JP6893510B2 - 三官能性架橋試薬 - Google Patents
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Description
分泌糖タンパク質としては、例えば、サイトカイン、ホルモン、成長および分化因子、酵素、神経ペプチド、血管メディエーター、抗原認識分子、免疫調節分子、構造糖タンパク質および他の生理活性分子が挙げられる。これらのタンパク質は、細胞間シグナル伝達、免疫応答、アポトーシス、宿主−病原体相互作用および多くの疾患の病因などの、多くの認識事象において重要である。それによって、特定の標的受容体に対するこのような糖タンパク質の特異性は、細胞間情報伝達の調節において必須である。したがって、分泌糖タンパク質とそれらの標的とのリガンド結合相互作用の同定および特徴付けは、生体情報転送の分子的理解に必須である。
さらに、シクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基は、場合により1〜4個の置換基で置換されていてもよい。置換基の例としては、少なくとも1つのハロ、ヒドロキシル、アミノ、シアノ、ニトロ、メルカプト、カルボキシ、または1〜6個の炭素原子を有するアルキル、アルケニル、アルキルアミノ、ジアルキルアミノまたはアルコキシ基から選択されるヒドロカルビル基が挙げられるが、これらに限定されない。
例示的ヒドロカルビル置換シクロアルキル基としては、2−メチルシクロプロピル、2−エチルシクロプロピル、2−メチルシクロブチル、3−メチルシクロブチル、2−メチルシクロペンチル、2,3−ジメチルシクロペンチル、3−イソプロピルシクロペンチル、2,6−ジメチルシクロヘキシル、4−(t−ブチル)シクロヘキシル、2−ビニルシクロヘキシル、3−アリルシクロペンチル、3,4−ジアリルシクロペンチル、1−(4−ピリジニル)ピペリジニル、1−(4−ピリジニルメチル)ピペリジニル、4−(4−ピリジニル)ピペリジニル、4−(4−ピリジニル)ピペラジン−1−イル、およびビシクロヘキシル基が挙げられる。
例示的ヒドロカルビル置換シクロアルケニル基としては、3−メチル−3−シクロペンテン−1−イル、3,4−ジメチル−3−シクロペンテン−1−イル、2−イソ−プロピル−2−シクロペンテン−1−イル、2,3−ジエチル−2−シクロペンテン−1−イル、4−ビニル−1−シクロヘキセン−1−イル、3,4−ジエチル−3−シクロペンテン−1−イル、および3,4−ジアリル−3−シクロペンテン−1−イル基が挙げられる。
例示的ヒドロカルビル置換アリール基としては、トリル、メシチル、キシリル、クメニル、シメニル、3,5−ジ(t−ブチル)フェニル、2−メチルナフチル、2−ビニルフェニル、2−ビニルベンジル、2−ビニルナフチル、4−シクロヘキシルフェニル、ビフェニル、4−(4−ピペリジニル)ピリジニル、およびp−テルフェニル基が挙げられる。
例示的ヒドロカルビル置換ヘテロアリール基としては、2−メチルピリジン−1−イル、2−エチルピリジン−1−イル、3−ビニルイミダゾール−1−イル、2−メチルイミダゾール−1−イル、2−メチルキノキサリン−1−イル、1−アリルベンゾ−トリアゾリル、2,2’−ビピリジル、4,4’−ビピリジル、4−メチルピラジニル、4−(ピリジニルメチル)−ピリジニル、4−ベンジルピラジニル、ニコチンアミジル、2−メチルフラニル、5−メチルフルフリルアミノ、2−メチルチオフェニル(methylthiopheneyl)、4−メチルオキサゾリル、2,5−ジフェニル−4−メチルオキサゾリル、および4−メチル−チアゾリル基が挙げられる。
本発明では、糖タンパク質は天然に存在する糖タンパク質であっても、または合成的に操作された配列を有していてもよい(但し、操作された糖タンパク質はグリコシル化部位として働く少なくとも1つのペプチド配列を含む)。糖タンパク質は、細胞内糖タンパク質、細胞表面糖タンパク質(すなわち、細胞の表面に結合した糖タンパク質)または溶液中の糖タンパク質(すなわち、培地中に分泌される糖タンパク質)であってよい。
本発明の方法に使用するための糖タンパク質は、目的の、または有用な生物学的または化学的活性を有する任意の医薬的、または商業的に関連する糖タンパク質、例えば、受容体、抗体、酵素、ホルモン、調節因子、抗原、結合剤であり得る。本発明の方法において使用され得る以下の糖タンパク質のリストは単なる例示であり、限定的な列挙を意図するものではない。当業者には、任意の糖タンパク質が本発明の方法において使用でき、彼または彼女の特定の必要性に基づいて特定の糖タンパク質を選択可能であることは理解されよう。
糖タンパク質受容体には、Varki,A.ら、Essentials of Glycobiology,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2009 and www.uniprot.org.に開示されているような、任意の細胞表面受容体または任意の分泌受容体が含まれる。糖タンパク質受容体の非限定的な例としては、例えば、線維芽細胞成長因子受容体1(FGFR1)(Swiss−Prot Ass.Nos:Q9QZM7、Q99AW7、Q9UD50、Q63827)、線維芽細胞成長因子受容体2(FGFR2)(Swiss−Prot Ass.Nos:Q96KM2、P21802、Q63241)、線維芽細胞成長因子受容体3(FGFR3)(Swiss−Prot Ass.Nos:Q95M13、AF487554、Q99052)、線維芽細胞成長因子受容体4(FGFR4)(Swiss−Prot Ass.No:Q91742)、ニューロトロフィンチロシンキナーゼ2型(NTRKT−2)(Swiss−Prot Ass.No:Q8WXJ5)、白血球抗原関連タンパク質−チロシンホスファターゼ(LAR−PTPRF)(Swiss−Prot Ass.Nos:Q9EQ17、Q64605、Q64604、Q9QW67、Q9VIS8 P10586)、ネフリン(Swiss−Prot Ass.Nos:Q925S5、Q9JIX2、Q9ET59、Q9R044、Q9QZS7、Q06500)、タンパク質−チロシンホスファターゼ受容体S型(PTPRS)(Swiss−Prot Ass.Nos:Q64699、Q13332、O75870)、タンパク質−チロシンホスファターゼ受容体κ型(R−PTP−κ)(Swiss−Prot Ass.No:Q15262)、タンパク質−チロシンホスファターゼ受容体D型(PTPRD)(Swiss−Prot Ass.Nos:QBWX65、Q9IAJ1、P23468、Q64487)、エフリンA型受容体8(EPHA8/チロシン−タンパク質キナーゼ受容体EEK)(Swiss−Prot Ass.Nos:O09127、P29322)、エフリンA型受容体3(EPHA8/チロシンタンパク質キナーゼ受容体ETK−1/GEK4)(Swiss−Prot Ass.No:P29318)、エフリンA型受容体2(Swiss−Prot Ass.No:Q8N3Z2)、インスリン受容体(IR)(Swiss−Prot Ass.No:Q9PWN6)インスリン様成長因子−1受容体(IGF−1)(Swiss−Prot Ass.Nos:Q9QVW4、P08069、P24062、Q60751、P15127、P15208)、インスリン関連受容体(IRR)(Swiss−Prot Ass.No:P14616)チロシン−タンパク質キナーゼ受容体Tie−1(Swiss−Prot Ass.Nos:06805、P35590、Q06806)、ラウンドアバウト受容体−1(robo−1)(Swiss−Prot Ass.Nos:O44924、AF041082、Q9Y6N7)、神経細胞性ニコチン性アセチルコリン受容体α3サブユニット(CHRNA3)(Swiss−Prot Ass.Nos:Q8VHH6、P04757、Q8R4G9、P32297)、神経細胞性アセチルコリン受容体α6サブユニット(Swiss−Prot Ass.Nos:Q15825、Q9R0W9)、血小板由来成長因子受容体β(PDGFRB)(Swiss−Prot Ass.Nos:Q8R406、Q05030)、インターロイキン−6受容体(IL−6R)(Swiss−Prot Ass.No:Q00560)、インターロイキン23受容体(IL−23R)(Swiss−Prot Ass.No:AF461422)、IL−3、IL5およびGmCsfのベータ共通サイトカイン受容体(Swiss−Prot Ass.No:P32927)、サイトカイン受容体様分子3(CRLF1)(Swiss−Prot Ass.No:Q9JM58)、クラスIサイトカイン受容体(ZCYTOR5)(Swiss−Prot Ass.No:Q9UHH5)、ネトリン−1受容体DCC(Swiss−Prot Ass.No:P43146)、白血球Fc受容体様タンパク質(IFGP2)(Swiss−Prot Ass.Nos:Q96PJ6、Q96KM2)、マクロファージスカベンジャー受容体2(MSR2)(Swiss−Prot Ass.No:Q91YK7)、または顆粒球コロニー刺激因子受容体(G−CSF−R)(Swiss−Prot Ass.No:Q99062)、またはこれらの断片もしくは変異体を含む受容体が挙げられる。
