JP6901253B2 - 接着性細胞培養用基材、ならびにこれを利用した細胞培養容器および細胞培養方法 - Google Patents
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Description
本発明の一形態は、細胞培養面のプロテオグリカン吸着量が75ng/cm2以上である、接着性細胞培養用基材である。かような接着性細胞培養用基材を用いることにより、凹凸構造のナノインプリントを必要とせずに、かつガンマ線滅菌後であっても、スフェロイドを基材表面上に付着した状態で形成することができる。そのメカニズムは依然として明確ではないが、以下のように推測される。
本発明にかかる接着性細胞培養用基材(以下、単純に「基材」とも称する。)は、後述の方法により測定されるプロテオグリカン吸着量が75ng/cm2以上であることを特徴とする。これにより、凹凸構造のナノインプリントを必要とせずに、かつガンマ線滅菌後であっても、スフェロイドを基材表面上に付着した状態で形成することができる。なお、本明細書において、単に「プロテオグリカン吸着量」と記載する場合、8kGyのガンマ線を照射した後の接着性細胞培養用基材を用いて測定した値を指す。ガンマ線照射後にプロテオグリカン吸着量は低下する傾向にあるものの、ガンマ線照射後のプロテオグリカン吸着量が上記範囲であれば、スフェロイドの形成が促進される。なお、本発明における接着性細胞培養用基材は8kGyのガンマ線を照射した場合のプロテオグリカン吸着量が所定値以上であればよく、本発明の技術的範囲が、ガンマ線を照射済みの接着性細胞培養用基材に限定されるものではない。すなわち、ガンマ線を未照射の接着性細胞培養用基材であっても、下記手法により8kGyの条件でガンマ線を照射した場合のプロテオグリカン吸着量が所定値以上であれば、本発明の技術的範囲に含まれる。
以下、適宜図1を参酌しながら、プロテオグリカン吸着量の測定方法について説明する。図1は、プロテオグリカン吸着量の測定方法のうち、接着性細胞培養用基材に対するプロテオグリカンを吸着させるステップを示す。図1に示すように、台座3上に、接着性細胞培養用基材1b、300μlのプロテオグリカン溶液2および接着性細胞培養用基材1aをこの順で配置する。このとき、接着性細胞培養用基材1aおよび1bは、細胞培養面がプロテオグリカン溶液2と接するように配置する。台座3は、振動安定性確保のため、シャーレ4に収容されている。シャーレ4に収容された台座3、当該台座3上に配置された接着性細胞培養用基材1b、プロテオグリカン溶液2および接着性細胞培養用基材1aを、まとめてユニット10と称する。プロテオグリカン溶液2は、ヘパラン硫酸プロテオグリカン(シグマ社;H4777)を、終濃度が5μg/mLとなるようにDulbecco’s PBS(−)に使用直前に溶解して調製する。接着性細胞培養用基材1aおよび1bは、それぞれ直径14mmの円形とする。水を入れたバットを収容して加湿した37℃の5体積%CO2インキュベーター内にユニット10を静置し、収容から20時間後に取り出してプロテオグリカン溶液を回収する。回収後、後のプロテオグリカン濃度測定をすぐに行わない場合は、回収した溶液を−20℃で保管する。回収したプロテオグリカン溶液中のプロテオグリカン濃度の測定にはELISA法も利用できが、本発明においてはGlycosaminoglycan Sulpated Alcian Blue Binding Assay(Euro Diagnostica)を用いて測定する。初期濃度(5μg/mL)と20時間後のプロテオグリカン濃度との差およびフィルムの面積(1枚片面当たり1.54cm2×2枚分で3.08cm2)から、基材の単位面積当たりのプロテオグリカン吸着量(ng/cm2)を算出する。
装置:東ソー株式会社製 HCL−8220GPC
カラム:TSKgel Super AWM−H
溶離液(LiBr・H2O、リン酸入りNMP):0.01mol/L
