JP6893510B2 - 三官能性架橋試薬 - Google Patents

Description

本発明は、（ｉ）標的糖タンパク質上に少なくとも１つの結合部位を有する目的のリガンドとのコンジュゲーションのためのリガンド反応性基、（ｉｉ）酸化された、またはアルデヒドを含有する受容体−糖タンパク質の捕捉のためのヒドラゾン基、（ｉｉｉ）捕捉された糖タンパク質の検出、単離および精製のための親和性基、を担持する三官能性架橋試薬、それらの製造方法、ならびにリガンドと、生細胞上および生体液中のそれらの対応する糖タンパク質標的受容体との間の相互作用の検出、同定および特徴付けのための方法におけるそれらの使用に関する。

グリコシル化は、最も顕著なタンパク質修飾の１つであり、哺乳動物細胞によって産生される、大部分ではないが多数の分泌性タンパク質および膜結合タンパク質は、共有結合したグリカンを含有する。このようなオリゴ糖部分は、複合生物の構築において、分泌された、および細胞表面のタンパク質のフォールディング、細胞内局在、代謝回転、活性および相互作用のための様々な構造的および機能的役割を果たす。
分泌糖タンパク質としては、例えば、サイトカイン、ホルモン、成長および分化因子、酵素、神経ペプチド、血管メディエーター、抗原認識分子、免疫調節分子、構造糖タンパク質および他の生理活性分子が挙げられる。これらのタンパク質は、細胞間シグナル伝達、免疫応答、アポトーシス、宿主−病原体相互作用および多くの疾患の病因などの、多くの認識事象において重要である。それによって、特定の標的受容体に対するこのような糖タンパク質の特異性は、細胞間情報伝達の調節において必須である。したがって、分泌糖タンパク質とそれらの標的とのリガンド結合相互作用の同定および特徴付けは、生体情報転送の分子的理解に必須である。

同様に、タンパク質、ペプチド、ホルモン、化学分子、医薬品または毒素などのリガンドによる細胞表面糖タンパク質受容体（ＣＳＲ）の会合は、細胞微小環境から細胞内への情報転送を可能にする。この細胞表面シグナル伝達ゲートウェイが細胞応答に重要であるという事実にもかかわらず、多くの機能性リガンドに対する受容体は依然として未知のままである。これは、主に、疎水性膜受容体タンパク質の同定における技術的限界、およびリガンドと対応するＣＳＲとの一時的で低親和性の相互作用に起因する。したがって、多くのシグナル伝達タンパク質および分子は、公知の一次分子標的のないオーファンリガンドのままであり、シグナル伝達、薬物作用、オフターゲット効果または疾患関連シグナル伝達ネットワークの個々の機序の詳細な分子的理解のための貴重な情報は現在欠けている。

欧州特許第２６７０７５５号は、（オーファン）リガンドと糖タンパク質標的受容体との間の相互作用を同定するための特異的三官能性架橋試薬および方法を開示している。ここに開示された化合物およびワークフローは、リガンド−受容体相互作用の同定を成功させるのに適しているが、該化合物ならびに関連する試料処理ワークフローには一定の制約があり、第１に、そこに開示された方法は６．５またはそれよりも酸性のｐＨに限定される。これは、ｐＨが生理的でない場合、リガンド−受容体相互作用が損なわれる場合に問題となり得る。第２に、標的受容体の同定は、標的のＮ−グリコシル化ペプチドのみに基づく。糖タンパク質標的受容体の非グリコシル化ペプチドに関する情報を受け取ることにより、Ｎ−グリコシル化されていない他の標的受容体の同定も可能になり、それは標的受容体の正確なプロテオフォームに関する情報を提供し、全体として標的受容体候補のより信頼できる定量化を可能にする。

これは、リガンドと標的糖タンパク質受容体との間の相互作用を決定するための改善された方法の必要性、およびこのような方法に適した新しい化合物を提供することの必要性を強調している。

欧州特許第２６７０７５５号

本発明は、主に、請求項１に定義の化合物および請求項１３に定義の方法を介して上記の制限を大いに克服する。本発明のさらなる態様は、本明細書および独立請求項に開示されており、好ましい実施形態は、本明細書および従属請求項に開示されている。

本発明を、以下により詳細に説明する。本明細書において提供／開示される様々な実施形態、選好および範囲は自由に組み合わせ可能であることは理解されよう。さらに、特定の実施形態に応じて、選択された定義、実施形態または範囲が適用されないこともある。

第１の態様において、本発明は、式（Ｉ）の三官能性架橋試薬に関する

第２の態様において、本発明は、リガンド−標的糖タンパク質受容体相互作用の特徴付けおよび分析のための、本発明の架橋試薬の使用に関する

第３の態様において、本発明は、リガンドと、試料中の少なくとも１つの炭水化物残基を有する標的糖タンパク質受容体との間の特異的相互作用を同定する方法に関する。

第４の態様において、本発明は、特に本明細書に記載の方法（第３の態様）における、生細胞上の生化学反応における非毒性触媒としての特異的有機化合物の使用に関する。

第５の態様において、本発明は、本明細書に記載の架橋試薬（第１の態様）および場合により本明細書に記載の有機化合物（第４の態様）を含むキットに関する。

より詳細な理解のために、本発明を以下の図に視覚化する。

細胞表面標的糖タンパク質受容体のリガンドに基づく受容体捕捉（ＬＲＣ）ワークフローの概略図を提供する。この図は、本発明の様々な態様、特に本発明の第３の態様で概説されるステップを具体的に例示している。この図では、化学物質（Ｉ）〜（ＸＸ）および方法ステップ（ｉ）〜（ｘｉ）が概略的に示されている；左：ワークフロー；右：対照実験。この図は、Ａ＝アジドである実施形態について本発明の概要を示している。 ｐＨ７．４においてモデルリガンドの上皮成長因子（ＥＧＦ）を用いた、リガンドに基づく受容体捕捉の相対定量評価を示す。受容体の捕捉は、Ｈ３５８細気管支細胞株上でＥＧＦ−ＨＡＴＲＩＣコンジュゲートを用いて行った。このプロットは、ｙ軸上の負のｌｏｇ２変換された偽発見率（ＦＤＲ）調整ｐ値対ｘ軸上のＥＧＦ／対照比のｌｏｇ２変換された倍数変化を示す。２つの条件を通して定量された全てのタンパク質を点として表示している。糖タンパク質標的受容体候補は、０．００１以下のＦＤＲ調整ｐ値および４倍以上の濃縮係数を有する受容体として定義される。左上のコーナーは、対照における糖タンパク質標的受容体候補を定義し、右上のボックスは、目的のリガンド、すなわちＥＧＦの糖タンパク質標的受容体候補を定義する。同定された糖タンパク質標的受容体候補は、黒い点として表示される。公知の糖タンパク質標的受容体の上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）は、ＥＧＦに対する標的受容体として右上の標的ボックスにおいて同定された。 別のＬＲＣワークフローの概略図を提供し、Ａ＝アルキンの実施形態について図１を補足する。

他に定義されていない限り、以下の定義が本説明を通して使用される。

本明細書で使用される場合、本発明の文脈において（特に特許請求の範囲の文脈において）使用される用語「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」および同様の用語は、本明細書において他のことが示されない、または文脈によって明らかに矛盾していない限り、単数および複数の両方を包含するものと解釈されるべきである。用語「複数」は、２以上の数を指す。

本明細書で使用される場合、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、本明細書において、それらのオープンで非限定的な意味で使用される。

用語「三官能性」は、「３つの官能基を担持する」ことを意味する。したがって、三官能性（架橋）試薬は、３つの官能基を有する（架橋）試薬を指す。「ヘテロ三官能性」という用語は、「３つの異なる官能基を担持する」ことを意味する。

本明細書で使用される用語「アルキル」は、１〜２４個、好ましくは１〜１２個の炭素原子を含む直鎖または分枝鎖の炭化水素を指す。アルキル基の例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、およびｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシルが挙げられるが、これらに限定されない。用語「アルコキシ」は、−Ｏ−アルキル基を指す。

本明細書で使用される用語「アルキレン」（「アルカンジイル」とも呼ばれる）は、炭化水素から誘導される二価ラジカル、例えばＲがＨまたは選択される置換基である−ＣＨＲ−（ＣＨＲ）_ｎ−を指す。典型的には、アルキレン基は１〜２４個の炭素原子（すなわち、ｎ＝２４）、好ましくは１０〜２４個の炭素原子を有する。本明細書で使用される用語「ヘテロアルキレン」は、アルキルラジカルに挿入された１または複数個のヘテロ原子、例えばＯ、ＮまたはＳ、好ましくはＯまたはＮを有するアルキレンを指す。

用語「シクロアルキル」は、３〜１２個の炭素を有する飽和および部分不飽和環状炭化水素基を指す。シクロアルキル基の例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチルおよびシクロオクチルが挙げられるが、これらに限定されない。

「ヘテロシクロアルキル」という用語は、１または複数のヘテロ原子（Ｏ、ＮまたはＳなど）を有する非芳香族の５〜８員単環式、８〜１２員二環式または１１〜１４員三環式系を指す。ヘテロシクロアルキル基の例としては、ピペラジニル、ピロリジニル、ジオキサニル、モルホリニル、およびテトラヒドロフラニル、グルコシルが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される用語「アリール」は、各環が非置換または１〜４個の置換基を有していてもよい、６炭素単環式、１０炭素二環式、１４炭素三環式芳香族環系を指す。アリール基の例としては、フェニル、ナフチル、およびアントラセニルが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の文脈において使用されるフェニレンは、好ましくは、場合により置換されている１，２−、１，３−または１，４−フェニレン基を示す。

用語「ヘテロアリール」は、１または複数のヘテロ原子（Ｏ、ＮまたはＳなど）を有する芳香族５〜８員単環式、８〜１２員二環式、または１１〜１４員三環式環系を指す。ヘテロアリール基の例としては、ピリジル、フリル、イミダゾリル、ベンズイミダゾリル、ピリミジニル、チエニル、キノリニル、インドリルおよびチアゾリルが挙げられる。ピリジルは、２−ピリジル、３−ピリジル、および４−ピリジル、好ましくは２−ピリジルを含む。用語「ヘテロアラルキル」は、ヘテロアリール基で置換されたアルキル基を指す。

本明細書で使用される用語「場合により置換されている」は、非置換および置換を含む。このような任意選択の置換基は、好ましくは、Ｈａｌ、−ＯＲ、−ＣＮ、−ＮＯ_２、−ＣＯＯＲ、Ｃ（１−８）アルキル、Ｃ（１−８）アルキレンおよびＣ（１−８）アルコキシ（Ｒは１〜８個の炭素原子である）からなる群から選択される。
さらに、シクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基は、場合により１〜４個の置換基で置換されていてもよい。置換基の例としては、少なくとも１つのハロ、ヒドロキシル、アミノ、シアノ、ニトロ、メルカプト、カルボキシ、または１〜６個の炭素原子を有するアルキル、アルケニル、アルキルアミノ、ジアルキルアミノまたはアルコキシ基から選択されるヒドロカルビル基が挙げられるが、これらに限定されない。
例示的ヒドロカルビル置換シクロアルキル基としては、２−メチルシクロプロピル、２−エチルシクロプロピル、２−メチルシクロブチル、３−メチルシクロブチル、２−メチルシクロペンチル、２，３−ジメチルシクロペンチル、３−イソプロピルシクロペンチル、２，６−ジメチルシクロヘキシル、４−（ｔ−ブチル）シクロヘキシル、２−ビニルシクロヘキシル、３−アリルシクロペンチル、３，４−ジアリルシクロペンチル、１−（４−ピリジニル）ピペリジニル、１−（４−ピリジニルメチル）ピペリジニル、４−（４−ピリジニル）ピペリジニル、４−（４−ピリジニル）ピペラジン−１−イル、およびビシクロヘキシル基が挙げられる。
例示的ヒドロカルビル置換シクロアルケニル基としては、３−メチル−３−シクロペンテン−１−イル、３，４−ジメチル−３−シクロペンテン−１−イル、２−イソ−プロピル−２−シクロペンテン−１−イル、２，３−ジエチル−２−シクロペンテン−１−イル、４−ビニル−１−シクロヘキセン−１−イル、３，４−ジエチル−３−シクロペンテン−１−イル、および３，４−ジアリル−３−シクロペンテン−１−イル基が挙げられる。
例示的ヒドロカルビル置換アリール基としては、トリル、メシチル、キシリル、クメニル、シメニル、３，５−ジ（ｔ−ブチル）フェニル、２−メチルナフチル、２−ビニルフェニル、２−ビニルベンジル、２−ビニルナフチル、４−シクロヘキシルフェニル、ビフェニル、４−（４−ピペリジニル）ピリジニル、およびｐ−テルフェニル基が挙げられる。
例示的ヒドロカルビル置換ヘテロアリール基としては、２−メチルピリジン−１−イル、２−エチルピリジン−１−イル、３−ビニルイミダゾール−１−イル、２−メチルイミダゾール−１−イル、２−メチルキノキサリン−１−イル、１−アリルベンゾ−トリアゾリル、２，２’−ビピリジル、４，４’−ビピリジル、４−メチルピラジニル、４−（ピリジニルメチル）−ピリジニル、４−ベンジルピラジニル、ニコチンアミジル、２−メチルフラニル、５−メチルフルフリルアミノ、２−メチルチオフェニル（ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏｐｈｅｎｅｙｌ）、４−メチルオキサゾリル、２，５−ジフェニル−４−メチルオキサゾリル、および４−メチル−チアゾリル基が挙げられる。

用語「ハロゲン」は、クロロ、フルオロ、ブロモまたはヨード置換基、好ましくはクロロまたはフルオロ置換基を示す。

用語「（相互作用）結合」または「相互作用」は、相互の親和性または結合能力を示す対応する分子の対（例えば、リガンド／標的糖タンパク質受容体）間の任意のタイプの相互作用的会合を指す。相互作用的会合は、例えば、相互反応性を示す化学反応性基（ドナー／アクセプター、酸／塩基など）の対応する対の間で起こり得る。典型的な結合事象としては、疎水性相互作用、親水性相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、イオン性相互作用、非イオン性相互作用、静電相互作用、共有結合などが挙げられるが、これらに限定されない。結合事象の性質に依存して、相互作用は異なるレベル、すなわち一時性または恒久的、弱いまたは強い結合であり得ることが理解されよう。

本明細書で使用する用語「糖タンパク質」（または「糖ペプチド」）は、１または複数の共有結合した炭水化物またはオリゴ糖基を含有するタンパク質（またはペプチド）を指す。炭水化物基は、典型的には、アミン側鎖基、典型的にはアスパラギンアミノ酸（Ｎ−結合型炭水化物を生じる）またはヒドロキシル側鎖基、通常はセリンもしくはスレオニンアミノ酸（Ｏ結合型炭水化物を生じる）またはインドール側鎖基、通常はトリプトファン残基（Ｃ結合型炭水化物を生じる）を介して結合する。酸化された糖タンパク質または糖ペプチドは、適切な酸化剤で処理され、それにより結合した炭水化物の隣接ジオール部分を切断してアルデヒド基を生成する糖タンパク質または糖ペプチドを指す。このような炭水化物の酸化（ジアルデヒド炭水化物を生じる）は、例えば、過ヨウ素酸または過ヨウ素酸塩、鉛（ＩＶ）塩または過マンガン酸塩、好ましくは（メタ）過ヨウ素酸ナトリウムを用いた従来の手順に従って行うことができる。または、化学的アプローチは、糖タンパク質受容体上に架橋剤の付着部位を生成するために、生体直交基（例えば、アジド、アルキン、ケトンまたはアルデヒド）を有するグリカン前駆体の類似体を用いて細胞の代謝標識を利用することができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ（２００７）１１巻（１）５２−８頁）。

本明細書で使用される用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、同じ意味を有し、任意の長さを有するアミノ酸ポリマー（典型的にはペプチドはタンパク質の断片と呼ばれる）を指す。このポリマーは、直鎖、分枝鎖または環状鎖であってよい。アミノ酸は、天然もしくは非天然のアミノ酸、または変異アミノ酸であってよい。ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに関する用語「断片」は、（長さｎの）参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの全長に対して１〜ｎ−１の範囲の配列長を有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドを指す。断片の長さは目的に応じて適宜変更することができる。
本発明では、糖タンパク質は天然に存在する糖タンパク質であっても、または合成的に操作された配列を有していてもよい（但し、操作された糖タンパク質はグリコシル化部位として働く少なくとも１つのペプチド配列を含む）。糖タンパク質は、細胞内糖タンパク質、細胞表面糖タンパク質（すなわち、細胞の表面に結合した糖タンパク質）または溶液中の糖タンパク質（すなわち、培地中に分泌される糖タンパク質）であってよい。
本発明の方法に使用するための糖タンパク質は、目的の、または有用な生物学的または化学的活性を有する任意の医薬的、または商業的に関連する糖タンパク質、例えば、受容体、抗体、酵素、ホルモン、調節因子、抗原、結合剤であり得る。本発明の方法において使用され得る以下の糖タンパク質のリストは単なる例示であり、限定的な列挙を意図するものではない。当業者には、任意の糖タンパク質が本発明の方法において使用でき、彼または彼女の特定の必要性に基づいて特定の糖タンパク質を選択可能であることは理解されよう。