他の実施形態において、糖タンパク質受容体は、プロテオグリカンの群から選択される。より好ましくは、プロテオグリカンは、ヘパラン硫酸プロテオグリカンを含む群から選択される。最も好ましい実施形態において、プロテオグリカンは、パールカン(Swiss−Prot Ass.No:P98160)、またはこれらの断片もしくは変異体である。
さらに他の実施形態において、糖タンパク質受容体は、膜アンカー型細胞表面酵素の群から選択される受容体である。例えば、細胞表面レセプターはメタロプロテイナーゼのピトリリシンファミリー、またはデスインテグリン(desintegrin)およびメタロプロテアーゼのファミリー(ADAM)、例えばADAM−8(Swiss−Prot Ass.No:Q05910)、ADAM−19(Swiss−Prot Ass.Nos:Q9H013,O35674)、ADAM−8(Swiss−Prot Ass.No:P78325)、ADAM−12(Swiss−Prot Ass.Nos:O43184、Q61824)、ADAM−28(Swiss−Prot Ass.Nos:Q9JLN6、Q61824、Q9XSL6、Q9UKQ2)、ADAM−33前駆体(Swiss−Prot Ass.Nos:Q8R533、Q923W9)、ADAM−9(Swiss−Prot Ass.Nos:Q13433、Q61072)、ADAM−7(Swiss−Prot Ass.Nos:Q9H2U9、O35227、Q63180)、ADAM−1Aファーティリンα(Swiss−Prot Ass.No:Q8R533)、ADAM−15(Swiss−Prot Ass.Nos:Q9QYV0、O88839、Q13444)、メタロプロテイナーゼ−デスインテグリン(desintegrin)ドメイン含有タンパク質(TECAM)(Swiss−Prot Ass.No:AF163291)、メタロプロテイナーゼ1(Swiss−Prot Ass.Nos:O95204、Q9BSI6)、またはこれらの断片もしくは変異体を含む群から選択される。
いくつかの実施形態において、糖タンパク質受容体は、酵素、例えばヒドロラーゼ、トランスフェラーゼ、イソメラーゼ、リアーゼ、リガーゼ、トランスフェラーゼおよびオキシドレダクターゼなどであり得る。ヒドロラーゼの例としては、リパーゼ、コリンエステラーゼ、アルカリホスファターゼ、β−アミラーゼデオキシリボヌクレアーゼ、グルコアミラーゼAおよびB、α−ガラクトシダーゼIおよびII、β−フルクトフラノシダーゼ、β−グコウロニダーゼ(glucouronidase)、N−アセチル−β−グルコサミニダーゼ、ヒアルロニダーゼ、オキシトシナーゼ、カリクレイン、ブロメライン、エンテロキナーゼ、プロテイナーゼa、bおよびc、ペプシノゲンおよびペプシンが挙げられる。オキシドレダクターゼの例としては、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよびクロロペルオキシダーゼが挙げられる。トランスフェラーゼの例としては、γ−グルタミルトランスペプチダーゼおよびリボヌクレアーゼが挙げられる。当業者は、本発明の方法に従って使用することができる酵素の他の公知の例を認識していると思われる。
さらなる実施形態において、糖タンパク質受容体は、成長因子または他のシグナル伝達分子であり得る。成長因子は、典型的には、細胞によって分泌され、他の細胞上の受容体に結合してこの受容体を活性化し、受容体細胞における代謝または発生変化を開始させる糖タンパク質である。哺乳動物成長因子および他のシグナル伝達分子の非限定的な例としては、サイトカイン;上皮成長因子(EGF);血小板由来成長因子(PDGF);FGF−5などの線維芽細胞成長因子(FGF);インスリン様成長因子−Tおよび−II(IGF−IおよびIGF−II);des(1−3)−IGF−1(脳IGF−I)、インスリン様成長因子結合タンパク質;CD−3、CD−4、CD−8およびCD−I 9などのCDタンパク質;エリスロポエチン;骨誘導性因子;免疫毒素;骨形成タンパク質(BMP);インターフェロン−α、−β、−γなどのインターフェロン;M−CSF、GM−CSF、およびG−CSFなどのコロニー刺激因子(CSF);ほとんどのインターロイキン;腫瘍壊死因子(TNF)ベータ;卵胞刺激ホルモン;カルシトニン;黄体形成ホルモン;プロテインCなどの抗凝固因子;心房性ナトリウム利尿因子;肺界面活性剤;ウロキナーゼまたはヒト尿などのプラスミノーゲン活性化因子または組織型プラスミノーゲン活性化因子(t−PA);造血成長因子;およびエンケファリナーゼが挙げられる。当業者は、本発明の方法に従って使用することができる他の成長因子またはシグナル伝達分子を認識していると思われる。
他の実施形態において、糖タンパク質受容体は細胞膜輸送体であり得る。細胞膜輸送体は、典型的には、細胞膜の脂質二重層、例えばチャネル、溶質キャリアスーパーファミリー、活性輸送体、補助輸送タンパク質または他の輸送体などの溶質の輸送を媒介する糖タンパク質である。チャネルの例としては、ナトリウムチャネルサブユニットβ−1(Swiss−Prot Ass.No:Q07699)が挙げられる。溶質キャリアファミリーの例としては、溶質キャリアファミリー2、促進型グルコース輸送体メンバー1(Swiss−Prot Ass.No:P11166)、溶質キャリアファミリー22メンバー1(Swiss−Prot Ass.No:O15245)および溶質キャリアファミリー22メンバー6(Swiss−Prot Ass.No:Q4U2R8)が挙げられる。活性輸送体の例としては、ナトリウム/カリウム輸送ATPaseサブユニットα−2(Swiss−Prot Ass.No:P50993)が挙げられる。当業者は、本発明の方法に従って使用できる細胞膜輸送体の他の公知の例を認識していると思われる。
いくつかの実施形態において、リガンドは、ペプチド、炭水化物、脂質またはヌクレオチドを含む群から選択される。用語ヌクレオチドは、天然ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、ヌクレオチド誘導体、ジ−、オリゴ−またはポリヌクレオチド、またはヌクレオチド含有物質を含む。ヌクレオチド類似体は、ヌクレオチド塩基または修飾されたヌクレオチド塩基、糖残基または修飾された糖残基、ならびにモノ−、ジ−、トリ−、クアドラ−またはペンタ−エステル基を含む分子として定義される。例えばタンパク質の断片、すなわちペプチドが使用される場合、それは任意の適切な長さであってよい。ペプチドの(最小の)長さおよび組成、すなわちアミノ酸の数およびタイプは、結合相互作用の性質によって規定されることが理解されよう。ペプチドは、典型的には、例えば、3〜100個のアミノ酸残基を含み得る。
