合親和性を少なくとも2分の1、少なくとも5分の1、または少なくとも10分の1に低下させる。Fc受容体に対するFcドメインの結合親和性を低下させる2つ以上のアミノ酸変異が存在する態様において、これらのアミノ酸変異の組み合わせは、Fc受容体に対するFcドメインの結合親和性を少なくとも10分の1、少なくとも20分の1、またはさらには少なくとも50分の1に低下させ得る。1つの態様において、エンジニアリングされたFcドメインを含む多重特異性抗原結合分子は、エンジニアリングされていないFcドメインを含む多重特異性抗原結合分子と比較して、20％未満、具体的には10％未満、より具体的には5％未満のFc受容体に対する結合親和性を示す。特定の態様において、Fc受容体はFcγ受容体である。いくつかの態様において、Fc受容体はヒトFc受容体である。いくつかの態様において、Fc受容体は活性化Fc受容体である。特定の態様において、Fc受容体は活性化ヒトFcγ受容体、より具体的にはヒトFcγ RIIIa、Fcγ RI、または Fcγ RIIa、最も具体的にはヒトFcγ RIIIaである。好ましくは、これらの受容体の各々に対する結合が低下する。
1つの態様において、Fc受容体に対するFcドメインの結合親和性を低下させるアミノ酸変異はアミノ酸置換である。1つの態様において、Fcドメインは、E233、L234、L235、N297、P331、およびP329の群より選択される位置でのアミノ酸置換を含む。より特定の態様において、Fcドメインは、L234、L235、およびP329の群より選択される位置でのアミノ酸置換を含む。いくつかの態様において、Fcドメインはアミノ酸置換L234AおよびL235Aを含む。1つのそのような態様において、Fcドメインは、IgG1 Fcドメイン、特にヒトIgG1 Fcドメインである。1つの態様において、Fcドメインは、P329位でのアミノ酸置換を含む。より特定の態様において、アミノ酸置換は、P329AまたはP329G、特にP329Gである。1つの態様において、Fcドメインは、P329位でのアミノ酸置換、およびE233、L234、L235、N297、およびP331から選択される位置でのさらなるアミノ酸置換を含む。より特定の態様において、さらなるアミノ酸置換は、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D、またはP331Sである。特定の態様において、Fcドメインは、P329位、L234位、およびL235位でのアミノ酸置換を含む。より特定の態様において、Fcドメインは、アミノ酸変異L234A、L235A、およびP329G（「P329G LALA」）を含む。1つのそのような態様において、Fcドメインは、IgG1 Fcドメイン、特にヒトIgG1 Fcドメインである。アミノ酸置換の「P329G LALA」の組み合わせは、PCT公報番号WO2012/130831に記載されているように、ヒトIgG1 FcドメインのFcγ受容体（ならびに補体）結合をほぼ完全に消失させる。WO2012/130831はまた、そのような変異Fcドメインを調製する方法、およびFc受容体結合またはエフェクター機能などのその特性を判定するための方法も記載している。
IgG4抗体は、IgG1抗体と比較して、Fc受容体に対する低下した結合親和性および低下したエフェクター機能を示す。したがって、いくつかの態様において、本明細書において記載されるT細胞を活性化する二重特異性抗原結合分子のFcドメインは、IgG4 Fcドメイン、特にヒトIgG4 Fcドメインである。1つの態様において、IgG4 Fcドメインは、S228位でのアミノ酸置換、特にアミノ酸置換S228Pを含む。Fc受容体に対するその結合親和性および/またはそのエフェクター機能をさらに低下させるために、1つの態様において、IgG4 Fcドメインは、L235位でのアミノ酸置換、特にアミノ酸置換L235Eを含む。別の態様において、IgG4 Fcドメインは、P329位でのアミノ酸置換、特にアミノ酸置換P329Gを含む。特定の態様において、IgG4 Fcドメインは、S228位、L235位、およびP329位でのアミノ酸置換、特にアミノ酸置換S228P、L235E、およびP329Gを含む。そのようなIgG4 Fcドメイン変異体およびそれらのFcγ受容体結合特性は、PCT公報番号WO2012/130831に記載されている。
特定の態様において、FcドメインのN-グリコシル化は除去されている。1つのそのような態様において、Fcドメインは、N297位でのアミノ酸変異、特に、アスパラギンをアラニン（N297A）またはアスパラギン酸（N297D）によって置換するアミノ酸置換を含む。
特に好ましい態様において、天然型IgG1 Fcドメインと比較して、Fc受容体に対する低下した結合親和性を示すFcドメインは、アミノ酸置換L234A、L235A、およびN297Aを含むヒトIgG1 Fcドメインである。
変異体Fcドメインは、当技術分野において周知の遺伝学的方法または化学的方法を用いて、アミノ酸の欠失、置換、挿入、または改変によって調製することができる。遺伝学的方法には、コードDNA配列の部位特異的変異誘発、PCR、および遺伝子合成等が含まれ得る。正確なヌクレオチドの変化は、例えば配列決定によって検証することができる。
Fc受容体への結合は、例えば、ELISAによって、またはBIAcore機器（GE Healthcare）などの標準的な機器装置を用いる表面プラズモン共鳴（SPR）によって容易に決定することができ、Fc受容体等は、組換え発現によって得られてもよい。適切なそのような結合アッセイが本明細書において記載される。あるいは、Fc受容体に対するFcドメインの結合親和性またはFcドメインを含む細胞活性化二重特異性抗原結合分子の結合親和性は、特定のFc受容体を発現することが公知の細胞株、例えばFcγ IIIa受容体を発現するヒトNK細胞を用いて評価され得る。
Fc受容体
用語「Fc受容体」または「FcR」は、抗体のFc領域に結合する受容体を指す。いくつかの態様において、FcRは、天然型ヒトFcRである。いくつかの態様において、FcRは、IgG抗体に結合するもの（ガンマ受容体）であり、FcγRI、FcγRII、およびFcγRIIIサブクラスの受容体を、これらの受容体の対立遺伝子バリアントおよび選択的スプライシングによる形態を含めて、含む。FcγRII受容体は、FcγRIIA（「活性化受容体」）およびFcγRIIB（「阻害受容体」）を含み、これらは主としてその細胞質ドメインにおいて相違する類似のアミノ酸配列を有する。活性化受容体FcγRIIAは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシン活性化モチーフ (immunoreceptor tyrosine-based activation motif: ITAM) を含む。阻害受容体FcγRIIBは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシン阻害モチーフ（immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif: ITIM）を含む。（例えば、Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997) を参照のこと。）FcRは、例えば、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)；Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994)；およびde Haas et al., J. Lab. Clin. Med 126:330-41 (1995)において総説されている。将来同定されるものを含む他のFcRも、本明細書の用語「FcR」に包含される。
用語「Fc受容体」または「FcR」はまた、母体のIgGの胎児への移動（Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)およびKim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)）ならびに免疫グロブリンのホメオスタシスの調節を担う、新生児型受容体FcRnを含む。FcRnへの結合を測定する方法は公知である（例えば、Ghetie and Ward., Immunol. Today 18(12):592-598 (1997); Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997); Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004); WO2004/92219 (Hinton et al.)を参照のこと）。
in vivoでのヒトFcRnへの結合およびヒトFcRn高親和性結合ポリペプチドの血漿半減期は、例えばヒトFcRnを発現するトランスジェニックマウスもしくはトランスフェクトされたヒト細胞株においてまたはバリアントFc領域を伴うポリペプチドが投与される霊長類において測定され得る。WO2000/42072 (Presta) は、FcRに対する結合が増加したまたは減少した抗体バリアントを記載している。例えば、Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001) も参照のこと。
Fcγ受容体
Fcγ受容体は、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4モノクローナル抗体のFcドメインに結合し得る受容体を指し、これにはFcγ受容体遺伝子によって実質的にコードされるタンパク質のファミリーに属するすべてのメンバーが含まれる。ヒトにおいて、このファミリーには、アイソフォームFcγRIa、FcγRIb、およびFcγRIcを含むFcγRI (CD64)；アイソフォームFcγRIIa（アロタイプH131およびR131を含む）、FcγRIIb（FcγRIIb-1およびFcγRIIb-2を含む）、およびFcγRIIcを含むFcγRII (CD32)；ならびにアイソフォームFcγRIIIa（アロタイプV158およびF158を含む）およびFcγRIIIb（アロタイプFcγRIIIb-NA1およびFcγRIIIb-NA2を含む）を含むFcγRIII (CD16)；ならびに未同定のヒトFcγ受容体、Fcγ受容体アイソフォーム、およびそれらのアロタイプのすべてが含まれる。しかしながら、Fcγ受容体はこれらの例に限定されない。Fcγ受容体には、これらに限定されないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびサルに由来するものが含まれる。Fcγ受容体は任意の生物に由来してよい。マウスFcγ受容体には、これらに限定されないが、FcγRI (CD64)、FcγRII (CD32)、FcγRIII (CD16)、およびFcγRIII-2 (CD16-2)、ならびに未同定のマウスFcγ受容体、Fcγ受容体アイソフォーム、およびそれらのアロタイプのすべてが含まれる。そのような好ましいFcγ受容体には、例えば、ヒトFcγRI (CD64)、FcγRIIA (CD32)、FcγRIIB (CD32)、FcγRIIIA (CD16)、および／またはFcγRIIIB (CD16) が含まれる。FcγRIのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれRefSeq登録番号NM_000566.3およびRefSeq登録番号NP_000557.1に示され；FcγRIIAのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれRefSeq登録番号BC020823.1およびRefSeq登録番号AAH20823.1に示され；FcγRIIBのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれRefSeq登録番号BC146678.1およびRefSeq登録番号AAI46679.1に示され；FcγRIIIAのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれRefSeq登録番号BC033678.1およびRefSeq登録番号AAH33678.1に示され；ならびにFcγRIIIBのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれRefSeq登録番号BC128562.1およびRefSeq登録番号AAI28563.1に示される。Fcγ受容体がIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4モノクローナル抗体のFcドメインに対する結合活性を有するかどうかは、上記のFACSおよびELISAフォーマットに加えて、ALPHAスクリーン（増幅発光近接ホモジニアスアッセイ）、表面プラズモン共鳴 (SPR) ベースのBIACORE法、およびその他によって評価することができる (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010)。
その一方で、「Fcリガンド」または「エフェクターリガンド」は、抗体Fcドメインに結合してFc/Fcリガンド複合体を形成する分子、および好ましくはポリペプチドを指す。該分子は任意の生物に由来してよい。FcリガンドのFcへの結合は、好ましくは1つまたは複数のエフェクター機能を誘導する。そのようなFcリガンドには、Fc受容体、Fcγ受容体、Fcα受容体、Fcβ受容体、FcRn、C1q、およびC3、マンナン結合レクチン、マンノース受容体、スタフィロコッカス（Staphylococcus）プロテインA、スタフィロコッカスプロテインG、ならびにウイルスFcγ受容体が含まれるが、これらに限定されない。Fcリガンドには、Fcγ受容体と相同なFc受容体のファミリーであるFc受容体相同体 (FcRH) (Davis et al., (2002) Immunological Reviews 190, 123-136) もまた含まれる。Fcリガンドには、Fcに結合する未同定の分子もまた含まれる。
Fcγ受容体結合活性
FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA、および／またはFcγRIIIBのいずれかのFcγ受容体に対するFcドメインの結合活性が損なわれていることは、上記のFACSおよびELISAフォーマット、ならびにALPHAスクリーン（増幅発光近接ホモジニアスアッセイ）および表面プラズモン共鳴 (SPR) ベースのBIACORE法を用いることによって評価することができる (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010)。
ALPHAスクリーンは、2種類のビーズ：ドナービーズおよびアクセプタービーズを用いる、下記の原理に基づいたALPHA技術によって実施される。ドナービーズに連結された分子がアクセプタービーズに連結された分子と生物学的に相互作用し、かつ2つのビーズが近接して位置する場合にのみ、発光シグナルが検出される。ドナービーズ内の光増感剤は、レーザー光によって励起されて、ビーズ周辺の酸素を励起状態の一重項酸素に変換する。一重項酸素がドナービーズ周辺に拡散し、近接して位置するアクセプタービーズに到達すると、アクセプタービーズ内の化学発光反応が誘導される。この反応によって最終的に光が放出される。ドナービーズに連結された分子がアクセプタービーズに連結された分子と相互作用しないのであれば、ドナービーズによって生成される一重項酸素はアクセプタービーズに到達せず、化学発光反応は起こらない。
例えば、ビオチン標識された抗原結合分子または抗体をドナービーズに固定化し、グルタチオンSトランスフェラーゼ (GST) でタグ付けされたFcγ受容体をアクセプタービーズに固定化する。競合的変異Fcドメインを含む抗原結合分子または抗体の非存在下では、Fcγ受容体は、野生型Fcドメインを含む抗原結合分子または抗体と相互作用し、結果として520〜620 nmのシグナルを誘導する。タグ付けされていない変異Fcドメインを有する抗原結合分子または抗体は、野生型Fcドメインを含む抗原結合分子または抗体と、Fcγ受容体との相互作用に関して競合する。競合の結果としての蛍光の減少を定量化することによって、相対的結合親和性を決定することができる。Sulfo-NHS-ビオチンなどを用いて抗体などの抗原結合分子または抗体をビオチン化する方法は公知である。GSTタグをFcγ受容体に付加するための適切な方法には、Fcγ受容体をコードするポリペプチドとGSTをコードするポリペプチドをインフレームで融合し、該融合遺伝子を保有するベクターが導入された細胞を用いて該遺伝子を発現させ、次いでグルタチオンカラムを用いて精製することを伴う方法が含まれる。誘導されたシグナルは好ましくは、例えば、GRAPHPAD PRISM（GraphPad；San Diego）などのソフトウェアを用いて非線形回帰分析に基づく一部位競合モデルに適合させることにより、解析することができる。
相互作用を観察するための物質の一方を、リガンドとしてセンサーチップの金薄膜上に固定化する。金薄膜とガラスとの境界面で全反射が起こるようにセンサーチップの裏面から光を当てると、ある特定の部位において反射光の強度が部分的に低下する（SPRシグナル）。相互作用を観察するための他方の物質を、分析物としてセンサーチップの表面上に注入する。分析物がリガンドに結合すると、固定化リガンド分子の質量が増加する。これにより、センサーチップの表面上の溶媒の屈折率が変化する。屈折率の変化は、SPRシグナルの位置のシフトを引き起こす（逆に、解離するとシグナルは元の位置にシフトして戻る）。Biacoreシステムでは、上記のシフトの量（すなわち、センサーチップ表面上での質量の変化）を縦軸にプロットし、そのようにして経時的な質量の変化を測定データとして表示する（センサーグラム）。センサーグラムの曲線から動態パラメーター（会合速度定数 (ka) および解離速度定数 (kd)）が決定され、これら2つの定数の比率から親和性 (KD) が決定される。BIACORE法では、阻害アッセイが好ましく用いられる。そのような阻害アッセイの例は、Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103(11), 4005-4010に記載されている。
多重特異性抗原結合分子の産生および精製
いくつかの態様において、多重特異性抗原結合分子は、単離された多重特異性抗原結合分子である。
本明細書において記載される多重特異性抗原結合分子は、Fcドメインの2つのサブユニットの一方またはもう一方に融合された、2種類の異なる抗原結合部分（例えば、「第1の抗原結合部分」および「第2の抗原結合部分」）を含み、よって、Fcドメインの2つのサブユニットは典型的には、2本の同一でないポリペプチド鎖に含まれる。これらのポリペプチドの組換え同時発現および続いての二量体化は、2つのポリペプチドの複数の組み合わせの可能性をもたらす。よって、組換え産生における多重特異性抗原結合分子の収量および純度を改善するために、所望のポリペプチドの会合を促進する改変を多重特異性抗原結合分子のFcドメイン中に導入することは有利となる。
したがって、特定の態様において、本明細書において記載される多重特異性抗原結合分子のFcドメインは、Fcドメインの第1のサブユニットと第2のサブユニットの会合を促進する改変を含む。ヒトIgG Fcドメインの2つのサブユニット間での最も広範囲のタンパク質-タンパク質相互作用の部位は、FcドメインのCH3ドメイン中にある。したがって、1つの態様において、該改変はFcドメインのCH3ドメイン中にある。
特定の態様において、該改変は、Fcドメインの2つサブユニットの一方における「ノブ」改変と、Fcドメインの2つのサブユニットのもう一方における「ホール」改変とを含む、いわゆる「ノブ-イントゥ-ホール」改変である。ノブ-イントゥ-ホールテクノロジーは、例えば、米国特許第5,731,168号；米国特許第7,695,936号；Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996)；およびCarter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)に記載されている。一般に、方法は、突起（「ノブ」）が空隙（「ホール」）中に位置し、ヘテロ二量体の形成を促進しかつホモ二量体の形成を妨げることができるように、突起を第1のポリペプチドの界面に、および対応する空隙を第2のポリペプチドの界面に導入する段階を伴う。突起は、第1のポリペプチドの界面の小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置き換えることによって構築される。突起と同じまたは同様のサイズの補償的な空隙は、大きなアミノ酸側鎖をより小さなもの（例えば、アラニンまたはスレオニン）で置き換えることによって第2のポリペプチドの界面に作出される。