本明細書において（ＩＩＩ）によって示される用語「標的糖タンパク質受容体」または「糖タンパク質受容体」は、１または複数の特定の種類のリガンドまたはシグナル伝達分子が結合し得る糖タンパク質を指す。このような（標的）糖タンパク質受容体は、任意の対象、好ましくは哺乳動物対象、例えばヒトまたは動物に由来する生体液中または細胞上に存在し得る。したがって、用語「細胞表面」と組み合わせて使用する場合（すなわち、細胞表面糖タンパク質受容体）、これは、細胞の細胞膜と会合し、時には細胞外空間に曝される少なくとも１つのアミノ酸を有し、１または複数の特定の種類のリガンドまたはシグナル伝達分子が結合可能な糖タンパク質を指す。用語「酸化された」と組み合わせて使用される場合、適切な酸化処理によって炭水化物部分が酸化されてアルデヒド基を形成する糖タンパク質、またはアルデヒド基が代謝標識によって導入された糖タンパク質を指す。
糖タンパク質受容体には、Ｖａｒｋｉ，Ａ．ら、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００９ ａｎｄ ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ．に開示されているような、任意の細胞表面受容体または任意の分泌受容体が含まれる。糖タンパク質受容体の非限定的な例としては、例えば、線維芽細胞成長因子受容体１（ＦＧＦＲ１）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｓｓ．Ｎｏｓ：Ｑ９ＱＺＭ７、Ｑ９９ＡＷ７、Ｑ９ＵＤ５０、Ｑ６３８２７）、線維芽細胞成長因子受容体２（ＦＧＦＲ２）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｓｓ．Ｎｏｓ：Ｑ９６ＫＭ２、Ｐ２１８０２、Ｑ６３２４１）、線維芽細胞成長因子受容体３（ＦＧＦＲ３）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｓｓ．Ｎｏｓ：Ｑ９５Ｍ１３、ＡＦ４８７５５４、Ｑ９９０５２）、線維芽細胞成長因子受容体４（ＦＧＦＲ４）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｓｓ．Ｎｏ：Ｑ９１７４２）、ニューロトロフィンチロシンキナーゼ２型（ＮＴＲＫＴ−２）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｓｓ．Ｎｏ：Ｑ８ＷＸＪ５）、白血球抗原関連タンパク質−チロシンホスファターゼ（ＬＡＲ−ＰＴＰＲＦ）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｓｓ．Ｎｏｓ：Ｑ９ＥＱ１７、Ｑ６４６０５、Ｑ６４６０４、Ｑ９ＱＷ６７、Ｑ９ＶＩＳ８ Ｐ１０５８６）、ネフリン（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｓｓ．Ｎｏｓ：Ｑ９２５Ｓ５、Ｑ９ＪＩＸ２、Ｑ９ＥＴ５９、Ｑ９Ｒ０４４、Ｑ９ＱＺＳ７、Ｑ０６５００）、タンパク質−チロシンホスファターゼ受容体Ｓ型（ＰＴＰＲＳ）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｓｓ．Ｎｏｓ：Ｑ６４６９９、Ｑ１３３３２、Ｏ７５８７０）、タンパク質−チロシンホスファターゼ受容体κ型（Ｒ−ＰＴＰ−κ）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｓｓ．Ｎｏ：Ｑ１５２６２）、タンパク質−チロシンホスファターゼ受容体Ｄ型（ＰＴＰＲＤ）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｓｓ．Ｎｏｓ：ＱＢＷＸ６５、Ｑ９ＩＡＪ１、Ｐ２３４６８、Ｑ６４４８７）、エフリンＡ型受容体８（ＥＰＨＡ８／チロシン−タンパク質キナーゼ受容体ＥＥＫ）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｓｓ．Ｎｏｓ：Ｏ０９１２７、Ｐ２９３２２）、エフリンＡ型受容体３（ＥＰＨＡ８／チロシンタンパク質キナーゼ受容体ＥＴＫ−１／ＧＥＫ４）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｓｓ．Ｎｏ：Ｐ２９３１８）、エフリンＡ型受容体２（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｓｓ．Ｎｏ：Ｑ８Ｎ３Ｚ２）、インスリン受容体（ＩＲ）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｓｓ．Ｎｏ：Ｑ９ＰＷＮ６）インスリン様成長因子−１受容体（ＩＧＦ−１）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｓｓ．Ｎｏｓ：Ｑ９ＱＶＷ４、Ｐ０８０６９、Ｐ２４０６２、Ｑ６０７５１、Ｐ１５１２７、Ｐ１５２０８）、インスリン関連受容体（ＩＲＲ）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｓｓ．Ｎｏ：Ｐ１４６１６）チロシン−タンパク質キナーゼ受容体Ｔｉｅ−１（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｓｓ．Ｎｏｓ：０６８０５、Ｐ３５５９０、Ｑ０６８０６）、ラウンドアバウト受容体−１（ｒｏｂｏ−１）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｓｓ．Ｎｏｓ：Ｏ４４９２４、ＡＦ０４１０８２、Ｑ９Ｙ６Ｎ７）、神経細胞性ニコチン性アセチルコリン受容体α３サブユニット（ＣＨＲＮＡ３）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｓｓ．Ｎｏｓ：Ｑ８ＶＨＨ６、Ｐ０４７５７、Ｑ８Ｒ４Ｇ９、Ｐ３２２９７）、神経細胞性アセチルコリン受容体α６サブユニット（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｓｓ．Ｎｏｓ：Ｑ１５８２５、Ｑ９Ｒ０Ｗ９）、血小板由来成長因子受容体β（ＰＤＧＦＲＢ）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｓｓ．Ｎｏｓ：Ｑ８Ｒ４０６、Ｑ０５０３０）、インターロイキン−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｓｓ．Ｎｏ：Ｑ００５６０）、インターロイキン２３受容体（ＩＬ−２３Ｒ）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｓｓ．Ｎｏ：ＡＦ４６１４２２）、ＩＬ−３、ＩＬ５およびＧｍＣｓｆのベータ共通サイトカイン受容体（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｓｓ．Ｎｏ：Ｐ３２９２７）、サイトカイン受容体様分子３（ＣＲＬＦ１）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｓｓ．Ｎｏ：Ｑ９ＪＭ５８）、クラスＩサイトカイン受容体（ＺＣＹＴＯＲ５）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｓｓ．Ｎｏ：Ｑ９ＵＨＨ５）、ネトリン−１受容体ＤＣＣ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｓｓ．Ｎｏ：Ｐ４３１４６）、白血球Ｆｃ受容体様タンパク質（ＩＦＧＰ２）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｓｓ．Ｎｏｓ：Ｑ９６ＰＪ６、Ｑ９６ＫＭ２）、マクロファージスカベンジャー受容体２（ＭＳＲ２）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｓｓ．Ｎｏ：Ｑ９１ＹＫ７）、または顆粒球コロニー刺激因子受容体（Ｇ−ＣＳＦ−Ｒ）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｓｓ．Ｎｏ：Ｑ９９０６２）、またはこれらの断片もしくは変異体を含む受容体が挙げられる。
他の実施形態において、糖タンパク質受容体は、プロテオグリカンの群から選択される。より好ましくは、プロテオグリカンは、ヘパラン硫酸プロテオグリカンを含む群から選択される。最も好ましい実施形態において、プロテオグリカンは、パールカン（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｓｓ．Ｎｏ：Ｐ９８１６０）、またはこれらの断片もしくは変異体である。
さらに他の実施形態において、糖タンパク質受容体は、膜アンカー型細胞表面酵素の群から選択される受容体である。例えば、細胞表面レセプターはメタロプロテイナーゼのピトリリシンファミリー、またはデスインテグリン（ｄｅｓｉｎｔｅｇｒｉｎ）およびメタロプロテアーゼのファミリー（ＡＤＡＭ）、例えばＡＤＡＭ−８（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｓｓ．Ｎｏ：Ｑ０５９１０）、ＡＤＡＭ−１９（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｓｓ．Ｎｏｓ：Ｑ９Ｈ０１３，Ｏ３５６７４）、ＡＤＡＭ−８（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｓｓ．Ｎｏ：Ｐ７８３２５）、ＡＤＡＭ−１２（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｓｓ．Ｎｏｓ：Ｏ４３１８４、Ｑ６１８２４）、ＡＤＡＭ−２８（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｓｓ．Ｎｏｓ：Ｑ９ＪＬＮ６、Ｑ６１８２４、Ｑ９ＸＳＬ６、Ｑ９ＵＫＱ２）、ＡＤＡＭ−３３前駆体（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｓｓ．Ｎｏｓ：Ｑ８Ｒ５３３、Ｑ９２３Ｗ９）、ＡＤＡＭ−９（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｓｓ．Ｎｏｓ：Ｑ１３４３３、Ｑ６１０７２）、ＡＤＡＭ−７（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｓｓ．Ｎｏｓ：Ｑ９Ｈ２Ｕ９、Ｏ３５２２７、Ｑ６３１８０）、ＡＤＡＭ−１Ａファーティリンα（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｓｓ．Ｎｏ：Ｑ８Ｒ５３３）、ＡＤＡＭ−１５（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｓｓ．Ｎｏｓ：Ｑ９ＱＹＶ０、Ｏ８８８３９、Ｑ１３４４４）、メタロプロテイナーゼ−デスインテグリン（ｄｅｓｉｎｔｅｇｒｉｎ）ドメイン含有タンパク質（ＴＥＣＡＭ）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｓｓ．Ｎｏ：ＡＦ１６３２９１）、メタロプロテイナーゼ１（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｓｓ．Ｎｏｓ：Ｏ９５２０４、Ｑ９ＢＳＩ６）、またはこれらの断片もしくは変異体を含む群から選択される。
いくつかの実施形態において、糖タンパク質受容体は、酵素、例えばヒドロラーゼ、トランスフェラーゼ、イソメラーゼ、リアーゼ、リガーゼ、トランスフェラーゼおよびオキシドレダクターゼなどであり得る。ヒドロラーゼの例としては、リパーゼ、コリンエステラーゼ、アルカリホスファターゼ、β−アミラーゼデオキシリボヌクレアーゼ、グルコアミラーゼＡおよびＢ、α−ガラクトシダーゼＩおよびＩＩ、β−フルクトフラノシダーゼ、β−グコウロニダーゼ（ｇｌｕｃｏｕｒｏｎｉｄａｓｅ）、Ｎ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ、ヒアルロニダーゼ、オキシトシナーゼ、カリクレイン、ブロメライン、エンテロキナーゼ、プロテイナーゼａ、ｂおよびｃ、ペプシノゲンおよびペプシンが挙げられる。オキシドレダクターゼの例としては、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよびクロロペルオキシダーゼが挙げられる。トランスフェラーゼの例としては、γ−グルタミルトランスペプチダーゼおよびリボヌクレアーゼが挙げられる。当業者は、本発明の方法に従って使用することができる酵素の他の公知の例を認識していると思われる。
さらなる実施形態において、糖タンパク質受容体は、成長因子または他のシグナル伝達分子であり得る。成長因子は、典型的には、細胞によって分泌され、他の細胞上の受容体に結合してこの受容体を活性化し、受容体細胞における代謝または発生変化を開始させる糖タンパク質である。哺乳動物成長因子および他のシグナル伝達分子の非限定的な例としては、サイトカイン；上皮成長因子（ＥＧＦ）；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；ＦＧＦ−５などの線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）；インスリン様成長因子−Ｔおよび−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）；ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−１（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質；ＣＤ−３、ＣＤ−４、ＣＤ−８およびＣＤ−Ｉ ９などのＣＤタンパク質；エリスロポエチン；骨誘導性因子；免疫毒素；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン−α、−β、−γなどのインターフェロン；Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦなどのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；ほとんどのインターロイキン；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ベータ；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；プロテインＣなどの抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺界面活性剤；ウロキナーゼまたはヒト尿などのプラスミノーゲン活性化因子または組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）；造血成長因子；およびエンケファリナーゼが挙げられる。当業者は、本発明の方法に従って使用することができる他の成長因子またはシグナル伝達分子を認識していると思われる。
他の実施形態において、糖タンパク質受容体は細胞膜輸送体であり得る。細胞膜輸送体は、典型的には、細胞膜の脂質二重層、例えばチャネル、溶質キャリアスーパーファミリー、活性輸送体、補助輸送タンパク質または他の輸送体などの溶質の輸送を媒介する糖タンパク質である。チャネルの例としては、ナトリウムチャネルサブユニットβ−１（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｓｓ．Ｎｏ：Ｑ０７６９９）が挙げられる。溶質キャリアファミリーの例としては、溶質キャリアファミリー２、促進型グルコース輸送体メンバー１（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｓｓ．Ｎｏ：Ｐ１１１６６）、溶質キャリアファミリー２２メンバー１（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｓｓ．Ｎｏ：Ｏ１５２４５）および溶質キャリアファミリー２２メンバー６（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｓｓ．Ｎｏ：Ｑ４Ｕ２Ｒ８）が挙げられる。活性輸送体の例としては、ナトリウム／カリウム輸送ＡＴＰａｓｅサブユニットα−２（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｓｓ．Ｎｏ：Ｐ５０９９３）が挙げられる。当業者は、本発明の方法に従って使用できる細胞膜輸送体の他の公知の例を認識していると思われる。

