JP6911466B2 - Microchips for measuring cell metabolism, devices for measuring cell metabolism, methods for measuring cell metabolism and systems for measuring cell metabolism - Google Patents

Microchips for measuring cell metabolism, devices for measuring cell metabolism, methods for measuring cell metabolism and systems for measuring cell metabolism Download PDF

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Description

本発明は、細胞の代謝を測定するためのマイクロチップ、細胞の代謝を測定するための装置、細胞の代謝を測定する方法及び細胞の代謝を測定するためのシステムに関する。 The present invention relates to microchips for measuring cell metabolism, devices for measuring cell metabolism, methods for measuring cell metabolism and systems for measuring cell metabolism.

近年、細胞の代謝や分泌等を測定する技術が開発されている。
例えば、細胞の酸素消費や代謝フラックスを、蛍光プレートリーダーを使って測定するアッセイキットが市販されている。
しかし、市販のアッセイキットは、測定対象が細胞のバルク（数万個の細胞）であり、単一細胞の代謝を測定することができなかった。そこで、単一細胞の代謝を測定できる技術が求められていた。 In recent years, techniques for measuring cell metabolism, secretion, etc. have been developed.
For example, assay kits for measuring cell oxygen consumption and metabolic flux using a fluorescent plate reader are commercially available.
However, commercially available assay kits could not measure the metabolism of a single cell because the measurement target was a bulk of cells (tens of thousands of cells). Therefore, there has been a demand for a technique capable of measuring the metabolism of a single cell.

細胞のバルクが測定対象の場合は、ウェルが大きいため、例えば酸素消費を測定する場合、酸素の拡散やウェル間での酸素の透過等の影響は少なかった。
しかし、単一細胞が測定対象の場合は、ウェルが非常に小さいため、酸素の拡散やウェル間での酸素の糖化等の影響が大きく、単一細胞を十分に隔離しなければ正確な酸素消費データが得られない。 When the bulk of the cells was the measurement target, the wells were large, so when measuring oxygen consumption, for example, the effects of oxygen diffusion and oxygen permeation between the wells were small.
However, when a single cell is the measurement target, the wells are very small, so the effects of oxygen diffusion and oxygen saccharification between wells are large, and accurate oxygen consumption must be achieved if the single cells are not sufficiently isolated. No data is available.

そのような問題を解決するため、各細胞を隔離する方法が開発されており、例えば、ピストンを使った方法がある（非特許文献１、２）。
非特許文献１には、マイクロウェルアレイに単一の生細胞を入れ、シアノアクリレート系接着剤、シリコーンゴム及びホウケイ酸ガラスを用いて封止し、単一の生細胞の酸素消費を測定したことが開示されている。
非特許文献２には、ガラスをエッチングしたマイクロウェルアレイに単一の生細胞を入れ、ピストンを用いて金で作られた酸素バリアでマイクロウェルを封止したことが開示されている。 In order to solve such a problem, a method for isolating each cell has been developed, and for example, there is a method using a piston (Non-Patent Documents 1 and 2).
In Non-Patent Document 1, a single living cell was placed in a microwell array and sealed with a cyanoacrylate adhesive, silicone rubber and borosilicate glass, and the oxygen consumption of the single living cell was measured. Is disclosed.
Non-Patent Document 2 discloses that a single living cell was placed in a glass-etched microwell array and the microwell was sealed with an oxygen barrier made of gold using a piston.

J. Dragavon et. al., “A cellular isolation system for real-time single-cell oxygen consumption monitoring”, [online], J R Soc Interface, 2008 Oct; 5(Suppl 2): S151-159, published online 2008 Jun 2J. Dragavon et. Al., “A cellular isolation system for real-time single-cell oxygen consumption monitoring”, [online], JR Soc Interface, 2008 Oct; 5 (Suppl 2): S151-159, published online 2008 Jun 2 T. W. Molter, et. al., “A New Approach for Measuring Single-Cell Oxygen Consumption Rates”, IEEE Trans Autom Sci Eng., 2008 Jan 1; 5(1): 32-42T. W. Molter, et. Al., “A New Approach for Measuring Single-Cell Oxygen Consumption Rates”, IEEE Trans Autom Sci Eng., 2008 Jan 1; 5 (1): 32-42

しかしながら、非特許文献１及び２に開示されたようなピストンを用いると、ピストンの動作の再現性、ピストンが細胞の入った液に接することによる細胞への影響やピストンの次の動作への影響、広範囲でのピストン動作の困難性、ピストンを採用した際の細胞代謝測定システムが大きく複雑になること、ピストン動作時に密封性を確認する必要があること等の問題がある。 However, when a piston as disclosed in Non-Patent Documents 1 and 2 is used, the reproducibility of the movement of the piston, the influence on the cells due to the contact of the piston with the liquid containing the cells, and the influence on the next movement of the piston are used. There are problems such as difficulty in piston operation in a wide range, large and complicated cell metabolism measurement system when a piston is adopted, and confirmation of sealing property during piston operation.

そこで、本発明者らは、前記課題解決のため鋭意研究し、細胞捕獲部の周囲に流路を設置して該流路に酸素透過性等の低い流体を流す本技術を開発した。 Therefore, the present inventors have conducted diligent research to solve the above-mentioned problems, and have developed the present technology in which a flow path is provided around the cell capture portion and a fluid having low oxygen permeability or the like is allowed to flow through the flow path.

すなわち、本技術は、
試料に含有される細胞を捕獲する細胞捕獲部と、
前記細胞捕獲部を封止する流体が導入される封止用流路と
を有し、
前記流体は、細胞代謝関連物質の透過性を実質的に有さないものである、
細胞の代謝を測定するためのマイクロチップを提供する。
前記流体は鉱物油から１種類又は複数種類を選択することができる。
前記細胞捕獲部は細胞代謝関連物質の透過性を実質的に有さない材質で形成されていてもよい。
また、前記細胞捕獲部の表面は親水性であり得る。
一方、前記封止用流路の表面は疎水性であり得る。
また、前記封止用流路は、前記細胞捕獲部外の上部、下部及び側部からなる群から選択される面を直接的又は間接的に封止するように形成されていてもよい。
更に、前記細胞捕獲部は細胞引き込み用通路を有してもよい。
また更に、試料流入部、試料流出部、流体流入部及び流体流出部を有してもよい。
なお、前記細胞は単一細胞又は細胞塊でもよい。 That is, this technology
A cell capture unit that captures the cells contained in the sample,
It has a sealing flow path into which a fluid for sealing the cell capture portion is introduced, and has a sealing flow path.
The fluid is substantially impermeable to cell metabolism-related substances.
Provided are microchips for measuring cell metabolism.
The fluid can be selected from one type or a plurality of types from mineral oil.
The cell capture portion may be made of a material that is substantially impermeable to cell metabolism-related substances.
In addition, the surface of the cell capture portion may be hydrophilic.
On the other hand, the surface of the sealing flow path may be hydrophobic.
Further, the sealing flow path may be formed so as to directly or indirectly seal a surface selected from the group consisting of an upper part, a lower part and a side part outside the cell capture part.
Further, the cell capture unit may have a cell attraction passage.
Further, it may have a sample inflow section, a sample outflow section, a fluid inflow section, and a fluid outflow section.
The cell may be a single cell or a cell mass.

また、本技術は、
細胞の代謝を測定するための装置であって、
試料に含有される細胞を捕獲する細胞捕獲部と、前記細胞捕獲部を封止する流体が導入される封止用流路とを有し、前記流体は細胞代謝関連物質の透過性を実質的に有さないものである、細胞の代謝を測定するためのマイクロチップ、
前記マイクロチップの封止用流路に前記流体を導入する流体導入部、及び
前記マイクロチップの細胞捕獲部に捕獲された細胞の代謝を測定する測定部
を有する装置を提供する。 In addition, this technology
A device for measuring cell metabolism
It has a cell capture section that captures cells contained in the sample and a sealing flow path into which a fluid that seals the cell capture section is introduced, and the fluid substantially permeates the cell metabolism-related substance. A microchip for measuring cell metabolism, which is not found in
Provided is an apparatus having a fluid introduction unit for introducing the fluid into the sealing flow path of the microchip and a measurement unit for measuring the metabolism of the cells captured in the cell capture unit of the microchip.