したがって、特定の態様においては、多重特異性抗原結合分子のFcドメインの第1のサブユニットのCH3ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それによって、第2のサブユニットのCH3ドメイン内の空隙中に位置することができる第1のサブユニットのCH3ドメイン内の突起が生成され、Fcドメインの第2のサブユニットのCH3ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それによって、第1のサブユニットのCH3ドメイン内の突起が位置することができる第2のサブユニットのCH3ドメイン内の空隙が生成される。
突起および空隙は、ポリペプチドをコードする核酸を例えば部位特異的変異誘発によって変更することによって、またはペプチド合成によって、作ることができる。
特定の態様において、Fcドメインの第1のサブユニットのCH3ドメインにおいて、366位のスレオニン残基は、トリプトファン残基で置き換えられ（T366W）、Fcドメインの第2のサブユニットのCH3ドメインにおいて、407位のチロシン残基は、バリン残基で置き換えられる（Y407V）。1つの態様において、Fcドメインの第2のサブユニットにおいて、さらに、366位のスレオニン残基は、セリン残基で置き換えられ（T366S）、368位のロイシン残基は、アラニン残基で置き換えられる（L368A）。
なおさらなる態様において、Fcドメインの第1のサブユニットにおいて、さらに、354位のセリン残基は、システイン残基で置き換えられ（S354C）、Fcドメインの第2のサブユニットにおいて、さらに、349位のチロシン残基は、システイン残基によって置き換えられる（Y349C）。これらの2つのシステイン残基の導入は、Fcドメインの2つのサブユニット間にジスルフィド架橋の形成をもたらし、二量体をさらに安定化する（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)）。
他の態様において、本開示の多重特異性抗原結合分子には、所望の組合せを有するH鎖間およびL鎖H鎖間の会合を促進するための他の技術を適用することができる。
例えば、多重特異性抗体の会合には、抗体H鎖の第2の定常領域または第3の定常領域（CH2またはCH3）の界面に静電気的反発を導入することにより望ましくないH鎖会合を抑制する技術を適用することができる（WO2006/106905）。
CH2またはCH3の界面に静電気的反発を導入することにより意図しないH鎖会合を抑制する技術において、H鎖の他方の定常領域の界面で接触するアミノ酸残基の例には、CH3領域におけるEUナンバリング位置356位、439位、357位、370位、399位、および409位の残基に対応する領域が含まれる。
より具体的には、2種のH鎖CH3領域を含む抗体であって、第1のH鎖CH3領域における、以下の（1）〜（3）に示すアミノ酸残基の対から選択される1〜3対のアミノ酸残基が同種の電荷を有する抗体が、例として挙げられる：（1）H鎖CH3領域に含まれる、EUナンバリング位置356位および439位のアミノ酸残基、（2）H鎖CH3領域に含まれる、EUナンバリング位置357位および370位のアミノ酸残基、ならびに（3）H鎖CH3領域に含まれる、EUナンバリング位置399位および409位のアミノ酸残基。
さらに、該抗体は、上記第1のH鎖CH3領域とは異なる第2のH鎖CH3領域におけるアミノ酸残基の対が、前記（1）〜（3）のアミノ酸残基の対から選択され、前記第1のH鎖CH3領域において同種の電荷を有する前記（1）〜（3）のアミノ酸残基の対に対応する1〜3対のアミノ酸残基が、前記第1のH鎖CH3領域における対応するアミノ酸残基とは反対の電荷を有する抗体であってもよい。
上記（1）〜（3）に示されるそれぞれのアミノ酸残基は、会合した際に互いに接近している。当業者であれば、所望のH鎖CH3領域またはH鎖定常領域において、市販のソフトウェアを用いたホモロジーモデリング等により、上記（1）〜（3）のアミノ酸残基に対応する位置を見出すことができ、適宜、これらの位置のアミノ酸残基を改変に供することが可能である。
上記抗体において、「電荷を有するアミノ酸残基」は、例えば、以下の群のいずれか1つに含まれるアミノ酸残基から選択されることが好ましい：
(a) グルタミン酸（E）およびアスパラギン酸（D）、ならびに
(b) リジン（K）、アルギニン（R）、およびヒスチジン（H）。
上記抗体において、語句「同じ電荷を有する」とは、例えば、2つ以上のアミノ酸残基のいずれもが、上記の群(a)および(b)のうちいずれか1つに含まれるアミノ酸残基から選択されることを意味する。語句「反対の電荷を有する」とは、例えば、2つ以上のアミノ酸残基のうちの少なくとも1つのアミノ酸残基が、上記の群(a)および(b)のうちいずれか1つに含まれるアミノ酸残基から選択される場合に、残りのアミノ酸残基が他の群に含まれるアミノ酸残基から選択されることを意味する。
好ましい態様において上記抗体は、その第1のH鎖CH3領域と第2のH鎖CH3領域がジスルフィド結合により架橋されていてもよい。
本開示において、改変に供するアミノ酸残基は、上述した抗体可変領域または抗体定常領域のアミノ酸残基に限られない。当業者であれば、変異ポリペプチドまたは異種多量体において、市販のソフトウェアを用いたホモロジーモデリング等により、界面を形成するアミノ酸残基を同定することができ、次いでこれらの位置のアミノ酸残基を、会合を制御するように改変に供することが可能である。
加えて、本開示の多重特異性抗原結合分子の形成には他の公知技術を用いることもできる。抗体の一方のH鎖CH3の一部を対応するIgA由来の配列に変え、対応するIgA由来の配列を他方のH鎖CH3の相補的な部分に導入することにより生成された鎖交換エンジニアリングドメインCH3（strand-exchange engineered domain CH3）を用いて、異なる配列を有するポリペプチドの会合をCH3の相補的な会合によって効率的に誘導することができる (Protein Engineering Design & Selection, 23; 195-202, 2010)。この公知技術を用いて効率的に目的の多重特異性抗原結合分子を形成させることもできる。
加えて、多重特異性抗原結合分子の形成には、WO2011/028952、WO2014/018572およびNat Biotechnol. 2014 Feb;32(2):191-8に記載されるような抗体のCH1とCLの会合およびVHとVLの会合を利用した抗体製造技術、WO2008/119353およびWO2011/131746に記載されるような別々に調製したモノクローナル抗体を組み合わせて使用して二重特異性抗体を製造する技術(Fab Arm Exchange)、WO2012/058768およびWO2013/063702に記載されるような抗体重鎖CH3間の会合を制御する技術、WO2012/023053に記載されるような2種類の軽鎖と1種類の重鎖とから構成される多重特異性抗体を製造する技術、Christophら（Nature Biotechnology Vol. 31, p 753-758 (2013)）によって記載されるような1本のH鎖と1本のL鎖を含む抗体の片鎖をそれぞれ発現する2つの細菌細胞株を利用した多重特異性抗体を製造する技術等を用いてもよい。
あるいは、目的の多重特異性抗原結合分子を効率的に形成させることができない場合であっても、産生された分子から目的の多重特異性抗原結合分子を分離し精製することによって、本開示の多重特異性抗原結合分子を得ることが可能である。例えば、2種類のH鎖の可変領域にアミノ酸置換を導入することにより等電点の差を付与することで、2種類のホモ体と目的のヘテロ抗体をイオン交換クロマトグラフィーで精製することを可能にする方法が報告されている（WO2007114325）。ヘテロ抗体を精製する方法として、これまでに、プロテインAに結合するマウスIgG2aのH鎖とプロテインAに結合しないラットIgG2bのH鎖とを含むヘテロ二量化抗体を、プロテインAを用いて精製する方法が報告されている（WO98050431およびWO95033844）。さらに、IgGとプロテインAの結合部位であるEUナンバリング位置435位および436位のアミノ酸残基を、異なるプロテインA親和性をもたらすアミノ酸であるTyr、Hisなどに置換したH鎖を用いて、あるいは、異なるプロテインA親和性を有するH鎖を用いて、各H鎖とプロテインAとの相互作用を変化させ、次いでプロテインAカラムを用いることにより、ヘテロ二量化抗体のみを効率的に精製することができる。
さらに、本開示のFc領域として、Fc領域のC末端のヘテロジェニティーが改善されたFc領域が適宜使用され得る。より具体的には、本開示は、IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4由来のFc領域を構成する2つのポリペプチドのアミノ酸配列のうちEUナンバリングによって特定される446位のグリシンおよび447位のリジンを欠失させることにより生成されたFc領域を提供する。
本明細書において記載されるように調製された多重特異性抗原結合分子は、例えば、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、およびサイズ排除クロマトグラフィー等の当技術分野において公知の技術によって精製されてもよい。特定のタンパク質を精製するために用いられる実際の条件は、正味電荷、疎水性、親水性等の因子に一部依存し、当業者に明らかである。アフィニティークロマトグラフィー精製では、多重特異性抗原結合分子が結合する、抗体、リガンド、受容体、または抗原を用いることができる。例えば、本発明の多重特異性抗原結合分子のアフィニティークロマトグラフィー精製では、プロテインAまたはプロテインGを有するマトリックスが用いられてもよい。多重特異性抗原結合分子を単離するために、連続したプロテインAまたはGアフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを用いることができる。多重特異性抗原結合分子の純度は、ゲル電気泳動および高圧液体クロマトグラフィー等を含む、さまざまな周知の分析方法のいずれかによって決定することができる。
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」または「ADCC」は、分泌されたIgが特定の細胞傷害性細胞（例えば、NK細胞、好中球およびマクロファージ）上に存在するFc受容体 (FcR) に結合しそれによってこれらの細胞傷害性エフェクター細胞が抗原を有する標的細胞に特異的に結合することができそしてその後にその標的細胞を細胞毒によって殺傷することができるようになる、細胞傷害の一形態を指す。ADCCを媒介するプライマリ細胞であるNK細胞はFcγRIIIのみを発現し、単球はFcγRI、FcγRII、およびFcγRIIIを発現する。造血細胞上のFcRの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991) の第464頁の表3にまとめられている。目的の分子のADCC活性を評価するために、in vitro ADCC測定法、例えば米国特許第5,500,362号もしくは第5,821,337号または米国特許第6,737,056号 (Presta) に記載のものが実施され得る。そのような測定法に有用なエフェクター細胞は、PBMCおよびNK細胞を含む。あるいはまたは加えて、目的の分子のADCC活性は、例えばClynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)に開示される動物モデルのような動物モデルにおいて、in vivoで評価されてもよい。
補体依存性細胞傷害
「補体依存性細胞傷害」または「CDC」は、補体の存在下での標的細胞の溶解を指す。古典的補体経路の活性化は、（適切なサブクラスの）抗体（対応する抗原に結合している）への補体系の第1要素（C1q）の結合によって開始される。補体活性化を評価するため、例えばGazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996) に記載のCDC測定法が実施され得る。改変されたFc領域アミノ酸配列を伴うポリペプチドバリアント（バリアントFc領域を伴うポリペプチド）および増加または減少したC1q結合能は、例えば、米国特許第6,194,551号B1およびWO1999/51642に記載されている。例えば、Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000) も参照のこと。
T細胞依存性細胞傷害
「T細胞依存性細胞傷害」または「TDCC」は、標的細胞に対する細胞傷害がT細胞により誘導されるように、抗原結合分子が、標的細胞上に発現している抗原とT細胞上に発現している別の抗原との両方に結合し、T細胞を標的細胞の近くにリダイレクティングする、細胞傷害の形態を指す。T細胞依存性細胞傷害を評価するための方法である、in vitro TDCCアッセイは、本明細書の「T細胞依存性細胞傷害の測定」のセクションでも説明される。
T細胞依存性細胞傷害の測定
抗原結合分子がCLDN6およびCD3/CD137の両方に結合する態様において、本開示の抗原結合分子を、本開示の抗原結合分子における抗原結合部位が結合するCLDN6発現細胞と接触させることによって引き起こされるT細胞依存性細胞傷害（TDCC）を評価または決定するための方法として、好ましくは、以下に記載する方法が用いられる。細胞傷害活性をin vitroで評価または決定するための方法には、細胞傷害性T細胞等の活性を決定するための方法が含まれる。T細胞媒介性細胞傷害を誘導する活性を本開示の抗原結合分子が有するかどうかは、公知の方法によって決定することができる（例えば、Current protocols in Immunology, Chapter 7. Immunologic studies in humans, Editor, John E, Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc., (1993)を参照）。細胞傷害アッセイにおいて、CLDN6と異なりかつ細胞において発現していない抗原と、CD3/CD137とに結合することができる抗原結合分子が、対照抗原結合分子として用いられる。対照抗原結合分子は同じようにアッセイされる。次いで、活性は、本開示の抗原結合分子が、対照抗原結合分子のものより強い細胞傷害活性を示すかどうかを試験することによって評価される。
一方、in vivo抗腫瘍効果は、例えば、以下の手法によって、評価または決定される。本開示の抗原結合分子における抗原結合部位が結合する抗原を発現する細胞は、非ヒト動物対象に皮内または皮下移植される。次いで、移植の日からまたはその後、被験抗原結合分子が、静脈内または腹膜腔内に毎日または数日間隔で投与される。腫瘍サイズは経時的に測定される。腫瘍サイズの変化の差は細胞傷害活性として定義することができる。in vitroアッセイと同様に、対照抗原結合分子が投与される。腫瘍サイズが、対照抗原結合分子を投与された群のものより、本開示の抗原結合分子を投与された群で小さい場合に、本開示の抗原結合分子は、細胞傷害活性を有すると判断することができる。
抗原結合分子の抗原結合部位が結合する抗原を発現する細胞の増殖を抑制する本開示の抗原結合分子との接触の作用を評価または決定するために、好ましくは、MTT法および細胞内へのアイソトープ標識チミジン取り込みの測定が用いられる。一方、in vivoで細胞増殖を抑制する活性を評価または決定するために、好ましくは、in vivo細胞傷害活性を評価または決定するための上記に記載の同じ方法を用いることができる。
本開示の抗体または抗原結合分子のTDCCは、当技術分野で公知の任意の適切な方法によって評価することができる。例えば、TDCCは、乳酸脱水素酵素 (LDH) 放出アッセイによって測定することができる。このアッセイでは、標的細胞（例えば、CLDN6発現細胞）を被験抗体または抗原結合分子の存在下でT細胞（例えば、PBMC）と共にインキュベートし、T細胞によって殺傷された標的細胞から放出されたLDHの活性を、適切な試薬を用いて測定する。典型的には、細胞傷害活性は、（例えば、Triton-Xでの処理によって溶解された）標的細胞の100％の死滅によって生じたLDH活性に対する、抗体または抗原結合分子とのインキュベーションによって生じたLDH活性の割合として算出される。上述のように算出された細胞傷害活性がより高い場合、被験抗体または抗原結合分子は、より高いTDCCを有すると判定される。
加えてまたはその代わりに、例えば、TDCCは、リアルタイム細胞増殖阻害アッセイによって測定することもできる。このアッセイでは、96ウェルプレートにおいて、標的細胞（例えば、CLDN6発現細胞）を被験抗体または抗原結合分子の存在下でT細胞（例えば、PBMC）と共にインキュベートし、当技術分野で公知の方法によって、例えば適切な分析機器（例えば、xCELLigenceリアルタイム細胞分析装置）を用いることによって、標的細胞の増殖をモニターする。細胞増殖阻害率 (CGI：％) を、CGI (％) = 100 - (CIAb×100 / CINoAb) として与えられる式に従って、Cell Indexから決定する。「CIAb」は、特定の実験時間における、抗体または抗原結合分子ありのウェルのCell Indexを表し、「CINoAb」は、抗体または抗原結合分子なしのウェルの平均Cell Indexを表す。抗体または抗原結合分子のCGI率が高い、すなわち有意な正の値を有する場合、その抗体または抗原結合分子はTDCC活性を有するということができる。
1つの局面において、本開示の抗体または抗原結合分子はT細胞活性化活性を有する。T細胞活性化は、その活性化に応答してレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）を発現する改変T細胞株（例えば、Jurkat / NFAT-REレポーター細胞株（T細胞活性化バイオアッセイ、Promega））を用いる方法などの、当技術分野で公知の方法によってアッセイすることができる。この方法では、標的細胞（例えば、CLDN6発現細胞）を被験抗体または抗原結合分子の存在下でT細胞と共に培養し、次いでレポーター遺伝子の発現産物のレベルまたは活性を、T細胞活性化の指標として適切な方法によって測定する。レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子である場合、ルシフェラーゼとその基質との反応によって生じた発光を、T細胞活性化の指標として測定することができる。上記のように測定されたT細胞活性化がより高い場合、被験抗体または抗原結合分子は、より高いT細胞活性化活性を有すると判定される。
医薬組成物
1つの局面において、本開示は、本開示の抗原結合分子または抗体を含む医薬組成物を提供する。特定の態様において、本開示の医薬組成物は、T細胞依存性細胞傷害を誘導し、言い換えると、本開示の医薬組成物は、細胞傷害を誘導するための治療剤である。特定の態様において、本開示の医薬組成物は、がんの治療および/または予防に用いられる医薬組成物である。特定の態様において、本開示の医薬組成物は、卵巣がん、非小細胞肺がん、胃がん、肝がん、子宮内膜がん、または胚細胞性腫瘍を含む、CLDN6陽性がんまたはCLDN6発現がん；および他のCLDN6陽性がんまたはCLDN6発現がんの治療および/または予防に用いられる医薬組成物である。特定の態様において、本開示の医薬組成物は、細胞増殖抑制剤である。特定の態様において、本開示の医薬組成物は抗がん剤である。
本開示の医薬組成物、本開示の細胞傷害を誘導するための治療剤、細胞増殖抑制剤、または抗がん剤は、必要に応じて、さまざまな種類の抗原結合分子または抗体と共に製剤化することができる。例えば、本開示の複数の抗原結合分子または抗体のカクテルによって、抗原を発現する細胞に対する細胞傷害作用を増強させることができる。
