JP6892867B2 - 環状ペプチド、アフィニティクロマトグラフィー担体、標識化抗体、抗体薬物複合体および医薬製剤 - Google Patents
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Description
[1] 下記式(I)によって表される環状ペプチド。
RN−Xg−[Xi−Xa−Xm−X1−X2−X3−Xn−Xb−Xj]k−Xh−RC ・・・(I)
式(I)中、
RNは、N末端基を表し;
RCは、C末端基を表し;
X1は、L−ロイシン残基、L−イソロイシン残基、L−メチオニン残基、L−リジン残基またはL−アルギニン残基を表し;
X2は、L−バリン残基またはL−イソロイシン残基を表し;
X3は、L−トリプトファン残基またはL−フェニルアラニン残基を表し;
XaおよびXbの一方は、側鎖にアジド基を有するアミノ酸に由来するアミノ酸残基を表し、他方は、側鎖にアルキニル基を有するアミノ酸に由来するアミノ酸残基を表し、かつ、XaおよびXbは、トリアゾール結合を介して結合しており;
Xg、Xh、Xi、Xj、XmおよびXnは、それぞれ、連続するg個のX、連続するh個のX、連続するi個のX、連続するj個のX、連続するm個のXおよび連続するn個のXを表し;
Xは、アミノ酸残基を表し、Xが複数である場合は、複数のXは互いに同一であっても異なっていてもよく;
g、h、iおよびjは、それぞれ独立に、0以上の整数であり;
mおよびnは、0≦m≦9、0≦n≦9、および3≦m+n≦9を同時に満たす整数であり;
kは、1以上の整数であり、k≧2である場合は、繰返し単位[Xi−Xa−Xm−X1−X2−X3−Xn−Xb−Xj]中のX1、X2、X3、Xa、Xb、Xi、Xj、XmおよびXnは、それぞれ、各繰返し単位間で同一であってもよいし、相違していてもよい。
[2] 下記式(IA)によって表される、上記[1]に記載の環状ペプチド。
RN−Xg−[Xp2−X4 r−Xp1−Xa−Xm−X1−X2−X3−Xn−Xb−Xq1−X5 s−Xq2]k−Xh−RC ・・・(IA)
式(IA)中、
RN、RC、X1、X2、X3、Xa、Xb、Xg、Xh、Xm、Xn、X、g、h、m、nおよびkは、上記式(I)中におけるものと同義であり;
X4 r、X5 s、Xp1、Xp2、Xq1およびXq2は、それぞれ、連続するr個のX4、連続するs個のX5、連続するp1個のX、連続するp2個のX、連続するq1個のXおよび連続するq2個のXを表し;
X4およびX5は、それぞれ独立に、側鎖にカルボキシ基を有するアミノ酸に由来するアミノ酸残基または側鎖にヒドロキシ基を有するアミノ酸に由来するアミノ酸残基を表し、X4またはX5が複数である場合は、複数のX4またはX5は互いに同一であっても異なっていてもよく;
p1、p2、q1およびq2は、それぞれ独立に、0以上の整数であり;
rおよびsは、それぞれ、0≦r≦5、0≦s≦5、および1≦Max(r,s)≦5を満たす整数であり、ただし、Max(r,s)は、r≠sであるとき、rとsの2数のうち大きい方を表し、r=sであるとき、rまたはsを表し;
k≧2である場合は、繰返し単位[Xp2−X4 r−Xp1−Xa−Xm−X1−X2−X3−Xn−Xb−Xq1−X5 s−Xq2]中のX1、X2、X3、Xa、Xb、X4 r、X5 s、Xm、Xn、Xp2、Xp1、Xq1およびXq2は、それぞれ、各繰返し単位間で同一であってもよいし、相違していてもよい。
[3] 下記式(IB)によって表される、上記[1]に記載の環状ペプチド。
RN−Xv1−X6 t−Xv2−[Xi−Xa−Xm−X1−X2−X3−Xn−Xb−Xj]k−Xw2−X7 u−Xw1−RC ・・・(IB)
式(IB)中、
RN、RC、X1、X2、X3、Xa、Xb、Xi、Xj、Xm、Xn、X、i、j、m、nおよびkは、上記式(I)中におけるものと同義であり;
X6 t、X7 u、Xv1、Xv2、Xw1およびXw2は、それぞれ、連続するt個のX6、連続するu個のX7、連続するv1個のX、連続するv2個のX、連続するw1個のXおよび連続するw2個のXを表し;
X6およびX7は、それぞれ独立に、側鎖に固定化官能基を有するアミノ酸に由来するアミノ酸残基を表し、X6またはX7が複数である場合は、複数のX6またはX7は互いに同一であっても異なっていてもよく;
tおよびuは、それぞれ、0≦t≦5、0≦u≦5、および1≦Max(t,u)≦5を満たす整数であり、ただし、Max(t,u)は、t≠uであるとき、tとuの2数のうち大きい方を表し、t=uであるとき、tまたはuを表し;
v1、v2、w1およびw2は、それぞれ独立に、0以上の整数であり;
k≧2である場合は、繰返し単位[Xi−Xa−Xm−X1−X2−X3−Xn−Xb−Xj]中のX1、X2、X3、Xa、Xb、Xi、Xj、XmおよびXnは、それぞれ、各繰返し単位間で同一であってもよいし、相違していてもよい。
[4] 下記式(IC)によって表される、上記[1]〜[3]のいずれか1つに記載の環状ペプチド。
RN−Xv1−X6 t−Xv2−[Xp2−X4 r−Xp1−Xa−Xm−X1−X2−X3−Xn−Xb−Xq1−X5 s−Xq2]k−Xw2−X7 u−Xw1−RC ・・・(IC)
式(IC)中、
RN、RC、X1、X2、X3、Xa、Xb、Xm、Xn、X、m、nおよびkは、上記式(I)中におけるものと同義であり;
Xp1、Xp2、Xq1、Xp2、X4 r、X5 s、X6 t、X7 u、Xv1、Xv2、Xw1およびXw2は、それぞれ、連続するp1個のX,連続するp2個のX、連続するq1個のX、連続するq2個のX、連続するr個のX4、連続するs個のX5、連続するt個のX6、連続するu個のX7、連続するv1個のX,連続するv2個のX、連続するw1個のXおよび連続するw2個のXを表し;
X4およびX5は、それぞれ独立に、側鎖にカルボキシ基を有するアミノ酸に由来するアミノ酸残基または側鎖にヒドロキシ基を有するアミノ酸に由来するアミノ酸残基を表し、X4またはX5が複数である場合は、複数のX4またはX5は互いに同一であっても異なっていてもよく;
X6およびX7は、それぞれ独立に、側鎖に固定化官能基を有するアミノ酸に由来するアミノ酸残基を表し、X6またはX7が複数である場合は、複数のX6またはX7は互いに同一であっても異なっていてもよく;
p1、p2、q1およびq2は、それぞれ独立に、0以上の整数であり;
rおよびsは、それぞれ、0≦r≦5、0≦s≦5、および1≦Max(r,s)≦5を満たす整数であり、ただし、Max(r,s)は、r≠sであるとき、rとsの2数のうち大きい方を表し、r=sであるとき、rまたはsを表し;
tおよびuは、それぞれ、0≦t≦5、0≦u≦5、および1≦Max(t,u)≦5を満たす整数であり、ただし、Max(t,u)は、t≠uであるとき、tとuの2数のうち大きい方を表し、t=uであるとき、tまたはuを表し;
v1、v2、w1およびw2は、それぞれ独立に、0以上の整数であり;
k≧2である場合は、繰返し単位[Xp2−X4 r−Xp1−Xa−Xm−X1−X2−X3−Xn−Xb−Xq1−X5 s−Xq2]中のX1、X2、X3、Xa、Xb、X4 r、X5 s、Xm、Xn、Xp2、Xp1、Xq1およびXq2は、それぞれ、各繰返し単位間で同一であってもよいし、相違していてもよい。
[5] 上記側鎖にカルボキシ基を有するアミノ酸が、L−アスパラギン酸、D−アスパラギン酸、L−グルタミン酸、D−グルタミン酸、L−ホモグルタミン酸およびD−ホモグルタミン酸からなる群から選択される少なくとも1種のアミノ酸であり、上記側鎖にヒドロキシ基を有するアミノ酸が、L−セリン、D−セリン、L−ホモセリン、D−ホモセリン、L−チロシン、D−チロシン、L−トレオニン、D−トレオニン、L−アロトレオニンおよびD−アロトレオニンからなる群から選択される少なくとも1種のアミノ酸である、上記[2]または[4]に記載の環状ペプチド。
[6] 上記側鎖に固定化官能基を有するアミノ酸が、L−リシン、D−リシン、L−システイン、D−システイン、L−ホモシステインおよびD−ホモシステインからなる群から選択される少なくとも1種のアミノ酸である、上記[3]または[4]に記載の環状ペプチド。
[7] 上記側鎖にアジド基を有するアミノ酸が、β−アジド−L−アラニン、γ−アジド−L−ホモアラニン、δ−アジド−L−ノルバリンおよびε−アジド−L−リシンからなる群から選択される少なくとも1種のアミノ酸であり、上記側鎖にアルキニル基を有するアミノ酸が、L−プロパルギルグリシン、L−ホモプロパルギルグリシンおよびL−ビスホモプロパルギルグリシンからなる群から選択される少なくとも1種のアミノ酸である、上記[1]〜[6]のいずれか1つに記載の環状ペプチド。
[8] Xm−X1−X2−X3−Xnが、下記式(1)で表されるアミノ酸配列(配列番号1)または下記式(2)で表されるアミノ酸配列(配列番号2)と、70%以上の配列相同性を有する、上記[1]〜[7]のいずれか1つに記載の環状ペプチド。
A−Y−H−L1−G−E−L2−V−W ・・・(1)
A−Y−H−R−G−E−L2−V−W ・・・(2)
式(1)および式(2)中、
AはL−アラニン残基またはD−アラニン残基を表し;
YはL−チロシン残基またはD−チロシン残基を表し;
HはL−ヒスチジン残基またはD−ヒスチジン残基を表し;
L1はL−ロイシン残基またはD−ロイシン残基を表し;
RはL−アルギニン残基またはD−アルギニン残基を表し;
Gはグリシン残基を表し;
EはL−グルタミン酸残基またはD−グルタミン酸残基を表し;
L2はL−ロイシン残基を表し;
VはL−バリン残基を表し;
WはL−トリプトファン残基を表す。
[9] k=1である、上記[1]〜[8]のいずれか1つに記載の環状ペプチド。
[10] 下記式(II)によって表される、上記[1]に記載の環状ペプチド。
RN−Xv0−X6 t0−Xe0−X4 r0−Xp0−Xa−A−Y−H−X8−G−E−L−V−W−Xb−Xq0−X5 s0−Xf0−X7 u0−Xw0−RC ・・・(II)
式(II)中、
Xa、Xb、X、RNおよびRCは、上記式(I)中におけるものと同義であり;
X4およびX5は、それぞれ独立に、側鎖にカルボキシ基またはヒドロキシ基を有するL−アミノ酸残基またはD−アミノ酸残基を表し、X4またはX5が複数である場合は、複数のX4またはX5は互いに同一であっても異なっていてもよく;
X6およびX7は、それぞれ独立に、側鎖に固定化官能基を有するL−アミノ酸残基またはD−アミノ酸残基を表し、X6またはX7が複数である場合は、複数のX6またはX7は互いに同一であっても異なっていてもよく;
X8はL−ロイシン残基、L−アルギニン残基、D−ロイシン残基およびD−アルギニン残基からなる群から選択されるいずれか1つを表し;
e0およびf0は、それぞれ、0≦e0≦10、および0≦f0≦10を満たす整数であり;
p0およびq0は、それぞれ、0≦p0≦5、および0≦q0≦5を満たす整数であり;
r0およびs0は、それぞれ、0≦r0≦5、および0≦s0≦5を満たす整数であり;