いくつかの実施形態において、リガンドは抗体であってもよい。抗体は重い(約150kDa)球状血漿タンパク質であり、そのアミノ酸残基のいくつかにオリゴ糖鎖が付加されている。それらは、特定の抗原に特異的に結合する能力を有する。医薬または他の市販の薬剤として現在使用されているまたは調査中の多数の抗体を考えると、本発明の方法による特定のリガンドとの結合相互作用の分析は特に興味深い。いくつかの実施形態において、抗体は、治療用抗体のトラスツズマブおよびベバシズマブなどのモノクローナル抗体であり得る。いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体はヒト化抗体である。他の実施形態において、抗体はポリクローナルであり得る。
いくつかの実施形態において、操作された親和性結合剤、例えばアンキリンリピート結合剤、ファージディスプレイによって生成された親和性結合剤、またはオリゴ核酸またはペプチドアプタマーなどを使用することができる。
いくつかの実施形態において、リガンドは、上記の糖タンパク質受容体などの糖タンパク質であってもよい。いくつかの実施形態において、リガンドは、上記の細胞表面糖タンパク質受容体などの細胞表面タンパク質のドメインであってもよい。
いくつかの実施形態において、リガンドは微生物またはウイルスであってもよい。
本発明によれば、リガンドは、その標的糖タンパク質受容体とその結合部位を介して相互作用し、結合部位は、標的糖タンパク質受容体の特異的ペプチド断片、例えば標的糖タンパク質のその断片の特定のアミノ酸配列または3次元構造であり、結合部位と称される。その(細胞表面または分泌)標的糖タンパク質受容体結合部位に結合するリガンドに関する「相互作用」または「相互作用」という用語は、(細胞表面または分泌された)標的糖タンパク質受容体とリガンドとの間の一時的または永続的な直接的または間接的な接触を含み、その結合親和性、すなわち解離平衡定数Kdによって特徴付けることができる。その標的糖タンパク質受容体に対するリガンドの典型的な結合親和性は、少なくとも10−5M、好ましくは10−7M以上、例えば約10−8M〜約10−12Mであり得る。本発明の方法は、(細胞表面または分泌)標的糖タンパク質受容体と、リガンドとの間の典型的な結合親和性および例えば10−5M未満の値を有するKdを特徴とする低親和性相互作用の両方を検出可能である。
(式中、
Xはコア構造を表し、
S1、S2、S3は互いに独立してスペーサー基を表し、
Lはリガンド反応性基を表し、
Aは親和性基を表し、
Zはアリールまたはヘテロアリールを表し、
R’はHまたはアルキル基を表し、R’’はアルキル基を表すか、またはR’、R’’は一緒になってシクロアルキル基を形成するアルカンジイルを表す)
によって表される。
(式中、点線はW1、W2、W3のS1、S2、S3基への結合を表し、
W1は−NH−、−O−、−S−を表し、
W2は−COO−、−OOC−、−CONH−、−NHCO−、−NH−、−O−、−S−を表し、
W3は−COO−、−OOC−、−CONH−、−NHCO−、−NH−、−O−、−S−を表し、
sは1〜12の整数を表す)
の基であってもよい。
有利には、W1は−NH−を表す。
有利には、W2は−CONH−を表す。
有利には、W3は−NHCO−を表す。
有利には、sは4を表す。
(式中、V1、V2、V3は、互いに独立して、カルボキシ、アミン、ヒドロキシル、チオールなどの官能基であり、Ra、Rb、Rcは、互いに独立して、OまたはNである)
の少なくとも三置換、好ましくは三官能性6員アリールまたはヘテロアリール基である置換されたアリールまたはヘテロアリール基であってよい。
反応性官能基を活性化するために使用される活性化試薬の例としては、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)、3−ヒドロキシ−3,4−ジヒドロ−1,2,3−ベンゾトリアジン−4−オン(HOOBt)、N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)、ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)−カルボジイミド(EDAC)、2−(1H−7−アザベンズトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート(HATU)、2−(1H−ベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート(HBTU)、3,4−ジヒドロ−1,2,3−ベンゾトリアジン−4−オン−3−オキシテトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート(HDTU)、ベンゾトリアゾール−1−イルオキシトリス(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスファート(BOP)、ベンゾトリアゾール−1−イルオキシトリス−(ピロリジノ)−ホスホニウムヘキサフルオロホスファート(PyBop)、(3,4−ジヒドロ−1,2,3−ベンゾトリアジン−4−オン−3−オキシ)ジエチルホスファート(DEPBt)、3,4−ジヒドロ−1,2,3−ベンゾトリアジン−4−オン−3−オキシトリス−(ピロリジノ)−ホスホニウムヘキサフルオロホスファート(PDOP)、2−(ベンゾトリアゾール−1−イルオキシ)−1,3−ジメチル−2−ピロリジン−1−イル−1,3,2−ジアザホスホリジニウムヘキサフルオロホスファート(BOMP)、5−(1H−7−アザベンゾトリアゾール−1−イルオキシ)−3,4−ジヒドロ−1−メチル2H−ピロリウムヘキサクロロアンチモナート(AOMP)、(1H−7−アザベンゾトリアゾール−1−イルオキシ)トリス(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスファート(AOP)、5−(1H−ベンゾトリアゾール−1−イル)−3,4−ジヒドロ−1−メチル2H−ピロリウムヘキサクロロアンチモナート:N−オキシド(BDMP)、2−ブロモ−3−エチル−4−メチルチアゾリウムテトラフルオロボラート(BEMT)、2−ブロモ−1−エチルピリジニウムテトラフルオロボラート(BEP)、2−ブロモ−1−エチルピリジニウムヘキサクロロアンチモナート(BEPH)、N−(1H−ベンゾトリアゾール−1−イルメチレン)−N−メチルメタンアミニウムヘキサクロロアンチモナートN−オキシド(BOMI)、N、N’−ビス(2−オキソ−3−オキサゾリジニル)ホスフィン酸クロリド(BOP−Cl)、1−(1H−ベンゾトリアゾール−1−イルオキシ)フェニルメチレンピロリジニウムヘキサクロロ−アンチモナート(BPMP)、1,1,3,3−ビス(テトラメチレン)フルオロウロニウムヘキサフルオロホスファート(BTFFH)、クロロ(4−モルホイノ(morphoino))メチレンモルホリニウムヘキサフルオロホスファート(CMMM)、2−クロロ−1,3−ジメチル−1H−ベンズイミダゾリウムヘキサフルオロホスファート(CMBI)、2−フルオロ−1−エチルピリジニウムテトラフルオロボラート(FEP)、2−フルオロ−1−エチルピリジニウムヘキサクロロアンチモナート(FEPH)、1−(1−ピロリジニル−1H−1,2,3−トリアゾロ[4,5−b]ピリジン−1−イルメチレン)ピロリジニウムヘキサフルオロ−ホスファートN−オキシド(HAPyU)、O−(1H−ベンゾトリアゾール−1−イル)−N,N,N’,N;−ビス−(ペンタメチレン)ウロニウムヘキサフルオロホスファート(HBPipU)、O−(1H−ベンゾトリアゾール−1−イル)N,N,N0,N0−ビス(テトラメチレン)ウリニウムヘキサフルオロホスファート(HBPyU)、(1H−7−アザベンゾトリアゾール−1−イルオキシ)トリス(ピロリジノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスファート(PyAOP)、ブロモ−トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート(PyBrOp)、クロロ−トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート(PyClOP)、1,1,3,3−ビス(テトラメチレン)クロロウロニウムヘキサフルオロホスファート(PyClU)、テトラメチルフルオロ−マミジニウムヘキサフルオロホスファート(TFFH)、トリホスゲン、トリアジン系試薬[塩化シアヌル、フッ化シアヌル、4−(4,6−ジメトキシ−1,3,5−トリアジン−2−イル)−4−メチルモルホリニウムクロリド(DMT−MM)、2−クロロ−4,6−ジメトキシ−1,3,5−トリアジン(CDMT)]、ビス(2−クロロフェニル)ホスホロクロリダート、ジフェニルホスホロクロリダート、ジフェニルホスホロアジド(DPPA)およびこれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
