JP6895297B2 - 細胞塊の評価方法及び細胞塊の状態解析装置 - Google Patents
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Description
但し、r,r’は、サンプリング円上の各画素に対し周方向に沿って順に与えられた画素番号である。f(r)は、画素番号rにおける画素値(すなわち輝度)である。μは平均値である。nはサンプリング円上のデータ数である。Δr’は、rとr’との差である。
上記実施形態の第1実施例について詳細に説明する。
まず、培養した細胞塊CMを、ピペットを用いて培養ディッシュから取り出す。このとき、細胞塊CMが潰れないように慎重に取り出す。勢いよく培養液Bを吸入すると細胞塊CMが傷つくので、培養液Bを緩やかに吸入する。次に、予め準備した血球計算盤(保持部5)の中央付近に、細胞塊CMを培養液Bと共に載せる。そして、細胞塊CMの上にカバーガラス(蓋部5c)を被せ、細胞塊CMを圧潰して細胞塊CMの厚さを均一(100μm)にする。続いて、血球計算盤を試料台にセットする。
まず、解析部17及び評価部19を含むコンピュータ21を起動する。次に、赤外光源(光源3)の電源を投入する。これと前後して、赤外カメラ(撮像部15)を起動する。そして、試料台または対物レンズ7を光軸方向に移動させて焦点位置を調整する。細胞塊CMが視野に入るように、光軸方向と交差する方向における血球計算盤の位置を調整する。細胞塊CMを透過した赤外光を赤外カメラ(撮像部15)により撮像して、画像データDを取得する。
図9(a)は、取得した画像データDを示す。まず、この画像データDに対して画素値の規格化を行う。すなわち、背景領域(細胞塊CMが存在しない領域)Eを選択し、背景輝度(バックグラウンド)の平均値を算出する。このとき、例えば細胞塊CMが存在しない四隅のうち対角に位置する二隅において、四角形状の領域Eを選択する。次に、下記の数式を用いて、画像データDに含まれる複数の画素の各画素値の規格化を行う。
(規格化画素値)=−log10{(画素値)/(バックグラウンドの平均値)}
上記実施形態では、撮像ステップS1において(撮像部15が)一つの細胞塊CMを含む画像データDを生成し、該一つの細胞塊CMについて複数のサンプリング円C1〜C4を設定した。本変形例では、図13に示されるように、撮像ステップS1において(撮像部15が)、細胞塊CM1(第1の細胞塊)、及び細胞塊CM1とは別の細胞塊CM2(第2の細胞塊)を含む画像データDDを取得する。そして、解析ステップS2において(解析部17は)、画像データDDに含まれる細胞塊CM1,CM2に対して個別に基準点A1,A2及びサンプリング円C6,C7を設定し、細胞塊CM1のサンプリング円C6上の画像データに基づいて第1のパラメータを求め、細胞塊CM2のサンプリング円C7上の画像データに基づいて第2のパラメータを求める。なお、第1のパラメータ及び第2のパラメータは、上記実施形態と同様(例えば、細胞数密度或いは自己相関関数の最初の波形の幅)である。そして、評価ステップS3の際に(評価部19が)、第1のパラメータと第2のパラメータとの比較に基づいて、細胞塊CM1,CM2の少なくとも一方の状態(例えば分化度合い)を評価する。
本変形例では、図14(a)及び図14(b)に示されるように、撮像ステップS1において(撮像部15が)、細胞塊CM1(第1の細胞塊)を含む画像データD1(第1の画像データ)と、細胞塊CM1とは別の細胞塊CM2(第2の細胞塊)を含む画像データD2(第2の画像データ)とを取得する。そして、解析ステップS2において(解析部17が)、画像データD1に含まれる細胞塊CM1に対して基準点A1及びサンプリング円C6を設定し、画像データD2に含まれる細胞塊CM2に対して基準点A2及びサンプリング円C7を設定する。その後、解析ステップS2において(解析部17が)、細胞塊CM1のサンプリング円C6上の画像データに基づいて第1のパラメータを求め、細胞塊CM2のサンプリング円C7上の画像データに基づいて第2のパラメータを求める。なお、第1のパラメータ及び第2のパラメータは、上記実施形態と同様(例えば、細胞数密度或いは自己相関関数の最初の波形の幅)である。そして、評価ステップS3の際に(評価部19が)、第1のパラメータと第2のパラメータとの比較に基づいて、細胞塊CM1,CM2の少なくとも一方の状態(例えば分化度合い)を評価する。