t0およびu0は、それぞれ、0≦t0≦5、および0≦u0≦5を満たす整数であり;
v0およびw0は、それぞれ、0≦v0≦5、および3≦w0≦5を満たす整数であり;
さらに、p0、q0、r0、s0、t0、u0、v0、およびw0は、0≦p0+q0+r0+s0+t0+u0+v0+w0≦39を満たし;
AはL−アラニン残基またはD−アラニン残基を表し;
YはL−チロシン残基またはD−チロシン残基を表し;
HはL−ヒスチジン残基またはD−ヒスチジン残基を表し;
Gはグリシン残基を表し;
EはL−グルタミン酸残基またはD−グルタミン酸残基を表し;
LはL−ロイシン残基を表し;
VはL−バリン残基を表し;
WはL−トリプトファン残基を表す。
[11] 抗体結合性リガンドである、上記[1]〜[10]のいずれか1つに記載の環状ペプチド。
[12] 抗体標識用リンカーである、上記[1]〜[10]のいずれか1つに記載の環状ペプチド。
[13] 抗体薬物複合体用リンカーである、上記[1]〜[10]のいずれか1つに記載の環状ペプチド。
[14] 薬物運搬体である、上記[1]〜[10]のいずれか1つに記載の環状ペプチド。
[15] 水不溶性担体および上記[1]〜[10]のいずれか1つに記載の環状ペプチドを含み、
上記水不溶性担体と上記環状ペプチドとが直接または間接的に結合している、アフィニティクロマトグラフィー担体。
[16] 抗体、標識化合物および上記[1]〜[10]のいずれか1つに記載の環状ペプチドを含み、
上記抗体と上記標識化合物とが上記環状ペプチドを介して結合している、標識化抗体。
[17] 抗体、薬物および上記[1]〜[10]のいずれか1つに記載の環状ペプチドを含み、
上記抗体と上記薬物とが上記環状ペプチドを介して結合している、抗体薬物複合体。
[18] 上記薬物が、リポソーム化、高分子ミセル化またはPEG化された薬物である、上記[17]に記載の抗体薬物複合体。
[19] 薬物および上記[1]〜[10]のいずれか1つに記載の環状ペプチドを含み、
上記薬物と上記環状ペプチドとが直接または間接的に結合している、医薬製剤。
[20] 上記薬物が、リポソーム化、高分子ミセル化またはPEG化された薬物である、上記[19]に記載の医薬製剤。
まず、本発明の従来技術に無い特徴を記載する。
特許文献1〜3には、2つのシステイン残基間でジスルフィド結合を形成して環化した環状ペプチドが記載されている。しかし、後述する比較例2の相対結合活性および薬品耐性の評価結果によれば、2つのシステイン残基間のジスルフィド結合により環化した環状ペプチドは、抗体結合性は優れるものの、薬品耐性が劣り、所望の性能を得ることができない。
また、特許文献1には、2つのアミノ酸残基間で側鎖アミノ基と側鎖カルボキシ基との反応によりアミド結合を形成して環化した環状ペプチドが記載され、特許文献3には、N末端アミノ基または側鎖アミノ基と側鎖カルボキシ基とがラクタム結合(アミド結合)を形成して環化した環状ペプチドが記載されている。しかし、後述する比較例1の相対結合活性および薬品耐性の評価結果によれば、側鎖アミノ基および側鎖カルボキシ基間のアミド結合により環化した環状ペプチドは、薬品耐性は優れるものの、抗体結合性が劣り、所望の性能を得ることができない。
これに対して、本発明では、後述する構成を採用したことによって、抗体結合性に優れ、しかも薬品耐性が改善された環状ペプチドを得ることができた。
なお、本明細書において「〜」を用いて表される範囲は、その範囲に「〜」の前後に記載された両端を含む範囲を意味する。例えば、「A〜B」はAおよびBを含む範囲を意味する。また、「以上」または「以下」を用いて表される範囲は、それぞれ、その範囲に「以上」または「以下」記載されたものを含む範囲を意味する。例えば、「C以上」はCおよびCよりも上の範囲を意味し、「D以下」はDおよびDよりも下の範囲を意味する。
特に明示しない限り、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列(「1次構造」ともいう。)は、左端から右端にかけてN末端からC末端となるようにアミノ酸残基を1列に並べて表す。ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列中のアミノ酸残基を位置も含めて特定する場合には、アミノ酸残基の略号の右側にN末端側からの何番目のアミノ酸残基であるかを示す数字を付して表す場合がある。例えば、N末端から2番目のL−リシンをLys2と表す場合がある。
本発明の環状ペプチドは、下記式(I)によって表される環状ペプチドである。
RN−Xg−[Xi−Xa−Xm−X1−X2−X3−Xn−Xb−Xj]k−Xh−RC ・・・(I)
式(I)によって表される環状ペプチドの環状部は「Xa−Xm−X1−X2−X3−Xn−Xb」部分であり、直鎖部は「Xg」、「Xh」、「Xi」および「Xj」であり、架橋部は「Xa」および「Xb」であり、抗体結合部は「X1−X2−X3」である。
また、式(I)中、[Xi−Xa−Xm−X1−X2−X3−Xn−Xb−Xj]を繰返し部という場合がある。
また、上記式(I)において、X2は、L−バリン残基またはL−イソロイシン残基であり、好ましくはL−バリン残基である。
また、上記式(I)において、X3は、L−トリプトファン残基またはL−フェニルアラニン残基であり、好ましくはL−トリプトファン残基である。
−R11−N3 (a)
式(a)中、R11は、炭素数1〜10のアルキレン基を表し、好ましくは炭素数1〜6のアルキレン基を表し、より好ましくはメチレン基、エチレン基、プロパン−1,3−ジイル基、プロパン−1,2−ジイル基、ブタン−1,2−ジイル基、ブタン−1,3−ジイル基、ブタン−1,4−ジイル基またはブタン−2,3−ジイル基を表し、さらに好ましくはメチレン基、エチレン基またはブタン−1,4−ジイル基を表す。経済性または架橋反応性の観点からは短鎖が好ましいが、これらの理由によって制限されるものではない。
なお、アジド基は「−N3」と表記するほか、「−N=N+=N−」または「−N−−N+≡N」等と表記することもある。
−R12−C≡CH (b)
式(b)中、R12は、炭素数1〜10のアルキレン基を表し、好ましくは炭素数1〜6のアルキレン基を表し、より好ましくはメチレン基、エチレン基、プロパン−1,3−ジイル基、プロパン−1,2−ジイル基、ブタン−1,2−ジイル基、ブタン−1,3−ジイル基、ブタン−1,4−ジイル基またはブタン−2,3−ジイル基を表し、さらに好ましくはメチレン基、エチレン基またはプロパン−1,2−ジイル基を表し、いっそう好ましくはメチレン基またはエチレン基を表す。経済性または架橋反応性の観点からは短鎖が好ましいが、これらの理由によって制限されるものではない。
上記Xは、アミノ酸残基であればよく、特に限定されないが、表1に示すアミノ酸(B、ZおよびXを除く。)および表2に示すアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸に由来するアミノ酸残基であることが好ましく、表1に示すアミノ酸(B、ZおよびXを除く。)からなる群から選択されるアミノ酸に由来するアミノ酸残基であることがより好ましい。また、存在する場合には、これらのアミノ酸のエナンチオマーまたはジアステレオマーに由来するアミノ酸残基であってもよい。
上記N末端基としては、例えば、アミノ基が挙げられ、当該アミノ基は、N−アセチル化、N−ホルミル化またはN−アシル化等のN末端修飾がされていてもよい。
上記C末端基としては、例えば、カルボキシ基が挙げられ、当該カルボキシ基は、アミド化等のC末端修飾がされていてもよい。
gは、好ましくは0≦g≦20を満たし、より好ましくは0≦g≦10を満たし、さらに好ましくは0≦g≦5を満たす。
hは、好ましくは0≦h≦20を満たし、より好ましくは0≦h≦10を満たし、さらに好ましくは0≦h≦5を満たす。
iは、好ましくは0≦i≦20を満たし、より好ましくは0≦i≦10を満たし、さらに好ましくは0≦i≦5を満たす。
jは、好ましくは0≦j≦20を満たし、より好ましくは0≦j≦10を満たし、さらに好ましくは0≦j≦5を満たす。
さらに、mおよびnは、3≦m+n≦9を満たし、好ましくは4≦m+n≦8を満たし、より好ましくは5≦m+n≦7を満たす。
環状部のアミノ酸残基数がこの範囲内であると、環状ペプチドの分子内ひずみが大きくなり過ぎず、αヘリックス等の高次構造が安定化するため、本発明の環状ペプチドの抗体結合性が優れる。
繰返し単位の数は、特に限定されるものではないが、繰返し単位の数が多いほど環状部を多く含むことができるため、環状ペプチドの抗体結合性を向上させることができる可能性があり、繰返し単位の数が少ないほど総アミノ酸残基数を少なくできるため、環状ペプチドの抗原性を抑制することができる可能性がある。環状ペプチドの合成コストの観点からは、アミノ酸残基数が少ない方が好ましく、繰返し単位の数の少ないことが好ましい。
すなわち式(I)中、g、h、j、j、m、nおよびkは、好ましくは8≦g+h+(i+j+m+n+5)×k≦50を満たし、より好ましくは9≦g+h+(i+j+m+n+5)×k≦40を満たし、さらに好ましくは10≦g+h+(i+j+m+n+5)×k≦30を満たし、いっそう好ましくは10≦g+h+(i+j+m+n+5)×k≦20を満たす。
通常、アミノ酸残基数が多くなるほど製造コストが高くなるため、経済的な観点からは、アミノ酸残基の総数は少ない方が好ましい。
RN−Xg−[Xp2−X4 r−Xp1−Xa−Xm−X1−X2−X3−Xn−Xb−Xq1−X5 s−Xq2]k−Xh−RC ・・・(IA)
また、式(IA)中、Xnは、式(I)中のXnと同様に、Xがn個連結していることを意図する。Xm、Xp1、Xp2、Xq1およびXq2についても同様である。
さらに、式(IA)中、X4 rおよびX5 sは、それぞれ、X4がr個連結していること、およびX5がs個連結していること、を意図する。
また、式(IA)中、繰返し単位は[Xp2−X4 r−Xp1−Xa−Xm−X1−X2−X3−Xn−Xb−Xq1−X5 s−Xq2]である。
p1は、好ましくは0≦p1≦20を満たし、より好ましくは0≦p1≦10を満たし、さらに好ましくは0≦p1≦5を満たし、いっそう好ましくは0≦p1≦2を満たす。
p2は、好ましくは0≦p2≦20を満たし、より好ましくは0≦p2≦10を満たし、さらに好ましくは0≦p2≦5を満たし、いっそう好ましくは0≦p2≦2を満たす。
q1は、好ましくは0≦q1≦20を満たし、より好ましくは0≦q1≦10を満たし、さらに好ましくは0≦q1≦5を満たし、いっそう好ましくは0≦q1≦2を満たす。
q2は、好ましくは0≦q2≦20を満たし、より好ましくは0≦q2≦10を満たし、さらに好ましくは0≦q2≦5を満たし、いっそう好ましくは0≦q2≦2を満たす。
ただし、Max(r,s)は、r≠sであるとき、rとsの2数のうち大きい方を表し、r=sであるとき、rまたはsを表す。
環状部のアミノ酸残基数がこの範囲内であると、環状ペプチドの分子内ひずみが大きくなり過ぎず、αヘリックス等の高次構造が安定化するため、本発明の環状ペプチドの抗体結合性が優れる。