また、本技術は、
細胞の代謝を測定する方法であって、
試料に含有される細胞を捕獲する細胞捕獲部と、前記細胞捕獲部を封止する流体が導入される封止用流路とを有し、前記流体は細胞代謝関連物質の透過性を実質的に有さないものである、細胞の代謝を測定するためのマイクロチップを用い、以下の工程（Ａ）〜（Ｃ）：
（Ａ）前記細胞を細胞捕獲部に捕獲する工程、
（Ｂ）前記封止用流路に流体を導入し、前記細胞捕獲部を封止する工程、及び
（Ｃ）前記細胞の代謝を測定する工程
を含む方法を提供する。
ここで、前記工程（Ｃ）は、酸素及び／又は水素イオンの濃度を測定することにより行うことができる。
また、前記工程（Ａ）で捕獲された細胞に細胞刺激物質を適用する工程を更に含んでもよい。 In addition, this technology
A method of measuring cell metabolism
It has a cell capture section that captures cells contained in the sample and a sealing flow path into which a fluid that seals the cell capture section is introduced, and the fluid substantially permeates the cell metabolism-related substance. Using a microchip for measuring cell metabolism, which is not present in the following steps (A) to (C):
(A) A step of capturing the cells in a cell capture unit,
Provided is a method including (B) introducing a fluid into the sealing flow path and sealing the cell capture portion, and (C) measuring the metabolism of the cells.
Here, the step (C) can be performed by measuring the concentration of oxygen and / or hydrogen ions.
Further, the step of applying the cell stimulant to the cells captured in the step (A) may be further included.

更に、本技術は、
細胞の代謝を測定するためのシステムであって、
試料に含有される細胞を捕獲する細胞捕獲部と、前記細胞捕獲部を封止する流体が導入される封止用流路とを有し、前記流体は細胞代謝関連物質の透過性を実質的に有さないものである、細胞の代謝を測定するためのマイクロチップ、前記マイクロチップの封止用流路に前記流体を導入する流体導入部、並びに前記マイクロチップの細胞捕獲部に捕獲された細胞の代謝を測定する測定部を有する、細胞の代謝を測定するための装置部と、
前記流体の流れの制御及び前記測定を前記装置部に実行させるためのプログラムを有する装置制御部と、
前記装置部により得られた測定データを解析する解析部と、
前記測定部により得られた測定データ及び／又は前記解析部により得られた解析結果を表示する表示部と、
を有するシステムを提供する。 Furthermore, this technology
A system for measuring cell metabolism
It has a cell capture section that captures cells contained in the sample and a sealing flow path into which a fluid that seals the cell capture section is introduced, and the fluid substantially permeates the cell metabolism-related substance. It was captured by a microchip for measuring cell metabolism, a fluid introduction section that introduces the fluid into the sealing flow path of the microchip, and a cell capture section of the microchip, which are not present in the above. A device unit for measuring cell metabolism, which has a measuring unit for measuring cell metabolism,
An apparatus control unit having a program for controlling the fluid flow and causing the apparatus unit to execute the measurement.
An analysis unit that analyzes the measurement data obtained by the device unit,
A display unit that displays the measurement data obtained by the measurement unit and / or the analysis result obtained by the analysis unit, and
To provide a system having.

本技術に係るマイクロチップの基本構造を示す図である。It is a figure which shows the basic structure of the microchip which concerns on this technology. 本技術に係るマイクロチップの実施態様１を示す図である。It is a figure which shows Embodiment 1 of the microchip which concerns on this technique. 本技術に係るマイクロチップのサイズの例を示す図である。It is a figure which shows the example of the size of the microchip which concerns on this technology. 本技術に係るマイクロチップの実施態様１を示す図面代用写真である。It is a drawing substitute photograph which shows Embodiment 1 of the microchip which concerns on this technique. 本技術に係るマイクロチップの実施態様１を示す図面代用写真である。It is a drawing substitute photograph which shows Embodiment 1 of the microchip which concerns on this technique. 本技術に係るマイクロチップの実施態様１を示す図面代用写真である。It is a drawing substitute photograph which shows Embodiment 1 of the microchip which concerns on this technique. 本技術に係るマイクロチップの実施態様２を示す図である。It is a figure which shows Embodiment 2 of the microchip which concerns on this technique. 本技術に係る細胞代謝測定装置を示す図である。It is a figure which shows the cell metabolism measuring apparatus which concerns on this technique. 本技術に係る細胞代謝測定方法の工程を示す図である。It is a figure which shows the process of the cell metabolism measurement method which concerns on this technique. 本技術に係る細胞代謝測定システムを示す図である。It is a figure which shows the cell metabolism measurement system which concerns on this technique.

以下、本技術を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。説明は以下の順序で行う。
１．細胞代謝測定用マイクロチップ
１−１．マイクロチップの構造
１−２．実施態様１
１−３．実施態様２
１−４．マイクロチップの製造方法
２．細胞代謝測定装置
３．細胞代謝測定方法
４．細胞代謝測定システム Hereinafter, a suitable mode for carrying out the present technology will be described. It should be noted that the embodiments described below show typical embodiments of the present technology, and the scope of the present technology is not narrowly interpreted by this. The explanation will be given in the following order.
1. 1. Microchip for measuring cell metabolism 1-1. Microchip structure 1-2. Embodiment 1
1-3. Embodiment 2
1-4. Manufacturing method of microchip 2. Cell metabolism measuring device 3. Cell metabolism measurement method 4. Cell metabolism measurement system

＜１．細胞代謝測定用マイクロチップ＞
本技術の細胞の代謝を測定するためのマイクロチップは、樹脂、ガラス、シリコン、金属等の材質で形成される。該材質は、オキソニウムイオン、水素イオン等のイオン透過性、酸素分子や水素分子等の気体透過性、液体透過性、細胞から排出・分泌される物質や細胞に取り込まれる物質等の細胞代謝関連物質の透過性を実質的に有さない材質であることが好ましい。具体的には、加熱により硬化する液状フッ素エラストマー、エチレン−ビニルアルコール共重合体、ポリ塩化ビニリデン、ポリイソブチレン、アクリル系樹脂等が挙げられる。 <1. Microchip for measuring cell metabolism ＞
The microchip for measuring cell metabolism of the present technology is formed of a material such as resin, glass, silicon, or metal. The material is ionic permeable such as oxonium ion and hydrogen ion, gas permeable such as oxygen molecule and hydrogen molecule, liquid permeable, and cell metabolism related substances such as substances excreted / secreted from cells and substances taken up by cells. It is preferable that the material has substantially no substance permeability. Specific examples thereof include liquid fluoroelastomers that are cured by heating, ethylene-vinyl alcohol copolymers, polyvinylidene chloride, polyisobutylene, and acrylic resins.

なお、ここで、「実質的に」とは、オキソニウムイオン、水素イオン等のイオン、酸素分子、水素分子等の気体、液体、細胞から排出・分泌される物質、細胞に取り込まれる物質等の細胞代謝関連物質のウェル間及びマイクロチップ間で拡散する量が、細胞代謝の測定において十分に無視できることをいう。好ましくは、細胞代謝の測定値の10％以内、より好ましくは1％以内である。
あるいは、「実質的に」とは、ウェルのサイズにもよるが、例えば50μm径のウェルが、該ウェル以外の部分であって細胞代謝関連物質が満たされている部分に接しているときに、該ウェルが前記細胞代謝関連物質で満たされるまでの時間が、好ましくは10分以上、より好ましくは60分以上かかることをいう。 Here, "substantially" means ions such as oxonium ions and hydrogen ions, oxygen molecules, gases such as hydrogen molecules, liquids, substances excreted / secreted from cells, substances taken up by cells, and the like. It means that the amount of a cell metabolism-related substance diffused between wells and between microchips is sufficiently negligible in the measurement of cell metabolism. Preferably, it is within 10%, more preferably within 1% of the measured value of cell metabolism.
Alternatively, "substantially" means, for example, when a well having a diameter of 50 μm is in contact with a portion other than the well, which is filled with a cell metabolism-related substance, depending on the size of the well. It means that it takes preferably 10 minutes or more, more preferably 60 minutes or more, for the well to be filled with the cell metabolism-related substance.

また、「細胞代謝関連物質」とは、例えば、イオン、気体及び液体からなる群から選択される物質である。具体的には、オキソニウムイオン、水素イオン、酸素分子、水素分子、水分等が挙げられる。更には、細胞に含有されるあらゆる生体物質、例えば、細胞内粒子、核酸、リボソーム、プロテアソーム、糖類、タンパク質、脂質タンパク質、リポ多糖類、脂質、脂肪酸、糖質タンパク質、タンパク質繊維、ペプチド、ホルモン、薬理学的薬剤、ビタミン、アミノ酸、水分に溶解した分子等も含まれる。 The "cell metabolism-related substance" is, for example, a substance selected from the group consisting of ions, gases and liquids. Specific examples thereof include oxonium ion, hydrogen ion, oxygen molecule, hydrogen molecule, water and the like. Furthermore, any biological material contained in a cell, such as intracellular particles, nucleic acids, ribosomes, proteasomes, sugars, proteins, lipid proteins, lipopolysaccharides, lipids, fatty acids, sugar proteins, protein fibers, peptides, hormones, It also includes pharmacological agents, vitamins, amino acids, molecules dissolved in water, and the like.

