JP6960224B2 - 生体物質定量方法、病理診断支援システム及びプログラム - Google Patents
生体物質定量方法、病理診断支援システム及びプログラム Download PDFInfo
- Publication number
- JP6960224B2 JP6960224B2 JP2016570607A JP2016570607A JP6960224B2 JP 6960224 B2 JP6960224 B2 JP 6960224B2 JP 2016570607 A JP2016570607 A JP 2016570607A JP 2016570607 A JP2016570607 A JP 2016570607A JP 6960224 B2 JP6960224 B2 JP 6960224B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- biological substance
- fluorescence
- primary antibody
- fluorescent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/585—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with a particulate label, e.g. coloured latex
- G01N33/587—Nanoparticles
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6875—Nucleoproteins
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
例えば、Ki67タンパクのように、細胞***中に核内に発現するタンパクの発現を評価して、様々な腫瘍の増殖性・悪性度が判断されている。
蛍光物質を内包した蛍光粒子を含む染色試薬を用いて染色された標本から、前記蛍光物質の蛍光に基づいて生体物質を定量する生体物質定量方法において、
前記標本の明視野画像から細胞核が抽出された画像である細胞核画像を生成する工程と、
前記標本における前記生体物質の発現を蛍光輝点で表す蛍光画像を入力する入力工程と、
前記細胞核画像及び前記蛍光輝点の蛍光に基づいて前記生体物質の発現量を定量する定量工程と、
を含み、
前記生体物質は細胞核に存在するタンパク質であるKi67、又は細胞核に存在するエストロゲン受容体(ER)であり、
前記蛍光粒子は前記生体物質を抗原とする一次抗体であるモノクローナル抗体を介して前記生体物質に結合し、前記一次抗体を抗原とする二次抗体であるモノクローナル抗体を介して前記生体物質に結合し、
前記生体物質がKi67である場合、前記一次抗体はSP6であり、前記二次抗体はLO−RG1、またはRG−16であり、もしくは前記一次抗体はEPR3610であり、前記二次抗体はLO−RG1、またはRG−16であり、もしくは前記一次抗体はB126.1であり、前記二次抗体はLO−MG1−13、またはLO−MG2a―7であり、もしくは前記一次抗体は4A1であり、前記二次抗体はLO−MG1−13、またはLO−MG2a―7であり、もしくは前記一次抗体はMIB−1であり、前記二次抗体はLO−MG1−13、またはSB77eであり、もしくは前記一次抗体は5D7であり、前記二次抗体はLO−RG1であり、
前記生体物質がエストロゲン受容体(ER)である場合、前記一次抗体は6F11であり、前記二次抗体はLO−MG1−13であり、もしくは前記一次抗体は14C8であり、前記二次抗体はLO−MG7であることを特徴とする生体物質定量方法が提供される。
前記蛍光粒子は、前記一次抗体を抗原とする二次抗体を介して前記生体物質に結合し、
前記二次抗体はモノクローナル抗体であることを特徴とする生体物質定量方法が提供される。
複数種類の抗体を含むポリクローナル抗体は、抗原上の複数の抗原決定基と反応するため、ポリクローナル抗体を用いた免疫染色によれば、モノクローナル抗体を用いた場合と比較して、特定タンパクの発現を高感度に検出できることが知られる。しかし、本発明は、モノクローナル抗体を用いても生体物質の発現を高感度に検出可能であるという点で、従来の染色方法による生体物質の定量とは特徴を異にする。
前記染色試薬は、相異なる発光波長の蛍光物質を含む2種類以上の試薬を混合した混合試薬であり、
前記2種類以上の試薬は、前記相異なる発光波長の蛍光物質を用いて同一種類の前記生体物質を染色可能であり、
前記入力工程において、前記標本における前記生体物質の発現を前記混合試薬に含まれる蛍光物質の蛍光に基づく蛍光輝点で表す蛍光画像が、前記蛍光物質の発光波長ごとに入力され、
前記定量工程において、前記蛍光物質の発光波長ごとに入力された前記蛍光画像における前記蛍光輝点に基づいて、前記生体物質量が定量され、
前記蛍光物質の発光波長ごとに定量された前記生体物質量が加算される加算工程を有することを特徴とする生体物質定量方法が提供される。
定量する生体物質が、例えばKi67のように細胞核に高密度に発現する核タンパク質である場合、互いに近接した複数の生体物質の発現に対応する複数の蛍光粒子は1つの輝点として計測される確率が高く、定量性が悪化する。その場合には、同じ種類の生体物質を染色可能な2色以上の蛍光粒子を用いて染色を行うことにより、顕微鏡の分解能の限界よりも近接した粒子を識別して観察することができるため、分解能が比較的低い顕微鏡を用いた場合であっても、標本内の生体物質の発現量の定量精度を高めることができる。
図1に、本発明の生体物質定量方法を用いた病理診断支援システム100の全体構成例を示す。病理診断支援システム100は、所定の染色試薬で染色された標本の顕微鏡画像を取得し、取得された顕微鏡画像を解析することにより、観察対象の組織標本における特定の生体物質の発現を定量的に表す特徴量を出力するシステムである。
さらに、病理診断支援システム100は標本の染色を自動で行う染色装置を備えても良い。