本明細書において（ＩＩ）によって示される特定の標的糖タンパク質受容体に特異的な用語「リガンド」は、本発明の文脈において広く使用される。具体的には、この用語は、膜に結合し、細胞表面上に位置するか、または分泌型である標的糖タンパク質受容体と相互作用または結合することができる任意の化合物を指す。各標的糖タンパク質受容体は１または複数の特異的リガンド結合部位を有することができ、これは異なるリガンドに対して同一であっても、または異なっていても、または重複していてもよく、リガンドの結合が起こる全標的糖タンパク質受容体内の特異的ペプチドドメイン（すなわち、タンパク質の特異的部分）である。リガンドとペプチドドメインとの間の認識は、リガンドまたは標的糖タンパク質受容体の配列特異性、三次元構造、または翻訳後修飾に起因し得る。リガンドの例としては、糖ペプチド、ポリペプチドを含むペプチド、糖タンパク質またはリンタンパク質を含むタンパク質、炭水化物、糖脂質、リン脂質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、アプタマー、ビタミン、抗原およびその断片、ハプテン、受容体アゴニスト、部分的アゴニスト、混合アゴニスト、拮抗薬、薬物、ケモカイン、ホルモン（例えば、ＬＨ、ＦＳＨ、ＴＲＨ、ＴＳＨ、ＡＣＴＨ、ＣＲＨ、ＰＲＨ、ＭＲＨ、ＭＳＨ、グルカゴンおよびプロラクチン；トランスフェリン；ラクトフェリン；アンジオテンシン；ヒスタミン；インスリン；レクチン）、伝達物質、オータコイド、成長因子（例えば、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦａ、ＴＢＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＦＧＦ、ＩＧＦ、ボンベシン、トロンボポエチン、エリスロポエチン、オンコスタチンおよびエンドセリン１）、インターロイキン（例えば、インターロイキン１から１５）、リンホカインおよび細胞シグナル伝達分子、例えば、腫瘍壊死因子（腫瘍壊死因子αおよびβ）およびインターフェロン（例えばインターフェロンα、βおよびγ）を含むサイトカイン、補欠分子族、補酵素、補因子、調節因子または受容体に特異的に結合することができる、天然または合成の有機分子ならびに同じ結合特性を維持するこれらの断片、類似体および他の誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。特定の細胞表面標的糖タンパク質受容体に特異的なリガンドは、広範囲の細胞型または特異的細胞型を標的とすることができる。
いくつかの実施形態において、リガンドは、ペプチド、炭水化物、脂質またはヌクレオチドを含む群から選択される。用語ヌクレオチドは、天然ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、ヌクレオチド誘導体、ジ−、オリゴ−またはポリヌクレオチド、またはヌクレオチド含有物質を含む。ヌクレオチド類似体は、ヌクレオチド塩基または修飾されたヌクレオチド塩基、糖残基または修飾された糖残基、ならびにモノ−、ジ−、トリ−、クアドラ−またはペンタ−エステル基を含む分子として定義される。例えばタンパク質の断片、すなわちペプチドが使用される場合、それは任意の適切な長さであってよい。ペプチドの（最小の）長さおよび組成、すなわちアミノ酸の数およびタイプは、結合相互作用の性質によって規定されることが理解されよう。ペプチドは、典型的には、例えば、３〜１００個のアミノ酸残基を含み得る。
いくつかの実施形態において、リガンドは抗体であってもよい。抗体は重い（約１５０ｋＤａ）球状血漿タンパク質であり、そのアミノ酸残基のいくつかにオリゴ糖鎖が付加されている。それらは、特定の抗原に特異的に結合する能力を有する。医薬または他の市販の薬剤として現在使用されているまたは調査中の多数の抗体を考えると、本発明の方法による特定のリガンドとの結合相互作用の分析は特に興味深い。いくつかの実施形態において、抗体は、治療用抗体のトラスツズマブおよびベバシズマブなどのモノクローナル抗体であり得る。いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体はヒト化抗体である。他の実施形態において、抗体はポリクローナルであり得る。
いくつかの実施形態において、操作された親和性結合剤、例えばアンキリンリピート結合剤、ファージディスプレイによって生成された親和性結合剤、またはオリゴ核酸またはペプチドアプタマーなどを使用することができる。
いくつかの実施形態において、リガンドは、上記の糖タンパク質受容体などの糖タンパク質であってもよい。いくつかの実施形態において、リガンドは、上記の細胞表面糖タンパク質受容体などの細胞表面タンパク質のドメインであってもよい。
いくつかの実施形態において、リガンドは微生物またはウイルスであってもよい。
本発明によれば、リガンドは、その標的糖タンパク質受容体とその結合部位を介して相互作用し、結合部位は、標的糖タンパク質受容体の特異的ペプチド断片、例えば標的糖タンパク質のその断片の特定のアミノ酸配列または３次元構造であり、結合部位と称される。その（細胞表面または分泌）標的糖タンパク質受容体結合部位に結合するリガンドに関する「相互作用」または「相互作用」という用語は、（細胞表面または分泌された）標的糖タンパク質受容体とリガンドとの間の一時的または永続的な直接的または間接的な接触を含み、その結合親和性、すなわち解離平衡定数Ｋ_ｄによって特徴付けることができる。その標的糖タンパク質受容体に対するリガンドの典型的な結合親和性は、少なくとも１０^−５Ｍ、好ましくは１０^−７Ｍ以上、例えば約１０^−８Ｍ〜約１０^−１２Ｍであり得る。本発明の方法は、（細胞表面または分泌）標的糖タンパク質受容体と、リガンドとの間の典型的な結合親和性および例えば１０^−５Ｍ未満の値を有するＫ_ｄを特徴とする低親和性相互作用の両方を検出可能である。

したがって、第１の態様において、本発明は三官能性架橋試薬に関する。これらの試薬は、式（Ｉ）

（式中、
Ｘはコア構造を表し、
Ｓ_１、Ｓ_２、Ｓ_３は互いに独立してスペーサー基を表し、
Ｌはリガンド反応性基を表し、
Ａは親和性基を表し、
Ｚはアリールまたはヘテロアリールを表し、
Ｒ’はＨまたはアルキル基を表し、Ｒ’’はアルキル基を表すか、またはＲ’、Ｒ’’は一緒になってシクロアルキル基を形成するアルカンジイルを表す）
によって表される。

式（Ｉ）のこれらの三官能性架橋剤は、有益な効果を示し、（特に遺伝子操作をしない場合のそれらの自然相互作用微小環境における）生細胞上の細胞膜糖タンパク質または分泌糖タンパク質を含む標的糖タンパク質受容体とのリガンドの相互作用の偏りのない検出のための直接定量的質量分析ワークフローに特に適している。これらの三官能性架橋剤はまた、生体液の分析において用途を見出すことができる。

本発明の第１の態様である式（Ｉ）の化合物について、以下にさらに詳細に説明する。

コア構造Ｘ：上記から明らかなように、本発明の化合物（Ｉ）は３つの分枝を有するコア構造Ｘを有し、各分枝は異なる官能性を有する（したがってこの架橋試薬はヘテロ三官能性とも呼ばれる）。第１の枝は、酸化糖タンパク質と反応することができるヒドラゾン基（Ｒ’’Ｒ’Ｃ＝Ｎ−ＮＨ−）を含む。第２の枝は、選択されたリガンドにコンジュゲートすることができるリガンド反応性基を含む。第３の枝は、精製目的、好ましくは第１および第２の官能基によって捕捉されたタンパク質の親和性精製目的のための親和性基を含む。これらの試薬は、１つの分子中のこれらの３つの異なる官能基の組み合わせが独特であり、リガンド（ＩＩ）と標的糖タンパク質受容体（ＩＩＩ）との間の相互作用の検出および特徴付けなどの様々な生物医学的用途において使用されるので特に興味深い。コア構造Ｘは、スペーサー基Ｓ_１、Ｓ_２、Ｓ_３および官能基の親和性基、Ｌおよびヒドラゾン基からなる３つの分枝を構築することを可能にする任意の構造であり得る。したがって、コア構造は、好ましくは、本明細書で定義される３つの反応性官能基を担持する。典型的には、コア構造およびスペーサー基は、３つの分枝の間の（したがって３つの官能基−Ｌ、−アフィニティー基およびヒドラゾン基の間の）立体障害がごくわずか、またはないように設計される。

一実施形態において、コア構造Ｘは置換アルキル基などの置換炭化水素、例えば、三置換または四置換炭素原子、例えばα−アミノ酸Ｈ_２Ｎ−ＣＨＲ_ＡＡ−ＣＯＯＨ（Ｒ_ＡＡはアミノ酸側鎖である）のα−炭素であり得る。したがって、Ｘは、反応性基を有する側鎖Ｒ_ＡＡを有する天然または非天然アミノ酸であり得る。天然アミノ酸の例としては、例えば、リジン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システインなどが挙げられる。非天然アミノ酸の例としては、例えば、対応するＤ−アミノ酸、ホモセリンなどが含まれる）。これらの実施形態において、３つのスペーサー基Ｓ_１、Ｓ_２、Ｓ_３は、アミノ基およびカルボキシ基ならびに反応性側鎖基Ｒ_ＡＡに連結され得る。有利な実施形態において、Ｘは式（Ｉ−Ｉ）

（式中、点線はＷ_１、Ｗ_２、Ｗ_３のＳ_１、Ｓ_２、Ｓ_３基への結合を表し、
Ｗ_１は−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−を表し、
Ｗ_２は−ＣＯＯ−、−ＯＯＣ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−を表し、
Ｗ_３は−ＣＯＯ−、−ＯＯＣ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−を表し、
ｓは１〜１２の整数を表す）
の基であってもよい。

式ＩＶの基の３つの官能基のいずれかが、３つのリンカーＳ_１、Ｓ_２、Ｓ_３のいずれかに結合できることは理解されよう。有利な実施形態において、Ｗ_１はＳ_１に連結され、Ｗ_２はＳ_２に連結され、Ｗ_３はＳ_３に連結される。
有利には、Ｗ_１は−ＮＨ−を表す。
有利には、Ｗ_２は−ＣＯＮＨ−を表す。
有利には、Ｗ_３は−ＮＨＣＯ−を表す。
有利には、ｓは４を表す。

さらなる実施形態において、コア構造Ｘは、式（Ｉ−ＩＩ）

（式中、Ｖ_１、Ｖ_２、Ｖ_３は、互いに独立して、カルボキシ、アミン、ヒドロキシル、チオールなどの官能基であり、Ｒ_ａ、Ｒ_ｂ、Ｒ_ｃは、互いに独立して、ＯまたはＮである）
の少なくとも三置換、好ましくは三官能性６員アリールまたはヘテロアリール基である置換されたアリールまたはヘテロアリール基であってよい。

なおさらなる実施形態において、コア構造Ｘは、直鎖または環状のグリセロールまたは糖部分から誘導され得る。本明細書に記載の三官能性架橋試薬の調製に使用することができる選択的（および特異的に除去可能な）保護基を有する様々な糖が利用可能である。

当業者は、様々な他のコア構造Ｘが、スペーサー基および官能基のために必要な足場を提供し得ることを知っていると思われる。

官能基Ｌ：三官能性架橋試薬（Ｉ）のこの官能基は、反応性官能基または活性化官能基などのリガンド反応性基である。この基は、スペーサーと選択されたリガンド（ＩＩ）とのカップリングのために役立ち、したがって、三官能性架橋試薬を特異的標的糖タンパク質受容体（ＩＩＩ）に向けることに役立つ。反応性官能基または活性化官能基は、リガンド上に存在する反応性カウンターパート基と反応することができる。

本明細書で使用される用語「反応性官能基」は、（特に他のことが述べられていない限り）保護されていない遊離官能基を指す。特定の実施形態において、反応性官能基は、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ_２、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＨ＝ＣＨ−および−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯＯＨからなる群から選択される。
反応性官能基を活性化するために使用される活性化試薬の例としては、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、３−ヒドロキシ−３，４−ジヒドロ−１，２，３−ベンゾトリアジン−４−オン（ＨＯＯＢｔ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＡＣ）、２−（１Ｈ−７−アザベンズトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＡＴＵ）、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）、３，４−ジヒドロ−１，２，３−ベンゾトリアジン−４−オン−３−オキシテトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＤＴＵ）、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＢＯＰ）、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス−（ピロリジノ）−ホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＰｙＢｏｐ）、（３，４−ジヒドロ−１，２，３−ベンゾトリアジン−４−オン−３−オキシ）ジエチルホスファート（ＤＥＰＢｔ）、３，４−ジヒドロ−１，２，３−ベンゾトリアジン−４−オン−３−オキシトリス−（ピロリジノ）−ホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＰＤＯＰ）、２−（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）−１，３−ジメチル−２−ピロリジン−１−イル−１，３，２−ジアザホスホリジニウムヘキサフルオロホスファート（ＢＯＭＰ）、５−（１Ｈ−７−アザベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）−３，４−ジヒドロ−１−メチル２Ｈ−ピロリウムヘキサクロロアンチモナート（ＡＯＭＰ）、（１Ｈ−７−アザベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＡＯＰ）、５−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−３，４−ジヒドロ−１−メチル２Ｈ−ピロリウムヘキサクロロアンチモナート：Ｎ−オキシド（ＢＤＭＰ）、２−ブロモ−３−エチル−４−メチルチアゾリウムテトラフルオロボラート（ＢＥＭＴ）、２−ブロモ−１−エチルピリジニウムテトラフルオロボラート（ＢＥＰ）、２−ブロモ−１−エチルピリジニウムヘキサクロロアンチモナート（ＢＥＰＨ）、Ｎ−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イルメチレン）−Ｎ−メチルメタンアミニウムヘキサクロロアンチモナートＮ−オキシド（ＢＯＭＩ）、Ｎ、Ｎ’−ビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）ホスフィン酸クロリド（ＢＯＰ−Ｃｌ）、１−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）フェニルメチレンピロリジニウムヘキサクロロ−アンチモナート（ＢＰＭＰ）、１，１，３，３−ビス（テトラメチレン）フルオロウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＢＴＦＦＨ）、クロロ（４−モルホイノ（ｍｏｒｐｈｏｉｎｏ））メチレンモルホリニウムヘキサフルオロホスファート（ＣＭＭＭ）、２−クロロ−１，３−ジメチル−１Ｈ−ベンズイミダゾリウムヘキサフルオロホスファート（ＣＭＢＩ）、２−フルオロ−１−エチルピリジニウムテトラフルオロボラート（ＦＥＰ）、２−フルオロ−１−エチルピリジニウムヘキサクロロアンチモナート（ＦＥＰＨ）、１−（１−ピロリジニル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジン−１−イルメチレン）ピロリジニウムヘキサフルオロ−ホスファートＮ−オキシド（ＨＡＰｙＵ）、Ｏ−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ；−ビス−（ペンタメチレン）ウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＢＰｉｐＵ）、Ｏ−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）Ｎ，Ｎ，Ｎ０，Ｎ０−ビス（テトラメチレン）ウリニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＢＰｙＵ）、（１Ｈ−７−アザベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリス（ピロリジノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＰｙＡＯＰ）、ブロモ−トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＰｙＢｒＯｐ）、クロロ−トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＰｙＣｌＯＰ）、１，１，３，３−ビス（テトラメチレン）クロロウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＰｙＣｌＵ）、テトラメチルフルオロ−マミジニウムヘキサフルオロホスファート（ＴＦＦＨ）、トリホスゲン、トリアジン系試薬［塩化シアヌル、フッ化シアヌル、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ−ＭＭ）、２−クロロ−４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン（ＣＤＭＴ）］、ビス（２−クロロフェニル）ホスホロクロリダート、ジフェニルホスホロクロリダート、ジフェニルホスホロアジド（ＤＰＰＡ）およびこれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用する用語「活性化官能基」は、対応する活性化官能基を得るためにカップリング剤を用いて標準的な化学技術によって活性化された反応性官能基を指す。
活性化された官能基は、それらの特異的反応性に従ってサブグループに分けることができる。したがって、特定の実施形態において、活性化官能基は、アミン反応性基、ヒドロキシル反応性基、チオール反応性基、アルデヒドまたはケト反応性基、およびカルボキシ反応性基からなる群から選択される。

「アミン反応性基」は、（第１級または第２級）アミンと反応する活性化官能基である。典型的なアミン反応性基としては、アリールまたはアルキル活性化カルボン酸エステル−ＣＯＯＲ、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルまたはこれらの誘導体（例えば、スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、フェノールエステルまたはこれらの誘導体（例えば、Ｒはフェノール、ｐ−ニトロフェノール、テトラフルオロフェノールである）が挙げられる。他のアミン反応性基としては、塩化アシル（−ＣＯＣｌ）、アリールおよびアルキルイミダート−Ｃ（ＮＨ）ＯＭｅ）およびアルキルまたはアリールイソシアナート（−ＮＣＯ）またはイソチオシアナート（−ＮＣＳ）が含まれる。

「ヒドロキシル反応性基」は、ヒドロキシルと反応する活性化官能基である。典型的なヒドロキシル反応性基としては、例えばアルキルまたはアリールイソシアナート−ＮＣＯ、およびアリールまたはアルキル活性化カルボン酸エステル−ＣＯＯＲが挙げられる。

「チオール反応性基」は、チオールと反応する活性化官能基である。典型的なチオール反応性基としては、例えばマレイミドまたはα−ハロアミド（−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ_２−Ｈａｌ）が挙げられる。

「アルデヒド−またはケト反応性基」は、（第１級または第２級）アルデヒドまたはケトンと反応する活性化官能基である。典型的なアルデヒドまたはケト反応性基としては、例えばアリールまたはアルキルヒドラジン（−ＮＨＮＨ_２）、アリールまたはアルキルアシルヒドラジン（−ＣＯ−ＮＨＮＨ_２）、アルキルまたはアリールヒドロキシルアミン（−ＯＮＨ_２）が挙げられる。

「カルボキシ反応性基」は、カルボキシル基と反応する活性化官能基である。典型的なカルボキシ反応性基としては、例えばハロゲン、アルキルまたはアリールスルホナート、ヒドロキシル、エポキシ、メルカプト、アミノ、イソシアナトおよびカルボジイミド基が挙げられる。

リガンド反応性基およびリガンド上に存在する反応性基の多数の対が実現可能であり、当業者が、選択されたリガンドとのカップリングのために、どのリガンド反応性基を選択すべきかを知っていることは理解されよう。

有利な実施形態において、Ｌは、アミン反応性基、ヒドロキシル反応性基、チオール反応性基、アルデヒドまたはケト反応性基、好ましくはアミン反応性基からなる群から選択される活性化官能基である。特に好ましくは、アリール−またはアルキル−活性化カルボン酸エステル−ＣＯＯＲ、例えば式、

のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである。

さらなる有利な実施形態において、Ｌは、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ_２、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＨ＝ＣＨ−および−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯＯＨからなる群から選択される反応性官能基である。

スペーサー基：上記のように、３つのスペーサー基は、立体的な混雑が最小限に抑えられ、３つの官能基の反応性が損なわれないように選択することができる。ヒドラゾン基およびリガンド反応性基Ｌを担持するリンカーＳ_２および／またはＳ_３の変異は、結合部位の近接をスキャンし、目的の標的受容体タンパク質それ自体の上に、または最終的には隣接分子上に位置していてもよい異なる炭水化物構造を捕捉することを可能にする。