活性化された官能基は、それらの特異的反応性に従ってサブグループに分けることができる。したがって、特定の実施形態において、活性化官能基は、アミン反応性基、ヒドロキシル反応性基、チオール反応性基、アルデヒドまたはケト反応性基、およびカルボキシ反応性基からなる群から選択される。
のN−ヒドロキシスクシンイミドエステルである。
(a)−[Y1−(CH2)n]p−
(b)−[Y2−(CH2)m−Y3]q−、
(式中、
Y1、Y2、Y3は互いに独立して、O−、−CO−、COO−、−OCO−、−O−CO−O−、−OCH2−、−CH2O−、NR1−、−NR1−CO−、−CO−NR1−
(式中、R1はHまたはC(1−6)−アルキルを表す)であり、および
n、m、pおよびqは、互いに独立して、1〜10の整数である)
またはこれらの組み合わせ、
の1または複数の繰り返し単位を含む直鎖を表す。
−[Y1−(CH2)n]p−[Y2−(CH2)m−Y3]q−、
−[Y2−(CH2)m−Y3]q−[(CH2)−Y1]p−、
−[Y1−(CH2)n]p−[Y1−(CH2)m−Y2]q−[(CH2)n−Y1]p−
(式中、Y1、Y2、Y3は互いに独立して、O−、−CO−、COO−、−OCO−、−O−CO−O−、−OCH2−、−CH2O−、NR1−、−NR1−CO−、−CO−NR1−
(式中、R1はHまたはC(1−6)−アルキルを表す)であり、
n、m、pおよびqは互いに独立して、1〜10の整数である)
のうちの1つを有し得る。
したがって、好ましい反復単位としては、
−CO−NR1−(CH2)n1−、−NR1−CO−(CH2)n2−、−(CH2)n3−CO−NR1−、−(CH2)n4−NR1−CO−、−CO−NR1−(CH2)n5−NR1−CO−、−NR1−CO−(CH2)n6−CO−NR1−、−COO−(CH2)m1−、
−OCO−(CH2)m2−、−(CH2)m3−COO−、−(CH2)m4−OCO−、−COO−(CH2)m5−OCO−、
−OCO−(CH2)m6−COO−、−O−(CH2)p1−、−(CH2)p2−O−が挙げられるが、これらに限定されない。
(式中、R1はHまたはC(1−6)−アルキルを表し、n1、n2、n3、n4、n5、n6、m1、m2、m3、m4、m5、m6、p1およびp2は互いに独立して1〜10の整数、好ましくは1、2、3、4、5または6である)。
−[Y1−(CH2)n]p−[Y1’−(CH2)n’]q’−[Y1’’−(CH2)n’’]q’’−
(式中、Y1、Y1’、Y1’’は互いに独立して、O−、−CO−、COO−、−OCO−、−O−CO−O−、−OCH2−、−CH2O−、NR1−、−NR1−CO−、−CO−NR1−
(式中、R1はHまたはC(1−6)−アルキルを表す)であり、
n、n’、n’’は互いに独立して、1〜10の整数である)
を有するものも挙げることができる。
(式中、
S1はC(1−24)アルキレンを表し、
S2はC(1−24)アルキレンを表し、
S3はC(1−24)アルキレンを表し、
アルキレンは直鎖または分枝鎖であり、アルキレンは置換または非置換であり、OおよびNなどのヘテロ原子が互いに直接結合していないことを条件として、1または複数の、好ましくは隣接しないアルキレンの−CH2−基が互いに独立して、1または複数の架橋基Yおよび/または非置換もしくは置換のシクロアルキル、非置換もしくは置換のヘテロシクロアルキル、非置換もしくは置換のアリール、非置換もしくは置換のヘテロアリールで置換されていてもよい)
の化合物に関する。
(式中、Yは、−CH(OH)−、−O−、−CO−、−CH2(CO)−、−SO−、−CH2(SO)−、−SO2−、−CH2(SO2)−、−COO−、−OCO−、−S−CO−、−CO−S−、−SOO−、−OSO−、−SOS−、−O−CO−O−、−OCH2−、−CH2O−、−NR1−、−NR1−CO−、−CO−NR1−、−NR1−CO−O−、−O−CO−NR1−、−NR1−CO−NR1−、−CH=CH−、−C≡C−、−CH=CH−COO−、−OCO−CH=CH−、−CH=N−、−C(CH3)=N−、−N=N−の基を表し、R1は互いに独立して水素またはC(1−6)アルキルを表す)
の化合物に関する。
のヒドラゾン基である。
この基は、細胞表面上の糖タンパク質、または分泌された糖タンパク質の酸化炭水化物基との共有結合を選択的に形成することができる。酸化糖タンパク質は、細胞表面上、または分泌された糖タンパク質それ自体に位置していてもよく、または標的糖タンパク質受容体と相互作用する空間的に近い分子上に位置していてもよい。スペーサーS2およびS3の長さは、リガンド結合部位と酸化糖タンパク質との間の距離を決定する。したがって、スペーサーS2およびS3の長さを変化させることにより、リガンド結合部位の現在の周囲環境または拡大環境をスキャンまたはプローブすることが可能になる。用語「ヒドラゾン基」は、水素、置換(C1−C6)アルキル、置換アリールおよび置換ヘテロアリールから選択される置換基を有するアルデヒドまたはケトンヒドラゾンを含む。本発明における使用のための置換基R’、R’’の選択が、架橋試薬の意図される使用に依存し得ることは理解されよう。
の化合物である。
この親和性基(すなわちアルキン基)は、式(I)の化合物中の多種多様なリガンド反応性基Lから選択可能なので、特に有用である。
(式中、
L、S1、S2、S3、Z、R’、R’’、sは、本明細書において定義された通りであり、
W1は、−NH−、−O−、−S−であり、
W2は、−COO−、−OOC−、−CONH−、−NHCO、−NH−、−O−、および−S−から選択される基であり、
W3は、−COO−、−OOC−、−CONH−、−NHCO、−NH−、−O−、−S−から選択される基である)
の化合物に関する。
簡潔には、上に示したように、本発明の架橋剤は、三官能性分子中に2つの異なる化学反応性基および1つの親和性基を組み合わせる。第1の化学反応性基は、目的のリガンド(II)への架橋剤のカップリングのために使用されるリガンド反応性基、好ましくはN−ヒドロキシスクシンイミドであり、次いでこれは(細胞表面の、または分泌された)目的の標的糖タンパク質受容体(III)に結合する。第2の化学反応性基は、酸化された標的糖タンパク質を捕捉するための芳香族ヒドラゾン、好ましくはアセトン保護ヒドラジノニコチナート基である。目的のリガンドにコンジュゲートすると、本発明の親和性タグ付き架橋剤は、酸化された生細胞上または溶液中の相互作用する標的糖タンパク質受容体の炭水化物指向性捕捉、および親和性基、好ましくはアジドを介した完全配列の捕捉糖タンパク質のその後の親和性濃縮を可能にし、その後の質量分析を可能にする。非指向性の対照試料との定量的比較により、リガンドとそれらの対応する標的糖タンパク質受容体との相互作用から生じる親和性タグ付け事象(例えば、アジド化)は、ランダムな(細胞表面の、または分泌された)タンパク質の非特異的な確率論的親和性タグ付け事象(例えば、アジド化)とは明確に識別することができる。これは、低親和性および一時的なリガンド−標的糖タンパク質受容体相互作用、ならびにリガンドと、元の細胞環境における膜結合形態または生体液中の分泌形態で存在する低量の糖タンパク質とのオフターゲット効果の検出でさえも可能にする。