顕微鏡画像取得装置1Aは、照射手段、結像手段、撮像手段、通信I/F等を備えて構成されている。照射手段は、光源、フィルター等により構成され、スライド固定ステージに載置されたスライド上の組織標本に光を照射する。結像手段は、接眼レンズ、対物レンズ等により構成され、照射した光によりスライド上の組織標本から発せられる透過光、反射光、又は蛍光を結像する。撮像手段は、CCD(Charge Coupled Device)センサー等を備え、結像手段により結像面に結像される像を撮像して顕微鏡画像のデジタル画像データを生成する顕微鏡設置カメラである。通信I/Fは、生成された顕微鏡画像の画像データを画像処理装置2Aに送信する。本実施の形態において、顕微鏡画像取得装置1Aは、明視野観察に適した照射手段及び結像手段を組み合わせた明視野ユニット、蛍光観察に適した照射手段及び結像手段を組み合わせた蛍光ユニットが備えられており、ユニットを切り替えることにより明視野/蛍光を切り替えることが可能である。
図2に、画像処理装置2Aの機能構成例を示す。図2に示すように、画像処理装置2Aは、制御部21、操作部22、表示部23、通信I/F24、記憶部25等を備えて構成され、各部はバス26を介して接続されている。
その他、画像処理装置2Aは、LANアダプターやルーター等を備え、LAN等の通信ネットワークを介して外部機器と接続される構成としてもよい。
明視野画像は、H(ヘマトキシリン)染色試薬、HE(ヘマトキシリン−エオジン)染色試薬を用いて染色された組織標本を、顕微鏡画像取得装置1Aにおいて明視野で拡大結像及び撮影することにより得られる顕微鏡画像であって、当該組織標本における細胞の形態を表す細胞形態画像である。ヘマトキシリンは青紫色の色素であり、細胞核、骨組織、軟骨組織の一部、漿液成分など(好塩基性の組織等)を染色する。エオジンは赤〜ピンク色の色素であり、細胞質、軟部組織の結合組織、赤血球、線維素、内分泌顆粒など(好酸性の組織等)を染色する。図3に、HE染色を行った組織標本を撮影した明視野画像の一例を示す。
蛍光画像は、特定の生体物質を特異的に標識する蛍光物質を内包したナノ粒子(蛍光粒子)を含む染色試薬を用いて染色された組織標本に対し、顕微鏡画像取得装置1Aにおいて所定波長の励起光を照射して蛍光粒子を発光(蛍光)させ、この蛍光を拡大結像及び撮影することにより得られる顕微鏡画像である。即ち、蛍光画像に現れる蛍光は、組織標本における、特定の生体物質の発現を示すものである。図4に、蛍光画像の一例を示す。
ここで、蛍光画像の取得方法について、この蛍光画像の取得に際して用いられる染色試薬、染色試薬による組織標本の染色方法等も含めて詳細に説明する。
蛍光画像の取得のための染色試薬に用いられる蛍光物質としては、蛍光有機色素及び量子ドット(半導体粒子)を挙げることができる。200〜700nmの範囲内の波長の紫外〜近赤外光により励起されたときに、400〜1100nmの範囲内の波長の可視〜近赤外光の発光を示すことが好ましい。
本実施の形態において蛍光物質内包ナノ粒子(蛍光粒子)とは、蛍光物質が樹脂やシリカを母体とするナノ粒子の内部又は表面に分散されたものをいい、蛍光物質とナノ粒子自体とが化学的に結合していても、結合していなくてもよい。
量子ドットは必要に応じて、有機ポリマー等により表面処理が施されているものを用いてもよい。例えば、表面カルボキシ基を有するCdSe/ZnS(インビトロジェン社製)、表面アミノ基を有するCdSe/ZnS(インビトロジェン社製)等が挙げられる。
なお、蛍光粒子の平均粒径の算出においては、まず、走査型電子顕微鏡(SEM)を用いて撮影した電子顕微鏡写真から蛍光粒子の断面積を計測し、各計測値を円の面積としたときの円の直径を粒径とする。本願においては、1000個の蛍光粒子の粒径を計測し、その算術平均を平均粒径とした。変動係数も、1000個の粒子の粒径分布から算出した値とした。
蛍光粒子は、目的とする生体物質と特異的に結合及び/又は反応するために表面修飾を施される。目的とする生体物質は、それと特異的に結合する物質が存在するものであれば特に限定されるものではないが、代表的にはタンパク質(ペプチド)および核酸(オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド)、抗体等が挙げられる。したがって、そのような目的とする生体物質に結合する物質としては、前記タンパク質を抗原として認識する抗体やそれに特異的に結合する他のタンパク質等、および前記核酸にハイブリタイズする塩基配列を有する核酸等が挙げられる。具体的には、細胞核に存在するタンパク質であるKi67に特異的に結合する抗Ki67抗体、細胞核に存在するエストロゲン受容体(ER)に特異的に結合する抗ER抗体、細胞骨格を形成するアクチンに特異的に結合する抗アクチン抗体等があげられる。中でも抗Ki67抗体及び抗ER抗体を蛍光粒子に結合させたものは、乳癌の投薬選定に用いることができ、好ましい。
一次抗体及び二次抗体は、蛍光粒子が特定の生体物質に特異的に結合できる組み合わせの抗体を任意に用いることができ、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれを用いても良い。
以下、組織標本の染色方法について述べるが、本発明は組織標本に限定されるものではなく、基板上に固定した細胞等の標本にも適用可能である。
また、以下に説明する染色方法が適用できる標本の作製法は特に限定されず、公知の方法により作製されたものを用いることができる。
キシレンを入れた容器に組織標本を浸漬させ、パラフィンを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、3分以上30分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でキシレンを交換してもよい。
次いで、エタノールを入れた容器に組織標本を浸漬させ、キシレンを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、3分以上30分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でエタノールを交換してもよい。
次いで、水を入れた容器に組織標本を浸漬させ、エタノールを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、3分以上30分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中で水を交換してもよい。
