JP6886433B2 - 植物のゲノム内に外因性配列を組み込むための方法および組成物 - Google Patents

植物のゲノム内に外因性配列を組み込むための方法および組成物 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１３年４月５日に出願された米国仮出願第６１／８０９，０９７号および
２０１３年５月７日に出願された米国仮出願第６１／８２０，４６１号の利益を主張し、
それらの開示は、参照により、その全体が本明細書において組み入れられる。
連邦政府により支援された研究下でなされた本発明に対する権利に関する言及
該当なし。
電子的に提出された配列リストの参照
配列リストの公式コピーが、本明細書と同時に、ＡＳＣＩＩ形式の配列リストとして、
ＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で電子的に提出される。このＡＳＣＩＩ形式文書に含まれる配列リス
トは、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書において組み入れられる。
本開示は、ゲノム操作の分野、特に、倍数体植物を含む植物中への、複数のゲノムに対
する複数の対立遺伝子の同時ゲノム編集を含む外因性配列の組み込みにある。
食糧生産の世界的な需要増加という課題に対応するため、農業生産性を改善するための
多くの効果的なアプローチ（例えば、収量の増強または害虫抵抗性の操作）は、変異育種
、または形質転換による作物種のゲノム中への新規遺伝子の導入のいずれかを利用する。
両方のプロセスが、本質的に非特異的であり、比較的非効率的である。例えば、従来の植
物形質転換方法は、無作為な位置でゲノム中に組み込まれる外因性ＤＮＡを送達する。こ
れらの方法の無作為な性質のため、望ましい属性を伴うトランスジェニック系統を同定お
よび分離するために、１つの構築物当たり数百の固有の無作為組み込み事象を生成および
スクリーニングすることが必要になる。さらに、従来の形質転換方法によって、（ａ）意
図しないゲノム破壊に起因する多面的効果が生じているか否かを予測する困難；ならびに
（ｂ）単一の導入遺伝子候補内の異なる調節エレメントおよび導入遺伝子の設計の影響を
比較する困難（なぜなら、そのような比較は、ゲノム中への無作為な組み込みにより複雑
化されているためである）を含む、導入遺伝子の評価についてのいくつかの課題が作製さ
れる。結果として、従来の植物形質の操作は、労力とコストがかかるプロセスであり、成
功の確率は低い。
精密遺伝子改変は、植物系における従来の慣行のロジスティックな課題を克服し、した
がって、基礎植物生物学研究および農業バイオテクノロジーの両方における長年の、しか
し、とらえどころのない目標であった。しかし、イネにおける陽性−陰性薬物選択または
前操作制限部位の使用を介した「遺伝子ターゲティング」を例外として、全ての植物種（
モデルおよび作物の両方）における標的化ゲノム改変が、最近まで非常に困難であること
が証明されていた。Terada et al.(2002)Nat Biotechnol 20(10):1030；Terada et al.(2
007)Plant Physiol 144(2):846；D'Halluin et al.(2008)Plant Biotechnology J.6(1):9
3。
最近、ゲノムＤＮＡの標的切断のための方法および組成物が記載されている。そのよう
な標的切断事象は、例えば、標的変異誘発を誘導し、細胞ＤＮＡ配列の標的欠失を誘導し
、所定の染色体遺伝子座での標的組換えおよび組み込みを促進させるために使用すること
ができる。例えば、Urnov et al.(2010) Nature 435(7042):646-51；米国特許第８，５８
６，５２６号；第８，５８６，３６３号；第８，４０９，８６１号；第８，１０６，２５
５号；第７，８８８，１２１号；第８，４０９，８６１号および米国特許公開２００３０
２３２４１０；２００５００２６１５７；２００９０２６３９００；２００９０１１７６
１７；２０１０００４７８０５；２０１００２５７６３８；２０１１０２０７２２１；２
０１１０２３９３１５；２０１１０１４５９４０を参照のこと。これらの開示は、全ての
目的のために、その全体が参照により組み入れられる。切断は、特異的ヌクレアーゼ、例
えば、操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベータ様エフェ
クターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）などの使用を介して、または特異的切断を導くための
操作されたｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒ ＲＮＡ（「シングルガイドＲＮＡ」）を伴うＣＲＩ
ＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して起こり得る。米国特許公開第２００８０１８２３３２号には
、植物ゲノムの標的化改変のための非正準的ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）の
使用が記載されている。米国特許第８，３９９，２１８号には、植物ＥＰＳＰＳ遺伝子座
のＺＦＮ媒介性標的化改変が記載されている。米国特許第８，３２９，９８６号には、植
物Ｚｐ１５遺伝子座の標的化改変が記載されており、米国特許第８，５９２，６４５号に
は、脂肪酸生合成に関与する植物遺伝子の標的化改変が記載されている。加えて、Moehle
et al.(2007)Proc. Natl. Acad, Sci. USA 104(9):3055-3060には、指定された遺伝子座
での標的遺伝子付加のための設計ＺＦＮを使用することが記載されている。米国特許公開
２０１１００４１１９５には、ホモ接合二倍体生物を作製する方法が記載されている。
導入遺伝子（または形質）スタッキングは、植物の産生のための大きな可能性を有する
が、困難であることが証明されている。例えば、Halpin(2005)Plant Biotechnology Jour
nal 3:141-155を参照のこと。加えて、生物が２つ以上の重複（同質倍数性）または関連
（異質倍数体）する染色体対の組を有する倍数性は、動物よりも植物種において頻繁に発
生する。例えば、小麦は二倍体（２組の染色体）、四倍体（４組の染色体）、および六倍
体（６組の染色体）である系統を有する。加えて、アブラナ（Brassica）属の多くの農業
的に重要な植物も異質４倍体である。
このように、植物およびその子孫において安定した遺伝性の遺伝学的改変を確立するた
めに、倍数体植物の異なるゲノムにわたる複数の対立遺伝子の同時改変を含め、植物ゲノ
ム内の正確な位置中への安定な標的組み込みの同定、選択、および迅速な進化のための組
成物および方法についての必要性が残っている。
本発明は、植物における精密形質転換、遺伝子ターゲティング、標的化ゲノム改変、お
よびタンパク質発現のための方法および組成物を提供する。特に、本開示では、外因性配
列を組み込み、植物ゲノム中の内因性遺伝子座（例えば、アセトヒドロキシ酸シンターゼ
（ＡＨＡＳ）遺伝子座）での異なる選択を活用する形質をスタッキングするための、新規
のトランスジェニックマーカーフリー戦略について記載する。この戦略によって、内因性
の植物遺伝子座で、例えば、１つまたは複数のＡＨＡＳパラログで正確に位置付けられた
１つまたは複数の導入遺伝子（あるいは、１つまたは複数の目的の遺伝子（ＧＯＩ）、そ
れにおいて、導入遺伝子は、トランスジェニックの選択可能マーカー遺伝子を含まない）
を有する植物の生成が促進される。本明細書に記載する方法および組成物によって、倍数
体植物種の複数のゲノムにわたる複数の対立遺伝子の同時編集を含め、正確に同じゲノム
位置で植物ゲノムにおいて並行および逐次両方の導入遺伝子のスタッキングが可能になる
。また、本発明の方法および組成物は、内因性遺伝子が、除草剤耐性植物をもたらす産物
を産生するように、ゲノム改変が内因性遺伝子において変異を生じる、外因性トランスジ
ェニック選択可能マーカーフリー選択および／または内因性遺伝子のゲノム改変を可能に
する（例えば、内因性遺伝子における公知の変異、例えばＢ群除草剤、またはＡＬＳ阻害
除草剤、例えばイミダゾリノンまたはスルホニル尿素などに対する耐性を付与するＡＨＡ
Ｓ遺伝子における公知の変異を利用することによる）。また、これらの導入遺伝子がスタ
ッキングおよび／または同時に改変された対立遺伝子を含む細胞（例えば、種子）、細胞
株、生物（例えば、植物）などを提供する。標的ゲノム編集（挿入、欠失、変異、導入遺
伝子スタッキング）は、例えば、収穫量の増加、疾患抵抗性をコードするタンパク質、成
長を増加させるタンパク質、昆虫抵抗性をコードするタンパク質、除草剤耐性をコードす
るタンパク質などをもたらし得る。収量の増加は、例えば、果実または穀物収量の増加量
、植物（または植物の果実もしくは穀物）のバイオマス増加、より高い果肉含量、より大
きな植物、乾燥重量の増加、固形含量の増加、収穫時でのより高い総重量、作物の色の強
度および／または均一性の増強、変化した化学物質（例えば、油、脂肪酸、炭水化物、タ
ンパク質）特性などを含み得る。
このように、一態様では、本明細書において開示するのは、植物遺伝子の１つまたは複
数の内因性対立遺伝子での正確なゲノム改変（例えば、導入遺伝子スタッキング）のため
の方法および組成物である。ある特定の実施形態では、導入遺伝子は、植物ゲノム（例え
ば、倍数体植物）の内因性遺伝子座中に組み込まれる。導入遺伝子の組み込みは、複数の
導入遺伝子の組み込みを含み、それは、並行（１つまたは複数の対立遺伝子中への１つま
たは複数の導入遺伝子の同時組み込み）または逐次であり得る。ある特定の実施形態では
、導入遺伝子は、トランスジェニックマーカーを含まないが、形質を含む導入遺伝子の組
み込み時に改変される内因性遺伝子座に組み込まれ（例えば、内因性アセトヒドロキシ酸
シンターゼ（ＡＨＡＳ）遺伝子座への導入遺伝子の組み込み（例えば、ＡＨＡＳ遺伝子座
の３’非翻訳領域））、その結果、導入遺伝子が発現され、ＡＨＡＳ遺伝子座が改変され
、除草剤耐性が変えられる（例えば、Ｂ群の除草剤、またはＡＬＳ阻害除草剤、例えばイ
ミダゾリノンまたはスルホニル尿素など）。導入遺伝子は、１つまたは複数の天然に存在
しないヌクレアーゼ、例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬ
ＥＮおよび／または操作された単一のガイドＲＮＡを伴うＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用
して、標的化様式で組み込まれる。導入遺伝子は、１つまたは複数のコード配列（例えば
、タンパク質）、非コード配列を含み得る、ならびに／あるいは１つまたは複数のＲＮＡ
分子（例えば、ｍＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）を産生し得る。ある
特定の実施形態では、導入遺伝子の組み込みは、同時（並行）である。他の実施形態では
、１つまたは複数の導入遺伝子（ＧＯＩ）の逐次組み込みは、例えば、ＡＨＡＳ遺伝子座
により、異なる除草剤（Ｂ群、またはＡＬＳ阻害除草剤、例えばイミダゾリノンまたはス
ルホニル尿素など）化学選択剤と、これらの特定の除草剤に対する耐性を付与する公知の
ＡＨＡＳ変異の間で交互に行うことにより達成される。さらに、本明細書に記載する植物
細胞のいずれかは、１つまたは複数の追加の導入遺伝子をさらに含み得るが、追加の導入
遺伝子は、導入遺伝子スタッキングのための標的対立遺伝子とは異なる（１つまたは複数
の）遺伝子座でゲノム中に組み込まれる。このように、複数の内因性遺伝子座は、本明細
書に記載する細胞において組み込み導入遺伝子を含み得る。
別の態様では、本明細書において開示するのは、異なるゲノム（サブゲノム）にわたる
１つまたは複数の遺伝子の複数の対立遺伝子が同時に改変された倍数体植物細胞である。
標的化改変は、倍数体植物において遺伝子活性（例えば、内因性遺伝子の活性および／ま
たは組み込まれた導入遺伝子の活性）を増強または低下し得る（例えば、除草剤耐性を変
化（例えば、増加）させるＡＨＡＳにおける変異）。
ある特定の実施形態では、倍数体植物細胞における標的化ゲノム改変は、インデルとし
ても公知である小さな挿入および／または欠失を含む。本明細書に記載する植物細胞のい
ずれかは、植物または植物の部分（例えば、種子、花、果実）内であり得る（例えば、小
麦、大豆、トウモロコシ、ジャガイモ、アルファルファ、イネ、オオムギ、ヒマワリ、ト
マト、シロイヌナズナ（Arabidopsis）、綿、アブラナ（Brassica）種（Ｂ．ナパス（B.
napus）、Ｂ．ラパ（B. rapa）、Ｂ．オレラセア（B. oleracea）、Ｂ．ニグラ（B. nigr
a）、Ｂ．ユンケア（B. juncea）、Ｂ．カリナタ（B. carinata）を含むが、これらに限
定されない）、ブラキポディウム（Brachypodium）、オオアワガエリなどの任意の品種）
。
別の態様では、本明細書に記載するのは、除草剤耐性に関与する遺伝子、例えば、ＡＨ
ＡＳ遺伝子に特異的に結合するＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ジンクフィンガータンパク
質（ＺＦＰ））である。ジンクフィンガータンパク質は、１つまたは複数のジンクフィン
ガー（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９またはそれ以上のジンクフィンガー）を
含むことができ、倍数体植物ゲノム内の任意の配列に結合するように操作することができ
る。本明細書に記載するジンクフィンガータンパク質のいずれかが、標的遺伝子のコード
配列内または隣接配列（例えば、プロモーターまたは他の発現エレメント）内の標的部位
に結合し得る。ある特定の実施形態では、ジンクフィンガータンパク質は、例えば、表３
および表１３に示す通り、ＡＨＡＳ遺伝子中の標的部位に結合する。例示的なＡＨＡＳ結
合ジンクフィンガーの認識ヘリックス領域を表２および表１２に示す。ジンクフィンガー
タンパク質の成分ジンクフィンガー結合ドメインの１つまたは複数は、正準（Ｃ２Ｈ２）
ジンクフィンガーまたは非正準（例えば、Ｃ３Ｈ）ジンクフィンガーであり得る（例えば
、Ｎ末端および／またはＣ末端のジンクフィンガーは、非正準フィンガーであり得る）。
別の態様では、本明細書において開示するのは、融合タンパク質であり、各融合タンパ
ク質は倍数体植物のゲノム中の遺伝子の複数の対立遺伝子に特異的に結合するＤＮＡ結合
ドメイン（例えば、ジンクフィンガータンパク質）を含む。ある特定の実施形態では、タ
ンパク質は、ジンクフィンガータンパク質および機能的ドメイン、例えば、転写活性化ド
メイン、転写抑制ドメイン、および／または切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）
を含む融合タンパク質である。ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、ジンクフィ
ンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である。切断ドメインおよび切断ハーフドメインは、例え
ば、種々の制限エンドヌクレアーゼおよび／またはホーミングエンドヌクレアーゼから得
ることができる。一実施形態では、切断ハーフドメインは、ＩＩＳ型制限エンドヌクレア
ーゼ（例えば、Ｆｏｋ Ｉ）に由来する。
他の態様では、本明細書に提供するのは、本明細書に記載するＤＮＡ結合ドメインおよ
び／または融合タンパク質のいずれかをコードするポリヌクレオチドである。ある特定の
実施形態では、本明細書に記載するのは、プロモーターに作動可能に連結された、本明細
書に記載する１つまたは複数のＤＮＡ結合ドメインおよび／または融合タンパク質をコー
ドするポリヌクレオチドを含む発現ベクターである。一実施形態では、融合タンパク質の
１つまたは複数はＺＦＮである。
ＤＮＡ結合ドメインおよびこれらのＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質は、倍数
体ゲノム中の２つ以上の内因性遺伝子（例えば、ＡＨＡＳ遺伝子）に、遺伝子のコード領
域内で、または遺伝子内のもしくはそれに隣接する非コード配列（例えば、リーダー配列
、トレーラー配列もしくはイントロン、またはプロモーター配列など）中で、または非転
写領域内で、コード領域の上流または下流のいずれか（例えば、３’非翻訳領域）で結合
する、および／またはそれを切断する。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインお
よび／または融合タンパク質は、標的遺伝子のコード配列または調節配列に結合する、お
よび／またはそれを切断する。
別の態様では、本明細書に記載するのは、本明細書に記載する１つまたは複数のタンパ
ク質、融合タンパク質またはポリヌクレオチドを含む組成物である。倍数体植物細胞は、
複数のゲノム対立遺伝子の標的を含む。このように、本明細書に記載する組成物は、倍数
体植物細胞の複数のゲノム（サブゲノムとも称される）中に存在する複数の対立遺伝子を
標的とする（および同時に改変する）１つまたは複数のＤＮＡ結合タンパク質（および同
をコードするポリヌクレオチド）を含み得る。ＤＮＡ結合タンパク質は、全ての遺伝子（
パラログ）、１つまたは複数の（しかし、全てより少ない）選択された対立遺伝子を標的
とし得る。
別の態様では、本明細書において提供するのは、倍数体植物細胞の複数のゲノムにわた
る複数の対立遺伝子を同時に変化させるための方法であって、細胞において１つまたは複
数のＤＮＡ結合ドメインタンパク質（例えば、ジンクフィンガータンパク質、例えばジン
クフィンガーヌクレアーゼなど）を発現させ、その結果、倍数体植物の複数の対立遺伝子
を変化させるステップを含む、方法である。ある特定の実施形態では、植物細胞において
１つまたは複数のＡＨＡＳ遺伝子の発現を変化させることであって、該方法は、細胞にお
いて１つまたは複数のＤＮＡ結合ドメインを含むタンパク質（例えば、ジンクフィンガー
タンパク質）を発現させ、その結果、ＡＨＡＳの発現を変化させるステップを含む。ある
特定の実施形態では、方法は、内因性遺伝子の発現を破壊する小さな挿入および／または
欠失（「インデル」）を作製するためにジンクフィンガーヌクレアーゼの対を使用するス
テップを含む。他の実施形態では、方法は、例えば、外因性配列（例えば、ドナー配列、
ＧＯＩ、または導入遺伝子）または発現増強エレメントの標的化挿入を介して、遺伝子発
現を増強するためにジンクフィンガーヌクレアーゼの対を使用するステップを含む。変化
した遺伝子の発現／機能は、光合成増加、除草剤耐性増加、および／または植物細胞内の
成長における改変をもたらすことができる。
別の態様では、本明細書において提供するのは、遺伝子（例えば、ＡＨＡＳ）の複数の
対立遺伝子の発現変化およびそれに対する改変を検出および／または測定するための、核
酸および抗体、ならびに同の使用方法である。
別の態様では、本明細書に記載するのは、倍数体植物細胞における１つまたは複数の内
因性遺伝子を同時に改変するための方法である。ある特定の実施形態では、該方法は：（
ａ）ヌクレアーゼが１つまたは複数の内因性遺伝子を切断し、それにより、１つまたは複
数の内因性（例えば、ＡＨＡＳ）遺伝子を改変するような条件下で１つまたは複数の遺伝
子中の標的部位に結合する１つまたは複数のヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ
、メガヌクレアーゼ、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）をコードする１つまたは
複数の発現ベクターを、倍数体植物細胞中に導入するステップを含む。他の実施形態では
、内因性遺伝子の１を上回る対立遺伝子が、例えば、倍数体植物において切断される。他
の実施形態では、１を上回る内因性遺伝子の１つまたは複数の対立遺伝子が切断される。
さらに、本明細書に記載する方法のいずれかにおいて、１つまたは複数の遺伝子の切断は
、切断領域においてヌクレオチドの欠失、付加、および／または置換をもたらすことがで
き、例えば、ＡＨＡＳ活性が変化され（例えば、増強または低下し）、それにより、例え
ば、改変された内因性遺伝子での、またはその近くでの導入遺伝子の組み込みの評価を可
能にする。
さらに別の態様では、本明細書に記載するのは、植物細胞のゲノム中に１つまたは複数
の外因性配列を導入するための方法であって、（ａ）細胞を、１つまたは複数の外因性配
列（例えば、ドナーベクター、導入遺伝子もしくはＧＯＩ、またはこれらの組合せ）と接
触させるステップ；および（ｂ）本明細書に記載する１つまたは複数のヌクレアーゼ（例
えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系
）を細胞中で発現させるステップであって、１つまたは複数のヌクレアーゼが、染色体Ｄ
ＮＡを切断し；その結果、ステップ（ｂ）における染色体ＤＮＡの切断が、相同組換えに
よるゲノム中への外因性配列の組み込みを刺激する、ステップを含む、方法である。ある
特定の実施形態では、染色体ＤＮＡを改変し、染色体配列（例えば、内因性遺伝子）を変
異させ、選択可能な表現型（例えば、除草剤耐性）を生じる産物を発現するようにする。
複数の外因性配列を同時に（並行して）組み込んでもよく、または、ステップを、導入遺
伝子の逐次付加（導入遺伝子スタッキング）について繰り返してもよい。ある特定の実施
形態では、１つまたは複数の導入遺伝子は、ＡＨＡＳ遺伝子、例えば、３’非翻訳領域内
に導入される。本明細書に記載する方法のいずれかにおいて、１つまたは複数のヌクレア
ーゼは、ヌクレアーゼ（切断）ドメイン（例えば、ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼまた
はメガヌクレアーゼの切断ドメイン）と、操作されたジンクフィンガー結合ドメインの間
での融合物であり得る。他の実施形態では、ヌクレアーゼは、ＴＡＬエフェクタードメイ
ン、ホーミングエンドヌクレアーゼ、および／またはＣｒｉｓｐｒ／Ｃａｓシングルガイ
ドＲＮＡを含む。本明細書に記載する方法のいずれかにおいて、外因性配列は、タンパク
質産物をコードし得る、および／またはＲＮＡ分子を産生し得る。本明細書に記載する方
法のいずれかにおいて、外因性配列を組み込むことができ、外因性配列が挿入される内因
性遺伝子座を改変し、１つまたは複数の測定可能な表現型またはマーカー（例えば、内因
性ＡＨＡＳの変異による除草剤耐性）を産生する。
さらに別の態様では、本明細書において開示するのは、植物細胞中の内因性遺伝子の１
つまたは複数の対立遺伝子に対する標的化ゲノム改変を含む植物細胞であって、該ゲノム
改変は、部位特異的ヌクレアーゼによる切断に続き、該ゲノム改変は、内因性遺伝子にお
いて変異を生じ、その結果、内因性遺伝子は、除草剤耐性植物細胞をもたらす産物を産生
する。実施形態では、ゲノム改変は、１つまたは複数の外因性配列の組み込みを含む。さ
らなる実施形態では、ゲノム改変は、内因性遺伝子を変異させる１つまたは複数のインデ
ルの導入を含む。追加の実施形態では、ゲノム改変を伴う内因性遺伝子は、スルホニル尿
素除草剤に対する耐性を付与するタンパク質をコードする。実施形態では、ゲノム改変を
伴う内因性遺伝子は、イミダゾリノン除草剤に対する耐性を付与するタンパク質をコード
する。さらなる実施形態では、外因性配列は、トランスジェニック選択可能マーカーをコ
ードしない。追加の実施形態では、外因性配列は、収穫量を増加させるタンパク質、疾患
抵抗性をコードするタンパク質、成長を増加させるタンパク質、昆虫抵抗性をコードする
タンパク質、除草剤耐性をコードするタンパク質、およびこれらの組合せからなる群から
選択されるタンパク質をコードする。その後の実施形態では、収穫量の増加は、果実収量
、穀物収量、バイオマス、果肉含量、サイズ、乾燥重量、固形含量、重量、色強度、色の
均一性、化学的特性の変化、またはこれらの組合せにおける増加を含む。ある特定の実施
形態では、内因性遺伝子は、内因性アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）遺伝子で
ある。追加の実施形態では、２つ以上の外因性配列は、内因性遺伝子中に組み込まれてい
る。さらなる態様では、植物細胞は、倍数体植物細胞である。実施形態では、部位特異的
ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよびＦｏｋＩ切断ドメインを含
む。さらに別の実施形態では、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、配列番号３５〜
５６および２６３〜２７８からなる群から選択される標的部位に結合するタンパク質をコ
ードする。さらなる実施形態では、植物は、小麦、大豆、トウモロコシ、ジャガイモ、ア
ルファルファ、イネ、オオムギ、ヒマワリ、トマト、シロイヌナズナ（Arabidopsis）、
綿、アブラナ（Brassica）種、およびオオアワガエリからなる群から選択される。
さらに別の態様では、本明細書において開示するのは、植物細胞中の内因性遺伝子の１
つまたは複数の対立遺伝子に対する標的化ゲノム改変を含む１つまたは複数の植物細胞を
含む植物、植物部分、種子、または果実であって、該ゲノム改変は、部位特異的ヌクレア
ーゼによる切断に続き、該ゲノム改変は、内因性遺伝子において変異を生じ、その結果、
該内因性遺伝子は、除草剤耐性植物細胞をもたらす産物を産生する。
さらに別の態様では、本明細書において開示するのは、本明細書において上に開示する
植物細胞を作製するための方法であって、植物細胞において１つまたは複数の部位特異的
ヌクレアーゼを発現させるステップ；および倍数体植物細胞の複数のゲノムにわたり内因
性遺伝子の１つまたは複数の対立遺伝子を改変するステップを含む、方法である。実施形
態では、内因性遺伝子は、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）遺伝子である。さ
らなる実施形態では、改変は、内因性遺伝子の発現を破壊する。さらに別の実施形態では
、改変は、内因性遺伝子の１つまたは複数の対立遺伝子中への１つまたは複数の外因性配
列の組み込みを含む。さらに、該方法により産生される１つまたは複数の植物細胞を含む
植物、植物部分、種子、または果実は、本開示の態様として、本明細書において開示され
る。
さらに別の態様では、本明細書において開示するのは、配列番号３５〜５６および２６
３〜２７８からなる群から選択される標的部位に結合するジンクフィンガータンパク質で
ある。さらなる実施形態では、ジンクフィンガータンパク質は、表２または表１２の単一
の列に示す認識ヘリックス領域を含む。
さらに別の態様では、本明細書に記載するのは、植物細胞のゲノム中に１つまたは複数
の外因性配列を組み込む方法であって、植物細胞において１つまたは複数の部位特異的ヌ
クレアーゼを発現させるステップであって、１つまたは複数のヌクレアーゼが、１つまた
は複数の内因性遺伝子座の染色体ＤＮＡを標的とし切断する、ステップ；植物細胞のゲノ
ム内の１つまたは複数の内因性遺伝子座中に１つまたは複数の外因性配列を組み込むステ
ップであって、１つまたは複数の内因性遺伝子座が改変され、その結果、内因性遺伝子が
変異して、植物細胞において選択可能な表現型をもたらす産物を発現する、ステップ；お
よび選択可能な表現型を発現する植物細胞を選択するステップであって、１つまたは複数
の外因性配列を組み入れた植物細胞が選択される、ステップを含む、方法である。さらな
る実施形態では、１つまたは複数の外因性配列が、ドナーポリヌクレオチド、導入遺伝子
、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される。その後の実施形態では、１つ
または複数の外因性配列の組み込みは、相同組換えまたは非相同末端結合によって起こる
。追加の実施形態では、１つまたは複数の外因性配列は、１つまたは複数の内因性遺伝子
座中に同時にまたは逐次組み入れられる。さらなる実施形態では、１つまたは複数の内因
性遺伝子座は、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）遺伝子を含む。実施形態では
、ＡＨＡＳ遺伝子は、倍数体ゲノムのＡ、Ｂ、またはＤゲノム上に位置する。別の実施形
態では、１つまたは複数の外因性配列は、ＡＨＡＳ遺伝子中に組み込まれる。さらに別の
実施形態では、１つまたは複数の外因性配列は、Ｓ６５３Ｎ ＡＨＡＳ変異をコードする
。追加の実施形態では、１つまたは複数の外因性配列は、Ｐ１９７Ｓ ＡＨＡＳ変異をコ
ードする。その後の実施形態では、部位特異的ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレ
アーゼ、ＴＡＬエフェクタードメインヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、お
よびＣｒｉｓｐｒ／ＣａｓシングルガイドＲＮＡヌクレアーゼからなる群から選択される
。さらなる実施形態では、部位特異的ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメ
インおよびＦｏｋＩ切断ドメインを含む。実施形態では、１つまたは複数の外因性配列は
、導入遺伝子をコードする、またはＲＮＡ分子を産生する。その後の実施形態では、導入
遺伝子は、収穫量を増加させるタンパク質、疾患抵抗性をコードするタンパク質、成長を
増加させるタンパク質、昆虫抵抗性をコードするタンパク質、除草剤耐性をコードするタ
ンパク質、およびこれらの組合せからなる群から選択されるタンパク質をコードする。さ
らなる実施形態では、導入遺伝子の組み込みは、１つまたは複数の内因性遺伝子座の発現
を破壊し、選択可能な表現型を生じる１つまたは複数のインデルの導入をさらに含む。該
方法のその後の実施形態は、１つまたは複数の外因性配列を含む選択された植物細胞を培
養するステップ；および植物ゲノムの１つまたは複数の内因性遺伝子座内に組み込まれた
１つまたは複数の外因性配列を含む植物全体を得るステップをさらに含む。追加の実施形
態では、イミダゾリノンを含む選択剤、またはスルホニル尿素選択剤を使用して、植物細
胞を選択する。他の実施形態では、植物ゲノムの１つまたは複数の内因性遺伝子座内に組
み込まれた１つまたは複数の外因性配列を含む植物全体は、植物ゲノムの内因性遺伝子座
内に追加の外因性配列を組み入れるようにさらに改変される。さらなる実施形態では、１
つまたは複数の外因性配列は、トランスジェニック選択可能マーカーをコードしない。
またさらなる態様では、本明細書に記載する方法のいずれかに従って得られた植物細胞
も提供される。
別の態様では、本明細書において提供するのは、本明細書に記載する植物細胞を含む植
物である。
別の態様では、本明細書において提供するのは、本明細書に記載する通りに得られる植
物細胞を含む植物からの種子である。
別の態様では、本明細書において提供するのは、本明細書に記載する通りに得られた植
物細胞を含む植物から得られた果実である。
本明細書に記載する組成物（細胞または植物）または方法のいずれかにおいて、植物細
胞は、単子葉植物細胞または双子葉植物細胞を含み得る。ある特定の実施形態では、植物
細胞は、作物植物、例えば、コムギ、トマト（または他の果実作物）、ジャガイモ、トウ
モロコシ、大豆、アルファルファなどである。
ｐＤＡＢ１０９３５０のプラスミドマップである。 ｐＤＡＢ１０９３６０のプラスミドマップである。 ｐＤＡＳ０００１３２のプラスミドマップである。 ｐＤＡＳ０００１３３のプラスミドマップである。 ｐＤＡＳ０００１３４のプラスミドマップである。 ｐＤＡＳ０００１３５のプラスミドマップである。 ｐＤＡＳ０００１３１のプラスミドマップである。 ｐＤＡＳ０００１５３のプラスミドマップである。 ｐＤＡＳ０００１５０のプラスミドマップである。 ｐＤＡＳ０００１４３のプラスミドマップである。 ｐＤＡＳ０００１６４のプラスミドマップである。 ｐＤＡＳ０００４３３のプラスミドマップである。 ｐＤＡＳ０００４３４のプラスミドマップである。 パネルＡおよびＢは、ＺＦＮ媒介、ＮＨＥＪ指向性ＤＮＡ修復を使用するコムギ（Triticum aestivum）の小麦ゲノム中の内因性ＡＨＡＳ遺伝子座での外因性マーカーを含まない、逐次導入遺伝子スタッキングを示す模式図である。図１４Ａは第１の導入遺伝子スタックを示し、図１４Ｂは第２の導入遺伝子スタックを示す。 パネルＡおよびＢは、ＺＦＮ媒介、ＮＨＥＪ指向性ＤＮＡ修復を使用するコムギ（Triticum aestivum）の小麦ゲノム中の内因性ＡＨＡＳ遺伝子座での外因性マーカーを含まない、逐次導入遺伝子スタッキングを示す模式図である。図１４Ａは第１の導入遺伝子スタックを示し、図１４Ｂは第２の導入遺伝子スタックを示す。 パネルＡおよびＢは、ＺＦＮ媒介、ＨＤＲ指向性ＤＮＡ修復を使用するコムギ（Triticum aestivum）の小麦ゲノム中の内因性ＡＨＡＳ遺伝子座での外因性マーカーを含まない、逐次導入遺伝子スタッキングを示す模式図である。図１５Ａは第１の導入遺伝子スタックを示し、図１５Ｂは第２の導入遺伝子スタックを示す。 パネルＡおよびＢは、ＺＦＮ媒介、ＨＤＲ指向性ＤＮＡ修復を使用するコムギ（Triticum aestivum）の小麦ゲノム中の内因性ＡＨＡＳ遺伝子座での外因性マーカーを含まない、逐次導入遺伝子スタッキングを示す模式図である。図１５Ａは第１の導入遺伝子スタックを示し、図１５Ｂは第２の導入遺伝子スタックを示す。 ｐＤＡＳ０００４３５の直鎖状マップを示す模式図である。 ｐＤＡＳ０００４３６の直鎖状マップを示す模式図である。 ｐＤＡＳ００００００４のプラスミドマップである。 ＱＡ＿ｐＤＡＳ０００４３４のプラスミドマップである。
本開示は、植物種中での（倍数体植物中を含む）並行（同時）または逐次外因性配列組
み込み（導入遺伝子スタッキングを含む）を含む、外因性配列の組み込みのための方法お
よび組成物に関する。本明細書に記載する方法および組成物は、組み込みを評価するため
に外因性のトランスジェニックマーカーを使用することなく、選択された遺伝子座中への
標的組み込みを提供する際に有利である。特に、トランスジェニックマーカーフリードナ
ー設計を用いた内因性遺伝子座での異なる選択は、回収された不正な組み込み事象数を低
下させることにより、標的化トランスジェニック事象についての選択にバイアスをかける
ことが実証されている（Shukla et al.(2009)Nature 459(7245):437-41）。加えて、本開