これは、細胞表面標的糖タンパク質受容体の場合、図1に模式的に示されており、目的のリガンド(II)は、リガンド適合性緩衝液中の三官能性架橋剤とカップリングされる。別の対照反応では、等モル量の架橋剤が対照タンパク質にカップリングされるか、または純粋な緩衝液中でクエンチされる(図1(iii))。細胞表面の炭水化物にアルデヒド基を生成させるために、生細胞を酸化させる(図1(ii))。次いで、先にカップリングしたリガンドを酸化細胞に添加して、酸化細胞表面の炭水化物構造の捕捉を可能にする(図1(iv a))。これにより、ランダムな細胞表面糖タンパク質が確率論的事象によって標識され、目的のリガンドのための標的細胞表面糖タンパク質受容体が、直接リガンド−受容体相互作用により効率的に捕捉される。並行して、対照プローブが同数の酸化細胞に加えられ、確率的な標識事象のみを生じる。以下の全てのステップで、両方のプローブが並行して処理される。標識反応後、細胞を溶解する(v)。残りの画分を洗浄し、アジドタグ付き細胞表面糖タンパク質を銅触媒によるアジド−アルキン環化付加によってアルキン−マトリックスで捕捉する(図1(vi))。完全配列糖タンパク質の共有結合捕捉時に、これらは還元され、アルキル化される。マトリックスと糖タンパク質との間の共有結合は、非共有結合化合物を除去するための過酷な洗浄を可能にする。洗浄後、完全配列の捕捉糖タンパク質はプロテアーゼ、典型的にはセリンプロテアーゼトリプシンで消化され、これはC末端をアルギニンまたはリジンまで切断するが、プロリンの前では切断しないか、または低頻度で切断する(図1(vii))。得られるトリプシン性ペプチドは、HATRICを介してマトリックスに未だ共有結合しているグリコシル化ペプチド(X)と、グリコシル化されていないか、またはマトリックスから放出されたHATRICと相互作用しなかったペプチド(IX)との間で異なる。放出されたペプチド(IX)を脱塩し、細胞表面糖タンパク質の同定のために高質量精度質量分析に供する(図1(viii))。細胞表面糖タンパク質のトリプシン性糖ペプチドは、マトリックスに共有結合したままである(図1(vii b))。プロテアーゼを洗い流した後、N−糖ペプチド(XI)を、オリゴ糖構造の最も内側の成分と、ペプチドのN−X−S/Tグリコシル化モチーフ(それぞれ、Nはアスパラギンを表し、Xはプロリンを除く任意のアミノ酸を表し、S/Tはセリンまたはスレオニンを表す)中の糖ペプチドのアスパラギンとの間を切断するPNGase Fを用いた酵素的ステップによりビーズから特異的に放出させる。そうすることにより、PNGaseFはアスパラギンを脱アミド化し、先にグリコシル化されたペプチド(図1(ix))中の特異的N115−X−S/Tシグネチャーを導入する。放出されたペプチドは脱塩され、高質量精度質量分析計を用いた分析のための適切な緩衝溶液中に再懸濁される。2つの異なるペプチド画分(IXおよびXI)の分析のために、質量分析計は、所定の閾値を超えるイオン信号が、ペプチドの衝突誘起解離(CID)スペクトルまたは高エネルギー衝突解離(HCD)スペクトルを生成するためにMSからMS/MSモードに切り替えるように装置を自動的に始動させる、データ依存モードで操作される。全てのMS/MSスペクトルを標準タンパク質データベースに対して検索する。N−糖ペプチド画分からのMS/MSスペクトルを、N115−X−S/Tモチーフの存在についてさらにフィルタリングする。異なるペプチド画分(IXおよびXI)の両方に基づいて、細胞表面受容体の特異的濃縮を検出するために、リガンド試料中の細胞表面ペプチドの濃度を対照試料と定量的に比較する。細胞表面タンパク質由来の確率論的にタグ付けされたペプチドについて、比率は約1のはずであり、リガンドに基づく方法で特異的に捕捉された糖タンパク質受容体ペプチドは、対照に対してリガンド試料においてより高い値を得る。タンパク質が2以上のペプチドで同定される場合、豊富な情報を、2つの異なるペプチド画分から組み合わせることができる。
i)標的(III)を含む試料を提供するステップと、
ii)標的(III)を酸化処理して、少なくとも1つの炭水化物残基上にアルデヒド官能基を生成させ、それによって酸化標的(IV)を得るステップと、
iii)本明細書に記載の式(I)の三官能性架橋試薬を提供し、そのリガンド反応性基Lをリガンド(II)とコンジュゲートさせて、リガンド−試薬−複合体(V)を得るステップと、
iv)ステップ(ii)の試料とステップ(iii)の複合体(V)とを、(a)複合体(V)が酸化標的(IV)上のリガンド特異的ドメインに結合することができ、b)複合体(V)のヒドラゾン基(R’R’’C=N−NH−)をその遊離形態に変換し、酸化炭水化物標的(IV)と共有結合させた条件下で接触させて、共有結合したリガンドと共有結合した標的とを含む標的−リガンド−試薬複合体(VI)を得るステップと、
v)ステップ(iv)の試料を溶解して膜に包埋された細胞表面タンパク質および複合体(VI)を利用可能にしてマトリックス(VII)と反応させて、マトリックス−結合複合体(VIII)を得るステップと、
vi)親和性マトリックス(VII)を使用して試料から複合体(VI)を濃縮し、マトリックス結合複合体(VIII)を得るステップと、
vii)マトリックス結合複合体(VIII)を消化して、(a)放出されたペプチド(IX)および(b)マトリックスに結合した糖ペプチド(X)を得るステップと、
viii)場合により、マトリックス(VIII)から結合糖ペプチド(X)を放出し、放出された糖ペプチド(XI)を得るステップと、
ix)放出された、(IX)、(XI)を、好ましくは高質量精度質量分析によって分析および定量するステップと、
x)リガンドと標的糖タンパク質受容体との間の相互作用を、好ましくは対照反応との定量的比較を介して同定するステップと
を含む。
ステップ(i):本明細書において上記で定義した細胞表面糖タンパク質受容体の場合、試料は、少なくとも1つがこのような細胞表面糖タンパク質受容体を発現する細胞または組織の集団を含む。本明細書において上記で定義された分泌糖タンパク質の場合、試料は、少なくとも1種の分泌糖タンパク質を含む生体液を含む。
図1は、共有結合リガンド(灰色の円)を含む化合物(VI)によりこのステップを概説している。
別個の対照反応において、等モル量の架橋剤(I)を対照タンパク質にカップリングするか、もしくは活性化官能基、例えばNHSエステルの加水分解のための純粋な緩衝液中でインキュベートするか、またはリガンド反応性基、すなわちアミン反応性基を別の定義された化合物でクエンチする。
図1は、左の列に共有結合したリガンド(灰色の円)または右の列にクエンチされた残基(黒いスラッシュ)を含む化合物(VI)によりこのステップを概説している。
・単一反応モニタリング(SRM)、
・細胞培養物におけるアミノ酸による安定同位体標識(SILAC;例えば、Nilssonら、ハイスループットプロテオミクスにおける質量分析:一流への準備。(Mass spectrometry in high−throughput proteomics:ready for the big time.)Nat Methods(2010)vol.7(9)pp.681−5頁を参照されたい)、
・質量スペクトルのデータ非依存的取得(SWATH MS;例えば、Gilletら、データ非依存性捕捉によって生成されたMS/MSスペクトルの標的データ抽出:一貫した正確なプロテオーム分析のための新しい概念(Targeted Data Extraction of the MS/MS Spectra Generated by Data−independent Acquisition:A New Concept for Consistent and Accurate Proteome Analysis)を参照されたい)、
・タンデム質量タグ(TMT;例えば、Dayonら、6−プレックスアイソバリックタグを用いたMS/MSによるヒト脳脊髄液中のタンパク質の相対定量(Relative Quantification of Proteins in Human Cerebrospinal Fluids by MS/MS using 6−Plex Isobaric Tags)を参照されたい)、