公知の方法にならい、目的とする生体物質の賦活化処理を行う。賦活化条件に特に定めはないが、賦活液としては、0.01M クエン酸緩衝液(pH6.0)、1mM EDTA溶液(pH8.0)、5% 尿素、0.1M トリス塩酸緩衝液等を用いることができる。加熱機器は、オートクレーブ、マイクロウェーブ、圧力鍋、ウォーターバス等を用いることができる。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。温度は50−130℃、時間は5−30分で行うことができる。
次いで、PBS(Phosphate Buffered Saline:リン酸緩衝生理食塩水)を入れた容器に、賦活化処理後の標本を浸漬させ、洗浄を行う。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、3分以上30分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でPBSを交換してもよい。
表面修飾された蛍光粒子のPBS分散液を組織標本に載せ、目的とする生体物質と反応させる。蛍光粒子の表面修飾を変えることにより、さまざまな生体物質に対応した染色が可能となる。数種類の表面修飾を施された蛍光粒子を用いる場合には、それぞれの蛍光粒子PBS分散液を予め混合しておいてもよいし、別々に順次組織標本に載せてもよい。
温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。反応時間は、30分以上24時間以下であることが好ましい。
蛍光粒子による染色を行う前に、BSA含有PBS等、公知のブロッキング剤を滴下することが好ましい。
次いで、PBSを入れた容器に、染色後の組織標本を浸漬させ、未反応蛍光粒子の除去を行う。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、3分以上30分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でPBSを交換してもよい。カバーガラスを組織標本に載せ、封入する。必要に応じて市販の封入剤を使用してもよい。
なお、HE染色試薬を用いて染色を行う場合、カバーガラスによる封入前にHE染色を行う。
染色した組織標本に対し顕微鏡画像取得装置1Aを用いて、広視野の顕微鏡画像(蛍光画像)を取得する。顕微鏡画像取得装置1Aにおいて、染色試薬に用いた蛍光物質の吸収極大波長及び蛍光波長に対応した励起光源及び蛍光検出用光学フィルターを選択する。
以下、病理診断支援システム100において、上記説明した蛍光画像及び明視野画像を取得して解析を行う動作について説明する。ここでは、HE染色試薬及び特定のタンパク質(以下、特定タンパクと呼ぶ。)を認識する生体物質認識部位が結合した蛍光粒子を含む染色試薬を用いて染色された組織標本を観察対象とする場合を例にとり説明するが、これに限定されるものではない。
その後、顕微鏡画像取得装置1Aにおいて、(a1)〜(a5)の手順により明視野画像及び蛍光画像が取得される。
(a1)操作者は、HE染色試薬と蛍光粒子を含む染色試薬とにより染色された組織標本をスライドに載置し、そのスライドを顕微鏡画像取得装置1Aのスライド固定ステージに設置する。
(a2)明視野ユニットに設定し、撮影倍率、ピントの調整を行い、組織上の観察対象の領域を視野に納める。
(a3)撮像手段で撮影を行って明視野画像の画像データを生成し、画像処理装置2Aに画像データを送信する。
(a4)ユニットを蛍光ユニットに変更する。
(a5)視野及び撮影倍率を変えずに、励起光及びフィルターを適宜選択して、染色試薬に含まれる蛍光粒子を励起させた状態で撮像手段により撮影を行って、染色試薬が発する蛍光を撮影した蛍光画像の画像データを生成し、画像処理装置2Aに画像データを送信する。
(a5)視野及び撮影倍率を変えずに、励起光及びフィルターを適宜選択して、染色試薬Aに含まれる蛍光粒子を励起させた状態で撮像手段により撮影を行って、染色試薬Aが発する蛍光を撮影した第一の蛍光画像の画像データを生成し、画像処理装置2Aに画像データを送信する。
(a6)視野及び撮影倍率を変えずに、励起光及びフィルターを適宜選択して、染色試薬Bに含まれる蛍光粒子を励起させた状態で撮像手段により撮影を行って、染色試薬Bが発する蛍光を撮影した第二の蛍光画像の画像データを生成し、画像処理装置2Aに画像データを送信する。
図5に、画像処理装置2Aにおける画像解析処理のフローチャートを示す。図5に示す画像解析処理は、制御部21と記憶部25に記憶されているプログラムとの協働により実行される。
図6に、ステップS2における処理の詳細フローを示す。ステップS2の処理は、制御部21と記憶部25に記憶されているプログラムとの協働により実行される。
次いで、モノクロ画像に対し予め定められた閾値を用いて閾値処理を施し、各画素の値を二値化した二値化画像を生成する(ステップS202)。
図8に、ステップS4における処理の詳細フローを示す。ステップS4の処理は、制御部21と記憶部25に記憶されているプログラムとの協働により実行される。
なお、ステップS402の閾値処理の前に細胞自家蛍光や他の不要信号成分等のノイズ除去処理が施されてもよく、ガウシアンフィルタ等のローパスフィルタや二次微分等のハイパスフィルタが好ましく用いられる。
本発明は、上記実施形態の核タンパク質の定量を実施するためのキットとしての態様を含む。キットの構成要素としては、上記実施形態で用いられる蛍光粒子が含まれる。さらに、定量する核タンパク質の種類に応じて選択される一次抗体及び二次抗体が含まれることが好ましく、さらに、細胞の形態を抽出するための染色試薬(例えば、HE染色試薬)、染色工程で用いられる希釈液、封入剤、定量方法を記載した説明書などが含まれることが好ましい。
かかる場合、上述したように、蛍光粒子の発光波長ごとに蛍光画像を取得して各蛍光画像に対してステップS3〜S7の処理を行っても良いし、また、例えば、ステップS401においてフィルターワーク等を用いてそれぞれの色成分を抽出し、その抽出した色成分(波長成分)ごとにステップS402〜S5の処理を実行し、ステップS6〜S7において、細胞画像と色成分毎に作成された蛍光粒子画像とを加算して、各色成分の蛍光粒子数を算出してもよい。
混合する蛍光粒子の色数が多いほど、隣接する特定タンパクが異なる蛍光粒子により染め分けられる確率が増加するため、高密度に分布した蛍光物質を分離して算出される確率が高まり、正確な定量が可能となる。