１−１．マイクロチップの構造
本技術のマイクロチップの基本構造を図１に示す。
該マイクロチップは、試料に含有される細胞を捕獲する細胞捕獲部１０１（斜線部分）と、該細胞捕獲部１０１を封止する流体が導入される封止用流路１０３とを有する。図１では、試料等は右上から左下に矢印方向に流れる例を示す。細胞捕獲部１０１は、側壁１０２で囲まれており、内部に細胞２０１が入る。なお、図１では、細胞捕獲部１０１を、正方形を例として表しているが、円形、楕円形、長方形、六角形、八角形、その他の多角形等、種々の形を取り得る。 1-1. Microchip structure The basic structure of the microchip of this technology is shown in Fig. 1.
The microchip has a cell capture unit 101 (hatched portion) that captures cells contained in the sample, and a sealing flow path 103 into which a fluid that seals the cell capture unit 101 is introduced. FIG. 1 shows an example in which a sample or the like flows in the direction of an arrow from the upper right to the lower left. The cell capture unit 101 is surrounded by a side wall 102, and cells 201 enter the inside. In FIG. 1, the cell capture unit 101 is represented by taking a square as an example, but it can take various shapes such as a circle, an ellipse, a rectangle, a hexagon, an octagon, and other polygons.

細胞捕獲部１０１で捕獲する細胞は、天然の単一細胞、単一細胞化処理で得られた細胞、複数の細胞で形成される細胞塊でもよく、あるいは生体組織でもよく、特に限定されない。
例えば、白血球、赤血球、マクロファージ、樹上細胞、好中球、好酸球、好塩基球、巨画球、細胞傷害性T細胞、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーT細胞、B細胞、肥満細胞、Th2細胞、制御性T細胞等の血液及び免疫系細胞、外分泌上皮細胞、ホルモン分泌細胞、上皮細胞、神経細胞、感覚器官の細胞、幹細胞、脂肪細胞、収縮性細胞、胚細胞、ナース細胞、間質細胞等が挙げられる。 The cells captured by the cell capture unit 101 may be a natural single cell, a cell obtained by a single cell formation treatment, a cell mass formed by a plurality of cells, or a living tissue, and are not particularly limited.
For example, leukocytes, erythrocytes, macrophages, arboreal cells, neutrophils, eosinophils, basal spheres, giant spheres, cytotoxic T cells, natural killer cells, natural killer T cells, B cells, mast cells, Th2 Blood and immune system cells such as cells, regulatory T cells, exocrine epithelial cells, hormone-secreting cells, epithelial cells, nerve cells, sensory organ cells, stem cells, mast cells, contractile cells, embryonic cells, nurse cells, interstitial cells Examples include cells.

１−２．実施態様１
本技術のマイクロチップの実施態様１を図２に示す。
図２は、波形構造を有するマイクロチップの例を示しており、山部の頂部に凹部を形成し、該凹部は側壁４０２で囲まれて細胞捕獲部１０１（斜線部分）となる。このような波形構造にすることにより、波形頂部の凹部の細胞捕獲部１０１に捕捉された細胞２０１に、他の細胞が接着することを防ぎ、かつ細胞捕獲部１０１近辺に堆積していくことを防ぐ。 1-2. Embodiment 1
The first embodiment of the microchip of the present technology is shown in FIG.
FIG. 2 shows an example of a microchip having a corrugated structure, in which a recess is formed at the top of a mountain portion, and the recess is surrounded by a side wall 402 to form a cell capture portion 101 (shaded portion). By adopting such a corrugated structure, it is possible to prevent other cells from adhering to the cells 201 captured by the cell capture portion 101 in the concave portion at the top of the waveform, and to accumulate in the vicinity of the cell capture portion 101. prevent.

捕獲された細胞２０１は、そのまま細胞捕獲部１０１に保持されて、細胞捕獲部１０１内に留まったまま酸素消費量、pHの変化等の細胞代謝を反映する現象が測定される。 The captured cells 201 are held in the cell capture unit 101 as they are, and a phenomenon that reflects cell metabolism such as changes in oxygen consumption and pH is measured while remaining in the cell capture unit 101.

細胞捕獲部１０１は、細胞引き込み用通路１０４を有する。また、細胞捕獲部１０１外の上部及び側部（すなわち封止用流路１０３）に試料や、細胞を運ぶシース液、封止用流体等を流せるように、封止用流路１０３が形成される。封止用流路１０３は、天板４０１を設置して形成してもよい。
図２は、試料等が封止用流路１０３を左から右へ矢印方向に流れる例を示す。なお、流れは逆方向でもかまわない。 The cell capture unit 101 has a cell attraction passage 104. In addition, a sealing flow path 103 is formed so that a sample, a sheath liquid carrying cells, a sealing fluid, and the like can flow in the upper part and the side portion (that is, the sealing flow path 103) outside the cell capture unit 101. NS. The sealing flow path 103 may be formed by installing the top plate 401.
FIG. 2 shows an example in which a sample or the like flows through the sealing flow path 103 from left to right in the direction of the arrow. The flow may be in the opposite direction.

一方、細胞捕獲部１０１外の下部には、底板４０３が設けられ、底板４０３の上に、細胞引き込み用通路１０４と連結するように外部流路１０５が形成される。外部流路１０５にはバッファーや細胞２０１が捕獲された後の試料、シース液等が流れる。
図２は、バッファーやシース液等が左から右へ矢印方向に流れる例を示す。なお、流れは逆方向でもかまわない。 On the other hand, a bottom plate 403 is provided in the lower part outside the cell capture unit 101, and an external flow path 105 is formed on the bottom plate 403 so as to connect with the cell attraction passage 104. The buffer, the sample after the cells 201 are captured, the sheath liquid, and the like flow through the external flow path 105.
FIG. 2 shows an example in which a buffer, a sheath liquid, or the like flows in the direction of an arrow from left to right. The flow may be in the opposite direction.

細胞２０１が細胞捕獲部１０１に効率よく捕獲されるには、封止用流路１０３に流れた細胞含有試料を流し、同時に外部流路１０５にバッファー等を流すことにより、外部流路１０５における流れが細胞引き込み用通路１０４を介して細胞捕獲部１０１に吸引力を生じさせればよい。該吸引力により、試料中の細胞が細胞捕獲部１０１に引き込まれる。細胞２０１が引き込まれた後の試料は、細胞引き込み用通路１０４を通って外部流路１０５に排出される。封止用流路１０３の流れと外部流路１０５の流れは、独立して制御できる。 In order for the cells 201 to be efficiently captured by the cell capture unit 101, the cell-containing sample that has flowed through the sealing flow path 103 is flowed, and at the same time, a buffer or the like is flowed through the external flow path 105 so that the cells flow through the external flow path 105. May generate a suction force in the cell capture unit 101 via the cell attraction passage 104. The suction force attracts the cells in the sample to the cell capture unit 101. After the cells 201 have been drawn in, the sample is discharged to the external flow path 105 through the cell pull-in passage 104. The flow of the sealing flow path 103 and the flow of the external flow path 105 can be controlled independently.

なお、細胞捕獲部１０１は、例えば細胞２０１が１個入る大きさを有するようにしてもよい。例えば、平均直径10μm程度の細胞であれば、細胞捕獲部１０１の開口部や深さは15〜20μ程度にすればよい。また、細胞塊であれば100μm程度等にするなど、適宜変更できる。
図３に、細胞捕獲部１０１及び細胞引き込み用通路１０４のサイズの例を示す。 The cell capture unit 101 may have a size for containing, for example, one cell 201. For example, in the case of cells having an average diameter of about 10 μm, the opening and depth of the cell capture unit 101 may be about 15 to 20 μm. Further, if it is a cell mass, it can be changed as appropriate, such as about 100 μm.
FIG. 3 shows an example of the sizes of the cell capture unit 101 and the cell attraction passage 104.

図３のサイズに基づいて成形したマイクロチップの横断面の写真を図４に示す。
マイクロチップは、前述した波形構造を有する。天板を有する封止用流路内では、試料の液流が層流となっており、常に封止用流路の中央の流速が流路側面付近より早いという特性がある。そのため、波形頂部の流速が早くなる。よって、波形頂部に細胞捕獲部を設けたことにより、細胞が細胞捕獲部に２個以上入ろうとするダブレットを防ぐことができる。つまり、ダブレットになろうとして２個目の細胞が付着しても波形構造の波形頂部の流速が早いため、中央層流に流されて２個目以降が入りにくくなる。
また、アレイ型マイクロチップの上面の写真を図５及び図６に示す。図６は図５の一部を拡大したものである。ダブレットになっているウェルがわずかにあるものの、ほとんどのウェルには単一細胞が捕獲されている。 A photograph of the cross section of the microchip formed based on the size of FIG. 3 is shown in FIG.
The microchip has the above-mentioned corrugated structure. In the sealing flow path having the top plate, the liquid flow of the sample is a laminar flow, and the flow velocity at the center of the sealing flow path is always faster than that near the side surface of the flow path. Therefore, the flow velocity at the top of the waveform becomes faster. Therefore, by providing the cell capture portion at the top of the waveform, it is possible to prevent doublets in which two or more cells try to enter the cell capture portion. That is, even if the second cell adheres to become a doublet, the flow velocity at the top of the waveform of the corrugated structure is high, so that the second and subsequent cells are difficult to enter due to the central laminar flow.
Further, photographs of the upper surface of the array type microchip are shown in FIGS. 5 and 6. FIG. 6 is an enlargement of a part of FIG. Most wells contain single cells, although there are a few doublet wells.