を使用することができる。
本明細書ではN結合型グリコシル化部位を用いて例示されているが、本発明の方法が、O結合型グリコシル化部位などの他のタイプの確実に同定されたグリコシル化部位、またはおそらく他のタイプの翻訳後修飾(例えば、グリコシルホスファチジルイノシトールとペプチドのC末端の結合)、または糖脂質などのタンパク質以外のグリコシル化有機化合物を使用できることは理解されよう。
・活性化された官能基Lを加水分解する(例えば、NHSエステルを加水分解する)ための純粋な緩衝液中でインキュベートするか、または
・リガンド反応性基L(例えば、NHSエステルがリガンドの第1級アミンと反応して安定なアミド結合を生じる)を、公知の結合選択性を有するリガンドでクエンチするか、
のいずれかを行う。
架橋剤(I)のリガンド反応性基が第1級アミン、例えばグリシンを含有する化合物を用いて加水分解またはクエンチされる場合、所与の細胞株、組織上または生体液中のランダムな細胞表面糖タンパク質の相対存在量を用いて、架橋剤(I)のバックグラウンド結合を推定することが可能である。架橋剤(I)のリガンド反応性基が公知の糖タンパク質標的受容体を有するリガンドに結合する場合、糖タンパク質標的受容体の同定は実験の品質管理として役立ち得る。
クエンチは、化合物(II)が存在しない図1および3の右側に例示されており、化合物(I)に結合しているクエンチ分子は黒いスラッシュとして示されている。
(式中、nは1または2を表し、mは0、1または2を表し、R4はNH2を表し、R5はC(1−6)アルキルまたはC(1−6)アルコキシを表す)
に従う。
概要
公開された手順に従ってモノ保護ジアミン7、[1]6−(2−(tert−ブトキシカルボニル)ヒドラジニル)ニコチン酸[2]およびγ−アジド酪酸[3]を調製した。
1H NMRスペクトルをBruker AV 600MHz分光計で記録し、内部標準(2.50ppmのDMSO)として用いた溶媒共鳴を用いてppmで報告する。ピークは(s=シングレット、d=ダブレット、t=トリプレット、q=カルテット、m=多重項または未解明、br=ブロードシグナル、カップリング定数(Hz)、積分)として報告する。13C NMRスペクトルを、Bruker AV 151MHz分光計で1Hデカップリングを行って記録し、内部標準(DMSO−d6、39.52ppm)として用いた溶媒共鳴を用いてppmで報告する。
赤外線スペクトルは、Perkin−Elmer UATR Two Spectrometerで適切に測定した。ピークは吸収極大(n、cm−1)として報告する。
高分解能質量スペクトルデータは、Varian IonSpec分光計(ESI)で得て、(m/z)として報告する。
旋光度は、Jasco P−2000 Polarimeter、10cm、1.0mLセルを用いて測定した。
[2]B.Teng、Y.Bai、Y.Chang、Y.Chen、Z.Li Bioorg.&Med.Chem.Lett.2007、17、3440−3444。
[3]T.−B−Yu、J.−Z.Bai、Z.Guan Angew.Chem.Int.Ed.2009,48,1097−1101。
1.6−(6−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)ヘキサンアミド)ヘキサン酸(3)の合成
DMF(150mL)中2(6.59g、50.2mmol、1.1当量)の溶液を、トリエチルアミン(5.08g、50.2mmol、1.1当量)および1(15.0g、45.7mmol、1.0当量)で処理した。室温で3時間後、反応混合物を水(250mL)で希釈し、EtOAc(3×250mL)で抽出した。合わせた有機相を5%LiCl水溶液(3×250mL)で洗浄し、MgSO4で脱水し、濾過し、蒸発させて白色固体を得た。生成物を酢酸エチル/ヘキサン(1:1,350ml)からの再結晶により精製し、白色結晶として3(17.5g、90%)を得た。
DMF(100mL)中4(15.0g、56.5mmol、1.0当量)の溶液を、DMAP(2.76g、22.6mmol、0.4当量)、tert−ブタノール(12.6g、170mmol、3.0当量)、EDC HCl(15.2g、79.0mmol、1.4当量)およびヒューニッヒ塩基(23.7mL、136mmol、2.4当量)で処理した。RTで14時間後、反応混合物をDCM(300mL)で希釈し、10%クエン酸水溶液(3×250mL)で洗浄した。有機相をMgSO4で脱水し、濾過し、減圧下で濃縮した。生成物をカラムクロマトグラフィー(200gのSiO2、酢酸エチル/ヘキサン 5:95、次いで酢酸エチル/ヘキサン 25:75)により精製して、5(14.6g、81%)を無色油状物として得た。
THF/水(5:1、100mL)中5(14.0g、43.6mmol、1.0当量)の溶液を、酢酸(2.64g、44.0mmol、1.0当量)および10重量%のPd/C(1.85g、1.74mmol、4mol%)で処理した。混合物を室温においてH2雰囲気下で16時間撹拌した。次いで、反応混合物を遠心分離し、上清をセライトで濾過し、減圧下で濃縮し、得られた油状物を真空中で乾燥させた。この油状物をDCM(150mL)に溶解し、トリエチルアミン(15.2mL、109mmol、2.5当量)および無水コハク酸(4.79g、47.9mmol、1.1当量)で処理した。反応混合物を室温において3時間撹拌し、次いでDCM(350mL)で希釈し、10%クエン酸水溶液(3×250mL)で洗浄した。生成物をフラッシュクロマトグラフィー(150gのSiO2;DCM、次いでDCM/MeOH 90:10)により精製して、6(11.7g、94%)を白色固体として得た。
DCM(400mL)中7(10.8g、30.3mmol、1.0当量)の溶液を、トリエチルアミン(5.29mL、37.9mmol、1.3当量)、続いてアリルクロロホルマート(3.56mL、33.4mmol、1.1当量)で4℃において処理した。15分後、反応物を室温に温め、2時間撹拌した。次いで、反応混合物を水(3×250mL)で洗浄し、MgSO4で脱水し、濾過し、減圧下で濃縮した。生成物をフラッシュクロマトグラフィー(200gのSiO2、酢酸エチル/ヘキサン 1:1、次いで酢酸エチル)により精製して、8(11.0g、90%)を無色油状物として得た。
DCM(10mL)中8(2.83g、7.00mmol、1.2当量)の溶液を、TFA(9mL)で処理し、室温において30分間撹拌した。次いで、トルエン(20mL)を加え、混合物を蒸発させた。トルエン(3×30mL)で共蒸発させると褐色の油状物が得られ、これを真空中で乾燥させた。残留物をDMF(20mL)に溶解し、9(2.85g、6.09mmol、1.0当量)を加え、続いてヒューニッヒ塩基(3.40mL、24.4mmol、4.0当量)およびHATU(2.55g、6.70mmol、1.1当量)を加えた。反応混合物を室温において30分間撹拌し、次いで酢酸エチル(100mL)で希釈し、飽和NaCl水溶液(3×100mL)で洗浄し、Na2SO4で脱水し、濾過し、減圧下で濃縮した。生成物をフラッシュクロマトグラフィー(100gのSiO2;DCM、次いでDCM/MeOH 96:4)により精製して、10(4.53g、99%)を無色の油状物として得て、放置すると固化した。
DCM(25mL)中10(6.00g、7.95mmol、1.0当量)の溶液をTFA(15mL)で処理し、室温において1時間撹拌した。次に、トルエン(30mL)を加え、混合物を蒸発させた。トルエン(3×30mL)で共蒸発させて油状物を得、これを真空中で乾燥させた。残留物をDMF(20mL)に溶解し、3(3.01g、8.74mmol、1.1当量)を加え、続いてヒューニッヒ塩基(6.25mL、35.8mmol、4.5当量)およびHATU(3.32g、8.74mmol、1.1当量)を加えた。反応混合物を室温において30分間撹拌し、次いで酢酸エチル(150mL)で希釈し、水(3×100mL)、5%LiCl水溶液(150mL)で洗浄し、MgSO4で脱水し、濾過し、減圧かで濃縮した。生成物をフラッシュクロマトグラフィー(100gのSiO2;DCM、次いでDCM/MeOH 90:10)により精製して、11(5.90g、76%)を無色油状物として得た。