蛍光物質としてAlexa488(ライフテクノロジーズ社製)2.5mgを水22.5mLに加えた後、ホットスターラー上で70℃で20分間加熱し、メラミン樹脂ニカラックMX−035(日本カーバイド工業社製、重量平均重合度:1.5)1.5gを加え、さらに5分間加熱撹拌した。ギ酸100μLを加え、60℃で20分間加熱撹拌した後、室温で放冷した。冷却後、反応混合物を遠心用チューブに入れて遠心分離機に12,000rpmで20分間かけ、上澄みを除去した。この粒子を1m1の純水中に再分散して、蛍光物質内包メラミンナノ粒子としてブチルヒドロキシトルエン・色素内包メラミン樹脂ナノ粒子を得た。
得られたAlexa488内包ナノ粒子を走査型電子顕微鏡(SEM;日立社製 S−800型)で観察したところ、平均粒径は150nmであった。
上記(A)で得られた蛍光物質内包メラミンナノ粒子0.1mgをEtOH1.5mL中に分散し、アミンプロピルトリメトキシシランLS−3150(信越化学工業社製)2μLを加えて8時間反応させて表面アミノ化処理を行なった。
次いで、EDTA(エチレンジアミン四酢酸)を2mM含有したPBS(リン酸緩衝液生理的食塩水)を用いて3nMに調整し、この溶液に最終濃度10mMとなるようSM(PEG)12(サーモサイエンティフィック社製、succinimidyl-[(N-maleomidopropionamid)-dodecaethyleneglycol]ester)を混合し、1時間反応させた。この混合液を10,000Gで20分遠心分離を行い、上澄みを除去した後、EDTAを2mM含有したPBSを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を3回行うことで末端にマレイミド基が付いた蛍光物質内包メラミンナノ粒子を得た。
一方、ストレプトアビジン(和光純薬社製)をN-succinimidyl S-acetylthioacetate(SATA)を用いてチオール基付加処理を行ったのち、ゲルろ過カラムによるろ過を行い、蛍光物質内包メラミンナノ粒子に結合可能なストレプトアビジン溶液を得た。
上記の蛍光物質内包メラミンナノ粒子とストレプトアビジンとを、EDTAを2mM含有したPBS中で混合し、1時間反応させた。10mMメルカプトエタノールを添加し、反応を停止させた。得られた溶液を遠心フィルターで濃縮後、精製用ゲルろ過カラムを用いて未反応ストレプトアビジン等を除去し、ストレプトアビジン結合蛍光物質内包メラミンナノ粒子を作成した。作成したストレプトアビジン結合蛍光物質内包メラミンナノ粒子は4℃で保存し、組織染色に使用する直前に、超音波分散及びブロッキング溶液(Dako社製 抗体希釈用緩衝液、Antibody Diluent with Background Reducing Components、製造番号S3022)を用いた希釈を行い、ナノ粒子の最終濃度が0.2nMとなるように調整した染色試薬を作成した。
ヒト***組織をホルマリン固定及びパラフィン包埋した組織アレイ(US-BioMax社製、商品名:パラフィン包埋乳がん組織アレイ、商品番号:BR243)中の、同一検体の隣接切片を、以下の手順により染色した。
まず、組織標本に対し、キシレンを用いた脱パラフィン処理、及びキシレンを除去する親水処理を行った。次いで、クエン酸バッファー(pH6.0)に入れた組織標本を加熱(121℃、5分間)して賦活化した。
具体的には、例えば、一次抗体としてKi67を抗原とするマウスモノクローナル抗体であるMIB−1(Dako社製)を上記ブロッキング溶液で希釈して0.61μh/mlとした試薬を、ブロッキング後の組織標本にのせて、4℃で一晩放置した。組織標本をPBSで洗浄した後、二次抗体として、モノクローナル抗マウス抗体であるLO-MG1-13(AbD社製、No.MCA1289)のビオチン標識体を上記ブロッキング溶液で希釈して2μg/mlとした試薬を組織標本にのせて、室温で30分放置した。なお、二次抗体のビオチン標識は定法に従い、Biotin Labeling Kit-SH(同仁科学研究所社製、製品コード:LK10)を使用して実施した。
次いで、市販のHE染色試薬を用いた細胞核の染色、及びエンテランニュー(メルク社製)を用いた封入を行った。
なお、表1及び表2には、各抗体の名称として、モノクローナル抗体についてはクローン名、ポリクローナル抗体については商品コードが記載されている。一次抗体のクローン名の下の括弧内には、一次抗体を作成した動物種(ホスト)が示されている。SP6、EPR3610、B126.1、4A1、5D7、RG-16、SB115h、SB77e、6F11、14C8、1D5、Ab15580、Ab97109、Ab97042、Ab97052、Ab97047、Ab97106、及びAb30656はアブカム社製、LO-MG7はアクリスアンチボディーズ社製、LO-RG1及びLO-MG2a-7はAbD社製、Sc-7877はサンタクルーズバイオテクノロジー社製、LS-C178370はライフスパンバイオサイエンス社製である。
ニコン社製超解像顕微鏡 N-SIMを用いて、染色された組織標本の顕微鏡画像(明視野画像及び蛍光画像)を取得した。蛍光画像は、励起波長490nmの励起光下、中心波長約540nmの蛍光を撮影した画像である。
また、取得した蛍光画像から、特開2013−57631号公報に記載の方法により、輝点数の計測を行った。具体的には、取得した蛍光画像から、予め設定された上限閾値および下限閾値に基づいて、輝点領域が抽出された2値化画像を作成した。この上限・下限閾値は、例えば、大津の判別分析法(大津展之;判別及び最小2乗基準に基づく自動しきい値選定法、電子通信学会論文誌、Vol.J63-D, No4, pp.349-356, 1980)による2値化などのような統計的閾値決定法を利用してもよい。作成された2値化画像に、ジーオングストローム社製の輝点計測ソフト「G-count」を用いて輝点領域当たりの輝点数を計測した。
次いで、明視野画像と蛍光画像とを重ね合わせ、1画像当たりの細胞核内及び細胞核外の領域に発現する輝点数を算出した。
本発明の蛍光粒子を用いた蛍光染色と、DAB法による染色の結果を、同じ一次抗体及び二次抗体の組み合わせを用いた場合で比較すると、本発明の方法によれば、特定タンパク(Ki67及びER)の発現率(全細胞のうち、特定タンパクを発現している細胞の割合)の評価に関しては、DAB法と同等の評価が得られた。