本明細書に記載の抗原結合分子または抗体を含む医薬組成物は、所望の純度を有する抗原結合分子または抗体を、1つまたは複数の任意の薬学的に許容される担体 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)) と混合することによって、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、調製される。薬学的に許容される担体は、概して、用いられる際の投与量および濃度ではレシピエントに対して非毒性であり、これらに限定されるものではないが、以下のものを含む：リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む、抗酸化剤；保存料（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、またはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；3-ペンタノール；およびm-クレゾールなど）；低分子（約10残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む、単糖、二糖、および他の炭水化物；EDTAなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、ソルビトールなどの、砂糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン類；金属錯体（例えば、Zn-タンパク質錯体）；および／またはポリエチレングリコール (PEG) などの非イオン系表面活性剤。本明細書の例示的な薬学的に許容される担体は、さらに、可溶性中性活性型ヒアルロニダーゼ糖タンパク質 (sHASEGP)（例えば、rHuPH20 (HYLENEX（登録商標）、Baxter International, Inc.) などのヒト可溶性PH-20ヒアルロニダーゼ糖タンパク質）などの間質性薬剤分散剤を含む。特定の例示的sHASEGPおよびその使用方法は（rHuPH20を含む）、米国特許出願公開第2005/0260186号および第2006/0104968号に記載されている。1つの局面において、sHASEGPは、コンドロイチナーゼなどの1つまたは複数の追加的なグリコサミノグリカナーゼと組み合わせられる。
例示的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第6,267,958号に記載されている。水溶液抗体製剤は、米国特許第6,171,586号およびWO2006/044908に記載のものを含み、後者の製剤はヒスチジン−アセテート緩衝液を含んでいる。
本明細書の製剤は、治療される特定の適応症のために必要であれば1つより多くの有効成分を含んでもよい。互いに悪影響を与えあわない相補的な活性を伴うものが好ましい。このような有効成分は、意図された目的のために有効である量で、好適に組み合わせられて存在する。
必要に応じて、本開示の抗原結合分子または抗体は、マイクロカプセル（ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、ポリ[メチルメタクリレート]などから作製されたマイクロカプセル）中に封入してもよく、コロイド薬物送達系（リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）の構成成分としてもよい（例えば、「Remington's Pharmaceutical Science 16th edition」、Oslo Ed. (1980)を参照）。さらに、薬剤を徐放性薬剤として調製するための方法も公知であり、これらは本開示の抗原結合分子に適用することができる（J. Biomed. Mater. Res. (1981) 15, 267-277; Chemtech. (1982) 12, 98-105；米国特許第3773719号；欧州特許出願 (EP)番号EP58481およびEP133988；Biopolymers (1983) 22, 547-556）。
必要に応じて、本開示の抗原結合分子または抗体を対象内で直接発現させるために、本開示の抗原結合分子または抗体をコードする核酸分子を含むベクターを、対象に導入してもよい。使用することが可能なベクターの例としては、アデノウイルスであるが、これに限定されない。本開示の抗原結合分子または抗体をコードする核酸分子を対象に直接投与すること、またはエレクトロポレーションを介して本開示の抗原結合分子または抗体をコードする核酸分子を対象に移入すること、または発現および分泌させるべき本開示の抗原結合分子または抗体をコードする核酸分子を含む細胞を対象に投与して、対象において本開示の抗原結合分子または抗体を連続的に発現および分泌させることも可能である。
本開示の医薬組成物、細胞増殖抑制剤、または抗がん剤は、経口または非経口のいずれかで患者に投与され得る。非経口投与が好ましい。具体的には、そのような投与法には、注射、経鼻投与、経肺投与、および経皮投与が含まれる。注射には、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、および皮下注射が含まれる。例えば、本開示の医薬組成物、細胞傷害を誘導するための治療剤、細胞増殖抑制剤、または抗がん剤は、注射により局所的にまたは全身的に投与することができる。さらに、適切な投与方法が患者の年齢および症状に応じて選択することができる。投与用量は、例えば、各投与につき体重1 kgあたり0.0001 mg〜1,000 mgの範囲から選択することができる。あるいは、用量は、例えば、1患者あたり0.001 mg〜100,000 mgの範囲から選択することができる。しかしながら、本開示の医薬組成物の用量は、これらの用量に限定されない。
好ましくは、本開示の医薬組成物は、本明細書において記載されるような抗原結合分子または抗体を含む。1つの局面において、組成物は、細胞傷害を誘導することにおいて使用するための医薬組成物である。別の局面において、組成物は、がんを治療または予防することにおいて使用するための医薬組成物である。好ましくは、がんは結腸直腸がんまたは胃がんである。本開示の医薬組成物は、がんを治療または予防するために用いることができる。したがって、本開示は、その必要がある患者に本願明細書に記載される抗原結合分子または抗体が投与される、がんを治療または予防するための方法を提供する。
本開示はまた、CLDN6を発現する細胞を、CLDN6に結合する本開示の抗原結合分子と接触させることによって、CLDN6を発現する細胞またはCLDN6陽性がんを損傷するための、または細胞増殖を抑制するための方法も提供する。本開示の抗原結合分子が結合する細胞は、それがCLDN6を発現する限り、特に限定されない。具体的には、本開示において、好ましいCLDN6発現がんまたはCLDN6陽性がんには、卵巣がん、非小細胞肺がん、胃がん、肝がん、子宮内膜がん、または胚細胞性腫瘍が含まれる。
本開示において、「接触」は、例えば、in vitroで培養されたCLDN6を発現する細胞の培地に本開示の抗原結合分子を添加することによって行うことができる。この場合、添加すべき抗原結合分子は、溶液、または凍結乾燥等によって調製された固体などの適切な形態で用いることができる。本開示の抗原結合分子を水溶液として添加する場合、該溶液は、抗原結合分子を単独で含有する純粋な水溶液、または例えば上記の界面活性剤、賦形剤、着色剤、着香剤、保存剤、安定化剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、および矯味剤を含有する溶液であってよい。添加濃度は特に限定されない；しかしながら、培地中の最終濃度は、好ましくは1 pg/ml〜1 g/mlの範囲内、より好ましくは1 ng/ml〜1 mg/ml、およびさらにより好ましくは1μg/ml〜1 mg/mlの範囲内である。
本開示の別の態様において、「接触」はまた、in vivoでCLDN6発現細胞を移植された非ヒト動物、またはCLDN6を内因的に発現するがん細胞を有する動物に投与することによって行うこともできる。投与方法は、経口または非経口であってよい。非経口投与が特に好ましい。具体的には、非経口投与方法には、注射、経鼻投与、経肺投与、および経皮投与が含まれる。注射には、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、および皮下注射が含まれる。例えば、本開示の医薬組成物、細胞傷害を誘導するための治療剤、細胞増殖抑制剤、または抗がん剤は、注射によって局所投与または全身投与することができる。さらに、適切な投与方法は、動物対象の年齢および症状に応じて選択することができる。抗原結合分子を水溶液として投与する場合、該溶液は、抗原結合分子を単独で含有する純粋な水溶液、または例えば上記の界面活性剤、賦形剤、着色剤、着香剤、保存剤、安定化剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、および矯味剤を含有する溶液であってよい。投与用量は、例えば、各投与につき体重1 kgあたり0.0001〜1,000 mgの範囲から選択することができる。あるいは、用量は、例えば、各患者につき0.001〜100,000 mgの範囲から選択することができる。しかしながら、本開示の抗原結合分子の用量は、これらの例に限定されない。
本開示はまた、本開示の抗原結合分子または本開示の方法によって産生された抗原結合分子を含有する、本開示の方法において使用するためのキットも提供する。該キットは、追加の薬学的に許容される担体もしくは媒体、またはキットの使用方法を記載した取扱説明書等と共に包装され得る。
本発明の別の局面において、上述の障害の治療、予防、および／または診断に有用な器材を含んだ製品が、提供される。製品は、容器、および当該容器上のラベルまたは当該容器に付属する添付文書を含む。好ましい容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、IV溶液バッグなどが含まれる。容器類は、ガラスやプラスチックなどの、様々な材料から形成されていてよい。容器は組成物を単体で保持してもよいし、症状の治療、予防、および／または診断のために有効な別の組成物と組み合わせて保持してもよく、また、無菌的なアクセスポートを有していてもよい（例えば、容器は、皮下注射針によって突き通すことのできるストッパーを有する静脈内投与用溶液バッグまたはバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも1つの有効成分は、本発明の抗体である。ラベルまたは添付文書は、組成物が選ばれた症状を治療するために使用されるものであることを示す。さらに製品は、(a)第1の容器であって、その中に収められた本発明の抗体を含む組成物を伴う、第1の容器；および、(b)第2の容器であって、その中に収められたさらなる細胞傷害剤またはそれ以外で治療的な剤を含む組成物を伴う、第2の容器を含んでもよい。本発明のこの態様における製品は、さらに、組成物が特定の症状を治療するために使用され得ることを示す、添付文書を含んでもよい。あるいはまたは加えて、製品はさらに、注射用制菌水 (BWFI)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、およびデキストロース溶液などの、薬学的に許容される緩衝液を含む、第2の（または第3の）容器を含んでもよい。他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、およびシリンジなどの、他の商業的観点またはユーザの立場から望ましい器材をさらに含んでもよい。
添付文書
用語「添付文書」は、治療用製品の市販パッケージに通常含まれる説明書を指すために用いられ、そのような治療用製品の使用に関する適応症、用法、投与量、投与方法、併用療法、禁忌、および/または警告についての情報を含む。
医薬製剤
用語「医薬製剤」または「医薬組成物」は、その中に含まれた有効成分の生物学的活性が効果を発揮し得るような形態にある調製物であって、かつ製剤が投与される対象に許容できない程度に毒性のある追加の要素を含んでいない、調製物を指す。
薬学的に許容される担体
「薬学的に許容される担体」は、対象に対して無毒な、医薬製剤中の有効成分以外の成分を指す。薬学的に許容される担体は、これらに限定されるものではないが、緩衝液、賦形剤、安定化剤、または保存剤を含む。
治療
本明細書で用いられる「治療」（および、その文法上の派生語、例えば「治療する」、「治療すること」など）は、治療される個体の自然経過を改変することを企図した臨床的介入を意味し、予防のためにも、臨床的病態の経過の間にも実施され得る。治療の望ましい効果は、これらに限定されるものではないが、疾患の発生または再発の防止、症状の軽減、疾患による任意の直接的または間接的な病理的影響の減弱、転移の防止、疾患の進行速度の低減、疾患状態の回復または緩和、および寛解または改善された予後を含む。いくつかの態様において、本開示の抗原結合分子または抗体は、疾患の発症を遅らせる、または疾患の進行を遅くするために用いられる。
がん
用語「がん」および「がん性」は、調節されない細胞成長／増殖によって典型的に特徴づけられる哺乳動物における生理学的状態を指すまたは説明するものである。
特定の態様において、がんは、卵巣がん、非小細胞肺がん、胃がん、肝がん、子宮内膜がん、または胚細胞性腫瘍を含むCLDN6発現がんまたはCLDN6陽性がん；および他のCLDN6陽性がんまたはCLDN6発現がんである。
腫瘍
用語「腫瘍」は、悪性か良性かによらず、すべての新生物性細胞成長および増殖ならびにすべての前がん性およびがん性細胞および組織を指す。用語「がん」、「がん性」、「細胞増殖性障害」、「増殖性障害」および「腫瘍」は、本明細書でいう場合、相互に排他的でない。
他の剤および治療
本明細書において記載される多重特異性抗原結合分子は、治療において1つまたは複数の他の剤との組み合わせで投与されてもよい。例えば、本明細書において記載される多重特異性抗原結合分子は、少なくとも1つの追加の治療剤と同時投与されてもよい。用語「治療剤」は、そのような治療の必要がある個体において症状または疾患を治療するために投与される任意の剤を包含する。そのような追加治療剤は、治療される特定の適応症に適している任意の有効成分、好ましくは、互いに悪影響を与えあわない相補的な活性を伴うものを含み得る。特定の態様において、追加治療剤は、免疫調節剤、細胞***阻害剤、細胞接着の阻害剤、細胞傷害剤、細胞アポトーシスの活性化剤、またはアポトーシス誘導因子に対する細胞の感受性を増加させる剤である。特定の態様において、追加治療剤は、抗がん剤、例えば、微小管破壊剤、抗代謝剤、トポイソメラーゼ阻害剤、DNAインターカレート剤、アルキル化剤、ホルモン療法、キナーゼ阻害剤、受容体アンタゴニスト、腫瘍細胞アポトーシスの活性化剤、または抗血管新生剤である。
そのような他の剤は、意図された目的のために有効である量で、好適に組み合わせられて存在する。そのような他の剤の有効量は、用いられる多重特異性抗原結合分子の量、障害または治療の種類、および上で論じた他の要因に依存する。多重特異性抗原結合分子は概して、本明細書に記載されるものと同じ投与量および投与経路で、または本明細書に記載される投与量の約1から99％で、または経験的／臨床的に適切と判断される任意の投与量および任意の経路で用いられる。
上記のそのような併用療法は、併用投与（2種類以上の治療剤が同じまたは別々の組成物中に含まれている）、および個別投与を包含し、個別投与の場合、本明細書に記載される多重特異性抗原結合分子の投与が追加治療剤および/またはアジュバントの投与に先立って、と同時に、および／または、続いて、行われ得る。本明細書において記載される多重特異性抗原結合分子はまた、放射線療法との組み合わせで用いることができる。
本明細書において引用したすべての文献は、参照により本明細書に組み入れられる。
以下は、本開示の方法および組成物の実施例である。上述の一般的な記載に照らし、種々の他の態様が実施され得ることが、理解されるであろう。
［実施例1］腫瘍細胞に対するin vitro細胞傷害活性の改善のための、親Dual-Fab H183L072に由来する親和性成熟バリアントのスクリーニング
1.1. 親和性成熟バリアントの配列
親Dual-Fab H183L072（重鎖：配列番号：90；軽鎖：配列番号：142）の結合親和性を増加させるために、H183L072を鋳型として用いて、可変領域に単一のまたは複数の変異を導入することにより、1,000個よりも多いDual-Fabバリアントを創出した。抗体を、Expi293（Invitrogen）を用いて発現させ、プロテインA精製、続いて、ゲル濾過が必要な場合にはゲル濾過によって精製した。複数の変異を有する15個の代表的なバリアントの配列を、表1に列記し、結合キネティクスを、実施例1.2.2に後述の通りにBiacore T200機器（GE Healthcare）を用いて25℃および／または37℃で評価した。
Figure 0006971419
1.2. 親和性成熟バリアントの結合キネティクス情報
1.2.1. ヒトCD3およびCD137の発現および精製
ヒトCD3複合体のγサブユニットおよびεサブユニット（ヒトCD3egリンカー）を29-merリンカーによって連結し、Flag-タグをγサブユニットのC末端に融合させた（配列番号：169）。この構築物を、FreeStyle293F細胞株（Thermo Fisher）を用いて一過性に発現させた。ヒトCD3egリンカーを発現する培養上清を、Q HP樹脂（GE healthcare）を充填したカラムを用いて濃縮し、次いで、FLAG-タグ親和性クロマトグラフィーに適用した。ヒトCD3egリンカーを含有する画分を収集し、続いて、1×D-PBSで平衡化したSuperdex 200ゲル濾過カラム（GE healthcare）に供した。次いで、ヒトCD3egリンカーを含有する画分をプールし、-80℃で保管した。
そのC末端にヘキサヒスチジン（His-タグ）およびビオチンアクセプターペプチド（BAP）を有するヒトCD137細胞外ドメイン（ECD）（配列番号：179）を、FreeStyle293F細胞株（Thermo Fisher）を用いて一過性に発現させた。ヒトCD137 ECDを発現する培養上清をHisTrap HPカラム（GE healthcare）に負荷し、イミダゾール（Nacalai）を含有する緩衝液で溶出した。ヒトCD137 ECDを含有する画分を収集し、続いて、1×D-PBSで平衡化したSuperdex 200ゲル濾過カラム（GE healthcare）に供した。次いで、ヒトCD137 ECDを含有する画分をプールし、-80℃で保管した。
1.2.2. ヒトCD3およびCD137に対する親和性測定
ヒトCD3に対するDual-Fab抗体（Dual-Ig）の結合親和性を、Biacore T200機器（GE Healthcare）を用いて25℃で評価した。抗ヒトFc（GE Healthcare）を、アミンカップリングキット（GE Healthcare）を用いてCM4センサーチップのすべてのフローセルの上に固相化した。抗体を抗Fcセンサー表面上に捕捉し、次いで、組換えヒトCD3またはCD137をフローセルにインジェクトした。すべての抗体およびアナライトを、20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05％ Tween 20、および0.005％ NaN3を含有するACES pH 7.4を用いて調製した。センサー表面は、3M MgCl2でサイクル毎に再生した。結合親和性は、Biacore T200 Evaluation software、version 2.0（GE Healthcare）を用いて、データをプロセシングし、1:1結合モデルにフィットさせることによって決定させた。CD137結合親和性アッセイを、アッセイ温度を37℃に設定したことを除いて、同じ条件で行った。組換えヒトCD3およびCD137に対するDual-Fab抗体の結合親和性を表2に示す（表中、Kon、Koff、およびKD値を表すために用いられる表示Eは、「10の冪」を意味し、例えば、3.54E+04 = 3.54×104である）。
Figure 0006971419
［実施例2］H0868L0581/hCD137複合体のX線結晶構造解析
2.1. 共結晶解析のための抗体の調製