本明細書で使用される用語「スペーサー」は、典型的には、単結合または直鎖もしくは分枝鎖の置換もしくは非置換Ｃ（１−２４）アルキレンであり、ＯおよびＮなどのヘテロ原子が互いに直接結合していないことを条件として、１または複数の、好ましくは隣接しない−ＣＨ_２−基が互いに独立して１または複数の架橋基および／または非置換もしくは置換のシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリールにより置換されていてもよい。架橋基は、アルキレン鎖内の−ＣＨ_２−基または末端−ＣＨ_２−基を置換し得る。

本明細書で使用される「架橋基」は、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＣＨ_２（ＣＯ）−、−ＳＯ−、−ＣＨ_２（ＳＯ）−、−ＳＯ_２−、−ＣＨ_２（ＳＯ_２）−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−Ｓ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｓ−、−ＳＯＯ−、−ＯＳＯ−、−ＳＯＳ−、−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−、−ＯＣＨ_２−、−ＣＨ_２Ｏ−、−ＮＲ_１−、−ＮＲ_１−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＲ_１−、−ＮＲ_１−ＣＯ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−ＮＲ_１−、−ＮＲ_１−ＣＯ−ＮＲ_１−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ＝Ｎ−、−Ｃ（ＣＨ_３）＝Ｎ−、−Ｎ＝Ｎ−（式中、Ｒ_Ｎは水素原子もしくはＣ（１−６）アルキル、またはこれらの組み合わせを表す）から選択される。好ましい架橋基としては、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＣＨ_２（ＣＯ）−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−、−ＯＣＨ_２−、−ＣＨ_２Ｏ−、ＮＲ_１−、−ＮＲ_１−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＲ_１−、−ＮＲ_１−ＣＯ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−ＮＲ_１−、−ＮＲ_１−ＣＯ−ＮＲ_１−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ＝Ｎ−、−Ｃ（ＣＨ_３）＝Ｎ−（式中、Ｒ_１はＨもしくはＣ（１−６）アルキル、またはこれらの組み合わせを表す）が挙げられる。より好ましい架橋基としては、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＣＨ_２（ＣＯ）−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−、−ＯＣＨ_２−、−ＣＨ_２Ｏ−、ＮＲ_１−、−ＮＲ_１−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＲ_１−（式中、Ｒ_１はＨもしくはＣ（１−６）アルキル、またはこれらの組み合わせを表す）が挙げられる。

特定の実施形態において、スペーサー基は、６〜３０個の炭素原子を有する置換もしくは非置換のヘテロアルキレン基、好ましくはポリエチレングリコール基（線状配置で２〜２４個のエチレングリコールモノマーを有する）、ポリアルコール基、ポリアミン基（例えばスペルミン、スペルミジンおよびこれらのポリマー誘導体）、（例えば、線状配置で３〜１５個のエチルアクリラートモノマーを有するポリエステル基（例えば、ポリ（エチルアクリラート））、ポリアミノ酸基またはこれらの組み合わせであり得る。

より好ましくは、スペーサー基は、１〜８個のアミノ酸を含むポリアミノ酸（すなわち、１個のアミノ酸またはジ−、トリ−、テトラ−、ペンタ−、ヘキサ−、ヘプタ−もしくはオクタペプチド）またはジ−、トリ−、テトラ−ペンタ−もしくはヘキサエチレングリコールであるポリエチレングリコール基、またはこのようなポリアミノ酸とポリエチレングリコールとの組み合わせであり得る。好ましい実施形態において、スペーサー基Ｓ_１、Ｓ_２、Ｓ_３は互いに独立して、式（ａ）および／または（ｂ）
（ａ）−［Ｙ_１−（ＣＨ_２）_ｎ］_ｐ−
（ｂ）−［Ｙ_２−（ＣＨ_２）_ｍ−Ｙ_３］_ｑ−、
（式中、
Ｙ_１、Ｙ_２、Ｙ_３は互いに独立して、Ｏ−、−ＣＯ−、ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−、−ＯＣＨ_２−、−ＣＨ_２Ｏ−、ＮＲ_１−、−ＮＲ_１−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＲ_１−
（式中、Ｒ_１はＨまたはＣ（１−６）−アルキルを表す）であり、および
ｎ、ｍ、ｐおよびｑは、互いに独立して、１〜１０の整数である）
またはこれらの組み合わせ、
の１または複数の繰り返し単位を含む直鎖を表す。

上記の基の組み合わせ（用語「これらの組み合わせ」によって示される）は、（ａ）および（ｂ）の組み合わせを交互またはブロック形態で含み、したがって、式
−［Ｙ_１−（ＣＨ_２）_ｎ］_ｐ−［Ｙ_２−（ＣＨ_２）_ｍ−Ｙ_３］_ｑ−、
−［Ｙ_２−（ＣＨ_２）_ｍ−Ｙ_３］_ｑ−［（ＣＨ_２）−Ｙ_１］_ｐ−、
−［Ｙ_１−（ＣＨ_２）_ｎ］_ｐ−［Ｙ_１−（ＣＨ_２）_ｍ−Ｙ_２］_ｑ−［（ＣＨ_２）_ｎ−Ｙ_１］_ｐ−
（式中、Ｙ_１、Ｙ_２、Ｙ_３は互いに独立して、Ｏ−、−ＣＯ−、ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−、−ＯＣＨ_２−、−ＣＨ_２Ｏ−、ＮＲ_１−、−ＮＲ_１−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＲ_１−
（式中、Ｒ_１はＨまたはＣ（１−６）−アルキルを表す）であり、
ｎ、ｍ、ｐおよびｑは互いに独立して、１〜１０の整数である）
のうちの１つを有し得る。
したがって、好ましい反復単位としては、
−ＣＯ−ＮＲ_１−（ＣＨ_２）_ｎ１−、−ＮＲ_１−ＣＯ−（ＣＨ_２）_ｎ２−、−（ＣＨ_２）_ｎ３−ＣＯ−ＮＲ_１−、−（ＣＨ_２）_ｎ４−ＮＲ_１−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＲ_１−（ＣＨ_２）_ｎ５−ＮＲ_１−ＣＯ−、−ＮＲ_１−ＣＯ−（ＣＨ_２）_ｎ６−ＣＯ−ＮＲ_１−、−ＣＯＯ−（ＣＨ_２）_ｍ１−、
−ＯＣＯ−（ＣＨ_２）_ｍ２−、−（ＣＨ_２）_ｍ３−ＣＯＯ−、−（ＣＨ_２）_ｍ４−ＯＣＯ−、−ＣＯＯ−（ＣＨ_２）_ｍ５−ＯＣＯ−、
−ＯＣＯ−（ＣＨ_２）_ｍ６−ＣＯＯ−、−Ｏ−（ＣＨ_２）_ｐ１−、−（ＣＨ_２）_ｐ２−Ｏ−が挙げられるが、これらに限定されない。
（式中、Ｒ_１はＨまたはＣ（１−６）−アルキルを表し、ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５、ｎ６、ｍ１、ｍ２、ｍ３、ｍ４、ｍ５、ｍ６、ｐ１およびｐ２は互いに独立して１〜１０の整数、好ましくは１、２、３、４、５または６である）。

上記の基の他の組み合わせは、様々な繰り返し単位（ａ）の組み合わせ、例えば、以下の式
−［Ｙ_１−（ＣＨ_２）_ｎ］_ｐ−［Ｙ_１’−（ＣＨ_２）_ｎ’］_ｑ’−［Ｙ_１’’−（ＣＨ_２）_ｎ’’］_ｑ’’−
（式中、Ｙ_１、Ｙ_１’、Ｙ_１’’は互いに独立して、Ｏ−、−ＣＯ−、ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−、−ＯＣＨ_２−、−ＣＨ_２Ｏ−、ＮＲ_１−、−ＮＲ_１−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＲ_１−
（式中、Ｒ_１はＨまたはＣ（１−６）−アルキルを表す）であり、
ｎ、ｎ’、ｎ’’は互いに独立して、１〜１０の整数である）
を有するものも挙げることができる。

有利な実施形態において、本発明は、本明細書に記載の式（Ｉ）
（式中、
Ｓ_１はＣ（１−２４）アルキレンを表し、
Ｓ_２はＣ（１−２４）アルキレンを表し、
Ｓ_３はＣ（１−２４）アルキレンを表し、
アルキレンは直鎖または分枝鎖であり、アルキレンは置換または非置換であり、ＯおよびＮなどのヘテロ原子が互いに直接結合していないことを条件として、１または複数の、好ましくは隣接しないアルキレンの−ＣＨ２−基が互いに独立して、１または複数の架橋基Ｙおよび／または非置換もしくは置換のシクロアルキル、非置換もしくは置換のヘテロシクロアルキル、非置換もしくは置換のアリール、非置換もしくは置換のヘテロアリールで置換されていてもよい）
の化合物に関する。

有利な実施形態において、本発明は、本明細書に記載の式（Ｉ）
（式中、Ｙは、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＣＨ_２（ＣＯ）−、−ＳＯ−、−ＣＨ_２（ＳＯ）−、−ＳＯ_２−、−ＣＨ_２（ＳＯ_２）−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−Ｓ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｓ−、−ＳＯＯ−、−ＯＳＯ−、−ＳＯＳ−、−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−、−ＯＣＨ_２−、−ＣＨ_２Ｏ−、−ＮＲ_１−、−ＮＲ_１−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＲ_１−、−ＮＲ_１−ＣＯ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−ＮＲ_１−、−ＮＲ_１−ＣＯ−ＮＲ_１−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ＝Ｎ−、−Ｃ（ＣＨ_３）＝Ｎ−、−Ｎ＝Ｎ−の基を表し、Ｒ_１は互いに独立して水素またはＣ（１−６）アルキルを表す）
の化合物に関する。

特に有利な実施形態において、本発明は、Ｙが−ＮＨ−ＣＯ−を表す、本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物に関する。

本発明の三官能性架橋剤の製造に使用するために、スペーサー基は、好ましくは、Ｘまたは官能基Ａ、Ｌおよび芳香族ヒドラジン基の１つに結合するように選択的に保護または活性化され得る末端官能基と共に提供されることが理解されよう。したがって、いくつかの実施形態において、スペーサー基は、架橋基、好ましくは−ＣＯＯ−、−ＣＯ−ＮＲ_１−、−Ｏ−、−ＮＲ_１−、−ＮＲ_１−ＣＯＯ−および−Ｓ−Ｓ−結合から選択される基を介して、Ｘおよび個別の官能基（Ａ、Ｌまたは芳香族ヒドラジン基）とカップリングすることができる。さらに、コア構造、スペーサー、および３つの官能基Ａ、Ｌおよび芳香族ヒドラジン基のうちの１つを組み立てる好ましい順序はないことが理解されよう。当業者は、様々な基の性質に応じて、組立の１つの順序が好ましいことを理解すると思われる。

ヒドラゾン基：本発明の三官能性架橋試薬のさらなる官能基は、式

のヒドラゾン基である。
この基は、細胞表面上の糖タンパク質、または分泌された糖タンパク質の酸化炭水化物基との共有結合を選択的に形成することができる。酸化糖タンパク質は、細胞表面上、または分泌された糖タンパク質それ自体に位置していてもよく、または標的糖タンパク質受容体と相互作用する空間的に近い分子上に位置していてもよい。スペーサーＳ_２およびＳ_３の長さは、リガンド結合部位と酸化糖タンパク質との間の距離を決定する。したがって、スペーサーＳ_２およびＳ_３の長さを変化させることにより、リガンド結合部位の現在の周囲環境または拡大環境をスキャンまたはプローブすることが可能になる。用語「ヒドラゾン基」は、水素、置換（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、置換アリールおよび置換ヘテロアリールから選択される置換基を有するアルデヒドまたはケトンヒドラゾンを含む。本発明における使用のための置換基Ｒ’、Ｒ’’の選択が、架橋試薬の意図される使用に依存し得ることは理解されよう。

有利な実施形態において、本発明は、Ｒ’がＣ（１−６）−アルキルを表し、Ｒ’’がＣ（１−６）−アルキルを表す本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物に関する。

有利な実施形態において、本発明は、Ｒ’およびＲ’’がメチルを表す、本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物に関する。

有利な実施形態において、本発明は、Ｚが、非置換または置換のフェニル、ナフチルおよびアントラセニルから選択されるアリール基を表す、本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物に関する。

有利な実施形態において、本発明は、Ｚが、非置換または置換のピリジル、フリル、イミダゾリル、ベンズイミダゾリル、ピリミジニル、チエニル、キノリニル、インドリルおよびチアゾリルから選択されるヘテロアリール基を表し、特に好ましくはＺがピリジルである、式（Ｉ）の化合物に関する。

親和性基：本明細書で使用される用語「親和性基」は、検出、同定および精製目的のために、別の組成物（場合によりビーズ、フィルター、プレート、膜、クロマトグラフィー樹脂など固体支持体に結合または連結されている）により特異的に結合され得る任意の同定可能なタグ、基または部分を指す。多くの異なる種の親和性基が当技術分野において公知であり、本発明の本方法のために個別に、または１または複数の異なる親和性基の組み合わせのいずれかで使用できることは理解されよう。特に好適な親和性基は、固体支持体への共有結合が可能である。このような共有結合は、溶解物からの酸化糖タンパク質受容体の単離を容易にする。

特に好ましい親和性基はアジド（−Ｎ_３）であり、したがって、式（Ｉｄ）

の化合物である。
この親和性基（すなわち、アジド基）は、式（Ｉ）の化合物の直接合成および精製を可能にするので、特に有用である。

さらに特に好ましい親和性基は、アルキン基−ＣＣＨであり、したがって、式（Ｉｅ）

の化合物である。
この親和性基（すなわちアルキン基）は、式（Ｉ）の化合物中の多種多様なリガンド反応性基Ｌから選択可能なので、特に有用である。

上記の議論を考慮して、式（Ｉ）の特異的化合物は、リガンド−標的糖タンパク質相互作用の特徴付けおよび分析のために使用される場合に特に有用であることが見出された。化合物は、以下の式（Ｉａ）、（Ｉｂ）および（Ｉｃ）によって定義される。

さらなる実施形態において、本発明は、式（Ｉａ）

（式中、
Ｌ、Ｓ_１、Ｓ_２、Ｓ_３、Ｚ、Ｒ’、Ｒ’’、ｓは、本明細書において定義された通りであり、
Ｗ_１は、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−であり、
Ｗ_２は、−ＣＯＯ−、−ＯＯＣ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ、−ＮＨ−、−Ｏ−、および−Ｓ−から選択される基であり、
Ｗ_３は、−ＣＯＯ−、−ＯＯＣ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−から選択される基である）
の化合物に関する。

さらなる実施形態において、本発明は、式（Ｉｂ）

（式中、置換基は請求項１に定義の通りである）の化合物に関する。

さらなる実施形態において、本発明は、ニックネーム「ＨＡＴＲＩＣ」により公知の式（Ｉｃ）

の化合物に関する。

さらなる有利な実施形態において、架橋試薬は水溶性および／または生体適合性である。用語「水溶性」は、典型的には、２４℃における物質と水の総重量に基づいて、１重量％を超える水中の物質の溶解性を指す。水溶性は、本発明の架橋剤の親水性、より具体的には、Ａ、Ｌ、Ｘ、Ｚ、Ｓ_１、Ｓ_２、Ｓ_３およびＲ_Ｎの１または複数の基の親水性によって付与される。当業者は、十分に親水性の架橋剤を得るためにどの化学基を選択すべきかを知っていると思われる。好ましい実施形態において、１または複数のスペーサー基Ｓ_１、Ｓ_２およびＳ_３は、得られる架橋試薬の親水性を高めるために、より親水性の官能基を含むことができる。用語「生体適合性」は、ヒトの細胞、組織または体液に関する化学的不活性およびこのような生存体に対する架橋試薬の最小毒性効果を指す。

