JP6952295B2 - ヒト抗hlaモノクローナル抗体の作製方法 - Google Patents
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Description
(1) 特定のHLA型に対する特異性を有するヒト抗HLAモノクローナル抗体を産生する細胞の単離方法であって、以下:
(a) ヒト被験者由来の単核球中の抗HLA抗体の存在を同定するステップ、
(b) 目的の抗HLAモノクローナル抗体を産生可能な細胞を含む単核球を培養するステップ、及び
(c) 培養した単核球から抗体産生細胞を単離するステップ
を含む、上記方法。
(2) 特定のHLA型に対する特異性を有するヒト抗HLAモノクローナル抗体の作製方法であって、
(d) 上記(1)記載の方法に従って得られた抗体産生細胞が産生する抗体をコードする遺伝子をクローニングするステップ、
(e) クローニングされた遺伝子を細胞にin vitroで導入するステップ、及び
(f) 該細胞を培養し、増殖させて抗体を回収するステップ
を含む、上記方法。
(3) 単核球が末梢血又は骨髄由来の細胞から得られる、上記(1)又は(2)記載の方法。
(4) ヒト被験者が妊娠経験のある女性、又は輸血、造血幹細胞移植、若しくは臓器移植経験がある被験者である、上記(1)〜(3)のいずれか記載の方法。
(5) HLA型がHLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DPのいずれかに属する型である、上記(1)〜(4)のいずれか記載の方法。
(6) HLA型がHLA-B61である、請求項(1)〜(5)のいずれか記載の方法。
(7) 上記(2)〜(6)のいずれか記載の方法によって得られる、単離された完全ヒト抗HLAモノクローナル抗体。
(8) ヒトHLA-B61抗原に対して特異的に結合するモノクローナル抗体であって、以下:
(a)配列番号2で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は該塩基配列に対して90%以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドがコードする重鎖可変領域ポリペプチド、及び
(b)配列番号4で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は該塩基配列に対して90%以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドがコードする軽鎖可変領域ポリペプチド
を含む、上記モノクローナル抗体。
(9) ヒトHLA-B61抗原に対して特異的に結合するモノクローナル抗体であって、以下:
(a)配列番号3で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドである重鎖可変領域ポリペプチド、及び
(b)配列番号5で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドである軽鎖可変領域ポリペプチド
を含む、上記モノクローナル抗体。
(10) ヒトHLA-B61抗原に対して特異的に結合するモノクローナル抗体であって、配列番号6で示されるアミノ酸配列からなるCDH1、配列番号7で示されるアミノ酸配列からなるCDH2、配列番号8で示されるアミノ酸配列からなるCDH3、配列番号9で示されるアミノ酸配列からなるCDL1、配列番号10で示されるアミノ酸配列からなるCDL2、配列番号11で示されるアミノ酸配列からなるCDL3を含む、上記モノクローナル抗体。
(11) 上記(7)〜(10)のいずれか記載のモノクローナル抗体と同じ結合特異性を有する抗HLAモノクローナル抗体。
(12) 上記(7)〜(10)のいずれか記載のモノクローナル抗体を含む、特定のHLA型に対する細胞傷害活性剤。
(13) 再生不良性貧血患者から採取したサンプルを、上記(7)〜(11)のいずれか記載のモノクローナル抗体と接触させて、該サンプル中のHLA-B61分子の発現を検出することを含む、該患者に対する免疫抑制療法の有効性を予測する方法。
本発明は、特定のHLA型に対する特異性を有するヒト抗HLAモノクローナル抗体を産生する細胞の単離方法を提供する。
(a) ヒト被験者由来の単核球中の抗HLA抗体の存在を同定するステップ、
(b) 目的の抗HLAモノクローナル抗体を産生可能な細胞を含む単核球を培養するステップ、及び
(c) 培養した単核球から抗体産生細胞を単離するステップ
を含む。
抗HLA抗体産生細胞の同定は、例えば目的のHLA型の抗原又は二次抗体を添加して結合の有無を測定することによって行うことができる。結合は、例えば蛍光色素等を用いて標識した抗原又は二次抗体を添加して、蛍光の有無を指標として検出することができる。
本発明はまた、特定のHLA型に対する特異性を有するヒト抗HLAモノクローナル抗体の作製方法を提供する。具体的には、この方法は、
(d) 上記の方法に従って単離した抗体産生細胞が産生する抗体をコードする遺伝子をクローニングするステップ、