すなわち、式(IA)中、g、h、m、n、p1、p2、q1、q2、r、sおよびkは、好ましくは8≦g+h+(m+n+p1+p2+q1+q2+r+s+5)×k≦50を満たし、より好ましくは9≦g+h+(m+n+p1+p2+q1+q2+r+s+5)×k≦40を満たし、さらに好ましくは10≦g+h+(m+n+p1+p2+q1+q2+r+s+5)×k≦30を満たし、いっそう好ましくは10≦g+h+(m+n+p1+p2+q1+q2+r+s+5)×k≦20を満たす。
通常、アミノ酸残基数が多くなるほど製造コストが高くなるため、経済的な観点からは、アミノ酸残基の総数は少ない方が好ましい。
RN−Xv1−X6 t−Xv2−[Xi−Xa−Xm−X1−X2−X3−Xn−Xb−Xj]k−Xw2−X7 u−Xw1−RC ・・・(IB)
また、式(IB)中、Xnは、式(I)中のXnと同様に、Xがn個連結していることを意図する。Xm、Xv1、Xv2、Xw1およびXw2についても同様である。
さらに、式(IB)中、X6 tおよびX7 uは、それぞれ、X6がt個連結していること、およびX7がu個連結していること、を意図する。
また、式(IB)中、繰返し単位は、式(I)と同様に、[Xi−Xa−Xm−X1−X2−X3−Xn−Xb−Xj]である。
このような固定化官能基としては、例えば、アミノ基、カルボキシ基、ヒドロキシ基、チオール基、アルデヒド基(「ホルミル基」ともいう。)、カルバモイル基、アジド基およびアルキニル基等が挙げられる。
本発明の環状ペプチドが有する固定化官能基と担体上の官能基の組合せとしては、アミノ基とカルボキシ基(アミド結合形成反応)、アミノ基とアルデヒド基(還元的アミノ化反応)、アミノ基とエポキシ基、ヒドロキシ基とエポキシ基、カルボキシ基とヒドロキシ基(エステル結合形成反応)、チオール基とチオール基(ジスルフィド結合)、チオール基とエポキシ基およびアジド基とアルキニル基(ヒュスゲン環化付加反応)等が挙げられる。
本発明の環状ペプチドが有する固定化官能基と担体上の官能基とが反応して共有結合を形成することにより、本発明の環状ペプチドが担体に固定化される。なお、本発明の環状ペプチドが有する固定化官能基の少なくとも一部が担体上の官能基と反応して共有結合を形成すればよく、すべての固定化官能基が担体上の官能基と反応しなくてもよい。
担体を構成する材料としては、例えば、アガロース、デキストラン、デンプン、セルロース、プルラン、キチン、キトサン、三酢酸セルロースおよび二酢酸セルロース等の多糖類およびその誘導体、ならびに、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアルキルビニルエーテルおよびポリビニルアルコール等のビニル系重合体等が挙げられる。これらの材料は、機械的強度を確保できることから、架橋構造を形成していてもよい。担体はこれらのうち1種類または2種類以上の材料からなることが好ましい。
また、担体は好ましくは多孔質担体であり、より好ましくは多孔質膜または多孔質粒子であり、さらに好ましくは多孔質粒子である。
ただし、Max(t,u)は、t≠uであるとき、tとuの2数のうち大きい方を表し、t=uであるとき、tまたはuを表す。
v1は、好ましくは0≦v1≦20を満たし、より好ましくは0≦v1≦10を満たし、さらに好ましくは0≦v1≦5を満たし、いっそう好ましくは0≦v1≦2を満たす。
v2は、好ましくは0≦v2≦20を満たし、より好ましくは0≦v2≦10を満たし、さらに好ましくは0≦v2≦5を満たし、いっそう好ましくは0≦v2≦2を満たす。
w1は、好ましくは0≦w1≦20を満たし、より好ましくは0≦w1≦10を満たし、さらに好ましくは0≦w1≦5を満たし、いっそう好ましくは0≦w1≦2を満たす。
w2は、好ましくは0≦w2≦20を満たし、より好ましくは0≦w2≦10を満たし、さらに好ましくは0≦w2≦5を満たし、いっそう好ましくは0≦w2≦2を満たす。
環状部のアミノ酸残基数がこの範囲内であると、環状ペプチドの分子内ひずみが大きくなり過ぎず、αヘリックス等の高次構造が安定化するため、本発明の環状ペプチドの抗体結合性が優れる。
すなわち、式(IB)中、i、j、m、n、t、u、v1、v2、w1、w2およびkは、好ましくは8≦(i+j+m+n+5)×k+t+u+v1+v2+w1+w2≦50を満たし、より好ましくは(i+j+m+n+5)×k+t+u+v1+v2+w1+w2≦40を満たし、さらに好ましくは10≦(i+j+m+n+5)×k+t+u+v1+v2+w1+w2≦30を満たし、いっそう好ましくは10≦(i+j+m+n+5)×k+t+u+v1+v2+w1+w2≦20を満たす。
通常、アミノ酸残基数が多くなるほど製造コストが高くなるため、経済的な観点からは、アミノ酸残基の総数は少ない方が好ましい。
RN−Xv1−X6 t−Xv2−[Xp2−X4 r−Xp1−Xa−Xm−X1−X2−X3−Xn−Xb−Xq1−X5 s−Xq2]k−Xw2−X7 u−Xw1−RC ・・・(IC)
また、式(IC)中、Xnは、式(I)中のXnと同様に、Xがn個連結していることを意図する。Xm、Xp1、Xp2、Xq1、Xq2、Xv1、Xv2、Xw1およびXw2についても同様である。
さらに、式(IC)中、X4 r、X5 s、X6 tおよびX7 uは、それぞれ、X4がr個連結していること、X5がs個連結していること、X6がt個連結していること、およびX7がu個連結していること、を意図する。
また、式(IC)中、繰返し単位は、式(IA)と同様に、[Xp2−X4 r−Xp1−Xa−Xm−X1−X2−X3−Xn−Xb−Xq1−X5 s−Xq2]である。
環状部のアミノ酸残基数がこの範囲内であると、環状ペプチドの分子内ひずみが大きくなり過ぎず、αヘリックス等の高次構造が安定化するため、本発明の環状ペプチドの抗体結合性が優れる。
すなわち、式(IC)中、m、n、p1、p2、q1、q2、r、s、t、u、v1、v2、w1、w2およびkは、好ましくは8≦(m+n+p1+p2+q1+q2+r+s+5)×k+t+u+v1+v2+w1+w2≦50を満たし、より好ましくは9≦(m+n+p1+p2+q1+q2+r+s+5)×k+t+u+v1+v2+w1+w2≦40を満たし、さらに好ましくは10≦(m+n+p1+p2+q1+q2+r+s+5)×k+t+u+v1+v2+w1+w2≦30を満たし、いっそう好ましくは10≦(m+n+p1+p2+q1+q2+r+s+5)×k+t+u+v1+v2+w1+w2≦20を満たす。
通常、アミノ酸残基数が多くなるほど製造コストが高くなるため、経済的な観点からは、アミノ酸残基の総数が少ない方が好ましい。
A−Y−H−L1−G−E−L2−V−W ・・・(1)
A−Y−H−R−G−E−L2−V−W ・・・(2)
(i)2つのアミノ酸配列のアラインメントを行う
一致(マッチ)は+1、不一致(ミスマッチ)は−1、ギャップは−1のスコアを与え、アラインメント・スコアが最大となるようにアラインメントを行う。
(ii)配列相同性を計算する
得られたアラインメントに基づいて、次式により配列相同性を計算する。
配列相同性[%]=(一致ポジション数/全ポジション数)×100[%]
全ポジション数はアラインメントの長さであり、一致ポジション数はアミノ酸の種類が一致するポジションの数である。
ここで、アミノ酸残基の種類が一致するか否かの判断は、そのアミノ酸残基の元になるアミノ酸の側鎖(アミノ酸側鎖)の構造が同一であるか否かによるものとする。なお、エナンチオマーの関係にあるアミノ酸の側鎖の構造は同一ではない。
(iii)配列相同性の計算例
例えば、次のアミノ酸配列を考える。
配列A AYHRGELVW
配列B AWHLGELVW
これを、上記した条件の下でアラインメントすると、次のようになる。ここで、配列A、B間でアミノ酸(残基)の種類が一致する箇所には、見やすくするため、ホモロジー・ストリング「|」を付けている。また、「−」はギャップである。
配列A AYHRGELVW
| | |||||
配列B AWHLGELVW
このアラインメントのスコアは、一致(+1)×7+不一致(−1)×2+ギャップ(−1)×0=5である。
この例では、全ポジション数は9であり、一致ポジション数は7であるから、上記式に従って算出した配列相同性は、7/9×100=77.8%である。
RN−Xv0−X6 t0−Xe0−X4 r0−Xp0−Xa−A−Y−H−X8−G−E−L−V−W−Xb−Xq0−X5 s0−Xf0−X7 u0−Xw0−RC ・・・(II)
式(II)中、Xa、Xb、X、RNおよびRCは、上記式(I)中におけるものと同義である。
また、式(II)中、Xe0は、式(I)中のXnと同様に、Xがe0個連結していることを意図する。Xf0、Xp0、Xq0、Xv0およびXw0についても同様である。
式(II)中、X6およびX7は、上記式(IB)中におけるものと同義である。
e0は、好ましくは0≦e0≦5を満たし、より好ましくは0≦e0≦3を満たし、さらに好ましくは0≦e0≦2を満たす。
f0は、好ましくは0≦f0≦5を満たし、より好ましくは0≦f0≦3を満たし、さらに好ましくは0≦f0≦2を満たす。
p0は、好ましくは0≦p0≦3を満たし、より好ましくは0≦p0≦2を満たす。
q0は、好ましくは0≦q0≦3を満たし、より好ましくは0≦q0≦2を満たす。
r0は、好ましくは0≦r0≦3を満たし、より好ましくは0≦r0≦2を満たす。
s0は、好ましくは0≦s0≦3を満たし、より好ましくは0≦s0≦2を満たす。
t0は、好ましくは0≦t0≦3を満たし、より好ましくは0≦t0≦2を満たす。
s0は、好ましくは0≦s0≦3を満たし、より好ましくは0≦s0≦2を満たす。
v0は、好ましくは0≦v0≦3を満たし、より好ましくは0≦v0≦2を満たす。
w0は、好ましくは0≦w0≦3を満たし、より好ましくは0≦w0≦2を満たす。
すなわち、式(II)中、e0、f0、p0、q0、r0、s0、t0、u0、v0およびw0は、0≦e0+f0+p0+q0+r0+s0+t0+u0+v0+w0≦39を満たし、好ましくは0≦e0+f0+p0+q0+r0+s0+t0+u0+v0+w0≦29を満たし、より好ましくは0≦e0+f0+p0+q0+r0+s0+t0+u0+v0+w0≦19を満たし、さらに好ましくは0≦e0+f0+p0+q0+r0+s0+t0+u0+v0+w0≦9を満たす。
3〜18)。
Asp-[Lys(N3)]-Ala-Tyr-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-[Bpg]-Thr-Lys-Lys (4)
Asp-[Bpg]-Ala-Tyr-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-[Lys(N3)]-Thr-Lys-Lys (5)
Asp-[Hpg]-Ala-Tyr-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-[Ala(N3)]-Thr-Lys-Lys (6)