第２の態様において、本発明は、リガンド（ＩＩ）と標的糖タンパク質（ＩＩＩ）との間の相互作用を特徴付け、分析するための本発明の三官能性架橋試薬の使用に関し、図１および３を参照されたい。
簡潔には、上に示したように、本発明の架橋剤は、三官能性分子中に２つの異なる化学反応性基および１つの親和性基を組み合わせる。第１の化学反応性基は、目的のリガンド（ＩＩ）への架橋剤のカップリングのために使用されるリガンド反応性基、好ましくはＮ−ヒドロキシスクシンイミドであり、次いでこれは（細胞表面の、または分泌された）目的の標的糖タンパク質受容体（ＩＩＩ）に結合する。第２の化学反応性基は、酸化された標的糖タンパク質を捕捉するための芳香族ヒドラゾン、好ましくはアセトン保護ヒドラジノニコチナート基である。目的のリガンドにコンジュゲートすると、本発明の親和性タグ付き架橋剤は、酸化された生細胞上または溶液中の相互作用する標的糖タンパク質受容体の炭水化物指向性捕捉、および親和性基、好ましくはアジドを介した完全配列の捕捉糖タンパク質のその後の親和性濃縮を可能にし、その後の質量分析を可能にする。非指向性の対照試料との定量的比較により、リガンドとそれらの対応する標的糖タンパク質受容体との相互作用から生じる親和性タグ付け事象（例えば、アジド化）は、ランダムな（細胞表面の、または分泌された）タンパク質の非特異的な確率論的親和性タグ付け事象（例えば、アジド化）とは明確に識別することができる。これは、低親和性および一時的なリガンド−標的糖タンパク質受容体相互作用、ならびにリガンドと、元の細胞環境における膜結合形態または生体液中の分泌形態で存在する低量の糖タンパク質とのオフターゲット効果の検出でさえも可能にする。
これは、細胞表面標的糖タンパク質受容体の場合、図１に模式的に示されており、目的のリガンド（ＩＩ）は、リガンド適合性緩衝液中の三官能性架橋剤とカップリングされる。別の対照反応では、等モル量の架橋剤が対照タンパク質にカップリングされるか、または純粋な緩衝液中でクエンチされる（図１（ｉｉｉ））。細胞表面の炭水化物にアルデヒド基を生成させるために、生細胞を酸化させる（図１（ｉｉ））。次いで、先にカップリングしたリガンドを酸化細胞に添加して、酸化細胞表面の炭水化物構造の捕捉を可能にする（図１（ｉｖ ａ））。これにより、ランダムな細胞表面糖タンパク質が確率論的事象によって標識され、目的のリガンドのための標的細胞表面糖タンパク質受容体が、直接リガンド−受容体相互作用により効率的に捕捉される。並行して、対照プローブが同数の酸化細胞に加えられ、確率的な標識事象のみを生じる。以下の全てのステップで、両方のプローブが並行して処理される。標識反応後、細胞を溶解する（ｖ）。残りの画分を洗浄し、アジドタグ付き細胞表面糖タンパク質を銅触媒によるアジド−アルキン環化付加によってアルキン−マトリックスで捕捉する（図１（ｖｉ））。完全配列糖タンパク質の共有結合捕捉時に、これらは還元され、アルキル化される。マトリックスと糖タンパク質との間の共有結合は、非共有結合化合物を除去するための過酷な洗浄を可能にする。洗浄後、完全配列の捕捉糖タンパク質はプロテアーゼ、典型的にはセリンプロテアーゼトリプシンで消化され、これはＣ末端をアルギニンまたはリジンまで切断するが、プロリンの前では切断しないか、または低頻度で切断する（図１（ｖｉｉ））。得られるトリプシン性ペプチドは、ＨＡＴＲＩＣを介してマトリックスに未だ共有結合しているグリコシル化ペプチド（Ｘ）と、グリコシル化されていないか、またはマトリックスから放出されたＨＡＴＲＩＣと相互作用しなかったペプチド（ＩＸ）との間で異なる。放出されたペプチド（ＩＸ）を脱塩し、細胞表面糖タンパク質の同定のために高質量精度質量分析に供する（図１（ｖｉｉｉ））。細胞表面糖タンパク質のトリプシン性糖ペプチドは、マトリックスに共有結合したままである（図１（ｖｉｉ ｂ））。プロテアーゼを洗い流した後、Ｎ−糖ペプチド（ＸＩ）を、オリゴ糖構造の最も内側の成分と、ペプチドのＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔグリコシル化モチーフ（それぞれ、Ｎはアスパラギンを表し、Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸を表し、Ｓ／Ｔはセリンまたはスレオニンを表す）中の糖ペプチドのアスパラギンとの間を切断するＰＮＧａｓｅ Ｆを用いた酵素的ステップによりビーズから特異的に放出させる。そうすることにより、ＰＮＧａｓｅＦはアスパラギンを脱アミド化し、先にグリコシル化されたペプチド（図１（ｉｘ））中の特異的Ｎ１１５−Ｘ−Ｓ／Ｔシグネチャーを導入する。放出されたペプチドは脱塩され、高質量精度質量分析計を用いた分析のための適切な緩衝溶液中に再懸濁される。２つの異なるペプチド画分（ＩＸおよびＸＩ）の分析のために、質量分析計は、所定の閾値を超えるイオン信号が、ペプチドの衝突誘起解離（ＣＩＤ）スペクトルまたは高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）スペクトルを生成するためにＭＳからＭＳ／ＭＳモードに切り替えるように装置を自動的に始動させる、データ依存モードで操作される。全てのＭＳ／ＭＳスペクトルを標準タンパク質データベースに対して検索する。Ｎ−糖ペプチド画分からのＭＳ／ＭＳスペクトルを、Ｎ１１５−Ｘ−Ｓ／Ｔモチーフの存在についてさらにフィルタリングする。異なるペプチド画分（ＩＸおよびＸＩ）の両方に基づいて、細胞表面受容体の特異的濃縮を検出するために、リガンド試料中の細胞表面ペプチドの濃度を対照試料と定量的に比較する。細胞表面タンパク質由来の確率論的にタグ付けされたペプチドについて、比率は約１のはずであり、リガンドに基づく方法で特異的に捕捉された糖タンパク質受容体ペプチドは、対照に対してリガンド試料においてより高い値を得る。タンパク質が２以上のペプチドで同定される場合、豊富な情報を、２つの異なるペプチド画分から組み合わせることができる。

ＭＳ分析は、他の分析方法に置き換えることができると考えられる。このような他の方法は、本方法の一部として含まれる。

したがって、第３の態様において、本発明は、式（Ｉ）の化合物の使用により、リガンド（ＩＩ）と試料中の標的糖タンパク質受容体（ＩＩＩ）との間の特異的相互作用を同定する方法に関する。具体的には、本発明は、標的（ＩＩＩ）が糖タンパク質受容体であり、リガンド（ＩＩ）が、標的（ＩＩＩ）上のリガンド特異的ドメインを認識し、本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物、リガンド（ＩＩ）および標的（ＩＩＩ）を含む標的−リガンド−試薬−複合体（ＶＩ）が形成され、リガンド（ＩＩ）が式（Ｉ）の基Ｌに共有結合し、標的（ＩＩＩ）が式（Ｉ）に存在するヒドラゾン基に共有結合する方法を提供する。

本発明のこの態様を以下にさらに詳細に説明する。

上記のように、標的糖タンパク質受容体（ＩＩＩ）は、（図１に示すように）溶液中または細胞表面上に存在し得ることは理解されよう。

上記のように、化合物（Ｉ）は、本発明の第１の態様に概説されるような多数の誘導体を含むことが理解されよう。したがって、好ましい実施形態において、本発明の上記方法は、式（Ｉａ）、（Ｉｂ）または（Ｉｃ）に従った化合物を用いて実施される。

この態様によれば、本発明は、リガンド（ＩＩ）と、細胞集団を含む試料中の、少なくとも１つのアルデヒド官能基（ＩＩＩ）を有する細胞表面受容体との間の特異的相互作用を同定する方法であって、リガンド（ＩＩ）が、標的糖タンパク質受容体（ＩＩＩ）上のリガンド特異的ペプチドドメインを認識する方法に関する。このようなアルデヒド官能基は、本明細書に記載されるように化学的に誘導され、代謝的に操作されるか、または酵素的に生成され得る。

有利な実施形態において、本発明の方法は、
ｉ）標的（ＩＩＩ）を含む試料を提供するステップと、
ｉｉ）標的（ＩＩＩ）を酸化処理して、少なくとも１つの炭水化物残基上にアルデヒド官能基を生成させ、それによって酸化標的（ＩＶ）を得るステップと、
ｉｉｉ）本明細書に記載の式（Ｉ）の三官能性架橋試薬を提供し、そのリガンド反応性基Ｌをリガンド（ＩＩ）とコンジュゲートさせて、リガンド−試薬−複合体（Ｖ）を得るステップと、
ｉｖ）ステップ（ｉｉ）の試料とステップ（ｉｉｉ）の複合体（Ｖ）とを、（ａ）複合体（Ｖ）が酸化標的（ＩＶ）上のリガンド特異的ドメインに結合することができ、ｂ）複合体（Ｖ）のヒドラゾン基（Ｒ’Ｒ’’Ｃ＝Ｎ−ＮＨ−）をその遊離形態に変換し、酸化炭水化物標的（ＩＶ）と共有結合させた条件下で接触させて、共有結合したリガンドと共有結合した標的とを含む標的−リガンド−試薬複合体（ＶＩ）を得るステップと、
ｖ）ステップ（ｉｖ）の試料を溶解して膜に包埋された細胞表面タンパク質および複合体（ＶＩ）を利用可能にしてマトリックス（ＶＩＩ）と反応させて、マトリックス−結合複合体（ＶＩＩＩ）を得るステップと、
ｖｉ）親和性マトリックス（ＶＩＩ）を使用して試料から複合体（ＶＩ）を濃縮し、マトリックス結合複合体（ＶＩＩＩ）を得るステップと、
ｖｉｉ）マトリックス結合複合体（ＶＩＩＩ）を消化して、（ａ）放出されたペプチド（ＩＸ）および（ｂ）マトリックスに結合した糖ペプチド（Ｘ）を得るステップと、
ｖｉｉｉ）場合により、マトリックス（ＶＩＩＩ）から結合糖ペプチド（Ｘ）を放出し、放出された糖ペプチド（ＸＩ）を得るステップと、
ｉｘ）放出された、（ＩＸ）、（ＸＩ）を、好ましくは高質量精度質量分析によって分析および定量するステップと、
ｘ）リガンドと標的糖タンパク質受容体との間の相互作用を、好ましくは対照反応との定量的比較を介して同定するステップと
を含む。

したがって、本発明の典型的な方法では、ステップ（ｉ）〜（ｘ）が実施される。これらの方法ステップは、「ＨＡＴＲＩＣベースのＬＲＣのワークフロー」とも呼ばれ、以下にさらに詳しく説明する：
ステップ（ｉ）：本明細書において上記で定義した細胞表面糖タンパク質受容体の場合、試料は、少なくとも１つがこのような細胞表面糖タンパク質受容体を発現する細胞または組織の集団を含む。本明細書において上記で定義された分泌糖タンパク質の場合、試料は、少なくとも１種の分泌糖タンパク質を含む生体液を含む。

本明細書で使用される用語「試料」または「生体試料」は、任意の生きた細胞または生物から得られる、それによって排出または分泌される任意の固体または流体試料を指し、組織培養物、バイオリアクター、ヒトまたは動物組織、植物、果物、野菜、単細胞微生物（例えば、細菌および酵母）および多細胞生物を含むが、これらに限定されない。例えば、生体試料は、例えば、血液、血漿、血清、尿、胆汁、***、脳脊髄液、眼房水もしくは硝子体液、または任意の身体分泌物、漏出液、滲出物（例えば、膿瘍または感染症もしくは炎症の任意の他の部位から得られる流体）または関節から得られる流体（例えば、正常な関節または関節リウマチ、変形性関節症、痛風または敗血症性関節炎などの疾患に侵された関節）から得られる生体液であってよいが、これらに限定されない。生体試料はまた、例えば、任意の器官または組織（生検または剖検標本を含む）から得られた試料であってもよく、細胞（初代細胞であろうと培養細胞であろうと）、任意の細胞、組織または器官により順化された培地、組織培養物を含むことができる。

用語「標的」は、糖タンパク質受容体（ＩＩＩ）を指し、上記で定義される。

ステップ（ｉｉ）：このステップにおいて、試料を酸化処理して、標的糖タンパク質受容体上に存在する炭水化物上にアルデヒド基を生成させる。これは、例えば、過ヨウ素酸塩（例えば、１〜２ｍＭのＮａＩＯ_４）を使用することによって達成することができる。

図１は白抜きの菱形を示すことによってこのステップを概説している。

ステップ（ｉｉｉ）：このステップにおいて、架橋剤（Ｉ）のリガンド−反応性基Ｌ、好ましくは活性化官能基、より好ましくはＮ−ヒドロキシスクシンイミド基は、リガンド適合性条件下で、ヒドラゾン官能基を失うことなく第１級アミンを介してリガンドと効率的にカップリングし、リガンド−架橋剤複合体（Ｖ）を得る。
図１は、共有結合リガンド（灰色の円）を含む化合物（ＶＩ）によりこのステップを概説している。
別個の対照反応において、等モル量の架橋剤（Ｉ）を対照タンパク質にカップリングするか、もしくは活性化官能基、例えばＮＨＳエステルの加水分解のための純粋な緩衝液中でインキュベートするか、またはリガンド反応性基、すなわちアミン反応性基を別の定義された化合物でクエンチする。
図１は、左の列に共有結合したリガンド（灰色の円）または右の列にクエンチされた残基（黒いスラッシュ）を含む化合物（ＶＩ）によりこのステップを概説している。

ステップ（ｉｖ）（ａ）：このステップにおいて、リガンド−架橋剤複合体（Ｖ）を、酸化された標的糖タンパク質受容体（ＩＶ）を含む細胞、組織または溶液のいずれかを含む試料と組み合わせ、リガンド−架橋剤複合体のヒドラゾン基が（ＩＶ）の酸化炭水化物基と反応可能にする。

リガンド−架橋剤複合体が酸化標的糖タンパク質受容体と相互作用する場合、架橋剤（Ｉ）のヒドラゾン基はこれらの酸化された部位と反応し、共有結合を形成する（図１、２：塗りつぶされた菱形と比較されたい）。糖タンパク質上の炭水化物構造の酸化は、通常、（図１に示すように）いくつかの潜在的な酸化された付着部位を生成するが、リガンド架橋試薬−複合体のヒドラゾン基によって捕捉された糖タンパク質は依然として同じままである。

ランダムな糖タンパク質は、確率論的事象によって捕捉される。理論に拘束されるものではないが、受容体上のリガンド結合部位に近接するアルデヒド基は、直接的なリガンド−標的糖タンパク質受容体相互作用によって引き起こされる局所濃縮のためにより効率的に捕捉されると考えられる。三官能性架橋試薬当たりのこの二重標識事象は、二重に結合した標的−リガンド−試薬複合体（ＶＩ）を生じる。この複合体の形成は、本明細書に記載された全方法にとって重要である。

同様に、対照プローブ（例えば、クエンチさせた架橋剤、または非特異的分子とコンジュゲートした架橋剤、または異なる受容体特異性を有するリガンド分子と結合した架橋剤）を、確率論的標識事象のみをもたらす等数の細胞に添加する。有利には、以下の全てのステップについて、対照プローブを並行して処理することができる。

典型的な反応条件としては、ｐＨ６．５〜７．４、例えば６．５；温度は０℃〜１０℃、例えば４℃；１０〜２４０分、例えば９０分が挙げられる。このような条件下では、保護されたヒドラゾン基（Ｒ’Ｒ’’Ｃ＝Ｎ−ＮＨ−）はその遊離形態に変換され、糖タンパク質標的受容体（および他の糖タンパク質受容体）の酸化炭水化物に共有結合する。

ステップ（ｉｖ）（ｂ）：任意選択であるこのステップにおいて、リガンド−架橋剤複合体（Ｖ）と、酸化標的糖タンパク質受容体（ＩＶ）を含む細胞、組織または溶液のいずれかを含む試料との組み合わせに、触媒（ＸＸ）を添加する。これにより、リガンド−架橋剤複合体のヒドラゾン基が生理学的ｐＨにおいて（ＩＶ）の酸化された炭水化物基と反応することが可能になる。

適切な触媒（ＸＸ）は以下に特定される。

有利には、リガンドと糖タンパク質標的受容体との間の生理学的反応を可能にする緩衝液の群から適切な緩衝液、すなわちリン酸緩衝化生理食塩水が提供される。有利には、触媒の量は５ｍＭの範囲である。有利には、ｐＨは６．５〜７．４であり、これは生理的条件に似ている。

生理的ｐＨ下で本発明の方法を実施することが大きな利点と考えられる。触媒（ＸＸ）の詳細は、以下の第４の態様に提供される。

ステップ（ｖ）：このステップにおいて、二重に結合した標的−リガンド−試薬複合体（ＶＩ）およびランダムな糖タンパク質−試薬複合体（ＶＩ_Ｒ）が、細胞および膜の溶解により試料から放出される。ステップ（ｉｖ）の試料の溶解は、膜に包埋された細胞表面タンパク質および複合体（ＶＩ）を利用可能にしてマトリックス（ＶＩＩ）と反応させ、マトリックス結合複合体（ＶＩＩＩ）を得る。