DCM(12mL)中11(5.85g、5.96mmol、1.0当量)の溶液をTFA(9mL)で処理し、室温において1時間撹拌した。次に、トルエン(30mL)を加え、混合物を蒸発させた。トルエン(3×30mL)で共蒸発させて油状物を得、これを真空中で乾燥させた。残留物をDMF(25mL)に溶解し、6−(2−(tert−ブトキシカルボニル)ヒドラジニル)ニコチン酸(1.79g、7.06mmol、1.2当量)、ヒューニッヒ塩基(4.69mL、26.8mmol、4.5当量)およびHATU(2.49g、6.56mmol、1.1当量)で処理した。室温において30分後、反応混合物をDCM(150mL)で希釈し、水(3×100mL)で洗浄した。
生成物をフラッシュクロマトグラフィー(100gのSiO2;DCM、次いでDCM/MeOH 90:10)により精製して、12(5.01g、75%)を無色泡状固体として得た。
DMF(15mL)中12(4.99g、4.47mmol、1.0当量)の溶液をピペリジン(2mL)で処理し、室温において1時間撹拌した。次にトルエン(15mL)を加え、混合物を蒸発させた。トルエン(3×15ml)で共蒸発させて油状物を得、これを真空中で乾燥させた。残留物をDMF(15mL)に溶解し、6(1.54g、5.36mmol、1.2当量)、トリエチルアミン(2.65mL、19.0mmol、4.3mmol)およびHATU(1.87g、4.92mmol、1.1当量)で処理した。室温において30分後、反応混合物を酢酸エチル(300mL)で希釈し、水(3×300mL)および5%LiCl水溶液(1×300mL)で洗浄した。生成物をフラッシュクロマトグラフィー(75gのSiO2;DCM、次いでDCM/MeOH 15:1、次いでDCM/MeOH 9:1)により精製して13(4.69g、90%)を無色泡状固体として得た。
MeOH(4mL)中13(1.41g、1.17mmol、1.0当量)の溶液を、ジエチルアミン(0.54mL、5.27mmol、4.5当量)、続いてDCM(8mL)中Pd(PPh3)4(67.6mg、0.0585mmol、5mol%)およびPPh3(33.8mg、0.129mmol、10mol%)の溶液で処理した。室温において30分後、反応混合物を蒸発させた。トルエン(3×15mL)で共蒸発させて油状物を得、これを真空中で乾燥させた。残留物をDMF(5mL)に溶解し、γ−アジド酪酸(0.201g、1.55mmol、1.3当量)、トリエチルアミン(025mL、1.76mmol、1.5当量)およびHATU(0.489g、1.29mmol、1.1当量)で処理した。室温において1時間後、反応混合物をトルエン(30mL)で希釈し、蒸発させた。トルエン(3×30ml)で共蒸発させて、暗色の油状物を得た。生成物をフラッシュクロマトグラフィー(15gのSiO2;DCM、次いでDCM/MeOH 90:10、次いでDCM/MeOH 80:20)により精製した。生成物を含有する画分を逆相C−18クロマトグラフィー(水/アセトニトリル 75:25、次いで70:30、65:35、60:40、55:45、50:50)によりさらに精製して、14(0.94g、62%)を得た。
6MのHCl水溶液(10mL)を14(0.85g、0.71mmol)に加え、この溶液を室温において撹拌した。20分後、透明溶液を氷浴で冷却し、2MのNaOH水溶液(31mL、予めHCl溶液に対して滴定)を加え、中和した溶液を凍結乾燥した。残留物をMeOH/アセトン 1:1(50ml)に懸濁し、揮発性物質を40℃において減圧下で蒸発させた。この手順をさらに2回繰り返した。次いで、懸濁液を濾過し、固体をMeOH/アセトン 1:1(100ml)で洗浄し、濾液を蒸発させた。生成物を逆相C−18クロマトグラフィー(水/アセトン/トリエチルアミン 90:10:1、次に水/アセトン/アセトニトリル 85:10:5)により精製して、15(0.39g、51%)を明るい灰色の泡状固体として得た。
DMF(15mL)中15(300mg、0.28mmol)の懸濁液を、ヒューニッヒ塩基(100μL、0.56mmol、2.0当量)、N−ヒドロキシスクシンイミド(65mg、0.56mmol、2.0当量)およびN,N’−ジスクシンイミジルカーボナート(143mg、0.56mmol、2.0当量)で処理し、次いで40℃において90分間撹拌した。次いで、反応混合物をトルエン(50ml)で処理し、蒸発させた。トルエン(3×50ml)で共蒸発させて油状物を得、これを真空中で乾燥させた。生成物をセファデックスLH−20(DCM/アセトン/MeOH 8:1:1)を用いたサイズ排除クロマトグラフィーにより精製して、16(295mg、90%)をオレンジ色の固体として得た。
1H−NMR(600MHz,DMSO−d6)δ=9.62(br,1H),8.57(dd,J=2.4,0.8Hz,1H),8.25(t,J=5.6Hz,1H),7.99(dd,J=8.8,2.4Hz,1H),7.95(d,J=8.0Hz,1H),7.87−7.77(m,3H),7.71(t,J=5.6Hz,2H),7.04(dd,J=8.8,0.8Hz,1H),4.12−4.05(m,1H),3.52−3.49(m,4H),3.48−3.43(m,4H),3.40−3.35(m,4H),3.32−3.28(m,2H),3.21(q,J=7.2,5.7Hz,2H),3.09−3.04(m,4H),3.03−2.96(m,6H),2.83−2.78(m,4H),2.65(t,J=7.3Hz,2H),2.39−2.26(m,4H),2.13(t,J=7.4Hz,2H),2.06−2.00(m,4H),1.96(s,3H),1.93(s,3H),1.73(dq,J=7.8,6.9Hz,2H),1.66−1.57(m,7H),1.54−1.43(m,7H),1.43−1.29(m,6H),1.29−1.13(m,8H)
13C−NMR(151MHz,DMSO−d6)δ=171.81,171.80,171.62,171.60,171.4,171.0,170.2,168.9,164.8,159.3,148.5,147.7,136.7,120.6,105.1,69.8,69.7,69.5(2炭素),68.1,68.0,52.6,50.3,38.9,38.29,38.25,38.2,35.9,35.8,35.4,32.2,31.5,30.73,30.71,30.7,30.1,29.3,29.2,29.1,29.0,28.9,28.6,26.20,26.15,25.43,25.42,25.14,25.13,25.1,24.5,23.9,23.0,17.0
IR(neat,vmax/cm−1)3287,2930,2858,2099,1738,1631,1603,1538,1364,1256,1206,1121,1068,712,644
ESI−MS:C55H90N14NaO14についての計算値[M+Na+]1193.6653;実測値1193.6668
[α]25 D=−4.0(c=0.2、MeOH)