Lys-Lys-Lys-Asp-[Hpg]-Ala-Tyr-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-[Ala(N3)]-Thr (7)
Asp-[Abu(N3)]-Ala-Tyr-His-Arg-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-[Pra]-Thr-Lys-Lys (8)
Asp-[Abu(N3)]-Ala-Tyr-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-[Pra]-Thr-Lys-Lys (9)
Asp-[Lys(N3)]-Ala-Tyr-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-[Hpg]-Thr-Lys-Lys (10)
Asp-[Pra]-Ala-Tyr-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-[Lys(N3)]-Thr-Lys-Lys (11)
Asp-[Lys(N3)]-Ala-Tyr-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-[Pra]-Thr-Lys-Lys (12)
Asp-[Abu(N3)]-Ala-Tyr-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-[Hpg]-Thr-Lys-Lys (13)
Asp-[Hpg]-Ala-Tyr-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-[Abu(N3)]-Thr-Lys-Lys (14)
Asp-[Abu(N3)]-Ala-Tyr-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-[Bpg]-Thr-Lys-Lys (15)
Asp-[Bpg]-Ala-Tyr-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-[Nva(N3)]-Thr-Lys-Lys (16)
Asp-[Hpg]-Ala-Tyr-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-[Nva(N3)]-Thr-Lys-Lys (17)
Asp-[Nva(N3)]-Ala-Tyr-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-[Bpg]-Thr-Lys-Lys (18)
本発明の環状ペプチドの合成方法は特に限定されるものではないが、例えば、有機合成化学的ペプチド合成方法または遺伝子工学的ペプチド合成方法によって合成することができる。
有機合成化学的ペプチド合成方法としては、液相合成法、固相合成法のいずれも用いることができる。本発明のポリペプチドの合成方法としては、全自動ペプチド合成装置を用いた固相合成法が簡便であり好ましい。
遺伝子工学的ペプチド合成方法は、細胞に遺伝子導入し、ペプチドを合成する方法である。細胞としては、細菌、線虫細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞および動物細胞等が用いられる。
例えば、4塩基コドン法を用いて、非天然アミノ酸を導入して合成することが可能である。また、鎖状ペプチドを合成し、環状部に導入されたアミノ酸残基の側鎖の架橋性官能基を反応させることにより環化し、合成できる。
本発明の環状ペプチドは、抗体結合性リガンド、抗体標識用リンカー、抗体薬物複合体用リンカーおよび薬物運搬体(医薬品用リンカー)等として用いることができる。ただし、これらに限定されるものではない。
本発明の環状ペプチドの用途は、アフィニティクロマトグラフィーの技術領域における抗体結合性リガンドとしての用途がある。
本発明の環状ペプチドの抗体結合性リガンド用途のアプリケーションとしては、例えば、本発明の環状ペプチドを水不溶性担体に固定化した、抗体または抗体誘導体の吸着材料およびアフィニティクロマトグラフィー担体を挙げることができる。
担体を臭化シアン、エピクロロヒドリン、ジグリシジルエーテル、トシルクロライド、トレシルクロライドまたはヒドラジン等と反応させて担体を活性化または担体表面に反応性官能基を導入し、リガンドとして固定化する化合物と反応、固定化する方法、また、担体とリガンドとして固定化する化合物が存在する系にカルボジイミドのような縮合試薬またはグリセルアルデヒドのように分子中に複数の官能基を持つ試薬を加えて縮合、架橋することによる固定化が挙げられる。
リガンドを固定化する際のpH条件は特に限定されず、酸性、中性およびアルカリ性のいずれでもよく、例えば、使用する溶媒(分散媒)に合わせて適宜設定することができる。
例えば、アルカリ性にする場合は、DBU(diazabicycloundecene;ジアザビシクロウンデセン)等の塩基をDMSO(dimethyl sulfoxide;ジメチルスルホキシド)やアルコールに添加してもよい。
本発明の環状ペプチドの用途は、イムノアッセイの技術領域においては、抗体標識用リンカーとしての用途がある。
本発明の環状ペプチドの抗体標識用リンカーとしての用途のアプリケーションとしては、抗体、標識化合物および本発明の環状ペプチドを含み、抗体と標識化合物とが本発明の環状ペプチドを介して結合している標識化抗体を挙げることができる。
イムノアッセイは、免疫反応(抗原抗体反応)を利用して、微量物質の検出および定量を行う分析方法であり、特異性が高く高感度であるという特徴を持つ。
イムノアッセイにおいて、微量物質(抗原)に結合した抗体(一次抗体)を検出するには、一次抗体に直接標識する方法および一次抗体に結合する抗体(二次抗体)に標識する方法等がある。本発明の環状ペプチドは、一次抗体に標識物質を結合させるためのリンカーとして用いることができるし、二次抗体に標識物質を結合させるためのリンカーとして用いることもできる。本発明の環状ペプチドは抗体結合性(IgG(Immunoglobulin G;免疫グロブリンG)結合性)を有するので、標識した本発明の環状ペプチドを、標識した二次抗体の代わりに用いることも可能である。
また、標識には多種あり、ラジオアイソトープを標識として用いる系を放射免疫測定法(RIA;radio immunoassay)、ペルオキシダーゼ等の酵素を標識として用いる系をEIA(enzyme immunoassay;酵素免疫測定法)、ルミノール等の化学発光物質を標識として用いる系をCLIA(chemiluminescent immunoassay;化学発光免疫測定法)、FITC(fluorescein isothiocyanate;フルオレセインイソチオシアネート)等の蛍光発光物質(蛍光色素)を標識物質として用いる系をFIA(fluorescent immunoassay;蛍光免疫測定法)という。本発明の環状ペプチドは、いずれの系においても、抗体標識用リンカーとして使用することができる。
イムノアッセイの検出感度を上げるためには、抗体1分子に多数の標識を付けることが必要であるが、従来の抗体標識用リンカーでは、多数結合した際に抗体の結合活性の低下を招き、かえってイムノアッセイの利点である特異性および感度を損なう可能性があった。しかし、本発明の環状ペプチドは、抗体に多数結合した場合であっても、抗体の構造的完全性を保持することができ、抗体の結合活性を低下させないので、多数結合した際にも、イムノアッセイの利点である特異性および感度を損なわず、検出感度を上げることが期待される。また、抗原抗体反応による結合であることから、従来困難であった標識後の分離も可能となり、標識の可逆操作が実現できる。
上記架橋剤としては、アミノ基間架橋剤、アミノ基−チオール基間架橋剤、カルボキシ基−アミノ基間架橋剤およびチオール基間架橋剤等が挙げられる。
上記アミノ基間架橋剤の例は、DSG(ジスクシンイミジルグルタラート)、DSS(ジスクシンイミジルスベラート)およびBS3(ビス(スルホスクシンイミジル)スベラート)、ならびにDMA(ジメチルアジピミダート)、DMP(ジメチルピメリミダート)およびDMS(ジメチルスベリミダート)などである。
上記アミノ基−チオール基間架橋剤の例は、SIA(スクシンイミジルヨードアセタート)、SBAP(スクシンイミジル−3−(ブロモアセタミド)プロピオナート)およびSIAB(スクシンイミジル(4−ヨードアセチル)アミノベンゾアート)、AMAS(N−α−マレイミドアセト−オキシスクシンイミドエステル)、BMPS(N−β−マレイミドプロピル−オキシスクシンイミドエステル)およびGMBS(N−γ−マレイミドブチリル−オキシスクシンイミドエステル)、ならびにSPDP(スクシンイミジル−3−(2−ピリジルジチオ)プロピオナート)、LC−SPDP(スクシンイミジル−6−(3(2−ピリジルジチオ)プロピオナミド)ヘキサノアート)およびSMPT(4−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−(2−ピリジルジチオ)トルエン)などである。
上記カルボキシ基−アミノ基間架橋剤の例は、EDC(1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドヒドロクロリド)、NHS(N−ヒドロキシスクシンイミド)およびSulfo−NHS(スルホ−N−ヒドロキシスルホスクシンイミド)などである。
上記チオール基間架橋剤の例は、BMOE(ビスマレイミドエタン)、BMB(1,4−ビスマレイミドブタン)およびBMH(ビスマレイミドヘキサン)などである。
CCAP法は、本発明の環状ペプチドの側鎖アミノ基または側鎖チオール基等の官能基に、抗体の側鎖アミノ基または側鎖チオール基等の官能基と反応性の官能基(「反応性官能基」という。)を有する基を導入しておき、まず、本発明の環状ペプチドと抗体とを抗原抗体反応で結合し、次いで、環状ペプチドに導入した反応性官能基と抗体のアミノ基またはチオール基等の官能基とカップリングさせることで、共有結合を形成する方法である。
上記反応性官能基の例は、アミノ基と反応性のNHS−エステル基およびイミドエステル基、ならびにチオール基と反応性のマレイミド基およびハロアセチル基などである。
CCAP法は、弱酸性から中性の条件下で、迅速かつ定量的に反応が進行するため、本発明の環状ペプチド、抗体および標識の安定性および親和性を損なわない。
本発明の環状ペプチドの用途は、抗体薬物複合体の技術領域においては、抗体薬物複合体用リンカーとしての用途がある。
本発明の環状ペプチドの抗体薬物複合体用リンカーとしての用途のアプリケーションとしては、例えば、抗体、薬物および本発明の環状ペプチドを含み、抗体と薬物とが本発明の環状ペプチドを介して結合している抗体薬物複合体を挙げることができる。
ADC(Antibody Drug Conjugate;抗体薬物複合体)は、別名、武装抗体(Armed Antibody)とも呼ばれ、細胞を認識する抗体と活性本体である薬物(低分子薬物)とを、適切なリンカーで結合した医薬である。抗体薬物複合体の作用機序は、概ね、以下のとおりである。