示は、内因性遺伝子座のゲノム改変（例えば、変異）に関し、その変異は、マーカー（表
現型）として役立つ産物の産生をもたらすことができる。このように、本開示は、内因性
遺伝子座中への外因性配列の組み込み（導入遺伝子スタッキングを含む）を提供し、その
内因性遺伝子座は、組み込みについてのマーカーとして役立つことができる（例えば、単
一変異が除草剤耐性を付与することができるＡＨＡＳ遺伝子座）。
外因性配列の（例えば、ＡＨＡＳ遺伝子座中への）組み込みは、内因性配列の標的二本
鎖切断により、例えば、３’非翻訳領域中に位置する配列の切断により促進される。切断
は、ＤＮＡ結合ドメイン、例えばメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン、ロイシンジッパ
ーＤＮＡ結合ドメイン、ＴＡＬ ＤＮＡ結合ドメイン、ジンクフィンガータンパク質（Ｚ
ＦＰ）などを含む融合タンパク質の使用を介して；またはＣｒｉｓｐｒ／Ｃａｓ ＲＮＡ
もしくは上記のキメラの組合せの使用を介して、この領域に標的化される。そのような切
断は、内因性切断部位での、またはその近くでのドナー核酸配列の組み込みを刺激する。
外因性配列の組み込みは、相同性依存および相同性非依存の両方の機構を介して進むこと
ができ、正確な標的化事象の選択は、正しい標的化事象においてだけ機能的である選択可
能マーカー（例えば、特定のＢ群の除草剤、またはＡＬＳ阻害除草剤、例えばイミダゾリ
ノンまたはスルホニル尿素などに対する耐性）についてのスクリーニングを介して達成さ
れる。
ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、１つまたは複数のＺＦＮ、１つまたは複数
のＴＡＬＥＮ、１つまたは複数のメガヌクレアーゼ、および／または１つまたは複数のＣ
ＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系を含む。ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮは、典型的には、切
断ドメイン（または切断ハーフドメイン）およびジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインま
たはＴＡＬＥエフェクターＤＮＡ結合ドメインを含み、タンパク質として、これらのタン
パク質をコードするポリヌクレオチドとして、またはポリペプチドとポリペプチドコード
ポリヌクレオチドの組合せとして導入され得る。ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮは、切断ハーフ
ドメインの二量体化に続き、二量体タンパク質として機能することができる。「左」およ
び「右」認識ドメインに結合するヌクレアーゼ単量体が会合し、活性ヌクレアーゼを形成
することができる偏性ヘテロ二量体ヌクレアーゼが記載されてきた。例えば、米国特許第
８，６２３，６１８号；第７，９１４，７９６号；第８０３４，５９８号を参照のこと。
このように、適当な標的部位を仮定すると、「左」単量体は、任意の「右」単量体と活性
ヌクレアーゼを形成し得る。これによって、種々の組合せにおいて使用することができる
、証明された左および右ドメインに基づく有用なヌクレアーゼ部位の数が有意に増加する
。例えば、４つのホモ二量体ヌクレアーゼの結合部位を組換えることによって、追加の１
２のヘテロ二量体ヌクレアーゼがもたらされる。より重要なのは、それによって、トラン
スジェニック設計への体系的アプローチが可能になり、全ての新たに導入された配列が、
遺伝子を切除して戻す、またはその次の追加の遺伝子を標的化するために使用することが
できる固有のヌクレアーゼ結合部位と隣接するようにする。加えて、この方法によって、
ヌクレアーゼ依存的な二本鎖切断により駆動される単一遺伝子座中へのスタッキングの戦
略を単純化することができる。
ジンクフィンガー結合ドメインは、正準（Ｃ２Ｈ２）ジンクフィンガーまたは非正準（
例えば、Ｃ３Ｈ）ジンクフィンガーであり得る。例えば、米国特許公開第２００８０１８
２３３２号を参照のこと。さらに、ジンクフィンガー結合ドメインは、１つまたは複数の
ジンクフィンガー（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９またはそれ以上のジンクフ
ィンガー）を含むことができ、任意の内因性遺伝子、例えば、ＡＨＡＳ遺伝子内の任意の
配列に結合するように操作することができる。細胞中でのそのような（１つまたは複数の
）融合タンパク質の存在は、融合タンパク質の、その（それらの）結合部位への結合およ
び標的遺伝子内での切断をもたらす。
一般
方法の実行、ならびに本明細書において開示する組成物の調製および使用は、他に示さ
ない限り、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算化学、細胞培養、組換
えＤＮＡにおける従来技術を用いており、関連分野は、当技術分野の技術の範囲内である
。これらの技術は、文献において十分に説明されている。例えば、Sambrook et al. MOLE
CULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laborator
y Press,1989 and Third edition, 2001；Ausubel et al. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECU
LAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987 and periodic updates；the series
METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego; Wolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND
FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego,1998；METHODS IN ENZYMOLOGY,
Vol. 304, “Chromatin” (P.M. Wassarman and A. P. Wolffe, eds.), Academic Press
, San Diego, 1999；およびMETHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, “Chromatin Pro
tocols” (P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999を参照のこと。
定義
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」は互換的に使用
され、直鎖状または環状立体構造における、一本鎖または二本鎖形態におけるデオキシリ
ボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的のために、これら
の用語は、ポリマーの長さに関して限定的として解釈されるべきではない。この用語は、
天然ヌクレオチドの公知の類似体、ならびに塩基、糖、および／またはリン酸部分（例え
ば、ホスホロチオエート骨格）において修飾されたヌクレオチドを包含することができる
。一般的に、特定のヌクレオチドの類似体は、同じ塩基対合特異性を有する；即ち、Ａの
類似体は、Ｔと塩基対形成する。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は互換的に使用され、ア
ミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、また、１つまたは複数のアミノ酸が、対応す
る天然に存在するアミノ酸の化学的類似体または修飾誘導体であるアミノ酸ポリマーに適
用される。
「結合」は、高分子間（例えば、タンパク質と核酸との間）の配列特異的な非共有結合
性の相互作用を指す。結合相互作用の全ての成分が、相互作用が全体として配列特異的で
ある限り、配列特異的である（例えば、ＤＮＡ骨格中のリン酸残基と接触する）必要はな
い。そのような相互作用は、一般的に、１０−６Ｍ−１またはそれ以下の解離定数（Ｋｄ
）により特徴付けられる。「親和性」は、結合の強度を指し：結合親和性の増加は、低い
Ｋｄと相関する。
「結合タンパク質」は、別の分子に結合することができるタンパク質である。結合タン
パク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タン
パク質）、および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合すること
ができる。タンパク質結合タンパク質の場合において、それは、それ自体に結合すること
ができる（ホモ二量体、ホモ三量体などを形成する）、および／または、それは、１つま
たは複数の異なるタンパク質の１つまたは複数の分子に結合することができる。結合タン
パク質は、結合活性の１を上回る型を有することができる。例えば、ジンクフィンガータ
ンパク質は、ＤＮＡ結合、ＲＮＡ結合、およびタンパク質結合活性を有する。
「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、その構造が亜
鉛イオンの配位を介して安定化される結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である１つま
たは複数のジンクフィンガーを介して配列特異的にＤＮＡに結合するタンパク質、または
より大きなタンパク質内のドメインである。用語、ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク
質は、しばしば、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと省略される。
「ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は、１つまたは複数のＴＡＬＥ
リピートドメイン／単位を含むポリペプチドである。リピートドメインは、その同族の標
的ＤＮＡ配列へのＴＡＬＥの結合に関与する。単一の「リピート単位」（「リピート」と
も称される）は、典型的には３３〜３５アミノ酸であり、ＤＮＡ結合特異性に関与するリ
ピート可変二残基（ＲＶＤ）と称される１２位および／または１３位での超可変二残基を
含む。ＴＡＬＥリピートは、天然に存在するＴＡＬＥタンパク質内の他のＴＡＬＥリピー
ト配列と、少なくともいくらかの配列相同性を示す。例えば、米国特許第８，５８６，５
２６号を参照のこと。
ジンクフィンガー結合ドメインおよびＴＡＬＥドメインは、所定のヌクレオチド配列に
結合するように「操作」することができる。ジンクフィンガータンパク質を操作するため
の方法の非限定的な例は、設計および選択である。設計されたジンクフィンガータンパク
質は、その設計／組成が主に合理的基準からもたらされる、自然に生じないタンパク質で
ある。設計のための合理的基準は、既存のＺＦＰ設計および結合データの情報を保存する
データベースにおいて情報を処理するための置換ルールおよびコンピュータアルゴリズム
の適用を含む。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号；第６，４５３，２４２号；お
よび第６，５３４，２６１号を参照のこと；また、ＷＯ９８／５３０５８；ＷＯ９８／５
３０５９；ＷＯ９８／５３０６０；ＷＯ０２／０１６５３６、およびＷＯ０３／０１６４
９６を参照のこと。
「選択された」ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、その産生が、主に、経
験的なプロセス、例えばファージディスプレイ、相互作用トラップ、またはハイブリッド
選択などからもたらされる、自然において見出されないタンパク質である。例えば、Ｕ．
Ｓ．８，５８６，５２６、Ｕ．Ｓ．５，７８９，５３８；Ｕ．Ｓ．５，９２５，５２３；
Ｕ．Ｓ．６，００７，９８８；Ｕ．Ｓ．６，０１３，４５３；Ｕ．Ｓ．６，２００，７５
９；ＷＯ９５／１９４３１；ＷＯ９６／０６１６６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ９８／
５４３１１；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／６０９７０；ＷＯ０１／８８１９７およ
びＷＯ０２／０９９０８４を参照のこと。
用語「配列」は、任意の長さのヌクレオチド配列を指し、それはＤＮＡまたはＲＮＡで
あり得る；直鎖状、環状、または分岐状であり得る、一本鎖または二本鎖のいずれかであ
り得る。用語「ドナー配列」は、ゲノム中に挿入されるヌクレオチド配列を指す。ドナー
配列は、任意の長さ、例えば、２〜１０，０００ヌクレオチド長の間（または、その間も
しくはそれを上回る任意の整数値）、好ましくは約１００〜１，０００ヌクレオチド長の
間（または、その間の任意の整数）、より好ましくは約２００〜５００ヌクレオチド長の
間であり得る。
「相同、非同一配列」は、第２の配列とある程度の配列同一性を共有するが、その配列
が、第２の配列のものと同一ではない第１の配列を指す。例えば、変異遺伝子の野生型配
列を含むポリヌクレオチドは、変異遺伝子の配列と相同で非同一である。ある特定の実施
形態では、２つの配列間の相同性の程度は、その間での相同組換えを可能にするのに十分
であり、通常の細胞機構を利用する。２つの相同な非同一配列は、任意の長さにすること
ができ、それらの非相同性の程度は、単一ヌクレオチドと小さく（例えば、標的相同組換
えによるゲノム点変異の補正のため）または１０キロベース以上と大きく（例えば、染色
体における所定の異所性部位での遺伝子の挿入のため）なり得る。相同な非同一配列を含
む２つのポリヌクレオチドは、同じ長さである必要はない。例えば、２０〜１０，０００
の間のヌクレオチドまたはヌクレオチド対の外因性ポリヌクレオチド（即ち、ドナーポリ
ヌクレオチド）を使用することができる。
核酸およびアミノ酸配列同一性を決定するための技術が、当技術分野において公知であ
る。典型的には、そのような技術は、遺伝子についてのｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決
定すること、および／または、それによりコードされるアミノ酸配列を決定すること、お
よび、これらの配列を第２のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列と比較することを含む
。ゲノム配列も決定し、この様式で比較することができる。一般的に、同一性は、２つの
ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはア
ミノ酸対アミノ酸の対応をそれぞれ指す。２つ以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミ
ノ酸）を、それらのパーセント同一性を決定することにより比較することができる。２つ
の配列のパーセント同一性は、核酸配列またはアミノ酸配列を問わず、より短い配列長に
より割り、１００を乗じた、２つの整列配列の間での正確なマッチ数である。核酸配列に
ついてのおおよその整列化が、Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics
2:482-489 (1981)の局所相同性アルゴリズムにより提供される。このアルゴリズムは、Da
yhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M.O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:35
3-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USA, and norma
lized by Gribskov, Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986)により開発されたスコア
リングマトリックスを使用することにより、アミノ酸配列に適用することができる。配列
のパーセント同一性を決定するための、このアルゴリズムの例示的な実施は、「Ｂｅｓｔ
Ｆｉｔ」実用的適用におけるＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ウィス
コンシン州、マディソン）により提供される。配列間のパーセント同一性または類似性を
算出するための適切なプログラムが、一般的に、当技術分野において公知であり、例えば
、別のアラインメントプログラムは、デフォルトパラメータと使用されるＢＬＡＳＴであ
る。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォルトパラメータを使用し
て使用することができる：遺伝コード＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ
＝６０；期待値＝１０；マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＡＳＴＰ用）；記載＝５
０配列；ソート＝ ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ；データベース＝非冗長、ＧｅｎＢａｎｋ＋Ｅ
ＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ翻訳＋Ｓｗｉｓｓ ｐｒｏｔｅｉｎ
＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、インターネットで見出すこ
とができる。本明細書に記載する配列に関して、配列同一性の所望の程度の範囲は、約８
０％〜１００％およびその間での任意の整数値である。典型的には、配列間のパーセント
同一性は、少なくとも７０〜７５％、好ましくは８０〜８２％、より好ましくは８５〜９
０％、さらにより好ましくは９２％、さらにより好ましくは９５％、最も好ましくは９８
％の配列同一性である。
あるいは、ポリヌクレオチド間の配列類似性の程度は、相同領域間で安定な二本鎖の形
成を可能にする条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、それに続く一本
鎖特異的ヌクレアーゼでの消化および消化断片のサイズ決定により決定することができる
。２つの核酸配列、または２つのポリペプチド配列は、配列が、上の方法を使用して決定
する通り、分子の定められた長さにわたり少なくとも約７０％〜７５％、好ましくは８０
％〜８２％、より好ましくは８５％〜９０％、さらにより好ましくは９２％、さらにより
好ましくは９５％、最も好ましくは９８％の配列同一性を示す場合、互いに実質的に相同
である。本明細書において使用する場合、実質的に相同は、また、特定のＤＮＡ配列また
はポリペプチド配列に対する完全な同一性を示す配列を指す。実質的に相同であるＤＮＡ
配列を、サザンハイブリダイゼーション実験において、例えば、ストリンジェントな条件
下で、その特定の系について定義される通りに同定することができる。適当なハイブリダ
イゼーション条件を定義することは、当業者に公知である。例えば、Sambrook et al.、
上記；Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, editors B.D. Hames and S
.J. Higgins,(1985)Oxford; Washington, DC; IRL Press）を参照のこと。
２つの核酸断片の選択的ハイブリダイゼーションを以下の通りに決定することができる
。２つの核酸分子間の配列同一性の程度は、そのような分子間でのハイブリダイゼーショ
ン事象の効率および強度に影響する。部分的に同一の核酸配列は、標的分子への完全に同
一な配列のハイブリダイゼーションを少なくとも部分的に阻害する。完全に同一な配列の
ハイブリダイゼーションの阻害は、当技術分野において周知であるハイブリダイゼーショ
ンアッセイを使用して評価することができる（例えば、サザン（ＤＮＡ）ブロット、ノー
ザン（ＲＮＡ）ブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど、Sambrook et al., Molecul
ar Cloning:A Laboratory Manual, Second Edition,(1989)Cold Spring Harbor, N.Y.を
参照）。そのようなアッセイは、例えば、低から高ストリンジェンシーまで変化する条件
を使用して、種々の程度の選択性を使用して行うことができる。低ストリンジェンシーの
条件が用いられる場合、非特異的結合の非存在を、配列同一性の部分的な程度さえ欠く二
次プローブ（例えば、標的分子と約３０％未満の配列同一性を有するプローブ）を使用し
て評価することができ、非特異的結合事象の非存在下において、二次プローブが標的にハ
イブリダイズしないようにする。
ハイブリダイゼーションベースの検出系を利用する場合、参照核酸配列に相補的な核酸
プローブが選択され、次に、適当な条件の選択により、プローブおよび参照配列は、選択
的にハイブリダイズし、または互いに結合し、二本鎖分子を形成する。中程度にストリン
ジェントなハイブリダイゼーション条件下で参照配列に選択的にハイブリダイズすること
が可能である核酸分子は、典型的には、選択された核酸プローブの配列と少なくとも約７
０％の配列同一性を有する、少なくとも約１０〜１４ヌクレオチド長の標的核酸配列の検
出を可能にする条件下でハイブリダイズする。ストリンジェントなハイブリダイゼーショ
ン条件は、典型的には、選択された核酸プローブの配列と約９０〜９５％を上回る配列同
一性を有する、少なくとも約１０〜１４ヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能にす
る。プローブおよび参照配列が特定の程度の配列同一性を有している場合、プローブ／参
照配列のハイブリダイゼーションのために有用なハイブリダイゼーション条件を、当技術
分野において公知の通りに決定することができる（例えば、Nucleic Acid Hybridization
:A Practical Approach, editors B.D. Hames and S.J. Higgins,(1985) Oxford; Washin
gton, DC; IRL Pressを参照）。
ハイブリダイゼーションのための条件は、当業者に周知である。ハイブリダイゼーショ
ンのストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション条件が、ミスマッチヌクレオチドを
含むハイブリッドの形成を支持しない程度を指し、より高いストリンジェンシーは、ミス
マッチハイブリッドについてのより低い許容度と相関する。ハイブリダイゼーションのス
トリンジェンシーに影響する因子は、当業者に周知であり、温度、ｐＨ、イオン強度、お
よび有機溶媒、例えばホルムアミドおよびジメチルスルホキシドなどの濃度を含むが、こ
れらに限定されない。当業者に公知の通り、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシ
ーは、より高い温度、より低いイオン強度、およびより低い溶媒濃度により増加される。
ハイブリダイゼーションのためのストリンジェンシー条件に関しては、多数の等価な条
件を用いて、例えば、以下の因子を変動させることにより特定のストリンジェンシーを確
立することができることが当技術分野で周知である：プローブ配列の長さおよび性質、種
々の配列の塩基組成、塩および他のハイブリダイゼーション溶液成分の濃度、ハイブリダ
イゼーション溶液（例えば、硫酸デキストランおよびポリエチレングリコール）中の遮断
剤の存在または非存在、ハイブリダイゼーション反応の温度および時間パラメータ、なら
びに変動する洗浄条件。ハイブリダイゼーション条件の特定のセットの選択は、当技術分
野における標準的方法に従って選択される（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloni
ng: A Laboratory Manual, Second Edition,(1989)Cold Spring Harbor, N.Y.を参照）。
「組換え」は、２つのポリヌクレオチド間の遺伝情報の交換のプロセスを指す。本開示
の目的のために、「相同組換え（ＨＲ）」は、例えば、細胞における二本鎖切断の修復の
間に起こるそのような交換の特殊な形態を指す。このプロセスは、「標的」分子の鋳型修
復に対する「ドナー」分子（即ち、二本鎖切断を経験したもの）を使用し、「非交差遺伝
子変換」または「短管遺伝子変換」として種々に公知であるヌクレオチド配列相同性を要
求する。なぜなら、それは、ドナーから標的への遺伝情報の伝達に導くからである。任意
の特定の理論に拘束されることを望まないが、そのような伝達は、破壊された標的とドナ
ーの間に形成するヘテロ二本鎖ＤＮＡのミスマッチ補正、および／または「合成依存性鎖
アニーリング」（ドナーが、標的の部分となる遺伝情報を再合成するために使用される）
、および／または関連プロセスを含み得る。そのような特殊なＨＲは、しばしば、標的分
子の配列の変化をもたらし、その結果、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全て
が、標的ポリヌクレオチド中に組み入れられる。
「切断」は、ＤＮＡ分子の共有結合骨格の破壊を指す。切断は、ホスホジエステル結合
の酵素的または化学的加水分解を含むが、これに限定されない種々の方法により開始する
ことができる。一本鎖切断および二本鎖切断の両方が可能であり、二本鎖切断は、２つの
異なる一本鎖切断事象の結果として生じ得る。ＤＮＡ切断は、平滑末端または付着末端の
いずれかの産生をもたらすことができる。ある特定の実施形態では、融合ポリペプチドは
、標的化された二本鎖ＤＮＡ切断のために使用される。
「切断ドメイン」は、ＤＮＡ切断のための触媒活性を持つ、１つまたは複数のポリペプ
チド配列を含む。切断ドメインは、単一のポリペプチド鎖中に含まれ得る、または、切断
活性は、２つ（またはそれ以上）のポリペプチドの会合からもたらされ得る。
「切断ハーフドメイン」は、第２のポリペプチド（同一または異なるのいずれか）との
併用において、切断活性（好ましくは二本鎖切断活性）を有する複合体を形成する、ポリ
ペプチド配列である。
「操作された切断ハーフドメイン」は、別の切断ハーフドメイン（例えば、別の操作さ
れた切断ハーフドメイン）との偏性ヘテロ二量体を形成するように改変された切断ハーフ
ドメインである。それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第７，
９１４，７９６号；第８，０３４，５９８号；第８，６２３，６１８号および米国特許公
開第２０１１／０２０１０５５号も参照のこと。
「クロマチン」は、細胞ゲノムを含む核タンパク質構造である。細胞クロマチンは、核
酸、主にＤＮＡ、およびタンパク質（ヒストンおよび非ヒストン染色体タンパク質を含む
）を含む。真核細胞クロマチンの大部分は、ヌクレオソームの形態で存在し、ヌクレオソ
ームコアは、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４の各々２つを含む八量体と会合
した約１５０塩基対のＤＮＡを含み；（生物に依存した可変長の）リンカーＤＮＡは、ヌ
クレオソームコアの間に伸長する。ヒストンＨ１の分子は、一般的に、リンカーＤＮＡと
会合する。本開示の目的のために、用語「クロマチン」は、原核生物および真核生物の両
方の細胞核タンパク質の全ての型を包含することを意味する。細胞クロマチンは、染色体
性およびエピソーム性クロマチンの両方を含む。
「染色体」は、細胞のゲノムの全てまたは一部を含むクロマチン複合体である。細胞の
ゲノムは、しばしば、その核型により特徴付けられ、それは、細胞のゲノムを含む全ての
染色体の集合体である。細胞のゲノムは、１つまたは複数の染色体を含み得る。
「エピソーム」は、複製中の核酸、核タンパク質複合体、または細胞の染色体核型の一
部ではない核酸を含む他の構造である。エピソームの例は、プラスミドおよびある特定の
ウイルスゲノムを含む。
「アクセス可能領域」は、核酸中に存在する標的部位が、標的部位を認識する外因性分
子により結合させることができる細胞クロマチン中の部位である。任意の特定の理論に拘
束されることを望まないが、アクセス可能領域は、ヌクレオソーム構造中にパッケージン
グされていないものであると考えられる。アクセス可能領域の異なる構造は、しばしば、
化学的および酵素的プローブ、例えば、ヌクレアーゼに対するその感受性により検出する
ことができる。
「標的部位」または「標的配列」は、結合のための十分な条件が存在することを仮定し
、結合分子が結合する核酸の部分を定義する核酸配列である。例えば、配列５’−ＧＡＡ
ＴＴＣ−３’は、Ｅｃｏ ＲＩ制限エンドヌクレアーゼのための標的部位である。加えて
、表３および１３は、表２および表１２のＺＦＰ認識ヘリックスの結合のための標的部位
を列挙する。
「外因性」分子は、通常、細胞中に存在しないが、１つまたは複数の遺伝学的、生化学
的または他の方法により細胞中に導入することができる分子である。「細胞中の通常の存
在」は、特定の発生段階および細胞の環境条件に関して決定される。このように、例えば
、花の発生の初期段階の間だけで細胞中に存在する分子は、十分に発生した花の細胞に関
して外因性分子である。同様に、熱ショックにより誘導される分子は、非熱ショック細胞
に関して外因性分子である。外因性分子は、例えば、任意のポリペプチドまたはその断片
についてのコード配列、機能不全内因性分子の機能バージョン、または正常に機能する内
因性分子の機能不全バージョンを含み得る。加えて、外因性分子は、宿主細胞における内
因性遺伝子のオルソログである、別の種からのコード配列を含み得る。
外因性分子は、とりわけ、コンビナトリアルケミストリープロセスにより生成されるよ
うな小分子、または巨大分子、例えばタンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質
、リポタンパク質、多糖、上の分子の任意の修飾誘導体、または上の分子の１つまたは複
数を含む任意の複合体であり得る。核酸はＤＮＡおよびＲＮＡを含み、一本鎖または二本
鎖であり得る；直鎖状、分枝状、または環状であり得る；任意の長さであり得る。核酸は
、二本鎖を形成することが可能な核酸、ならびに三本鎖形成核酸を含む。例えば、米国特
許第５，１７６，９９６号および第５，４２２，２５１号を参照のこと。タンパク質は、
ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化ＤＮＡ結合タ
ンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、
キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラ
ーゼ、ジャイレース、およびヘリカーゼを含むが、これらに限定されない。このように、
この用語は、植物細胞中に導入された外因性配列である「導入遺伝子」または「目的の遺
伝子」を含む。
外因性分子は、内因性分子、例えば、外因性タンパク質または核酸と同じ型の分子であ
り得る。例えば、外因性核酸は、感染性ウイルスゲノム、細胞中に導入されたプラスミド
もしくはエピソーム、または細胞中に通常は存在しない染色体を含み得る。細胞中への外
因性分子の導入のための方法は、当業者に公知であり、プロトプラスト形質転換、シリコ
ンカーバイド（例えば、ＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標））、アグロバクテリウム（Agrobacter
ium）媒介性形質転換、脂質媒介性移入（即ち、中性およびカチオン性脂質を含む、リポ
ソーム）、エレクトロポレーション、直接注入、細胞融合、粒子照射（例えば、「遺伝子
銃」を使用する）、リン酸カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性移入、およ
びウイルスベクター媒介性移入を含むが、これらに限定されない。
対照的に、「内因性」分子は、特定の環境条件下で、特定の発生段階で特定の細胞にお
いて通常存在するものである。例えば、内因性核酸は、染色体、ミトコンドリア、葉緑体
もしくは他の細胞小器官のゲノム、または天然に存在するエピソーム核酸を含み得る。追
加の内因性分子は、タンパク質、例えば転写因子および酵素を含み得る。
本明細書において使用する場合、用語「外因性核酸の産物」は、ポリヌクレオチドおよ
びポリペプチドの両方の産物、例えば、転写産物（ポリヌクレオチド、例えばＲＮＡなど
）および翻訳産物（ポリペプチド）を含む。
「融合」分子は、２つ以上のサブユニット分子が、好ましくは共有結合的に連結された
分子である。サブユニット分子は、分子の同じ化学型であり得る、または分子の異なる化
学型であり得る。融合分子の第１の型の例は、融合タンパク質、例えば、ＤＮＡ結合ドメ
イン（例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、および／またはメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン
）とヌクレアーゼ（切断）ドメイン（例えば、エンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼな
ど）の間での融合および融合核酸（例えば、本明細書に記載する融合タンパク質をコード
する核酸）を含むが、これらに限定されない。融合分子の第２の型の例は、三本鎖形成核
酸とポリペプチドの間での融合、および副溝結合剤と核酸の間での融合を含むが、これら
に限定されない。
細胞中での融合タンパク質の発現は、細胞への融合タンパク質の送達から、または、細
胞への、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの送達によりもたらされ得るが、
それにおいて、ポリヌクレオチドが転写され、転写物は翻訳され、融合タンパク質を生成
する。トランススプライシング、ポリペプチド切断、およびポリペプチドライゲーション
も、細胞中でのタンパク質の発現に関与し得る。細胞へのポリヌクレオチドおよびポリペ
プチド送達のための方法は、本開示において別の場所で提示されている。
本開示の目的のための「遺伝子」は、そのような調節配列が、コード配列および／また
は転写配列に隣接しているか否かを問わず、遺伝子産物（以下を参照）をコードするＤＮ