測定方法:0.5重量%の溶液を溶離液で作製し、ポリスチレンで作製した検量線をもとに分子量を算出する。
本発明の一実施形態では、上記の接着性細胞培養用基材を有する、細胞培養容器が提供される。本発明の細胞培養用容器は、本発明の細胞培養用基材と他の部材とが組み合わされて構成されていてもよいし、本発明の細胞培養用基材と他の部材とが一体化されて構成されていてもよいし、本発明の細胞培養用基材のみにより構成されていてもよい。
1.ポリアミド酸樹脂組成物の調製
100ml容量の三口フラスコに1,4−ビス(アミノフェノキシ)ベンゼン(TPEQ)2.976g(10.2ミリモル)、4,4’−ヘキサフルオロイソプロピリデンジフタル酸無水物(6FDA)4.524g(10.2ミリモル)、N,N−ジメチルアセトアミド42.5gを仕込んだ。窒素雰囲気下、室温で5日間攪拌することで、含フッ素ポリアミド酸樹脂組成物(固形分濃度15.0質量%)を得た。該ポリアミド酸の重量平均分子量は18万であった。なお、ポリアミド酸の重量平均分子量と、焼成後の含フッ素ポリイミド樹脂の重量平均分子量は実質的に同一である。
得られた含フッ素ポリアミド酸樹脂組成物を、硝子基材上にダイコーターを用いて焼成後の含フッ素ポリイミドフィルムの厚みが30μmとなるようにフィルム状に製膜し、320℃で1時間、窒素雰囲気下で焼成を行った。その後、フィルムを硝子から剥離して、含フッ素ポリイミドフィルム1を得た。
焼成温度を340℃に変更した以外は比較例1と同様の操作を行い、含フッ素ポリイミドフィルム2を得た。
1.ポリアミド酸樹脂組成物の調製
100ml容量の三口フラスコに1,4−ビス(アミノフェノキシ)ベンゼン(TPEQ)3.842g(7.38ミリモル)、4,4’−(4−4’−イソプロピリデンジフェノキシ)ジフタル酸(BPADA)2.158g(7.38ミリモル)、N−メチルピロリドン34gを仕込んだ。窒素雰囲気下、室温で5日間攪拌することで、ポリアミド酸樹脂組成物(固形分濃度15.0質量%)を得た。該ポリアミド酸の重量平均分子量は12万であった。なお、ポリアミド酸の重量平均分子量と、焼成後のポリイミド樹脂の重量平均分子量は実質的に同一である。
得られたポリアミド酸樹脂組成物を、硝子基材上にダイコーターを用いて焼成後のポリイミドフィルムの厚みが30μmとなるようにフィルム状に製膜し、340℃で1時間、窒素雰囲気下で焼成を行った。その後、フィルムを硝子から剥離して、ポリイミドフィルム3を得た。BPADA/TPEQ共重合体の構成単位を、以下に示す。
1.ポリアミド酸樹脂組成物の調製
100ml容量の三口フラスコに2,2−ビス[4−(4−アミノフェノキシ)フェニル]ヘキサフルオロプロパン(HFBAPP)3.006g(5.77ミリモル)、4,4’−(4−4’−イソプロピリデンジフェノキシ)ジフタル酸(BPADA)2.994g(5.77ミリモル)、N−メチルピロリドン34gを仕込んだ。窒素雰囲気下、室温で5日間攪拌することで、含フッ素ポリアミド酸樹脂組成物(固形分濃度15.0質量%)を得た。該ポリアミド酸の重量平均分子量は10万であった。なお、ポリアミド酸の重量平均分子量と、焼成後の含フッ素ポリイミド樹脂の重量平均分子量は実質的に同一である。
得られた含フッ素ポリアミド酸樹脂組成物を、硝子基材上にダイコーターを用いて焼成後の含フッ素ポリイミドフィルムの厚みが30μmとなるようにフィルム状に製膜し、340℃で1時間、窒素雰囲気下で焼成を行った。その後、フィルムを硝子から剥離して、含フッ素ポリイミドフィルム4を得た。BPADA/HFBAPP共重合体の式(I)で示される構成単位を、以下に示す。
装置:自動接触角計(協和界面科学製:DM−500)
測定方法:フィルム上に水2μlを滴下した直後の液滴の付着角度を測定した(測定温度:25℃)。
装置:自動接触角計(協和界面科学製:DM−500)
測定方法:フィルム上に水25μlを滴下した後、基材を連続的に傾けていき、流れ落ちた際の角度を転落角とした。(測定温度:25℃)。