(1)標的細胞表面の標的分子に抗体薬物複合体の抗体部分が結合する。
(2)抗体薬物複合体が細胞内に取り込まれる。
(3)細胞内で抗体薬物複合体のリンカーが切断される。
(4)細胞内で薬物(低分子薬物)の薬効が発揮される。
抗体薬物複合体では、抗体が標的とする分子が発現している細胞でのみ薬効が発揮されるため、全身の副作用を抑え、標的細胞に集中して薬効を発揮できるため、薬物単体に比べて、よく効き、副作用が少ない。例えば、細胞***が盛んながん細胞を攻撃することを目的として開発された抗がん剤は、同様に盛んな細胞***で機能を維持している細胞、具体的には、免疫を担当する細胞、消化管の細胞、毛根の細胞等も攻撃してしまうため、副作用として、感染症に弱くなり、下痢を起こし、頭髪が抜け落ちる等の症状が現れることがある。しかし、抗体薬物複合体では、標的のがん細胞に選択的に抗がん剤を運搬することができるので、抗がん剤が標的細胞以外の細胞を攻撃することによる副作用を抑えることができる。
また、本発明の環状ペプチドは従来の環状ペプチドよりも経時安定性が高いことから、抗体薬物複合体用リンカーおよび抗体薬物複合体の血中での安定性も向上することが期待される。
さらに、環状部であるトリアゾール結合の側鎖部分を変更することにより、細胞内での薬物放出性を制御することが期待される。
上記架橋剤としては、アミノ基間架橋剤、アミノ基−チオール基間架橋剤、カルボキシ基−アミノ基間架橋剤およびチオール基間架橋剤等が挙げられる。
上記アミノ基間架橋剤の例は、DSG(ジスクシンイミジルグルタラート)、DSS(ジスクシンイミジルスベラート)およびBS3(ビス(スルホスクシンイミジル)スベラート)、ならびにDMA(ジメチルアジピミダート)、DMP(ジメチルピメリミダート)およびDMS(ジメチルスベリミダート)などである。
上記アミノ基−チオール基間架橋剤の例は、SIA(スクシンイミジルヨードアセタート)、SBAP(スクシンイミジル−3−(ブロモアセタミド)プロピオナート)およびSIAB(スクシンイミジル(4−ヨードアセチル)アミノベンゾアート)、AMAS(N−α−マレイミドアセト−オキシスクシンイミドエステル)、BMPS(N−β−マレイミドプロピル−オキシスクシンイミドエステル)およびGMBS(N−γ−マレイミドブチリル−オキシスクシンイミドエステル)、ならびにSPDP(スクシンイミジル−3−(2−ピリジルジチオ)プロピオナート)、LC−SPDP(スクシンイミジル−6−(3(2−ピリジルジチオ)プロピオナミド)ヘキサノアート)およびSMPT(4−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−(2−ピリジルジチオ)トルエン)などである。
上記カルボキシ基−アミノ基間架橋剤の例は、EDC(1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドヒドロクロリド)、NHS(N−ヒドロキシスクシンイミド)およびSulfo−NHS(スルホ−N−ヒドロキシスルホスクシンイミド)などである。
上記チオール基間架橋剤の例は、BMOE(ビスマレイミドエタン)、BMB(1,4−ビスマレイミドブタン)およびBMH(ビスマレイミドヘキサン)などである。
CCAP法は、本発明の環状ペプチドの側鎖アミノ基または側鎖チオール基等の官能基に、抗体の側鎖アミノ基または側鎖チオール基等の官能基と反応性の官能基(「反応性官能基」という。)を有する基を導入しておき、まず、本発明の環状ペプチドと抗体とを抗原抗体反応で結合し、次いで、環状ペプチドに導入した反応性官能基と抗体のアミノ基またはチオール基等の官能基とカップリングさせることで、共有結合を形成する方法である。
上記反応性官能基の例は、アミノ基と反応性のNHS−エステル基およびイミドエステル基、ならびにチオール基と反応性のマレイミド基およびハロアセチル基などである。
CCAP法は、弱酸性から中性の条件下で、迅速かつ定量的に反応が進行するため、本発明の環状ペプチド、抗体および薬物の安定性および親和性を損なわない。
薬物は、リポソーム化、高分子ミセル化またはPEG化されることにより、多くの場合において有効成分の生体内安定性、組織移行性プロファイルをはじめとする薬物動態および細胞内動態等の改善が図られる。
本発明の環状ペプチドの用途は、ドラッグデリバリーシステムにおける薬物運搬体としての用途がある。
本発明の環状ペプチドの薬物運搬体としての用途のアプリケーションとしては、例えば、薬物および本発明の環状ペプチドを含み、薬物と本発明の環状ペプチドとが直接または間接的に結合している医薬製剤を挙げることができる。
本発明の環状ペプチドが生体内に存在するIgGに結合することにより、上記した抗体医薬複合体と同様の効果を期待することができる。薬物はそのまま環状ペプチドと結合していてもよいし、リポソーム化、高分子ミセル化またはPEG(ポリエチレングリコール)化された薬物として、環状ペプチドと結合していてもよい。また、デキストランのような多糖類や親水性ポリマーを介して環状ペプチドと結合していてもよい。
(1)環状ペプチドの合成
全自動ペプチド合成装置(PSSM−8、島津製作所社製)を用いて、下記式(3)で表される環状ポリペプチド(配列番号3)を合成した。以下、この環状ペプチドを「環状ペプチド1」という場合がある。
Asp-[Lys(N3)]-Ala-Tyr-His-Arg-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-[Bpg]-Thr-Lys-Lys (3)
式(3)中、[Lys(N3)]はε−アジド−L−リシンに由来するアミノ酸残基を表し、[Bpg]はL−ビスホモプロパルギルグリシンに由来するアミノ酸残基を表し、[Lys(N3)]と[Bpg]は側鎖アジド基と側鎖エチニル基との環化付加反応により形成されたトリアゾール結合を介して架橋している(下記化学式参照)。
なお、上記化学式中「*」は隣接するアミノ酸残基との結合点を表す。
GEヘルスケア社製の表面プラズモン共鳴装置であるBiacore3000(Biacoaは登録商標)に市販のCM5(カルボキシメチルデキストラン導入タイプ、GEヘルスケア社製)センサーチップをセットし、SPR(surface plasmon resonance;表面プラズモン共鳴)用HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid;ヘペス)緩衝液(20mM HEPES−HCl、150mM NaCl、pH7.4)を10μL/minの流速で安定させ、0.2MのEDC(1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide;1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミド)と0.04MのNHS(N-Hydroxysuccinimide;N−ヒドロキシコハク酸イミド)混合水溶液を70μL注入した。その後、HEPES緩衝液にて0.2g/Lに希釈し、0.20μm径のPTFE(polytetrafluoroethylene)フィルター(ADVANTEC社製)で処理した環状ペプチド1の試料液100μLを、センサーチップに供給した。次いで、試料液にエタノールアミン水溶液によってブロッキング処理を施し、水酸化ナトリウム水溶液にて洗浄して、固定化を行った。同様に、上記センサーチップの別流路に試料を固定化せず、0.2MのEDCと0.04MのNHS混合水溶液を70μL添加した後、ブロッキング処理と洗浄処理を行った。得られた固定化センサーチップを、以下「固定化センサーチップA」という。
上記(2)で作製した固定化センサーチップAに、25℃にて3000nMのヒトIgG(Immunoglobulin G;免疫グロブリンG)抗体を10分間添加した。次いで、添加直後の環状ペプチドを固定化した流路と未固定の流路の抗体結合量を測定した。環状ペプチドを固定化した流路と未固定の流路の抗体結合量の差分と、環状ペプチドの固定化量とから環状ペプチドの活性を算出し、さらに、比較例1の環状ペプチド5の活性を1とした時のヒトIgG抗体との相対結合活性を算出した。
(相対結合活性の評価基準)
相対結合活性が8倍超・・・・・・・・・・・・・・・A
相対結合活性が4倍超、8倍以下・・・・・・・・・・B
相対結合活性が2倍超、4倍以下・・・・・・・・・・C
相対結合活性が1倍超、2倍以下・・・・・・・・・・D
相対結合活性が1倍以下・・・・・・・・・・・・・・E
評価結果を表3の「相対結合活性」の欄に示す。
評価A、BおよびCは本固定化による改善効果が十分であることを表し、評価DおよびEは十分な結合活性が見られないことを表す。十分な結合活性を示す環状ペプチドを用いることにより、抗体と特異的に結合することができ、より効率的に抗体を精製することが可能となり、抗体の精製コストをより低減することができる。
HiTrap NHS-activated HP Columns(リガンド固定化用カップリングカラム、GEヘルスケア社製)(HITRAPは登録商標)1mLに環状ペプチド1を固定化バッファー(10%DMSO in 200mM NaHCO3、500mM NaCl、pH8.3)に溶解して調製した10mg/mL環状ペプチド液1mLを25℃で1時間反応させる。これをエタノールアミン水溶液でブロッキング、洗浄し、環状ペプチド1の固定化担体を得た。得られた固定化担体を、以下「固定化担体A」という。
上記(4)で作製した固定化担体Aに、クロマトシステムAKTA avant 25(GEヘルスケア社製)(AKTAAVANTは登録商標)を接続し、抗体結合量の測定を行った。カラムを平衡化液(20mMリン酸バッファー、150mM NaCl、pH7.4)で平衡化した後に、5mg/mLのヒトIgG抗体標準バッファー(20mMリン酸バッファー、150mM NaCl、pH7.4)溶液20mLを流速0.21mL/minにて注入した。その後、負荷後洗浄液(20mMリン酸バッファー、150mM NaCl、pH7.4)を同じ流速で5mL流して洗浄した後に、溶出前洗浄液(20mMリン酸バッファー、1M NaCl、pH7.4)を同じ流速で5mL流した。その後、溶出液(100mMクエン酸バッファー、pH3.2)を同じ流速で5mL流した。さらに連続して、CIP(cleaning in place;定置洗浄)液(0.1M水酸化ナトリウム)を同じ流速で5mLを流し、その後再平衡化液(20mMリン酸バッファー、150mM NaCl、pH7.4)を同じ流速で5mL流した。このとき、280nmの吸光度をモニタリングして得られたIgG(Immunoglobulin G;免疫グロブリンG)溶出ピークより、抗体原液の10%が担体から漏れ出すまでに担体に抗体が結合した量を抗体結合量として測定した。次に、固定化担体Aを0.05M NaOH水溶液に25℃で6時間満たして静置した後、同様に担体の抗体結合量を測定し、アルカリ処理前後の抗体結合量から結合量変化率を算出した。