表1及び表2は、それぞれ、本発明の方法を用いてKi67及びERを蛍光染色した標本における1画像当たりの細胞核外の輝点数に基づく評価を示す。細胞核外の輝点数が9個以下の場合は◎、10〜99個の場合は○、100〜200個の場合は△と評価する。「―」は、評価を行っていないことを示す。
Alexa488の代わりにAlexa647(ライフテクノロジーズ社製)を用いた他は、実施例の(A)〜(B)と同様の手順により、Alexa647を内包するストレプトアビジン結合蛍光物質内包メラミンナノ粒子を作成し、これを0.2nM含む染色試薬を作成した。さらに、実施例で作成したAlexa488を用いた染色試薬と同量ずつ混合して、2種類の蛍光粒子の合計濃度が0.2nMとなるように調整した混合試薬を準備した。
次いで、実施例の(C)の染色工程において、染色試薬として混合試薬を用いた他は同様にして、組織染色を実施した。
実施例と同様の、特定タンパクの発現率をDAB法による染色法と比較する評価、及び1画像当たりの細胞核外輝点数に基づく定量精度の評価については、実施例と同等の結果が得られた。
1画像当たりの細胞核内の輝点数はいずれの標本においてもほぼ同じであり、その数は約10000個であった。このように、蛍光波長の異なる2種類の蛍光粒子を用いたことにより、実施例よりも多数の輝点数が計測された理由は、以下のように考察される。
しかし、本変形例では、蛍光波長の異なる2種類の蛍光粒子を用いて染色を行うことにより、複数の蛍光粒子が顕微鏡の解像度よりも近接して存在している場合であっても、これらの蛍光粒子の蛍光波長が異なっていれば、分離した輝点として分離して計測できる。そのため、輝点数がより正確に計測できるようになったと考察できる。
さらに、一次抗体及び二次抗体の少なくとも一方、好ましくは両方をモノクローナル抗体とすれば、特定タンパクに非特異的な輝点が減少し、定量結果の信頼度が高い。
2A 画像処理装置
3A ケーブル
21 制御部
22 操作部
23 表示部
24 通信I/F
25 記憶部
26 バス
100 病理診断支援システム
Claims (7)
- 蛍光物質を内包した蛍光粒子を含む染色試薬を用いて染色された標本から、前記蛍光物質の蛍光に基づいて生体物質を定量する生体物質定量方法において、
前記標本の明視野画像から細胞核が抽出された画像である細胞核画像を生成する工程と、
前記標本における前記生体物質の発現を蛍光輝点で表す蛍光画像を入力する入力工程と、
前記細胞核画像及び前記蛍光輝点の蛍光に基づいて前記生体物質の発現量を定量する定量工程と、
を含み、
前記生体物質は細胞核に存在するタンパク質であるKi67、又は細胞核に存在するエストロゲン受容体(ER)であり、
前記蛍光粒子は前記生体物質を抗原とする一次抗体であるモノクローナル抗体を介して前記生体物質に結合し、前記一次抗体を抗原とする二次抗体であるモノクローナル抗体を介して前記生体物質に結合し、
前記生体物質がKi67である場合、前記一次抗体はSP6であり、前記二次抗体はLO−RG1、またはRG−16であり、もしくは前記一次抗体はEPR3610であり、前記二次抗体はLO−RG1、またはRG−16であり、もしくは前記一次抗体はB126.1であり、前記二次抗体はLO−MG1−13、またはLO−MG2a―7であり、もしくは前記一次抗体は4A1であり、前記二次抗体はLO−MG1−13、またはLO−MG2a―7であり、もしくは前記一次抗体はMIB−1であり、前記二次抗体はLO−MG1−13、またはSB77eであり、もしくは前記一次抗体は5D7であり、前記二次抗体はLO−RG1であり、
前記生体物質がエストロゲン受容体(ER)である場合、前記一次抗体は6F11であり、前記二次抗体はLO−MG1−13であり、もしくは前記一次抗体は14C8であり、前記二次抗体はLO−MG7であることを特徴とする生体物質定量方法。 - 蛍光物質を内包した蛍光粒子を含む染色試薬を用いて染色された標本から、前記蛍光物質の蛍光に基づいて生体物質を定量する生体物質定量方法において、
前記標本の明視野画像から細胞核が抽出された画像である細胞核画像を生成する工程と、
前記標本における前記生体物質の発現を蛍光輝点で表す蛍光画像を入力する入力工程と、
前記細胞核画像及び前記蛍光輝点の蛍光に基づいて前記生体物質の発現量を定量する定量工程と、
を含み、
前記生体物質は細胞核に存在するタンパク質であるKi67、又は細胞核に存在するエストロゲン受容体(ER)であり、
前記蛍光粒子は前記生体物質を抗原とする一次抗体であるモノクローナル抗体を介して前記生体物質に結合し、前記一次抗体を抗原とする二次抗体であるモノクローナル抗体を介して前記生体物質に結合し、
前記生体物質がKi67である場合、前記一次抗体はSP6であり、前記二次抗体はLO−RG1、またはRG−16であり、もしくは前記一次抗体はEPR3610であり、前記二次抗体はLO−RG1、またはRG−16であり、もしくは前記一次抗体はB126.1であり、前記二次抗体はLO−MG1−13、またはLO−MG2a―7であり、もしくは前記一次抗体は4A1であり、前記二次抗体はLO−MG1−13、またはLO−MG2a―7であり、もしくは前記一次抗体はMIB−1であり、前記二次抗体はLO−MG1−13、またはSB77eであり、もしくは前記一次抗体は5D7であり、前記二次抗体はLO−RG1であり、
前記生体物質がエストロゲン受容体(ER)である場合、前記一次抗体は6F11であり、前記二次抗体はLO−MG1−13であり、もしくは前記一次抗体は14C8であり、前記二次抗体はLO−MG7であり、
前記染色試薬は、相異なる発光波長の蛍光物質を含む2種類以上の試薬を混合した混合試薬であり、
前記2種類以上の試薬は、前記相異なる発光波長の蛍光物質を用いて同一種類の前記生体物質を染色可能であり、
前記入力工程において、前記標本における前記生体物質の発現を前記混合試薬に含まれる蛍光物質の蛍光に基づく蛍光輝点で表す蛍光画像が、前記蛍光物質の発光波長ごとに入力され、
前記定量工程において、前記蛍光物質の発光波長ごとに入力された前記蛍光画像における前記蛍光輝点の蛍光に基づいて、前記生体物質の発現量が定量され、
前記蛍光物質の発光波長ごとに定量された前記生体物質の発現量を加算する加算工程を有することを特徴とする生体物質定量方法。 - 前記染色試薬は、相異なる発光波長の蛍光物質を含む3種類以上の試薬を混合した混合試薬であり、