ヘパラン硫酸プロテオグリカン(シグマ社;H4777)をDulbecco’s PBS(−)(Wako社;041−20211)でプロテオグリカン濃度が5μg/mLとなるように溶解し、プロテオグリカン溶液を得た。シャーレの上の台座に上記のフィルム1枚(直径14mmの円形)をセットし、当該フィルム上にプロテオグリカン溶液を300μLマウントした。
Specific viral pathogen freeのWistarラット、オス、9週齢、体重200gを日本エスエルシー株式会社より購入した。ラット初代肝細胞の取得は培養細胞実験ハンドブック(羊土社)第10章、「肝細胞」に記載の方法を参考に行った。具体的には、Wistarラットをイソフルラン麻酔下で開腹し、門脈にカテーテルを挿入して以下記載の組成の前かん流液を注入した。次に胸腔を開き、右心房に入る下大静脈を切開し、血液を放出させた。肝臓からの脱血が十分になされたことを確認した後にかん流を止め、かん流液を以下記載の組成のコラゲナーゼ溶液に換えて、かん流を行った。細胞間組織がコラゲナーゼにより消化されたことを確認した後、かん流を止めた。肝臓を切り離し、ガラスシャーレに移した後、冷やしたEMEM High Glucose培地(Wako社)を添加して、ピペッティングにより細胞を分散させた。次に150mm濾過器により未消化の組織を除去した。細胞懸濁液は、50G、1分の遠心分離を数回繰り返して非実質細胞を除去した。得られた肝細胞の生存率はトリパンブルー排除法で計測し、生存率85%以上の肝細胞をラット初代肝細胞として培養試験に使用した。
細胞培養試験には、上記のように調製した含フッ素ポリイミドフィルム1および2(直径14mmの円形)をガンマ線滅菌して用いた(ガンマ線滅菌の条件:8kGy)。
William’s E medium(和光純薬)、10%(w/v)FBS(和光純薬)、8.6nM インスリン、255nM デキサメサゾン、50ng/mL EGF、5KIU/mL アプロチニン、抗生物質(ペニシリン(100unit/mL)/ストレプトマイシン(100μg/mL)/アムホテリシンB(0.25μg/mL))。
初代肝細胞に比べて、細胞の増殖活性が低下した凍結肝細胞を用いて、培養試験を行った。
2 プロテオグリカン溶液、
3 台座、
4 シャーレ、
10 ユニット、
20 支持部材、
100、101、102 細胞培養容器。
Claims (7)
- 細胞培養面の静的水接触角が75°以上かつ転落角が15°以上である、請求項1に記載の接着性細胞培養用基材。
- 前記式(I)において、X 0 が−C(CF 3 ) 2 −および前記b−8から選択される基であり、Yがe−1およびe−4から選択される基である、請求項1または2に記載の接着性細胞培養用基材。
- 前記樹脂が、4,4’−ヘキサフルオロイソプロピリデンジフタル酸無水物(6FDA)/1,4−ビス(アミノフェノキシ)ベンゼン(TPEQ)共重合体、4,4’−(4−4’−イソプロピリデンジフェノキシ)ジフタル酸(BPADA)/2,2−ビス[4−(4−アミノフェノキシ)フェニル]ヘキサフルオロプロパン(HFBAPP)共重合体、および4,4’−(4−4’−イソプロピリデンジフェノキシ)ジフタル酸(BPADA)/1,4−ビス(アミノフェノキシ)ベンゼン(TPEQ)共重合体から選択される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の接着性細胞培養用基材。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の接着性細胞培養用基材を有する、細胞培養容器。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の接着性細胞培養用基材上で接着性細胞を培養する工程を含む、細胞培養方法。
- 前記培養する工程において、前記接着性細胞を三次元培養する、請求項6に記載の細胞培養方法。
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