(結合量変化率の評価基準)
結合量変化率が90%超・・・・・・・・・・・・・・・A
結合量変化率が80%超、90%以下・・・・・・・・・B
結合量変化率が70%超、80%以下・・・・・・・・・C
結合量変化率が50%超、70%以下・・・・・・・・・D
結合量変化率が50%以下・・・・・・・・・・・・・・E
評価結果を表3の「薬品耐性」の欄に示す。
評価A、BおよびCは薬品耐性が十分であることを表し、評価DおよびEは十分な薬品耐性が見られないことを表す。十分な薬品耐性を示す環状ペプチドを用いることにより、洗浄後も抗体と特異的に繰り返し結合することができ、長期間、抗体を精製することが可能となり、抗体の精製コストをより低減することができる。
環状ペプチド1のヒト血漿(ProMedDx社製)中での安定性を評価した。
5μMの環状ペプチド1水溶液を調製し、20μLのヒト血漿に2μL添加して、室温で20分間放置した。20分後、そこへメタノール(和光純薬工業社製)を100μL添加して反応を停止した。撹拌後、溶液を遠心分離し、上清を採取し、これを20分サンプルとした。一方、20μLのヒト血漿にメタノールを100μL添加した後、環状ペプチド水溶液を2μL添加、撹拌、遠心分離し上清を採取したものを0分サンプルとした。
0分サンプルおよび20分サンプルを、質量分析装置TRIPLE QUAD 5500(AB SCIEX社製)を用いて環状ペプチド1の含有量を定量した。0分サンプルの定量値を100%としたときの20分サンプル定量値を残存率として算出した。
結合量変化率が90%超・・・・・・・・・・・・・・・A
結合量変化率が80%超、90%以下・・・・・・・・・B
結合量変化率が70%超、80%以下・・・・・・・・・C
結合量変化率が50%超、70%以下・・・・・・・・・D
結合量変化率が50%以下・・・・・・・・・・・・・・E
環状ペプチドの構造および評価結果を表3の「血漿中安定性」の欄に示す。
(1)実施例1に準じて、下記式(4)で表される環状ペプチド(配列番号4)を合成した。以下、この環状ペプチドを「環状ペプチド2」という場合がある。
Asp-[Lys(N3)]-Ala-Tyr-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-[Bpg]-Thr-Lys-Lys (4)
式(4)中、[Lys(N3)]はε−アジド−L−リシンに由来するアミノ酸残基を表し、[Bpg]
はL−ビスホモプロパルギルグリシンに由来するアミノ酸残基を表し、[Lys(N3)]と[Bpg]は側鎖アジド基と側鎖エチニル基との環化付加反応により形成されたトリアゾール結合を介して架橋している(下記化学式参照)。
なお、上記化学式中「*」は隣接するアミノ酸残基との結合点を表す。
(2)環状ペプチド1の代わりに環状ペプチド2を用いたこと以外は、実施例1と同様にして、固定化センサーチップBを得た。
(3)実施例1と同様にして、結合活性を評価した。評価結果を表3の「相対結合活性」の欄に示す。
(4)環状ペプチド1の代わりに環状ペプチド2を用いたこと以外は、実施例1と同様にして、固定化担体Bを得た。
(5)実施例1と同様にして、薬品耐性を評価した。評価結果を表3の「薬品耐性」の欄に示す。
(6)実施例1と同様にして、ヒト血漿中の環状ペプチド2の安定性評価を行った。評価結果を表3の「血漿中安定性」の欄に示す。
(1)実施例1に準じて、下記式(5)で表される環状ペプチド(配列番号5)を合成した。以下、この環状ペプチドを「環状ペプチド3」という場合がある。
Asp-[Bpg]-Ala-Tyr-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-[Lys(N3)]-Thr-Lys-Lys (5)
式(5)中、[Bpg]はL−ビスホモプロパルギルグリシンに由来するアミノ酸残基を表し、[Lys(N3)]はε−アジド−L−リシンに由来するアミノ酸残基を表し、[Bpg]と[Lys(N3)]
は側鎖エチニル基と側鎖アジド基との環化付加反応により形成されたトリアゾール結合を介して架橋している。
(2)環状ペプチド1の代わりに環状ペプチド3を用いたこと以外は、実施例1と同様にして、固定化センサーチップCを得た。
(3)実施例1と同様にして、結合活性を評価した。評価結果を表3の「相対結合活性」の欄に示す。
(4)環状ペプチド1の代わりに環状ペプチド3を用いたこと以外は、実施例1と同様にして、固定化担体Cを得た。
(5)実施例1と同様にして、薬品耐性を評価した。評価結果を表3の「薬品耐性」の欄に示す。
(1)実施例1に準じて、下記式(6)で表される環状ペプチド(配列番号6)を合成した。以下、この環状ペプチドを「環状ペプチド4」という場合がある。
Asp-[Hpg]-Ala-Tyr-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-[Ala(N3)]-Thr-Lys-Lys (6)
式(6)中、[Hpg]はL−ホモプロパルギルグリシンに由来するアミノ酸残基を表し、[Ala(N3)]はβ−アジド−L−アラニンに由来するアミノ酸残基を表し、[Hpg]と[Ala(N3)]は側鎖エチニル基と側鎖アジド基との環化付加反応により形成されたトリアゾール結合を介して架橋している(下記化学式参照)。
なお、上記化学式中「*」は隣接するアミノ酸残基との結合点を表す。
(2)環状ペプチド1の代わりに環状ペプチド4を用いたこと以外は、実施例1と同様にして、固定化センサーチップDを得た。
(3)実施例1と同様にして、結合活性を評価した。評価結果を表3の「相対結合活性」の欄に示す。
(4)環状ペプチド1の代わりに環状ペプチド4を用いたこと以外は、実施例1と同様にして、固定化担体Dを得た。
(5)実施例1と同様にして、薬品耐性を評価した。評価結果を表3の「薬品耐性」の欄に示す。
(6)実施例1と同様にして、ヒト血漿中の環状ペプチド4の安定性評価を行った。評価結果を表3の「血漿中安定性」の欄に示す。
(1)実施例1に準じて、下記式(7)で表される環状ペプチド(配列番号7)を合成した。以下、この環状ペプチドを「環状ペプチド5」という場合がある。
Lys-Lys-Lys-Asp-[Hpg]-Ala-Tyr-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-[Ala(N3)]-Thr (7)
式(7)中、[Hpg]はL−ホモプロパルギルグリシンに由来するアミノ酸残基を表し、[Ala(N3)]はβ−アジド−L−アラニンに由来するアミノ酸残基を表し、[Hpg]と[Ala(N3)]は側鎖エチニル基と側鎖アジド基との環化付加反応により形成されたトリアゾール結合を介して架橋している。
(2)環状ペプチド1の代わりに環状ペプチド5を用いたこと以外は、実施例1と同様にして、固定化センサーチップEを得た。
(3)実施例1と同様にして、結合活性を評価した。評価結果を表3の「相対結合活性」の欄に示す。
(4)環状ペプチド1の代わりに環状ペプチド5を用いたこと以外は、実施例1と同様にして、固定化担体Eを得た。
(5)実施例1と同様にして、薬品耐性を評価した。評価結果を表3の「薬品耐性」の欄に示す。
(1)実施例1に準じて、下記式(8)で表される環状ペプチド(配列番号8)を合成した。以下、この環状ペプチドを「環状ペプチド6」という場合がある。
Asp-[Abu(N3)]-Ala-Tyr-His-Arg-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-[Pra]-Thr-Lys-Lys (8)
式(8)中、[Abu(N3)]はγ−アジド−L−ホモアラニンに由来するアミノ酸残基を表し、[Pra]はL−ホモプロパルギルグリシンに由来するアミノ酸残基を表し、[Abu(N3)]と[Pra]は側鎖アジド基と側鎖エチニル基との環化付加反応により形成されたトリアゾール結合を介して架橋している。
(2)環状ペプチド1の代わりに環状ペプチド6を用いたこと以外は、実施例1と同様にして、固定化センサーチップFを得た。
(3)実施例1と同様にして、結合活性を評価した。評価結果を表3の「相対結合活性」の欄に示す。
(4)環状ペプチド1の代わりに環状ペプチド6を用いたこと以外は、実施例1と同様にして、固定化担体Fを得た。
(5)実施例1と同様にして、薬品耐性を評価した。評価結果を表3の「薬品耐性」の欄に示す。
(1)実施例1に準じて、下記式(9)で表される環状ペプチド(配列番号9)を合成した。以下、この環状ペプチドを「環状ペプチド7」という場合がある。
Asp-[Abu(N3)]-Ala-Tyr-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-[Pra]-Thr-Lys-Lys (9)
式(9)中、[Abu(N3)]はγ−アジド−L−ホモアラニンに由来するアミノ酸残基を表し、[Pra]はL−プロパルギルグリシンに由来するアミノ酸残基を表し、[Abu(N3)]と[Pra]は側鎖アジド基と側鎖エチニル基との環化付加反応により形成されたトリアゾール結合を介して架橋している。
(2)環状ペプチド1の代わりに環状ペプチド7を用いたこと以外は、実施例1と同様にして、固定化センサーチップGを得た。
(3)実施例1と同様にして、結合活性を評価した。評価結果を表3の「相対結合活性」の欄に示す。
(4)環状ペプチド1の代わりに環状ペプチド7を用いたこと以外は、実施例1と同様にして、固定化担体Gを得た。
(5)実施例1と同様にして、薬品耐性を評価した。評価結果を表3の「薬品耐性」の欄に示す。
(1)実施例1に準じて、下記式(10)で表される環状ペプチド(配列番号10)を合成した。以下、この環状ペプチドを「環状ペプチド8」という場合がある。
Asp-[Lys(N3)]-Ala-Tyr-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-[Hpg]-Thr-Lys-Lys (10)
式(10)中、[Lys(N3)]はε−アジド−L−リシンに由来するアミノ酸残基を表し、[Hpg]はL−ホモプロパルギルグリシンに由来するアミノ酸残基を表し、[Lys(N3)]と[Hpg]は側鎖アジド基と側鎖エチニル基との環化付加反応により形成されたトリアゾール結合を介して架橋している。
(2)環状ペプチド1の代わりに環状ペプチド8を用いたこと以外は、実施例1と同様にして、固定化センサーチップHを得た。
(3)実施例1と同様にして、結合活性を評価した。評価結果を表3の「相対結合活性」の欄に示す。
(4)環状ペプチド1の代わりに環状ペプチド8を用いたこと以外は、実施例1と同様にして、固定化担体Hを得た。
(5)実施例1と同様にして、薬品耐性を評価した。評価結果を表3の「薬品耐性」の欄に示す。
(1)実施例1に準じて、下記式(11)で表される環状ペプチド(配列番号11)を合成した。以下、この環状ペプチドを「環状ペプチド9」という場合がある。
Asp-[Pra]-Ala-Tyr-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-[Lys(N3)]-Thr-Lys-Lys (11)
式(11)中、[Pra]はL−プロパルギルグリシンに由来するアミノ酸残基を表し、[Lys(N3)]はε−アジド−L−リシンに由来するアミノ酸残基を表し、[Pra]と[Lys(N3)]は側鎖エチニル基と側鎖アジド基との環化付加反応により形成されたトリアゾール結合を介して架橋している。
(2)環状ペプチド1の代わりに環状ペプチド9を用いたこと以外は、実施例1と同様にして、固定化センサーチップIを得た。
(3)実施例1と同様にして、結合活性を評価した。評価結果を表3の「相対結合活性」の欄に示す。
(4)環状ペプチド1の代わりに環状ペプチド9を用いたこと以外は、実施例1と同様にして、固定化担体Iを得た。
(5)実施例1と同様にして、薬品耐性を評価した。評価結果を表3の「薬品耐性」の欄に示す。
(1)実施例1に準じて、下記式(12)で表される環状ペプチド(配列番号12)を合成した。以下、この環状ペプチドを「環状ペプチド10」という場合がある。
Asp-[Lys(N3)]-Ala-Tyr-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-[Pra]-Thr-Lys-Lys (12)
式(12)中、[Lys(N3)]はε−アジド−L−リシンに由来するアミノ酸残基を表し、[Pra]はL−プロパルギルグリシンに由来するアミノ酸残基を表し、[Lys(N3)]と[Pra]は側鎖アジド基と側鎖エチニル基との環化付加反応により形成されたトリアゾール結合を介して架橋している。
(2)環状ペプチド1の代わりに環状ペプチド10を用いたこと以外は、実施例1と同様にして、固定化センサーチップJを得た。
(3)実施例1と同様にして、結合活性を評価した。評価結果を表3の「相対結合活性」の欄に示す。
(4)環状ペプチド1の代わりに環状ペプチド10を用いたこと以外は、実施例1と同様にして、固定化担体Jを得た。
(5)実施例1と同様にして、薬品耐性を評価した。評価結果を表3の「薬品耐性」の欄に示す。
(1)実施例1に準じて、下記式(13)で表される環状ペプチド(配列番号13)を合成した。以下、この環状ペプチドを「環状ペプチド11」という場合がある。
Asp-[Abu(N3)]-Ala-Tyr-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-[Hpg]-Thr-Lys-Lys (13)
式(13)中、[Abu(N3)]はγ−アジド−L−ホモアラニンに由来するアミノ酸残基を表し、[Hpg]はL−ホモプロパルギルグリシンに由来するアミノ酸残基を表し、[Abu(N3)]と[Hpg]は側鎖アジド基と側鎖エチニル基との環化付加反応により形成されたトリアゾール結合を介して架橋している。
(2)環状ペプチド1の代わりに環状ペプチド11を用いたこと以外は、実施例1と同様にして、固定化センサーチップKを得た。
(3)実施例1と同様にして、結合活性を評価した。評価結果を表3の「相対結合活性」の欄に示す。
(4)環状ペプチド1の代わりに環状ペプチド11を用いたこと以外は、実施例1と同様にして、固定化担体Kを得た。
(5)実施例1と同様にして、薬品耐性を評価した。評価結果を表3の「薬品耐性」の欄に示す。
(1)実施例1に準じて、下記式(14)で表される環状ペプチド(配列番号14)を合成した。以下、この環状ペプチドを「環状ペプチド12」という場合がある。
Asp-[Hpg]-Ala-Tyr-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-[Abu(N3)]-Thr-Lys-Lys (14)
式(14)中、[Hpg]はL−ホモプロパルギルグリシンに由来するアミノ酸残基を表し、[Abu(N3)]はγ−アジド−L−ホモアラニンに由来するアミノ酸残基を表し、[Hpg]と[Abu(N3)]は側鎖エチニル基と側鎖アジド基との環化付加反応により形成されたトリアゾール結合を介して架橋している。
(2)環状ペプチド1の代わりに環状ペプチド12を用いたこと以外は、実施例1と同様にして、固定化センサーチップLを得た。
(3)実施例1と同様にして、結合活性を評価した。評価結果を表3の「相対結合活性」の欄に示す。
(4)環状ペプチド1の代わりに環状ペプチド12を用いたこと以外は、実施例1と同様にして、固定化担体Lを得た。
(5)実施例1と同様にして、薬品耐性を評価した。評価結果を表3の「薬品耐性」の欄に示す。
(1)実施例1に準じて、下記式(15)で表される環状ペプチド(配列番号15)を合成した。以下、この環状ペプチドを「環状ペプチド13」という場合がある。
Asp-[Abu(N3)]-Ala-Tyr-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-[Bpg]-Thr-Lys-Lys (15)
式(15)中、[Abu(N3)]はγ−アジド−L−ホモアラニンに由来するアミノ酸残基を表し、[Bpg]はL−ビスホモプロパルギルグリシンに由来するアミノ酸残基を表し、[Abu(N3)]と[Bpg]は側鎖アジド基と側鎖エチニル基との環化付加反応により形成されたトリアゾール結合を介して架橋している。
(2)環状ペプチド1の代わりに環状ペプチド13を用いたこと以外は、実施例1と同様にして、固定化センサーチップMを得た。
(3)実施例1と同様にして、結合活性を評価した。評価結果を表3の「相対結合活性」の欄に示す。
(4)環状ペプチド1の代わりに環状ペプチド13を用いたこと以外は、実施例1と同様にして、固定化担体Mを得た。
(5)実施例1と同様にして、薬品耐性を評価した。評価結果を表3の「薬品耐性」の欄に示す。
(1)実施例1に準じて、下記式(16)で表される環状ペプチド(配列番号16)を合成した。以下、この環状ペプチドを「環状ペプチド14」という場合がある。
Asp-[Bpg]-Ala-Tyr-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-[Nva(N3)]-Thr-Lys-Lys (16)
式(16)中、[Bpg]はL−ビスホモプロパルギルグリシンに由来するアミノ酸残基を表し、[Nva(N3)]はδ−アジド−L−ノルバリンに由来するアミノ酸残基を表し、[Bpg]と[Nva(N3)]は側鎖エチニル基と側鎖アジド基との環化付加反応により形成されたトリアゾール結合を介して架橋している。
(2)環状ペプチド1の代わりに環状ペプチド14を用いたこと以外は、実施例1と同様にして、固定化センサーチップNを得た。
(3)実施例1と同様にして、結合活性を評価した。評価結果を表3の「相対結合活性」の欄に示す。
(4)環状ペプチド1の代わりに環状ペプチド14を用いたこと以外は、実施例1と同様にして、固定化担体Nを得た。
(5)実施例1と同様にして、薬品耐性を評価した。評価結果を表3の「薬品耐性」の欄に示す。
(1)実施例1に準じて、下記式(17)で表される環状ペプチド(配列番号17)を合成した。以下、この環状ペプチドを「環状ペプチド15」という場合がある。
Asp-[Hpg]-Ala-Tyr-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-[Nva(N3)]-Thr-Lys-Lys (17)
式(17)中、[Hpg]はL−ホモプロパルギルグリシンに由来するアミノ酸残基を表し、[Nva(N3)]はδ−アジド−L−ノルバリンに由来するアミノ酸残基を表し、[Hpg]と[Nva(N3)]は側鎖エチニル基と側鎖アジド基との環化付加反応により形成されたトリアゾール結合を介して架橋している。
(2)環状ペプチド1の代わりに環状ペプチド15を用いたこと以外は、実施例1と同様にして、固定化センサーチップPを得た。
(3)実施例1と同様にして、結合活性を評価した。評価結果を表3の「相対結合活性」の欄に示す。
(4)環状ペプチド1の代わりに環状ペプチド15を用いたこと以外は、実施例1と同様にして、固定化担体Pを得た。
(5)実施例1と同様にして、薬品耐性を評価した。評価結果を表3の「薬品耐性」の欄に示す。
(1)実施例1に準じて、下記式(18)で表される環状ペプチド(配列番号18)を合成した。以下、この環状ペプチドを「環状ペプチド16」という場合がある。
Asp-[Nva(N3)]-Ala-Tyr-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-[Bpg]-Thr-Lys-Lys (18)
式(18)中、[Nva(N3)]はδ−アジド−L−ノルバリンに由来するアミノ酸残基を表し、[Bpg]はL−ビスホモプロパルギルグリシンに由来するアミノ酸残基を表し、[Nva(N3)] と[Bpg]は側鎖アジド基と側鎖エチニル基との環化付加反応により形成されたトリアゾール結合を介して架橋している。
(2)環状ペプチド1の代わりに環状ペプチド16を用いたこと以外は、実施例1と同様にして、固定化センサーチップQを得た。
(3)実施例1と同様にして、結合活性を評価した。評価結果を表3の「相対結合活性」の欄に示す。
(4)環状ペプチド1の代わりに環状ペプチド16を用いたこと以外は、実施例1と同様にして、固定化担体Qを得た。
(5)実施例1と同様にして、薬品耐性を評価した。評価結果を表3の「薬品耐性」の欄に示す。
(1)全自動ペプチド合成装置(PSSM−8、島津製作所社製)を用いて、下記式(19)で表される環状ペプチド(配列番号19)を合成した。以下、この環状ペプチドを「環状ペプチド17」という場合がある。
Asp-[Glu]-Ala-Tyr-His-Arg-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-[Lys]-Thr-Lys-Lys (19)
式(19)中、[Glu]はL−グルタミン酸に由来するアミノ酸残基を表し、[Lys]はL−リシンに由来するアミノ酸残基を表し、[Glu]と[Lys]は側鎖カルボキシ基と側鎖アミノ基との脱水縮合により形成されたアミド結合を介して架橋している(下記化学式参照)。
なお、上記化学式中「*」は隣接するアミノ酸残基との結合点を表す。
(2)環状ペプチド1の代わりに環状ペプチド17を用いたこと以外は、実施例1と同様にして、固定化センサーチップRを得た。
(3)実施例1と同様にして、結合活性を評価した。評価結果を表3の「相対結合活性」の欄に示す。
(4)環状ペプチド1の代わりに環状ペプチド17を用いたこと以外は、実施例1と同様にして、固定化担体Rを得た。
(5)実施例1と同様にして、薬品耐性を評価した。評価結果を表3の「薬品耐性」の欄に示す。
(6)実施例1と同様にして、ヒト血漿中の環状ペプチド17の安定性評価を行った。評価結果を表3の「血漿中安定性」の欄に示す。
(1)比較例1と同様にして、下記式(20)で表される環状ペプチド(配列番号20)を合成した。以下、この環状ペプチドを「環状ペプチド18」という場合がある。
Asp-[Glu]-Ala-Tyr-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-[Lys]-Thr-Lys-Lys (20)