前記3種類以上の試薬は、前記相異なる発光波長の蛍光物質を用いて同一種類の前記生体物質を染色可能であることを特徴とする請求項2に記載の生体物質定量方法。 - 前記蛍光粒子の平均粒径は、50nm以上100nm未満であることを特徴とする請求項2又は3に記載の生体物質定量方法。
- 前記入力工程において、超解像顕微鏡を用いて前記蛍光画像を入力することを特徴とする請求項2〜4の何れか一項に記載の生体物質定量方法。
- 蛍光物質を内包した蛍光粒子を含む染色試薬を用いて染色された標本から、前記蛍光物質の蛍光に基づいて生体物質を定量する病理診断支援システムであって、
前記標本の明視野画像から細胞核が抽出された画像である細胞核画像を生成する手段と、
前記標本における前記生体物質の発現を蛍光輝点で表す蛍光画像を入力する入力手段と、
前記細胞核画像及び前記蛍光輝点の蛍光に基づいて前記生体物質の発現量を定量する定量手段と、
を備え、
前記生体物質は細胞核に存在するタンパク質であるKi67、又は細胞核に存在するエストロゲン受容体(ER)であり、
前記蛍光粒子は、前記生体物質を抗原とする一次抗体であるモノクローナル抗体を介して前記生体物質に結合し、前記一次抗体を抗原とする二次抗体であるモノクローナル抗体を介して前記生体物質に結合し、
前記生体物質がKi67である場合、前記一次抗体はSP6であり、前記二次抗体はLO−RG1、またはRG−16であり、もしくは前記一次抗体はEPR3610であり、前記二次抗体はLO−RG1、またはRG−16であり、もしくは前記一次抗体はB126.1であり、前記二次抗体はLO−MG1−13、またはLO−MG2a―7であり、もしくは前記一次抗体は4A1であり、前記二次抗体はLO−MG1−13、またはLO−MG2a―7であり、もしくは前記一次抗体はMIB−1であり、前記二次抗体はLO−MG1−13、またはSB77eであり、もしくは前記一次抗体は5D7であり、前記二次抗体はLO−RG1であり、
前記生体物質がエストロゲン受容体(ER)である場合、前記一次抗体は6F11であり、前記二次抗体はLO−MG1−13であり、もしくは前記一次抗体は14C8であり、前記二次抗体はLO−MG7であることを特徴とする病理診断支援システム。 - 蛍光物質を内包した蛍光粒子を含む染色試薬を用いて染色された標本から、前記蛍光物質の蛍光に基づいて生体物質を定量するコンピュータを、
前記標本の明視野画像から細胞核が抽出された画像である細胞核画像を生成する手段、
前記標本における前記生体物質の発現を蛍光輝点で表す蛍光画像を入力する入力手段、
前記細胞核画像及び前記蛍光輝点の蛍光に基づいて前記生体物質の発現量を定量する定量手段、
として機能させ、
前記生体物質は細胞核に存在するタンパク質であるKi67、又は細胞核に存在するエストロゲン受容体(ER)であり、
前記蛍光粒子は、前記生体物質を抗原とする一次抗体であるモノクローナル抗体を介して前記生体物質に結合し、前記一次抗体を抗原とする二次抗体であるモノクローナル抗体を介して前記生体物質に結合し、
前記生体物質がKi67である場合、前記一次抗体はSP6であり、前記二次抗体はLO−RG1、またはRG−16であり、もしくは前記一次抗体はEPR3610であり、前記二次抗体はLO−RG1、またはRG−16であり、もしくは前記一次抗体はB126.1であり、前記二次抗体はLO−MG1−13、またはLO−MG2a―7であり、もしくは前記一次抗体は4A1であり、前記二次抗体はLO−MG1−13、またはLO−MG2a―7であり、もしくは前記一次抗体はMIB−1であり、前記二次抗体はLO−MG1−13、またはSB77eであり、もしくは前記一次抗体は5D7であり、前記二次抗体はLO−RG1であり、
前記生体物質がエストロゲン受容体(ER)である場合、前記一次抗体は6F11であり、前記二次抗体はLO−MG1−13であり、もしくは前記一次抗体は14C8であり、前記二次抗体はLO−MG7であることを特徴とするプログラム。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2015009938 | 2015-01-22 | ||
JP2015009938 | 2015-01-22 | ||
PCT/JP2016/051116 WO2016117466A1 (ja) | 2015-01-22 | 2016-01-15 | 生体物質定量方法、病理診断支援システム及びプログラム |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2016117466A1 JPWO2016117466A1 (ja) | 2017-11-02 |
JP6960224B2 true JP6960224B2 (ja) | 2021-11-05 |
Family
ID=56417013
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016570607A Active JP6960224B2 (ja) | 2015-01-22 | 2016-01-15 | 生体物質定量方法、病理診断支援システム及びプログラム |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10746740B2 (ja) |
EP (1) | EP3249401B1 (ja) |
JP (1) | JP6960224B2 (ja) |
WO (1) | WO2016117466A1 (ja) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP6372370B2 (ja) * | 2015-01-23 | 2018-08-15 | コニカミノルタ株式会社 | 生体物質定量方法、画像処理装置、及びプログラム |
WO2017175523A1 (ja) * | 2016-04-06 | 2017-10-12 | コニカミノルタ株式会社 | 蛍光免疫染色法 |
JP7184046B2 (ja) * | 2017-10-19 | 2022-12-06 | コニカミノルタ株式会社 | 生体物質定量方法、画像処理装置、病理診断支援システム及びプログラム |
CN111435192B (zh) * | 2019-01-15 | 2021-11-23 | 卡尔蔡司显微镜有限责任公司 | 利用荧光显微镜生成荧光照片的方法 |