試料反応において、300μgのEGFを70μgの(例1から得られた)三官能性架橋剤HATRICにカップリングさせた。対照反応において、70ugのHATRICのリガンド反応性官能基を等モル量のグリシンでクエンチした。この手順は、ステップ(i)に対応する。グリシンによりクエンチされたHATRICを用いた処理のために3つの複製物を調製し、EGFによりクエンチされたHATRICを用いた処理のために3つの複製物を調製した。調製は、6つの試料のそれぞれについて、H358細気管支細胞株の1,500万個の細胞を1.5mMのNaIO4で15分間、pH6.5、4℃において酸化させ、ステップ(i)および(ii)に従って細胞表面糖タンパク質の炭水化物構造上にアルデヒドを生成させることを意味する。酸化された細胞を、5mMの2−アミノ−5−メトキシ安息香酸(XX)の存在下で、EGFによりコンジュゲートされた、またはグリシンによりクエンチされたHATRICと一緒に、ステップ(iv b)および請求項16に記載のようにpH7.4、4℃において90分間インキュベートした。続いて、細胞を、8Mの尿素、0.1%Rapigest含有プロテアーゼ阻害剤中で、ステップ(v)に従って超音波処理によって溶解させた。HATRICタグ付け完全配列糖タンパク質を、銅触媒によるアルキン−アジド環化付加反応で(1mM CuSO4、6.25mM THPTAおよび2mMアスコルビン酸ナトリウム、室温において18時間)アルキンアガロースビーズを用いて捕捉した。タンパク質の還元およびアルキル化の際に、1%SDS、8M尿素、5M NaCl、100mM NaHCO3、pH11、100mM NH4HCO3および20%アセトニトリルでアガロースマトリックスを洗浄することによって、未結合タンパク質を除去した。これは手順のステップ(vi)を要約している。最後に、細胞表面糖タンパク質のペプチドをトリプシン消化により37℃で16時間放出させた。脱塩後、ペプチドをMS/MS分析に供した。得られた質量分析データをMS1ピーク強度に基づいて相対的に定量した。これは手順のステップ(vii)および(ix)を概説している。簡潔には、同定されたペプチドの存在量を、各糖タンパク質受容体について、複製物全体にわたって合計し、対照反応の複製物における存在量とペアワイズ比較した。この比較を統計的有意性について試験し、p値を報告した。実験全体にわたる偽発見率(FDR)を制御するBenjamini−Hochberg法を用いて、P値を多重比較のために調整した。糖タンパク質標的受容体候補は、0.001以下のFDR調整p値および4倍またはそれ以上のリガンド試料中の濃縮係数を有する受容体として定義される。上皮成長因子受容体(EGFR)は、EGFの糖タンパク質標的受容体として右上の標的ボックスで同定された。この所見は、これまでに発表された所見に対応し、このアプローチの有用性を実証している。
Claims (10)
- 式(I)の化合物:
(式中、
Xはコア構造を表し、
S1、S2、S3は互いに独立してスペーサー基を表し、
Lはリガンド反応性基を表し、
Aは親和性基を表し、
Zはアリールまたはヘテロアリールを表し、
R’はHまたはC(1−6)−アルキルを表し、
R’’はC(1−6)−アルキル基を表す)
の化合物において、
Aが、アジド−N3およびアルキン−CCHから選択され、
Xが式(I−I)
(式中、点線はW1、W2、W3のS1、S2、S3基への結合を表し、
sは1〜12の整数を表し、
W1は−NH−を表し、
W2は−CONH−又は−NHCO−を表し、
W3は−NHCO−又は−CONH−を表す)
の基を表し、
Lは、下記式で表されるヒドロキシスクシンイミドエステルを表し、
S1はC(1−24)アルキレンを表し、
S2はC(1−24)アルキレンを表し、
S3はC(1−24)アルキレンを表し、
(前記アルキレンは直鎖または分枝鎖であり、前記アルキレンは置換または非置換であり、ヘテロ原子が互いに直接結合していないことを条件として、1または複数の、隣接しない前記アルキレンの−CH2−基が互いに独立して、1または複数の架橋基Yおよび/または非置換もしくは置換のシクロアルキル、非置換もしくは置換のヘテロシクロアルキル、非置換もしくは置換のアリール、非置換もしくは置換のヘテロアリールで置換されていてもよい)、
Yは、−CH(OH)−、−O−、−CO−、−CH2(CO)−、−SO−、−CH2(SO)−、−SO2−、−CH2(SO2)−、−COO−、−OCO−、−S−CO−、−CO−S−、−SOO−、−OSO−、−SOS−、−O−CO−O−、−OCH2−、−CH2O−、−NR1−、−NR1−CO−、−CO−NR1−、−NR1−CO−O−、−O−CO−NR1−、−NR1−CO−NR1−、−CH=CH−、−C≡C−、−CH=CH−COO−、−OCO−CH=CH−、−CH=N−、−C(CH3)=N−、−N=N−の基を表し、
R1は互いに独立してHまたはC(1−6)アルキルを表し、
Zは、非置換フェニル、ナフチル、およびアントラセニルから選択されるアリール基、または非置換ピリジル、フリル、イミダゾリル、ベンズイミダゾリル、ピリミジニル、チエニル、キノリニル、インドリルおよびチアゾリルから選択されるヘテロアリール基を表す。 - リガンドと、糖タンパク質受容体の群から選択される標的との間の相互作用を特徴付け、分析するための、請求項1から4のいずれかに記載の化合物の使用。
- ・標的とされた糖タンパク質受容体が、細胞表面の、または分泌された糖タンパク質受容体である;および/または
・リガンドが、タンパク質、ペプチド、薬物およびウイルスからなる群から選択されるオーファンリガンドである、
請求項5に記載の使用。 - リガンド(II)と、試料中の標的(III)との間の特異的相互作用を同定する方法であって、
・標的(III)が糖タンパク質受容体であり、
・リガンド(II)が、標的(III)上のリガンド特異的ドメインを認識する、
以下を特徴とする方法:
請求項1から4のいずれかに記載の式(I)の化合物、リガンド(II)および標的(III)を含む標的−リガンド−試薬−複合体(VI)が形成され、リガンド(II)が式(I)の基Lに共有結合し、標的(III)が式(I)に存在するヒドラゾン基に共有結合する。 - i)標的(III)を含む試料を提供するステップと、
ii)標的(III)を酸化処理して、少なくとも1つの炭水化物残基上にアルデヒド官能基を生成させ、それによって酸化標的(IV)を得るステップと、
iii)請求項1に記載の式(I)の、請求項2に記載の式(IA)の、請求項3に記載の式(Ib)の、又は請求項4に記載の式(Ic)の、三官能性架橋試薬を提供し、そのリガンド反応性基Lをリガンド(II)とコンジュゲートさせて、リガンド−試薬−複合体(V)を得るステップと、
iv)ステップii)の試料とステップiii)の複合体(V)とを、(a)複合体(V)が酸化標的(IV)上のリガンド特異的ドメインに結合することができ、(b)複合体(V)のヒドラゾン基(R’R’’C=N−NH−)をその遊離形態に変換し、酸化炭水化物標的(IV)と共有結合させた条件下で接触させて、共有結合したリガンドと共有結合した標的とを含む標的−リガンド−試薬複合体(VI)を得るステップと、
v)ステップiv)の試料を溶解して膜に包埋された細胞表面タンパク質および複合体(VI)を利用可能にしてマトリックス(VII)と反応させて、マトリックス−結合複合体(VIII)を得るステップと、
vi)親和性マトリックスを使用して前記試料から複合体を濃縮し、マトリックス−結合複合体(VIII)を得るステップと、
vii)マトリックス−結合複合体(VIII)を消化して、(a)放出されたペプチド(IX)および(b)マトリックスに結合した糖ペプチド(X)を得るステップと、
viii)場合により、マトリックス(VIII)から結合糖ペプチド(X)を放出し、放出された糖ペプチド(XI)を得るステップと、
ix)放出された、(IX)、(XI)を分析および定量するステップと、
x)前記リガンドと前記標的(III)との間の相互作用を同定するステップと
を含む、請求項7に記載の方法。 - 標的(III)が溶液中または細胞表面上のいずれかにある、請求項7または8に記載の方法。
- ステップiv)では、
・(a)の反応条件がpH6.5〜7.4であり;温度が0〜10℃、10〜240分であり、
・ステップ(b)の反応条件が、pH6.5〜7.4のアミノ安息香酸の群から選択される有効量の触媒(XX)の提供を含み、
ステップv)では、二重に結合した標的−リガンド−試薬複合体(VI)およびランダムな糖タンパク質−試薬複合体が、細胞および膜の溶解によって試料から放出され、
ステップvi)では、1%ドデシル硫酸ナトリウム、8M尿素、20%アセトニトリル、5M塩化ナトリウム、80%イソプロパノール、100mM重炭酸ナトリウム、pH11を含有するタンパク質適合性緩衝液を用いて精製が達成される、請求項8または9に記載の方法。
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