なお、細胞捕獲部１０１は、細胞代謝能の測定用センサが組み込まれていてもよい。例えば、細胞捕獲部１０１に入るサイズの測定用センサが壁面等に設置されてもよいし、細胞捕獲部１０１の底面にシート型測定用センサが設置されてもよいし、捕獲部１０１に固定化されていてもよい。あるいは、シース液や試薬等に含有されてもよい。
センサとして、例えば酸素消費量測定用センサ、pHセンサ等が挙げられる。具体的には、燐光の時定数の変化による酸素濃度測定用センサ、水素イオン濃度の変化に従い燐光の時定数が変化するセンサ、酸素濃度及び水素イオン濃度を独立した波長帯（励起又は蛍光波長）で燐光を示すセンサ、又はこれらを組み合わせたものが挙げられる。 The cell capture unit 101 may incorporate a sensor for measuring cell metabolic capacity. For example, a measurement sensor having a size that fits in the cell capture unit 101 may be installed on a wall surface or the like, a sheet-type measurement sensor may be installed on the bottom surface of the cell capture unit 101, or the sensor may be fixed to the capture unit 101. It may have been. Alternatively, it may be contained in a sheath liquid, a reagent or the like.
Examples of the sensor include a sensor for measuring oxygen consumption, a pH sensor, and the like. Specifically, a sensor for measuring oxygen concentration due to a change in the time constant of phosphorescence, a sensor in which the time constant of phosphorescence changes according to a change in hydrogen ion concentration, and an independent wavelength band (excitation or fluorescence wavelength) for oxygen concentration and hydrogen ion concentration. Examples thereof include a sensor that exhibits phosphorescence, or a combination thereof.

細胞捕獲部１０１に細胞２０１が捕獲された後、細胞捕獲部を封止する流体が封止用流路１０３、細胞引き込み用通路１０４、外部流路１０５に導入される。
封止用流体は、オキソニウムイオン、水素イオン等のイオン、酸素分子、水素分子等の気体、液体、例えば、細胞から排出・分泌される物質や、細胞に取り込まれる物質等の細胞代謝関連物質の透過性を実質的に有さないものである。 After the cells 201 are captured by the cell capture unit 101, the fluid that seals the cell capture unit is introduced into the sealing flow path 103, the cell attraction passage 104, and the external flow path 105.
The sealing fluid is an ion such as an oxonium ion or a hydrogen ion, a gas or liquid such as an oxygen molecule or a hydrogen molecule, and a cell metabolism-related substance such as a substance discharged / secreted from a cell or a substance taken into the cell. It has substantially no transparency.

ここで、「実質的に」とは、オキソニウムイオン、水素イオン等のイオン、酸素分子、水素分子等の気体、液体、細胞から排出・分泌される物質、細胞に取り込まれる物質等の細胞代謝関連物質のウェル間及びマイクロチップ間で拡散する量が、封止用流体が介在したときに、細胞代謝の測定において十分に無視できることをいう。好ましくは、細胞代謝の測定値の10％以内、より好ましくは1％以内である。
あるいは、「実質的に」とは、ウェルや封止用流路、外部流路等のサイズにもよるが、例えば50μm径のウェルが、封止用流体が介在しかつ該ウェル以外の部分であって細胞代謝関連物質が満たされている部分に接しているときに、該ウェルが前記細胞代謝関連物質で満たされるまでの時間が、好ましくは10分以上、より好ましくは60分以上かかることをいう。 Here, "substantially" means cell metabolism of ions such as oxonium ions and hydrogen ions, gas and liquid such as oxygen molecules and hydrogen molecules, substances excreted and secreted from cells, and substances taken up by cells. It means that the amount of the related substance diffused between the wells and between the microchips is sufficiently negligible in the measurement of cell metabolism when the sealing fluid is present. Preferably, it is within 10%, more preferably within 1% of the measured value of cell metabolism.
Alternatively, "substantially" depends on the size of the well, the sealing flow path, the external flow path, etc., but for example, a well having a diameter of 50 μm is a portion other than the well where the sealing fluid is interposed. When in contact with the portion filled with the cell metabolism-related substance, it takes preferably 10 minutes or more, more preferably 60 minutes or more, for the well to be filled with the cell metabolism-related substance. say.

封止用流体は、酸素溶解度や拡散定数ができるだけ小さい液体を選択することが好ましい。酸素溶解度又は拡散定数の値が大きい場合は封止機能が十分に働かない。また、酸素分子及び水素イオンの極性の点から、水よりも極性の低い液体が好ましい。
例えば、鉱物油（パラフィン系、ケロシン、炭化水素又は鎖式飽和炭化水素系等）が挙げられる。また、粘度の高い流体では拡散定数が低くなるので、炭化水素又は鎖式飽和炭化水素系の場合、炭化水素が長い方が好ましい。
酸素透過性が低い流体としては、グリセリン、ジエチレングリコール、PEG 400、エチレングリコール、ポリイソブチレン、ポリイソブチレンとポリスチレンとの混合物等が挙げられる。
水素イオンの封止可能な流体としては、極性の無い液体が挙げられ、例えばパラフィン、ポリイソブチレン等である。 As the sealing fluid, it is preferable to select a liquid having an oxygen solubility and a diffusion constant as small as possible. If the value of oxygen solubility or diffusion constant is large, the sealing function does not work sufficiently. Further, from the viewpoint of the polarity of oxygen molecules and hydrogen ions, a liquid having a lower polarity than water is preferable.
For example, mineral oils (paraffin-based, kerosene, hydrocarbons, chain saturated hydrocarbons, etc.) can be mentioned. Further, since the diffusion constant is low in a fluid having a high viscosity, a longer hydrocarbon is preferable in the case of a hydrocarbon or a chain saturated hydrocarbon system.
Examples of the fluid having low oxygen permeability include glycerin, diethylene glycol, PEG 400, ethylene glycol, polyisobutylene, and a mixture of polyisobutylene and polystyrene.
Examples of the fluid that can seal hydrogen ions include non-polar liquids, such as paraffin and polyisobutylene.

また、細胞２０１の代謝能をインビトロで測定するため、細胞捕獲部１０１の温度を制御することも考えられる。そのため、封止用流体は、温度変化によって性質が大きく変わらず、常温常圧で液体であるものが好ましい。かつ、封止用流体は、本技術のマイクロチップの材質や細胞等に影響を与えないことが好ましい。
封止用流体は、１種類選択して用いてもよいし、又は複数種類を選択してもよいし、複数種類を混合して用いてもよい。 Further, in order to measure the metabolic capacity of the cell 201 in vitro, it is conceivable to control the temperature of the cell capture unit 101. Therefore, it is preferable that the sealing fluid is a liquid at normal temperature and pressure without significantly changing its properties due to temperature changes. Moreover, it is preferable that the sealing fluid does not affect the material, cells, etc. of the microchip of the present technology.
One type of sealing fluid may be selected and used, a plurality of types may be selected, or a plurality of types may be mixed and used.

更に、封止用流体とマイクロチップ表面との親和性も考慮することが好ましい。
例えば、封止用流体が鉱物油の場合、鉱物油を封止用流路１０３に流したときにマイクロチップ表面が親油性であることが好ましい。
一方、細胞捕獲部１０１には細胞含有試料やシース液を保持しておくので、親水性であることが好ましい。 Further, it is preferable to consider the affinity between the sealing fluid and the surface of the microchip.
For example, when the sealing fluid is mineral oil, it is preferable that the surface of the microchip is lipophilic when the mineral oil is flowed through the sealing flow path 103.
On the other hand, since the cell-containing sample and the sheath liquid are held in the cell capture unit 101, it is preferably hydrophilic.

従って、封止用流路１０３と封止用流路側の側壁４０２の表面には、例えば疎水基があることが好ましい。
一方で、細胞捕獲部１０１の表面には、親水基があることが好ましい。また、細胞引き込み用通路の１０４の表面にも親水基があることが好ましい。 Therefore, it is preferable that the surfaces of the sealing flow path 103 and the side wall 402 on the sealing flow path side have, for example, hydrophobic groups.
On the other hand, it is preferable that the surface of the cell capture unit 101 has a hydrophilic group. Further, it is preferable that the surface of 104 of the cell attraction passage also has a hydrophilic group.