CN111551725B (zh) * | 2020-04-10 | 2023-07-28 | 湖州正熙医学检验实验室有限公司 | 一种提高抗体荧光染料标记信号的方法 |
CN114624431B (zh) * | 2022-05-11 | 2022-10-18 | 深圳市帝迈生物技术有限公司 | 一种免疫分析仪及其修正方法 |
Family Cites Families (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005509870A (ja) | 2001-11-20 | 2005-04-14 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | 細胞及び組織アレイ及びマイクロアレイと使用方法 |
CA2544577C (en) | 2003-12-01 | 2013-01-08 | Dako Denmark A/S | Methods and compositions for immuno-histochemical detection |
GB0421838D0 (en) | 2004-09-30 | 2004-11-03 | Congenia S R L | Cancer markers |
JP2009509171A (ja) | 2005-09-21 | 2009-03-05 | シーシーシー ダイアグノスティックス, エルエルシー | 個別化抗癌化学療法(pac)のための包括的な診断試験 |
ATE483972T1 (de) | 2006-02-16 | 2010-10-15 | Ventana Med Syst Inc | Reagenzien und verfahren für krebsprognose und pathologische einstufung |
EP2023127B1 (en) * | 2006-05-31 | 2017-12-20 | Olympus Corporation | Biological specimen imaging method and biological specimen imaging apparatus |
JP5553661B2 (ja) | 2010-03-30 | 2014-07-16 | シスメックス株式会社 | 癌の再発リスク判定方法 |
EP3779433A3 (en) * | 2010-08-30 | 2021-05-19 | Konica Minolta, Inc. | Tissue staining method, tissue evaluation method and biosubstance detection method |
JP5974892B2 (ja) * | 2010-08-31 | 2016-08-23 | コニカミノルタ株式会社 | 生体物質検出方法 |
JP5858461B2 (ja) * | 2011-03-17 | 2016-02-10 | コニカミノルタ株式会社 | 病理診断情報生成方法及び病理診断情報生成システム |
JP5887823B2 (ja) * | 2011-10-19 | 2016-03-16 | コニカミノルタ株式会社 | 組織評価方法 |
US9632081B2 (en) | 2012-03-28 | 2017-04-25 | Konica Minolta, Inc. | Detection method for biological substance |
JP5892238B2 (ja) * | 2012-03-30 | 2016-03-23 | コニカミノルタ株式会社 | 医用画像処理装置及びプログラム |
EP2833138B1 (en) * | 2012-03-30 | 2017-08-09 | Konica Minolta, Inc. | Medical image processor and program |
WO2013146741A1 (ja) * | 2012-03-30 | 2013-10-03 | コニカミノルタ株式会社 | 組織染色方法 |
EP3040724B1 (en) | 2013-09-26 | 2018-08-29 | Konica Minolta, Inc. | Method for determining quantity of biological material in tissue section |
WO2015093518A1 (ja) * | 2013-12-18 | 2015-06-25 | コニカミノルタ株式会社 | 画像処理装置、病理診断支援システム、画像処理プログラム及び画像処理方法 |
WO2016006096A1 (ja) * | 2014-07-11 | 2016-01-14 | コニカミノルタ株式会社 | 生体物質定量方法、画像処理装置、病理診断支援システム及びプログラム |
-
2016
- 2016-01-15 WO PCT/JP2016/051116 patent/WO2016117466A1/ja active Application Filing
- 2016-01-15 US US15/544,795 patent/US10746740B2/en active Active
- 2016-01-15 EP EP16740073.8A patent/EP3249401B1/en active Active
- 2016-01-15 JP JP2016570607A patent/JP6960224B2/ja active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP3249401B1 (en) | 2019-12-25 |
US20180275134A1 (en) | 2018-09-27 |
US10746740B2 (en) | 2020-08-18 |
EP3249401A4 (en) | 2017-11-29 |
WO2016117466A1 (ja) | 2016-07-28 |
JPWO2016117466A1 (ja) | 2017-11-02 |
EP3249401A1 (en) | 2017-11-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6960224B2 (ja) | 生体物質定量方法、病理診断支援システム及びプログラム | |