(e) クローニングされた遺伝子を細胞にin vitroで導入するステップ、及び
(f) 該細胞を培養し、増殖させて抗体を回収するステップ
を含む。すなわち、抗HLAモノクローナル抗体は、該抗体をコードするポリヌクレオチドを適切な宿主細胞に導入して発現させ、組換えタンパク質として得ることができる。
上記の本発明の方法を使用して、ヒト被験者の単核球中に含まれ得るヒト抗HLAモノクローナル抗体産生細胞を迅速に単離・増殖して、目的の抗HLAモノクローナル抗体を取得することができる。本発明の方法によって得られるモノクローナル抗体は、完全ヒト抗体であるため、ヒトに対する治療目的で使用することが可能である。従って、本発明は、上記の方法によって得られる、単離された完全ヒト抗HLAモノクローナル抗体を提供する。
HLA-B61には、B*40:02、B*40:06、B*40:03のアレルが知られており、HLA-B61陽性の被験者は、一方または双方のHLAが上記のアレルとなっていると考えられる。再生不良性貧血患者において、B*40:02のアレル頻度が高いことが知られている(Blood, 2011, December 15, 118(25) 6601-9)。
(a)配列番号2で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は該塩基配列に対して90%以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドがコードする重鎖可変領域ポリペプチド、及び
(b)配列番号4で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は該塩基配列に対して90%以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドがコードする軽鎖可変領域ポリペプチド
を含むものであり得る。
(a)配列番号3で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドである重鎖可変領域ポリペプチド、及び
(b)配列番号5で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドである軽鎖可変領域ポリペプチド
を含むものであり得る。
(方法)
本実施例では、A. Jin等、Nature Medicine 2009, 15: 1088-92に記載の方法に従って抗体産生細胞の単離、並びに抗体の作製を行った。
実施例1で作製した抗HLA-B61モノクローナル抗体(抗HLA-B61mAbs)、及び比較対照のモノクローナル抗体(抗インフルエンザウイルス抗体、富山大学免疫学教室作製)をフルオレセインイソチオシアネート(fluorescein isothiocyanate, FITC)で標識して、HLA-B61抗原陽性もしくは陰性B-LCL(B-リンパ芽球様細胞系(B-lymphoblastoid cell lines))細胞(健常者ドナー由来)の検出をフローサイトメトリーで行った結果、図2に示すように、コントロール抗体では検出できなかったのに対して、本発明の抗体は明瞭にHLA-B61抗原陽性B-LCLを検出することができた(図2A)。一方、HLA-B61抗原陰性B-LCLを用いた場合には、コントロール抗体と抗HLA-B61抗体とで差異は見られなかった(図2B)。
実施例1と同様にして、抗HLA-A24抗体陽性ドナーの末梢血から抗HLA-A24モノクローナル抗体を単離し、遺伝子クローニング技術を用いて抗HLA-A24モノクローナル抗体を作製した。得られた抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域の塩基配列を解析した結果を以下に示す。下線は重鎖におけるCDRをコードする塩基配列箇所をそれぞれ示す。
実施例3で作製した抗HLA-A24モノクローナル抗体、及び比較対照のモノクローナル抗体(抗インフルエンザウイルス抗体、富山大学免疫学教室作製)をフルオレセインイソチオシアネート(fluorescein isothiocyanate, FITC)で標識して、実施例2と同様にしてヒト被験者由来の末梢血を用いてHLA-A24抗原陽性もしくは陰性細胞の検出を試みた結果、フローサイトメトリーで明瞭にHLA-A24抗原陽性Tリンパ球を検出することができた(図5)。
実施例1で作製した抗HLA-B61モノクローナル抗体の機能を検討した。
5x104個のHLA-B61陽性B-LCL細胞(target (T))をRPMI培地に加え、実施例1で作製した抗HLA-B61モノクローナル抗体20μg/ml及びエフェクター細胞(effector (E))としてヒト末梢血単核球(E/T比 40)、更にCFSE(5-(6)-カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル)2.5μMを添加して37℃で2時間反応させた後、7-AADで染色してフローサイトメトリーで細胞傷害活性を調べた。その結果、本発明の抗体では図7Aに示すように明瞭な細胞傷害活性が認められた。なお、陰性対照のアイソタイプモノクローナル抗体では細胞傷害活性は認められなかった(図7B)。