H0868L581を、hCD137タンパク質との共結晶解析のために選択した。二価抗体を、Expi293 Expression system（Thermo Fisher Scientific）を用いて一過性にトランスフェクトし、発現させた。培養上清を採取し、MabSelect SuRe親和性クロマトグラフィー（GE Healthcare）およびその後のSuperdex200（GE Healthcare）を用いたゲル濾過クロマトグラフィーを用いて、抗体を上清から精製した。
2.2. ヒトCD137の細胞外ドメイン（24〜186）の発現および精製
第Xa因子切断可能リンカーを介してFcに融合したヒトCD137の細胞外ドメイン（CD137-FFc、配列番号：166）を、キフネンシンの存在下でHEK293細胞において発現させた。培養培地由来のCD137-FFcを、親和性クロマトグラフィー（HiTrap MabSelect SuRe column, GE Healthcare）およびサイズ排除クロマトグラフィー（HiLoad 16/600 Superdex 200 pg column, GE healthcare）によって精製した。Fcを第Xa因子で切断して、結果として生じたCD137細胞外ドメインを、タンデムに接続されたゲル濾過カラム（HiLoad 16/600 Superdex 200 pg, GE healthcare）およびプロテインAカラム（HiTrap MabSelect SuRe 1ml, GE Healthcare）でさらに精製し、その後、Benzamidine Sepharose樹脂（GE Healthcare）を用いて精製した。CD137細胞外ドメインを含有する画分をプールして、-80℃で保管した。
2.3. H0868L0581および抗CD137対照抗体のFab断片の調製
結晶構造解析のための抗体を、Expi293 Expression system（Thermo Fisher Scientific）を用いて一過性にトランスフェクトし、発現させた。培養上清を採取し、MabSelect SuRe親和性クロマトグラフィー（GE Healthcare）およびその後のSuperdex200（GE Healthcare）を用いたゲル濾過クロマトグラフィーを用いて、抗体を上清から精製した。H0868L0581および公知の抗CD137対照抗体（以下137Ctrlと呼ばれる、重鎖は配列番号：167、軽鎖は配列番号：168）のFab断片を、Lys-C（Roche）での制限消化と、それに続く、Fc断片を除去するためのプロテインAカラム（MabSlect SuRe, GE Healthcare）、カチオン交換カラム（HiTrap SP HP, GE Healthcare）、およびゲル濾過カラム（Superdex200 16/60, GE Healthcare）上へのローディングを用いた、従来の方法によって調製した。Fab断片を含有する画分をプールして、-80℃で保管した。
2.4. H0868L0581 Fab、137Ctrl、およびヒトCD137複合体の調製
精製されたCD137を、脱グリコシル化のためにGST-タグ融合エンドグリコシダーゼF1（社内）と混合し、続いて、ゲル濾過カラム（HiLoad 16/600 Superdex 200 pg, GE healthcare）およびプロテインAカラム（HiTrap MabSelect SuRe 1ml, GE Healthcare）を用いたCD137の精製を行った。精製されたCD137を、H0868L0581 Fabと混合した。複合体を、ゲル濾過カラム（Superdex 200 Increase 10/300 GL, GE healthcare）によって精製し、その後、精製されたH0868L0581 FabおよびCD137複合体を、137Ctrlと混合した。三成分複合体を、25 mM HEPES pH7.3、100 mM NaClで平衡化されたカラムを用いたゲル濾過クロマトグラフィー（Superdex200 10/300 increase, GE Healthcare）によって精製した。
2.5. 結晶化
精製された複合体を、約10 mg/mLまで濃縮し、21℃でのシッティングドロップ蒸気拡散法によって結晶化を実施した。リザーバー溶液は、0.1Mトリス塩酸塩 pH8.5、25.0％ v/vポリエチレングリコールモノメチルエーテル550からなった。
2.6. データ収集および構造決定
X線回折データを、SLSでのX06SAによって測定した。測定の最中には、結晶を、-178℃の窒素流に常に置いて凍結状態に維持し、結晶を一回に0.25度回転させながら、ビームラインに付属したEiger X16M（DECTRIS）を用いて合計で1440枚のX線回折画像を収集した。セルパラメーターの決定、回折スポットの指数付け、および回折画像から得られた回折データのプロセシングは、autoPROC program（Acta. Cryst. 2011, D67: 293-302）、XDS Package（Acta. Cryst. 2010, D66: 125-132）、およびAIMLESS（Acta. Cryst. 2013, D69: 1204-1214）を用いて行い、最終的に、最大で3.705オングストローム解像度の回折強度データが得られた。結晶学データの統計を、表3に示す。
構造を、プログラムPhaserでの分子置換によって決定した（J. Appl. Cryst. 2007, 40: 658-674）。検索モデルは、公開された結晶構造（PDBコード：4NKIおよび6MI2）に由来した。モデルは、Cootプログラム（Acta Cryst. 2010, D66: 486-501）で作り、プログラムRefmac5（Acta Cryst. 2011, D67: 355-367）およびPHENIX（Acta Cryst. 2010, D66: 213-221）で精密化した。77.585〜3.705オングストロームの回折強度データについての結晶学的信頼度因子（R）は、22.33％であり、フリーR値は27.50％であった。構造精密化の統計を、表3に示す。
Figure 0006971419
2.7. H0868L0581 FabおよびCD137の相互作用部位の特定
H0868L0581 Fab、137Ctrl、およびCD137の三成分複合体の結晶構造を、3.705オングストローム解像度で決定した。図1および2では、H0868L0581 Fab接触領域のエピトープを、それぞれCD137アミノ酸配列においておよび結晶構造においてマッピングしている。エピトープは、結晶構造においてH0868L0581 Fabの任意の部分から4.5オングストロームの距離内に位置する1個または複数個の原子を含有するCD137のアミノ酸残基を含む。加えて、3.0オングストローム内のエピトープを、図1および2において強調表示している。
図1および2に示すように、結晶構造により、H0868L0581 Fabの重鎖と軽鎖との間に形成されるポケットに結合したCD137のCRD1におけるL24〜N30、特にL24〜S29が、CD137のN末端がポケットの深部に対して向けられる様式で深く埋められていることが示された。加えて、CD137中のCRD1におけるN39〜I44およびCRD2におけるG58〜I64が、H0868L0581 Fabの重鎖CDRによって認識された。CRDとは、WO2015/156268に記載されているようにCRD参照と呼ばれる、Cys-Cysにより形成される構造によって隔てられるドメインの名称である。
本発明者らは、ヒトCD137のN末端領域、特にL24〜N30を認識する抗ヒトCD137抗体を特定し、この領域に対する抗体が細胞上のCD137を活性化できることもまた特定した。
［実施例3］抗CLDN6/Dual-Fab三重特異性抗体の生成
FAST-Ig（WO2013065708）またはCrossMabテクノロジー（図3）を利用することによって、クローディン6を標的とする1つのアームと、CD3およびCD137に対するデュアルターゲティング機能を持つもう1つのアームとを有する三重特異性抗体を生成した。三重特異性抗体中の各Fv領域の標的抗原を表4に示した。各鎖の命名規則を図3に示した。配列番号を表5に示す。各可変領域の配列を表6に示す。
Fc領域は、Fcγ Rサイレントであり、かつ脱グリコシル化されていた。FcRn増強変異Act5（M428L、N434A、Q438R、S440E）を適用し、抗体のPKを改善した。各抗体に適用したエンジニアリング構成要素を表7-1および7-2に示し、FAST06、FAST22、およびFAST30の詳細を表8に示した。すべての抗体を、Expi293細胞（Invitrogen）での一過性発現によって三重特異性形態として発現させ、参考実施例1に従って精製した。
Figure 0006971419
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［実施例4］CLDNファミリーに対する特異性のFACS分析
CLDN3、CLDN4、CLDN6、およびCLDN9間で、アミノ酸配列は高度に保存されている。したがって、発明者らは、FACS分析によって、VHとして65HQ39EおよびVLとして54L0532Q38Kを含むCLDN6結合FvのCLDN6結合特異性を調べた。hCLDN6/BaF、hCLDN3/BaF、hCLDN4/BaF、およびhCLDN9/BaFを、CLDN6結合Fv CLDN6AE25EKおよびCD3結合Fv（重鎖可変領域の配列番号：184、軽鎖可変領域の配列番号：185）を含む15μg/mlの抗CLDN6/CD3二重特異性抗体（CS2961）と共にインキュベートした。染色対照として、別の抗CLDN6/CD3二重特異性抗体（6PHU3/TR01）およびCLDN6への結合能を有さない抗体（KLH/TR01）を用いた。6PHU3/TR01およびKLH/TR01は、同じCD3結合Fv（重鎖可変領域の配列番号：188、軽鎖可変領域の配列番号：189）を含む。6PHU3/TR01のCLDN6結合Fvは、配列番号：190に示す重鎖可変領域および配列番号：191に示す軽鎖可変領域を含む。KLH/TR01は、KLH結合Fv（重鎖可変領域の配列番号：186、軽鎖可変領域の配列番号：187）を含む。
各抗体の結合を、Alexa Fluor 488コンジュゲート抗ヒトIgG（Invitrogen）によって検出した。死細胞をeFlour 780（Invitrogen）染色によって区別した。
図4に示すように、CS2961は、6PHU3/TR01と比較して、CLDN6に対するより良好な特異性を示した。
［実施例5］抗CLDN6/CD3二重特異性抗体および抗CLDN6/Dual-Fab三重特異性抗体のT細胞依存性細胞傷害の測定
図5は、NIH:OVCAR-3（高CLDN6発現卵巣がん細胞株）ならびにA2780およびCOV413A（低CLDN6発現卵巣がん細胞株）に対する、抗CLDN6/CD3二重特異性抗体（CS3348）および5種類の抗CLDN6/Dual-Fab三重特異性抗体（PPU4134、PPU4135、PPU4136、PPU4137、およびPPU4138）のT細胞依存性細胞傷害を示す。抗体の配列を表9に示す。
Figure 0006971419
細胞傷害を、ヒトPBMCを用いたLDHアッセイによって評価した。15,000個の標的細胞および150,000個のヒトPBMC（E/T = 10）を96ウェルU底プレートの各ウェルに播種し、種々の濃度の抗体と共に37℃および5％CO2にて一晩インキュベートした。標的細胞の死滅をLDH細胞傷害検出キット（Takara Bio）によって測定した。各抗体の細胞傷害活性（％）を以下の式を用いて計算した。
細胞傷害活性 (％) = (A - B - C)×100 / (D - C)
「A」は、抗体およびPBMCで処理したウェルの平均吸光度値を表し、「B」は、エフェクター細胞PBMCのみを有するウェルの平均吸光度値を表し、「C」は、未処理標的細胞のみを有するウェルの平均吸光度値を表し、かつ「D」は、Triton-Xで溶解した標的細胞を有するウェルの平均吸光度値を表す。さらに、抗体なしでPBMCおよび標的細胞を含有するウェルで計算した細胞傷害を0％に設定した。すべての抗CLDN6/Dual-Fab三重特異性抗体は、CLDN6発現細胞に対するT細胞依存性細胞傷害を示した。
［実施例6］CD137/CD3ダブルヒト化マウスの生成
ヒトCD137ノックイン（KI）マウス系統を、マウス胚性幹細胞を用いてマウス内在性Cd137ゲノム領域をヒトCD137ゲノム配列で置き換えることによって生成した。ヒトCD3 EDG置換マウスは、CD3複合体の3つの成分CD3e、CD3d、およびCD3gがすべて、そのヒトカウンターパートCD3E、CD3D、およびCD3Gで置き換えられている系統として樹立された（Scientific Rep. 2018; 8: 46960）。CD137/CD3ダブルヒト化マウス系統を、ヒトCD137 KIマウスをヒトCD3 EDG置換マウスと交配することによって樹立した。
［実施例7］hCD3/hCD137マウスでの抗CLDN6/Dual-Fab三重特異性抗体のin vivo有効性の評価
実施例3において調製された抗体を、そのin vivo有効性について担癌モデルを用いて評価する。
in vivo有効性評価のために、以下「hCD3/hCD137マウス」と呼ばれる、実施例6において樹立されたCD3/CD137ダブルヒト化マウスを用いる。ヒトCLDN6の安定な発現を有する細胞を、hCD3/hCD137マウス中に移植して、腫瘍形成が確認されたhCD3/hCD137マウスを、抗体の投与によって処置する。
より具体的には、担癌モデルを用いた抗体の薬物有効性試験において、下記の試験を行う。CLDN6発現細胞（1×106細胞）を、hCD3/hCD137マウスの鼠径部皮下領域中に移植する。移植の日を、0日目と定義する。移植後9日目に、マウスを、その体重および腫瘍サイズに従ってランダム化して群分けする。ランダム化の日に、抗体を、6 mg/kgで尾静脈を通じて静脈内投与する。抗体は、1回のみ投与する。腫瘍体積および体重を、3〜4日毎に抗腫瘍試験システム（ANTES version 7.0.0.0）で測定する。
別のin vivo有効性評価において、CLDN6発現細胞を、hCD3/hCD137マウスの右側腹部中に移植する。9日目に、マウスを、その腫瘍体積および体重に基づいてランダム化して群分けし、溶媒または実施例3において調製された抗体をi.v.注射する。腫瘍体積を、週2回測定する。IL-6解析のために、処置の2時間後にマウスから採血する。血漿サンプルを、Bio-Plex Pro Mouse Cytokine Th1 Panelにより製造業者のプロトコールに従って解析する。
［実施例8］乳酸デヒドロゲナーゼ放出アッセイを用いた細胞傷害活性のin vitroアッセイ
抗CLDN6/Dual-Fab三重特異性抗体PPU4135の細胞傷害活性を、乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）放出アッセイによって評価した。
ヒトCLDN6を発現する、ヒト胃がん細胞株NUGC-3（JCRB）、ヒト奇形がん細胞株PA-1（ATCC）、ヒト子宮がん細胞株SNG-M（JCRB）、ヒト精巣胚細胞性腫瘍細胞株NEC8（JCRB）、およびヒト卵黄嚢腫瘍細胞株NEC14（JCRB）を標的細胞として用いた。
凍結したPBMC（CTL）を、CTL anti-aggregate washおよび10％FBSを含有するRPMI-1640培地（SIGMA）（10％FBS/RPMIと呼ばれる）によって洗浄し、PBMCを3×106細胞/mLに調整した。これらのPBMCをエフェクター細胞として用いた。
標的細胞を培養フラスコから剥離し、U底透明96ウェルプレート（Corning）に、100μL/ウェルで1.5×104細胞ずつ播種した。ヒトPMBC溶液50μL（1.5×105細胞）および0.004、0.04、0.4、4、または40 nMから選択される濃度の調製した抗体50μLを、それぞれウェル内に添加した。37℃で一晩のインキュベーション後、プレートを遠心分離し、各ウェルからの培養上清100μLを新たな平底透明96ウェルプレートに移した。次いで、LDH検出試薬（触媒を含有する色素溶液、TaKaRa）100μLを各ウェルに添加し、続いて室温で30分間インキュベートした。490 nmおよび620 nmでの吸光度をEnVision（PerkinElmer Japan）によって測定した。
以下の式により、細胞傷害活性率（％）を、490 nmの吸光度と620 nmの吸光度の差から計算した。
細胞傷害活性 (％) = (A - B - C)×100 / (D - C)
「A」は、抗体およびPBMCで処理したウェルの平均吸光度値を表し、「B」は、エフェクター細胞PBMCのみを有するウェルの平均吸光度値を表し、「C」は、未処理の標的細胞のみを有するウェルの平均吸光度値を表し、かつ「D」は、Triton-Xで溶解した標的細胞を有するウェルの平均吸光度値を表す。培養培地ウェルの平均吸光度値を、すべての吸光度値から減算した。さらに、抗体なしでPBMCおよび標的細胞を含有するウェルで計算した細胞傷害を0％に設定した。抗CLDN6/Dual-Fab三重特異性抗体は、用いたすべての細胞株に対してT細胞依存性細胞傷害を示した。
結果を図7に示す。
［実施例9］リアルタイム細胞増殖阻害アッセイ（xCELLigenceアッセイ）
抗CLDN6/Dual-Fab三重特異性抗体によって媒介されるT細胞依存性増殖阻害を、xCELLigence RTCA MP機器（ACEA Biosciences）を用いた細胞増殖アッセイによって評価した。
ヒトCLDN6を発現する、ヒト卵巣がん細胞株NIH:OVCAR-3（ATCC）およびヒト肺がん細胞株NCI-H1435（ATCC）を、標的細胞として用いた。
1,000単位/mLのヘパリン溶液（NovoNordisk）を予め500μL充填した注射器によって、健常な成人ボランティアから末梢血50 mLを採取した。PBS（-）で希釈し4等分した末梢血に、Ficoll-Paque PLUS 15 mLを注入し、Leucosepリンパ球分離管（Greiner Bio-One）中で遠心分離した。分離管を遠心分離（室温にて2150 rpmで10分間）した後、末梢血単核細胞（以下、PBMCと称する）画分層を分離した。10％ FBSを含有するRPMI-1640培地（SIGMA）（10％FBS/RPMIと呼ぶ）でPBMCを1回洗浄した後、PBMCを4×105細胞/mLに調整した。これらのPBMCをエフェクター細胞として用いた。
100μL/ウェルで、1×104個の標的細胞をE-Plate 96プレート（Roche Diagnostics）にプレーティングした。一晩培養後、0.004、0.04、0.4、4、または40 nMから選択される濃度の抗体と共に2×104個のT細胞をそれぞれ、50μL/ウェルで添加した。プレートのインキュベーションの間、72時間にわたって15分毎に細胞増殖をxCELLigenceを用いてモニターした。細胞増殖阻害率（CGI：％）を、CGI (%) = 100 - (CIAb×100 / CINoAb) として与えられる式に従って、Cell Index値から決定した。「CIAb」は、特定の実験時間における、抗体ありのウェルのCell Index値を表し、「CINoAb」は、同じ実験時間における、抗体なしのウェルの平均Cell Index値を表す。
この結果から、すべての抗CLDN6/Dual-Fab三重特異性抗体が、CLDN6を発現するがん細胞株（OVCAR-3およびNCI-H1435）の細胞増殖を用量依存的に阻害したことが示された。
結果を図8に示す。
［実施例10］CLDN6発現腫瘍細胞と共培養したNFAT-luc2 Jurkat細胞株におけるT細胞活性化
抗CLDN6/Dual-Fab三重特異性抗体によるCD3結合を通じたT細胞活性化を、エフェクター細胞としてGloResponse NFAT-luc2 Jurkat細胞（Promega、J1601）を用いたルシフェラーゼアッセイシステムによって測定した。クローディン6を内因的に発現する細胞として、ヒト卵巣がん細胞株OVCAR-3(ATCC）および肺腺がん細胞株NCI-H1435（ATCC）を用いた。CLDN6陰性細胞として、ヒト膀胱がん細胞株5637（ATCC）を用いた。