JP6350527B2 (ja) | 画像処理装置、病理診断支援システム、画像処理プログラム及び病理診断支援方法 | |
JP5892238B2 (ja) | 医用画像処理装置及びプログラム | |
JP5804194B2 (ja) | 医用画像処理装置及びプログラム | |
WO2016042963A1 (ja) | 画像処理装置、画像処理方法、及びプログラム | |
JP2015062032A (ja) | 組織染色用蛍光標識体 | |
JP6597316B2 (ja) | 画像処理装置及びプログラム | |
JP6763407B2 (ja) | 画像処理装置及びプログラム | |
WO2016136441A1 (ja) | 画像処理装置、画像処理方法、及び画像処理プログラム | |
JP6493398B2 (ja) | 診断支援情報生成方法、画像処理装置、診断支援情報生成システム及び画像処理プログラム | |
JPWO2019082788A1 (ja) | 画像処理装置、合焦位置特定方法及び合焦位置特定プログラム | |
JP5863057B2 (ja) | 組織評価方法 | |
JP6375925B2 (ja) | 画像処理装置、画像処理システム、画像処理プログラム及び画像処理方法 | |
JP7235036B2 (ja) | 画像処理方法、画像処理装置及びプログラム | |
EP3396375B1 (en) | Image processing device and program | |
JP6337629B2 (ja) | 診断支援情報生成方法、画像処理装置、診断支援情報生成システム及び画像処理プログラム | |
JP6405985B2 (ja) | 画像処理装置、画像処理システム、画像処理プログラム及び画像処理方法 | |
WO2021192910A1 (ja) | 画像生成方法、画像生成装置及びプログラム | |
WO2021039592A1 (ja) | 創薬支援方法、創薬支援装置及びプログラム | |
US20210318323A1 (en) | Information Acquiring Method, Information Acquiring Device, and Program |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20180614 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20190806 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20191004 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20200331 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200630 |
|
C60 | Trial request (containing other claim documents, opposition documents) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C60 Effective date: 20200630 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20200710 |
|
C21 | Notice of transfer of a case for reconsideration by examiners before appeal proceedings |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C21 Effective date: 20200714 |
|
A912 | Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912 Effective date: 20201002 |
|
C211 | Notice of termination of reconsideration by examiners before appeal proceedings |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C211 Effective date: 20201006 |
|
C22 | Notice of designation (change) of administrative judge |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C22 Effective date: 20201020 |
|
C13 | Notice of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C13 Effective date: 20210601 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210729 |
|
C23 | Notice of termination of proceedings |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C23 Effective date: 20210831 |
|
C03 | Trial/appeal decision taken |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C03 Effective date: 20211005 |
|
C30A | Notification sent |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C3012 Effective date: 20211005 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20211011 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6960224 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |