JP5576585B2 - リン酸化タンパク質免疫測定用試薬 - Google Patents
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Description
(1) ドナー蛍光タンパク質-ロイシンジッパーモチーフをリン酸化ペプチドにフレキシブルリンカーを介して結合させた第1複合体と、アクセプター蛍光タンパク質-ロイシンジッパーモチーフを抗リン酸化タンパク質抗体にフレキシブルリンカーを介して結合させた第2複合体とから構成される、リン酸化タンパク質免疫測定用試薬。
(4) 前記抗リン酸化タンパク質抗体が、測定対象のリン酸化タンパク質のリン酸化モチーフを特異的に認識するものである、(1)または(2)に記載のリン酸化タンパク質免疫測定用試薬。
(6) 前記リン酸化タンパク質がMAPキナーゼであって、リン酸化ペプチドがDHTGFL(pT)E(pY)であることを特徴とする、(1)〜(5)のいずれかに記載のリン酸化タンパク質免疫測定用試薬。
(8) (1)〜(7)のいずれかに記載のリン酸化タンパク質免疫測定用試薬を試料と接触させ、接触前後のFRETシグナルの変化を指標として、当該試料中のリン酸化タンパク質を測定する方法。
1.リン酸化タンパク質免疫測定用試薬
本発明のリン酸化タンパク質免疫測定用試薬(以下、「免疫測定用試薬」という)は、ドナー蛍光タンパク質-ロイシンジッパーモチーフをリン酸化ペプチドにフレキシブルリンカーを介して結合させた第1複合体と、アクセプター蛍光タンパク質-ロイシンジッパーモチーフを抗リン酸化タンパク質抗体にフレキシブルリンカーを介して結合させた第2複合体とから構成される。
本発明の免疫測定用試薬を用いてリン酸化タンパク質を測定する原理を、リン酸化MAPKを例として図1に基づいて説明する。
本発明の免疫測定用試薬は、競合物質(リン酸化MAPK)が存在しない状態では、第1複合体中のリン酸化ペプチド(DHTGFL(pT)E(pY)またはDHTGFL(pT)E(pY)V)と、第2複合体中の抗リン酸化タンパク質抗体(抗MAPK抗体)との間に抗原抗体反応による結合が生じ、かつ、ドナー蛍光タンパク質とアクセプター蛍光タンパク質にそれぞれに付加しているロイシンジッパーモチーフの相互作用が働いている(図1の左図)。この状態では、ドナー蛍光タンパク質の励起波長を照射すると、ドナー蛍光タンパク質とアクセプター蛍光タンパク質の間が近接しているため蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)が生じ(FRETオン)、アクセプター蛍光タンパク質の蛍光が観察される。この反応系に、競合物質(リン酸化MAPK)が存在すると、その競合物質は第1複合体のリン酸化ペプチドと競合的に第2複合体の抗体部位に結合する(図1の右図)。そのため、被検試料中の競合物質の量に応じて第1複合体と第2複合体の抗原抗体反応が解消され、その結果、FRETが解消し(FRETオフ)、アクセプターの蛍光は減少してドナーの蛍光が増大する。従って、本発明の免疫測定用試薬を試料と接触させた際に、FRETシグナルの変化を観察することにより、試料中の被検物質(すなわち、測定対象とするリン酸化タンパク質)の有無やその存在量を測定することができる。なお、「測定」には検出と定量の両者が包含される。
0分〜60分程度が例示できる。また、使用する試薬の濃度は、予想される被検物質濃度等に応じて適宜設定することができるが、通常、1nM〜10μM程度である。
(実施例1) 免疫測定用試薬の調製
(1) 蛍光融合タンパク質発現ベクターの作製
N末端から、チオレドキシン(Trx)、フレキシブルリンカー(FL4)、蛍光タンパク質(ECFPまたはEYFP)、ロイシンジッパー(LzipJun)からなる融合タンパク質の発現ベクターは、既報(Analytical Chemistry 2002年74号p5786-5792)に記載の抗ヒトアルブミン抗体-蛍光タンパク質-ロイシンジッパー融合タンパク質発現ベクターから抗体遺伝子を除去することにより作製した。
(1)にて作製した発現ベクターAおよび発現ベクターBを用いて、大腸菌Origami(DE3)(Novagen社)の形質転換を行った。形質転換した大腸菌を5ml LB(50μg/mlアンピシリン、15μg/mlカナマイシン、12.5μg/mlテトラサイクリン)培地にて30℃で一晩振とう培養した。翌日、培養細胞を1.5l LB培地に植え継ぎ、30℃で培養を続けた。培養液の濁度がO.D.600が約0.5に達したところ(約6時間培養)で、0.1M IPTGを1.5ml添加し、温度を16℃に下げ、一晩培養を続けた。翌日、遠心分離により菌体を回収し、菌体破砕液(50mM NaH2PO4-NaOH、300mM NaCl、10mM imidazole, pH8.0)を各サンプルに40ml加え、菌体を縣濁させた。その後、この菌体液を遮光した状態で-80℃と室温に交互に置き、凍結融解を2回おこなった。凍結融解後のサンプルは、超音波処理により菌体を破砕し、破砕後のサンプルを遠心分離することにより菌体破砕上清を回収した。
抗リン酸化MAPK抗体IgG(Sigma)3mgを1.5mlの酢酸ナトリウム緩衝液に溶解後、60μgのペプシン(Sigma)を添加し、37℃で16時間ペプシン消化した。ペプシン消化したサンプルは1N NaOHで直ちに中和し、Superdex200(16/60)カラムでF(ab')2断片を精製した。精製したF(ab')2溶液に20mMの2-メルカプトエタノール(2ME)を添加し、37℃、1.5時間処理することにより、Fab'を調製した。さらに、Sephadex-G25カラムで2MEを除去した後に、1,11-maleimidotetraethyleneglycol(BM(PEO)4)(ピアス)をFab'の100倍量(モル比)添加し、30℃で1時間保温した。反応溶液をSephadex-G25カラムで精製し、未反応の1,11-bismaleimidotetraethyleneglycolを除去することによりマレイミド-Fab'を調製した。
リン酸化MAPKペプチドとして、N末端に標識用のマレイミド基を導入したペプチド3種(マレイミド-DHTGFL(pT)E(pY)VA、マレイミド-DHTGFL(pT)E(pY)V、マレイミド-DHTGFL(pT)E(pY))を化学合成し、カップリング反応用のリン酸緩衝液に溶解した。一方、上記(2)で調製したTrx-FL4-ECFP-Lzip(Jun)タンパク質溶液に20mMのDTTを添加し、室温で一晩処理後、Sephadex-G25カラムにより還元Trx-FL4-ECFP-Lzip(Jun)を精製した。次に、大過剰のマレイミド-リン酸化MAPKペプチド溶液と還元Trx-FL4-ECFP-Lzip(Jun)タンパク質溶液を混合し、30℃で1時間保温することにより、リン酸化MAPKペプチド-蛍光融合タンパク質複合体を作製した。さらに、カップリングしたサンプルに、蛍光タンパク質の5倍量(モル比)のN-ethylmaleimide(NEM)を添加することにより、カップリング反応を停止した。反応後のサンプルは、Superdex200(16/60)カラムを用いて、未反応のマレイミド-ペプチド、NEMを除去し、リン酸化MAPKペプチド-蛍光融合タンパク質複合体を精製した。
実施例1(3)および(4)で作製した抗リン酸化MAPK抗体-蛍光融合タンパク質複合体と3種のリン酸化MAPKペプチド-蛍光融合タンパク質複合体を40nMになるように、アッセイ用緩衝液(50mM Tris-HCl、50mM NaCl、0.1%ウシ血清アルブミン、pH8.0)に溶解し、37℃で10分間反応させた。次に、混合液を蛍光光度計のセルに注入し、ここにリン酸化MAPKペプチドDHTGFL(pT)E(pY)VATを終濃度で40nMになるように添加し、添加10分後の蛍光スペクトル変化を測定した。蛍光スペクトル測定は蛍光光度計Shimadzu RF-5300PC(島津)を用い、433nmで励起し、450〜600nmの蛍光スペクトルを測定した(室温)。その結果、DHTGFL(pT)E(pY)VAペプチド-蛍光融合タンパク質複合体(図2)では、リン酸化ペプチド添加による大きなFRETシグナル変化は確認できなかったが、DHTGFL(pT)E(pY)Vペプチド-蛍光融合タンパク質複合体(図3)およびDHTGFL(pT)E(pY)ペプチド-蛍光融合タンパク質複合体(図4)では、競合反応に伴う迅速なFRETシグナル変化が確認された。以上の結果から、リン酸化MAPKペプチドとしてDHTGFL(pT)E(pY)VペプチドまたはDHTGFL(pT)E(pY)ペプチドを用いることにより迅速なリン酸化MAPKペプチドの検出が可能であることが示された。
実施例1(3)および(4)で作製した抗リン酸化MAPK抗体-蛍光タンパク質複合体とDHTGFL(pT)E(pY)ペプチド-蛍光融合タンパク質複合体を40nMになるように、アッセイ用緩衝液(50mM Tris-HCl、50mM NaCl、0.1%ウシ血清アルブミン、pH8.0)に溶解し、37℃で10分間反応させた。次に、混合液を蛍光光度計のセルに注入し、ここにグルタチオンSトランスフェラーゼ融合リン酸化MAPK(GST-pERK2:Upstate)を終濃度で360nMになるように添加し、添加直後から60分間の蛍光スペクトルを測定した。蛍光スペクトル測定は蛍光光度計Shimadzu RF-5300PC(島津)を用い、433nmで励起し、450〜600nmの蛍光スペクトルを測定した(37℃)。
観察用のHela細胞は、10%のウシ血清を含むDMEM培地にて、37℃、5% 二酸化炭素濃度の培養条件下で培養し、アッセイ前日から無血清のDMEM培地にて培養した。実施例1(3)および(4)で作製した抗リン酸化MAPK抗体-蛍光融合タンパク質複合体とDHTGFL(pT)E(pY)ペプチド-蛍光融合タンパク質複合体を4μMになるように混合し、15,000rpm、15分間遠心分離した。遠心分離後、回収した上清をインジェクションニードルに分注し、ニードルをマイクロインジェクション装置に設置した。次に、蛍光顕微鏡IX81(オリンパス)の観察ステージにHela細胞をセットし、マイクロインジェクション(エッペンドルフ)により、蛍光プローブ(上記抗リン酸化MAPK抗体-蛍光融合タンパク質複合体とDHTGFL(pT)E(pY)ペプチド-蛍光融合タンパク質複合体)を生細胞内に導入した。
Claims (4)
- ドナー蛍光タンパク質-ロイシンジッパーモチーフをDHTGFL(pT)E(pY)またはDHTGFL(pT)E(pY)Vにフレキシブルリンカーを介して結合させた第1複合体と、アクセプター蛍光タンパク質-ロイシンジッパーモチーフを抗リン酸化MAPキナーゼ抗体にフレキシブルリンカーを介して結合させた第2複合体とから構成される、リン酸化MAPキナーゼの免疫測定用試薬。
- アクセプター蛍光タンパク質-ロイシンジッパーモチーフをDHTGFL(pT)E(pY)またはDHTGFL(pT)E(pY)Vにフレキシブルリンカーを介して結合させた第1複合体と、ドナー蛍光タンパク質-ロイシンジッパーモチーフを抗リン酸化MAPキナーゼ抗体にフレキシブルリンカーを介して結合させた第2複合体とから構成される、リン酸化MAPキナーゼの免疫測定用試薬。
- 前記ドナー蛍光タンパク質とアクセタプター蛍光タンパク質との間に、蛍光共鳴エネル
ギー転移(FRET: Fluorescence resonance energy transfer)が生じる、請求項1または2に記載のリン酸化MAPキナーゼの免疫測定用試薬。 - 請求項1〜3のいずれかに記載のリン酸化MAPキナーゼの免疫測定用試薬を試料と接触させ、接触前後のFRETシグナルの変化を指標として、当該試料中のリン酸化MAPキナーゼを測定する方法。
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