アッセイを以下の通りに行った。はじめに、上記がん細胞株を培養フラスコから剥離し、25μL/ウェル（2×104細胞）で白色平底96ウェルプレート（Coster #3917）にプレーティングした。次に、0.003、0.03、0.3、3、または30 nMから選択される濃度の抗体と共に1×105個のJurkat/NFAT-REレポーター細胞株をそれぞれ、25μL/ウェルで添加した。37℃で一晩培養後、Bio-Glo試薬（Promega #G7941）を75μL/ウェルで添加し、続いて、室温で10分間さらにインキュベートした。次いで、活性化Jurkat細胞から生じた発光をEnSpire（PerkinElmer Japan）によって測定した。各ウェルの発光倍率を、抗体ありのウェルと抗体なしのウェルとの間で比較を行うことによって計算した。
標的細胞としてCLDN6発現ヒト細胞株（OVCAR3およびNCI-H1435）およびCLDN6陰性細胞株（5637）を用いた、抗CLDN6/Dual-Fab三重特異性抗体およびCS3348のNFATシグナル活性化特性の結果を、図9に示す。
クローディン6陽性細胞株の存在下で、すべての抗体によるNFAT活性化が用量依存的に観察された。一方で、クローディン6陰性細胞株5637の存在下では、高濃度の抗体でも活性化はほとんど観察されなかった。
［実施例11］CLDN6発現腫瘍細胞と共培養したヒト4-1BBおよびルシフェラーゼを発現するJurkatレポーター細胞株におけるNFκB活性化
抗CLDN6/Dual-Fab三重特異性抗体によるCD137結合を通じたNFκB活性化を、GloResponse(商標)NFκB luc2/4-1BB Jurkat（Promega, CS196004）を用いて評価した。クローディン6を内因的に発現する細胞として、ヒト卵巣がん細胞株OVCAR-3（ATCC）および肺腺がん細胞株NCI-H1435（ATCC）を用いた。CLDN6陰性細胞として、ヒト膀胱がん細胞株5637（ATCC）を用いた。
アッセイを以下の通りに行った。はじめに、上記のがん細胞株を培養フラスコから剥離し、25μL/ウェル（2.5×104細胞）で白色平底96ウェルプレート（Coster #3917）にプレーティングした。次に、5×104個のNFκB luc2/4-1BB Jurkatレポーター細胞株を移し、漸増量の抗体を含有する25μl培地を混合した。アッセイプレートを37℃で6時間インキュベートし、次いで、Bio-Glo試薬（Promega #G7941）を75μL/ウェルで添加し、続いて、室温で10分間さらにインキュベートした。次いで、活性化Jurkat細胞から生じた発光をEnVision（PerkinElmer Japan）によって測定した。各ウェルの発光倍率を、各抗体（0.003、0.03、0.3、3、および30 nM）ありのウェルと抗体なしのウェルとの間で比較を行うことにより計算した。
標的細胞としてCLDN6発現ヒト細胞株（OVCAR3およびNCI-H1435）およびCLDN6陰性細胞株（5637）を用いた、抗CLDN6/Dual-Fab三重特異性抗体およびCS3348のNFκBシグナル活性化特性の結果を、図10に示す。
クローディン6陽性細胞株の存在下で、すべての抗体によるNFκB活性化が用量依存的に観察された。特に、抗CLDN6/Dual-Fab三重特異性抗体の存在下ではるかに高い活性化が確認された。一方で、クローディン6陰性細胞株5637の存在下では、高濃度の抗体でも活性化が観察されなかった。
［実施例12］in vivo抗腫瘍効果試験
抗CLDN6/Dual-Fab三重特異性抗体のin vivo抗腫瘍効果を、担癌マウスモデルを用いて評価した。臍帯血由来のヒト幹細胞を注射したヒト化NOGマウス（HuNOGマウスモデル）の皮下に、ヒトCLDN6を発現するヒトがん細胞株（NCI-H1435またはOV-90）を移植した。担癌マウスは、ランダム化して処置群に分け、抗体、または対象として溶媒を投与した（表10）。
移植後8日目（NCI-H1435）または16日目（OV90）の腫瘍サイズおよび体重によってマウスをランダム化しかつ群分けした後、抗CLDN6/Dual-Fab三重特異性抗体を静脈内に投与した。抗CLDN6/Dual-Fab三重特異性抗体は1回のみ投与された。腫瘍塊の長さ（L）および幅（W）を測定し、腫瘍体積（TV）をTV = (L×W×W) / 2として計算した。
溶媒投与対照群と比較して抗CLDN6/Dual-Fab三重特異性抗体投与群において、抗腫瘍効果が観察された（図11および12）。
Figure 0006971419
［実施例13］抗CLDN6/Dual-Fab三重特異性抗体の毒性研究
PPU4135抗体（抗CLDN6/Dual-Fab三重特異性抗体）の潜在的な毒性を、カニクイザルを用いた毒性研究においてCS3348抗体（抗CLDN6/CD3二重特異性抗体）と比較して評価した。PPU4135抗体およびCS3348抗体は両方とも、カニクイザルのそれらの抗原と交差反応することから、in vivo毒性研究における評価のための動物種としてカニクイザルを選択した。単回投与毒性研究の概要を表11に示す。CS3348を用いた毒性研究では、雌より雄の動物でより毒性学的所見に対する感受性が高いと考えられた（図13）ため、PPU4135由来毒性の評価では2匹の雄が用いられた。これらの研究において、設定した用量レベルは、100（CS3348）または90（PPU4135）μg/kgであり、これらは、最大反応の80％を生じる有効濃度のおよそ2.57倍であった。
Figure 0006971419
 IV = 静脈内
CS3348またはPPU4135で処置した雄動物では、血漿曝露レベルは、8日目までPPU4135処置群とCS3348処置群との間で同等であった。これらの抗体の単回投与後に、AST（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）、ALT（アラニンアミノトランスフェラーゼ）、およびGLDH（グルタミン酸デヒドロゲナーゼ）（肝酵素）；ALP（アルカリホスファターゼ）、TBIL（総ビリルビン）、GGT（γグルタミルトランスペプチダーゼ）、およびTBA（総胆汁酸）（肝胆道障害パラメーター）；ならびにCRP（C反応性タンパク質）（炎症マーカー）の増加が記録された（図13）。本研究から、これらの抗体で処置した雄動物間での肝酵素レベルの差はわずかであった（図13）が、肝胆道障害パラメーターおよび炎症マーカーの上昇は、CS3348投与と比較してPPU4135の投与で劇的に軽減した（図13）。これらの結果は、被験物質由来の肝毒性、主に肝胆道障害は、抗CLDN6/CD3二重特異性抗体を用いるより抗CLDN6/Dual-Fab三重特異性抗体を用いることによって減弱することを示唆している。
［実施例14］抗CLDN6/Dual-Fab三重特異性抗体の特徴づけ
pH 7.4でのヒトおよびカニクイザル（cyno）CLDN6 VLP（ウイルス様粒子）に対する抗CLDN6/Dual-Fab三重特異性抗体の結合親和性を、Biacore T200機器（GE Healthcare）を用いて25℃で決定した。抗ヒトCD81（BD Pharmingen）抗体を、アミンカップリングキット（GE Healthcare）を用いてC1センサーチップのすべてのフローセル上に固相化した。ヒトおよびカニクイザルCLDN6 VLPを、抗ヒトCD81抗体によってセンサー表面上に捕捉した。各VLPは、緩衝液（20 mMリン酸Na、150 mM NaCl、0.1 mg/mL BSA、0.005％ NaN3、pH 7.4）によって5倍希釈した。被験抗体を緩衝液（20 mMリン酸Na、150 mM NaCl、0.1 mg/mL BSA、0.005％ NaN3、pH 7.4）において調製した。抗CLDN6/Dual-Fab三重特異性抗体を50および200 nMでインジェクトし、続いて解離させた。センサー表面は、サイクル毎に0.1％ SDSおよび100 mM H3PO4で再生した。表12に示すように、カニクイザルCLDN6に対するPPU4135の結合親和性は、ヒトCLDN6に対するものと同等である。結合親和性は、Biacore T200 Evaluation software、version 2.0（GE Healthcare）を用いて、データをプロセシングし、1：1結合モデルにフィットさせることによって決定した。
pH 7.4での組換えヒトおよびカニクイザルCD3eg（CD3のγおよびεサブユニット）に対する抗CLDN6/Dual-Fab三重特異性抗体の結合親和性を、Biacore 8K機器（GE Healthcare）を用いて25℃で決定した。pH 7.4での組換えヒトおよびカニクイザルCD137に対する抗CLDN6/Dual-Fab三重特異性抗体の結合親和性を、Biacore 8K機器（GE Healthcare）を用いて37℃で決定した。抗ヒトFc（GE Healthcare）抗体を、アミンカップリングキット（GE Healthcare）を用いてCM4センサーチップのすべてのフローセル上に固相化した。被験抗体およびアナライトを、20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05％ Tween 20、0.005％ NaN3を含有するACES pH 7.4において調製した。抗CLDN6/Dual-Fab三重特異性抗体を抗ヒトFcによってセンサー表面上に捕捉した。抗体捕捉レベルは、300レゾナンスユニット（RU）を目指した。組換えCD3egおよびCD137を500および2000 nMの両方でインジェクトし、続いて解離させた。センサー表面は、サイクル毎に3M MgCl2で再生した。表12に示すように、カニクイザルCD3egおよびカニクイザルCD137に対するPPU4135の結合親和性はそれぞれ、ヒトCD3egおよびCD137に対するものと同等である。結合親和性は、Biacore Insight Evaluationソフトウェア（GE Healthcare）を用いて、データをプロセシングし、1：1結合モデルにフィットさせることによって決定した。
Figure 0006971419
 （表中でka（1/Ms）、kd（1/s）、およびKD値を表すために用いられる表示Eは、「10の冪」を意味し、例えば、2.17E+05 = 2.17×105である）
［参考実施例1］抗CLDN6/Dual-Fab三重特異性抗体の精製
ヘテロ二量体化のための各変異を有する重鎖定常領域および軽鎖定常領域を含有する発現ベクター内に、重鎖可変領域および軽鎖可変領域をクローニングした。
in vitroおよびin vivo研究向けの抗CLDN6/Dual-Fab三重特異性抗体の大規模調製のために、製造者の指示に従って、Expi293F細胞（Life technologies）を用いて、抗体を一過性に発現させた。最初に、組換え抗体を含有する培養培地をMabSelect Sure（GE healthcare）カラムで精製し、50 mM酢酸で溶出した。溶出した抗体を1.5 M Tris HCl/1 MアルギニンHCl緩衝液で中和した。次いで、ProA溶出物を、20 mMリン酸ナトリウム、pH6緩衝液中、カチオン交換HiTrap SP-HP（GE healthcare）カラム上に添加し、20 mMリン酸ナトリウム、1M NaCl、pH6緩衝液で溶出した。二重特異性抗体を含有する画分をプールし、濃縮した。高分子量および/または低分子量の構成成分を取り除くために、サイズ排除クロマトグラフィーを、P1緩衝液（20 mMヒスチジン、150 mMアルギニン、162.1 mM Asp、pH6.0）中、Superdex 200カラム（GE healthcare）を用いて実施した。精製した二重特異性抗体を濃縮し、-80℃の冷凍庫で保管した。
［参考実施例2］クローディン発現細胞の生成
ヒトCLDN6、ヒトCLDN9（配列番号：198）、ヒトCLDN3（配列番号：199）、ヒトCLDN4（配列番号：200）、マウスCLDN6（配列番号：201）、マウスCLDN9（配列番号：202）、マウスCLDN3（配列番号：203）、およびマウスCLDN4（配列番号：204）発現ベクターをそれぞれマウスプロB細胞株Ba/F3にトランスフェクトすることによって、ヒトCLDN6を発現するBa/F3細胞（hCLDN6/BaF）、ヒトCLDN9を発現するBa/F3細胞（hCLDN9/BaF）、ヒトCLDN3を発現するBa/F3細胞（hCLDN3/BaF）、ヒトCLDN4を発現するBa/F3細胞（hCLDN4/BaF）、マウスCLDN6を発現するBa/F3細胞（mCLDN6/BaF）、マウスCLDN9を発現するBa/F3細胞（mCLDN9/BaF）、マウスCLDN3を発現するBa/F3細胞（mCLDN3/BaF）、およびマウスCLDN4を発現するBa/F3細胞（mCLDN4/BaF）を樹立した。
クローディンファミリータンパク質は、抗体にとってアクセス可能な2つの細胞外ドメインを有する。ヒトCLDN6とヒトCLDN9とでの細胞外ドメイン間のアミノ酸配列類似性に関して、第1の細胞外ドメインはほぼ同一であり、第2の細胞外ドメインでは、異なるアミノ酸が2個だけ存在する（図6）。ヒトクローディン6の156位のグルタミン（配列番号：196または197に示される配列での156位）を、ロイシンに置換し、156位にヒトクローディン9と同じアミノ酸を含むヒトCLDN6変異体を作製した。このヒトCLDN6変異体をhCLDN6（Q156L）（配列番号：205）と名付けた。hCLDN6（Q156L）を安定的に発現するBa/F3トランスフェクタントを、上記に記載のものと類似の方法を用いて生成した。樹立したBa/F3トランスフェクタントをhCLDN6（Q156L）/BaFと名付けた。
293fectin（Invitrogen）を用いてヒトおよびマウスCLDN（CLDN6、CLDN9、CLDN3、およびCLDN4を含む）の発現ベクターをFreeStyle(商標)293-F細胞（Invitrogen）に導入することによって、ヒトおよびマウスCLDN3、4、6、および9を一過性に発現するFreeStyle(商標)293-Fトランスフェクタント細胞を生成した。生成したFreeStyle(商標)293-Fトランスフェクタント細胞をそれぞれ、hCLDN3/FS293、hCLDN4/FS293、hCLDN6/FS293、hCLDN9/FS293、mCLDN3/FS293、mCLDN4/FS293、mCLDN6/FS293、およびmCLDN9/FS293と名付けた。
本開示は、CD3およびCD137（4-1BB）に結合することができるが、CD3とCD137に同時には結合せず、かつCLDN6に結合することができる、多重特異性抗原結合分子を提供する。本開示の多重特異性抗原結合分子は、CD3/CD37およびCLDN6への結合を通じたCLDN6依存的様式で、増強されたT細胞依存性細胞傷害活性を示す。多重特異性抗原結合分子およびその医薬組成物は、種々のがん、特に、CLDN6陽性がんなどのCLDN6に関連するがんを治療するための免疫療法において使用するために、CLDN6を発現する細胞を標的とするのに用いることができる。

Claims (19)

  1. 第1の抗体可変領域と第2の抗体可変領域とによって構成され、CD3に結合する第1の抗原結合部分、及び、第3の抗体可変領域と第4の抗体可変領域とによって構成され、クローディン6に結合することができる第2の抗原結合部分を含む多重特異性抗原結合分子であって、以下の(1)〜(6)：
    (1) 配列番号：11の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：17のCDR 2、および配列番号：23のCDR 3を含む、第1の抗体可変領域；配列番号：32のCDR 1、配列番号：36のCDR 2、および配列番号：40のCDR 3を含む、第2の抗体可変領域；配列番号：7の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：13のCDR 2、および配列番号：19のCDR 3を含む、第3の抗体可変領域；ならびに配列番号：29のCDR 1、配列番号：33のCDR 2、および配列番号：37のCDR 3を含む、第4の抗体可変領域；
    (2) 配列番号：9の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：15のCDR 2、および配列番号：21のCDR 3を含む、第1の抗体可変領域；配列番号：31のCDR 1、配列番号：35のCDR 2、および配列番号：39のCDR 3を含む、第2の抗体可変領域；配列番号：8の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：14のCDR 2、および配列番号：20のCDR 3を含む、第3の抗体可変領域；ならびに配列番号：30のCDR 1、配列番号：34のCDR 2、および配列番号：38のCDR 3を含む、第4の抗体可変領域；
    (3) 配列番号：10の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：16のCDR 2、および配列番号：22のCDR 3を含む、第1の抗体可変領域；配列番号：31のCDR 1、配列番号：35のCDR 2、および配列番号：39のCDR 3を含む、第2の抗体可変領域；配列番号：8の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：14のCDR 2、および配列番号：20のCDR 3を含む、第3の抗体可変領域；ならびに配列番号：30のCDR 1、配列番号：34のCDR 2、および配列番号：38のCDR 3を含む、第4の抗体可変領域；
    (4) 配列番号：12の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：18のCDR 2、および配列番号：24のCDR 3を含む、第1の抗体可変領域；配列番号：32のCDR 1、配列番号：36のCDR 2、および配列番号：40のCDR 3を含む、第2の抗体可変領域；配列番号：7の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：13のCDR 2、および配列番号：19のCDR 3を含む、第3の抗体可変領域；ならびに配列番号：29のCDR 1、配列番号：33のCDR 2、および配列番号：37のCDR 3を含む、第4の抗体可変領域；
    (5) 配列番号：11の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：17のCDR 2、および配列番号：23のCDR 3を含む、第1の抗体可変領域；配列番号：32のCDR 1、配列番号：36のCDR 2、および配列番号：40のCDR 3を含む、第2の抗体可変領域；配列番号：29の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：33のCDR 2、および配列番号：37のCDR 3を含む、第3の抗体可変領域；ならびに配列番号：7のCDR 1、配列番号：13のCDR 2、および配列番号：19のCDR 3を含む、第4の抗体可変領域；
    (6) 配列番号：12の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：18のCDR 2、および配列番号：24のCDR 3を含む、第1の抗体可変領域；配列番号：32のCDR 1、配列番号：36のCDR 2、および配列番号：40のCDR 3を含む、第2の抗体可変領域；配列番号：29の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：33のCDR 2、および配列番号：37のCDR 3を含む、第3の抗体可変領域；ならびに配列番号：7のCDR 1、配列番号：13のCDR 2、および配列番号：19のCDR 3を含む、第4の抗体可変領域
    のいずれか一つを含む、多重特異性抗原結合分子。
  2. 第1の抗体可変領域と第2の抗体可変領域とによって構成され、CD137に結合する第1の抗原結合部分、及び、第3の抗体可変領域と第4の抗体可変領域とによって構成され、クローディン6に結合することができる第2の抗原結合部分を含む多重特異性抗原結合分子であって、以下の(1)〜(6)：
    (1) 配列番号：11の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：17のCDR 2、および配列番号：23のCDR 3を含む、第1の抗体可変領域；配列番号：32のCDR 1、配列番号：36のCDR 2、および配列番号：40のCDR 3を含む、第2の抗体可変領域；配列番号：7の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：13のCDR 2、および配列番号：19のCDR 3を含む、第3の抗体可変領域；ならびに配列番号：29のCDR 1、配列番号：33のCDR 2、および配列番号：37のCDR 3を含む、第4の抗体可変領域；