Claims (11)
- 特定のHLA型に対する特異性を有するヒト抗HLAモノクローナル抗体の作製方法であって、以下:
抗HLA抗体の存在が同定されたヒト被験者由来の単核球を分離し、
該単核球をマイクロアレイにウェル当たり1個の細胞でアプライして培養し、
目的のHLA型抗原と特異的に結合する抗体が存在するウェルを同定し、
該ウェルから目的の抗HLAモノクローナル抗体を産生する細胞を単離し、
単離された細胞が産生する抗体をコードする遺伝子をクローニングし、
クローニングされた遺伝子を細胞にin vitroで導入し、そして
遺伝子が導入された該細胞を培養し、増殖させて抗体を回収する
ことを含む、上記方法。 - 単核球が末梢血、脾臓、リンパ節又は骨髄由来の細胞から得られる、請求項1記載の方法。
- ヒト被験者が妊娠経験のある女性、又は輸血、造血幹細胞移植、若しくは臓器移植経験がある被験者である、請求項1又は2記載の方法。
- HLA型がHLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DPのいずれかに属する型である、請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。
- HLA型がHLA-B61である、請求項1〜4のいずれか1項記載の方法。
- ヒトHLA-B61抗原に対して特異的に結合するモノクローナル抗体であって、以下:
(a)配列番号2で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は該塩基配列に対して90%以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドがコードする重鎖可変領域ポリペプチドであって、配列番号6で示されるアミノ酸配列からなるCDR1領域、配列番号7で示されるアミノ酸配列からなるCDR2領域、及び配列番号8で示されるアミノ酸配列からなるCDR3領域を含む重鎖可変領域ポリペプチド、及び
(b)配列番号4で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は該塩基配列に対して90%以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドがコードする軽鎖可変領域ポリペプチドであって、配列番号9で示されるアミノ酸配列からなるCDR1領域、配列番号10で示されるアミノ酸配列からなるCDR2領域、及び配列番号11で示されるアミノ酸配列からなるCDR3領域を含む軽鎖可変領域ポリペプチド
を含む、上記モノクローナル抗体。 - ヒトHLA-B61抗原に対して特異的に結合するモノクローナル抗体であって、以下:
(a)配列番号3で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、配列番号6で示されるアミノ酸配列からなるCDR1領域、配列番号7で示されるアミノ酸配列からなるCDR2領域、及び配列番号8で示されるアミノ酸配列からなるCDR3領域を含む重鎖可変領域ポリペプチド、及び
(b)配列番号5で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、配列番号9で示されるアミノ酸配列からなるCDR1領域、配列番号10で示されるアミノ酸配列からなるCDR2領域、及び配列番号11で示されるアミノ酸配列からなるCDR3領域を含む軽鎖可変領域ポリペプチド
を含む、上記モノクローナル抗体。 - ヒトHLA-B61抗原に対して特異的に結合するモノクローナル抗体であって、配列番号6で示されるアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号7で示されるアミノ酸配列からなるCDR2、及び配列番号8で示されるアミノ酸配列からなるCDR3を含む重鎖、及び配列番号9で示されるアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号10で示されるアミノ酸配列からなるCDR2、及び配列番号11で示されるアミノ酸配列からなるCDR3を含む軽鎖を含む、上記モノクローナル抗体。
- 請求項6〜8のいずれか1項記載のモノクローナル抗体と同じ結合特異性を有する抗HLAモノクローナル抗体。
- 請求項6〜9のいずれか1項記載のモノクローナル抗体を含む、特定のHLA型に対する細胞傷害活性剤。
- 再生不良性貧血患者から採取したサンプルを、請求項6〜9のいずれか1項記載のモノクローナル抗体と接触させて、該サンプル中のHLA-B61分子の発現を検出すること、又は請求項5記載の方法でヒト抗HLAモノクローナル抗体を作製し、該モノクローナル抗体と再生不良性貧血患者から採取したサンプルを接触させて、該サンプル中のHLA-B61分子の発現を検出することを含む、該患者に対する免疫抑制療法の有効性を予測する方法であって、HLA-B61分子の発現が検出されない場合に免疫抑制療法が有効であると予測される、上記方法。
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