封止用流路１０３と封止用流路側の側壁４０２の表面の親油性は、マイクロチップに採用される材質の樹脂の性質に依ることができる。または、封止用流路１０３と側壁４０２の表面にCnH2n+1基、C6H5基等の疎水基を導入してもよい。
細胞捕獲部１０１の表面を親水性にするには、フッ素ガスと酸素を表面に当てることによるカルボキシル基の導入、フッ素ガスと二酸化硫黄を表面に当てることによるスルホン酸基の導入等で行うことができる。 The lipophilicity of the surfaces of the sealing flow path 103 and the side wall 402 on the sealing flow path side can depend on the properties of the resin of the material used for the microchip. Alternatively, hydrophobic groups such as C n H 2n + 1 group and C 6 H 5 group may be introduced on the surfaces of the sealing flow path 103 and the side wall 402.
In order to make the surface of the cell capture unit 101 hydrophilic, it is possible to introduce a carboxyl group by exposing the surface to fluorine gas and oxygen, or to introduce a sulfonic acid group by applying fluorine gas and sulfur dioxide to the surface. can.

封止用流体は、封止用流路１０３に流し、細胞捕獲部１０１の側壁４０２の側部及び細胞捕獲部１０１の上部を封止する。よって、細胞捕獲部１０１外の上部の面は封止用流体で覆われて直接的に封止できる。これにより、細胞捕獲部１０１に保持された細胞２０１の細胞代謝能、例えば酸素消費量の測定において酸素不透過性が担保され、測定がより正確に行える。 The sealing fluid is allowed to flow through the sealing flow path 103 to seal the side portion of the side wall 402 of the cell capture portion 101 and the upper portion of the cell capture portion 101. Therefore, the upper surface outside the cell capture unit 101 is covered with the sealing fluid and can be directly sealed. As a result, oxygen impermeability is ensured in the measurement of the cell metabolic capacity of the cells 201 held in the cell capture unit 101, for example, the amount of oxygen consumed, and the measurement can be performed more accurately.

また、前述したように、細胞引き込み用通路１０４、外部流路１０５にも封止用流体を流せる。よって、細胞捕獲部１０１外の下部の面は、まずマイクロチップの材質により直接的に封止でき、更に外部流路１０５に満たされた封止用流体により間接的に封止できる。細胞捕獲部１０１外の側部は、まずマイクロチップの側壁４０２の材質により直接的に封止でき、更に細胞捕獲部１０１の周囲をとりまく封止用流路１０３に満たされた封止用流体により間接的に封止できる。よって、複数の細胞捕獲部１０１間での酸素等のコンタミネーションを抑えることができる。 Further, as described above, the sealing fluid can also flow through the cell attraction passage 104 and the external passage 105. Therefore, the lower surface outside the cell capture portion 101 can be first directly sealed by the material of the microchip, and further indirectly sealed by the sealing fluid filled in the external flow path 105. The side portion outside the cell capture portion 101 can be directly sealed by the material of the side wall 402 of the microchip, and further by the sealing fluid filled in the sealing flow path 103 surrounding the cell capture portion 101. Can be sealed indirectly. Therefore, contamination of oxygen and the like between the plurality of cell capture units 101 can be suppressed.

１−３．実施態様２
本技術のマイクロチップの実施態様２を図７に示す。
マイクロチップ１は、その内部に、試料流入部５０１、流体流入部５０２、試料流出部５０３、流体流出部５０４を有してもよい。
試料流入部５０１と流体流入部５０２は分けずに兼用してもよいし、試料流出部５０３と流体流出部５０４も分けずに兼用してもよい。 1-3. Embodiment 2
A second embodiment of the microchip of the present technology is shown in FIG.
The microchip 1 may have a sample inflow section 501, a fluid inflow section 502, a sample outflow section 503, and a fluid outflow section 504 inside the microchip 1.
The sample inflow section 501 and the fluid inflow section 502 may be shared without being separated, or the sample outflow section 503 and the fluid outflow section 504 may be used without being separated.

図４は、試料及び流体が右上から左下に矢印方向に流れる例を示す。
試料は、試料流入部から導入し、封止用流路１０３に流れ、細胞捕獲部１０１の上部及び細胞捕獲部１０１内にも流れて、細胞捕獲部１０１に試料中の細胞が捕獲される。
細胞捕獲後、バッファーやシース液、洗浄液等で残余の試料を試料流出部５０３に流してもよい。 FIG. 4 shows an example in which the sample and fluid flow from the upper right to the lower left in the direction of the arrow.
The sample is introduced from the sample inflow section, flows into the sealing flow path 103, flows to the upper part of the cell capture section 101 and into the cell capture section 101, and the cells in the sample are captured by the cell capture section 101.
After capturing the cells, the remaining sample may be poured into the sample outflow section 503 with a buffer, a sheath solution, a washing solution, or the like.

次に、封止用流体を流体流入部５０２に導入する。封止用流体は、封止用流路１０３と細胞捕獲部１０１の上部とに流れる。このとき、細胞捕獲部１０１は、細胞及び試料で満たされたまま、細胞捕獲部１０１の上部に封止用流体が導入されることにより封止される。また、封止用流路１０３に封止用流体が導入されることにより、細胞捕獲部１０１の側部が封止用流体で満たされ、細胞捕獲部１０１は、側壁１０２と封止用流体とで封止される。 Next, the sealing fluid is introduced into the fluid inflow section 502. The sealing fluid flows to the sealing flow path 103 and the upper part of the cell capture unit 101. At this time, the cell capture unit 101 is sealed by introducing a sealing fluid into the upper part of the cell capture unit 101 while being filled with the cells and the sample. Further, by introducing the sealing fluid into the sealing flow path 103, the side portion of the cell capture portion 101 is filled with the sealing fluid, and the cell capture portion 101 becomes the side wall 102 and the sealing fluid. It is sealed with.

封止したまま、細胞２０１の細胞代謝能を測定した後、封止用流体をバッファーや試薬等を流すことにより押出し、流体流出部に排出してもよい。
このような操作で、細胞を傷付けることなく細胞に影響を与えることなく、封止及び封止の解除を繰り返し行うことができる。 After measuring the cell metabolic capacity of the cells 201 in the sealed state, the sealing fluid may be extruded by flowing a buffer, a reagent, or the like and discharged to the fluid outflow portion.
By such an operation, sealing and unsealing can be repeated without damaging the cells and affecting the cells.

１−４．マイクロチップの製造方法
本技術の酸素消費量測定用マイクロチップは、例えば以下のように製造できる。
ジメチルポリシロキサン（PDMS）の基板の全体に、エチレン−ビニルアルコール共重合体（EVOH）のフィルムを積層する。その上に、細胞の酸素代謝を測定できるシート型センサを積層する。基板への積層はスピンコーティング等の技術で行うことができる。 1-4. Manufacturing method of microchip The microchip for measuring oxygen consumption of this technology can be manufactured as follows, for example.
A film of ethylene-vinyl alcohol copolymer (EVOH) is laminated over the entire substrate of dimethylpolysiloxane (PDMS). A sheet-type sensor capable of measuring the oxygen metabolism of cells is laminated on the sheet. Lamination on the substrate can be performed by a technique such as spin coating.

次に、積層した基板のエンボス加工によりウェル（細胞捕獲部１０１に該当）を形成する。エンボス加工用の押し型は、所望の形状に加工するように形成できる。例えば、前記実施態様１の波形構造を形成する押し型にできる。また、エンボス加工の条件は、例えば130℃、10kNとすることができる。 Next, wells (corresponding to the cell capture unit 101) are formed by embossing the laminated substrates. The embossing die can be formed so as to be processed into a desired shape. For example, it can be a stamp that forms the corrugated structure of the first embodiment. The conditions for embossing can be, for example, 130 ° C. and 10 kN.

細胞代謝能測定時には、押し型を外し、ウェルの底部に積層されたシート型センサを残し、その他の部分のシート型センサを基板から剥がす。これにより、ウェルに細胞が捕捉されたときにシート型センサで酸素消費量を測定できる。 When measuring cell metabolic capacity, the stamp is removed, leaving the sheet-type sensor laminated on the bottom of the well, and the sheet-type sensor in the other part is peeled off from the substrate. This allows the sheet sensor to measure oxygen consumption when cells are trapped in the wells.

＜２．細胞代謝測定装置＞
本技術の細胞代謝測定装置の例を図８に示す。
細胞代謝測定装置１１は、
試料に含有される細胞を捕獲する細胞捕獲部と、前記細胞捕獲部を封止する流体が導入される封止用流路とを有し、前記流体は細胞代謝関連物質の透過性、特に酸素透過性及び／又は水素透過性を実質的に有さないものである、細胞の代謝を測定するためのマイクロチップ１、
前記マイクロチップの封止用流路に前記流体を導入する流体導入部２、及び
前記マイクロチップの細胞捕獲部に捕獲された細胞の代謝を測定する測定部３
を有する。 <2. Cell metabolism measuring device>
An example of the cell metabolism measuring device of the present technology is shown in FIG.
The cell metabolism measuring device 11
It has a cell capture section that captures cells contained in the sample and a sealing flow path into which a fluid that seals the cell capture section is introduced, and the fluid is permeable to cell metabolism-related substances, particularly oxygen. Microchips for measuring cell metabolism 1, which are substantially non-permeable and / or hydrogen permeable.
A fluid introduction unit 2 that introduces the fluid into the sealing flow path of the microchip, and a measurement unit 3 that measures the metabolism of cells captured by the cell capture unit of the microchip.
Have.