    (2) 配列番号：9の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：15のCDR 2、および配列番号：21のCDR 3を含む、第1の抗体可変領域；配列番号：31のCDR 1、配列番号：35のCDR 2、および配列番号：39のCDR 3を含む、第2の抗体可変領域；配列番号：8の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：14のCDR 2、および配列番号：20のCDR 3を含む、第3の抗体可変領域；ならびに配列番号：30のCDR 1、配列番号：34のCDR 2、および配列番号：38のCDR 3を含む、第4の抗体可変領域；
    (3) 配列番号：10の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：16のCDR 2、および配列番号：22のCDR 3を含む、第1の抗体可変領域；配列番号：31のCDR 1、配列番号：35のCDR 2、および配列番号：39のCDR 3を含む、第2の抗体可変領域；配列番号：8の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：14のCDR 2、および配列番号：20のCDR 3を含む、第3の抗体可変領域；ならびに配列番号：30のCDR 1、配列番号：34のCDR 2、および配列番号：38のCDR 3を含む、第4の抗体可変領域；
    (4) 配列番号：12の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：18のCDR 2、および配列番号：24のCDR 3を含む、第1の抗体可変領域；配列番号：32のCDR 1、配列番号：36のCDR 2、および配列番号：40のCDR 3を含む、第2の抗体可変領域；配列番号：7の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：13のCDR 2、および配列番号：19のCDR 3を含む、第3の抗体可変領域；ならびに配列番号：29のCDR 1、配列番号：33のCDR 2、および配列番号：37のCDR 3を含む、第4の抗体可変領域；
    (5) 配列番号：11の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：17のCDR 2、および配列番号：23のCDR 3を含む、第1の抗体可変領域；配列番号：32のCDR 1、配列番号：36のCDR 2、および配列番号：40のCDR 3を含む、第2の抗体可変領域；配列番号：29の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：33のCDR 2、および配列番号：37のCDR 3を含む、第3の抗体可変領域；ならびに配列番号：7のCDR 1、配列番号：13のCDR 2、および配列番号：19のCDR 3を含む、第4の抗体可変領域；
    (6) 配列番号：12の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：18のCDR 2、および配列番号：24のCDR 3を含む、第1の抗体可変領域；配列番号：32のCDR 1、配列番号：36のCDR 2、および配列番号：40のCDR 3を含む、第2の抗体可変領域；配列番号：29の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：33のCDR 2、および配列番号：37のCDR 3を含む、第3の抗体可変領域；ならびに配列番号：7のCDR 1、配列番号：13のCDR 2、および配列番号：19のCDR 3を含む、第4の抗体可変領域
    のいずれか一つを含む、多重特異性抗原結合分子。
  3. 第1の抗体可変領域と第2の抗体可変領域とによって構成され、CD3およびCD137に結合することができ、CD3またはCD137のいずれかに結合する第1の抗原結合部分、ならびに、第3の抗体可変領域と第4の抗体可変領域とによって構成され、クローディン6に結合することができる第2の抗原結合部分を含む多重特異性抗原結合分子であって、以下の(1)〜(6)：
    (1) 配列番号：11の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：17のCDR 2、および配列番号：23のCDR 3を含む、第1の抗体可変領域；配列番号：32のCDR 1、配列番号：36のCDR 2、および配列番号：40のCDR 3を含む、第2の抗体可変領域；配列番号：7の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：13のCDR 2、および配列番号：19のCDR 3を含む、第3の抗体可変領域；ならびに配列番号：29のCDR 1、配列番号：33のCDR 2、および配列番号：37のCDR 3を含む、第4の抗体可変領域；
    (2) 配列番号：9の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：15のCDR 2、および配列番号：21のCDR 3を含む、第1の抗体可変領域；配列番号：31のCDR 1、配列番号：35のCDR 2、および配列番号：39のCDR 3を含む、第2の抗体可変領域；配列番号：8の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：14のCDR 2、および配列番号：20のCDR 3を含む、第3の抗体可変領域；ならびに配列番号：30のCDR 1、配列番号：34のCDR 2、および配列番号：38のCDR 3を含む、第4の抗体可変領域；
    (3) 配列番号：10の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：16のCDR 2、および配列番号：22のCDR 3を含む、第1の抗体可変領域；配列番号：31のCDR 1、配列番号：35のCDR 2、および配列番号：39のCDR 3を含む、第2の抗体可変領域；配列番号：8の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：14のCDR 2、および配列番号：20のCDR 3を含む、第3の抗体可変領域；ならびに配列番号：30のCDR 1、配列番号：34のCDR 2、および配列番号：38のCDR 3を含む、第4の抗体可変領域；
    (4) 配列番号：12の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：18のCDR 2、および配列番号：24のCDR 3を含む、第1の抗体可変領域；配列番号：32のCDR 1、配列番号：36のCDR 2、および配列番号：40のCDR 3を含む、第2の抗体可変領域；配列番号：7の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：13のCDR 2、および配列番号：19のCDR 3を含む、第3の抗体可変領域；ならびに配列番号：29のCDR 1、配列番号：33のCDR 2、および配列番号：37のCDR 3を含む、第4の抗体可変領域；
    (5) 配列番号：11の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：17のCDR 2、および配列番号：23のCDR 3を含む、第1の抗体可変領域；配列番号：32のCDR 1、配列番号：36のCDR 2、および配列番号：40のCDR 3を含む、第2の抗体可変領域；配列番号：29の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：33のCDR 2、および配列番号：37のCDR 3を含む、第3の抗体可変領域；ならびに配列番号：7のCDR 1、配列番号：13のCDR 2、および配列番号：19のCDR 3を含む、第4の抗体可変領域；
    (6) 配列番号：12の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：18のCDR 2、および配列番号：24のCDR 3を含む、第1の抗体可変領域；配列番号：32のCDR 1、配列番号：36のCDR 2、および配列番号：40のCDR 3を含む、第2の抗体可変領域；配列番号：29の相補性決定領域（CDR）1、配列番号：33のCDR 2、および配列番号：37のCDR 3を含む、第3の抗体可変領域；ならびに配列番号：7のCDR 1、配列番号：13のCDR 2、および配列番号：19のCDR 3を含む、第4の抗体可変領域
    のいずれか一つを含む、多重特異性抗原結合分子。
  4. 第1の抗体可変領域と第2の抗体可変領域とによって構成され、CD3に結合する第1の抗原結合部分、及び、第3の抗体可変領域と第4の抗体可変領域とによって構成され、クローディン6に結合することができる第2の抗原結合部分を含む多重特異性抗原結合分子であって、以下の（I）〜（VI）：
    (I) 配列番号：5のアミノ酸配列を含む第1の抗体可変領域；配列番号：28のアミノ酸配列を含む第2の抗体可変領域；配列番号：1のアミノ酸配列を含む第3の抗体可変領域；および配列番号：25のアミノ酸配列を含む第4の抗体可変領域；
    (II) 配列番号：3のアミノ酸配列を含む第1の抗体可変領域；配列番号：27のアミノ酸配列を含む第2の抗体可変領域；配列番号：2のアミノ酸配列を含む第3の抗体可変領域；および配列番号：26のアミノ酸配列を含む第4の抗体可変領域；
    (III) 配列番号：4のアミノ酸配列を含む第1の抗体可変領域；配列番号：27のアミノ酸配列を含む第2の抗体可変領域；配列番号：2のアミノ酸配列を含む第3の抗体可変領域；および配列番号：26のアミノ酸配列を含む第4の抗体可変領域；
    (IV) 配列番号：6のアミノ酸配列を含む第1の抗体可変領域；配列番号：28のアミノ酸配列を含む第2の抗体可変領域；配列番号：1のアミノ酸配列を含む第3の抗体可変領域；および配列番号：25のアミノ酸配列を含む第4の抗体可変領域；
    (V) 配列番号：5のアミノ酸配列を含む第1の抗体可変領域；配列番号：28のアミノ酸配列を含む第2の抗体可変領域；配列番号：25のアミノ酸配列を含む第3の抗体可変領域；および配列番号：1のアミノ酸配列を含む第4の抗体可変領域；
    (VI) 配列番号：6のアミノ酸配列を含む第1の抗体可変領域；配列番号：28のアミノ酸配列を含む第2の抗体可変領域；配列番号：25のアミノ酸配列を含む第3の抗体可変領域；および配列番号：1のアミノ酸配列を含む第4の抗体可変領域
    のいずれか一つを含む、多重特異性抗原結合分子。
  5. 第1の抗体可変領域と第2の抗体可変領域とによって構成され、CD137に結合する第1の抗原結合部分、及び、第3の抗体可変領域と第4の抗体可変領域とによって構成され、クローディン6に結合することができる第2の抗原結合部分を含む多重特異性抗原結合分子であって、以下の（I）〜（VI）：
    (I) 配列番号：5のアミノ酸配列を含む第1の抗体可変領域；配列番号：28のアミノ酸配列を含む第2の抗体可変領域；配列番号：1のアミノ酸配列を含む第3の抗体可変領域；および配列番号：25のアミノ酸配列を含む第4の抗体可変領域；
    (II) 配列番号：3のアミノ酸配列を含む第1の抗体可変領域；配列番号：27のアミノ酸配列を含む第2の抗体可変領域；配列番号：2のアミノ酸配列を含む第3の抗体可変領域；および配列番号：26のアミノ酸配列を含む第4の抗体可変領域；
    (III) 配列番号：4のアミノ酸配列を含む第1の抗体可変領域；配列番号：27のアミノ酸配列を含む第2の抗体可変領域；配列番号：2のアミノ酸配列を含む第3の抗体可変領域；および配列番号：26のアミノ酸配列を含む第4の抗体可変領域；
    (IV) 配列番号：6のアミノ酸配列を含む第1の抗体可変領域；配列番号：28のアミノ酸配列を含む第2の抗体可変領域；配列番号：1のアミノ酸配列を含む第3の抗体可変領域；および配列番号：25のアミノ酸配列を含む第4の抗体可変領域；
    (V) 配列番号：5のアミノ酸配列を含む第1の抗体可変領域；配列番号：28のアミノ酸配列を含む第2の抗体可変領域；配列番号：25のアミノ酸配列を含む第3の抗体可変領域；および配列番号：1のアミノ酸配列を含む第4の抗体可変領域；
    (VI) 配列番号：6のアミノ酸配列を含む第1の抗体可変領域；配列番号：28のアミノ酸配列を含む第2の抗体可変領域；配列番号：25のアミノ酸配列を含む第3の抗体可変領域；および配列番号：1のアミノ酸配列を含む第4の抗体可変領域
    のいずれか一つを含む、多重特異性抗原結合分子。
  6. 第1の抗体可変領域と第2の抗体可変領域とによって構成され、CD3およびCD137に結合することができ、CD3またはCD137のいずれかに結合する第1の抗原結合部分、ならびに、第3の抗体可変領域と第4の抗体可変領域とによって構成され、クローディン6に結合することができる第2の抗原結合部分を含む多重特異性抗原結合分子であって、以下の（I）〜（VI）：
    (I) 配列番号：5のアミノ酸配列を含む第1の抗体可変領域；配列番号：28のアミノ酸配列を含む第2の抗体可変領域；配列番号：1のアミノ酸配列を含む第3の抗体可変領域；および配列番号：25のアミノ酸配列を含む第4の抗体可変領域；
    (II) 配列番号：3のアミノ酸配列を含む第1の抗体可変領域；配列番号：27のアミノ酸配列を含む第2の抗体可変領域；配列番号：2のアミノ酸配列を含む第3の抗体可変領域；および配列番号：26のアミノ酸配列を含む第4の抗体可変領域；
    (III) 配列番号：4のアミノ酸配列を含む第1の抗体可変領域；配列番号：27のアミノ酸配列を含む第2の抗体可変領域；配列番号：2のアミノ酸配列を含む第3の抗体可変領域；および配列番号：26のアミノ酸配列を含む第4の抗体可変領域；
    (IV) 配列番号：6のアミノ酸配列を含む第1の抗体可変領域；配列番号：28のアミノ酸配列を含む第2の抗体可変領域；配列番号：1のアミノ酸配列を含む第3の抗体可変領域；および配列番号：25のアミノ酸配列を含む第4の抗体可変領域；
    (V) 配列番号：5のアミノ酸配列を含む第1の抗体可変領域；配列番号：28のアミノ酸配列を含む第2の抗体可変領域；配列番号：25のアミノ酸配列を含む第3の抗体可変領域；および配列番号：1のアミノ酸配列を含む第4の抗体可変領域；
    (VI) 配列番号：6のアミノ酸配列を含む第1の抗体可変領域；配列番号：28のアミノ酸配列を含む第2の抗体可変領域；配列番号：25のアミノ酸配列を含む第3の抗体可変領域；および配列番号：1のアミノ酸配列を含む第4の抗体可変領域
    のいずれか一つを含む、多重特異性抗原結合分子。
  7. 天然型ヒトIgG1 Fcドメインと比較して、ヒトFcγ受容体に対する低下した結合親和性を示すFcドメインをさらに含み、
    前記FcドメインはE233、L234、L235、N297、P331、およびP329の群より選択される少なくとも１つの位置でのアミノ酸置換を含み、該アミノ酸の位置が、EUインデックスによりナンバリングされる、
    請求項１から請求項６のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合分子。
  8. 前記Fcドメインが、第1のFc領域サブユニットおよび第2のFc領域サブユニットで構成され、且つ以下の（e1）または（e2）：
    （e1）439位にGluを含む第1のFc領域サブユニット、および356位にLysを含む第2のFc領域サブユニット；
    （e2）349位にCys、366位にSer、368位にAla、および407位にValを含む、第1のFc領域サブユニット、ならびに354位にCysおよび366位にTrpを含む第2のFc領域サブユニット
    を含み、該アミノ酸位置が、EUインデックスによりナンバリングされる、請求項７に記載の多重特異性抗原結合分子。
  9. 第1および/または第2のFc領域サブユニットが、以下の（f1）または（f2）：
    （f1）234位にAla、235位にAla、および297位にAla；
    （f2）234位にAlaおよび235位にAla
    を含み、該アミノ酸位置が、EUインデックスによりナンバリングされる、請求項８に記載の多重特異性抗原結合分子。
  10. 前記Fcドメインが、天然型ヒトIgG1 Fcドメインと比較して、ヒトFcRnに対するより強力なFcRn結合親和性をさらに示し、前記第1および/または第2のFc領域サブユニットが、428位にLeu、434位にAla、438位にArg、および440位にGluを含み、該アミノ酸位置が、EUインデックスによりナンバリングされる、請求項７から請求項９のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合分子。
  11. 第1の抗原結合部分の第1の抗体可変領域が第1の重鎖定常領域に融合されており、第1の抗原結合部分の第2の抗体可変領域が第1の軽鎖定常領域に融合されており、第2の抗原結合部分の第3の抗体可変領域が第2の重鎖定常領域に融合されており、第2の抗原結合部分の第4の抗体可変領域が第2の軽鎖定常領域に融合されており、
    該定常領域が、以下の（g1）〜（g7）：
    （g1）配列番号：74のアミノ酸配列を含む第1の重鎖定常領域、配列番号：87のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖定常領域、配列番号：73のアミノ酸配列を含む第2の重鎖定常領域、および配列番号：88のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖定常領域；
    （g2）配列番号：74のアミノ酸配列を含む第1の重鎖定常領域、配列番号：85のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖定常領域、配列番号：81のアミノ酸配列を含む第2の重鎖定常領域、および配列番号：86のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖定常領域；
    （g3）配列番号：79のアミノ酸配列を含む第1の重鎖定常領域、配列番号：72のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖定常領域、配列番号：80のアミノ酸配列を含む第2の重鎖定常領域、および配列番号：89のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖定常領域；
    （g4）配列番号：83のアミノ酸配列を含む第1の重鎖定常領域、配列番号：87のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖定常領域、配列番号：82のアミノ酸配列を含む第2の重鎖定常領域、および配列番号：88のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖定常領域；
    （g5）配列番号：83のアミノ酸配列を含む第1の重鎖定常領域、配列番号：85のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖定常領域、配列番号：84のアミノ酸配列を含む第2の重鎖定常領域、および配列番号：86のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖定常領域；
    （g6）配列番号：77のアミノ酸配列を含む第1の重鎖定常領域、配列番号：72のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖定常領域、配列番号：78のアミノ酸配列を含む第2の重鎖定常領域、および配列番号：89のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖定常領域；
    （g7）配列番号：75のアミノ酸配列を含む第1の重鎖定常領域、配列番号：72のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖定常領域、配列番号：76のアミノ酸配列を含む第2の重鎖定常領域、および配列番号：89のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖定常領域