本変形例に係る評価方法のフローチャートを図15に示す。本変形例の評価方法は、第1の撮像ステップS11、第1の解析ステップS21、第2の撮像ステップS12、及び第2の解析ステップS22を含む。なお、第1の撮像ステップS11及び第2の撮像ステップS12の詳細は上記実施形態の撮像ステップS1と同様であり、第1の解析ステップS21及び第2の解析ステップS22の詳細は上記実施形態の解析ステップS2と同様である。第1の撮像ステップS11では、細胞塊CM1を含む画像データD1(図14(a)参照)を取得する。第1の解析ステップS21では、画像データD1に含まれる細胞塊CM1に対して基準点A1及びサンプリング円C6を設定し、細胞塊CM1のサンプリング円C6上の画像データに基づいて第1のパラメータを求める。第2の撮像ステップS12では、細胞塊CM2を含む画像データD2(図14(b)参照)を取得する。第2の解析ステップS22では、画像データD2に含まれる細胞塊CM2に対して基準点A2及びサンプリング円C7を設定し、細胞塊CM2のサンプリング円C7上の画像データに基づいて第2のパラメータを求める。なお、第1のパラメータ及び第2のパラメータは、上記実施形態と同様(例えば、細胞数密度或いは自己相関関数の最初の波形の幅)である。そして、評価ステップS3の際に、第1のパラメータと第2のパラメータとの比較に基づいて、細胞塊CM1,CM2の少なくとも一方の状態(例えば分化度合い)を評価する。
本変形例では、圧潰されていない或る細胞塊について、異なるタイミングで少なくとも2枚の画像データを取得し、それらの画像データに基づいてパラメータを求める。具体的には、撮像ステップにおいて(撮像部15が)、図16(a)に示されるように、細胞塊CMを含む画像データD3(第1の画像データ)を第1のタイミングにおいて取得する。次に、撮像ステップにおいて(撮像部15が)、図16(b)に示されるように、同じ細胞塊CMを含む画像データD4(第2の画像データ)を、第1のタイミングより後の第2のタイミングにおいて取得する。第1のタイミングと第2のタイミングとの時間差は、例えば数日である。そして、解析ステップS2において(解析部17が)、画像データD3に含まれる細胞塊CMに対して基準点A3及びサンプリング円C8を設定し、画像データD4に含まれる細胞塊CMに対して基準点A4及びサンプリング円C9を設定する。その後、解析ステップS2において(解析部17が)、サンプリング円C8上の画像データに基づいて第1のパラメータを求め、サンプリング円C9上の画像データに基づいて第2のパラメータを求める。なお、第1のパラメータ及び第2のパラメータは、上記実施形態と同様(例えば、細胞数密度或いは自己相関関数の最初の波形の幅)である。そして、評価ステップS3の際に(評価部19が)、第1のパラメータと第2のパラメータとの比較に基づいて、細胞塊CMの状態(例えば分化度合い)を評価する。
本変形例に係る評価方法のフローチャートを図17に示す。本変形例の評価方法は、第1の撮像ステップS13、第1の解析ステップS23、第2の撮像ステップS14、及び第2の解析ステップS24を含む。なお、第1の撮像ステップS13及び第2の撮像ステップS14の詳細は上記実施形態の撮像ステップS1と同様であり、第1の解析ステップS23及び第2の解析ステップS24の詳細は上記実施形態の解析ステップS2と同様である。第1の撮像ステップS13では、細胞塊CMを含む画像データD3(図16(a)参照)を、第1のタイミングにおいて取得する。第1の解析ステップS23では、画像データD3に含まれる細胞塊CMに対して基準点A3及びサンプリング円C8を設定し、細胞塊CMのサンプリング円C8上の画像データに基づいて第1のパラメータを求める。第2の撮像ステップS14では、同じ細胞塊CMを含む画像データD4(図16(b)参照)を、第1のタイミングより後の第2のタイミングにおいて取得する。第2の解析ステップS24では、画像データD4に含まれる細胞塊CMに対して基準点A4及びサンプリング円C9を設定し、細胞塊CMのサンプリング円C9上の画像データに基づいて第2のパラメータを求める。なお、第1のパラメータ及び第2のパラメータは、上記実施形態と同様(例えば、細胞数密度或いは自己相関関数の最初の波形の幅)である。そして、評価ステップS3の際に、第1のパラメータと第2のパラメータとの比較に基づいて、細胞塊CMの状態(例えば分化度合い)を評価する。
同じ培養ディッシュで4日間培養した2つの細胞塊を解析し、比較した実施例について説明する。まず、第1実施例に示された方法と同様にして、或る細胞塊CM1を含む画像データD1を取得した。次に、第1実施例に示された方法と同様にして、別の細胞塊CM2を含む画像データD2を取得した。このとき用いた対物レンズ7の倍率は10倍であり、赤外カメラの分解能は2.97(μm/画素)であった。そして、これらの画像データD1,D2に対して画素値の規格化を行った。図18(a)及び図18(b)は、それぞれ規格化後の画像データD1,D2を示す。