マイクロチップ１は、細胞代謝測定装置１１において容易に交換することができる。マイクロチップ１はディスポーザブル又はリサイクル可能にすることができる。
また、マイクロチップ１を設置する装置部分には、生細胞が活動する温度、例えばヒト由来の細胞であれば細胞捕獲部が35〜40℃になるようなヒーターを設置することができる。 The microchip 1 can be easily replaced in the cell metabolism measuring device 11. The microchip 1 can be disposable or recyclable.
Further, a heater can be installed in the device portion where the microchip 1 is installed so that the temperature at which the living cells are active, for example, in the case of human-derived cells, the cell capture portion is 35 to 40 ° C.

流体導入部２は、細胞代謝関連物質等の透過性を実質的に有さない流体をマイクロチップ１内に導入する。流体導入部２は、図４に示した流体流入部５０２と連結している。
そして、流体導入部２は、例えばポンプ等の送液装置を有しており、例えば加圧により封止用流体をマイクロチップ１内に送り込むことができる。
なお、流体導入部２は試料導入部（図示せず）や細胞刺激試薬導入部（図示せず）と兼用としてもよい。 The fluid introduction unit 2 introduces a fluid having substantially no permeability such as a cell metabolism-related substance into the microchip 1. The fluid introduction unit 2 is connected to the fluid inflow unit 502 shown in FIG.
The fluid introduction unit 2 has, for example, a liquid feeding device such as a pump, and can feed the sealing fluid into the microchip 1 by, for example, pressurizing.
The fluid introduction unit 2 may also be used as a sample introduction unit (not shown) or a cell stimulating reagent introduction unit (not shown).

測定部３は、例えば前記酸素消費量を測定できるシート型センサからの信号を受け、細胞代謝能を測定する。測定は経時的に行うことができる。
測定部３の具体例としては、蛍光強度を測定する測定部、個々の細胞捕獲部１０１における燐光の時定数の経時変化を測定する測定部、高速イメージング等を使って一括で複数の細胞捕獲部１０１における燐光の時定数の変化を測定する測定部等が挙げられる。
また、細胞代謝能測定前に、どの細胞捕獲部１０１に細胞が捕獲されたかを画像データを取得する装置（CMOS、CCD等）を含めてもよい。画像データで各々の細胞捕獲部１０１に細胞が捕獲されたことを確認後、細胞代謝能を測定してもよい。 The measuring unit 3 receives a signal from, for example, a sheet-type sensor capable of measuring the oxygen consumption, and measures the cell metabolic capacity. The measurement can be performed over time.
Specific examples of the measuring unit 3 include a measuring unit for measuring fluorescence intensity, a measuring unit for measuring the time constant of phosphorescence in each cell capturing unit 101, and a plurality of cell capturing units at once using high-speed imaging or the like. Examples thereof include a measuring unit that measures a change in the time constant of phosphorescence in 101.
In addition, a device (CMOS, CCD, etc.) for acquiring image data of which cell capture unit 101 has captured cells may be included before measuring the cell metabolic capacity. After confirming that the cells have been captured by each cell capture unit 101 from the image data, the cell metabolic capacity may be measured.

測定後は、測定結果に基づいて所望の細胞を選択し、キャピラリー等で回収することもできる。
または、特定の細胞を認識できるように試薬でマーキングしておき、細胞を全部回収した後、マーキングした細胞のみを選択することもできる。 After the measurement, desired cells can be selected based on the measurement result and collected by a capillary or the like.
Alternatively, it is also possible to mark specific cells with a reagent so that they can be recognized, collect all the cells, and then select only the marked cells.

＜３．細胞代謝測定方法＞
本技術の細胞代謝測定方法は、本技術のマイクロチップを用い、
以下の工程（Ａ）〜（Ｃ）：
（Ａ）前記細胞を細胞捕獲部に捕獲する工程、
（Ｂ）前記封止用流路に流体を導入し、前記細胞捕獲部を封止する工程、及び
（Ｃ）前記細胞の代謝を測定する工程
を含んで行う。 <3. Cell metabolism measurement method>
The cell metabolism measurement method of this technology uses the microchip of this technology.
The following steps (A) to (C):
(A) A step of capturing the cells in a cell capture unit,
(B) A step of introducing a fluid into the sealing flow path and sealing the cell capture portion, and (C) a step of measuring the metabolism of the cells are included.

細胞代謝測定方法の工程の例を図１０に示す。
まず、マイクロチップに細胞を含有する試料を導入する。細胞をマイクロチップ内で運ぶためにシース液等を用いてもよい。運ばれた細胞はマイクロチップの細胞捕獲部にて、例えば１個ずつ捕獲される（S101）。捕獲されなかった細胞や余剰の試料は、シース液や洗浄液で洗い流しても、封止用流体で押出してもよい。 An example of the process of the cell metabolism measurement method is shown in FIG.
First, a sample containing cells is introduced into a microchip. Sheath fluid or the like may be used to carry the cells within the microchip. The carried cells are captured, for example, one by one at the cell capture section of the microchip (S101). Uncaptured cells and surplus samples may be washed away with a sheath solution or washing solution, or extruded with a sealing fluid.

ここで、マイクロチップに封止用流体を流し、細胞捕獲部を封止して、最初の細胞代謝能を測定してもよい。それにより、最初の測定結果と、経時後の測定結果や細胞刺激後の測定結果とを比較することができる。
測定項目として、例えば酸素透過性、水素イオンの濃度、pHが挙げられるが、特に限定されない。 Here, the sealing fluid may be flowed through the microchip to seal the cell capture portion, and the initial cell metabolic capacity may be measured. Thereby, the initial measurement result can be compared with the measurement result after aging and the measurement result after cell stimulation.
The measurement items include, for example, oxygen permeability, hydrogen ion concentration, and pH, but are not particularly limited.

次に、封止用流体をバッファーや洗浄液で押出す等してマイクロチップから除去した後、細胞に細胞刺激物質を適用し、細胞を刺激してもよい（S102）。細胞刺激物質として、例えば、糖、アミノ酸、脂肪、酸・アルカリ（pH調整剤）が挙げられる。 Next, after removing the sealing fluid from the microchip by extruding it with a buffer or a washing solution, a cell stimulant may be applied to the cells to stimulate the cells (S102). Examples of cell stimulants include sugars, amino acids, fats, and acids / alkalis (pH regulators).

細胞を刺激した後、再度マイクロチップの細胞捕獲部を封止用流体で封止し（S103）、細胞代謝能を測定する（S104）。そして、封止用流体をバッファー等で押出して封止を解除する（S105）。S102又はS103からS105を繰り返して測定を複数回又は経時的に行うことができる。 After stimulating the cells, the cell capture part of the microchip is sealed again with a sealing fluid (S103), and the cell metabolic capacity is measured (S104). Then, the sealing fluid is extruded with a buffer or the like to release the sealing (S105). The measurement can be performed a plurality of times or over time by repeating S102 or S103 to S105.

＜４．細胞代謝測定システム＞
本技術の細胞代謝測定システムの例を図１０に示す。
細胞代謝測定システム１０００は、
細胞代謝測定装置１１と、
流体の流れの制御及び測定を、細胞代謝測定装置１１の装置部に実行させるためのプログラムを有する装置制御部１２と、
装置１１にある測定部により得られた測定データを解析する解析部と、
測定部により得られた測定データ及び／又は前記解析部により得られた解析結果を表示する表示部と、
を有する。 <4. Cell metabolism measurement system>
An example of the cell metabolism measurement system of the present technology is shown in FIG.
The cell metabolism measurement system 1000
Cell metabolism measuring device 11 and
A device control unit 12 having a program for causing the device unit of the cell metabolism measuring device 11 to control and measure the fluid flow, and
An analysis unit that analyzes the measurement data obtained by the measurement unit in the device 11 and
A display unit that displays the measurement data obtained by the measurement unit and / or the analysis result obtained by the analysis unit, and
Have.

細胞代謝測定装置１１は、マイクロチップへの封止用流体、試料、細胞刺激物質の試薬等の導入、それらの流れ、マイクロチップの温度、測定時間の測定条件や装置動作が、装置制御部１２により制御される。装置制御部１２は、例えばコンピュータである。
装置制御部１２はプログラムを搭載しており、プログラムには予め測定条件や装置動作が設定され、該条件に応じて細胞代謝測定装置１１を制御する。 In the cell metabolism measuring device 11, the device control unit 12 controls the introduction of the sealing fluid, the sample, the reagent for the cell stimulant, etc. into the microchip, their flow, the temperature of the microchip, the measurement conditions of the measurement time, and the device operation. Is controlled by. The device control unit 12 is, for example, a computer.
The device control unit 12 is equipped with a program, and measurement conditions and device operations are set in advance in the program, and the cell metabolism measuring device 11 is controlled according to the conditions.