    のいずれか一つである、請求項１から請求項６のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合分子。
  12. 以下の(h03)、(h09)、(h15)、(h01)、(h02)、(h04)〜(h08)、(h10)〜(h14)、および(h16)〜(h18)のいずれか一つを含む、多重特異性抗原結合分子であって、第1の抗原結合部分はCD3に結合し、第2の抗原結合部分はクローディン6に結合することができる、多重特異性抗原結合分子：
    （h03）配列番号：42のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：51のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）からなる第２の抗原結合部分、ならびに配列番号：56のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：69のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）からなる第１の抗原結合部分；
    （h09）配列番号：46のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：51のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）からなる第２の抗原結合部分、ならびに配列番号：64のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：69のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）からなる第１の抗原結合部分；
    （h15）配列番号：49のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：53のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）からなる第２の抗原結合部分、ならびに配列番号：64のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：71のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）からなる第１の抗原結合部分；
    （h01）配列番号：41のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：50のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）からなる第２の抗原結合部分、ならびに配列番号：54のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：68のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）からなる第１の抗原結合部分；
    （h02）配列番号：41のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：50のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）からなる第２の抗原結合部分、ならびに配列番号：55のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：68のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）からなる第１の抗原結合部分；
    （h04）配列番号：42のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：51のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）からなる第２の抗原結合部分、ならびに配列番号：57のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：69のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）からなる第１の抗原結合部分；
    （h05）配列番号：44のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：52のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）からなる第２の抗原結合部分、ならびに配列番号：60のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：70のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）からなる第１の抗原結合部分；
    （h06）配列番号：44のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：52のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）からなる第２の抗原結合部分、ならびに配列番号：61のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：70のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）からなる第１の抗原結合部分；
    （h07）配列番号：45のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：50のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）からなる第２の抗原結合部分、ならびに配列番号：62のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：68のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）からなる第１の抗原結合部分；
    （h08）配列番号：45のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：50のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）からなる第２の抗原結合部分、ならびに配列番号：63のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：68のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）からなる第１の抗原結合部分；
    （h10）配列番号：46のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：51のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）からなる第２の抗原結合部分、ならびに配列番号：65のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：69のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）からなる第１の抗原結合部分；
    （h11）配列番号：47のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：52のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）からなる第２の抗原結合部分、ならびに配列番号：66のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：70のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）からなる第１の抗原結合部分；
    （h12）配列番号：47のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：52のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）からなる第２の抗原結合部分、ならびに配列番号：67のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：70のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）からなる第１の抗原結合部分；
    （h13）配列番号：48のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：53のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）からなる第２の抗原結合部分、ならびに配列番号：56のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：71のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）からなる第１の抗原結合部分；
    （h14）配列番号：48のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：53のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）からなる第２の抗原結合部分、ならびに配列番号：57のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：71のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）からなる第１の抗原結合部分；
    （h16）配列番号：49のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：53のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）からなる第２の抗原結合部分、ならびに配列番号：65のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：71のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）からなる第１の抗原結合部分；
    （h17）配列番号：43のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：52のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）からなる第２の抗原結合部分、ならびに配列番号：58のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：70のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）からなる第１の抗原結合部分；および
    （h18）配列番号：43のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：52のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）からなる第２の抗原結合部分、ならびに配列番号：59のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：70のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）からなる第１の抗原結合部分。
  13. 以下の(h03)、(h09)、(h15)、(h01)、(h02)、(h04)〜(h08)、(h10)〜(h14)、および(h16)〜(h18)のいずれか一つを含む、多重特異性抗原結合分子であって、第1の抗原結合部分はCD137に結合し、第2の抗原結合部分はクローディン6に結合することができる、多重特異性抗原結合分子：
    （h03）配列番号：42のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：51のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）からなる第２の抗原結合部分、ならびに配列番号：56のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：69のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）からなる第１の抗原結合部分；
    （h09）配列番号：46のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：51のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）からなる第２の抗原結合部分、ならびに配列番号：64のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：69のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）からなる第１の抗原結合部分；
    （h15）配列番号：49のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：53のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）からなる第２の抗原結合部分、ならびに配列番号：64のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：71のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）からなる第１の抗原結合部分；
    （h01）配列番号：41のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：50のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）からなる第２の抗原結合部分、ならびに配列番号：54のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：68のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）からなる第１の抗原結合部分；
    （h02）配列番号：41のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：50のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）からなる第２の抗原結合部分、ならびに配列番号：55のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：68のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）からなる第１の抗原結合部分；
    （h04）配列番号：42のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：51のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）からなる第２の抗原結合部分、ならびに配列番号：57のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：69のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）からなる第１の抗原結合部分；
    （h05）配列番号：44のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：52のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）からなる第２の抗原結合部分、ならびに配列番号：60のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：70のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）からなる第１の抗原結合部分；
    （h06）配列番号：44のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：52のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）からなる第２の抗原結合部分、ならびに配列番号：61のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：70のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）からなる第１の抗原結合部分；
    （h07）配列番号：45のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：50のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）からなる第２の抗原結合部分、ならびに配列番号：62のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：68のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）からなる第１の抗原結合部分；
    （h08）配列番号：45のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：50のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）からなる第２の抗原結合部分、ならびに配列番号：63のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：68のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）からなる第１の抗原結合部分；
    （h10）配列番号：46のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：51のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）からなる第２の抗原結合部分、ならびに配列番号：65のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：69のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）からなる第１の抗原結合部分；
    （h11）配列番号：47のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：52のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）からなる第２の抗原結合部分、ならびに配列番号：66のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：70のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）からなる第１の抗原結合部分；
    （h12）配列番号：47のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：52のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）からなる第２の抗原結合部分、ならびに配列番号：67のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：70のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）からなる第１の抗原結合部分；