それぞれ別の培養ディッシュで培養し、培養日数が互いに異なる2つの細胞塊CM1(培養日数4日)及び細胞塊CM2(培養日数6日)を解析し、比較した実施例について説明する。なお、これらの細胞塊CM1,CM2に関する画像データD1,D2の取得及び規格化、基準点A1,A2の算出、サンプリング円C6,C7の設定、及び平均自己相関距離の算出を、前述した第2実施例と同様にして行った。画像データD1に用いた対物レンズ7の倍率は10倍であり、赤外カメラの分解能は2.97(μm/画素)であった。画像データD2に用いた対物レンズ7の倍率は20倍であり、赤外カメラの分解能は1.98(μm/画素)であった。図19(a)及び図19(b)は、それぞれ規格化後の画像データD1,D2を示す。この例では、サンプリング円C6の平均自己相関距離は3.5μmであり、サンプリング円C7の平均自己相関距離は2.7μmであった。従って、細胞塊CM1,CM2の細胞数密度に顕著な相違は見られず、分化度合いが同程度であると評価された。
Claims (19)
- 複数の細胞が集合してなる細胞塊を評価する方法であって、
前記細胞塊への光照射により前記細胞塊から得られる光を撮像する撮像ステップと、
前記撮像ステップにより得られた画像に含まれる前記細胞塊に対し、基準点を設定し、該基準点を中心とするサンプリング円を設定し、前記サンプリング円上の領域に含まれる画像データに基づいて、前記細胞塊の状態に関するパラメータを求める解析ステップと、
前記パラメータに基づいて前記細胞塊を評価する評価ステップと、
を含み、
前記パラメータは、細胞数密度である、細胞塊の評価方法。 - 複数の細胞が集合してなる細胞塊を評価する方法であって、
前記細胞塊への光照射により前記細胞塊から得られる光を撮像する撮像ステップと、
前記撮像ステップにより得られた画像に含まれる前記細胞塊に対し、基準点を設定し、該基準点を中心とするサンプリング円を設定し、前記サンプリング円上の領域に含まれる画像データに基づいて、前記細胞塊の状態に関するパラメータを求める解析ステップと、
前記パラメータに基づいて前記細胞塊を評価する評価ステップと、
を含み、
前記パラメータは、前記サンプリング円の周方向に沿った前記画像データの自己相関関数の最初の波形の幅である、細胞塊の評価方法。 - 前記細胞塊は、幹細胞によって構成され、前記評価ステップにおいて、前記パラメータに基づいて前記細胞塊の分化度合いを評価する、請求項1または2に記載の細胞塊の評価方法。
- 前記解析ステップにおいて、一つの前記細胞塊に対し、共通の前記基準点を中心とし半径が互いに異なる複数の前記サンプリング円を設定し、前記複数のサンプリング円上の領域に含まれる画像データに基づいて、前記細胞塊の状態に関する複数のパラメータを求め、
前記評価ステップにおいて、前記複数のパラメータの比較に基づいて前記細胞塊を評価する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の細胞塊の評価方法。 - 前記撮像ステップにおいて、第1の前記細胞塊及び前記第1の細胞塊とは別の第2の細胞塊を含む画像を取得し、
前記解析ステップにおいて、前記画像に含まれる前記第1の細胞塊に関する前記パラメータである第1のパラメータと、前記画像に含まれる前記第2の細胞塊に関する前記パラメータである第2のパラメータと、を求め、
前記評価ステップにおいて、前記第1のパラメータと前記第2のパラメータとの比較に基づいて前記第1の細胞塊及び前記第2の細胞塊の少なくとも一方を評価する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の細胞塊の評価方法。 - 前記撮像ステップにおいて、第1の前記細胞塊を含む第1の画像と、前記第1の細胞塊とは別の第2の細胞塊を含む第2の画像とを取得し、
前記解析ステップにおいて、前記第1の画像に含まれる前記第1の細胞塊に関する前記パラメータである第1のパラメータと、前記第2の画像に含まれる前記第2の細胞塊に関する前記パラメータである第2のパラメータと、を求め、
前記評価ステップにおいて、前記第1のパラメータと前記第2のパラメータとの比較に基づいて前記第1の細胞塊及び前記第2の細胞塊の少なくとも一方を評価する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の細胞塊の評価方法。 - 第1の前記細胞塊に対して前記撮像ステップ及び前記解析ステップを行い、前記第1の細胞塊の状態に関する前記パラメータである第1のパラメータを求め、
前記第1の細胞塊とは別の第2の前記細胞塊に対して前記撮像ステップ及び前記解析ステップを行い、前記第2の細胞塊の状態に関する前記パラメータである第2のパラメータを求め、