細胞代謝測定装置１１の測定部により測定されたデータは解析部１３に送られ、解析部１３で解析される。解析は、各々の細胞から得られた酸素消費量データやpHデータを組み合わせ、どの細胞がどの程度の細胞代謝能を有しているかを分析することにより行う。解析結果に基づいて所望の細胞を選択するために、所望の細胞捕獲部を特定できる。
また、解析結果を装置制御部１２にフィードバックし、自動的に測定条件や装置動作を変えることもできる。 The data measured by the measuring unit of the cell metabolism measuring device 11 is sent to the analysis unit 13 and analyzed by the analysis unit 13. The analysis is performed by combining oxygen consumption data and pH data obtained from each cell and analyzing which cell has what degree of cell metabolic capacity. The desired cell capture site can be identified in order to select the desired cells based on the analysis results.
Further, the analysis result can be fed back to the device control unit 12, and the measurement conditions and the device operation can be automatically changed.

表示部１４は、細胞代謝測定装置１１の測定部により得られた測定データや解析部１３により得られた解析結果等を表示する。具体的には、コンピュータに備え付けられたディスプレイ、プリントアウト装置等が挙げられる。 The display unit 14 displays the measurement data obtained by the measurement unit of the cell metabolism measuring device 11 and the analysis result obtained by the analysis unit 13. Specific examples thereof include a display installed in a computer, a printout device, and the like.

なお、本技術は、以下のような構成も採ることができる。
〔１〕 試料に含有される細胞を捕獲する細胞捕獲部と、
前記細胞捕獲部を封止する流体が導入される封止用流路と
を有し、
前記流体は、細胞代謝関連物質の透過性を実質的に有さないものである、
細胞の代謝を測定するためのマイクロチップ。
〔２〕 前記流体は鉱物油から１種類又は複数種類が選択されたものである、〔１〕のマイクロチップ。
〔３〕 前記細胞捕獲部は細胞代謝関連物質の透過性を実質的に有さない材質で形成された、〔１〕又は〔２〕のマイクロチップ。
〔４〕 前記細胞捕獲部の表面は親水性である、〔１〕〜〔３〕のいずれかのマイクロチップ。
〔５〕 前記封止用流路の表面は疎水性である、〔１〕〜〔４〕のいずれかのマイクロチップ。
〔６〕 前記封止用流路は、前記細胞捕獲部外の上部、下部及び側部からなる群から選択される面を直接的又は間接的に封止するように形成された、〔１〕〜〔５〕のいずれかのマイクロチップ。
〔７〕 前記細胞捕獲部は細胞引き込み用通路を有する、〔１〕〜〔６〕のいずれかのマイクロチップ。
〔８〕 更に、試料流入部、試料流出部、流体流入部及び流体流出部を有する、〔１〕〜〔７〕のいずれかのマイクロチップ。
〔９〕 前記細胞は単一細胞又は細胞塊である、〔１〕〜〔８〕のいずれかのマイクロチップ。
〔１０〕 細胞の代謝を測定するための装置であって、
試料に含有される細胞を捕獲する細胞捕獲部と、前記細胞捕獲部を封止する流体が導入される封止用流路とを有し、前記流体は細胞代謝関連物質の透過性を実質的に有さないものである、細胞の代謝を測定するためのマイクロチップ、
前記マイクロチップの封止用流路に前記流体を導入する流体導入部、及び
前記マイクロチップの細胞捕獲部に捕獲された細胞の代謝を測定する測定部
を有する、前記装置。
〔１１〕 細胞の代謝を測定する方法であって、
試料に含有される細胞を捕獲する細胞捕獲部と、前記細胞捕獲部を封止する流体が導入される封止用流路とを有し、前記流体は細胞代謝関連物質の透過性を実質的に有さないものである、細胞の代謝を測定するためのマイクロチップを用い、以下の工程（Ａ）〜（Ｃ）：
（Ａ）前記細胞を細胞捕獲部に捕獲する工程、
（Ｂ）前記封止用流路に流体を導入し、前記細胞捕獲部を封止する工程、及び
（Ｃ）前記細胞の代謝を測定する工程
を含む、前記方法。
〔１２〕 前記工程（Ｃ）は、酸素透過性及び／又は水素イオンの濃度を測定することにより行う、〔１１〕に記載の方法。
〔１３〕 前記工程（Ａ）で捕獲された細胞に細胞刺激物質を適用する工程を更に含む、〔１１〕又は〔１２〕に記載の方法。
〔１４〕 細胞の代謝を測定するためのシステムであって、
試料に含有される細胞を捕獲する細胞捕獲部と、前記細胞捕獲部を封止する流体が導入される封止用流路とを有し、前記流体は細胞代謝関連物質の透過性を実質的に有さないものである、細胞の代謝を測定するためのマイクロチップ、前記マイクロチップの封止用流路に前記流体を導入する流体導入部、並びに前記マイクロチップの細胞捕獲部に捕獲された細胞の代謝を測定する測定部を有する、細胞の代謝を測定するための装置部と、
前記流体の流れの制御及び前記測定を前記装置部に実行させるためのプログラムを有する装置制御部と、
前記装置部により得られた測定データを解析する解析部と、
前記測定部により得られた測定データ及び／又は前記解析部により得られた解析結果を表示する表示部と、
を有する前記システム。 The present technology can also adopt the following configurations.
[1] A cell capture unit that captures cells contained in a sample,
It has a sealing flow path into which a fluid for sealing the cell capture portion is introduced, and has a sealing flow path.
The fluid is substantially impermeable to cell metabolism-related substances.
A microchip for measuring cell metabolism.
[2] The microchip according to [1], wherein the fluid is one or more selected from mineral oils.
[3] The microchip according to [1] or [2], wherein the cell capture portion is made of a material having substantially no permeability of a cell metabolism-related substance.
[4] The microchip according to any one of [1] to [3], wherein the surface of the cell capture portion is hydrophilic.
[5] The microchip according to any one of [1] to [4], wherein the surface of the sealing flow path is hydrophobic.
[6] The sealing flow path is formed so as to directly or indirectly seal a surface selected from the group consisting of an upper part, a lower part, and a side part outside the cell capture part. [1] ~ [5] Any of the microchips.
[7] The microchip according to any one of [1] to [6], wherein the cell capture unit has a cell attraction passage.
[8] Further, the microchip according to any one of [1] to [7], which has a sample inflow part, a sample outflow part, a fluid inflow part, and a fluid outflow part.
[9] The microchip according to any one of [1] to [8], wherein the cell is a single cell or a cell mass.
[10] A device for measuring cell metabolism.
It has a cell capture section that captures cells contained in the sample and a sealing flow path into which a fluid that seals the cell capture section is introduced, and the fluid substantially permeates the cell metabolism-related substance. A microchip for measuring cell metabolism, which is not found in
The apparatus having a fluid introduction unit that introduces the fluid into the sealing flow path of the microchip, and a measurement unit that measures the metabolism of cells captured in the cell capture unit of the microchip.
[11] A method for measuring cell metabolism.
It has a cell capture section that captures cells contained in the sample and a sealing flow path into which a fluid that seals the cell capture section is introduced, and the fluid substantially permeates the cell metabolism-related substance. Using a microchip for measuring cell metabolism, which is not present in the following steps (A) to (C):
(A) A step of capturing the cells in a cell capture unit,
The method comprising (B) introducing a fluid into the sealing flow path and sealing the cell capture portion, and (C) measuring the metabolism of the cells.
[12] The method according to [11], wherein the step (C) is performed by measuring oxygen permeability and / or the concentration of hydrogen ions.
[13] The method according to [11] or [12], further comprising the step of applying a cell stimulant to the cells captured in the step (A).
[14] A system for measuring cell metabolism.
It has a cell capture section that captures cells contained in the sample and a sealing flow path into which a fluid that seals the cell capture section is introduced, and the fluid substantially permeates the cell metabolism-related substance. It was captured by a microchip for measuring cell metabolism, a fluid introduction section that introduces the fluid into the sealing flow path of the microchip, and a cell capture section of the microchip, which are not present in the above. A device unit for measuring cell metabolism, which has a measuring unit for measuring cell metabolism,
An apparatus control unit having a program for controlling the fluid flow and causing the apparatus unit to execute the measurement.
An analysis unit that analyzes the measurement data obtained by the device unit,
A display unit that displays the measurement data obtained by the measurement unit and / or the analysis result obtained by the analysis unit, and
The system having.