リガンドと標的糖タンパク質受容体との間の特異的相互作用を同定する方法であって、標的糖タンパク質受容体が細胞表面受容体などの細胞表面糖タンパク質である場合、細胞を含む試料は最初に溶解ステップに供され、二重タンパク質結合複合体を含む処理済み細胞試料を提供する。

次いで、二重に結合した標的リガンド−試薬複合体を、その第３の官能基である親和性基を用いてアフィニティー精製する。アジドが親和性基として使用される場合、二重に結合した標的−リガンド−試薬複合体は、アルキン含有マトリックス、すなわちアルキンアガロースまたはアルキン磁気ビーズとの銅触媒による環化付加反応においてアルキンビーズを用いてアフィニティー精製される。これにより、マトリックスに共有結合した三重に結合した標的−リガンド−試薬複合体が得られる。例えば、銅触媒による環化付加反応においてアルキンアガロースビーズが適切である。典型的な反応条件は公知であり、１ｍＭ ＣｕＳＯ４、６．２５ｍＭ ＴＨＰＴＡおよび２ｍＭアスコルビン酸ナトリウムで６〜２４時間、例えば１８時間、１０〜３０℃、例えば室温においてである。

ステップ（ｖｉ）：このステップにおいて、標的リガンド−試薬複合体（ＶＩ）を親和性マトリックスに共有結合させ、試料から精製する。

主に細胞内の空間からの溶解試料由来の他のタンパク質は、タンパク質適合生緩衝液を用いて洗い流される。適切な緩衝液は、糖タンパク質の一次アミノ酸配列を改変しない。このような緩衝液は公知であり、１％ドデシル硫酸ナトリウム、８Ｍ尿素、２０％アセトニトリル、５Ｍ塩化ナトリウム、８０％イソプロパノール、１００ｍＭ重炭酸ナトリウム、ｐＨ１１の組み合わせを含む。

ステップ（ｖｉｉ）ａ：このステップにおいて、試料を処理し、タグ化糖タンパク質によってマトリックスに共有結合していないグリコシル化タンパク質のペプチドを放出する、酵素的または化学的消化に供する。

本方法の一実施形態において、プロテアーゼは、例えばトリプシン、キモトリプシン、エンドプロテイナーゼＡｓｐＮ、エンドプロテイナーゼＬｙｓ Ｃなどの薬剤、これらの組み合わせ、好ましくはトリプシンに暴露することによって使用される。トリプシンはタンパク質をＣ末端のアルギニンまたはリシンまで切断するが、プロリンの前に切断しないか、または低頻度で切断する。

ステップ（ｖｉｉ）ｂ：このステップにおいて、ステップ（ｖｉ）ａにおいてマトリックスに共有結合したままであるＮ−糖ペプチドを洗浄して、ステップ（ｖｉｉ）ａ由来の残留プロテアーゼを除去する。

ステップ（ｖｉｉ）ａのプロテアーゼが適切に除去されない場合、エンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼによる後続の消化ステップは後者のタンパク質分解によって妨げられることがある。

ステップ（ｖｉｉｉ）：このステップにおいて、このようにして得られた放出ペプチド（ＩＸ）を分析する。この分野で利用可能なこのような化合物を分析するための任意の方法を使用することができ、好ましい方法は質量分析法である。質量分析法の方法は、当業者に周知である（例えば、Ｙａｔｅｓ、Ｊ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔ．３３：１−１９（１９９８）；ＫｉｎｔｅｒおよびＳｈｅｒｍａｎ、タンデム質量分析法を用いたタンパク質配列決定および同定（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｔａｎｄｅｍ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０００）；ＡｅｂｅｒｓｏｌｄおよびＧｏｏｄｌｅｔｔ、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０１：２６９−２９５（２００１）を参照）。高分解能ポリペプチド断片分離のために、分離法としてキャピラリー逆相クロマトグラフィーを使用する液体クロマトグラフィーＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳまたは自動ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用することができる（Ｙａｔｅｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１２：５５３−５６９（１９９９））。好ましくは、動的除外を伴うデータ依存性衝突誘起解離（ＣＩＤ）または高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）が、選択される質量分析法として使用される（Ｇｏｏｄｌｅｔｔら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７２：１１１２−１１１８（２０００）））。このような分析のために、質量分析計は、典型的には、所定の閾値を超えるイオン信号が、ペプチドの衝突誘起解離（ＣＩＤ）スペクトルまたは高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）スペクトルを生成するためにＭＳからＭＳ／ＭＳモードに切り替えるように装置を自動的に始動させる、データ依存モードで操作される。

有利には、標準アルゴリズム（ＳＥＱＵＥＳＴ、Ｍａｓｃｏｔ、Ｘ！ｔａｎｄｅｍ、ＯＭＳＳＡなど）を使用して、全てのＭＳ／ＭＳスペクトルを標準タンパク質データベースに対して検索し、偽陽性タンパク質識別率を１％未満に制限するために典型的なフィルタリングを行う。

さらに、全ての推定糖タンパク質を、細胞表面アノテーションについてフィルタリングする。

有利には、ステップ（ｖｉｉｉ）は、ステップ（ｖｉｉ）（ａ）で得られた放出ペプチドを定量的質量分析法により分析し、それによってリガンド（ＩＩ）と標的（ＩＩＩ）との間の相互作用を同定するステップを含む。

有利には、リガンド試料中の糖タンパク質の濃度を対照試料と定量的に比較することができる。

これは、標的糖タンパク質受容体の特異的濃縮を検出可能にする。この無標識質量分析のために、質量分析の直前の逆相クロマトグラフィーを、質量／電荷比に対して保持時間の特徴をプロットしたＭＳ特徴マップとして表示することができる。質量分析計によって検出されるように、このようなマップ中のペプチドは、所定の時間にわたって明確な同位体パターンで現れ、試料中の存在量に応じて規定されたイオン電流強度で現れる。ペプチドが断片化およびＭＳ／ＭＳ分析によって同定されると、この情報をＭＳマップの特定のペプチドの特徴に割り当てることができ、Ｓｕｐｅｒｈｉｒｎ（Ｍｕｅｌｌｅｒら、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ（２００７）ｖｏｌ．７（１９）ｐｐ．３４７０−３４８０頁）またはＰｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ＬＣ−ＭＳ（Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）のようなオープンソースまたは商用アルゴリズムを用いた半定量的データと組み合わせることができる。次いで、ペプチド存在量の比率を得るために、異なる試料のＭＳ特徴マップ（例えば、試料対対照）を重ね合わせて比較することができる。糖タンパク質由来の確率論的に標識されたペプチドについては、これらの比は約１のはずであり、リガンドに基づいて特異的に捕捉される糖タンパク質受容体ペプチドは、リガンド試料対対照においてより高い値を得る。タンパク質が２以上のペプチドで同定される場合、豊富な情報を組み合わせることができる。

他の実施形態において、代わりの質量分析に基づく定量方法、例えば
・単一反応モニタリング（ＳＲＭ）、
・細胞培養物におけるアミノ酸による安定同位体標識（ＳＩＬＡＣ；例えば、Ｎｉｌｓｓｏｎら、ハイスループットプロテオミクスにおける質量分析：一流への準備。（Ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｉｎ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：ｒｅａｄｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｂｉｇ ｔｉｍｅ．）Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１０）ｖｏｌ．７（９）ｐｐ．６８１−５頁を参照されたい）、
・質量スペクトルのデータ非依存的取得（ＳＷＡＴＨ ＭＳ；例えば、Ｇｉｌｌｅｔら、データ非依存性捕捉によって生成されたＭＳ／ＭＳスペクトルの標的データ抽出：一貫した正確なプロテオーム分析のための新しい概念（Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄａｔａ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＭＳ／ＭＳ Ｓｐｅｃｔｒａ Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ Ｄａｔａ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ：Ａ Ｎｅｗ Ｃｏｎｃｅｐｔ ｆｏｒ Ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ ａｎｄ Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ）を参照されたい）、
・タンデム質量タグ（ＴＭＴ；例えば、Ｄａｙｏｎら、６−プレックスアイソバリックタグを用いたＭＳ／ＭＳによるヒト脳脊髄液中のタンパク質の相対定量（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ Ｆｌｕｉｄｓ ｂｙ ＭＳ／ＭＳ ｕｓｉｎｇ ６−Ｐｌｅｘ Ｉｓｏｂａｒｉｃ Ｔａｇｓ）を参照されたい）、
を使用することができる。

ステップ（ｉｘ）：これにおいて、ステップ（ｖｉ）ｂにおいてマトリックスに結合したままのＮ−糖ペプチドは、炭水化物構造を切断することによってビーズから特異的に放出される。

この方法の一実施形態において、グリカナーゼが、例えばＰＮＧａｓｅ Ｆ、ＰＮＧａｓｅ Ａなどの薬剤への暴露によって使用され、好ましくはＰＮＧａｓｅＦが使用される。ＰＮＧａｓｅＦ処理は、オリゴ糖構造の最も内側の成分と、ペプチドのＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔグリコシル化モチーフ（それぞれ、Ｎはアスパラギンを表し、Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸を表し、Ｓ／Ｔはセリンまたはスレオニンを表す）中の糖ペプチドのアスパラギンとの間を切断し、それによってペプチドの放出（およびそれに付随してアスパラギンの脱アミド化）をもたらす。
本明細書ではＮ結合型グリコシル化部位を用いて例示されているが、本発明の方法が、Ｏ結合型グリコシル化部位などの他のタイプの確実に同定されたグリコシル化部位、またはおそらく他のタイプの翻訳後修飾（例えば、グリコシルホスファチジルイノシトールとペプチドのＣ末端の結合）、または糖脂質などのタンパク質以外のグリコシル化有機化合物を使用できることは理解されよう。

したがって、上記の方法のステップ（ｖ）は、好ましくは、ステップ（ｉｖ）で得られた精製二重ペプチド−結合複合体をグリコシダーゼ処理、好ましくは、異なるエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼによる処理に供して、捕捉されたペプチドをそこから分離し、放出ペプチドを得るステップを含む。または、切断可能なリンカー、例えば、それぞれ還元剤または過ヨウ素酸塩で切断可能な、ジスルフィド結合またはシス−ジオール含有リンカーを使用することができる。

ステップ（ｘ）：このステップにおいて、このようにして得られた放出ペプチド（ＸＩ）を分析する。この分野で利用可能なこのような化合物を分析するための任意の方法を使用することができ、好ましい方法は質量分析法である。質量分析法の方法は、当業者に周知である（例えば、Ｙａｔｅｓ、Ｊ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔ．３３：１−１９（１９９８）；ＫｉｎｔｅｒおよびＳｈｅｒｍａｎ、タンデム質量分析法を用いたタンパク質配列決定および同定（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｔａｎｄｅｍ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０００）；Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ およびＧｏｏｄｌｅｔｔ、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０１：２６９−２９５（２００１）を参照）。高分解能ポリペプチド断片分離のために、分離法としてキャピラリー逆相クロマトグラフィーを使用する液体クロマトグラフィーＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳまたは自動ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用することができる（Ｙａｔｅｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１２：５５３〜５６９頁（１９９９））。好ましくは、動的除外を伴うデータ依存性衝突誘起解離（ＣＩＤ）または高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）が、選択される質量分析法として使用される（Ｇｏｏｄｌｅｔｔら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７２：１１１２−１１１８（２０００）））。このような分析のために、質量分析計は、典型的には、所定の閾値を超えるイオン信号が、ペプチドの衝突誘起解離（ＣＩＤ）スペクトルまたは高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）スペクトルを生成するためにＭＳからＭＳ／ＭＳモードに切り替えるように装置を自動的に始動させる、データ依存モードで操作される。

有利には、標準アルゴリズム（例えば、ＳＥＱＵＥＳＴ、Ｍａｓｃｏｔ、Ｘ！ｔａｎｄｅｍ、ＯＭＳＳＡ）を使用して、全てのＭＳ／ＭＳスペクトルを標準タンパク質データベースに対して検索し、偽陽性タンパク質識別率を１％未満に制限するために典型的なフィルタリングを行う。さらに、全てのペプチドを、先のグリコシル化ペプチドのＮ１１５−Ｘ−Ｓ／Ｔモチーフについてフィルタリングする。

有利には、ステップ（ｘ）は、ステップ（ｉｘ）で得られた放出ペプチドを定量的質量分析法（ステップ（ｖｉｉｉ）について上記で述べた方法など）により分析し、それによってリガンド（ＩＩ）と標的（ＩＩＩ）との間の相互作用を同定するステップを含む。

有利には、リガンド試料中の糖タンパク質の濃度を対照試料と定量的に比較することができ、詳細は、上記のステップ（ｖｉｉｉ）に提供されている。

他の実施形態において、上記のステップ（ｖｉｉｉ）で論じたように、代わりの質量分析に基づく定量方法を使用することができる。

対照反応：対照反応の実施は、当業者の知識の範囲内である。このような対照反応は、加水分解反応（リガンドを添加しない場合）またはクエンチ反応（既知の受容体選択性を有するリガンドを添加する場合）のいずれかであり得る。原則として、このような反応は、以下の逸脱を含む、図１および図３の右側にも概略的に例示された（クエンチされた残基を黒色のスラッシュとして例示）本明細書に記載のワークフロー、ステップ（ｉ）〜（ｘ）に準じて実行される。

ＬＲＣ実験では、対照試料は、典型的には、試料中の糖タンパク質の存在量を対照と比較できるように、並行して生成される。この試料を用いて、所与の細胞株、組織上または生体液中のランダムな細胞表面糖タンパク質に対する架橋剤（Ｉ）の確率的結合を推定することができる。この目的のために、架橋剤（Ｉ）を
・活性化された官能基Ｌを加水分解する（例えば、ＮＨＳエステルを加水分解する）ための純粋な緩衝液中でインキュベートするか、または
・リガンド反応性基Ｌ（例えば、ＮＨＳエステルがリガンドの第１級アミンと反応して安定なアミド結合を生じる）を、公知の結合選択性を有するリガンドでクエンチするか、
のいずれかを行う。
架橋剤（Ｉ）のリガンド反応性基が第１級アミン、例えばグリシンを含有する化合物を用いて加水分解またはクエンチされる場合、所与の細胞株、組織上または生体液中のランダムな細胞表面糖タンパク質の相対存在量を用いて、架橋剤（Ｉ）のバックグラウンド結合を推定することが可能である。架橋剤（Ｉ）のリガンド反応性基が公知の糖タンパク質標的受容体を有するリガンドに結合する場合、糖タンパク質標的受容体の同定は実験の品質管理として役立ち得る。
クエンチは、化合物（ＩＩ）が存在しない図１および３の右側に例示されており、化合物（Ｉ）に結合しているクエンチ分子は黒いスラッシュとして示されている。

リガンド中の所与の糖タンパク質の量と対照試料との比を比較すると、確率的にタグ付けされた糖タンパク質は約１の比を有する。比が１よりも大きい糖タンパク質標的受容体ペプチドは、リガンド依存的様式で特異的に捕捉される。

反応と対照反応とを比較することで、図１および図３に視覚化されるように、信号Δを同定することができる。

第４の態様において、本発明は、特に本明細書に記載の方法（第３の態様）における、生化学反応における触媒としての特異的有機化合物の使用に関する。本発明のこの態様を以下にさらに詳細に説明する。

本発明のこの態様の文脈における有機化合物は、式（ＸＸ）

（式中、ｎは１または２を表し、ｍは０、１または２を表し、Ｒ^４はＮＨ_２を表し、Ｒ^５はＣ（１−６）アルキルまたはＣ（１−６）アルコキシを表す）
に従う。

有利には、Ｒ^４はオルト位にあり、ｎ＝１である。

有利には、Ｒ^５はメトキシを表し、ｍ＝１を表す。

生化学反応という用語は公知であり、具体的には、細胞表面タンパク質上の炭水化物構造などの生体分子が化学的に変換され、特に酸化される反応を指す。

好ましい実施形態において、生化学反応という用語は、生細胞上の生化学的反応を指す。

好ましい実施形態において、生化学反応という用語は、本発明の第３の態様に記載のステップ（ｉｖ）を指す。驚くべきことに、式（ＸＸ）の水溶性有機化合物をステップ（ｉｖ）ｂに含めることによって、三官能性架橋試薬のヒドラゾン基と、細胞表面タンパク質上の炭水化物構造の酸化により生成されたアルデヒドとの間のヒドラゾン形成は、ｐＨ７．４で飽和まで起こった。