式(20)中、[Glu]はL−グルタミン酸に由来するアミノ酸残基を表し、[Lys]はL−リシンに由来するアミノ酸残基を表し、[Glu]と[Lys]は側鎖カルボキシ基と側鎖アミノ基との脱水縮合により形成されたアミド結合を介して架橋している。
(2)環状ペプチド1の代わりに環状ペプチド18を用いたこと以外は、実施例1と同様にして、固定化センサーチップSを得た。
(3)実施例1と同様にして、結合活性を評価した。評価結果を表3の「相対結合活性」の欄に示す。
(4)環状ペプチド1の代わりに環状ペプチド18を用いたこと以外は、実施例1と同様にして、固定化担体Sを得た。
(5)実施例1と同様にして、薬品耐性を評価した。評価結果を表3の「薬品耐性」の欄に示す。
(6)実施例1と同様にして、ヒト血漿中の環状ペプチド18の安定性評価を行った。評価結果を表3の「血漿中安定性」の欄に示す。
(1)全自動ペプチド合成装置(PSSM−8、島津製作所社製)を用いて、下記式(21)で表される環状ペプチド(配列番号21)を合成した。以下、この環状ペプチドを「環状ペプチド19」という場合がある。
Asp-[Cys]-Ala-Tyr-His-Arg-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-[Cys]-Thr-Lys-Lys (21)
式(21)中、[Cys]はL−システインに由来するアミノ酸残基を表し、2つの[Cys]は側鎖チオール基の酸化により形成されたジスルフィド結合を介して架橋している(下記化学式参照)。
なお、上記化学式中「*」は隣接するアミノ酸残基との結合点を表す。
(2)環状ペプチド1の代わりに環状ペプチド19を用いたこと以外は、実施例1と同様にして、固定化センサーチップTを得た。
(3)実施例1と同様にして、結合活性を評価した。評価結果を表3の「相対結合活性」の欄に示す。
(4)環状ペプチド1の代わりに環状ペプチド19を用いたこと以外は、実施例1と同様にして、固定化担体Tを得た。
(5)実施例1と同様にして、薬品耐性を評価した。評価結果を表3の「薬品耐性」の欄に示す。
以下の表3に実施例・比較例の性能評価の結果を示す。
《実施例1〜16および比較例1〜3》
実施例1〜16は、相対結合活性がC評価以上で、薬品耐性がB評価以上であった。すなわち、実施例1〜16は、抗体結合性が十分であり、薬品耐性が優れていた。なかでも、実施例1〜5、11および12は、相対結合活性および薬品耐性がいずれもA評価であり、特に優れていた。
これに対して、アミド結合により架橋している比較例1および2は、薬品耐性がB評価であり、薬品耐性は十分であったが、相対結合活性がE評価であり、抗体結合活性が劣っていた。また、ジスルフィド結合により架橋している比較例3は、相対結合活性がA評価であり、抗体結合活性は十分であったが、薬品耐性がE評価であり、薬品耐性が劣っていた。
実施例2、8および10は、架橋部のアミノ酸残基のうち、ポリペプチド鎖のN末端側のアミノ酸残基がε−アジド−L−リシンに由来するアミノ酸残基[Lys(N3)]であり、ポリペプチド鎖のC末端側のアミノ酸残基が、L−ビスホモプロパルギルグリシンに由来するアミノ酸残基[Bpg](実施例2)、L−ホモプロパルギルグリシンに由来するアミノ酸残基[Hpg](実施例8)またはL−プロパルギルグリシンに由来するアミノ酸残基[Pra](実施例10)である実施例である。
相対結合活性は、実施例2がA評価であり、実施例8がB評価であり、実施例10がC評価であった。このような評価の相違は、架橋部のC末端側のアミノ酸残基において、トリアゾール環が結合する炭素原子が、δ炭素原子であるか(実施例2)、γ炭素原子であるか(実施例8)またはβ炭素原子であるか(実施例10)によって、トリアゾール環による抗体結合部位に対する立体障害の影響があるものと推測される。
実施例7、11および13は、架橋部のアミノ酸残基のうち、ポリペプチド鎖のN末端側のアミノ酸残基がγ−アジド−L−ホモアラニンに由来するアミノ酸残基[Abu(N3)]であり、ポリペプチド鎖のC末端側のアミノ酸残基が、L−プロパルギルグリシンに由来するアミノ酸残基[Pra](実施例7)、L−ホモプロパルギルグリシンに由来するアミノ酸残基[Hpg](実施例11)またはL−ビスホモプロパルギルグリシンに由来するアミノ酸残基[Bpg](実施例13)である実施例である。
相対結合活性は、実施例11がA評価であり、実施例7および13がB評価であった。このような評価の相違は、架橋部のC末端側のアミノ酸残基において、トリアゾール環が結合する炭素原子が、γ炭素原子であるか(実施例11)、β炭素原子であるか(実施例7)またはδ炭素原子であるか(実施例13)によって、抗体結合部位に対するトリアゾール環の立体障害が影響していると推測される。
実施例2の環状ペプチド2と実施例3の環状ペプチド3は、架橋部のN末端側のアミノ酸残基とC末端側のアミノ酸残基を入れ換えた実施例である。また、実施例9の環状ペプチド9と実施例10の環状ペプチド、実施例11の環状ペプチド11と実施例12の環状ペプチド12、および実施例14の環状ペプチド14と実施例16の環状ペプチド16も、それぞれ、架橋部のN末端側のアミノ酸残基とC末端側のアミノ酸残基を入れ換えた実施例である。実施例2、3、9、10、11、12、14および16は、いずれも、相対結合活性がC評価以上であり、薬品耐性はA評価であった。したがって、これらの環状ペプチドの抗体結合活性および薬品耐性は十分であった。
実施例4の環状ペプチド4と実施例5の環状ペプチド5とは、固定化官能基であるアミノ基を有するリシン残基(1文字表記=K、3文字表記=Lys)が3個、N末端に存在するか、C末端に存在するかという点で相違する。しかし、実施例4および実施例5の相対結合活性および薬品耐性はいずれもA評価であり、十分な抗体結合性および薬品耐性を持っている。このことから、固定化官能基を有するアミノ酸残基は、N末端側およびC末端側のどちらに存在してもよいといえる。
トリアゾール環(トリアゾール結合)を介する架橋構造を含む環状ペプチド(実施例1〜10)は、抗体結合性と薬品耐性に優れていた。また、アミド結合を介する架橋構造を含む環状ペプチド(比較例1および比較例2)は、抗体結合性が劣っていたが、薬品耐性は十分であった。抗体結合性が劣る理由は明らかではないが、アミド結合が有する剛直性が大きく影響するのではないかと考えられる。また、ジスルフィド結合を介する架橋構造を含む環状ペプチド(比較例3)は、薬品耐性が劣っていた。これは架橋構造を形成した際の環のひずみが大きく、不安定となり、薬品耐性が劣ることとなったものと考えられる。
実施例1の環状ペプチド1、実施例2の環状ペプチド2および実施例4の環状ペプチド4の血漿中安定性はA評価であったが、比較例1の環状ペプチド17および比較例2の環状ペプチド18の血漿中安定性はE評価であった。
このような血漿中安定性の相違は、トリアゾール結合が架橋構造を構成するか(実施例1、2および4)、またはアミド結合が架橋構造を構成するか(比較例1および2)に起因して生じる。
本発明の環状ペプチドは、血漿中安定性が高いことから、酵素耐性に優れ、血中での使用、特に、抗体標識用リンカーまたは抗体薬物複合体用リンカーとして使用することができる。また、細胞内の還元雰囲気下でも安定的に使用できる。
Claims (11)
- 下記式(II)によって表される、環状ペプチド。
RN−X6 t0−X 4 −Xa−A−Y−H−X8−G−E−L−V−W−Xb−X 5 −X7 u0−RC ・・・(II)
式(II)中、
RNは、N末端基を表し;
RCは、C末端基を表し;
XaおよびXbの一方は、側鎖にアジド基を有するアミノ酸に由来するアミノ酸残基を表し、他方は、側鎖にアルキニル基を有するアミノ酸に由来するアミノ酸残基を表し、かつ、XaおよびXbは、トリアゾール結合を介して結合しており、
前記側鎖にアジド基を有するアミノ酸が、β−アジド−L−アラニン、γ−アジド−L−ホモアラニン、δ−アジド−L−ノルバリンおよびε−アジド−L−リシンからなる群から選択される少なくとも1種のアミノ酸であり、
前記側鎖にアルキニル基を有するアミノ酸が、L−プロパルギルグリシン、L−ホモプロパルギルグリシンおよびL−ビスホモプロパルギルグリシンからなる群から選択される少なくとも1種のアミノ酸であり;
X4およびX5は、それぞれ独立に、側鎖にカルボキシ基を有するアミノ酸に由来するアミノ酸残基または側鎖にヒドロキシ基を有するアミノ酸に由来するアミノ酸残基を表し、
前記側鎖にカルボキシ基を有するアミノ酸が、L−アスパラギン酸、および、D−アスパラギン酸からなる群から選択される少なくとも1種のアミノ酸であり、
前記側鎖にヒドロキシ基を有するアミノ酸が、L−トレオニン、および、D−トレオニンからなる群から選択される少なくとも1種のアミノ酸であり;
X6およびX7は、それぞれ独立に、L−リシン、および、D−リシンからなる群から選択される少なくとも1種のアミノ酸を表し、X6またはX7が複数である場合は、複数のX6またはX7は互いに同一であっても異なっていてもよく;
X8はL−ロイシン残基、L−アルギニン残基、D−ロイシン残基およびD−アルギニン残基からなる群から選択されるいずれか1つを表し;
t0およびu0は、それぞれ、0≦t0≦3、および1≦u0≦3を満たす整数であるか、または、1≦t0≦3、および0≦u0≦3を満たす整数であり;
AはL−アラニン残基またはD−アラニン残基を表し;
YはL−チロシン残基またはD−チロシン残基を表し;
HはL−ヒスチジン残基またはD−ヒスチジン残基を表し;
Gはグリシン残基を表し;
EはL−グルタミン酸残基またはD−グルタミン酸残基を表し;
LはL−ロイシン残基を表し;
VはL−バリン残基を表し;
WはL−トリプトファン残基を表す。 - 抗体結合性リガンドである、請求項1に記載の環状ペプチド。
- 抗体標識用リンカーである、請求項1に記載の環状ペプチド。
- 抗体薬物複合体用リンカーである、請求項1に記載の環状ペプチド。
- 薬物運搬体である、請求項1に記載の環状ペプチド。
- 水不溶性担体および請求項1に記載の環状ペプチドを含み、
前記水不溶性担体と前記環状ペプチドとが直接または間接的に結合している、アフィニティクロマトグラフィー担体。 - 抗体、標識化合物および請求項1に記載の環状ペプチドを含み、
前記抗体と前記標識化合物とが前記環状ペプチドを介して結合している、標識化抗体。 - 抗体、薬物および請求項1に記載の環状ペプチドを含み、
前記抗体と前記薬物とが前記環状ペプチドを介して結合している、抗体薬物複合体。 - 前記薬物が、リポソーム化、高分子ミセル化またはPEG化された薬物である、請求項8に記載の抗体薬物複合体。
- 薬物および請求項1に記載の環状ペプチドを含み、
前記薬物と前記環状ペプチドとが直接または間接的に結合している、医薬製剤。 - 前記薬物が、リポソーム化、高分子ミセル化またはPEG化された薬物である、請求項10に記載の医薬製剤。
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