１ マイクロチップ
２ 流体導入部
３ 測定部
１１ 細胞代謝測定装置
１２ 装置制御部
１３ 解析部
１４ 表示部
１５ 細胞含有試料
１０１ 細胞捕獲部
１０２ 側壁
１０３ 封止用流路
１０４ 細胞引き込み用通路
１０５ 外部流路
２０１ 細胞
４０１ 天板
４０２ 側壁
４０３ 底板
５０１ 試料流入部
５０２ 流体流入部
５０３ 試料流出部
５０４ 流体流出部
６０１ 基板
６０２ フィルム
６０３ シート型センサ
６０４ 押し型
１０００ 細胞代謝測定システム 1 Microchip 2 Fluid introduction unit 3 Measurement unit 11 Cell metabolism measurement device 12 Device control unit 13 Analysis unit 14 Display unit 15 Cell-containing sample 101 Cell capture unit 102 Side wall 103 Sealing flow path 104 Cell lead-in passage 105 External flow path 201 Cell 401 Top plate 402 Side wall 403 Bottom plate 501 Sample inflow part 502 Fluid inflow part 503 Sample outflow part 504 Fluid outflow part 601 Board 602 Film 603 Sheet type sensor 604 Push type 1000 Cell metabolism measurement system

Claims (14)

試料に含有される細胞を捕獲する細胞捕獲部と、
前記細胞捕獲部を封止する流体が導入される封止用流路と、
を有する、細胞の代謝を測定するためのマイクロチップであって、
前記流体は、細胞代謝関連物質の透過性を実質的に有さないものであり、
前記マイクロチップは、波形構造を有し、
前記細胞捕獲部は、前記波形構造における山部の頂部に形成され、且つ、側壁で囲まれた凹部である、マイクロチップ。 A cell capture unit that captures the cells contained in the sample,
A sealing flow path into which a fluid for sealing the cell capture portion is introduced, and a sealing flow path .
To have a, a microchip for measuring the metabolism of the cells,
The fluid state, and are not substantially no penetration of cellular metabolism-related substances,
The microchip has a corrugated structure
The cell capture portion is a microchip formed at the top of a mountain portion in the corrugated structure and is a recess surrounded by a side wall. 前記流体は鉱物油から１種類又は複数種類が選択されたものである、請求項１に記載のマイクロチップ。 The microchip according to claim 1, wherein the fluid is one or more selected from mineral oils. 前記細胞捕獲部は細胞代謝関連物質の透過性を実質的に有さない材質で形成された、請求項１又は２に記載のマイクロチップ。 The microchip according to claim 1 or 2 , wherein the cell capture unit is made of a material having substantially no permeability of a cell metabolism-related substance. 前記細胞捕獲部の表面は親水性である、請求項１から３のいずれか一項に記載のマイクロチップ。 The microchip according to any one of claims 1 to 3, wherein the surface of the cell capture portion is hydrophilic. 前記封止用流路の表面は疎水性である、請求項１から４のいずれか一項に記載のマイクロチップ。 The microchip according to any one of claims 1 to 4, wherein the surface of the sealing flow path is hydrophobic. 前記封止用流路は、前記細胞捕獲部外の上部、下部及び側部からなる群から選択される面を直接的又は間接的に封止するように形成された、請求項１から５のいずれか一項に記載のマイクロチップ。 15. The microchip according to any one item. 前記細胞捕獲部は細胞引き込み用通路を有する、請求項１から６のいずれか一項に記載のマイクロチップ。 The microchip according to any one of claims 1 to 6, wherein the cell capture unit has a cell attraction passage. 更に、試料流入部、試料流出部、流体流入部及び流体流出部を有する、請求項１から７のいずれか一項に記載のマイクロチップ。 The microchip according to any one of claims 1 to 7, further comprising a sample inflow section, a sample outflow section, a fluid inflow section, and a fluid outflow section. 前記細胞は単一細胞又は細胞塊である、請求項１から８のいずれか一項に記載のマイクロチップ。 The microchip according to any one of claims 1 to 8, wherein the cell is a single cell or a cell mass. 細胞の代謝を測定するための装置であって、
試料に含有される細胞を捕獲する細胞捕獲部と、前記細胞捕獲部を封止する流体が導入される封止用流路と、を有する、細胞の代謝を測定するためのマイクロチップであって、前記流体は、細胞代謝関連物質の透過性を実質的に有さないものであり、前記マイクロチップは、波形構造を有し、前記細胞捕獲部は、前記波形構造における山部の頂部に形成され、且つ、側壁で囲まれた凹部である、マイクロチップ、
前記マイクロチップの封止用流路に前記流体を導入する流体導入部、及び
前記マイクロチップの細胞捕獲部に捕獲された細胞の代謝を測定する測定部
を有する、前記装置。 A device for measuring cell metabolism
To Yes a cell capture unit for capturing cells contained in the sample, the sealing channel the fluid to seal the cell capture portion is introduced, and a microchip for measuring the metabolism of the cells Te, the fluid state, and are not substantially no penetration of cellular metabolism-related substances, wherein the microchip has a waved configuration, the cell capture unit, the top of the mountain portion in the waveform structure A microchip, which is a recess formed in a wall and surrounded by a side wall.
The apparatus having a fluid introduction unit that introduces the fluid into the sealing flow path of the microchip, and a measurement unit that measures the metabolism of cells captured in the cell capture unit of the microchip. 細胞の代謝を測定する方法であって、
試料に含有される細胞を捕獲する細胞捕獲部と、前記細胞捕獲部を封止する流体が導入される封止用流路と、を有する、細胞の代謝を測定するためのマイクロチップであって、前記流体は、細胞代謝関連物質の透過性を実質的に有さないものであり、前記マイクロチップは、波形構造を有し、前記細胞捕獲部は、前記波形構造における山部の頂部に形成され、且つ、側壁で囲まれた凹部である、マイクロチップを用い、以下の工程（Ａ）〜（Ｃ）：
（Ａ）前記細胞を細胞捕獲部に捕獲する工程、
（Ｂ）前記封止用流路に流体を導入し、前記細胞捕獲部を封止する工程、及び
（Ｃ）前記細胞の代謝を測定する工程
を含む、前記方法。 A method of measuring cell metabolism
To Yes a cell capture unit for capturing cells contained in the sample, the sealing channel the fluid to seal the cell capture portion is introduced, and a microchip for measuring the metabolism of the cells Te, the fluid state, and are not substantially no penetration of cellular metabolism-related substances, wherein the microchip has a waved configuration, the cell capture unit, the top of the mountain portion in the waveform structure The following steps (A) to (C):
(A) A step of capturing the cells in a cell capture unit,
The method comprising (B) introducing a fluid into the sealing flow path and sealing the cell capture portion, and (C) measuring the metabolism of the cells. 前記工程（Ｃ）は、酸素透過性及び／又は水素イオンの濃度を測定することにより行う、請求項１１に記載の方法。 The method according to claim 11, wherein the step (C) is performed by measuring oxygen permeability and / or the concentration of hydrogen ions. 前記工程（Ａ）で捕獲された細胞に細胞刺激物質を適用する工程を更に含む、請求項１１又は１２に記載の方法。 The method according to claim 11 or 12 , further comprising the step of applying a cell stimulant to the cells captured in the step (A). 細胞の代謝を測定するためのシステムであって、
試料に含有される細胞を捕獲する細胞捕獲部と、前記細胞捕獲部を封止する流体が導入される封止用流路と、を有する、細胞の代謝を測定するためのマイクロチップであって、前記流体は、細胞代謝関連物質の透過性を実質的に有さないものであり、前記マイクロチップは、波形構造を有し、前記細胞捕獲部は、前記波形構造における山部の頂部に形成され、且つ、側壁で囲まれた凹部である、マイクロチップ、前記マイクロチップの封止用流路に前記流体を導入する流体導入部、並びに前記マイクロチップの細胞捕獲部に捕獲された細胞の代謝を測定する測定部を有する、細胞の代謝を測定するための装置部と、
前記流体の流れの制御及び前記測定を前記装置部に実行させるためのプログラムを有する装置制御部と、
前記装置部により得られた測定データを解析する解析部と、
前記測定部により得られた測定データ及び／又は前記解析部により得られた解析結果を表示する表示部と、
を有する前記システム。
A system for measuring cell metabolism
To Yes a cell capture unit for capturing cells contained in the sample, the sealing channel the fluid to seal the cell capture portion is introduced, and a microchip for measuring the metabolism of the cells Te, the fluid state, and are not substantially no penetration of cellular metabolism-related substances, wherein the microchip has a waved configuration, the cell capture unit, the top of the mountain portion in the waveform structure Microchip, a fluid introduction section that introduces the fluid into the sealing flow path of the microchip, and cells captured by the cell capture section of the microchip, which are recesses formed in and surrounded by side walls. A device unit for measuring cell metabolism, which has a measuring unit for measuring metabolism of cells,
An apparatus control unit having a program for controlling the fluid flow and causing the apparatus unit to execute the measurement.
An analysis unit that analyzes the measurement data obtained by the device unit,
A display unit that displays the measurement data obtained by the measurement unit and / or the analysis result obtained by the analysis unit, and
The system having.
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