第５の態様において、本発明は、本明細書に記載の三官能性架橋試薬（第１の態様）および場合により本明細書に記載の有機化合物（第４の態様）を含むキットに関する。

本発明を、以下の非限定的な例によってさらに例示する：
概要

特に他のことを注記しない限り、全ての反応は周囲雰囲気下で実施し、全ての試薬は市販の供給業者から購入し、さらに精製することなく使用した。Ｍｅｒｃｋシリカゲル６０Ｆ２５４ ＴＬＣガラスプレート上で分析薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を行い、２５４ｎｍの光およびｐ−アニスアルデヒド染色溶液、その後の加熱によって視覚化した。反応生成物の精製は、Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇシリカ３２−６３、６０Ａを使用する、０．３〜０．５バールの圧力下のフラッシュクロマトグラフィーによって、Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓシリカゲル、Ｃ１８−ＲＰ、２３％Ｃ、４０〜６３μｍを使用する逆相クロマトグラフィーによって、またはＡｌｄｒｉｃｈ Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０を用いたサイズ排除クロマトグラフィーによって実施した。
公開された手順に従ってモノ保護ジアミン７、^［１］６−（２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ヒドラジニル）ニコチン酸^［２］およびγ−アジド酪酸^［３］を調製した。
^１Ｈ ＮＭＲスペクトルをＢｒｕｋｅｒ ＡＶ ６００ＭＨｚ分光計で記録し、内部標準（２．５０ｐｐｍのＤＭＳＯ）として用いた溶媒共鳴を用いてｐｐｍで報告する。ピークは（ｓ＝シングレット、ｄ＝ダブレット、ｔ＝トリプレット、ｑ＝カルテット、ｍ＝多重項または未解明、ｂｒ＝ブロードシグナル、カップリング定数（Ｈｚ）、積分）として報告する。^１３Ｃ ＮＭＲスペクトルを、Ｂｒｕｋｅｒ ＡＶ １５１ＭＨｚ分光計で^１Ｈデカップリングを行って記録し、内部標準（ＤＭＳＯ−ｄ_６、３９．５２ｐｐｍ）として用いた溶媒共鳴を用いてｐｐｍで報告する。
赤外線スペクトルは、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＵＡＴＲ Ｔｗｏ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒで適切に測定した。ピークは吸収極大（ｎ、ｃｍ^−１）として報告する。
高分解能質量スペクトルデータは、Ｖａｒｉａｎ ＩｏｎＳｐｅｃ分光計（ＥＳＩ）で得て、（ｍ／ｚ）として報告する。
旋光度は、Ｊａｓｃｏ Ｐ−２０００ Ｐｏｌａｒｉｍｅｔｅｒ、１０ｃｍ、１．０ｍＬセルを用いて測定した。

［１］Ｗ．Ｌｉｕ、Ｆ．Ｌｉ、Ｘ．Ｃｈｅｎ、Ｊ．Ｈｏｕ、Ｌ．Ｙｉ、Ｙ．−Ｗ．Ｗｕ Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１４、１３６、４４６８−４４７１。
［２］Ｂ．Ｔｅｎｇ、Ｙ．Ｂａｉ、Ｙ．Ｃｈａｎｇ、Ｙ．Ｃｈｅｎ、Ｚ．Ｌｉ Ｂｉｏｏｒｇ．＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２００７、１７、３４４０−３４４４。
［３］Ｔ．−Ｂ−Ｙｕ、Ｊ．−Ｚ．Ｂａｉ、Ｚ．Ｇｕａｎ Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００９，４８，１０９７−１１０１。

例１：架橋剤「ＨＡＴＲＩＣ」の合成
１．６−（６−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ヘキサンアミド）ヘキサン酸（３）の合成

ＤＭＦ（１５０ｍＬ）中２（６．５９ｇ、５０．２ｍｍｏｌ、１．１当量）の溶液を、トリエチルアミン（５．０８ｇ、５０．２ｍｍｏｌ、１．１当量）および１（１５．０ｇ、４５．７ｍｍｏｌ、１．０当量）で処理した。室温で３時間後、反応混合物を水（２５０ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（３×２５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相を５％ＬｉＣｌ水溶液（３×２５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ_４で脱水し、濾過し、蒸発させて白色固体を得た。生成物を酢酸エチル／ヘキサン（１：１，３５０ｍｌ）からの再結晶により精製し、白色結晶として３（１７．５ｇ、９０％）を得た。

２．ｔｅｒｔ−ブチル６−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ）ヘキサノアート（５）の合成

ＤＭＦ（１００ｍＬ）中４（１５．０ｇ、５６．５ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液を、ＤＭＡＰ（２．７６ｇ、２２．６ｍｍｏｌ、０．４当量）、ｔｅｒｔ−ブタノール（１２．６ｇ、１７０ｍｍｏｌ、３．０当量）、ＥＤＣ ＨＣｌ（１５．２ｇ、７９．０ｍｍｏｌ、１．４当量）およびヒューニッヒ塩基（２３．７ｍＬ、１３６ｍｍｏｌ、２．４当量）で処理した。ＲＴで１４時間後、反応混合物をＤＣＭ（３００ｍＬ）で希釈し、１０％クエン酸水溶液（３×２５０ｍＬ）で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ_４で脱水し、濾過し、減圧下で濃縮した。生成物をカラムクロマトグラフィー（２００ｇのＳｉＯ_２、酢酸エチル／ヘキサン ５：９５、次いで酢酸エチル／ヘキサン ２５：７５）により精製して、５（１４．６ｇ、８１％）を無色油状物として得た。

３．４−（（６−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−６−オキソヘキシル）アミノ）−４−オキソブタン酸（６）の合成

ＴＨＦ／水（５：１、１００ｍＬ）中５（１４．０ｇ、４３．６ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液を、酢酸（２．６４ｇ、４４．０ｍｍｏｌ、１．０当量）および１０重量％のＰｄ／Ｃ（１．８５ｇ、１．７４ｍｍｏｌ、４ｍｏｌ％）で処理した。混合物を室温においてＨ_２雰囲気下で１６時間撹拌した。次いで、反応混合物を遠心分離し、上清をセライトで濾過し、減圧下で濃縮し、得られた油状物を真空中で乾燥させた。この油状物をＤＣＭ（１５０ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（１５．２ｍＬ、１０９ｍｍｏｌ、２．５当量）および無水コハク酸（４．７９ｇ、４７．９ｍｍｏｌ、１．１当量）で処理した。反応混合物を室温において３時間撹拌し、次いでＤＣＭ（３５０ｍＬ）で希釈し、１０％クエン酸水溶液（３×２５０ｍＬ）で洗浄した。生成物をフラッシュクロマトグラフィー（１５０ｇのＳｉＯ_２；ＤＣＭ、次いでＤＣＭ／ＭｅＯＨ ９０：１０）により精製して、６（１１．７ｇ、９４％）を白色固体として得た。

４．アリルｔｅｒｔ−ブチル（（（オキシビス（エタン−２，１−ジイル）ビス（オキシ）ビス（プロパン−３，１−ジイル））ジカルバマート（８）の合成

ＤＣＭ（４００ｍＬ）中７（１０．８ｇ、３０．３ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液を、トリエチルアミン（５．２９ｍＬ、３７．９ｍｍｏｌ、１．３当量）、続いてアリルクロロホルマート（３．５６ｍＬ、３３．４ｍｍｏｌ、１．１当量）で４℃において処理した。１５分後、反応物を室温に温め、２時間撹拌した。次いで、反応混合物を水（３×２５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ_４で脱水し、濾過し、減圧下で濃縮した。生成物をフラッシュクロマトグラフィー（２００ｇのＳｉＯ_２、酢酸エチル／ヘキサン １：１、次いで酢酸エチル）により精製して、８（１１．０ｇ、９０％）を無色油状物として得た。

５．（Ｓ）−（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチルアリルｔｅｒｔ−ブチル（１５−オキソ−４，７，１０−トリオキサ−１４−アザイコサン−１，１６，２０−トリイル）トリカルバマート（１０）の合成

ＤＣＭ（１０ｍＬ）中８（２．８３ｇ、７．００ｍｍｏｌ、１．２当量）の溶液を、ＴＦＡ（９ｍＬ）で処理し、室温において３０分間撹拌した。次いで、トルエン（２０ｍＬ）を加え、混合物を蒸発させた。トルエン（３×３０ｍＬ）で共蒸発させると褐色の油状物が得られ、これを真空中で乾燥させた。残留物をＤＭＦ（２０ｍＬ）に溶解し、９（２．８５ｇ、６．０９ｍｍｏｌ、１．０当量）を加え、続いてヒューニッヒ塩基（３．４０ｍＬ、２４．４ｍｍｏｌ、４．０当量）およびＨＡＴＵ（２．５５ｇ、６．７０ｍｍｏｌ、１．１当量）を加えた。反応混合物を室温において３０分間撹拌し、次いで酢酸エチル（１００ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＣｌ水溶液（３×１００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で脱水し、濾過し、減圧下で濃縮した。生成物をフラッシュクロマトグラフィー（１００ｇのＳｉＯ_２；ＤＣＭ、次いでＤＣＭ／ＭｅＯＨ ９６：４）により精製して、１０（４．５３ｇ、９９％）を無色の油状物として得て、放置すると固化した。

６．（Ｓ）−（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチルアリルｔｅｒｔ−ブチル（１５，２２，２９−トリオキソ−４，７，１０−トリオキサ−１４，２１，２８−トリアザテトラトリアコンタン−１，１６，３４−トリイル）トリカルバマート（１１）の合成

ＤＣＭ（２５ｍＬ）中１０（６．００ｇ、７．９５ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液をＴＦＡ（１５ｍＬ）で処理し、室温において１時間撹拌した。次に、トルエン（３０ｍＬ）を加え、混合物を蒸発させた。トルエン（３×３０ｍＬ）で共蒸発させて油状物を得、これを真空中で乾燥させた。残留物をＤＭＦ（２０ｍＬ）に溶解し、３（３．０１ｇ、８．７４ｍｍｏｌ、１．１当量）を加え、続いてヒューニッヒ塩基（６．２５ｍＬ、３５．８ｍｍｏｌ、４．５当量）およびＨＡＴＵ（３．３２ｇ、８．７４ｍｍｏｌ、１．１当量）を加えた。反応混合物を室温において３０分間撹拌し、次いで酢酸エチル（１５０ｍＬ）で希釈し、水（３×１００ｍＬ）、５％ＬｉＣｌ水溶液（１５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ_４で脱水し、濾過し、減圧かで濃縮した。生成物をフラッシュクロマトグラフィー（１００ｇのＳｉＯ_２；ＤＣＭ、次いでＤＣＭ／ＭｅＯＨ ９０：１０）により精製して、１１（５．９０ｇ、７６％）を無色油状物として得た。

７．（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−（５−（（２２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−５，２１，２８，３５−テトラオキソ−４，１０，１３，１６−テトラオキサ−６，２０，２７，３４−テトラアザテトラコント−１−エン−４０−イル）カルバモイル）ピリジン−２−イル）ヒドラジンカルボキシラート（１２）の合成

ＤＣＭ（１２ｍＬ）中１１（５．８５ｇ、５．９６ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液をＴＦＡ（９ｍＬ）で処理し、室温において１時間撹拌した。次に、トルエン（３０ｍＬ）を加え、混合物を蒸発させた。トルエン（３×３０ｍＬ）で共蒸発させて油状物を得、これを真空中で乾燥させた。残留物をＤＭＦ（２５ｍＬ）に溶解し、６−（２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ヒドラジニル）ニコチン酸（１．７９ｇ、７．０６ｍｍｏｌ、１．２当量）、ヒューニッヒ塩基（４．６９ｍＬ、２６．８ｍｍｏｌ、４．５当量）およびＨＡＴＵ（２．４９ｇ、６．５６ｍｍｏｌ、１．１当量）で処理した。室温において３０分後、反応混合物をＤＣＭ（１５０ｍＬ）で希釈し、水（３×１００ｍＬ）で洗浄した。
生成物をフラッシュクロマトグラフィー（１００ｇのＳｉＯ_２；ＤＣＭ、次いでＤＣＭ／ＭｅＯＨ ９０：１０）により精製して、１２（５．０１ｇ、７５％）を無色泡状固体として得た。

８．（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル２２−（４−（６−（６−（６−（２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ヒドラジニル）ニコチンアミド）ヘキサンアミド）ヘキサンアミド）ブチル）−５，２１，２４，２７−テトラオキソ−４，１０，１３，１６−テトラオキサ−６，２０，２３，２８−テトラアザテトララトリアコント−１−エン−３４−オアート（１３）の合成

ＤＭＦ（１５ｍＬ）中１２（４．９９ｇ、４．４７ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液をピペリジン（２ｍＬ）で処理し、室温において１時間撹拌した。次にトルエン（１５ｍＬ）を加え、混合物を蒸発させた。トルエン（３×１５ｍｌ）で共蒸発させて油状物を得、これを真空中で乾燥させた。残留物をＤＭＦ（１５ｍＬ）に溶解し、６（１．５４ｇ、５．３６ｍｍｏｌ、１．２当量）、トリエチルアミン（２．６５ｍＬ、１９．０ｍｍｏｌ、４．３ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（１．８７ｇ、４．９２ｍｍｏｌ、１．１当量）で処理した。室温において３０分後、反応混合物を酢酸エチル（３００ｍＬ）で希釈し、水（３×３００ｍＬ）および５％ＬｉＣｌ水溶液（１×３００ｍＬ）で洗浄した。生成物をフラッシュクロマトグラフィー（７５ｇのＳｉＯ_２；ＤＣＭ、次いでＤＣＭ／ＭｅＯＨ １５：１、次いでＤＣＭ／ＭｅＯＨ ９：１）により精製して１３（４．６９ｇ、９０％）を無色泡状固体として得た。

９．（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル１−アジド−２１−（４−（６−（６−（６−（２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ヒドラジニル）ニコチンアミド）ヘキサンアミド）ヘキサンアミド）ブチル）−４，２０，２３，２６−テトラオキソ−９，１２，１５−トリオキサ−５，１９，２２，２７−テトラアザトリアンコンタン−３３−オアート（１４）の合成

ＭｅＯＨ（４ｍＬ）中１３（１．４１ｇ、１．１７ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液を、ジエチルアミン（０．５４ｍＬ、５．２７ｍｍｏｌ、４．５当量）、続いてＤＣＭ（８ｍＬ）中Ｐｄ（ＰＰｈ_３）_４（６７．６ｍｇ、０．０５８５ｍｍｏｌ、５ｍｏｌ％）およびＰＰｈ_３（３３．８ｍｇ、０．１２９ｍｍｏｌ、１０ｍｏｌ％）の溶液で処理した。室温において３０分後、反応混合物を蒸発させた。トルエン（３×１５ｍＬ）で共蒸発させて油状物を得、これを真空中で乾燥させた。残留物をＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解し、γ−アジド酪酸（０．２０１ｇ、１．５５ｍｍｏｌ、１．３当量）、トリエチルアミン（０２５ｍＬ、１．７６ｍｍｏｌ、１．５当量）およびＨＡＴＵ（０．４８９ｇ、１．２９ｍｍｏｌ、１．１当量）で処理した。室温において１時間後、反応混合物をトルエン（３０ｍＬ）で希釈し、蒸発させた。トルエン（３×３０ｍｌ）で共蒸発させて、暗色の油状物を得た。生成物をフラッシュクロマトグラフィー（１５ｇのＳｉＯ_２；ＤＣＭ、次いでＤＣＭ／ＭｅＯＨ ９０：１０、次いでＤＣＭ／ＭｅＯＨ ８０：２０）により精製した。生成物を含有する画分を逆相Ｃ−１８クロマトグラフィー（水／アセトニトリル ７５：２５、次いで７０：３０、６５：３５、６０：４０、５５：４５、５０：５０）によりさらに精製して、１４（０．９４ｇ、６２％）を得た。

１０．（Ｓ）−１−アジド−４，２０，２３，２６−テトラオキソ−２１−（４−（６−（６−（６−（２−（プロパン−２−イリデン）ヒドラジニル）ニコチンアミド）ヘキサンアミド）ヘキサンアミド）ブチル）−９，１２，１５−トリオキサ−５，１９，２２，２７−テトラアザ−トリトリアコンタン−３３−オイック酸（１５）の合成