    （h13）配列番号：48のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：53のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）からなる第２の抗原結合部分、ならびに配列番号：56のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：71のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）からなる第１の抗原結合部分；
    （h14）配列番号：48のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：53のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）からなる第２の抗原結合部分、ならびに配列番号：57のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：71のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）からなる第１の抗原結合部分；
    （h16）配列番号：49のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：53のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）からなる第２の抗原結合部分、ならびに配列番号：65のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：71のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）からなる第１の抗原結合部分；
    （h17）配列番号：43のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：52のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）からなる第２の抗原結合部分、ならびに配列番号：58のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：70のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）からなる第１の抗原結合部分；および
    （h18）配列番号：43のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：52のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）からなる第２の抗原結合部分、ならびに配列番号：59のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：70のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）からなる第１の抗原結合部分。
  14. 以下の(h03)、(h09)、(h15)、(h01)、(h02)、(h04)〜(h08)、(h10)〜(h14)、および(h16)〜(h18)のいずれか一つを含む、多重特異性抗原結合分子であって、第1の抗原結合部分はCD3およびCD137に結合することができ、CD3またはCD137のいずれかに結合し、第2の抗原結合部分はクローディン6に結合することができる、多重特異性抗原結合分子：
    （h03）配列番号：42のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：51のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）からなる第２の抗原結合部分、ならびに配列番号：56のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：69のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）からなる第１の抗原結合部分；
    （h09）配列番号：46のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：51のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）からなる第２の抗原結合部分、ならびに配列番号：64のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：69のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）からなる第１の抗原結合部分；
    （h15）配列番号：49のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：53のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）からなる第２の抗原結合部分、ならびに配列番号：64のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：71のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）からなる第１の抗原結合部分；
    （h01）配列番号：41のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：50のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）からなる第２の抗原結合部分、ならびに配列番号：54のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：68のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）からなる第１の抗原結合部分；
    （h02）配列番号：41のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：50のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）からなる第２の抗原結合部分、ならびに配列番号：55のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：68のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）からなる第１の抗原結合部分；
    （h04）配列番号：42のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：51のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）からなる第２の抗原結合部分、ならびに配列番号：57のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：69のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）からなる第１の抗原結合部分；
    （h05）配列番号：44のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：52のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）からなる第２の抗原結合部分、ならびに配列番号：60のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：70のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）からなる第１の抗原結合部分；
    （h06）配列番号：44のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：52のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）からなる第２の抗原結合部分、ならびに配列番号：61のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：70のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）からなる第１の抗原結合部分；
    （h07）配列番号：45のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：50のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）からなる第２の抗原結合部分、ならびに配列番号：62のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：68のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）からなる第１の抗原結合部分；
    （h08）配列番号：45のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：50のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）からなる第２の抗原結合部分、ならびに配列番号：63のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：68のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）からなる第１の抗原結合部分；
    （h10）配列番号：46のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：51のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）からなる第２の抗原結合部分、ならびに配列番号：65のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：69のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）からなる第１の抗原結合部分；
    （h11）配列番号：47のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：52のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）からなる第２の抗原結合部分、ならびに配列番号：66のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：70のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）からなる第１の抗原結合部分；
    （h12）配列番号：47のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：52のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）からなる第２の抗原結合部分、ならびに配列番号：67のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：70のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）からなる第１の抗原結合部分；
    （h13）配列番号：48のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：53のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）からなる第２の抗原結合部分、ならびに配列番号：56のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：71のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）からなる第１の抗原結合部分；
    （h14）配列番号：48のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：53のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）からなる第２の抗原結合部分、ならびに配列番号：57のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：71のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）からなる第１の抗原結合部分；
    （h16）配列番号：49のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：53のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）からなる第２の抗原結合部分、ならびに配列番号：65のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：71のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）からなる第１の抗原結合部分；
    （h17）配列番号：43のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：52のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）からなる第２の抗原結合部分、ならびに配列番号：58のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：70のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）からなる第１の抗原結合部分；および
    （h18）配列番号：43のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖1）および配列番号：52のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖2）からなる第２の抗原結合部分、ならびに配列番号：59のアミノ酸配列を含む重鎖（鎖3）および配列番号：70のアミノ酸配列を含む軽鎖（鎖4）からなる第１の抗原結合部分。
  15. 請求項１から請求項１４のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合分子をコードする、単離された核酸。
  16. 請求項１５に記載の核酸を含む、宿主細胞。
  17. 多重特異性抗原結合分子が産生されるように、請求項１６に記載の宿主細胞を培養する段階を含む、多重特異性抗原結合分子を産生する方法。
  18. 宿主細胞の培養から多重特異性抗原結合分子を回収する段階をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
  19. 請求項１から請求項１４のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合分子と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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TWI652279B (zh) 2013-11-11 2019-03-01 中外製藥股份有限公司 含改變的抗體可變區之抗原結合分子
US11952422B2 (en) 2017-12-05 2024-04-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule comprising altered antibody variable region binding CD3 and CD137
WO2023053282A1 (ja) * 2021-09-29 2023-04-06 中外製薬株式会社 がんの治療に用いるための細胞傷害誘導治療剤
WO2023131329A1 (en) * 2022-01-09 2023-07-13 I-Mab Biopharma Co., Ltd. Multispecific constructs and uses thereof

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3064512B1 (en) 2008-01-11 2023-08-30 The University of Tokyo Anti-cldn6 antibody
NZ716587A (en) 2009-11-11 2017-10-27 Ganymed Pharmaceuticals Ag Antibodies specific for claudin 6 (cldn6)
EP2404936A1 (en) 2010-07-06 2012-01-11 Ganymed Pharmaceuticals AG Cancer therapy using CLDN6 target-directed antibodies in vivo
PL3026064T3 (pl) 2011-05-13 2019-05-31 Ganymed Pharmaceuticals Gmbh Przeciwciała do leczenia nowotworu z ekspresją klaudyny 6
WO2014075788A1 (en) 2012-11-13 2014-05-22 Biontech Ag Agents for treatment of claudin expressing cancer diseases
WO2014075697A1 (en) * 2012-11-13 2014-05-22 Biontech Ag Agents for treatment of claudin expressing cancer diseases
RU2016122041A (ru) 2013-11-06 2017-12-11 ЭББВИ СТЕМСЕНТРКС ЭлЭлСи Новые анти-клаудин антитела и способы их применения
WO2018054484A1 (en) * 2016-09-23 2018-03-29 Biontech Ag Bispecific trivalent antibodies binding to claudin 6 or claudin18.2 and cd3 for treatment of claudin expressing cancer diseases
US11952422B2 (en) * 2017-12-05 2024-04-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule comprising altered antibody variable region binding CD3 and CD137
JP2021510064A (ja) * 2018-01-05 2021-04-15 中外製薬株式会社 細胞傷害誘導治療剤
WO2020067399A1 (en) 2018-09-28 2020-04-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule comprising altered antibody variable region
CN113950485A (zh) 2019-07-10 2022-01-18 中外制药株式会社 密蛋白-6结合分子及其用途

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