前記評価ステップにおいて、前記第1のパラメータと前記第2のパラメータとの比較に基づいて前記第1の細胞塊及び前記第2の細胞塊の少なくとも一方を評価する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の細胞塊の評価方法。 - 前記撮像ステップにおいて、前記細胞塊を含む第1の画像を第1のタイミングにおいて取得し、前記細胞塊を含む第2の画像を前記第1のタイミングより後の第2のタイミングにおいて取得し、
前記解析ステップにおいて、前記第1の画像に含まれる前記細胞塊に関する前記パラメータである第1のパラメータと、前記第2の画像に含まれる前記細胞塊に関する前記パラメータである第2のパラメータと、を求め、
前記評価ステップにおいて、前記第1のパラメータと前記第2のパラメータとの比較に基づいて前記細胞塊を評価する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の細胞塊の評価方法。 - 第1のタイミングにおいて、前記撮像ステップ及び前記解析ステップを行い、前記細胞塊に関する前記パラメータである第1のパラメータを求め、
前記第1のタイミングより後の第2のタイミングにおいて、前記撮像ステップ及び前記解析ステップを行い、前記細胞塊に関する前記パラメータである第2のパラメータを求め、
前記評価ステップにおいて、前記第1のパラメータと前記第2のパラメータとの比較に基づいて前記細胞塊を評価する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の細胞塊の評価方法。 - 前記細胞塊に照射される光は、赤外光である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の細胞塊の評価方法。
- 前記撮像ステップにおいて、薄層状に圧潰された前記細胞塊に対して厚み方向から前記光を照射する、請求項1〜10のいずれか一項に記載の細胞塊の評価方法。
- 複数の細胞が集合してなる細胞塊の評価に用いられる装置であって、
前記細胞塊に照射される光を出力する光源と、
前記光の照射により前記細胞塊から得られる光を撮像する撮像部と、
撮像により得られた画像に含まれる前記細胞塊に対し、基準点を設定し、該基準点を中心とするサンプリング円を設定し、前記サンプリング円上の領域に含まれる画像データに基づいて、前記細胞塊の状態に関するパラメータを求める解析部と、
を備え、
前記パラメータは、細胞数密度である、細胞塊の状態解析装置。 - 複数の細胞が集合してなる細胞塊の評価に用いられる装置であって、
前記細胞塊に照射される光を出力する光源と、
前記光の照射により前記細胞塊から得られる光を撮像する撮像部と、
撮像により得られた画像に含まれる前記細胞塊に対し、基準点を設定し、該基準点を中心とするサンプリング円を設定し、前記サンプリング円上の領域に含まれる画像データに基づいて、前記細胞塊の状態に関するパラメータを求める解析部と、
を備え、
前記パラメータは、前記サンプリング円の周方向に沿った前記画像データの自己相関関数の最初の波形の幅である、細胞塊の状態解析装置。 - 前記解析部によって求められた前記パラメータに基づいて前記細胞塊を評価する評価部を更に備える、請求項12または13に記載の細胞塊の状態解析装置。
- 前記細胞塊は、幹細胞によって構成され、前記評価部は、前記パラメータに基づいて前記細胞塊の分化度合いを評価する、請求項14に記載の細胞塊の状態解析装置。
- 前記解析部は、一つの前記細胞塊に対し、共通の前記基準点を中心とし半径が互いに異なる複数の前記サンプリング円を設定し、前記複数のサンプリング円上の領域に含まれる画像データに基づいて複数の前記パラメータを求める、請求項12〜15のいずれか一項に記載の細胞塊の状態解析装置。
- 前記撮像部は、第1の前記細胞塊及び前記第1の細胞塊とは別の第2の細胞塊を含む画像を取得し、
前記解析部は、前記画像に含まれる前記第1の細胞塊に関する前記パラメータである第1のパラメータと、前記画像に含まれる前記第2の細胞塊に関する前記パラメータである第2のパラメータと、を求める、請求項12〜15のいずれか一項に記載の細胞塊の状態解析装置。 - 前記細胞塊に照射される光は、赤外光である、請求項12〜17のいずれか一項に記載の細胞塊の状態解析装置。
- 前記細胞塊を薄層状に圧潰した状態で保持する保持部を更に備え、
前記細胞塊に対して厚み方向から前記光が照射される、請求項12〜18のいずれか一項に記載の細胞塊の状態解析装置。
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