６ＭのＨＣｌ水溶液（１０ｍＬ）を１４（０．８５ｇ、０．７１ｍｍｏｌ）に加え、この溶液を室温において撹拌した。２０分後、透明溶液を氷浴で冷却し、２ＭのＮａＯＨ水溶液（３１ｍＬ、予めＨＣｌ溶液に対して滴定）を加え、中和した溶液を凍結乾燥した。残留物をＭｅＯＨ／アセトン １：１（５０ｍｌ）に懸濁し、揮発性物質を４０℃において減圧下で蒸発させた。この手順をさらに２回繰り返した。次いで、懸濁液を濾過し、固体をＭｅＯＨ／アセトン １：１（１００ｍｌ）で洗浄し、濾液を蒸発させた。生成物を逆相Ｃ−１８クロマトグラフィー（水／アセトン／トリエチルアミン ９０：１０：１、次に水／アセトン／アセトニトリル ８５：１０：５）により精製して、１５（０．３９ｇ、５１％）を明るい灰色の泡状固体として得た。

１１．ＨＡＴＲＩＣ（１６）の合成

ＤＭＦ（１５ｍＬ）中１５（３００ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）の懸濁液を、ヒューニッヒ塩基（１００μＬ、０．５６ｍｍｏｌ、２．０当量）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（６５ｍｇ、０．５６ｍｍｏｌ、２．０当量）およびＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボナート（１４３ｍｇ、０．５６ｍｍｏｌ、２．０当量）で処理し、次いで４０℃において９０分間撹拌した。次いで、反応混合物をトルエン（５０ｍｌ）で処理し、蒸発させた。トルエン（３×５０ｍｌ）で共蒸発させて油状物を得、これを真空中で乾燥させた。生成物をセファデックスＬＨ−２０（ＤＣＭ／アセトン／ＭｅＯＨ ８：１：１）を用いたサイズ排除クロマトグラフィーにより精製して、１６（２９５ｍｇ、９０％）をオレンジ色の固体として得た。
^１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ＝９．６２（ｂｒ，１Ｈ），８．５７（ｄｄ，Ｊ＝２．４，０．８Ｈｚ，１Ｈ），８．２５（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），７．９９（ｄｄ，Ｊ＝８．８，２．４Ｈｚ，１Ｈ），７．９５（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．８７−７．７７（ｍ，３Ｈ），７．７１（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），７．０４（ｄｄ，Ｊ＝８．８，０．８Ｈｚ，１Ｈ），４．１２−４．０５（ｍ，１Ｈ），３．５２−３．４９（ｍ，４Ｈ），３．４８−３．４３（ｍ，４Ｈ），３．４０−３．３５（ｍ，４Ｈ），３．３２−３．２８（ｍ，２Ｈ），３．２１（ｑ，Ｊ＝７．２，５．７Ｈｚ，２Ｈ），３．０９−３．０４（ｍ，４Ｈ），３．０３−２．９６（ｍ，６Ｈ），２．８３−２．７８（ｍ，４Ｈ），２．６５（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），２．３９−２．２６（ｍ，４Ｈ），２．１３（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），２．０６−２．００（ｍ，４Ｈ），１．９６（ｓ，３Ｈ），１．９３（ｓ，３Ｈ），１．７３（ｄｑ，Ｊ＝７．８，６．９Ｈｚ，２Ｈ），１．６６−１．５７（ｍ，７Ｈ），１．５４−１．４３（ｍ，７Ｈ），１．４３−１．２９（ｍ，６Ｈ），１．２９−１．１３（ｍ，８Ｈ）
^１３Ｃ−ＮＭＲ（１５１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ＝１７１．８１，１７１．８０，１７１．６２，１７１．６０，１７１．４，１７１．０，１７０．２，１６８．９，１６４．８，１５９．３，１４８．５，１４７．７，１３６．７，１２０．６，１０５．１，６９．８，６９．７，６９．５（２炭素），６８．１，６８．０，５２．６，５０．３，３８．９，３８．２９，３８．２５，３８．２，３５．９，３５．８，３５．４，３２．２，３１．５，３０．７３，３０．７１，３０．７，３０．１，２９．３，２９．２，２９．１，２９．０，２８．９，２８．６，２６．２０，２６．１５，２５．４３，２５．４２，２５．１４，２５．１３，２５．１，２４．５，２３．９，２３．０，１７．０
ＩＲ（ｎｅａｔ，ｖ_ｍａｘ／ｃｍ^−１）３２８７，２９３０，２８５８，２０９９，１７３８，１６３１，１６０３，１５３８，１３６４，１２５６，１２０６，１１２１，１０６８，７１２，６４４
ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ_５５Ｈ_９０Ｎ_１４ＮａＯ_１４についての計算値［Ｍ＋Ｎａ^＋］１１９３．６６５３；実測値１１９３．６６６８
［α］^２５ _Ｄ＝−４．０（ｃ＝０．２、ＭｅＯＨ）

例２：ｐＨ７．４におけるＨ３５８細気管支細胞上の（例１から得られた）ＨＡＴＲＩＣにコンジュゲートされた上皮成長因子によるリガンドベースの受容体の捕捉
試料反応において、３００μｇのＥＧＦを７０μｇの（例１から得られた）三官能性架橋剤ＨＡＴＲＩＣにカップリングさせた。対照反応において、７０ｕｇのＨＡＴＲＩＣのリガンド反応性官能基を等モル量のグリシンでクエンチした。この手順は、ステップ（ｉ）に対応する。グリシンによりクエンチされたＨＡＴＲＩＣを用いた処理のために３つの複製物を調製し、ＥＧＦによりクエンチされたＨＡＴＲＩＣを用いた処理のために３つの複製物を調製した。調製は、６つの試料のそれぞれについて、Ｈ３５８細気管支細胞株の１，５００万個の細胞を１．５ｍＭのＮａＩＯ_４で１５分間、ｐＨ６．５、４℃において酸化させ、ステップ（ｉ）および（ｉｉ）に従って細胞表面糖タンパク質の炭水化物構造上にアルデヒドを生成させることを意味する。酸化された細胞を、５ｍＭの２−アミノ−５−メトキシ安息香酸（ＸＸ）の存在下で、ＥＧＦによりコンジュゲートされた、またはグリシンによりクエンチされたＨＡＴＲＩＣと一緒に、ステップ（ｉｖ ｂ）および請求項１６に記載のようにｐＨ７．４、４℃において９０分間インキュベートした。続いて、細胞を、８Ｍの尿素、０．１％Ｒａｐｉｇｅｓｔ含有プロテアーゼ阻害剤中で、ステップ（ｖ）に従って超音波処理によって溶解させた。ＨＡＴＲＩＣタグ付け完全配列糖タンパク質を、銅触媒によるアルキン−アジド環化付加反応で（１ｍＭ ＣｕＳＯ_４、６．２５ｍＭ ＴＨＰＴＡおよび２ｍＭアスコルビン酸ナトリウム、室温において１８時間）アルキンアガロースビーズを用いて捕捉した。タンパク質の還元およびアルキル化の際に、１％ＳＤＳ、８Ｍ尿素、５Ｍ ＮａＣｌ、１００ｍＭ ＮａＨＣＯ_３、ｐＨ１１、１００ｍＭ ＮＨ_４ＨＣＯ_３および２０％アセトニトリルでアガロースマトリックスを洗浄することによって、未結合タンパク質を除去した。これは手順のステップ（ｖｉ）を要約している。最後に、細胞表面糖タンパク質のペプチドをトリプシン消化により３７℃で１６時間放出させた。脱塩後、ペプチドをＭＳ／ＭＳ分析に供した。得られた質量分析データをＭＳ１ピーク強度に基づいて相対的に定量した。これは手順のステップ（ｖｉｉ）および（ｉｘ）を概説している。簡潔には、同定されたペプチドの存在量を、各糖タンパク質受容体について、複製物全体にわたって合計し、対照反応の複製物における存在量とペアワイズ比較した。この比較を統計的有意性について試験し、ｐ値を報告した。実験全体にわたる偽発見率（ＦＤＲ）を制御するＢｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法を用いて、Ｐ値を多重比較のために調整した。糖タンパク質標的受容体候補は、０．００１以下のＦＤＲ調整ｐ値および４倍またはそれ以上のリガンド試料中の濃縮係数を有する受容体として定義される。上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）は、ＥＧＦの糖タンパク質標的受容体として右上の標的ボックスで同定された。この所見は、これまでに発表された所見に対応し、このアプローチの有用性を実証している。

例３：架橋剤「ＴＲＩＣＥＰＳ４．０」の合成
１．ＴＲＩＣＥＰＳ中間体の合成

表題化合物は、それぞれの出発物質を使用して、例１に記載の手順に準じて得られる。

２．ＴＲＩＣＥＰＳ４．０の合成

表題化合物は、例１に記載の手順に準じて、例３．１の化合物およびそれぞれの出発物質を用いて得られる。

例４：架橋剤「ＴＲＩＣＥＰＳ５．０」の合成

表題化合物は、例１に記載の手順に準じて、例３．１の化合物およびそれぞれの出発物質を用いて得られる。

Claims (10)

1. 式（Ｉ）の化合物：
   

   

   
   （式中、
   Ｘはコア構造を表し、
   Ｓ_１、Ｓ_２、Ｓ_３は互いに独立してスペーサー基を表し、
   Ｌはリガンド反応性基を表し、
   Ａは親和性基を表し、
   Ｚはアリールまたはヘテロアリールを表し、
   Ｒ’はＨまたはＣ_{（１−６）}−アルキルを表し、
   Ｒ’’はＣ_{（１−６）}−アルキル基を表す）
   の化合物において、
   Ａが、アジド−Ｎ_３およびアルキン−ＣＣＨから選択され、
   Ｘが式（Ｉ−Ｉ）
   

   

   
   （式中、点線はＷ_１、Ｗ_２、Ｗ_３のＳ_１、Ｓ_２、Ｓ_３基への結合を表し、
   ｓは１〜１２の整数を表し、
   Ｗ_１は−ＮＨ−を表し、
   Ｗ_２は−ＣＯＮＨ−又は−ＮＨＣＯ−を表し、
   Ｗ_３は−ＮＨＣＯ−又は−ＣＯＮＨ−を表す）
   の基を表し、
   Ｌは、下記式で表されるヒドロキシスクシンイミドエステルを表し、
   

   

   
   Ｓ_１はＣ_{（１−２４）}アルキレンを表し、
   Ｓ_２はＣ_{（１−２４）}アルキレンを表し、
   Ｓ_３はＣ_{（１−２４）}アルキレンを表し、
   （前記アルキレンは直鎖または分枝鎖であり、前記アルキレンは置換または非置換であり、ヘテロ原子が互いに直接結合していないことを条件として、１または複数の、隣接しない前記アルキレンの−ＣＨ_２−基が互いに独立して、１または複数の架橋基Ｙおよび／または非置換もしくは置換のシクロアルキル、非置換もしくは置換のヘテロシクロアルキル、非置換もしくは置換のアリール、非置換もしくは置換のヘテロアリールで置換されていてもよい）、
   Ｙは、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＣＨ_２（ＣＯ）−、−ＳＯ−、−ＣＨ_２（ＳＯ）−、−ＳＯ_２−、−ＣＨ_２（ＳＯ_２）−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−Ｓ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｓ−、−ＳＯＯ−、−ＯＳＯ−、−ＳＯＳ−、−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−、−ＯＣＨ_２−、−ＣＨ_２Ｏ−、−ＮＲ_１−、−ＮＲ_１−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＲ_１−、−ＮＲ_１−ＣＯ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−ＮＲ_１−、−ＮＲ_１−ＣＯ−ＮＲ_１−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ＝Ｎ−、−Ｃ（ＣＨ_３）＝Ｎ−、−Ｎ＝Ｎ−の基を表し、
   Ｒ_１は互いに独立してＨまたはＣ_{（１−６）}アルキルを表し、
   Ｚは、非置換フェニル、ナフチル、およびアントラセニルから選択されるアリール基、または非置換ピリジル、フリル、イミダゾリル、ベンズイミダゾリル、ピリミジニル、チエニル、キノリニル、インドリルおよびチアゾリルから選択されるヘテロアリール基を表す。
2. 式（Ｉａ）の、請求項１に記載の化合物：
   

   

   
   置換基は請求項１に定義されているとおりのものである。
3. 式（Ｉｂ）の、請求項１に記載の化合物：
   

   

   
   
   置換基は請求項１に定義されているとおりのものである。
4. 式（Ｉｃ）の、請求項１に記載の化合物：
   

   

   
   。
5. リガンドと、糖タンパク質受容体の群から選択される標的との間の相互作用を特徴付け、分析するための、請求項１から４のいずれかに記載の化合物の使用。
6. ・標的とされた糖タンパク質受容体が、細胞表面の、または分泌された糖タンパク質受容体である；および／または
   ・リガンドが、タンパク質、ペプチド、薬物およびウイルスからなる群から選択されるオーファンリガンドである、
   請求項５に記載の使用。
7. リガンド（ＩＩ）と、試料中の標的（ＩＩＩ）との間の特異的相互作用を同定する方法であって、
   ・標的（ＩＩＩ）が糖タンパク質受容体であり、
   ・リガンド（ＩＩ）が、標的（ＩＩＩ）上のリガンド特異的ドメインを認識する、
   以下を特徴とする方法：
   請求項１から４のいずれかに記載の式（Ｉ）の化合物、リガンド（ＩＩ）および標的（ＩＩＩ）を含む標的−リガンド−試薬−複合体（ＶＩ）が形成され、リガンド（ＩＩ）が式（Ｉ）の基Ｌに共有結合し、標的（ＩＩＩ）が式（Ｉ）に存在するヒドラゾン基に共有結合する。
8. ｉ）標的（ＩＩＩ）を含む試料を提供するステップと、
   ｉｉ）標的（ＩＩＩ）を酸化処理して、少なくとも１つの炭水化物残基上にアルデヒド官能基を生成させ、それによって酸化標的（ＩＶ）を得るステップと、
   ｉｉｉ）請求項１に記載の式（Ｉ）の、請求項２に記載の式（ＩＡ）の、請求項３に記載の式（Ｉｂ）の、又は請求項４に記載の式（Ｉｃ）の、三官能性架橋試薬を提供し、そのリガンド反応性基Ｌをリガンド（ＩＩ）とコンジュゲートさせて、リガンド−試薬−複合体（Ｖ）を得るステップと、
   ｉｖ）ステップｉｉ）の試料とステップｉｉｉ）の複合体（Ｖ）とを、（ａ）複合体（Ｖ）が酸化標的（ＩＶ）上のリガンド特異的ドメインに結合することができ、（ｂ）複合体（Ｖ）のヒドラゾン基（Ｒ’Ｒ’’Ｃ＝Ｎ−ＮＨ−）をその遊離形態に変換し、酸化炭水化物標的（ＩＶ）と共有結合させた条件下で接触させて、共有結合したリガンドと共有結合した標的とを含む標的−リガンド−試薬複合体（ＶＩ）を得るステップと、
   ｖ）ステップｉｖ）の試料を溶解して膜に包埋された細胞表面タンパク質および複合体（ＶＩ）を利用可能にしてマトリックス（ＶＩＩ）と反応させて、マトリックス−結合複合体（ＶＩＩＩ）を得るステップと、
   ｖｉ）親和性マトリックスを使用して前記試料から複合体を濃縮し、マトリックス−結合複合体（ＶＩＩＩ）を得るステップと、
   ｖｉｉ）マトリックス−結合複合体（ＶＩＩＩ）を消化して、（ａ）放出されたペプチド（ＩＸ）および（ｂ）マトリックスに結合した糖ペプチド（Ｘ）を得るステップと、
   ｖｉｉｉ）場合により、マトリックス（ＶＩＩＩ）から結合糖ペプチド（Ｘ）を放出し、放出された糖ペプチド（ＸＩ）を得るステップと、
   ｉｘ）放出された、（ＩＸ）、（ＸＩ）を分析および定量するステップと、
   ｘ）前記リガンドと前記標的（ＩＩＩ）との間の相互作用を同定するステップと
   を含む、請求項７に記載の方法。
9. 標的（ＩＩＩ）が溶液中または細胞表面上のいずれかにある、請求項７または８に記載の方法。
10. ステップｉｖ）では、
    ・（ａ）の反応条件がｐＨ６．５〜７．４であり；温度が０〜１０℃、１０〜２４０分であり、
    ・ステップ（ｂ）の反応条件が、ｐＨ６．５〜７．４のアミノ安息香酸の群から選択される有効量の触媒（ＸＸ）の提供を含み、
    ステップｖ）では、二重に結合した標的−リガンド−試薬複合体（ＶＩ）およびランダムな糖タンパク質−試薬複合体が、細胞および膜の溶解によって試料から放出され、
    ステップｖｉ）では、１％ドデシル硫酸ナトリウム、８Ｍ尿素、２０％アセトニトリル、５Ｍ塩化ナトリウム、８０％イソプロパノール、１００ｍＭ重炭酸ナトリウム、ｐＨ１１を含有するタンパク質適合性緩衝液を用いて精製が達成される、請求項８または９に記載の方法。

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