Ａ領域、ならびに遺伝子産物の産生を調節する全てのＤＮＡ領域を含む。したがって、遺
伝子は、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列（例えばリボソーム結合部位
および内部リボソーム進入部位など）、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、
境界エレメント、複製起点、マトリクス付着部位、および遺伝子座制御領域を含むが、こ
れらに必ずしも限定されない。
「遺伝子発現」は、遺伝子産物への、遺伝子中に含まれる情報の変換を指す。遺伝子産
物は、遺伝子の直接的な転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセン
スＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡ、またはＲＮＡの任意の他の型）またはｍＲＮＡの翻
訳により産生されるタンパク質であり得る。遺伝子産物は、また、プロセス、例えばキャ
ッピング、ポリアデニル化、メチル化、および編集などにより修飾されたＲＮＡならびに
、例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化、ミリス
トイル化、およびグリコシル化により修飾されたタンパク質を含む。
遺伝子発現の「モジュレーション」は、遺伝子の活性における変化を指す。発現のモジ
ュレーションは、遺伝子活性化および遺伝子抑制を含み得るが、これらに限定されない。
「トランスジェニック選択可能マーカー」は、キメラ遺伝子発現カセットを含むように
、プロモーターおよび３’−ＵＴＲに作動可能に連結されたマーカー遺伝子を含む外因性
配列を指す。トランスジェニック選択可能マーカーの非限定的な例は、除草剤耐性、抗生
物質抵抗性、および視覚的レポーターマーカーを含む。トランスジェニック選択可能マー
カーは、標的組み込みを介して、ドナー配列と共に組み込むことができる。したがって、
トランスジェニック選択可能マーカーは、ドナーの組み込みを評価するために使用される
産物を発現する。対照的に、本明細書に記載する方法および組成物は、トランスジェニッ
ク選択可能マーカーの同時組み込みを必要とせず、例えば、内因性標的遺伝子座から選択
可能マーカーを産生するために組み込まれた内因性遺伝子を変異させるドナーを使用する
ことにより（即ち、この例において使用される選択可能マーカーは、トランスジェニック
ではない）、任意のドナー配列の組み込みを可能にする。選択可能マーカーの非限定的な
例は、除草剤耐性マーカー（本明細書に記載する変異ＡＨＡＳ遺伝子を含む）を含む。
「植物」細胞は、単子葉（単子葉植物）または双子葉（双子葉植物）植物の細胞を含む
が、これらに限定されない。単子葉植物の非限定的な例は、穀物植物、例えばトウモロコ
シ、イネ、オオムギ、カラスムギ、コムギ、モロコシ、ライムギ、サトウキビ、パイナッ
プル、タマネギ、バナナ、ココナッツなどを含む。双子葉植物の非限定的な例は、タバコ
、トマト、ヒマワリ、ワタ、テンサイ、ジャガイモ、レタス、メロン、ダイズ、キャノー
ラ（ナタネ）、およびアルファルファを含む。植物細胞は、植物の任意の部分から、およ
び／または植物発生の任意の段階からのものであり得る。
「目的の領域」は、細胞クロマチンの任意の領域、例えば、遺伝子または遺伝子内もし
くはそれに隣接する非コード配列などであり、それにおいて、外因性分子を結合すること
が望ましい。結合は、標的ＤＮＡ切断および／または標的組換えの目的であり得る。目的
の領域は、例えば、染色体、エピソーム、オルガネラゲノム（例えば、ミトコンドリア、
葉緑体）、または感染ウイルスゲノム中に存在し得る。目的の領域は、遺伝子のコード領
域内、転写される非コード領域、例えば、リーダー配列、トレーラー配列もしくはイント
ロン内など、または非転写領域内、コード領域の上流または下流のいずれかであり得る。
目的の領域は、単一ヌクレオチド対と短い、または２，０００ヌクレオチド対長まで、ま
たはヌクレオチド対の任意の整数値であり得る。
用語「作動可能な連結」および「作動可能に連結された」（または「作動的に連結され
た」）は、２つ以上の成分（例えば配列エレメントなど）の並置を参照して互換的に使用
され、それにおいて、成分は、両方の成分が正常に機能し、成分の少なくとも１つが、他
の成分の少なくとも１つに対して発揮される機能を媒介することができるという可能性を
可能にするように配置される。例証として、転写調節配列、例えばプロモーターなどは、
転写調節配列が、１つまたは複数の転写調節因子の存在または非存在に応答して、コード
配列の転写レベルを制御する場合、コード配列に作動可能に連結されている。転写調節配
列は、一般的に、コード配列とシスで作動可能に連結されているが、それに直接的に隣接
する必要はない。例えば、エンハンサーは、それらが連続的ではないにもかかわらず、コ
ード配列に作動可能に連結される転写調節配列である。
融合ポリペプチドに関して、用語「作動可能に連結された」は、成分の各々が、他の成
分への連結において、それがそのように連結されていない場合と同じ機能を実施するとの
事実を指し得る。例えば、ＤＮＡ結合ドメイン（ＺＦＰ、ＴＡＬＥ）が切断ドメイン（例
えば、エンドヌクレアーゼドメイン、例えばＦｏｋＩ、メガヌクレアーゼドメインなど）
に融合されている融合ポリペプチドに関して、ＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメインは
、融合ポリペプチドにおいて、ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはそ
の結合部位に結合することができ、切断（ヌクレアーゼ）ドメインが標的部位の近くでＤ
ＮＡを切断することができる場合、作動可能な連結中にある。ヌクレアーゼドメインは、
また、ＤＮＡ結合能を示し得る（例えば、ＤＮＡにも結合することができるＺＦＰまたは
ＴＡＬＥドメインに融合されたヌクレアーゼ）。同様に、ＤＮＡ結合ドメインが、活性化
ドメインまたは抑制ドメインに融合されている融合ポリペプチドに関して、ＤＮＡ結合ド
メインおよび活性化ドメインまたは抑制ドメインは、融合ポリペプチドにおいて、ＤＮＡ
結合ドメイン部分が、その標的部位および／またはその結合部位に結合することができ、
活性化ドメインが、遺伝子発現を上方制御することができる、または抑制ドメインが、遺
伝子発現を下方制御することができる場合、作動可能な連結中にある。タンパク質、ポリ
ペプチド、または核酸の「機能的断片」は、その配列が全長タンパク質、ポリペプチド、
または核酸と同一ではないが、依然として全長タンパク質、ポリペプチド、または核酸と
同じ機能を保持する、タンパク質、ポリペプチド、または核酸である。機能的断片は、対
応する天然分子よりも多い、少ない、または同じ数の残基を有することができる、および
／または１つまたは複数のアミノ酸もしくはヌクレオチド置換を含むことができる。核酸
の機能を決定するための方法（例えば、コード機能、別の核酸にハイブリダイズする能力
）は、当技術分野において周知である。同様に、タンパク質機能を決定するための方法は
周知である。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能は、例えば、フィルター結合、電気
泳動移動度シフト、または免疫沈降アッセイにより決定することができる。ＤＮＡ切断は
、ゲル電気泳動によりアッセイすることができる。Ausubel et al.（上記）を参照のこと
。別のタンパク質と相互作用するタンパク質の能力は、例えば、共免疫沈降、ツーハイブ
リッドアッセイ、または相補性により、遺伝学的および生化学的の両方で決定することが
できる。例えば、Fields et al.(1989)Nature 340:245-246；米国特許第５，５８５，２
４５号およびＰＣＴ ＷＯ９８／４４３５０を参照のこと。
ＤＮＡ結合ドメイン
任意のＤＮＡ結合ドメインは、本明細書において開示する方法において使用することが
できる。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガータンパク質
を含む。ジンクフィンガー結合ドメインは、１つまたは複数のジンクフィンガーを含む。
Miller et al.(1985)EMBO J. 4:1609-1614；Rhodes(1993)Scientific American Feb.:56-
65；米国特許第６，４５３，２４２号。本明細書に記載するジンクフィンガー結合ドメイ
ンは、一般的に、２、３、４、５、６またはさらにそれ以上のジンクフィンガーを含む。
典型的には、単一のジンクフィンガードメインは、約３０アミノ酸の長さである。構造
研究では、各ジンクフィンガードメイン（モチーフ）が、２つのベータシート（２つの不
変システイン残基を含むベータターン中に保持される）およびアルファヘリックス（２つ
の不変ヒスチジン残基を含む）を含むことが実証されており、それらは、２つのシステイ
ンおよび２つのヒスチジンにより、亜鉛原子の配位を介して、特定の立体構造中に保持さ
れる。
ジンクフィンガーは、正準Ｃ２Ｈ２ジンクフィンガー（即ち、亜鉛イオンが、２つのシ
ステイン残基および２つのヒスチジン残基により配位されているもの）と非正準ジンクフ
ィンガー、例えば、Ｃ３Ｈジンクフィンガー（亜鉛イオンが、３つのシステイン残基およ
び１つのヒスチジン残基により配位されているもの）およびＣ４ジンクフィンガー（亜鉛
イオンが、４つのシステイン残基により配位されているもの）の両方を含む。植物におけ
る使用のための非正準ＺＦＰに関するＷＯ０２／０５７２９３および米国特許公開第２０
０８０１８２３３２号も参照のこと。
操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然に存在するジンクフィンガータンパ
ク質と比較して、新規の結合特異性を有し得る。操作方法は、合理的な設計および種々の
型の選択を含むが、これらに限定されない。合理的な設計は、例えば、トリプレット（ま
たはクアドラプレット）ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を
含むデータベースを使用することを含み、それにおいて、各々のトリプレットまたはクア
ドラプレットヌクレオチド配列は、特定のトリプレットまたはクアドラプレット配列に結
合するジンクフィンガーの１つまたは複数のアミノ酸配列と会合する。
ファージディスプレイおよびツーハイブリッド系を含む、例示的な選択方法が、米国特
許第５，７８９，５３８号；第５，９２５，５２３号；第６，００７，９８８号；第６，
０１３，４５３号；第６，４１０，２４８号；第６，１４０，４６６号；第６，２００，
７５９号；および第６，２４２，５６８号；ならびにＷＯ９８／３７１８６；ＷＯ９８／
５３０５７；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／８８１９７およびＧＢ２，３３８，２３
７に開示されている。
ジンクフィンガー結合ドメインについての結合特異性の増強は、例えば、米国特許第６
，７９４，１３６号に記載されている。
個々のジンクフィンガーは、３ヌクレオチド（即ち、トリプレット）配列（または、隣
接するジンクフィンガーの４ヌクレオチド結合部位と、１つのヌクレオチドにより重複し
得る４ヌクレオチド配列）に結合するため、ジンクフィンガー結合ドメインが結合するよ
うに操作された配列（例えば、標的配列）の長さによって、操作されたジンクフィンガー
結合ドメイン中のジンクフィンガーの数が決定される。例えば、フィンガーモチーフが重
複するサブサイトに結合しないＺＦＰについては、６ヌクレオチドの標的配列が、２フィ
ンガー結合ドメインにより結合される；９ヌクレオチドの標的配列が、３フィンガー結合
ドメインなどにより結合される。本明細書に記載する通り、標的部位における個々のジン
クフィンガー（即ち、サブサイト）についての結合部位は、連続的である必要はないが、
マルチフィンガー結合ドメインにおけるジンクフィンガー間のアミノ酸配列（即ち、フィ
ンガー間リンカー）の長さおよび性質に依存して、１つまたは複数のヌクレオチドにより
分離され得る。
マルチフィンガージンクフィンガー結合ドメインにおいて、隣接するジンクフィンガー
は、約５アミノ酸のアミノ酸リンカー配列（いわゆる「正準」フィンガー間リンカー）に
より、または、代わりに、１つまたは複数の非正準リンカーにより分離することができる
。例えば、米国特許第６，４５３，２４２号および第６，５３４，２６１号を参照のこと
。３を上回るフィンガーを含む、操作されたジンクフィンガー結合ドメインについて、ジ
ンクフィンガーのいくつかの間のより長い（「非正準」）フィンガー間リンカーの挿入が
、一部の例において望まれ得る。なぜなら、それによって、結合ドメインによる結合の親
和性および／または特異性が増加し得るからである。例えば、米国特許第６，４７９，６
２６号およびＷＯ０１／５３４８０を参照のこと。したがって、マルチフィンガージンク
フィンガー結合ドメインは、また、非正準フィンガー間リンカーの存在および位置に関し
て特徴付けることができる。例えば、３つのフィンガー（２つの正準フィンガー間リンカ
ーにより連結される）、長いリンカー、および３つの追加フィンガー（２つの正準フィン
ガー間リンカーにより連結される）を含む６フィンガージンクフィンガー結合ドメインは
、２×３配置と表される。同様に、２つのフィンガー（その間に正準リンカーを伴う）、
長いリンカー、および２つの追加フィンガー（正準リンカーにより連結される）を含む結
合ドメインは、２×２配置と表される。３つの２フィンガー単位（それらの各々において
、２つのフィンガーが、正準リンカーにより連結される）を含むタンパク質は、それにお
いて、各々の２フィンガー単位が、長いリンカーにより、隣接する２フィンガー単位に連
結され、３×２配置と称される。
マルチフィンガー結合ドメインにおける２つの隣接するジンクフィンガー間の長いまた
は非正準フィンガー間リンカーの存在は、しばしば、２つのフィンガーが、標的配列にお
いて直に隣接していないサブサイトに結合することを可能にする。したがって、標的部位
におけるサブサイト間に１つまたは複数のヌクレオチドのギャップがあり得る。即ち、標
的部位は、ジンクフィンガーにより接触されていない１つまたは複数のヌクレオチドを含
み得る。例えば、２×２のジンクフィンガー結合ドメインは、１つのヌクレオチドにより
分離された２つの６ヌクレオチド配列に結合することができ、即ち、それは、１３ヌクレ
オチド標的部位に結合する。Moore et al.(2001a)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:1432-
1436；Moore et al.(2001b) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:1437-1441およびＷＯ０１
／５３４８０も参照のこと。
以前に考察した通り、標的サブサイトは、単一のジンクフィンガーにより結合される３
または４ヌクレオチド配列である。ある特定の目的のために、２フィンガー単位は、「結
合モジュール」と表される。結合モジュールは、例えば、特定の６ヌクレオチド標的配列
に結合する、マルチフィンガータンパク質（一般的に、３つのフィンガー）との関連にお
いて、２つの隣接するフィンガーについて選択することにより得ることができる。あるい
は、モジュールは、個々のジンクフィンガーのアセンブリにより構築することができる。
ＷＯ９８／５３０５７およびＷＯ０１／５３４８０も参照のこと。
あるいは、ＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼに由来し得る。例えば、ホーミングエ
ンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼの認識配列、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｐ
Ｉ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−Ｓｃ
ｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ
Ｉ、およびＩ−ＴｅｖＩＩＩが公知である。米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許
第６，８３３，２５２号；Belfort et al.(1997)Nucleic Acids Res.25:3379-3388；Dujo
n et al.(1989)Gene 82:115-118；Perler et al.(1994)Nucleic Acids Res.22,1125-1127
；Jasin(1996)Trends Genet.12:224-228；Gimble et al.(1996)J. Mol. Biol.263:163-18
0；Argast et al.(1998)J. Mol. Biol.280:345-353およびNew England Biolabsカタログ
も参照のこと。加えて、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ
結合特異性は、非天然の標的部位に結合するように操作することができる。例えば、Chev
alier et al.(2002)Molec. Cell 10:895-905；Epinat et al.(2003)Nucleic Acids Res.3
1:2952-2962；Ashworth et al.(2006)Nature 441:656-659；Paques et al.(2007)Current
Gene Therapy 7:49-66；米国特許公開第２００７０１１７１２８号を参照のこと。ホー
ミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、全体として
ヌクレアーゼの関連において変えることができる（即ち、ヌクレアーゼが、同族切断ドメ
インを含むようにする）、または、異種ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ジンクフィンガー
タンパク質またはＴＡＬＥ）または異種切断ドメインに融合させることができる。メガヌ
クレアーゼ由来のＤＮＡ結合ドメインもＤＮＡ結合活性を示すことができる。
他の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、天然に存在するまたは操作された（天然に
存在しない）ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインを含む。例えば、その全体が参照に
より本明細書に組み入れられる米国特許第８，５８６，５２６号を参照のこと。キサント
モナス（Xanthomonas）属の植物病原性細菌は、重要な作物植物において多くの疾患を起
こすことが公知である。キサントモナス（Xanthomonas）の病原性は、２５を上回る異な
るエフェクタータンパク質を植物細胞中に注入する、保存されたＩＩＩ型分泌（Ｔ３Ｓ）
系に依存する。これらの注入タンパク質のうちには、植物転写アクチベータを模倣し、植
物トランスクリプトームを操る、転写アクチベータ様エフェクター（ＴＡＬＥ）がある（
Kay et al.(2007)Science 318:648-651を参照）。これらのタンパク質は、ＤＮＡ結合ド
メインおよび転写活性化ドメインを含む。最もよく特徴付けられたＴＡＬＥの１つは、キ
サントモナス・カムペストリスｐｖ．ベスカトリア（Xanthomonas campestgris pv. Vesi
catoria）からのＡｖｒＢｓ３である（Bonas et al.(1989)Mol Gen Genet 218:127-136お
よびＷＯ２０１００７９４３０を参照）。ＴＡＬＥは、タンデムリピートの集中化ドメイ
ンを含み、各リピートは、これらのタンパク質のＤＮＡ結合特異性に重要である、約３４
のアミノ酸を含む。加えて、それらは、核局在化配列および酸性転写活性化ドメイン含む
（概説については、Schornack S et al.(2006)J Plant Physiol 163(3): 256-272を参照
）。加えて、植物病原性細菌ラルストニア・ソラナケアルム（Ralstonia solanacearum）
において、ｂｒｇ１１およびｈｐｘ１７と命名される２つの遺伝子が、Ｒ．ソラナケアル
ム（R. solanacearum）次亜種１のＧＭＩ１０００株における、および次亜種４のＲＳ１
０００株におけるキサントモナス（Xanthomonas）のＡｖｒＢｓ３ファミリーに相同であ
ることが判明している（Heuer et al.(2007)Appland Envir Micro 73(13): 4379-4384を
参照）。これらの遺伝子は、ヌクレオチド配列において互いに９８．９％同一であるが、
ｈｐｘ１７のリピートドメイン中の１，５７５ｂｐの欠失だけ異なる。しかし、両方の遺
伝子産物は、キサントモナス（Xanthomonas）のＡｖｒＢｓ３ファミリータンパク質と４
０％未満の配列同一性を有する。
このように、一部の実施形態では、標的遺伝子座における標的部位に結合するＤＮＡ結
合ドメインは、植物病原体キサントモナス（Xanthomonas）（Boch et al.(2009)Science
326: 1509-1512およびMoscou and Bogdanove, (2009)Science326:1501を参照）およびラ
ルストニア（Ralstonia）（Heuer et al.(2007)Applied and Environmental Microbiolog
y 73(13): 4379-4384；米国特許第８，５８６，５２６号；第８，４２０，７８２号およ
び第８，４４０，４３１号を参照）に由来するものと同様のＴＡＬエフェクターからの操
作ドメインである。ＴＡＬＥＮはＣキャップおよび／またはＮキャップ配列を含み得る（
例えば、ＴＡＬＥ骨格のＣ末端および／またはＮ末端切断（例えば、「＋１７」、「＋６
３」Ｃキャップ））。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号を参照のこと。
別の代替物として、ＤＮＡ結合ドメインは、ロイシンジッパータンパク質に由来し得る
。ロイシンジッパーは、遺伝子発現に関連付けられる重要な転写因子である、多くの真核
生物の調節タンパク質におけるタンパク質−タンパク質相互作用に関与するタンパク質の
クラスである。ロイシンジッパーは、動物、植物、酵母などを含むいくつかの界にわたり
、これらの転写因子において共有される共通の構造モチーフを指す。ロイシンジッパーは
、ロイシン残基がα−ヘリックスを介して均一に離間されるような様式で、特定のＤＮＡ
配列に結合する２つのポリペプチド（ホモダイマーまたはヘテロダイマー）により形成さ
れ、２つのポリペプチドのロイシン残基が、最後はヘリックスの同一面上にあるようにな
る。ロイシンジッパーのＤＮＡ結合特異性は、本明細書において開示するＤＮＡ結合ドメ
インにおいて利用することができる。
切断ドメイン
上記の通り、任意のＤＮＡ結合ドメインが、切断（ヌクレアーゼ）ドメインと関連付け
られ得る。例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼは、ヌクレアーゼ機能を保持しながら
、それらのＤＮＡ結合特異性において修飾され得る。加えて、ジンクフィンガータンパク
質は、また、ヌクレアーゼ（切断）ドメインに融合され、ジンクフィンガーヌクレアーゼ
（ＺＦＮ）を形成し得る。ＴＡＬＥタンパク質は、ヌクレアーゼ（切断）ドメインに連結
され、ＴＡＬＥＮを形成し得る。
本明細書において開示する融合タンパク質の切断ドメイン部分は、任意のエンドヌクレ
アーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインが由来し得る、例
示的なエンドヌクレアーゼは、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレア
ーゼを含むが、これらに限定されない。例えば、2002-2003 Catalogue, New England Bio
labs, Beverly, MA；およびBelfort et al.(1997)Nucleic Acids Res. 25:3379-3388を参
照のこと。ＤＮＡを切断する追加の酵素が公知である（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ；マン
グビーンヌクレアーゼ；膵臓ＤＮアーゼＩ；ミクロコッカスヌクレアーゼ；酵母ＨＯエン
ドヌクレアーゼ；また、Linn et al.(eds.)Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory
Press,1993を参照）。ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼの非限定的
な例（Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、
Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−
ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、およびＩ−ＴｅｖＩＩＩを含む）が公知であ
る。また、米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許第６，８３３，２５２号；Belfor
t et al.(1997)Nucleic Acids Res.25:3379-3388；Dujon et al.(1989)Gene 82:115-118
；Perler et al.(1994)Nucleic Acids Res.22,1125-1127；Jasin (1996)Trends Genet.12
:224-228；Gimble et al.(1996)J. Mol. Biol. 263:163-180；Argast et al.(1998)J. Mo
l. Biol. 280:345-353およびNew England Biolabsカタログを参照のこと。これらの酵素
（または、それらの機能的断片）の１つまたは複数を、切断ドメインおよび切断ハーフド
メインの供給源として使用することができる。
制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は多くの種に存在し、ＤＮＡへの（認識部位での
）配列特異的結合、および結合部位で、もしくはその近くでＤＮＡを切断することが可能
である。ある特定の制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）が、認識部位から除去された部位でＤ
ＮＡを切断し、分離可能な結合ドメインおよび切断ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型
酵素ＦｏｋＩは、一方の鎖上でのその認識部位から９ヌクレオチドおよび他方の鎖上のそ
の認識部位から１３ヌクレオチドで、ＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許
第５，３５６，８０２号；第５，４３６，１５０号および第５，４８７，９９４号；なら
びにLi et al.(1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279；Li et al.(1993)Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768；Kim et al.(1994a)Proc. Natl. Acad. Sci. USA
91:883-887；Kim et al.(1994b)J. Biol. Chem. 269:31,978-31,982を参照のこと。この
ように、一実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素からの
切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）および、操作されてもされなくてもよい１つ
または複数のジンクフィンガー結合ドメインを含む。
その切断ドメインが結合ドメインから分離可能である、例示的なＩＩＳ型制限酵素はＦ
ｏｋＩである。この特定の酵素は、二量体として活性である。Bitinaite et al.(1998)Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10,570-10,575。したがって、本開示の目的のために、開
示する融合タンパク質において使用されるＦｏｋＩ酵素の部分は、切断ハーフドメインと
考えられる。このように、ジンクフィンガー−ＦｏｋＩ融合体を使用した細胞配列の標的
二本鎖切断および／または標的置換のために、各々がＦｏｋＩ切断ハーフドメインを含む
２つの融合タンパク質を使用して、触媒活性切断ドメインを再構成することができる。あ
るいは、ジンクフィンガー結合ドメインおよび２つのＦｏｋＩ切断ハーフドメインを含む
単一ポリペプチド分子を使用することもできる。ジンクフィンガー−ＦｏｋＩ融合体を使
用した標的切断および標的配列変化のためのパラメータを、本開示において他の場所で提
供する。
切断ドメインまたは切断ハーフドメインは、切断活性を保持する、または機能的な切断
ドメインを形成するために多量体化（例えば、二量体化）する能力を保持する、タンパク
質の任意の部分であり得る。
例示的なＩＩＳ型制限酵素が、米国公開第２００７０１３４７９６号に記載されており
、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
切断特異性を増強するために、切断ドメインを改変してもよい。ある特定の実施形態で
は、切断ハーフドメインのバリアントを用い、これらのバリアントは、切断ハーフドメイ
ンのホモ二量体化を最小限にする、または防止する。ＦｏｋＩの４４６位、４４７位、４
７９位、４８３位、４８４位、４８６位、４８７位、４９０位、４９１位、４９６位、４
９８位、４９９位、５００位、５３１位、５３４位、５３７位、および５３８位のアミノ
酸残基は、ＦｏｋＩ切断ハーフドメインの二量体化に影響を与えるための全ての標的であ
る。そのような改変された切断ハーフドメインの非限定的な例は、米国特許第７，８８８
，１２１号；第７，９１４，７９６号および第８，０３４，５９８号において詳細に記載
されており、参照により本明細書に組み入れられる。実施例も参照のこと。
偏性ヘテロ二量体を形成する、ＦｏｋＩの追加の操作された切断ハーフドメインも、本
明細書に記載するＺＦＮにおいて使用することができる。偏性ヘテロ二量体を形成する、
ＦｏｋＩの例示的な操作された切断ハーフドメインは対を含み、それにおいて、第１の切
断ハーフドメインが、ＦｏｋＩの４９０位および５３８位のアミノ酸残基に変異を含み、
第２の切断ハーフドメインが、アミノ酸残基４８６および４９９に変異を含む。
このように、一実施形態では、４９０での変異は、Ｇｌｕ（Ｅ）をＬｙｓ（Ｋ）で置換
する。５３８での変異は、Ｉｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で置換する。４８６での変異は、
Ｇｌｎ（Ｑ）をＧｌｕ（Ｅ）で置換する。４９９位での変異は、Ｉｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（
Ｋ）で置換する。具体的には、本明細書に記載する操作された切断ハーフドメインは、１
つの切断ハーフドメインにおいて４９０位（Ｅ→Ｋ）および５３８位（Ｉ→Ｋ）を変異さ
せ、「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」と命名された操作された切断ハーフドメインを産生し、
別の切断ハーフドメインにおいて４８６位（Ｑ→Ｅ）および４９９位（Ｉ→Ｌ）を変異さ
せ、「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」と命名された操作された切断ハーフドメインを産生する
ことにより調製した。本明細書に記載する操作された切断ハーフドメインは、異常な切断
が最小化または無効にされた偏性ヘテロ二量体変異体である。例えば、米国特許第７，９
１４，７９６号および第８，０３４，５９８号を参照のこと。その開示は、全ての目的の
ために参照により組み入れられる。ある特定の実施形態では、操作された切断ハーフドメ
インは、４８６位、４９９位、および４９６位（野生型ＦｏｋＩと比べたナンバリング）
の変異、例えば、４８６位の野生型Ｇｌｎ（Ｑ）残基をＧｌｕ（Ｅ）残基で、４９９位の
野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｅｕ（Ｌ）残基で、および４９６位の野生型Ａｓｎ（Ｎ）残
基をＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）残基で置換する変異（それぞれ「ＥＬＤ」および「
ＥＬＥ」ドメインとも称される）を含む。他の実施形態では、操作された切断ハーフドメ
インは、４９０位、５３８位、および５３７位（野生型ＦｏｋＩと比べたナンバリング）
の変異、例えば、４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で、５３８位の
野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で、および５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残
基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基で置換する変異（それぞれ「ＫＫＫ」およ
び「ＫＫＲ」ドメインとも称される）を含む。他の実施形態では、操作された切断ハーフ
ドメインは、４９０位および５３７位（野生型ＦｏｋＩと比べたナンバリング）の変異、
例えば、４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で、および５３７位の野
生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基で置換する変異（それ
ぞれ「ＫＩＫ」および「ＫＩＲ」ドメインとも称される）を含む。（米国特許公開第２０
１１０２０１０５５号を参照）。他の実施形態では、操作された切断ハーフドメインは「
Ｓｈａｒｋｅｙ」および／または「Ｓｈａｒｋｅｙ’」変異を含む（Guo et al.(2010)J.
Mol. Biol. 400(1):96-107を参照）。
本明細書に記載する操作された切断ハーフドメインは、任意の適した方法を使用して、
例えば、米国特許第７，９１４，７９６号；第８，０３４，５９８号および第８，６２３
，６１８号；および米国特許公開第２０１１０２０１０５５号に記載される通り、野生型
切断ハーフドメイン（Ｆｏｋ Ｉ）の部位特異的変異誘発により調製することができる。
他の実施形態では、ヌクレアーゼは、また、操作されたＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン
およびヌクレアーゼドメイン（例えば、エンドヌクレアーゼおよび／またはメガヌクレア
ーゼドメイン）（ＴＡＬＥＮとも称される）を含む。ユーザーの選択の標的配列との頑強
で部位特異的な相互作用のために、これらのＴＡＬＥＮタンパク質を操作するための方法
および組成物が公開されている（米国特許第８，５８６，５２６号を参照）。一部の実施
形態では、ＴＡＬＥＮは、エンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）切断ドメインまたは
切断ハーフドメインを含む。他の実施形態では、ＴＡＬＥヌクレアーゼはメガＴＡＬであ
る。これらのメガＴＡＬヌクレアーゼは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインおよびメガヌク
レアーゼ切断ドメインを含む融合タンパク質である。メガヌクレアーゼ切断ドメインは、
単量体として活性であり、活性のために二量体化を要求しない。（Boissel et al.(2013)
Nucl Acid Res: 1-13, doi: 10.1093/nar/gkt1224を参照）。加えて、ヌクレアーゼドメ
インは、また、ＤＮＡ結合機能を示し得る。
またさらなる実施形態では、ヌクレアーゼは、コンパクトＴＡＬＥＮ（ｃＴＡＬＥＮ）
を含む。これらは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインをＴｅｖＩヌクレアーゼドメインに連
結する一本鎖融合タンパク質である。融合タンパク質は、ＴＡＬＥ領域により局在化され
たニッカーゼとして作用することができる、または、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが、
ＴｅｖＩヌクレアーゼドメインに関して位置付けられる場所に依存して、二本鎖切断を作
製することができる（Beurdeley et al.(2013)Nat Comm: 1-8 DOI: 10.1038/ncomms2782
を参照）。任意のＴＡＬＥＮは、追加のＴＡＬＥＮ（例えば、１つまたは複数のメガＴＡ
Ｌを伴う、１つまたは複数のＴＡＬＥＮ（ｃＴＡＬＥＮまたはＦｏｋＩ−ＴＡＬＥＮ））
との組合せにおいて使用され得る。
ヌクレアーゼは、ｉｎ ｖｉｖｏの核酸標的部位での、いわゆる「スプリット酵素」技
術（例えば、米国特許公開第２００９００６８１６４号を参照）の使用を含む、標準的な
技術を使用してアセンブルされ得る。そのようなスプリット酵素の成分は、別々の発現構
築物で発現され得るか、または個々の成分が、例えば、自己切断２ＡペプチドまたはＩＲ
ＥＳ配列により分離された、１つのオープンリーディングフレームにおいて連結すること
ができる。成分は、個々のジンクフィンガー結合ドメインまたはメガヌクレアーゼ核酸結
合ドメインのドメインであり得る。
ヌクレアーゼは、例えば、米国特許第８，５６３，３１４号に記載される酵母ベースの
染色体系における使用の前に、活性についてスクリーニングすることができる。ヌクレア
ーゼ発現構築物は、当技術分野において公知の方法を使用して容易に設計することができ
る。例えば、米国特許公開２００３０２３２４１０；２００５０２０８４８９；２００５
００２６１５７；２００５００６４４７４；２００６０１８８９８７；２００６００６３
２３１；および国際公開ＷＯ０７／０１４２７５を参照のこと。ヌクレアーゼの発現は、
構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター、例えば、ラフィノースおよび／またはガ
ラクトースの存在下において活性化（脱抑制）され、グルコースの存在下において抑制さ
れるガラクトキナーゼプロモーターの制御下であり得る。
ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含む。系のＲＮＡ
成分をコードするＣＲＩＳＰＲ（クラスタ化され、定期的に間隔のあいた短いパリンドロ
ームリピート）遺伝子座、およびタンパク質をコードするｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺
伝子座（Jansen et al., 2002.Mol.Microbiol.43: 1565-1575；Makarova et al., 2002.N
ucleic Acids Res. 30: 482-496；Makarova et al., 2006.Biol. Direct 1: 7；Haft et
al., 2005. PLoS Comput.Biol. 1:e60）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系の遺伝
子配列を構成する。微生物宿主におけるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃ
ａｓ）遺伝子の組合せ、ならびにＣＲＩＳＰＲ媒介性核酸切断の特異性をプログラムする
ことが可能な非コードＲＮＡエレメントを含む。
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲは、最もよく特徴付けられた系の１つであり、４つの連続ステップ
において標的ＤＮＡ二本鎖切断を行う。第一に、２つの非コードＲＮＡ、プレｃｒＲＮＡ
アレイ、およびｔｒａｃｒＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。第二に、ｔ
ｒａｃｒＲＮＡは、プレｃｒＲＮＡのリピート領域にハイブリダイズし、個々のスペーサ
ー配列を含む成熟ｃｒＲＮＡへのプレｃｒＲＮＡのプロセシングを媒介する。第三に、成
熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体は、標的認識のための追加要件である、ｃｒＲＮ
Ａ上のスペーサーと、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の次の標的ＤＮＡ上のプ
ロトスペーサーとの間でのワトソン・クリック塩基対形成を介して、標的ＤＮＡにＣａｓ
９を向ける。最後に、Ｃａｓ９は、プロトスペーサー内の二本鎖切断を作製するための標
的ＤＮＡの切断を媒介する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の活性は、３つのステップで構成さ
れる：（ｉ）「適応」と呼ばれるプロセスにおいて、将来の攻撃を防止するためのＣＲＩ
ＳＰＲアレイ中への外来ＤＮＡ配列の挿入、（ｉｉ）関連タンパク質の発現、ならびにア
レイの発現およびプロセシング、それに続く（ｉｉｉ）外来核酸へのＲＮＡ媒介干渉。こ
のように、細菌細胞中で、いわゆる「Ｃａｓ」タンパク質のいくつかが、ＣＲＩＳＰＲ／
Ｃａｓ系の自然な機能に関与し、外来ＤＮＡの挿入などの機能において役割を果たす。
ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、天然に存在するＣａｓタンパク質の「
機能的誘導体」であり得る。天然配列ポリペプチドの「機能的誘導体」は、天然配列ポリ
ペプチドと共通の定性的な生物学的特性を有する化合物である。「機能的誘導体」は、そ
れらが、対応する天然配列ポリペプチドと共通の生物学的活性を有するという条件で、天
然配列の断片ならびに天然配列ポリペプチドの誘導体およびその断片を含むが、これらに
限定されない。本明細書において検討する生物学的活性は、ＤＮＡ基質を断片に加水分解
する、機能的誘導体の能力である。用語「誘導体」は、ポリペプチドのアミノ酸配列バリ
アント、共有結合修飾、およびそれらの融合体の両方を包含する。Ｃａｓポリペプチドま
たはその断片の適切な誘導体は、Ｃａｓタンパク質またはその断片の変異体、融合体、共
有結合修飾を含むが、これらに限定されない。Ｃａｓタンパク質またはその断片を含むＣ
ａｓタンパク質、ならびにＣａｓタンパク質の誘導体またはその断片は、細胞から入手可
能であり得る、または化学的に、もしくはこれらの２つの手順の組合せにより合成され得
る。細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然で産生する細胞、あるいは、Ｃａｓタンパク質を天
然で産生し、内因性Ｃａｓタンパク質をより高い発現レベルで産生するように、または外
因的に導入された核酸（その核酸は、内因性Ｃａｓと同じまたはそれとは異なるＣａｓを
コードする）からＣａｓタンパク質を産生するように遺伝学的に操作された細胞であり得
る。一部の場合において、細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然で産生せず、Ｃａｓタンパク
質を産生するように遺伝学的に操作されている。例えば、米国仮出願第６１／８２３，６
８９号を参照のこと。
このように、ヌクレアーゼは、結合部位でまたはその近くでＤＮＡを切断するヌクレア
ーゼドメインと組み合わせて、任意の遺伝子中の標的部位に特異的に結合するＤＮＡ結合
ドメインを含む。
融合タンパク質
融合タンパク質（および同をコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のための
方法は、当業者に公知である。例えば、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ジンクフィンガー
ドメイン、ＴＡＬＥ）および調節ドメインまたは切断ドメイン（または切断ハーフドメイ
ン）を含む融合タンパク質、ならびに、そのような融合タンパク質をコードするポリヌク
レオチドの設計および構築のための方法は、米国特許第８，５８６，５２６号；第８，５
９２，６４５号；第８，３９９，２１８号；第８，３２９，９８６号；第７，８８８，１
２１号；第６，４５３，２４２号；および第６，５３４，２６１号ならびに米国特許出願
公開２００７／０１３４７９６に記載されており、本明細書にその全体が参照により組み
入れられる。ある特定の実施形態では、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが
構築される。これらのポリヌクレオチドは、ベクター中に挿入することができ、ベクター
は、細胞中に導入することができる（細胞中にポリヌクレオチドを導入するためのベクタ
ーおよび方法に関する追加の開示については、以下を参照）。
本明細書に記載する方法のある特定の実施形態では、ジンクフィンガーヌクレアーゼま
たはＴＡＬＥＮは、ジンクフィンガー結合ドメインまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン
およびヌクレアーゼドメイン（例えば、ＩＩＳ型制限酵素および／またはメガヌクレアー
ゼドメイン）を含む融合タンパク質を含む。ある特定の実施形態では、ＺＦＮまたはＴＡ
ＬＥＮは、ＦｏｋＩ制限酵素からの切断ハーフドメインを含み、２つのそのような融合タ
ンパク質は細胞中で発現される。細胞中での２つの融合タンパク質の発現は、２つのタン
パク質の細胞への送達；１つのタンパク質およびタンパク質の１つをコードする１つの核
酸の細胞への送達；各々がタンパク質の１つをコードする２つの核酸の細胞への送達から
もたらされ得る；または両方のタンパク質をコードする単一の核酸の細胞への送達により
得る。追加の実施形態では、融合タンパク質は、２つの切断ハーフドメインおよびジンク
フィンガードメインまたはＴＡＬＥ結合ドメインを含む単一ポリペプチド鎖を含む。この
場合において、単一の融合タンパク質は、細胞中で発現され、理論により拘束されること
を望まないが、切断ハーフドメインの分子内二量体の形成の結果として、ＤＮＡを切断す
ると考えられる。
ある特定の実施形態では、融合タンパク質（例えば、ＺＦＰ−ＦｏｋＩ融合体）の成分
が、ＤＮＡ結合ドメインが融合タンパク質のアミノ末端に最も近く、切断ハーフドメイン
がカルボキシ末端に最も近いように配置される。これは、天然に存在する二量体化切断ド
メイン（例えばＦｏｋＩ酵素に由来するものなど）中での切断ドメインの相対的配向を反
映し、それにおいて、ＤＮＡ結合ドメインはアミノ末端に最も近く、切断ハーフドメイン
はカルボキシ末端に最も近い。これらの実施形態では、機能的ヌクレアーゼを形成するた
めの切断ハーフドメインの二量化が、反対側のＤＮＡ鎖上の部位への融合タンパク質の結
合によりもたらされ、結合部位の５’末端は互いに近位である。
追加の実施形態では、融合タンパク質（例えば、ＺＦＰ−ＦｏｋＩ融合体）の成分は、
切断ハーフドメインが融合タンパク質のアミノ末端に最も近く、ジンクフィンガードメイ
ンがカルボキシ末端に最も近いように配置される。これらの実施形態では、機能的ヌクレ
アーゼを形成するための切断ハーフドメインの二量化が、反対側のＤＮＡ鎖上の部位への
融合タンパク質の結合によりもたらされ、結合部位の３’末端は互いに近位である。
さらに追加の実施形態では、第１の融合タンパク質は、融合タンパク質のアミノ末端に
最も近い切断ハーフドメイン、およびカルボキシ末端に最も近いジンクフィンガードメイ
ンを含み、第２の融合タンパク質は、ジンクフィンガードメインが融合タンパク質のアミ
ノ末端に最も近いように、および、切断ハーフドメインがカルボキシ末端に最も近いよう
に配置される。これらの実施形態では、両方の融合タンパク質が、同じＤＮＡ鎖に結合し
、カルボキシ末端に最も近いジンクフィンガードメインを含む第１の融合タンパク質の結
合部位が、アミノ末端に最も近いジンクフィンガードメインを含む第２の融合タンパク質
の結合部位の５’側に位置する。
開示する融合タンパク質のある特定の実施形態では、ジンクフィンガードメインと切断
ドメイン（または切断ハーフドメイン）の間のアミノ酸配列は、「ＺＣリンカー」と表記
される。ＺＣリンカーは、上で考察したフィンガー間リンカーとは区別すべきである。切
断を最適化するＺＣリンカーの入手に関する詳細については、例えば、米国特許第７，８
８８，１２１号を参照のこと。
一実施形態では、本開示は、表２に示す認識ヘリックスのアミノ酸配列の１つまたは複
数を有するジンクフィンガータンパク質を含むＺＦＮを提供する（例えば、表２の単一の
列に示す、認識ヘリックスを伴う成分ジンクフィンガードメインで構成されるジンクフィ
ンガータンパク質）。別の実施形態では、本明細書において提供するのは、表２または１
２に示す１つまたは複数の認識ヘリックスを有するＺＦＰをコードするヌクレオチド配列
を含むＺＦＰ発現ベクターである。別の実施形態では、本明細書において提供するのは、
表３または１３に示す標的部位に結合するＺＦＰ、あるいは表３または１３に示す標的部
位に結合するＺＦＰをコードするポリヌクレオチドである。
標的部位
開示する方法および組成物は、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥなど）
および調節ドメインまたは切断（例えば、ヌクレアーゼ）ドメイン（または切断ハーフド
メイン）を含む融合タンパク質を含み、それにおいて、ＤＮＡ結合ドメインは、１つまた
は複数の植物遺伝子における細胞クロマチン中の配列に結合することにより、標的配列の
近傍中への１つまたは複数の外因性配列（導入遺伝子を含む）の切断および標的組み込み
を誘導する。
本開示における他の場所に示す通り、ＤＮＡ結合ドメインは、実質的に任意の所望の配
列に結合するように操作することができる。したがって、遺伝子調節、切断、または組換
えが望まれる配列を含む、目的の領域を同定した後、１つまたは複数のＤＮＡ結合ドメイ
ンを、目的の領域内の１つまたは複数の配列に結合するように操作することができる。あ
る特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、表３または表１３に示す通り、１つまた
は複数のＡＨＡＳ遺伝子中の標的部位に結合するジンクフィンガータンパク質を含む。
ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、標的部位）による結合のための任意の遺伝子の細胞クロ
マチンにおける目的のゲノム領域内の標的部位の選択は、例えば、米国特許第６，４５３
，２４２号に開示される方法に従って達成することができる。ヌクレオチド配列の簡単な
目視検査も、標的部位の選択のために使用することができることが当業者には明らかであ
ろう。したがって、標的部位選択のための任意の手段は、特許請求される方法において使
用することができる。
標的部位は、一般的に、複数の隣接する標的サブサイトで構成される。ジンクフィンガ
ータンパク質の場合において、標的サブサイトは、個々のジンクフィンガーにより結合さ
れた配列（通常、ヌクレオチドトリプレット、または隣接するクアドラプレットと１ヌク
レオチドだけ重複することができるヌクレオチドクアドラプレットのいずれか）を指す。
例えば、米国特許第６，７９４，１３６号を参照のこと。ジンクフィンガータンパク質が
最も接触する鎖が、標的鎖「一次認識鎖」または「一次接触鎖」と命名される場合、一部
のジンクフィンガータンパク質は、標的鎖中の３つの塩基トリプレットおよび非標的鎖上
の４番目の塩基に結合する。標的部位は、一般的に、少なくとも９ヌクレオチドの長さを
有し、したがって、少なくとも３つのジンクフィンガーを含むジンクフィンガー結合ドメ
インにより結合される。しかし、例えば、１２ヌクレオチド標的部位への４フィンガー結
合ドメインの、１５ヌクレオチド標的部位への５フィンガー結合ドメインの、または１８
ヌクレオチド標的部位への６フィンガー結合ドメインの結合も可能である。明らかであろ
う通り、より長い標的部位へのより大きな結合ドメイン（例えば、７、８、９フィンガー
およびそれ以上）の結合も可能である。
標的部位は、３ヌクレオチドの倍数である必要はない。例えば、交差鎖相互作用が起こ
る場合において（例えば、米国特許第６，４５３，２４２号および第６，７９４，１３６
号を参照）、マルチフィンガー結合ドメインの個々のジンクフィンガーの１つまたは複数
が、重複するクアドラプレットサブサイトに結合することができる。結果として、３フィ
ンガータンパク質は、１０ヌクレオチド配列に結合することができ、それにおいて第１０
ヌクレオチドは、末端フィンガーにより結合されるクアドラプレットの部分であり、４フ
ィンガータンパク質は、１３ヌクレオチド配列に結合することができ、それにおいて第１
３ヌクレオチドは、末端フィンガーにより結合されるクアドラプレットの部分などである
。
ある特定の実施形態では、標的部位は、ＡＨＡＳ遺伝子座（非翻訳領域、例えばＡＨＡ
Ｓの３’非翻訳領域などを含む）中にある。適切なＡＨＡＳ標的部位の非限定的な例を、
表３および表１３に示す。ＡＨＡＳ（ＡＨＡＳ／ＡＬＳとしても公知）遺伝子は、トウモ
ロコシ、ダイズ、綿、シロイヌナズナ（Arabidopsis）、イネ、ヒマワリ、小麦、大麦、
テンサイ、およびアブラナ（Brassica）を含むが、これらに限定されない全ての主要な植
物種に存在する。ＡＨＡＳ構造遺伝子配列に対する特定のアミノ酸修飾が記載されており
、それらは、植物の性能に対する負のペナルティを伴わず、結果として生じる、除草剤の
種々の構造クラスに対するタンパク質の感受性を変化させる。例えば、イミダゾリノン耐
性トウモロコシ（トウモロコシ（Zea mays L.））［Currie RS, Kwon CS and Penner D,
Magnitude of imazethapyr resistance of corn (Zea mays) hybrids with altered acet
olactate synthase. Weed Sci 43:578-582 (1995)、Wright TR and Penner D, Corn (Zea
mays) acetolactate synthase sensitivity to four classes of ALS-inhibiting herbi
cides. Weed Sci 46:8-12 (1998)、Siehl DL, Bengtson AS, Brockman JP, Butler JH, K
raatz GW, Lamoreaux RJ and Subramanian MV, Patterns of cross tolerance to herbic
ides inhibiting acetohydroxyacid synthase in commercial corn hybrids designed fo
r tolerance to imidazolinones. Crop Sci 36:274-278(1996)、およびBailey WA and Wi
lcut JW, Tolerance of imidazolinone-resistant corn (Zea mays) to diclosulam. Wee
d Technol 17:60-64 (2003)］、イネ（イネ（Oryza sativa L.））［Webster EP and Mas
son JA, Acetolactate synthase-inhibiting herbicides on imidazolinone-tolerant ri
ce. Weed Sci 49:652-657 (2001)およびGealy DR, Mitten DH and Rutger JN, Gene flow
between red rice (Oryza sativa) and herbicide-resistant rice (O sativa): implic
ations for weed management. Weed Technol 17:627-645 (2003)］、パン用小麦（パンコ
ムギ（Triticum aestivum L.））［Newhouse K, Smith WA, Starrett MA, Schaefer TJ a
nd Singh BK, Tolerance to imidazolinone herbicides in wheat. Plant Physiol 100:8
82-886(1992)およびPozniak CJ and Hucl PJ, Genetic analysis of imidazolinone resi
stance in mutation-derived lines of common wheat. Crop Sci 44:23-30(2004)］、お
よびアブラナ（セイヨウアブラナ（Brassica napus）およびカラシナ（B. juncea L. Cze
rn.））［Shaner DL, Bascomb NF and Smith W, Imidazolinoneresistant crops: select
ion, characterization and management, in Herbicide resistant crops, edited by Du
ke SO, CRC Press, Boca Raton, pp 143-157 (1996)およびSwanson EB, Herrgesell MJ,
Arnoldo M, Sippell DW and Wong RSC, Microspore mutagenesis and selection: canola
plants with field tolerance to the imidazolinones. Theor Appl Genet 78:525-530(
1989)］が変異誘発、選択、および従来の育種技術を介して開発されており、１９９２年
、２００３年、２００２年、および１９９６年以来にそれぞれ商業化されている。イミダ
ゾリノン除草剤に対して耐性であるＡＨＡＳ酵素をコードするいくつかのＡＨＡＳ遺伝子
が、自然発生する変異として、化学的変異誘発のプロセスを介して、植物において発見さ
れている。Ｓ６５３Ｎ変異は、植物中のイミダゾリノン除草剤に対する耐性をもたらす、
ＡＨＡＳ遺伝子における５つの最も一般的な単一点変異の１つである（Tan, S.,Evans, R
.R.,Dahmer, M.L.,Singh, B.K.,and Shaner, D.L.(2005)Imidazolinone-tolerant crops:
History, current status and future. Pest Manag. Sci. 61:246-257）。
マルチフィンガー結合ドメインにおける個々のジンクフィンガー間のアミノ酸リンカー
配列の長さおよび性質も、標的配列への結合に影響する。例えば、マルチフィンガー結合
ドメインにおける隣接するジンクフィンガー間のいわゆる「非正準リンカー」、「長いリ
ンカー」、または「構造化リンカー」の存在によって、それらのフィンガーが、直に隣接
していないサブサイトに結合することを可能にする。そのようなリンカーの非限定的な例
は、例えば、米国特許第６，４７９，６２６号および第７，８５１，２１６号に記載され
ている。したがって、１つまたは複数のサブサイトが、ジンクフィンガー結合ドメインの
ための標的部位において、１、２、３、４、５またはそれ以上のヌクレオチドにより互い
に分離することができる。一例だけ提供すると、４フィンガー結合ドメインは、配列中に
、２つの隣接する３ヌクレオチドサブサイト、介在ヌクレオチド、および２つの隣接する
トリプレットサブサイトを含む１３ヌクレオチド標的部位に結合することができる。また
、異なる数のヌクレオチドにより分離された標的部位に結合するために人工ヌクレアーゼ
を連結するための組成物および方法については、米国特許公開第２００９０３０５４１９
号および第２０１１０２８７５１２号を参照のこと。配列（例えば、標的部位）間の距離
は、互いに最も近い配列の端から測定される、２つの配列間に介在するヌクレオチドまた
はヌクレオチド対の数を指す。
ある特定の実施形態では、転写因子の機能を伴うＤＮＡ結合ドメインは、例えば、ＤＮ
Ａ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ）および転写調節ドメイン（例えば、活
性化ドメインまたは抑制ドメイン）を含む融合タンパク質を構築することにより設計され
る。転写因子の機能のために、プロモーターへの単純な結合およびそれとの十分な近接が
、一般的に必要とされる全てである。プロモーターに対する正確なポジショニング、配向
、および限度内、距離は、大きな問題にはならない。この特色によって、人工的な転写因
子を構築するために標的部位を選ぶ際での、かなりの柔軟性が可能になる。ＤＮＡ結合ド
メインにより認識される標的部位は、したがって、任意選択で調節ドメインに連結される
、遺伝子発現の活性化または抑制を可能にする、標的遺伝子における任意の適切な部位で
あり得る。好ましい標的部位は、転写開始部位に隣接する、その下流、またはその上流の
領域を含む。加えて、標的部位は、エンハンサー領域、リプレッサー部位、ＲＮＡポリメ
ラーゼ休止部位、および特定の調節部位（例えば、ＳＰ−１部位、低酸素応答エレメント
、核内受容体認識エレメント、ｐ５３結合部位）、ｃＤＮＡコード領域中の部位中に、ま
たは発現配列タグ（ＥＳＴ）コード領域中に位置する。
他の実施形態では、ヌクレアーゼ活性を伴うＺＦＰが設計される。ジンクフィンガー結
合ドメインおよび切断ドメインを含む融合タンパク質を含むＺＦＮの（または、各々がジ
ンクフィンガー結合ドメインおよび切断ハーフドメインを含む２つの融合タンパク質の）
発現が、細胞中で、標的配列の近傍における切断に影響する。ある特定の実施形態では、
切断は、２つのジンクフィンガードメイン／切断ハーフドメイン融合分子と別々の標的部
位の結合に依存する。２つの標的部位は、反対側のＤＮＡ鎖上に存在し得る、または、代
わりに、両方の標的部位は、同じＤＮＡ鎖上にあり得る。
種々のアッセイを使用して、ＺＦＰが遺伝子発現をモジュレートするか否かを決定する
ことができる。特定のＺＦＰの活性を、種々のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏア
ッセイを使用して、例えば、タンパク質またはｍＲＮＡレベル、産物レベル、酵素活性、
レポーター遺伝子の転写活性化または抑制を測定することにより（例えば、免疫アッセイ
（例えば、抗体を用いたＥＬＩＳＡおよび免疫組織化学アッセイ）、ハイブリダイゼーシ
ョンアッセイ（例えば、ＲＮａｓｅ保護、ノーザン、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーシ
ョン、オリゴヌクレオチドアレイ研究）、比色定量アッセイ、増幅アッセイ、酵素活性ア
ッセイ、表現型アッセイなどを使用して）評価することができる。
ＺＦＰは、典型的には、最初に、ＥＬＩＳＡアッセイを使用し、次に酵母発現系を使用
し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性について試験される。ＺＦＰは、しばしば、最初に、レポ
ーター遺伝子を用いた一過性発現系を使用して試験され、次に、標的内因性遺伝子の調節
は、細胞中および植物全体において、ｉｎ ｖｉｖｏでもｅｘ ｖｉｖｏでも試験される
。ＺＦＰは、細胞中で組換え発現させる、植物中に移植された細胞中で組換え発現させる
、またはトランスジェニック植物中で組換え発現させる、ならびに、下に記載する送達媒
体を使用して、タンパク質として植物または細胞中に投与することができる。細胞は、固
定化する、溶液中にある、植物中に注入する、またはトランスジェニック植物もしくは非
トランスジェニック植物において自然発生し得る。
トランスジェニック植物および非トランスジェニック植物は、また、ｉｎ ｖｉｖｏで
内因性遺伝子発現の調節を検証するための好ましい実施形態として使用される。トランス
ジェニック植物は、選択されたＺＦＰを安定的に発現することができる。あるいは、選択
されたＺＦＰを一過性に発現する、またはＺＦＰが送達媒質中で投与された植物を使用す
ることができる。内因性遺伝子発現の調節は、本明細書に記載するアッセイのいずれか１
つを使用して試験される。
標的切断のための方法
開示する方法および組成物を使用し、細胞クロマチンにおける目的の領域で（例えば、
ゲノム中の所望の、または所定の部位で、例えば、ＡＨＡＳ遺伝子内で、またはそれに隣
接して）ＤＮＡを切断することができる。そのような標的化ＤＮＡ切断のために、ＤＮＡ
結合ドメイン（例えば、ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥ）は、所定の切断部
位で、またはその近くの標的部位に結合するように操作され、操作されたジンクフィンガ
ー結合ドメインおよび切断ドメインを含む融合タンパク質が、細胞中で発現される。標的
部位への融合タンパク質のＤＮＡ結合部分の結合時、ＤＮＡは、切断ドメインにより標的
部位の近くで切断される。
あるいは、各々がＤＮＡ結合ドメインおよび切断ハーフドメインを含む２つの融合タン
パク質が、細胞中で発現され、機能的切断ドメインが再構成され、ＤＮＡが標的部位の近
傍で切断されるように並置された標的部位に結合する。一実施形態では、切断は、２つの
ＤＮＡ結合ドメインの標的部位の間で起こる。ジンクフィンガー結合ドメインの１つまた
は両方を操作することができる。
ジンクフィンガー結合ドメイン−切断ドメイン融合ポリペプチドを使用した標的切断に
ついて、結合部位は切断部位を包含することができる、または、結合部位の近端は、切断
部位から１、２、３、４、５、６、１０、２５、５０またはそれ以上のヌクレオチド（ま
たは１〜５０ヌクレオチドの間の任意の整数値）であり得る。結合部位の正確な位置は、
切断部位に関して、特定の切断ドメインおよびＺＣリンカーの長さに依存する。各々がジ
ンクフィンガー結合ドメインおよび切断ハーフドメインを含む２つの融合ポリペプチドが
使用される方法については、結合部位は、一般的に、切断部位にまたがる。このように、
第１の結合部位の近端は、切断部位の一方の側で、１、２、３、４、５、６、１０、２５
またはそれ以上のヌクレオチド（または１〜５０ヌクレオチドの間の任意の整数値）であ
り得、第２の結合部位の近端は、切断部位の他方の側で、１、２、３、４、５、６、１０
、２５またはそれ以上のヌクレオチド（または１〜５０ヌクレオチドの間の任意の整数値
）であり得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの切断部位のマッピングのため
の方法が、当業者に公知である。
このように、本明細書に記載する方法では、切断ドメインに融合された、操作されたジ
ンクフィンガー結合ドメインを用いることができる。これらの場合において、結合ドメイ
ンは、切断が望まれる場所で、またはその近くで標的配列に結合するように操作される。
融合タンパク質、または同をコードするポリヌクレオチドが、植物細胞中に導入される。
一度、細胞中に導入される、またはそれにおいて発現されると、融合タンパク質は、標的
配列に結合し、標的配列で、またはその近くで標的配列を切断する。切断の正確な部位は
、切断ドメインの性質ならびに／あるいは結合ドメインと切断ドメインの間のリンカー配
列の存在および／または性質に依存する。各々が切断ハーフドメインを含む２つの融合タ
ンパク質を使用する場合において、結合部位の近端間の距離は１、２、３、４、５、６、
７、８、９、１０、２５またはそれ以上のヌクレオチド（または１〜５０ヌクレオチドの
間の任意の整数値）であり得る。切断の最適レベルは、また、２つの融合タンパク質の結
合部位間の距離（例えば、Smith et al.(2000)Nucleic Acids Res. 28:3361-3369；Bibik
ova et al. (2001)Mol. Cell. Biol. 21:289-297を参照）および各融合タンパク質中のＺ
Ｃリンカーの長さの両方に依存する。また、米国特許公開２００５００６４４７４Ａ１お
よび国際特許公開ＷＯ０５／０８４１９０、ＷＯ０５／０１４７９１およびＷＯ０３／０
８０８０９を参照のこと。
ある特定の実施形態では、切断ドメインは、２つの切断ハーフドメインを含み、それら
の両方が、結合ドメインを含む単一ポリペプチドの一部（第１の切断ハーフドメインおよ
び第２の切断ハーフドメイン）である。切断ハーフドメインは、それらがＤＮＡを切断す
るように機能する限り、同じアミノ酸配列または異なるアミノ酸配列を有することができ
る。
切断ハーフドメインは、また、別々の分子において提供されてもよい。例えば、２つの
融合ポリペプチドを細胞中に導入してもよく、それにおいて、各々のポリペプチドは、結
合ドメインおよび切断ハーフドメインを含む。切断ハーフドメインは、それらがＤＮＡを
切断するように機能する限り、同じアミノ酸配列または異なるアミノ酸配列を有すること
ができる。さらに、結合ドメインは、典型的には、融合ポリペプチドの結合時に、２つの
切断ハーフドメインが互いに、切断ドメインの再構成（例えば、ハーフドメインの二量体
化により）を可能にする空間的配向で提示されるように配置されている標的配列に結合し
、それにより、機能的切断ドメインを形成するように互いに対してハーフドメインを位置
付け、目的の領域における細胞クロマチンの切断をもたらす。一般的に、再構成された切
断ドメインによる切断は、２つの標的配列間に位置する部位で起こる。タンパク質の一方
または両方を、その標的部位に結合するように操作することができる。
２つの融合タンパク質は、同じまたは反対の極性において目的の領域に結合することが
でき、それらの結合部位（即ち、標的部位）は、任意の数のヌクレオチド、例えば０〜２
００ヌクレオチドまたはその間の任意の整数値により分離することができる。ある特定の
実施形態では、各々がジンクフィンガー結合ドメインおよび切断ハーフドメインを含む２
つの融合タンパク質についての結合部位は、他の結合部位に最も近い各結合部位の端から
測定して、５〜１８ヌクレオチド離れて、例えば、５〜８ヌクレオチド離れて、または１
５〜１８ヌクレオチド離れて、または６ヌクレオチド離れて、または１６ヌクレオチド離
れて位置することができ、切断が、結合部位間で起こる。
ＤＮＡが切断される部位は、一般的に、２つの融合タンパク質についての結合部位間に
ある。ＤＮＡの二本鎖切断は、しばしば、２つの一本鎖切断、または「ニック」、１、２
、３、４、５、６またはそれ以上のヌクレオチドによるオフセットに起因する（例えば、
天然ＦｏｋＩによる二本鎖ＤＮＡの切断は、４ヌクレオチドによる一本鎖切断オフセット
に起因する）。このように、切断は、必ずしも、各ＤＮＡ鎖上の正確に反対の部位で起こ
るわけではない。加えて、融合タンパク質の構造および標的部位間の距離は、切断が、単
一ヌクレオチド対に隣接して起こるか否か、または切断がいくつかの部位で起こるか否か
に影響し得る。しかし、標的組換えおよび標的変異誘発（下記参照）を含む多くの適用に
ついて、ヌクレオチドの範囲内での切断は、一般的に十分であり、特定の塩基対間での切
断は要求されない。
上記の通り、融合タンパク質は、ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドとして
導入することができる。例えば、各々が上記のポリペプチドの１つをコードする配列を含
む２つのポリヌクレオチドを細胞中に導入することができ、ポリペプチドが発現され、各
々がその標的配列に結合する際、切断が、標的配列で、またはその近くで起こる。あるい
は、両方の融合ポリペプチドをコードする配列を含む単一のポリヌクレオチドが、細胞中
に導入される。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、あるいは任意の改変形態または類
似体またはＤＮＡおよび／もしくはＲＮＡであり得る。
切断特異性を増強するために、追加の組成物は、また、本明細書に記載する方法におい
て用いることができる。例えば、単一の切断ハーフドメインは、限定された二本鎖切断活
性を示し得る。各々が３フィンガージンクフィンガードメインおよび切断ハーフドメイン
を含む２つの融合タンパク質が細胞中に導入される方法において、いずれかのタンパク質
が約９ヌクレオチド標的部位を特定する。１８ヌクレオチドの集合標的配列は、哺乳動物
および植物のゲノム中で固有である可能性が高いが、任意の所与の９ヌクレオチドの標的
部位は、平均で、ヒトゲノムにおいて約２３，０００倍生じる。このように、非特異的切
断が、単一のハーフドメインの部位特異的結合に起因して起こり得る。したがって、本明
細書に記載する方法では、２つの融合タンパク質と一緒に細胞中で発現されるヌクレアー
ゼ（または同をコードする核酸）のドミナントネガティブ変異体の使用が検討される。ド
ミナントネガティブ変異体は、二量体化することが可能であるが、二量化した場合、二本
鎖切断を誘導することができない。融合タンパク質に、モル過剰でドミナントネガティブ
変異体を提供することにより、両方の融合タンパク質が結合した領域だけが、二量体化お
よび二本鎖切断が起こるのに十分に高い機能的な切断ハーフドメインの局所濃度を有する
であろう。
他の実施形態では、ヌクレアーゼドメインは、一本鎖切断を誘導する点でニッカーゼで
ある。ある特定の実施形態では、ニッカーゼは２つのヌクレアーゼドメインを含み、その
１つが、ヌクレアーゼが一本鎖切断だけを作製するように改変される（例えば、触媒的に
不活性であるように）。そのようなニッカーゼは、例えば、米国特許公開第２０１０００
４７８０５号に記載されている。２つのニッカーゼを使用して、二本鎖切断を誘導しても
よい。
発現ベクター
本明細書に記載する、１つまたは複数の融合タンパク質（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ
など）をコードする核酸を、複製および／または発現のために、原核細胞または真核細胞
中への形質転換用のベクター中にクローニングすることができる。ベクターは、原核生物
ベクター（例えば、プラスミド、またはシャトルベクター、昆虫ベクター）または真核生
物ベクターであり得る。融合タンパク質をコードする核酸は、また、細胞への投与のため
に、発現ベクター中にクローニングすることができる。
融合タンパク質を発現させるために、融合タンパク質をコードする配列は、典型的には
、転写を導くためのプロモーターを含む発現ベクター中にサブクローニングされる。適切
な原核生物および真核生物のプロモーターが当技術分野において周知であり、例えば、Sa
mbrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual(2nd ed. 1989; 3rd ed., 200
1)；Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual(1990)；およびCur
rent Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.、上記)において記載されている
。ＺＦＰを発現するための細菌発現系は、例えば、大腸菌（E. coli）、バチルス属種（B
acillus sp）、およびサルモネラ（Salmonella）において利用可能である（Palva et al.
, Gene 22:229-235(1983)）。そのような発現系のためのキットは、商業的に利用可能で
ある。哺乳動物細胞、酵母、および昆虫細胞のための真核生物発現系は、当業者により周
知であり、また、商業的に利用可能である。
融合タンパク質をコードする核酸の発現を導くのに使用されるプロモーターは、特定の
適用に依存する。例えば、宿主細胞に適切な強力な構成的プロモーターは、典型的には、
融合タンパク質の発現および精製のために使用される。
対照的に、融合タンパク質が、植物遺伝子の調節のためにｉｎ ｖｉｖｏで投与される
場合（以下の「植物細胞への核酸送達」のセクションを参照）、融合タンパク質の特定の
使用に依存して、構成的、調節的（例えば、発生中、組織型もしくは細胞型により、また
は環境により）、または誘導性プロモーターを使用する。植物プロモーターの非限定的な
例は、シロイヌナズナ（A. thaliana）のユビキチン−３（ｕｂｉ−３）（Callis et al.
, 1990, J. Biol. Chem. 265-12486-12493）；Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）
のマンノピンシンターゼ（Δｍａｓ）（Petolino et al.、米国特許第６，７３０，８２
４号）；および／またはキャッサバ葉脈モザイクウイルス（ＣｓＶＭＶ）（Verdaguer et
al., 1996,Plant Molecular Biology 31:1129-1139）由来のプロモーター配列を含む。
実施例も参照のこと。
プロモーターに加えて、発現ベクターは、典型的には、原核生物または真核生物のいず
れかの宿主細胞における核酸の発現のために要求される、全ての追加のエレメントを含む
転写ユニットまたは発現カセットを含む。典型的な発現カセットは、このように、例えば
、融合タンパク質、および、例えば、転写物の効率的なポリアデニル化、転写終結、また
は翻訳終結のために要求されるシグナルをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプ
ロモーター（リボソーム結合部位を含む）を含む。カセットの追加エレメントは、例えば
、エンハンサー、異種スプライシングシグナル、ゾセア・アシグナ（Thosea asigna）ウ
イルスからの２Ａ配列（Mattion et al.(1996)J. Virol. 70:8124-8127）、および／また
は核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含み得る。
細胞中に遺伝情報を輸送するために使用される特定の発現ベクターは、融合タンパク質
の意図される使用、例えば、植物、動物、細菌、真菌、原生動物などにおける発現に関し
て選択される（以下に記載される発現ベクターを参照）。標準的な細菌および動物発現ベ
クターは、当技術分野において公知であり、例えば、米国特許公開２００５００６４４７
４Ａ１および国際特許公開ＷＯ０５／０８４１９０、ＷＯ０５／０１４７９１、およびＷ
Ｏ０３／０８０８０９に詳細に記載されている。
標準的なトランスフェクション方法を使用して、大量のタンパク質を発現する細菌、植
物、哺乳動物、酵母、または昆虫の細胞株を産生することができ、次いでそれらは標準的
な技術を使用して精製することができる（例えば、Colley et al., J. Biol. Chem. 264:
17619-17622(1989)；Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology, vol.
182(Deutscher, ed., 1990)を参照）。真核細胞および原核細胞の形質転換は、標準的な
技術に従って実施される（例えば、Morrison, J. Bact. 132:349-351(1977)；Clark-Curt
iss & Curtiss, Methods in Enzymology 101:347-362(Wu et al., eds.,1983)を参照）。
そのような宿主細胞中に外来ヌクレオチド配列を導入するための周知の手順のいずれか
を使用することができる。これらは、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレ
ン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、超音波法（例えば、ソノポレーショ
ン）、リポソーム、マイクロインジェクション、ネイキッドＤＮＡ、プラスミドベクター
、ウイルスベクター、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換、シリコンカ
ーバイド（例えば、ＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標））媒介形質転換（エピソームおよび組み込
みの両方）、およびクローニングされたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、または他
の外来遺伝物質を宿主細胞中に導入するための他の周知の方法（例えば、Sambrook et al
.、上記を参照）の使用を含む。使用される特定の遺伝子操作手順によって、少なくとも
１つの遺伝子を、選択されたタンパク質を発現することが可能である宿主細胞に成功裏に
導入することが可能であることだけが必要である。
ドナー
上記の通り、例えば、スタッキングのための１つまたは複数の外因性配列（「ドナー配
列」または「ドナー」または「導入遺伝子」とも呼ばれる）の挿入も完成させることがで
きる。ドナー配列は、目的の場所での効率的なＨＤＲを可能にするために、相同な２つの
領域により隣接される非相同配列を含むことができる。加えて、ドナー配列は、細胞クロ
マチン中の目的の領域と相同でない配列を含むベクター分子を含むことができる。ドナー
分子は、細胞クロマチンと相同な、いくつかの不連続領域を含むことができる。例えば、
目的の領域中に通常存在しない配列の標的挿入のために、前記配列が、ドナー核酸分子中
に存在し、目的の領域における配列と相同な領域により隣接させることができる。
ドナーポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡ、一本鎖または二本鎖であり得る、お
よび直鎖または環状の形態で細胞中に導入することができる。例えば、米国特許公開第２
０１０００４７８０５号；第２０１１０２８１３６１号；および第２０１１０２０７２２
１号を参照のこと。直鎖形態で導入された場合、ドナー配列の末端は、当業者に公知の方
法により（例えば、エキソヌクレアーゼ分解から）保護することができる。例えば、１つ
または複数のジデオキシヌクレオチド残基は、直鎖状分子の３’末端に付加される、およ
び／または自己相補的オリゴヌクレオチドが一方または両方の末端に連結される。例えば
、Chang et al.(1987)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4959-4963；Nehls et al.(1996)S
cience 272:886-889を参照のこと。分解から外因性ポリヌクレオチドを保護するための追
加の方法は、末端アミノ基の付加および修飾ヌクレオチド間連結（例えば、ホスホロチオ
エート、ホスホロアミデート、およびＯ−メチルリボースまたはデオキシリボース残基な
ど）の使用を含むが、これらに限定されない。
ポリヌクレオチドは、追加の配列（例えば、複製起点、プロモーター、および抗生物質
抵抗性をコードする遺伝子など）を有するベクター分子の一部として細胞中に導入するこ
とができる。さらに、ドナーポリヌクレオチドは、ネイキッド核酸として、薬剤（例えば
リポソームまたはポロキサマーなど）と複合体化した核酸として導入することができる、
またはウイルス（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、レトロウイルス
、レンチウイルス、およびインテグラーゼ欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ））により送達
することができる。例えば、米国特許公開第２００９０１１７６１７号を参照のこと。
ドナーは、一般的に、その発現が、組み込み部位での内因性プロモーター、即ち、ドナ
ーが挿入される内因性遺伝子の発現を駆動するプロモーターにより駆動されるように挿入
される。しかし、ドナーは、プロモーターおよび／またはエンハンサー、例えば、構成的
プロモーターまたは誘導性もしくは組織特異的プロモーターを含むことができることは明
らかであろう。さらに、ドナー分子は、内因性遺伝子の全て、一部が発現するように、ま
たはいずれも発現しないように、内因性遺伝子に挿入してもよい。
さらに、発現のために要求されないが、外因性配列は、また、転写または翻訳調節配列
、例えば、プロモーター、エンハンサー、インスレーター、内部リボソーム進入部位、２
Ａペプチドをコードする配列、および／またはポリアデニル化シグナルを含んでもよい。
ドナー配列を内因性遺伝子（または遺伝子の複数の対立遺伝子）中に導入し、内因性遺
伝子の機能が変化し、導入遺伝子の組み込みのための内因性マーカーとして作用し、それ
により、ゲノム改変がもたらされるようにする。ある特定の実施形態では、導入遺伝子が
導入される内因性遺伝子座は、ＡＨＡＳ遺伝子座である。ＡＨＡＳ遺伝子中のいくつかの
変異は、Ｂ群、またはＡＬＳ阻害除草剤耐性（例えば、イミダゾリノンまたはスルホニル
尿素）を付与することが公知であり、６５３位のセリンのアスパラギンへの単一変異（Ｓ
６５３Ｎ）を含む。例えば、Lee et al., (2011) Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 108: 8
909-8913、およびTan, S., Evans, R.R., Dahmer, M.L., Singh, B.K., and Shaner, D.L
.(2005)Imidazolinone-tolerant crops: History, current status and future. Pest Ma
nag. Sci. 61:246-257を参照のこと。
ＡＨＡＳは１つの望ましい遺伝子座である。なぜなら、その遺伝子は、植物発生の全て
の段階で転写活性を有し、この遺伝子座への新たな遺伝子または植物形質転換単位の挿入
が、宿主植物の農学的または品質上の特性に悪影響を与えない場合、遺伝子サイレンシン
グ（例えば、ＤＮＡ、ヒストンメチル化、ｉＲＮＡなどによる）の傾向がないからである
。ＡＨＡＳ遺伝子座の普遍的な性質および菜種、トウモロコシ、ヒマワリ、綿、大豆、テ
ンサイ、小麦および任意の他の植物における１つまたは複数のＡＨＡＳ遺伝子座の変化が
、農学的または品質上のペナルティを保有しないとの明確な商業的な証拠は、ＡＨＡＳ遺
伝子座が、全ての商業的に関連する植物種にわたる、好ましい標的遺伝子座の広いクラス
を表すことを意味する。
野生型（除草剤感受性）ＡＨＡＳ遺伝子座へのドナーＤＮＡの組み込みは、典型的には
、外因性配列（例えば、導入遺伝子）および変異の両方を内因性ＡＨＡＳに導入し、イミ
ダゾリノンに対する耐性を付与するゲノム修飾を生じ（即ち、除草剤耐性植物細胞をもた
らす産物）、このように、トランスジェニックの選択マーカー系よりむしろ、内因性のイ
ミダゾリノン選択系を使用して正確な標的植物の再生を可能にする。ＡＨＡＳ遺伝子座で
の第２の導入遺伝子のスタッキングは、１つまたは複数の追加の導入遺伝子を導入する、
ドナーＤＮＡの組み込みにより達成することができ、イミダゾリンに対する感受性、しか
し、スルホニル尿素に対する耐性を付与し（即ち、除草剤耐性植物細胞をもたらす産物）
、このように、スルホニル尿素選択剤を使用した正確な標的植物の再生が可能になる。第
３の導入遺伝子のスタッキングは、さらなる導入遺伝子を導入し、スルホニル尿素に対す
る感受性およびイミダゾリノンに対する耐性を付与するドナーＤＮＡの組み込みにより達
成することができ、このように、イミダゾリノン選択剤を使用して、正確な標的植物の再
生を可能にする。したがって、逐次導入遺伝子スタッキングの連続ラウンドが、野生型Ａ
ＨＡＳに変異（例えば、ゲノム修飾）を導入するドナー分子の使用により可能であり、こ
のように、スルホニル尿素とイミダゾリノンの化学選択剤のディファレンシャルサイクリ
ングを可能にする。
植物細胞への核酸送達
上記の通り、ＤＮＡ構築物（例えば、ヌクレアーゼおよび／またはドナー）は、種々の
従来の技術により所望の植物宿主に（例えば、そのゲノム中に）導入することができる。
そのような技術の総説については、例えば、Weissbach & Weissbach Methods for Plant
Molecular Biology(1988, Academic Press, N.Y.)Section VIII, pp. 421-463；およびGr
ierson & Corey, Plant Molecular Biology(1988, 2d Ed.), Blackie, London, Ch. 7-9
を参照のこと。また、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許公
開第２００９０２０５０８３号；第２０１００１９９３８９号；第２０１１０１６７５２
１号および第２０１１０１８９７７５号を参照のこと。１つまたは複数のＤＮＡ構築物を
、本発明の実施において用いることができ、例えば、ヌクレアーゼは、ドナーを保有する
構築物と同じ構築物または異なる構築物により保有され得ることは明らかであろう。
ＤＮＡ構築物は、植物細胞プロトプラストのエレクトロポレーションおよびマイクロイ
ンジェクションのような技術を使用して植物細胞のゲノムＤＮＡ中に直接的に導入するこ
とができ、または、ＤＮＡ構築物は、ＤＮＡ粒子照射のような微粒子銃法を使用して植物
組織に直接的に導入することができる（例えば、Klein et al., (1987)Nature 327:70-73
を参照）。あるいは、ＤＮＡ構築物は、ナノ粒子形質転換を介して植物細胞中に導入する
ことができる（例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許公開第
２００９０１０４７００号を参照）。あるいは、ＤＮＡ構築物は、適切なＴ−ＤＮＡ境界
／隣接領域と組み合わせて、従来のアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacter
ium tumefaciens）宿主ベクター中に導入してもよい。癌遺伝子の無力化を含むアグロバ
クテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）媒介形質転換技術ならび
にバイナリーベクターの開発および使用が、科学文献において十分に記載されている。例
えば、Horsch et al.(1984)Science 233:496-498、およびFraley et al.(1983) Proc. Na
t'l. Acad. Sci. USA 80:4803を参照のこと。
加えて、遺伝子移入は、非アグロバクテリウム細菌またはウイルス、例えばリゾビウム
属種（Rhizobium sp.）ＮＧＲ２３４、シノリゾビウム・メリロティ（Sinorhizoboium me
liloti）、メソリゾビウム・ロティ（Mesorhizobium loti）、ジャガイモウイルスＸ、カ
リフラワーモザイクウイルスおよびキャッサバ葉脈モザイクウイルスおよび／またはタバ
コモザイクウイルスを使用して達成することができる。例えば、Chung et al.(2006)Tren
ds Plant Sci. 11(1):1-4を参照のこと。
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）宿主の病原性
機能は、細胞が、バイナリーＴ−ＤＮＡベクター（Bevan(1984)Nuc. Acid Res. 12:8711-
8721）または同時培養手順（Horsch et al.(1985)Science 227:1229-1231）を使用して細
菌により感染された際に、植物細胞ＤＮＡ中へ構築物および隣接するマーカーを含むＴ−
ストランドの挿入を導く。一般的に、アグロバクテリウム（Agrobacterium）形質転換系
が、双子葉植物を操作するために使用される（Bevan et al.(1982)Ann. Rev. Genet 16:3
57-384；Rogers et al.(1986)Methods Enzymol.118:627-641）。アグロバクテリウム（Ag
robacterium）形質転換系は、また、単子葉植物および植物細胞にＤＮＡを形質転換なら
びに移入するために使用することができる。米国特許第５，５９１，６１６号；Hernalst
een et al.(1984)EMBO J 3:3039-3041；Hooykass-Van Slogteren et al.(1984)Nature 31
1:763-764；Grimsley et al.(1987)Nature 325:1677-179；Boulton et al.(1989)Plant M
ol. Biol.12:31-40；およびGould et al.(1991)Plant Physiol.95:426-434を参照のこと
。
代替的な遺伝子移入および形質転換方法は、カルシウム、ポリエチレングリコール（Ｐ
ＥＧ）、またはエレクトロポレーション媒介性のネイキッドＤＮＡの取り込みを介したプ
ロトプラスト形質転換（Paszkowski et al.(1984)EMBO J 3:2717-2722、Potrykus et al.
(1985)Molec. Gen. Genet. 199:169177；Fromm et al.(1985) Proc. Nat. Acad. Sci. US
A 82:5824-5828；およびShimamoto (1989) Nature 338:274-276を参照）および植物組織
のエレクトロポレーション（D'Halluin et al.(1992)Plant Cell 4:1495-1505）を含むが
、これらに限定されない。植物細胞の形質転換のための追加の方法は、マイクロインジェ
クション、炭化ケイ素（例えば、ＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標））媒介性ＤＮＡ取り込み（Ka
eppler et al.(1990)Plant Cell Reporter 9:415-418）、および微粒子照射（Klein et a
l.(1988)Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85:4305-4309；およびGordon-Kamm et al.(1990)Pl
ant Cell 2:603-618を参照）を含む。最後に、ナノ粒子、ナノキャリア、および細胞透過
性ペプチドを、植物細胞中にＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチドおよび／またはタンパク質を送達
するために利用することができる（ＷＯ／２０１１／２６６４４、ＷＯ／２００９／０４
６３８４、およびＷＯ／２００８／１４８２２３を参照）。
開示する方法および組成物は、ＡＨＡＳ遺伝子中に外因性配列を挿入するために使用す
ることができる。これは、植物ゲノム中に導入された導入遺伝子の発現が、その組み込み
部位に決定的に依存し、上記の通り、ＡＨＡＳが、導入遺伝子組み込みのために適した部
位を提供する限り、有用である。したがって、例えば、除草剤耐性、昆虫抵抗性、栄養素
、抗生物質、または治療的分子をコードする遺伝子を、標的組換えにより、それらの発現
に有利な植物ゲノムの領域中に挿入することができる。
上記の形質転換技術のいずれかにより産生された形質転換植物細胞を培養し、形質転換
した遺伝子型、ひいては所望の表現型を持つ全植物を再生することができる。そのような
再生技術は、組織培養増殖培地における特定の植物ホルモンの操作を利用し、典型的には
、所望のヌクレオチド配列と一緒に導入された殺生物剤および／または除草剤マーカーを
利用する。培養されたプロトプラストからの植物の再生は、Evans et al., "Protoplasts
Isolation and Culture" in Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, Macmilla
n Publishing Company, New York, 1983；およびBinding, Regeneration of Plants, Pla
nt Protoplasts,pp.21-73, CRC Press, Boca Raton,1985に記載されている。再生は、ま
た、植物カルス、外植片、器官、花粉、胚、またはそれらの部分から得ることができる。
そのような再生技術は、Klee et al.(1987)Ann. Rev. of Plant Phys.38:467-486に一般
的に記載されている。
植物細胞中に導入された核酸を使用し、本質的に任意の植物に、所望の形質を付与する
ことができる。多種多様の植物および植物細胞系を、本開示の核酸構築物および上記の種
々の形質転換方法を使用して、本明細書において記載する所望の生理学的および農学的特
性について操作してもよい。好ましい実施形態では、操作のための標的植物および植物細
胞は、それらの単子葉植物および双子葉植物、例えば穀物（例えば、コムギ、トウモロコ
シ、イネ、キビ、オオムギ）、果実作物（例えば、トマト、リンゴ、ナシ、イチゴ、オレ
ンジ）、飼料作物（例えば、アルファルファ）、根菜作物（例えば、ニンジン、ジャガイ
モ、テンサイ、ヤムイモ）、葉菜作物（例えば、レタス、ホウレンソウ）；顕花植物（例
えば、ペチュニア、バラ、キク）、針葉樹および松の木（例えば、松、モミ、トウヒ）；
ファイトレメディエーションにおいて使用される植物（例えば、重金属蓄積植物）；油料
作物（例えば、ヒマワリ、ナタネ）および実験の目的のために使用される植物（例えば、
シロイヌナズナ（Arabidopsis））を含む作物を含むが、これらに限定されない。このよ
うに、開示する方法および組成物には、広範囲の植物（アスパラガス（Asparagus）属、
カラスムギ（Avena）属、アブラナ（Brassica）属、シトラス（Citrus）属、スイカ（Cit
rullus）属、トウガラシ（Capsicum）属、カボチャ（Cucurbita）属、ニンジン（Daucus
）属、ムカシヨモギ（Erigeron）属、グリシン（Glycine）属、ワタ（Gossypium）属、オ
オムギ（Hordeum）属、アキノノゲシ（Lactuca）属、ドクムギ（Lolium）属、リコペルシ
コン（Lycopersicon）属、リンゴ（Malus）属、キャッサバ（Manihot）属、タバコ（Nico
tiana）属、オオアラセイトウ（Orychophragmus）属、イネ（Oryza）属、タブノキ（Pers
ea）属、インゲンマメ（Phaseolus）属、エンドウ（Pisum）属、ナシ（Pyrus）属、サク
ラ（Prunus）属、ダイコン（Raphanus）属、ライムギ（Secale）属、ナス（Solanum）属
、モロコシ（Sorghum）属、コムギ（Triticum）属、ブドウ（Vitis）属、ササゲ（Vigna
）属、およびトウモロコシ（Zea）属からの種を含むが、これらに限定されない）にわた
る使用を有する。
植物細胞に導入される核酸の導入を使用し、本質的に任意の植物に、所望の形質を付与
することができる。ある特定の実施形態では、植物細胞中の組み込まれた導入遺伝子は、
果実収量の増加量、植物（または植物の果実）のバイオマス増加、果肉のより高い含量、
濃縮されたフルーツセット、より大きな植物、果肉重量の増加、乾燥重量の増加、固形含
量の増加、収穫時のより高い総重量、作物の色の強度および／または均一性の増強、変化
した化学物質（例えば、油、脂肪酸、炭水化物、タンパク質）特性などを有する植物をも
たらす。
当業者は、外因性配列を植物細胞中に一過性に組み入れることができることを認識する
であろう。外因性ポリヌクレオチド配列の導入では、配列が導入された植物細胞の細胞機
構を利用することができる。一過性に植物細胞中に組み入れられたＺＦＮを含む外因性ポ
リヌクレオチド配列の発現は、任意のインデル、逆位、または挿入を同定し、決定するた
めに、標的配列のゲノムＤＮＡを分析することによりアッセイすることができる。再配列
のこれらの型は、ゲノムＤＮＡ配列内の標的部位の切断、その後のＤＮＡ修復からもたら
される。加えて、外因性ポリヌクレオチド配列の発現は、当業者に公知のマーカー遺伝子
の発現の試験を可能にする方法を使用してアッセイすることができる。マーカー遺伝子の
一過性発現が、種々の植物、組織、およびＤＮＡ送達系を使用して報告されている。一過
性分析系は、目的の任意の植物種を使用した任意の一過性植物アッセイにおける組織のエ
レクトロポレーションまたは粒子照射を介した直接的な遺伝子送達を含むが、これに限定
されない。そのような一過性系は、種々の組織供給源からのプロトプラストのエレクトロ
ポレーションまたは目的の特定組織の粒子照射を含むが、これらに限定されない。本開示
は、部位特異的エンドヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ）を評価し、標的遺伝子（例えば、
ＡＨＡＳ）内に導入遺伝子および／または変異を導入し、ゲノムの改変をもたらすための
、任意の一過性発現系の使用を包含する。適当な送達系を介して一過性に試験することが
想定される植物組織の例は、葉の基部組織、カルス、子葉、根、胚乳、胚、花組織、花粉
、および表皮組織を含むが、これらに限定されない。
当業者は、外因性ポリヌクレオチド配列がトランスジェニック植物において安定的に組
み入れることができることを認識するであろう。一度、外因性ポリヌクレオチド配列が、
作動可能であることが確認された場合、それは、有***配により他の植物に導入すること
ができる。いくつかの標準的な育種技術のいずれかを、交配される種に依存して、使用す
ることができる。
形質転換された植物細胞、カルス、組織、または植物は、外因性ＤＮＡ配列上に存在す
るマーカーによりコードされる表現型のための、操作された植物材料の選択またはスクリ
ーニングにより同定および単離することができる。マーカーは、また、選択可能マーカー
またはレポーターマーカーとも記載および称され得る。マーカーは、形質転換植物（「形
質転換体」）の同定および選択のために利用することができる。典型的には、マーカーは
、外因性配列として植物細胞のゲノム中に組み入れられる。一部の例において、外因性マ
ーカー配列は、ドナー配列として部位特異的な標的遺伝子座で植物ゲノム中に組み入れら
れ、該ドナー配列は、選択剤（例えば、除草剤など）に対する耐性をもたらす変異を含む
。他の例において、外因性マーカー配列は、導入遺伝子（即ち、「トランスジェニック選
択可能マーカー」）として植物ゲノム中に組み入れられ、該マーカー遺伝子は、キメラ遺
伝子の発現カセットを含むように、プロモーターおよび３’−ＵＴＲに作動可能に連結さ
れている。マーカー遺伝子の発現は、視覚的マーカータンパク質の発現または選択剤（例
えば、除草剤、抗生物質など）に対する耐性をもたらす。
例えば、選択は、抗生物質または除草剤（即ち、選択剤としても記載される）の阻害量
を含む培地上で、操作された植物材料を成長させることにより実施することができ、それ
に対して、形質転換遺伝子構築物が耐性を付与する。実施形態では、選択可能マーカー遺
伝子は、除草剤耐性遺伝子を含む。
除草剤耐性マーカーは、除草剤に非感受性である修飾標的タンパク質、または、それが
作用することができる前に、植物において除草剤を分解および解毒する酵素をコードする
。例えば、除草剤に対して非感受性である修飾標的タンパク質は、グリホセートに対する
耐性を含み得る。グリホセート耐性植物は、変異標的酵素５−エノールピルビルシキミ酸
−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）をコードする遺伝子を使用することにより得られ
ている。ＥＰＳＰＳについての遺伝子および変異体は周知であり、変異型５−エノールピ
ルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰ）、ｄｇｔ−２８、およびａｒｏＡ遺
伝子を含む。そのような遺伝子は、組換え核酸の導入および／または天然ＥＰＳＰ遺伝子
の種々の形態のｉｎ ｖｉｖｏ変異誘発を介して、グリホセートに対する耐性を提供する
。植物において除草剤を分解および解毒する酵素の例は、グルホシネートアンモニウム、
ブロモキシニル、および２，４−ジクロロフェノキシアセテート（２，４−Ｄ）に対する
耐性を含むであろう。これらの除草剤に対する耐性は、導入遺伝子として植物細胞内でｐ
ａｔまたはＤＳＭ−２、ニトリラーゼ、ａａｄ−１またはａａｄ−１２遺伝子をコードす
る細菌遺伝子を発現させることにより得られている。ホスホノ化合物についての耐性遺伝
子は、ストレプトミセス（Streptomyces）種（ストレプトミセス・ハイグロスコピクス（
Streptomyces hygroscopicus）およびストレプトミセス・ビリドクロモゲネス（Streptom
yces viridichromogenes）を含む）からのｂａｒおよびｐａｔ遺伝子、ならびにピリジノ
キシまたはフェノキシプロピオン酸およびシクロヘキサン（cyclohexones）（ＡＣＣアー
ゼ阻害剤をコードする遺伝子）を含む。シクロヘキサンジオンおよび／またはアリールオ
キシフェノキシプロパン酸（ハロキシホップ、ジクロホップ、フェノキサプロップ（Feno
xyprop）、フルアジホップ、キザロホップを含む）に対する耐性を付与する例示的な遺伝
子は、アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣアーゼ）の遺伝子、例えばＡｃ
ｃ１−Ｓ１、Ａｃｃ１−Ｓ２、およびＡｃｃ１−Ｓ３などを含む。実施形態では、除草剤
は、光合成を阻害することができる（トリアジン（ｐｓｂＡおよび１ｓ＋遺伝子）または
ベンゾニトリル（ニトリラーゼ遺伝子）を含む）。他の除草剤耐性遺伝子配列が、当業者
に公知である。
抗生物質抵抗性マーカーは、それが植物に作用することができる前に、植物中の抗生物
質を分解および解毒する酵素をコードする。種々の型の抗生物質は、適切な濃度で使用さ
れる場合、植物の成長および発生を妨げ得ることが公知である（例えばカナマイシン、ク
ロラムフェニコール、スペクチノマイシン、およびハイグロマイシンなど）。外因性配列
を得て（例えば、細菌遺伝子）、抗生物質を分解する導入遺伝子として発現させることが
できる。例えば、抗生物質抵抗性マーカー遺伝子は、抗生物質抵抗性をコードする外因性
配列を含む（例えばネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＥＯ）、クロラムフ
ェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アルカリホスファターゼ、スペクチ
ノマイシン抵抗性、カナマイシン抵抗性、およびハイグロマイシンホスホトランスフェラ
ーゼ（ＨＰＴ）をコードする遺伝子など）。
さらに、形質転換された植物および植物細胞は、可視マーカー遺伝子をコードするレポ
ーター遺伝子の活性についてスクリーニングすることにより同定することもできる。レポ
ーター遺伝子は、典型的には、組換え核酸構築物として提供され、導入遺伝子として植物
細胞中に組み入れられる。タンパク質の目視観察（例えばβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ
）、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、
ＤｓＲｅｄ、β−ガラクトシダーゼをコードするレポーター遺伝子など）を使用して、形
質転換体を同定および選択することができる。そのような選択およびスクリーニング方法
は、当業者に周知である。
マーカー遺伝子の上記のリストは、限定することを意味しない。任意のレポーター遺伝
子または選択可能マーカー遺伝子が、本開示に包含される。さらに、マーカー（例えば、
除草剤耐性マーカー）は、雑草種を防除するために野外環境において適用される除草剤に
対する耐性を提供するために利用される形質（例えば、除草剤耐性形質）と比較し、主に
、形質転換植物の同定および選択のために利用されることを認識すべきである。
物理的および生化学的方法が、また、安定的に挿入された遺伝子構築物を含む植物もし
くは植物細胞形質転換体、または部位特異的エンドヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ）の一
過性発現から生じる標的遺伝子改変ゲノムＤＮＡを含む植物細胞を同定するために使用す
ることができる。これらの方法は、１）組換えＤＮＡ挿入物の構造を検出および決定する
ためのサザン分析またはＰＣＲ増幅；２）遺伝子構築物のＲＮＡ転写物を検出および検証
するためのノーザンブロット、Ｓ１ ＲＮａｓｅ保護、プライマー伸長、または逆転写酵
素ＰＣＲ増幅；３）酵素またはリボザイム活性を検出するための酵素アッセイ（そのよう
な遺伝子産物が遺伝子構築物によりコードされる）；４）タンパク質ゲル電気泳動、ウエ
スタンブロット法、免疫沈降法、または酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）（遺伝子
構築産物がタンパク質である）を含むが、これらに限定されない。追加技術、例えばｉｎ
ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、酵素染色、および免疫染色なども、特定の植物器官
および組織における組換え構築物の存在または発現を検出するために使用してもよい。全
てのこれらのアッセイを行うための方法は、当業者に周知である。
本明細書において開示する方法を使用した遺伝子操作の効果は、例えば、目的の組織か
ら単離されたＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）のノーザンブロットにより観察することができ
る。典型的には、ｍＲＮＡが存在する、またはｍＲＮＡの量が増加している場合、対応す
る導入遺伝子が発現されていると仮定することができる。遺伝子および／またはコードさ
れるポリペプチドの活性を測定する他の方法を使用することができる。異なる型の酵素ア
ッセイを、使用される基質および反応生成物または副産物の増加または減少を検出する方
法に依存して、使用することができる。加えて、発現されるポリペプチドのレベルは、免
疫化学的に測定することができる（即ち、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＩＡ、および例えば電
気泳動検出アッセイ（染色またはウエスタンブロッティングのいずれかで）などによる当
業者に周知の他の抗体ベースのアッセイ）。１つの非限定的な例として、ＥＬＩＳＡアッ
セイを使用したＡＡＤ−１およびＰＡＴタンパク質の検出は、米国特許公開第２００９０
０９３３６６号に記載されており、その参照は、その全体が参照により本明細書に組み入
れられる。導入遺伝子は、植物の一部の組織において、または一部の発生段階で選択的に
発現され得る、あるいは、導入遺伝子は、実質的に全ての植物組織中で、実質的にその全
体のライフサイクルに沿って発現され得る。しかし、任意のコンビナトリアル発現様式も
適用可能である。
本開示は、また、種子が導入遺伝子または遺伝子構築物を有する、上記のトランスジェ
ニック植物の種子を包含する。本開示は、子孫、クローン、細胞株、または上記のトラン
スジェニック植物の細胞をさらに包含し、前記子孫、クローン、細胞株、または細胞は、
導入遺伝子または遺伝子構築物を有する。
融合タンパク質（例えば、ＺＦＮ）および融合タンパク質をコードする発現ベクターは
、遺伝子調節、標的切断、および／または組換えのために植物に直接投与することができ
る。ある特定の実施形態では、植物は、複数のパラロガスな標的遺伝子を含む。例えば、
ＡＨＡＳについて、セイヨウアブラナ（Brassica napus）は５つのパラログを含み、小麦
は３つのパラログを含む。このように、１つまたは複数の異なる融合タンパク質または融
合タンパク質をコードする発現ベクターは、植物におけるこれらのパラロガスな遺伝子の
１つまたは複数を標的化するために、植物に投与され得る。
有効量の投与は、処理されるべき植物細胞と最終的に接触するように、融合タンパク質
を導入するために通常使用される経路のいずれかによる。ＺＦＰは、好ましくは、許容さ
れる担体を用いて、任意の適切な様式で投与される。そのようなモジュレーターを投与す
る適切な方法が利用可能であり、当業者に周知であるが、複数の経路が、特定の組成物を
投与するために使用することができ、特定の経路が、しばしば、別の経路よりも迅速でよ
り効果的な反応を提供することができる。
担体を使用してもよく、投与される特定の組成物により、ならびに組成物を投与するた
めに使用される特定の方法により部分的に決定される。したがって、利用可能な多種多様
の適切な製剤がある。
[実施例]
ＡＨＡＳゲノム標的配列の特徴付け
ＡＨＡＳ配列の同定
３つの同祖ＡＨＡＳ遺伝子の転写領域を同定し、かつ決定した。これらの新規の配列を
、配列番号１、配列番号２および配列番号３として一覧にする。以前の配列決定の労力に
より、コムギ（Triticum aestivum）由来のＡＨＡＳ遺伝子の同祖コピーが、染色体６Ａ
、６Ｂおよび６Ｄの長腕に対して同定され、かつ遺伝的にマッピングされた（Anderson e
t al., (2004) Weed Science 52:83-90; およびLi et al., (2008) Molecular Breeding
22:217-225）。Ｇｅｎｂａｎｋで利用可能な発現配列タグ（ＥＳＴ）およびゲノム配列（
登録番号：ＡＹ２１０４０５．１、ＡＹ２１０４０７．１、ＡＹ２１０４０６．１、ＡＹ
２１０４０８．１、ＦＪ９９７６２８．１、ＦＪ９９７６２９．１、ＦＪ９９７６３１．
１、ＦＪ９９７６３０．１、ＦＪ９９７６２７．１、ＡＹ２７３８２７．１）の配列分析
を用いて、ＡＨＡＳ遺伝子（配列番号１〜３）の同祖コピーの転写領域を決定した。
転写領域の上流および下流に位置する新規の非コード配列を初めて特徴付けた。これら
の非コード配列を完全に特徴付けるために、ＡＨＡＳ遺伝子の３つの同祖コピーのそれぞ
れの転写配列を、ＢＬＡＳＴＮ（商標）クエリとして用いて、コムギ（Triticum aestivu
m）品種Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｓｐｒｉｎｇの全ゲノムショットガン配列決定から生じた、ア
センブルされていないＲＯＣＨＥ ４５４（商標）配列リードをスクリーニングした。コ
ムギ（Triticum aestivum）品種Ｃｈｉｎｅｓｅ ＳｐｒｉｎｇのＲＯＣＨＥ ４５４（
商標）配列リードを、５倍の配列適用範囲まで生じさせた。配列アセンブリは、ＲＯＣＨ
Ｅ ４５４（商標）のＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ ＳＯＦＴＷＡＲＥ（商標）（ＧｅｎｅＣｏ
ｄｅｓ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を用いて完了した。有意にＢＬＡＳＴＮ（商標）ヒ
ットした（Ｅ値＜０．０００１）配列リードを用いて、これらの非転写領域を特徴付けた
。ＢＬＡＳＴＮ（商標）分析および配列アセンブリの反復ラウンドを実行した。各繰返し
が、先の繰返しからのアセンブルしたＡＨＡＳ配列を組み入れたので、全配列が単一の連
続した配列として編集された。全体として、染色体６Ａ、６Ｂおよび６Ｄ上に位置する同
祖ＡＨＡＳ遺伝子のゲノム配列のそれぞれ４，３８４、７，５９０および６，２０５を特
徴付けた（配列番号４〜６）。
コムギ（Triticum aestivum）品種Ｂｏｂｗｈｉｔｅ ＭＰＢ２６ＲＨから単離したＡＨ
ＡＳ遺伝子の配列分析
ＡＨＡＳ遺伝子の同祖コピーをコムギ（Triticum aestivum）品種Ｂｏｂｗｈｉｔｅ
ＭＰＢ２６ＲＨからクローニングし、かつ配列決定して、当該配列に高程度の特異性で結
合し得る特異的なジンクフィンガータンパク質を設計するのに適したヌクレオチド配列を
得た。コムギ（Triticum aestivum）品種Ｂｏｂｗｈｉｔｅ ＭＰＢ２６ＲＨから得たＡ
ＨＡＳヌクレオチド配列の配列分析は、ＧｅｎｂａｎｋおよびＲＯＣＨＥ ４５４（商標
）ＡＨＡＳ遺伝子配列中に存在するヌクレオチドの注釈を確かめるために必要であった。
これは、ＧｅｎｂａｎｋおよびＲＯＣＨＥ ４５４（商標）配列を得た品種Ｂｏｂｗｈｉ
ｔｅ ＭＰＢ２６ＲＨと他の小麦品種との間の対立遺伝子のバリエーションのためである
。
ＰＣＲプライマーのコホート（表１）を、ＡＨＡＳ遺伝子の増幅のために設計した。プ
ライマーは、ＣＬＵＳＴＡＬＷ（商標）（Thompson et al., (1994) Nucleic Acids Rese
arch 22:4673-80）を用いて生じた複数の配列アラインメントから生じたコンセンサス配
列から設計した。配列アラインメントを、５倍の適用範囲で完了したＲＯＣＨＥ ４５４
（商標）配列決定から生じた品種Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｓｐｒｉｎｇ配列決定データからアセ
ンブルした。
表１に示すように、ＰＣＲプライマーは、３つ全ての同祖配列を増幅するように、また
は単一の同祖配列のみを増幅するように設計した。例えば、ＡＨＡＳ遺伝子の転写領域を
増幅するのに用いたＰＣＲプライマーは、単一のマルチプレックスＰＣＲ反応において３
つ全ての同祖コピーを同時に増幅するように設計した。非転写領域を増幅するのに用いた
ＰＣＲプライマーは、３つ全ての同祖コピーを増幅するように、または単一の同祖コピー
のみを増幅するように設計した。全てのＰＣＲプライマーを、長さが１８から２７ヌクレ
オチドとなるように、かつ融解温度が６０から６５℃、最適には６３℃となるように設計
した。また、いくつかのプライマーは、最後から２番目の塩基（ホスホロチオエート連結
を含有しており、表１において星印［＊］が示される）をヌクレオチド配列のバリエーシ
ョンに対して配置して、遺伝子コピーを各小麦サブゲノムと識別するように設計した。表
１は、設計し、かつ合成したＰＣＲプライマーを一覧にしている。
Figure 0006886433
サブゲノム特異的増幅は、オン／オフＰＣＲ（Yang et al., (2005) Biochemical and
Biophysical Research Communications 328:265-72）を用いて、最後から２番目の塩基（
ホスホロチオエート連結を含有する）をヌクレオチド配列のバリエーションに対して配置
して、遺伝子コピーを各小麦サブゲノムと識別するように設計したプライマーにより、達
成した。異なる２セットのＰＣＲ条件を用いて、品種Ｂｏｂｗｈｉｔｅ ＭＰＢ２６ＲＨ
由来のＡＨＡＳ遺伝子の同祖コピーを増幅した。転写領域のＰＣＲ反応は、０．２ｍＭ
ｄＮＴＰｓ、１×ＩＭＭＯＬＡＳＥ ＰＣＲ（商標）バッファー（Ｂｉｏｌｉｎｅ、Ｔａ
ｕｎｔｏｎ、ＭＡ）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２５ユニット ＩＭＭＯＬＡＳＥ
ＤＮＡ ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥ（商標）（Ｂｉｏｌｉｎｅ、Ｔａｕｎｔｏｎ、ＭＡ）、フ
ォワードプライマーおよびリバースプライマーをそれぞれ０．２μＭ、ならびに約５０ｎ
ｇ ゲノムＤＮＡを含有した。ＡＨＡＳ＿１Ｆ１プライマーおよびＡＨＡＳ＿１Ｒ１プラ
イマーを含有する反応は、８％（ｖ／ｖ） ＤＭＳＯを補った。非転写領域のＰＣＲ反応
は、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、１×ＰＨＵＳＩＯＮ ＧＣ ＢＵＦＦＥＲ（商標）（Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）、０．５ユニット ＨＯＴ
−ＳＴＡＲＴ ＰＨＵＳＩＯＮ ＤＮＡ（商標）ポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ）、フォワードプライマーおよびリバースプライマーをそれぞれ０．２
μＭ、ならびに約５０ｎｇ ゲノムＤＮＡを含有した。ＰＣＲは、最終２５μｌの反応容
量中で、ＭＪ ＰＴＣ２００（登録商標）サーモサイクラー（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕ
ｌｅｓ、ＣＡ）を用いて実行した。ＰＣＲサイクルの後、反応産物を、ＰＧＥＭ−Ｔ Ｅ
ＡＳＹ ＶＥＣＴＯＲ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて精製
し、大腸菌（E. coli）ＪＭ１０９細胞中にクローニングした。プラスミドＤＮＡを、Ｄ
ＮＡＥＡＳＹ ＰＬＡＳＭＩＤ ＤＮＡ精製キット（商標）（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎ
ｃｉａ、ＣＡ）を用いて抽出し、ＢＩＧＤＹＥ（登録商標）ｖ３．１ ｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いてＡＢＩ
３７３０ＸＬ（登録商標）オートメーション化キャピラリ電気泳動プラットホームでサン
ガー法により配列決定した。ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ ＳＯＦＴＷＡＲＥ（商標）（Ｇｅｎ
ｅＣｏｄｅｓ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を用いて実行した配列分析を利用して、品種
Ｂｏｂｗｈｉｔｅ ＭＰＢ２６ＲＨ由来の各同祖遺伝子コピーのコンセンサス配列を生成
した（配列番号２５、配列番号２６および配列番号２７）。ＣＬＵＳＴＡＬＷ（商標）を
用いて、ＡＨＡＳ遺伝子コピーを識別する同祖配列バリエーションを確かめる複数のコン
センサス配列アラインメントを生じさせた。
ＡＨＡＳ遺伝子配列に特異的なジンクフィンガー結合ドメインの設計
ＡＨＡＳ遺伝子の同祖コピーの同定したＤＮＡ配列に対するジンクフィンガータンパク
質を、以前に記載されたように設計した。例えばUrnov et al., (2005) Nature 435:646-
551参照。例示的な標的配列および認識ヘリックスを、表２（認識ヘリックス領域設計）
および表３（標的部位）に示す。表３において、ＺＦＰ認識ヘリックスが接触する標的部
位のヌクレオチドを大文字で示す；非接触ヌクレオチドを小文字で示す。ジンクフィンガ
ーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）標的部位は、ＡＨＡＳ遺伝子中の４領域にあった：セリン６５
３アミノ酸残基の約５００ｂｐ上流の領域、セリン６５３アミノ酸残基に隣接する（３０
ｂｐ以内）上流の領域、セリン６５３アミノ酸残基に隣接する（８０ｂｐ以内）下流の領
域、およびセリン６５３アミノ酸残基の約４００ｂｐ下流の領域。
Figure 0006886433
Figure 0006886433
Figure 0006886433
ＡＨＡＳジンクフィンガー設計を、ＣＣＨＣ構造を備える少なくとも１本のフィンガー
を有するタンパク質をコードするジンクフィンガー発現ベクター中に組み入れた。米国特
許出願公開第２００８／０１８２３３２号参照。特に、各タンパク質の最後のフィンガー
は、認識ヘリックスのＣＣＨＣ骨格を有した。非正準ジンクフィンガーをコードする配列
を、トウモロコシ（Zea mays）に由来する４つのアミノ酸ＺＣリンカーおよびｏｐａｑｕ
ｅ−２核局在化シグナルを介して、タイプＩＩＳ制限酵素ＦｏｋＩのヌクレアーゼドメイ
ン（Wah et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10564-10569の配列のアミノ酸
３８４〜５７９）に融合させて、ＡＨＡＳジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を形
成した。米国特許第７８８８１２１号参照。
活性ヌクレアーゼを同定するために以前に示された発芽酵母ベースの系を用いて、切断
活性について最適なジンクフィンガーを確認した。例えば、米国特許出願公開第２００９
／０１１１１１９号；Doyon et al., (2008) Nat Biotechnology 26:702-708；Geurts et
al., (2009) Science 325:433参照。種々の機能ドメイン用のジンクフィンガーを、ｉｎ
ｖｉｖｏ使用のために選択した。設計し、産生し、かつ、推定のＡＨＡＳゲノムポリヌ
クレオチド標的部位に結合することを試験した多数のＺＦＮの内、１３のＺＦＮが高レベ
ルのｉｎ ｖｉｖｏ活性を有すると同定し、さらなる実験のために選択した。１１のＺＦ
Ｎを、３つの同祖遺伝子コピーに結合するように設計し、そして２つのＺＦＮ（２９９８
９−２Ａ−２９９８８および３０００６−２Ａ−３０００８）を、染色体６Ｄ上の遺伝子
コピーにのみ結合するように設計した。１３のＺＦＮは、固有のＡＨＡＳゲノムポリヌク
レオチド標的部位にｉｎ ｐｌａｎｔａで効率的に結合し、かつこれを切断することがで
きると特徴付けた。例示的なベクターを以下に記載する。
一過性アッセイを用いた、ＡＨＡＳ遺伝子のジンクフィンガーヌクレアーゼ切断の評価
ＺＦＮ構築物アセンブリ
実施例２に記載した酵母アッセイを用いて同定したＺＦＮ遺伝子発現構築物を含有する
プラスミドベクターを、当該技術において一般的に知られている技術を用いて設計して完
成させた。ＺＦＮをコードする各配列を、ジンクフィンガーヌクレアーゼの上流に位置す
る、ｏｐａｑｕｅ−２核局在化シグナル（Maddaloni et al., (1989) Nuc. Acids Res. 1
7: 7532）をコードする配列に融合させた。
融合タンパク質の発現を、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含むトウモロコシ（Zea mays）
ユビキチン遺伝子由来の構築プロモーターによって駆動した（Toki et al., (1992) Plan
t Physiology 100; 1503-07）。発現カセットもまた、トウモロコシ（Zea mays）ペルオ
キシダーゼ（Ｐｅｒ５）遺伝子（米国特許出願公開第２００４／０１５８８８７号）由来
の３’ＵＴＲ（転写ターミネータおよびポリアデニル化部位を含む）を含んだ。ゾセア・
アシグナ（Thosea asigna）ウイルス由来のヌクレオチド配列をコードする自己加水分解
２Ａ（Szymczak et al., (2004) Nat Biotechnol. 22:760-760）を、構築物中にクローニ
ングされる２つのジンクフィンガーヌクレアーゼ融合タンパク質の間に加えた。
プラスミドベクターは、ＩＮ−ＦＵＳＩＯＮ（商標）Ａｄｖａｎｔａｇｅ Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を用いてアセンブ
ルした。制限エンドヌクレアーゼをＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（Ｉｐｓｗ
ｉｃｈ、ＭＡ）から得、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａ
ｄ、ＣＡ）をＤＮＡライゲーションに用いた。プラスミド調製は、ＮＵＣＬＥＯＳＰＩＮ
（登録商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ Ｉｎｃ．、Ｂｅ
ｔｈｌｅｈｅｍ、ＰＡ）またはＰｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用
いて、供給業者の説明書に従って実行した。ＤＮＡ断片は、アガロース トリス−酢酸ゲ
ル電気泳動後に、ＱＩＡＱＵＩＣＫ ＧＥＬ ＥＸＴＲＡＣＴＩＯＮ ＫＩＴ（商標）（
Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離した。最初に、ライゲーション反応物のコロニーを、ミニプ
レップＤＮＡの制限消化によってスクリーニングした。選択したクローンのプラスミドＤ
ＮＡを、商業的配列決定業者（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎ、Ｈｕｎｔｓｖ
ｉｌｌｅ、ＡＬ）に配列決定させた。配列データは、ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ（商標）ソフ
トウェア（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐ．、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を用いてア
センブルし、かつ分析した。
結果として生じた１３のプラスミド構築物：ｐＤＡＢ１０９３５０（ＺＦＮ ２９７３
２−２Ａ−２９７３０）、ｐＤＡＢ１０９３５１（ＺＦＮ ２９７３２−２Ａ−２９７３
１）、ｐＤＡＢ１０９３５２（ＺＦＮ ２９７５３−２Ａ−２９７５４）、ｐＤＡＢ１０
９３５３（ＺＦＮ ２９９６８−２Ａ−２９９６７）、ｐＤＡＢ１０９３５４（ＺＦＮ
２９９６５−２Ａ−２９９６４）、ｐＤＡＢ１０９３５５（ＺＦＮ ２９９６８−２Ａ−
２９９６６）、ｐＤＡＢ１０９３５６（ＺＦＮ ２９９６９−２Ａ−２９９６７）、ｐＤ
ＡＢ１０９３５７（ＺＦＮ ２９９７１−２Ａ−２９９７０）、ｐＤＡＢ１０９３５８（
ＺＦＮ ２９９８９−２Ａ−２９９８８）、ｐＤＡＢ１０９３５９（ＺＦＮ ３０００６
−２Ａ−３０００８）、ｐＤＡＢ１０９３６０（ＺＦＮ ３００１２−２Ａ−３００１８
）、ｐＤＡＢ１０９３６１（ＺＦＮ ３００１４−２Ａ−３００１８）およびｐＤＡＢ１
０９３８５（ＺＦＮ ２９７７０−２Ａ−２９７６９）は、制限酵素消化を介して、かつ
ＤＮＡ配列決定を介して、確かめた。
代表的なプラスミドｐＤＡＢ１０９３５０およびｐＤＡＢ１０９３６０を、図１および
図２に示す。
ＺＦＮ構築物からのトランスフェクション用ＤＮＡの調製
コムギ（Triticum aestivum）プロトプラストへの送達の前に、各ＺＦＮ構築物のプラ
スミドＤＮＡを、ＰＵＲＥ ＹＩＥＬＤ ＰＬＡＳＭＩＤ ＭＡＸＩＰＲＥＰ ＳＹＳＴ
ＥＭ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）
またはＰＬＡＳＭＩＤ ＭＡＸＩ ＫＩＴ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉ
ａ、ＣＡ）を用いて、供給業者の説明書に従って、大腸菌（E. coli）の培養物から調製
した。
小麦葉肉プロトプラストの単離
小麦系統品種Ｂｏｂｗｈｉｔｅ ＭＰＢ２６ＲＨ由来の葉肉プロトプラストを、以下の
ようなポリエチレングリコール（ＰＥＧ）媒介ＤＮＡ送達を用いるトランスフェクション
用に調製した。
成熟種子を、８０％（ｖ／ｖ）エタノール中に３０秒間浸し、水道水で２回リンスして
から、２０％ ＤＯＭＥＳＴＯＳ（登録商標）（入手可能な０．８ｖ／ｖ％塩素）中で１
４０ｒｐｍの旋回シェーカー上で２０分間洗浄することによって表面滅菌した。ＤＯＭＥ
ＳＴＯＳ（登録商標）をデカントして取り除き、種子を滅菌水で４回リンスした。ＷＨＡ
ＴＭＡＮ（商標）濾紙上に種子を置くことによって、過剰な水を取り除いた。種子を、滅
菌ＰＥＴＲＩ（商標）皿内で、湿らせた数枚の滅菌ＷＨＡＴＭＡＮ（商標）濾紙上に置い
て、２４℃にて２４時間インキュベートした。インキュベーション後、種子を、先に記載
したように、１５％ ＤＯＭＥＳＴＯＳ（登録商標）中で１５分振盪させてから滅菌水で
リンスして、二度目の表面滅菌をした。種子を、ムラシゲスクーグ（ＭＳ）固形培地上に
２４℃にて２４時間置いた。最後に、種子を、先に記載したように、１０％ ＤＯＭＥＳ
ＴＯＳ（登録商標）中で１０分振盪させてから滅菌水でリンスして、三度目の表面滅菌を
した。種子は、溝側を下にして、ＰＥＴＲＩ（商標）皿あたり１０種子をＭＳ固形培地上
に置き、２４℃にて１４〜２１日間暗所で発芽させた。
発芽した種子から約２〜３グラムの葉材料を２〜３ｃｍの長さに切って、予め計量した
ＰＥＴＲＩ（商標）皿内に置いた。葉鞘および黄ばんだ葉材料は破棄した。およそ１０ｍ
Ｌの葉酵素消化ミックス（０．６Ｍ マンニトール、１０ｍＭ ＭＥＳ、１．５ｗ／ｖ％
セルラーゼＲ１０、０．３ｗ／ｖ％ マセロザイム、１ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１％
ウシ血清アルブミン、０．０２５ｖ／ｖ％ プルロニック酸、５ｍＭ β−メルカプトエ
タノール、ｐＨ ５．７）をＰＥＴＲＩ（商標）皿中にピペットで移し、葉材料を、鋭い
メス刃を用いて１〜２ｍｍのセグメントに横方向に切り刻んだ。葉材料は、葉消化ミック
スの存在下で切り刻んで、葉材料の乾燥に由来する細胞損傷を防止した。付加的な葉酵素
消化ミックスをＰＥＴＲＩ（商標）皿に加えて、葉材料の新鮮重量１グラムあたり１０ｍ
Ｌの容量とし、真空（２０”Ｈｇ）圧力に３０分間曝した。ＰＥＴＲＩ（商標）皿をＰＡ
ＲＡＦＩＬＭ（登録商標）で封をし、２８℃にて穏やかに回転振盪させながら４〜５時間
インキュベートした。
消化懸濁液を１００ミクロンのメッシュに通して５０ｍＬの収集チューブ中に入れるこ
とによって、葉セグメントから酵素消化ミックス中に解放された葉肉プロトプラストを植
物残骸から単離した。プロトプラストの収率を最大にするために、消化した葉材料を３回
洗浄した。各洗浄は、１０ｍＬの洗浄バッファー（２０ｍＭ ＫＣｌ、４ｍＭ ＭＥＳ、
０．６Ｍ マンニトール、ｐＨ ５．６）をＰＥＴＲＩ（商標）皿に加えて、１分間穏や
かに渦巻かせてから、洗浄バッファーを１００ミクロンの篩に通して同５０ｍＬの収集チ
ューブ中に入れることによって、実行した。次に、濾過したプロトプラスト懸濁液を７０
ミクロンの篩に続いて４０ミクロンの篩に通した。次に、濾過したプロトプラスト懸濁液
の６ｍＬのアリコートを、１２ｍＬの蓋付き丸底遠心チューブに移し、１２℃で７０ｇに
て１０分間遠心分離した。遠心分離の後、上清を取り除いて、プロトプラストペレットを
それぞれ７ｍＬの洗浄バッファー中に再懸濁させた。プロトプラストは、先に記載したよ
うに、遠心分離によって二度目のペレット化をさせた。プロトプラストをそれぞれ１ｍＬ
の洗浄バッファー中に再懸濁させて、２本の遠心チューブにプールした。洗浄バッファー
の容量を、各チューブにおいて７ｍＬの最終容量に調整してから、先に記載したように、
遠心分離を実行した。上清の除去後、プロトプラストのペレットを１ｍＬの洗浄バッファ
ー中に再懸濁させて、単一のチューブにプールした。葉肉プロトプラストの収率は、Ｎｅ
ｕｂａｕｅｒヘモサイトメーターを用いて推定した。エバンスブルー染色を用いて、回収
された生細胞の割合を判定した。
葉肉プロトプラストのＰＥＧ媒介トランスフェクション
約１０６個の葉肉プロトプラストを、１２ｍＬの丸底チューブに加えて、７０ｇでの遠
心分離によってペレット化させてから、上清を取り除いた。プロトプラストを、７０μｇ
のプラスミドＤＮＡを含有する６００μｌの洗浄バッファー中に穏やかに再懸濁させた。
プラスミドＤＮＡは、先に記載したジンクフィンガーヌクレアーゼ構築物からなった。次
に、４０％のＰＥＧ溶液（４０ｗ／ｖ％ ＰＥＧ４，０００、０．８Ｍ マンニトール、
１Ｍ Ｃａ（ＮＯ３）２、ｐＨ ５．６）の等容量をプロトプラスト懸濁液にゆっくり加
え、同時にチューブを穏やかに回転させて混合した。プロトプラスト懸濁液を、全く撹拌
せずに室温で１５分間インキュベートした。
洗浄バッファーの６ｍＬの付加的容量を、１ｍＬ、２ｍＬおよび３ｍＬの順次的なアリ
コート中プロトプラスト懸濁液にゆっくり加えた。同時に穏やかに混合して、順次的な各
アリコートによる均質な懸濁液を維持した。プロトプラスト懸濁液の半分を第２の１２ｍ
Ｌの丸底チューブに移して、洗浄バッファーの３ｍＬの付加的容量を、各チューブにゆっ
くり加え、同時に穏やかに混合した。プロトプラストを、７０ｇにて１０分間の遠心分離
によってペレット化させて、上清を取り除いた。プロトプラストのペレットをそれぞれ１
ｍＬの洗浄バッファー中に再懸濁させてから、対にした丸底チューブのプロトプラストを
単一の１２ｍＬチューブにプールした。付加的な７ｍＬの洗浄バッファーを、プールした
プロトプラストに加えてから、先に記載したように遠心分離した。上清を完全に取り除い
て、プロトプラストペレットを２ｍＬのＱｉａｏ培地（０．４４ｗ／ｖ％ ＭＳ、さらに
ビタミン、３ｍＭ ＭＥＳ、０．０００１ｗ／ｖ％ ２，４−Ｄ、０．６Ｍ グルコース
、ｐＨ ５．７）中に再懸濁させた。プロトプラスト懸濁液を、滅菌済み３ｃｍ ＰＥＴ
ＲＩ（商標）皿に移して、暗所で２４℃にて７２時間インキュベートした。
葉肉プロトプラストからのゲノムＤＮＡ単離
トランスフェクトしたプロトプラストを、３ｃｍのＰＥＴＲＩ（商標）皿から２ｍＬの
ミクロフュージチューブに移した。細胞を、７０ｇでの遠心分離によってペレット化させ
て、上清を取り除いた。トランスフェクトしたプロトプラストの回収率を最大にするため
に、ＰＥＴＲＩ（商標）皿を１ｍＬの洗浄バッファーで３回リンスした。各リンスは、Ｐ
ＥＴＲＩ（商標）皿内で洗浄バッファーを１分間渦巻かせることによって実行した後に、
液体を同２ｍＬのミクロフュージチューブに移した。各リンスの終了後、細胞を、７０ｇ
での遠心分離によってペレット化させて、上清を取り除いた。ペレット化したプロトプラ
ストを、液体窒素中で急速凍結してから、ＬＡＢＣＯＮＣＯ ＦＲＥＥＺＯＮＥ ４．５
（登録商標）（Ｌａｂｃｏｎｃｏ、Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ、ＭＯ）内で−４０℃にて１
３３×１０−３ｍＢａｒの圧力で２４時間凍結乾燥させた。凍結乾燥した細胞を、ＤＮＥ
ＡＳＹ（登録商標）ＰＬＡＮＴ ＤＮＡ ＥＸＴＲＡＣＴＩＯＮ ＭＩＮＩキット（Ｑｉ
ａｇｅｎ）を用いて、製造業者の説明書に従ってＤＮＡ抽出にかけたが、例外として、組
織破壊を必要とせずにプロトプラスト細胞を溶解バッファーに直接加えた。
プロトプラストゲノムＤＮＡの、ＺＦＮ配列切断についてのＰＣＲアッセイ
ＡＨＡＳ遺伝子座用に設計したＺＦＮの切断有効性および標的部位特異性を調査するこ
とができるように、ＰＣＲプライマーは、１つまたは複数のＺＦＮ標的部位が捕捉されて
いる最大３００ｂｐの断片を増幅するように設計した。プライマーの一方は、捕捉された
ＺＦＮ標的部位の１００ｂｐのウインドウ内にあるように設計した。この設計戦略により
、Ｉｌｌｕｍｉｎａショートリード技術を用いて、トランスフェクトしたプロトプラスト
における標的ＺＦＮ部位の完全性を評価することができた。また、ＰＣＲプライマーは、
ＡＨＡＳ遺伝子の３つの同祖コピーを増幅し、かつ、同祖性を区別するヌクレオチド配列
バリエーションを捕捉して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列リードが、それが由来する小麦サブゲ
ノムによるものと明解に考えられ得るように設計した。
合計４セットのＰＣＲプライマーを、ＺＦＮ標的部位遺伝子座を増幅するように設計し
た（表４）。各プライマーセットを合成し、フォワードプライマーおよびリバースプライ
マーの５’末端のそれぞれＩｌｌｕｍｉｎａ ＳＰ１およびＳＰ２配列は、Ｉｌｌｕｍｉ
ｎａショートリード配列決定ケミストリーとの適合性を提供する。合成したプライマーは
また、最後から２番目の５’および３’ヌクレオチド（表４において星印［＊］が示され
る）にホスホロチオエート連結を含有した。５’ホスホロチオエート連結は、Ｉｌｌｕｍ
ｉｎａ ＳＰ１およびＳＰ２配列のエキソヌクレアーゼ分解に対する保護を与える一方で
、３’ホスホロチオエート連結は、オン／オフＰＣＲ（Yang et al.,(2005)）を用いた標
的ＡＨＡＳ配列の増幅に対するＰＣＲ特異性を向上させた。全てのＰＣＲプライマーを、
長さが１８から２７ヌクレオチドであるように、かつ融解温度が６０から６５℃、最適に
は６３℃であるように設計した。
表４において、ＡＨＡＳ遺伝子に特異的なヌクレオチドを大文字で示す；Ｉｌｌｕｍｉ
ｎａ ＳＰ１およびＳＰ２配列に対応するヌクレオチドを小文字で示す。各プライマーセ
ットは、ＰＣＲ増幅産物のサンガーベースの配列決定法により、３つの同祖ＡＨＡＳ遺伝
子コピーの増幅について、実験に基づいて試験した。
Figure 0006886433
トランスフェクトした小麦葉肉プロトプラストから抽出したゲノムＤＮＡからのＺＦＮ
標的部位遺伝子座のＰＣＲ増幅を用いて、Ｉｌｌｕｍｉｎａベースの合成による配列決定
（sequencing-by-synthesis）技術に適切なフォーマットで、必要な遺伝子座特異的ＤＮ
Ａ分子を生じさせた。各ＰＣＲアッセイを、２００ｎｇの出発ＤＮＡ（約１２，５００細
胞のコムギ（Triticum aestivum）ゲノムに相当）で機能するように最適化した。ＺＦＮ
効率および標的部位特異性の信頼性が高い評価のアッセイに十分なコムギ（Triticum aes
tivum）ゲノムのコピーを確実にするために、トランスフェクトした試料毎に複数の反応
を実行した。個々のプロトプラストからとれたコムギ（Triticum aestivum）ゲノムの２
００，０００コピーに相当する約１６のＰＣＲアッセイを、トランスフェクトした試料毎
に実行した。トランスフェクトした各試料について、単一のＰＣＲマスターミックスを調
製した。ＺＦＮ標的部位の最適なＰＣＲ増幅を確実にするために（即ち、ＰＣＲ試薬の制
限を防止するために、かつＰＣＲが指数関数的な増幅段階のままであることを確実にする
ために）、最初のアッセイは、標的組織に実行するのに最適なサイクル数を決定する量的
ＰＣＲ法を用いて実行した。最初のＰＣＲは、ＭＸ３０００Ｐ ＴＨＥＲＭＯＣＹＣＬＥ
Ｒ（商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）での必要な陰性対照反応で実行した。定量ＰＣＲ機
器から集めたデータアウトプットから、蛍光の相対的増大をサイクル毎にプロットして、
十分な増幅をもたらすであろう一方で、反応が試薬制限され得ないサイクル数をアッセイ
毎に決定した。これは、共通分子の過剰サイクルおよび偏った増幅を減らそうとするもの
であった。定量ＰＣＲ分析が結論を下して最適サイクル数を決定するまで、未使用のマス
ターミックスを氷上に留めた。その後、残りのマスターミックスを所望の反応チューブ数
（ＺＦＮアッセイあたり約１６）に等分して、ＰＣＲ増幅を最適サイクル数実行した。増
幅後、ＺＦＮ標的部位が同じである試料を一緒にプールして、ＺＦＮあたり２００μｌの
プールした産物を、ＱＩＡＱＵＩＣＫ ＭＩＮＩＥＬＵＴＥ ＰＣＲ ＰＵＲＩＦＩＣＡ
ＴＩＯＮ ＫＩＴ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造業者の説明書に従って精製し
た。
Ｉｌｌｕｍｉｎａショートリード技術を用いて試料を配列決定することができるように
、ＰＣＲの付加的なラウンドを実行して、増幅されたＤＮＡ断片上にＩｌｌｕｍｉｎａ
Ｐ５およびＰ７配列を、そして、配列リードが、それが由来した試料によるものと明解に
考えるために用いられ得る配列バーコードインデックスを、導入した。これは、増幅の第
１のラウンドにおいて加えたＳＰ１およびＳＰ２配列と部分的に相補的であるが、試料イ
ンデックスならびにＰ５およびＰ７配列をも含有するプライマーを用いて、達成した。付
加的な配列をテンプレートに、共通断片を過剰増幅させることなく加えるのに必要とされ
るＰＣＲサイクルの最適数を、先に記載した定量ＰＣＲサイクル分析によって決定した。
増幅後、生じた産物を、ＡＭＰＵＲＥ ＭＡＧＮＥＴＩＣ ＢＥＡＤＳ（登録商標）（Ｂ
ｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）を１：１．７のＤＮＡ対ビーズ比で用いて、精製した。
精製したＤＮＡ断片を、Ｉｌｌｕｍｉｎａショートリード技術による配列決定のために、
ＰＣＲベースのライブラリー定量キット（ＫＡＰＡ）を用いて、製造業者の説明書に従っ
て、滴定した。配列決定用の試料を、ｃＢｏｔクラスタ生成キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）
を用いて調製し、ＩＬＬＵＭＩＮＡ ＧＡＩＩＸ（商標）またはＨＩＳＥＱ２０００（商
標）機器（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）上で製造業者の説明書に従って配列決定して、１００ｂｐ
の対末端配列リードを生成した。
標的ＺＦＮ部位のＮＨＥＪを検出するためのデータ分析
トランスフェクトした葉肉プロトプラストについて調製した試料ライブラリーのＩｌｌ
ｕｍｉｎａショートリード配列データの生成後、バイオインフォマティクス分析を実行し
て、標的ＺＦＮ部位にて欠失したヌクレオチドを同定した。そのような欠失は、非相同末
端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復に由来するｉｎ ｐｌａｎｔａ ＺＦＮ活性の指標である
ことが知られている。
ＮＨＥＪ欠失のある配列リードを同定するために、ＨＩＳＥＱ２０００（商標）機器（
Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で生成した配列データを加工するための、製造業者の供給したスクリ
プトを用いて、第１に、ショート配列リードを、それが由来するプロトプラスト試料にコ
ンピュータ処理的に割り当てた。試料割当ては、先に記載したライブラリー調製中に導入
したバーコードインデックス配列に基づいた。正しい試料割当ては、ライブラリーを調製
するのに用いた６ｂｐのバーコードインデックスが少なくともツーステップの配列差異に
よって互いと区別されると、確実であった。
試料割当ての後、品質フィルタを、全ての配列にわたってかけた。品質フィルタは、カ
スタム開発されたＰＥＲＬスクリプトで実施した。不明瞭な塩基が３を超える場合、また
は中央Ｐｈｒｅｄスコアが２０未満である場合、または３以上の連続塩基のＰｈｒｅｄス
コアが２０未満である場合、または配列リードの長さが４０ヌクレオチドよりも短い場合
、配列リードを除外した。
次に、品質トリミングした配列は、それが由来する小麦サブゲノムによるものと考えた
。これは、第２のカスタム開発されたＰＥＲＬスクリプトを用いて達成され、サブゲノム
割当てを、先に記載したＡＨＡＳ遺伝子の３つの同祖コピーを増幅するのに用いたＰＣＲ
プライマーによって捕捉したヌクレオチド配列バリアントのハプロタイプから決定した。
最後に、サブゲノムに割り当てられた配列リードにおけるＺＦＮ切断部位でのＮＨＥＪ
欠失の頻度を、各試料について、第３のカスタム開発されたＰＥＲＬスクリプトおよびＭ
ｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ２０１０（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏ
ｎ）におけるマニュアルデータ操作を用いて判定した。これは、各試料内の各サブゲノム
上の固有のＮＨＥＪ欠失の頻度をカウントすることによって、達成した。
２つのアプローチを用いて、試験したＺＦＮの切断効率および特異性を評価した。切断
効率は、ＺＦＮ標的部位でのＮＨＥＪ欠失を含有する、サブゲノムに割り当てられた配列
の割合として表した（リードの百万分の一部）。それらの観察された切断効率によるＺＦ
Ｎのランク順位を用いて、ＡＨＡＳ遺伝子の４つの標的領域のそれぞれについてサブゲノ
ム特異的な最も良い切断活性を有するＺＦＮを同定した。
試験した全てのＺＦＮは、ｉｎ ｐｌａｎｔａ ＺＦＮ活性について予想されるのと合
致するＮＨＥＪ欠失サイズ分布を示した。切断特異性は、３つのサブゲノムの全体にわた
って観察される切断効率の比率として表した。データ分析において生物学的反復を含めて
も、試験したＺＦＮの切断活性および特異性のランク順位に実質的に影響が及ばなかった
。
これらの結果から、３つの小麦サブゲノムのそれぞれにおける重要なゲノムＤＮＡ切断
活性の特徴を考えると、プラスミドｐＤＡＢ１０９３５０（即ちＺＦＮ ２９７３２およ
び２９７３０）およびｐＤＡＢ１０９３６０（即ちＺＦＮ ３００１２および３００１８
）上にコードされるＺＦＮを、以降の実験におけるｉｎ ｐｌａｎｔａ標的用に選択した
。
一過性アッセイを用いたＺＦＮ媒介ＡＨＡＳ遺伝子編集のためのドナー設計の評価
小麦における内因性ＡＨＡＳ遺伝子座でのＺＦＮ媒介ゲノム編集を調査するために、相
同組換え（ＨＲ）指向性および非相同末端結合（ＮＨＥＪ）指向性のＤＮＡ修復の効率に
及ぼすドナー設計の効果を評価する一連の実験を企てた。これらの実験は、一過性アッセ
イを用いて、イミダゾリノンクラス除草剤に対する耐性をもたらす以前に記載されたＳ６
５３Ｎ変異（Li et al.,(2008)Molecular Breeding 22:217-225）の、小麦における内因
性ＡＨＡＳ遺伝子座へのＺＦＮ媒介付加について、または代わりに、標的ＺＦＮ切断によ
って内因性ＡＨＡＳ遺伝子内に生じた二本鎖ＤＮＡ切断へのＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレ
アーゼ配列部位のＺＦＮ媒介導入についての効率をモニターした。
ＨＲ指向性ＤＮＡ修復のためのドナー設計
ドナーＤＮＡ設計は、ＺＦＮ ２９７３２および２９７３０の標的切断部位の側面にそ
れぞれ位置する７５０ｂｐの相同腕（即ち、内因性ＡＨＡＳ遺伝子と同一の配列）を含有
するプラスミドＤＮＡベクターに基づいた。プラスミドＤＮＡベクターを、３つの小麦サ
ブゲノムのそれぞれについて設計した：ｐＤＡＳ０００１３２（図３）、ｐＤＡＳ０００
１３３（図４）およびｐＤＡＳ０００１３４（図５）をそれぞれ、Ａ、ＢおよびＤゲノム
に対して設計した（配列番号６５、配列番号６６および配列番号６７）。各プラスミドＤ
ＮＡベクターは、Ｓ６５３Ｎ（ＡＧＣ→ＡＴＴ）変異を、イミダゾリノンクラス除草剤に
対する耐性をもたらすゲノム改変として、ＺＦＮ媒介ＨＲ指向性のＤＮＡ修復によって内
因性ＡＨＡＳ遺伝子の標的同祖コピーに導入するように設計した。２つの付加的なプラス
ミドＤＮＡ構築物もまた、Ｄゲノムを標的とするように設計した。第１のプラスミドＤＮ
Ａ、ｐＤＡＳ０００１３５（配列番号６８）（図６）は、２つの付加的な（同義の）単一
ヌクレオチド点変異を含有する（それぞれＳ６５３Ｎ変異の１５ｂｐ上流および下流に位
置する）こと以外、ｐＤＡＳ０００１３４と同一であった。第２のプラスミドＤＮＡ、ｐ
ＤＡＳ０００１３１（配列番号６９）（図７）は、Ｓ６５３Ｎ変異を含有しないが、内因
性ＡＨＡＳ遺伝子のＤゲノムコピーにおける標的ＺＦＮ切断によって生じた二本鎖ＤＮＡ
切断に、ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ認識部位（即ち、ＧＡＡＴＴＣ）を導入する
ように設計した。
ＮＨＥＪ指向性ＤＮＡ修復のためのドナー設計
ドナーＤＮＡ設計の２つのタイプを、ＮＨＥＪ指向性のＤＮＡ修復に用いた。
ドナー設計の第１のタイプは、小麦における内因性ＡＨＡＳ遺伝子との相同性を共有し
ない配列の４１ｂｐを含む直鎖状の二本鎖ＤＮＡ分子であった。２つのドナーＤＮＡ分子
を設計し、それぞれＡＨＡＳ遺伝子の３つの同祖コピーを標的とした。双方のドナーＤＮ
Ａ分子は、ライゲーション突出を提供する突出５’末端および３’末端を有し、ＺＦＮ媒
介ＮＨＥＪ指向性のＤＮＡ修復を促進した。２つのドナーＤＮＡ分子は、それらの突出３
’末端の配列が異なった。第１のドナーＤＮＡ分子、ｐＤＡＳ０００１５２（配列番号７
４および配列番号７５）は、ＺＦＮ ２９７３２および２９７３０（プラスミドｐＤＡＢ
１０９３５０上にコードされる）による内因性ＡＨＡＳ遺伝子の切断によって生じるもの
と適合性があるライゲーション突出を提供するように、かつ、ＮＨＥＪ指向性のＤＮＡ修
復を介した、二重鎖ＤＮＡ切断部位の内因性ＡＨＡＳ遺伝子中への４１ｂｐのドナー分子
の挿入をもたらすように設計した。第２のドナーＤＮＡ分子、ｐＤＡＳ０００１４９（配
列番号７６および配列番号７７）は、ＺＦＮ ２９７３２および２９７３０（プラスミド
ｐＤＡＢ１０９３５０上にコードされる）ならびにＺＦＮ ３００１２および３００１８
（プラスミドｐＤＡＢ１０９３６０上にコードされる）による内因性ＡＨＡＳ遺伝子の二
重切断によって生じるものと適合性があるライゲーション突出を提供するように、かつ、
ＮＨＥＪ指向性のＤＮＡ修復を介した、ＺＦＮによって生じた２つの二重鎖ＤＮＡ切断間
に含有される内因性ＡＨＡＳ配列の、４１ｂｐのドナー分子との置換をもたらすように設
計した。
ドナーの第２のタイプは、小麦における内因性ＡＨＡＳ遺伝子との相同性を共有せず、
かつ、内因性ＡＨＡＳ遺伝子中で二本鎖ＤＮＡ切断を生じさせるのに用いられるＺＦＮに
よって認識される配列がいずれかの隣接する配列の４１ｂｐを含有するプラスミドＤＮＡ
ベクターであった。このドナー設計により、内因性ＡＨＡＳ遺伝子中の標的部位を切断す
るのに用いられる同ＺＦＮによるプラスミドＤＮＡ分子からの固有の４１ｂｐ配列のｉｎ
ｐｌａｎｔａ放出、およびＮＨＥＪ指向性のＤＮＡ修復を介して内因性ＡＨＡＳ遺伝子
中に解放された４１ｂｐ配列の突出ライゲーションに適した突出末端の同時発生が可能と
なる。２つのプラスミドドナーＤＮＡ分子を設計し、それぞれＡＨＡＳ遺伝子の３つの同
祖コピーを標的とした。第１のプラスミドドナー分子、ｐＤＡＳ０００１５３（配列番号
７８および配列番号７９）（図８）は、ＺＦＮ ２９７３２および２９７３０（プラスミ
ドｐＤＡＢ１０９３５０上にコードされる）による内因性ＡＨＡＳ遺伝子の切断によって
生じるものと適合性がある、解放された４１ｂｐ ＤＮＡ断片上にライゲーション突出を
提供するように設計した。第２のプラスミドドナー分子、ｐＤＡＳ０００１５０（配列番
号８０および配列番号８１）（図９）は、ＺＦＮ ２９７３２および２９７３０（プラス
ミドｐＤＡＢ１０９３５０上にコードされる）によって生じるものと適合性がある一方端
に、かつ、ＺＦＮ ３００１２および３００１８（プラスミドｐＤＡＢ１０９３６０上に
コードされる）によって生じるものと適合性がある他方端にある、解放された４１ｂｐ
ＤＮＡ断片上にライゲーション突出を提供するように設計した。この設計により、ＺＦＮ
２９７３２および２９７３０ならびにＺＦＮ ３００１２および３００１８によって生
じる２つの二本鎖ＤＮＡ切断間に含有される内因性ＡＨＡＳ配列の、４１ｂｐドナー分子
配列との置換が可能となった。
ＮＨＥＪ指向性およびＨＤＲ指向性のＤＮＡ修復用のドナーＤＮＡの合成
当業者によって一般的に知られている標準的なクローニング法を用いて、プラスミドベ
クターを構築した。コムギ（Triticum aestivum）への送達前に、各ドナー構築物用のプ
ラスミドＤＮＡを、ＰＵＲＥ ＹＩＥＬＤ ＰＬＡＳＭＩＤ ＭＡＸＩＰＲＥＰ ＳＹＳ
ＴＥＭ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ
）またはＰＬＡＳＭＩＤ ＭＡＸＩ ＫＩＴ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃ
ｉａ、ＣＡ）を用いて、供給業者の説明書に従って、大腸菌（E. coli）の培養物から調
製した。
標準的なホスホラミダイト化学を用いて、二本鎖ＤＮＡドナー分子を合成的に合成した
（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、
ＩＡ）。各ドナー分子について、一対の相補的な一本鎖ＤＮＡオリゴマーを合成し、それ
ぞれ５’末端に２つのホスホロチオエート連結を付けて、ｉｎ ｐｌａｎｔａエンドヌク
レアーゼ分解に対する保護を提供した。一本鎖ＤＮＡオリゴマーを、高速液体クロマトグ
ラフィーによって精製して全長分子について濃縮し、かつ合成工程由来の化学的キャリー
オーバーからＮａ＋交換を用いて精製した。二本鎖ドナー分子を、当業者によって一般的
に知られている標準的な方法を用いて、２つの相補的な一本鎖ＤＮＡオリゴマーの等モル
量をアニーリングすることによって、形成した。コムギ（Triticum aestivum）への送達
前に、二本鎖ＤＮＡ分子を滅菌水中で、必要とされる濃度に希釈した。
体細胞胚発生カルスに由来する小麦プロトプラストの単離
ドナー小麦系統品種Ｂｏｂｗｈｉｔｅ ＭＰＢ２６ＲＨから体細胞胚発生カルス（ＳＥ
Ｃ）に由来するプロトプラストを、以下のようなポリエチレングリコール（ＰＥＧ）媒介
ＤＮＡ送達を用いるトランスフェクション用に調製した：
ドナー小麦系統の実生を、１８／１６℃（日／夜）および１６／８時間（日／夜）の光
周期（照明を８００ｍｍｏｌ ｍ２毎秒で提供する）に維持した環境制御育生室内で育生
した。小麦の穂を開花後１２〜１４日目に収集し、７０％（ｖ／ｖ）エタノール中に１分
間浸すことによって表面を滅菌した。穂を脱穀して、未熟な種子を１７％（ｖ／ｖ）漂白
剤中で穏やかに振盪させながら１５分間滅菌してから、滅菌蒸留水で少なくとも３回リン
スした。胚を、解剖顕微鏡下で未熟な種子から無菌的に単離した。胚軸を、鋭いメスを用
いて取り除き、破棄した。胚盤を、２〜４のＴＩＭＥＮＴＩＮ（商標）フリー培地を含有
する９ｃｍ ＰＥＴＲＩ（商標）皿に入れ、切られていない胚盤を上方に向けた。合計２
５個の胚盤を、各９ｃｍ ＰＥＴＲＩ（商標）皿上にプレーティングした。暗所において
２４℃で３週間インキュベートすることによって、体細胞胚発生カルス（ＳＥＣ）形成を
開始した。３週後、ＳＥＣを非胚発生カルスから分離して、新鮮な２〜４のＴＩＭＥＮＴ
ＩＮ（商標）フリー培地上に置き、さらに３週間暗所において２４℃にてインキュベート
した。ＳＥＣの継代培養を合計３回繰り返してから、プロトプラスト調製に用いた。
鋭いメス刃を用いて、およそ１０ｍＬの小麦カルス消化ミックス（２．５ｗ／ｖ％セル
ラーゼＲＳ、０．２ｗ／ｖ％ペクトリアーゼＹ２３、０．１ｗ／ｖ％ ＤＲＩＳＥＬＡＳ
Ｅ（登録商標）、１４ｍＭ ＣａＣｌ２、０．８ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．７ｍＭ ＫＨ２
ＰＯ４、０．６Ｍマンニトール、ｐＨ ５．８）を含有する１０ｃｍ ＰＥＴＲＩ（商標
）皿内で、約１グラムのＳＥＣを１〜２ｍｍのピースに切り刻んで、カルスを無水状態か
ら防止した。付加的なカルス消化ミックスをＰＥＴＲＩ（商標）皿に加えて、カルスのグ
ラム新鮮重あたり１０ｍＬの容量とし、真空（２０”Ｈｇ）圧力に３０分間曝した。ＰＥ
ＴＲＩ（商標）皿をＰＡＲＡＦＩＬＭ（登録商標）で封をし、２８℃にて３０〜４０ｒｐ
ｍで穏やかに回転振盪させながら４〜５時間インキュベートした。
消化懸濁液を１００ミクロンのメッシュに通して５０ｍＬの収集チューブに入れること
によって、カルスから解放したＳＥＣプロトプラストを単離した。プロトプラストの収率
を最大にするために、消化したカルス材料を３回洗浄した。各洗浄は、１０ｍＬのＳＥＣ
洗浄バッファー（０．６Ｍマンニトール、０．４４ｗ／ｖ％ ＭＳ、ｐＨ ５．８）をＰ
ＥＴＲＩ（商標）皿に加えて、１分間穏やかに渦巻かせてから、ＳＥＣ洗浄バッファーを
１００ミクロンの篩に通して同５０ｍＬの収集チューブ中に入れることによって、実行し
た。次に、濾過したプロトプラスト懸濁液を７０ミクロンの篩に続いて４０ミクロンの篩
に通した。次に、濾過したプロトプラスト懸濁液の６ｍＬのアリコートを、１２ｍＬの蓋
付き丸底遠心チューブに移し、１２℃で７０ｇにて１０分間遠心分離した。遠心分離の後
、およそ０．５ｍＬの上清を残して上清を取り除いて、プロトプラストペレットをそれぞ
れ７ｍＬの２２％シュークロース溶液中に再懸濁させた。シュークロース／プロトプラス
トミックスを、２ｍＬのＳＥＣ洗浄バッファーで、２つの溶液が混合しないことを確実に
するように慎重に覆った。プロトプラストは、先に記載したように、遠心分離によって二
度目の遠心分離をした。ＳＥＣ洗浄バッファーとシュークロース溶液との間に見えるプロ
トプラストのバンドを、ピペットを用いて収集して、きれいな１２ｍＬの丸底チューブ中
に入れた。７ｍＬのＳＥＣ洗浄バッファーをプロトプラストに加えて、チューブを、先に
記載したように遠心分離した。上清を取り除いて、ＳＥＣプロトプラストを単一のチュー
ブに組み合わせて、最終容量１〜２ｍＬのＳＥＣ洗浄バッファー中に再懸濁させた。ＳＥ
Ｃプロトプラストの収率は、Ｎｅｕｂａｕｅｒヘモサイトメーターを用いて推定した。エ
バンスブルー染色を用いて、回収された生細胞の割合を判定した。
ＳＥＣプロトプラストのＰＥＧ媒介トランスフェクション
約２００万個のＳＥＣプロトプラストを、１２ｍＬの丸底チューブに加えて、７０ｇで
の遠心分離によってペレット化させてから、上清を取り除いた。プロトプラストを、７０
μｇのＤＮＡを含有する４８０μＬのＳＥＣ洗浄バッファー中に穏やかに再懸濁させた。
ＤＮＡは、先に記載したジンクフィンガーヌクレアーゼ構築物およびドナーＤＮＡ構築物
からなり、各構築物は、企てた実験に必要とされるモル比で存在した。次に、７２０μＬ
の５０％ ＰＥＧ溶液（５０ｗ／ｖ％ ＰＥＧ ４０００、０．８Ｍ マンニトール、１
Ｍ Ｃａ（ＮＯ３）２、ｐＨ ５．６）をプロトプラスト懸濁液にゆっくり加え、同時に
チューブを穏やかに回転させて混合した。プロトプラスト懸濁液を、全く撹拌せずに室温
で１５分間インキュベートした。
ＳＥＣ洗浄バッファーの７ｍＬの付加的容量を、１ｍＬ、２ｍＬおよび３ｍＬの順次的
なアリコート中プロトプラスト懸濁液にゆっくり加えた。同時に穏やかに混合して、順次
的な各アリコートによる均質な懸濁液を維持した。プロトプラスト懸濁液の半分を第２の
１２ｍＬの丸底チューブに移して、ＳＥＣ洗浄バッファーの３ｍＬの付加的容量を、各チ
ューブにゆっくり加え、同時に穏やかに混合した。プロトプラストを７０ｇにて１０分間
の遠心分離によってペレット化させて、上清を取り除いた。プロトプラストのペレットを
それぞれ１ｍＬのＳＥＣ洗浄バッファー中に再懸濁させてから、対にした丸底チューブの
プロトプラストを単一の１２ｍＬチューブにプールした。付加的な７ｍＬのＳＥＣ洗浄バ
ッファーを、プールしたプロトプラストに加えてから、先に記載したように遠心分離した
。上清を完全に取り除いて、プロトプラストペレットを２ｍＬのＱｉａｏ培地中に再懸濁
させた。プロトプラスト懸濁液を、滅菌済み３ｃｍ ＰＥＴＲＩ（商標）皿に移して、暗
所で２４℃にて７２時間インキュベートした。
未熟な接合子小麦胚からの胚盤の単離
ドナー小麦系統品種Ｂｏｂｗｈｉｔｅ ＭＰＢ２６ＲＨからの未熟な接合子小麦胚の胚
盤を、以下のような微粒子銃媒介ＤＮＡ送達を用いるトランスフェクション用に調製した
。
ドナー小麦系統の実生を、１８／１６℃（日／夜）および１６／８時間（日／夜）の光
周期（照明を８００ｍｍｏｌ ｍ２毎秒で提供する）に維持した環境制御育生室内で育生
した。小麦の穂を開花後１２〜１４日目に収集し、７０％（ｖ／ｖ）エタノール中に１分
間浸すことによって表面を滅菌した。穂を脱穀して、未熟な種子を１７％（ｖ／ｖ）漂白
剤中で穏やかに振盪させながら１５分間滅菌してから、滅菌蒸留水で少なくとも３回リン
スした。胚を、解剖顕微鏡下で未熟な種子から無菌的に単離した。胚軸を、鋭いメスを用
いて取り除き、破棄した。胚盤を、浸透性ＭＳ（Ｅ３マルトース）培地を含有する９ｃｍ
ＰＥＴＲＩ（商標）皿に入れ、切られていない胚盤を上方に向けた。合計２０個の胚盤
を、各９ｃｍ ＰＥＴＲＩ（商標）皿上にプレーティングした。調製した胚は、微粒子銃
媒介ＤＮＡ送達を用いるトランスフェクションの前に、２６℃の暗所で最低でも４時間プ
レ培養した。
微粒子銃媒介ＤＮＡ送達による、未熟な接合子小麦胚の胚盤のトランスフェクション
４０ｍｇの０．６ミクロン コロイド金粒子（ＢｉｏＲａｄ）を、１．５ｍＬのマイク
ロチューブ内の１ｍＬの滅菌水に加えることによって、微粒子銃媒介ＤＮＡ送達用の金粒
子を調製した。金粒子を５分間ボルテックスすることによって、再懸濁させた。１０回の
照射に十分な材料を調製するために、金粒子懸濁液の５０μＬのアリコートを、５μＬの
滅菌水中に再懸濁した５μｇのＤＮＡを含有する１．５ｍＬのマイクロチューブに移した
。ボルテックスによる徹底的な混合の後、５０μＬの２．５Ｍ ＣａＣｌ２および２０μ
Ｌの０．１Ｍ スペルミジンをマイクロチューブに加え、各試薬の添加後に徹底的に混合
した。ＤＮＡコーティングされた金粒子を、卓上マイクロフュージ内で最大速度にて１分
間の遠心分離によってペレット化させた。上清を取り除き、１ｍＬの１００％エタノール
を加えて、金粒子を洗浄し、かつ再懸濁させた。先に記載したように、金粒子を遠心分離
によってペレット化させて、上清を破棄した。ＤＮＡコーティングされた金粒子を、１１
０μＬの１００％エタノール中に再懸濁させて、氷上で維持した。短いボルテックスの後
、１０μＬの金粒子溶液を、マクロキャリア膜上の中央に置いて、空気乾燥させた。
ＰＤＳ−１０００／ＨＥ ＰＡＲＴＩＣＬＥ ＧＵＮ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥ
Ｍ（商標）（ＢｉｏＲａｄ）を用いて、未熟な接合子小麦胚の胚盤を、微粒子銃媒介ＤＮ
Ａ送達によってトランスフェクトした。ＤＮＡコーティングされた金粒子の送達を、以下
のセッティングを用いて実行した：ギャップ２．５ｃｍ、ストッピングプレートアパーチ
ャ０．８ｃｍ、標的距離６．０ｃｍ、真空９１．４〜９４．８ｋＰａ、真空フロー速度５
．０および出口フロー速度４．５。未熟な接合子小麦胚の胚盤を、９００ｐｓｉラプチャ
ーディスクを用いて照射した。２０個の胚盤を含有する各ＰＥＴＲＩ（商標）皿を一度照
射した。照射された胚盤を、２６℃の暗所で１６時間インキュベートしてから、カルス誘
導培地上に移した。胚盤を、カルス誘導培地上で、２６℃の暗所で７日間培養した。
ＳＥＣプロトプラストからのゲノムＤＮＡの単離
葉肉プロトプラストについて先に記載した手順を用いて、ゲノムＤＮＡをＳＥＣプロト
プラストから抽出した。トランスフェクションに用いたドナーＤＮＡの存在を減らす付加
的な精製工程を実行した。これは、トランスフェクションに用いるドナーＤＮＡからＳＥ
Ｃプロトプラスト由来のゲノムＤＮＡを分離するために、ゲル電気泳動を用いて達成した
。抽出したＤＮＡを、０．５×ＴＢＥを用いて、０．５％ アガロースゲルにおいて３時
間電気泳動にかけた。ＤＮＡは、ＳＹＢＲ（登録商標）ＳＡＦＥ染色によって視覚化し、
ＳＥＣプロトプラスト由来のゲノムＤＮＡに相当するバンドを切り取った。ゲノムＤＮＡ
をアガロースゲルから、ＱＩＡＱＵＩＣＫ ＤＮＡＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＫＩＴ（
商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造業者の説明書に従って精製したが、ＱＩＡＱＵＩ
ＣＫ（商標）ＤＮＡ精製カラムは、ＤＮＥＡＳＹ ＰＬＡＮＴ ＤＮＡ ＥＸＴＲＡＣＴ
ＩＯＮ ＭＩＮＩ ＫＩＴ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ）のＤＮＡ結合カラムに取って代えた
。
未熟な接合子胚の胚盤からのゲノムＤＮＡの単離
各微粒子銃媒介ＤＮＡ送達用にトランスフェクトした未熟な接合子小麦胚の２０個の胚
盤を、１５ｍｌ チューブに移して、液体窒素中で急速凍結してから、ＬＡＢＣＯＮＣＯ
ＦＲＥＥＺＯＮＥ ４．５（登録商標）（Ｌａｂｃｏｎｃｏ、Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ
、ＭＯ）内で−４０℃にて１３３×１０−３ｍＢａｒの圧力で２４時間凍結乾燥させた。
凍結乾燥したカルスを、ＤＮＥＡＳＹ（登録商標）ＰＬＡＮＴ ＤＮＡ ＥＸＴＲＡＣＴ
ＩＯＮ ＭＡＸＩ（商標）ＫＩＴ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造業者の説明書に従って
ＤＮＡ抽出にかけた。
トランスフェクションに用いるドナーＤＮＡの存在を減らす付加的な精製工程を実行し
た。これは、トランスフェクションに用いるドナーＤＮＡからカルス由来のゲノムＤＮＡ
を分離するために、ゲル電気泳動を用いて達成した。抽出したＤＮＡを、０．５×ＴＢＥ
を用いて、０．５％ アガロースゲルにおいて３時間電気泳動にかけた。ＤＮＡは、ＳＹ
ＢＲ（登録商標）ＳＡＦＥ染色によって視覚化し、カルス由来のゲノムＤＮＡに相当する
バンドを切り取った。ゲノムＤＮＡをアガロースゲルから、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（商標）Ｄ
ＮＡ ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造業者の説明書に
従って精製したが、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（商標）ＤＮＡ精製カラムは、ＤＮＥＡＳＹ（登録
商標）ＰＬＡＮＴ ＤＮＡ ＥＸＴＲＡＣＴＩＯＮ ＭＡＸＩ（商標）ＫＩＴ（Ｑｉａｇ
ｅｎ）のＤＮＡ結合カラムに取って代えた。
ゲノムＤＮＡのＺＦＮ媒介ＡＨＡＳ編集についてのＰＣＲアッセイ
小麦における内因性ＡＨＡＳ遺伝子でのＺＦＮ媒介ゲノム編集を、ＨＲおよびＮＨＥＪ
指向性ＤＮＡ修復を用いて調査し、かつ各ＤＮＡ修復経路の有効性に及ぼすドナーＤＮＡ
設計の効果を評価するために、ＰＣＲアッセイを用いて、トランスフェクトした小麦細胞
のゲノムＤＮＡから標的ＡＨＡＳ領域を増幅した。ＰＣＲアッセイを、先に記載したよう
に実行して、Ｉｌｌｕｍｉｎａベースの合成による配列決定技術に適切なフォーマットで
、必要な遺伝子座特異的ＤＮＡ分子を生じさせた。各アッセイを、ＺＦＮ ２９７３２お
よび２９７３０（プラスミドｐＤＡＢ１０９３５０上にコードされる）ならびにＺＦＮ
３００１２および３００１８（プラスミドｐＤＡＢ１０９３６０上にコードされる）によ
って標的とされる領域を増幅するように設計した、先に記載したプライマー対（配列番号
５９および配列番号６０）を用いて、ＡＨＡＳ遺伝子の３つの同祖コピーのそれぞれにつ
いて、実行した。ＺＦＮ媒介遺伝子編集の信頼性が高い評価のアッセイに十分なコムギ（
Triticum aestivum）ゲノムのコピーを確実にするために、トランスフェクトした試料毎
に複数の反応を実行した。トランスフェクトしたＳＥＣプロトプラストについて、個々の
プロトプラストからとれたコムギ（Triticum aestivum）ゲノムの２００，０００コピー
に相当する最大１６のＰＣＲアッセイを、トランスフェクトした試料毎に実行した。未熟
な接合子胚のトランスフェクトした胚盤について、個々のプロトプラストからとれたコム
ギ（Triticum aestivum）ゲノムの６００，０００コピーに相当する約４８のＰＣＲアッ
セイを、トランスフェクトした試料毎に実行した。トランスフェクトした各試料を、先に
記載したように、ＣＢＯＴ ＣＬＵＳＴＥＲ ＧＥＮＥＲＡＴＩＯＮ ＫＩＴ（商標）（
Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて、配列決定用に調製し、そしてＩＬＬＵＭＩＮＡ ＧＡＩＩ
Ｘ（商標）またはＨＩＳＥＱ２０００（商標）機器（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）上で配列決定し
て、１００ｂｐの対末端配列リードを生成した。
ＡＨＡＳ遺伝子座でのＺＦＮ媒介ＨＲ指向性の編集を検出するためのデータ分析
トランスフェクトしたＳＥＣプロトプラストおよび未熟な接合子小麦胚の胚盤について
調製した試料ライブラリーのＩｌｌｕｍｉｎａショートリード配列データの生成後、標的
ＺＦＮ部位でのＺＦＮ媒介ＨＲ指向性編集の分子証拠を同定する分析を実行した。
ＨＲ指向性遺伝子編集の分子証拠を有する配列リードを同定するために、先に記載した
ように、ショート配列リードを第１にコンピュータ処理的に加工して、各リードを、それ
が由来した試料およびサブゲノムに割り当て、かつ高い品質配列のみを以降の分析に用い
ることを確実とするための品質フィルタリングを実行した。次に、カスタム開発されたＰ
ＥＲＬスクリプトおよびＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ２０１０（商標）（Ｍｉｃｒ
ｏｓｏｆｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）におけるマニュアルデータ操作を用いて、トラン
スフェクションに用いたドナーＤＮＡ分子および内因性ＡＨＡＳ遺伝子座の双方の配列を
含有するリードを同定した。ＺＦＮ媒介ＨＲ指向性遺伝子編集から生じた配列リードと、
トランスフェクションに用いた（あらゆる）ドナーＤＮＡのキャリーオーバーに由来する
配列リードとの明確な識別を確実にするために、配列リードが、ＺＦＮによって生じた二
本鎖ＤＮＡ切断の位置にＮＨＥＪ欠失をも含む場合にのみ、遺伝子編集の分子証拠を明言
した；即ち、配列リードは、不完全なＨＲ指向性のＤＮＡ修復の結果の証拠を示す。編集
頻度（リードの百万分の一部で表す）は、ＺＦＮ媒介ＨＲ指向性遺伝子編集の証拠を示す
サブゲノム割当て配列リードの割合として計算した。
各プラスミドドナーＤＮＡ設計に実行した３つの生物学的反復の結果から、小麦におけ
る内因性ＡＨＡＳ遺伝子の３つの同祖コピーにてＺＦＮ媒介ＨＲ指向性編集を示す配列リ
ードの濃縮について、分子証拠が得られた（表５および表６）。強い分子証拠が、ｐＤＡ
Ｂ１０９３５０およびｐＤＡＳ０００１３１でトランスフェクトしたＳＥＣプロトプラス
トおよび未熟な接合子胚の胚盤の試料の双方における内因性ＡＨＡＳ遺伝子の３つ全ての
同祖コピーにおける、ＺＦＮ ２９７３２および２９７３０によって生じた二本鎖ＤＮＡ
切断部分へのＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ部位の添加について、得られた。ＺＦＮ
媒介ＨＲ指向性遺伝子編集の頻度は、ドナーＤＮＡ分子が標的とするＤゲノムで最も高か
った。同様に、強い分子証拠が、ｐＤＡＢ１０９３５０およびｐＤＡＳ０００１３２、ｐ
ＤＡＳ０００１３３またはｐＤＡＳ０００１３４のいずれかでトランスフェクトした未熟
な接合子胚の胚盤の試料における内因性ＡＨＡＳ遺伝子の３つ全ての同祖コピーにおける
、Ｓ６５３Ｎ変異を含有するドナーポリヌクレオチドの導入について得られた；強い分子
証拠が、ｐＤＡＢ１０９３５０およびｐＤＡＳ０００１３４でトランスフェクトしたＳＥ
Ｃプロトプラストの試料についても観察された。ＺＦＮ媒介ＨＲ指向性遺伝子編集の頻度
は、ここでも、ドナーＤＮＡを設計したサブゲノムで最も高かった。重要なことに、ｐＤ
ＡＢ１０９３５０およびｐＤＡＳ０００１３５でトランスフェクトしたＳＥＣプロトプラ
ストおよび未熟な接合子胚の胚盤の試料における編集頻度は、ｐＤＡＢ１０９３５０およ
びｐＤＡＳ０００１３４でトランスフェクトした試料について観察した編集頻度よりも、
（約１０倍）低かった。この結果は、ｐＤＡＳ００１３５ドナー設計において隣接する変
異の存在によるＨＲ指向性のＤＮＡ修復の効率に課されるペナルティにより、予想された
。
Figure 0006886433
Figure 0006886433
ＡＨＡＳ遺伝子でのＺＦＮ媒介ＮＨＥＪ指向性の編集を検出するためのデータ分析
トランスフェクトしたＳＥＣプロトプラストおよび未熟な接合子小麦胚の胚盤について
調製した試料ライブラリーのＩｌｌｕｍｉｎａショートリード配列データの生成後、標的
ＺＦＮ部位でのＺＦＮ媒介ＮＨＥＪ指向性編集の分子証拠を同定する分析を実行した。
ＮＨＥＪ指向性遺伝子編集の分子証拠を有する配列リードを同定するために、先に記載
したように、ショート配列リードを第１にコンピュータ処理的に加工して、各リードを、
それが由来した試料およびサブゲノムに割り当て、かつ高い品質配列のみを以降の分析に
用いることを確実とするための品質フィルタリングを実行した。次に、カスタム開発され
たＰＥＲＬスクリプトおよびＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ２０１０（Ｍｉｃｒｏｓ
ｏｆｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）におけるマニュアルデータ操作を用いて、トランスフ
ェクションに用いたドナーＤＮＡ分子および内因性ＡＨＡＳ遺伝子座の双方の配列を含有
するリードを同定した。編集頻度（リードの百万分の一部で表す）は、ＺＦＮ媒介ＮＨＥ
Ｊ指向性遺伝子編集の証拠を示すサブゲノム割当て配列リードの割合として計算した。
各直鎖状二本鎖ＤＮＡドナー設計に実行した３つの生物学的反復の結果から、小麦にお
ける内因性ＡＨＡＳ遺伝子の３つの同祖コピーでのＺＦＮ媒介ＮＨＥＪ指向性の編集を示
す配列リードの濃縮の分子証拠を得た（表７および表８）。ｐＤＡＢ１０９３５０および
ｐＤＡＳ０００１５２でトランスフェクトしたＳＥＣプロトプラストおよび未熟な接合子
胚の胚盤の双方の試料におけるＺＦＮ ２９７３２および２９７３０によるＡＨＡＳ遺伝
子の同祖コピーの切断によって生じた二本鎖ＤＮＡ切断位置での、直鎖状の二本鎖４１ｂ
ｐドナー分子の組み込みの強い分子証拠を得た。類似の編集効率を、これらの試料におけ
る３つの小麦サブゲノムの全体にわたって観察した。対照的に、ｐＤＡＢ１０９３５０お
よびｐＤＡＳ０００１５３でトランスフェクトしたＳＥＣプロトプラストおよび未熟な接
合子胚の胚盤の試料は、ＺＦＮ媒介ＮＨＥＪ指向性の遺伝子編集の不十分な証拠を示した
。これはおそらくプラスミド骨格からの４１ｂｐドナー配列のｉｎ ｐｌａｎｔａ放出の
前提要件のためである。内因性ＡＨＡＳ配列の、４１ｂｐドナー分子との置換の分子証拠
を、ｐＤＡＢ１０９３５０、ｐＤＡＢ１０９３６０およびｐＤＡＳ０００１４９でトラン
スフェクトしたＳＥＣプロトプラストおよび未熟な接合子胚の胚盤の双方で観察した。し
かしながら、編集頻度は、ｐＤＡＢ１０９３５０およびｐＤＡＳ０００１５２を用いて実
行したトランスフェクションについて観察した編集頻度よりも有意に低かった。これはお
そらく、内因性ＡＨＡＳ配列の二重ＺＦＮ切断についての要件のためである。ｐＤＡＢ１
０９３５０、ｐＤＡＢ１０９３６０およびｐＤＡＳ０００１５０でトランスフェクトした
ＳＥＣプロトプラストおよび未熟な接合子胚の胚盤の試料におけるプラスミド骨格からの
ｉｎ ｐｌａｎｔａ解放に必要とされる４１ｂｐドナー分子との内因性ＡＨＡＳ配列の置
換について、限られた証拠を得た。
Figure 0006886433
Figure 0006886433
まとめて、結果は、小麦における内因性ＡＨＡＳ遺伝子座での正確なＺＦＮ媒介ＮＨＥ
Ｊ指向性の編集についての強い分子証拠を提供している。これらの結果は、３つ全てのサ
ブゲノムが単一のＺＦＮおよびドナーにより標的とされ得ることを示している。結果は、
直鎖状ドナーＤＮＡ設計の編集が、プラスミドドナーＤＮＡ設計と比較して、より高い頻
度であることを明確に実証している。おそらく、これらの結果は、ＮＨＥＪ指向性のＤＮ
Ａ修復に関与し得る前の、プラスミドドナー分子のｉｎ ｐｌａｎｔａ直鎖化の前提要件
のためである。結果はまた、サブゲノム特異的媒介ＮＨＥＪ指向性の遺伝子編集が、二本
鎖切断によって促進されることを示している。二本鎖ＤＮＡ切断を誘導するように設計し
たＺＦＮは、ドナーＤＮＡによりコムギ（Triticum aestivum）植物細胞に送達されると
、サブゲノム特異的媒介ＮＨＥＪ指向性の遺伝子編集をもたらした。
ＡＨＡＳ編集植物を産生するための形質転換系の開発
正確なゲノム改変がＺＦＮ媒介遺伝子編集によって誘導される植物生成形質転換系を開
発するためのモデル遺伝子座として、小麦の内因性ＡＨＡＳ遺伝子座を選択した。内因性
ＡＨＡＳ遺伝子をモデル遺伝子座として選択したのは、選択可能な表現型（即ち、グルー
プＢ除草剤、またはＡＬＳ阻害除草剤（イミダゾリノンまたはスルホニル尿素等）に対す
る耐性）を示すその能力、サブゲノム特異的遺伝子コード配列の不可欠な情報についての
知識、および、ＡＨＡＳ遺伝子において化学的に誘導された変異を有する小麦の特徴付け
からの、グループＢ除草剤、またはＡＬＳ阻害除草剤に対する耐性をもたらす特異的変異
についての知識のためである。イミダゾリノンクラスの除草剤に対する耐性をもたらすＳ
６５３Ｎ変異を、ＺＦＮ媒介遺伝子編集の標的として選択した。これは、Ｓ６５３Ｎ変異
を乗せている、商業的に発売されている小麦品種の入手可能性のためのであり、正確に編
集された事象を濃縮するような化学的選択系を開発するための陽性対照として用いること
ができた。
コムギ（Triticum aestivum）品種Ｃｌｅａｒｆｉｅｌｄ Ｊａｎｚの分子特徴付け
Ｄゲノム内にＳ６５３Ｎ変異を乗せている、商業的に発売されているコムギ（Triticum
aestivum）品種Ｃｌｅａｒｆｉｅｌｄ Ｊａｎｚを、ＺＦＮ媒介遺伝子編集によって産
生されるＡＨＡＳ編集小麦植物を濃縮するような化学的選択戦略を開発するための陽性対
照として用いるために選択した。純粋な遺伝的種子系統を生じさせるために、４８の実生
を、９６のマイクロサテライト（ＳＳＲ）マーカーで、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ−Ｒｅａｄｙ
ＰＣＲ技術（Hayden et al., (2008) BMC Genomics 9; 80）を用いてスクリーニングし
た。同一のＳＳＲハプロタイプである実生を、以降の実験で用いる種子を産生するために
用いた。
種子を産生するのに用いる小麦植物がＳ６５３Ｎ変異を乗せていることを確実にするた
めに、変異を乗せているＡＨＡＳ遺伝子の領域を小麦のＤゲノムから増幅するＰＣＲアッ
セイを開発した。サブゲノム特異的増幅は、最後から２番目の塩基（ホスホロチオエート
連結を含有する）を、ＡＨＡＳ遺伝子の同祖コピーを識別するヌクレオチド配列のバリエ
ーションに対して配置するように設計したプライマーＡＨＡＳ−ＰＳ−６ＤＦ２およびＡ
ＨＡＳ−ＰＳ−６ＤＲ２（配列番号８２および配列番号８３）によるオン／オフＰＣＲ（
Yang et al., (2005) Biochemical and Biophysical Research Communications 328:265-
72）を用いて達成した。ＰＣＲプライマーを、長さが１８から２７ヌクレオチドとなるよ
うに、かつ融解温度が６０から６５℃、最適には６３℃となるように設計した。増幅した
ＰＣＲ産物は、ＱＩＡＱＵＩＣＫ ＭＩＮＩＥＬＵＴＥ ＰＣＲ ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩ
ＯＮ ＫＩＴ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、ダイレクトサンガー配列決定法
を用いて配列決定した。配列決定した産物を、ＢＩＧＤＹＥ（登録商標）ｖ３．１プロト
コール（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に従って、エタノール、酢酸ナトリウ
ムおよびＥＤＴＡで精製し、ＡＢＩ３７３０ＸＬ（登録商標）オートメーション化キャピ
ラリ電気泳動プラットホーム上で電気泳動を実行した。
ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ ｖ３．７（商標）（ＧｅｎｅＣｏｄｅｓ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ
、ＭＩ）を用いた増幅ＡＨＡＳ遺伝子配列の分析は、Ｓ６５３Ｎ変異についての分離を明
らかにし、そしてＳ６５３Ｎ変異についてホモ接合性（Ｎ６５３／Ｎ６５３）であり、か
つヘテロ接合性（Ｎ６５３／Ｓ６５３）である、または除草剤感受性対立遺伝子について
ホモ接合性（Ｓ６５３／Ｓ６５３）である植物の同定を可能とした。個々の植物からの種
子の収穫は、品種Ｃｌｅａｒｆｉｅｌｄ Ｊａｎｚの遺伝的バックグラウンドにおけるＳ
６５３Ｎ変異について接合性のレベルが異なる種子源を提供した。
ＩＭＡＺＡＭＯＸ（商標）に基づく化学的選択条件の最適化
ＡＨＡＳ編集小麦植物を再生させるのに最適な選択条件を決定するための一連の実験を
実行した。これらの実験は、ドナー小麦系統品種Ｂｏｂｗｈｉｔｅ ＭＰＢ２６ＲＨ（Ｓ
６５３／Ｓ６５３遺伝子型）の、確立された小麦形質転換系のカルス誘導、植物再生およ
び発根段階でのＩＭＡＺＡＭＯＸ（商標）に対する基礎的耐性の試験に基づいた。類似の
実験を、異なる用量のＳ６５３Ｎ変異を乗せている品種Ｃｌｅａｒｆｉｅｌｄ Ｊａｎｚ
遺伝子型；即ち、Ｎ６５３／Ｎ６５３およびＳ６５３／Ｓ６５３遺伝子型を有する植物の
基礎的耐性および抵抗性を判定するために実行した。
ＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）に対する、カルス誘導段階でのドナー小麦系統品種Ｂｏ
ｂｗｈｉｔｅ ＭＰＢ２６ＲＨの基礎的耐性および品種Ｃｌｅａｒｆｉｅｌｄ Ｊａｎｚ
（Ｎ６５３／Ｎ６５３）遺伝子型の基礎的抵抗性を、以下のように判定した：各小麦系統
からの未熟な接合子胚の胚盤を、先に記載したように単離して、０、５０、１００、２０
０、３００、４００および５００ｎＭ ＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）をそれぞれ補った
ＣＩＭ培地を含有する１０ｃｍ ＰＥＴＲＩ（商標）皿内に置いた。２０個の胚盤を各Ｐ
ＥＴＲＩ（商標）皿内に置いた。ドナー小麦系統品種Ｂｏｂｗｈｉｔｅ ＭＰＢ２６ＲＨ
および品種Ｃｌｅａｒｆｉｅｌｄ Ｊａｎｚ遺伝子型のそれぞれからの合計６０個の胚盤
を、各ＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）濃度にて、基礎的耐性および基礎的抵抗性の応答に
ついてそれぞれ試験した。暗所における２４℃での４週間のインキュベーションの後、各
ＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）濃度での体細胞胚発生カルス（ＳＥＣ）形成量を記録した
。結果は、品種Ｂｏｂｗｈｉｔｅ ＭＰＢ２６ＲＨのＳＥＣ形成が、非処理の試料と比較
して、１００ｎＭ ＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）で約７０％低下することを示した。品
種Ｃｌｅａｒｆｉｅｌｄ Ｊａｎｚ遺伝子型のカルス形成は、非処理の対照と比較して、
試験した全てのＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）濃度で影響を受けなかった。
ＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）に対する、植物再生段階でのドナー小麦系統品種Ｂｏｂ
ｗｈｉｔｅ ＭＰＢ２６ＲＨの基礎的耐性を、以下のように判定した：ドナー小麦系統か
らの未熟な接合子胚の胚盤を、先に記載したように単離して、ＣＩＭ培地を含有する１０
ｃｍ ＰＥＴＲＩ（商標）皿内に置いた。体細胞胚発生カルスを、暗所において２４℃で
４週間インキュベートすることによって形成させた。ＳＥＣを、０、１００、２００、３
００、４００、５００および１０００ｎＭ ＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）をそれぞれ補
ったＤＲＭ培地を含有する１０ｃｍ ＰＥＴＲＩ（商標）皿に移した。２０のＣＩＭを各
ＰＥＴＲＩ（商標）皿内に置いた。合計６０のＣＩＭを、各ＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標
）濃度にて、基礎的耐性応答について試験した。育生室における１６／８（明／暗）時間
の光周期下での２４℃にて２週間のインキュベーション後、再生応答を記録した。結果は
、植物再生が、非処理の試料と比較して、２００ｎＭ ＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）で
約８０％低下することを示した。
ＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）に対する、植物再生段階での品種Ｃｌｅａｒｆｉｅｌｄ
Ｊａｎｚ（Ｓ６５３／Ｓ６５３）遺伝子型の基礎的耐性および品種Ｃｌｅａｒｆｉｅｌ
ｄ Ｊａｎｚ（Ｎ６５３／Ｎ６５３）遺伝子型の基礎的抵抗性を、改変アプローチを用い
て判定した。これは、品種Ｃｌｅａｒｆｉｅｌｄ Ｊａｎｚの組織培養における植物再生
応答が不十分（即ち、胚形成が不十分）であることを観察したためである。各品種Ｃｌｅ
ａｒｆｉｅｌｄ Ｊａｎｚ遺伝子型用の種子を、小麦葉肉プロトプラストを産生するため
に先に記載した無菌的アプローチを用いて、発芽させた。発芽した実生を、増殖培地上で
継代培養することによってｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖させた。増殖後、各遺伝子型の植物を、
０、１００、３００、６００、９００、１２００、１５００および３０００ｎＭ ＩＭＡ
ＺＡＭＯＸ（登録商標）をそれぞれ補った植物成長培地（ＭＳ＋１０μＭ ＢＡ＋０．８
％アガー）を含有する１０ｃｍ ＰＥＴＲＩ（商標）皿に移した。１０の植物を、各ＰＥ
ＴＲＩ（商標）皿内に置いた。各ＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）濃度での基礎的応答につ
いて、遺伝子型あたり合計３０の植物を試験した。育生室における１６／８（明／暗）時
間の光周期下での２４℃にて３週間のインキュベーション後、成長応答を記録した。結果
は、品種Ｃｌｅａｒｆｉｅｌｄ Ｊａｎｚ（Ｓ６５３／Ｓ６５３）遺伝子型の植物成長が
、非処理の試料と比較して、少なくとも２００ｎＭ ＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）を含
有する培地において激しく低下することを示した。この応答は、品種Ｂｏｂｗｈｉｔｅ
ＭＰＢ２６ＲＨ（Ｓ６５３／Ｓ６５３）遺伝子型について観察された応答と類似した。対
照的に、品種Ｃｌｅａｒｆｉｅｌｄ Ｊａｎｚ（Ｎ６５３／Ｎ６５３）遺伝子型の植物成
長は、非処理の試料と比較して、ＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）濃度が２，０００ｎＭを
超えるまで、強く抑制されなかった。
ＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）に対する、植物発根段階でのドナー小麦系統品種Ｂｏｂ
ｗｈｉｔｅ ＭＰＢ２６ＲＨの基礎的耐性を、以下のように判定した：ドナー小麦系統由
来の未熟な接合子胚の胚盤を、先に記載したように単離して、ＣＩＭ培地を含有する１０
ｃｍ ＰＥＴＲＩ（商標）皿内に置いた。体細胞胚発生カルスを、暗所において２４℃に
て４週間インキュベートすることによって形成させた。ＳＥＣを、ＤＲＭ培地を含有する
１０ｃｍ ＰＥＴＲＩ（商標）皿に移して、１６／８（明／暗）時間の光周期下で２４℃
にて２週間インキュベートすることによって、植物再生を起こさせた。再生植物を、０、
１００、２００、３００、４００、５００ｎＭ ＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）をそれぞ
れ補ったＲＭ培地を含有する１０ｃｍ ＰＥＴＲＩ（商標）皿に移した。２０の再生植物
を、各ＰＥＴＲＩ（商標）皿内に置いた。各ＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）濃度での基礎
的耐性応答について、合計６０の再生植物を試験した。育生室における１６／８（明／暗
）時間の光周期下での２４℃にて３週間のインキュベーション後、根形成応答を記録した
。結果は、根形成が、非処理の試料と比較して、試験したＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）
の全ての濃度で激しく制限されていることを示した。
ＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）に対する、植物発根段階での品種Ｃｌｅａｒｆｉｅｌｄ
Ｊａｎｚ（Ｓ６５３／Ｓ６５３）遺伝子型の基礎的耐性および品種Ｃｌｅａｒｆｉｅｌ
ｄ Ｊａｎｚ（Ｎ６５３／Ｎ６５３）遺伝子型の基礎的抵抗性を、改変アプローチを用い
て判定した。これは、品種Ｃｌｅａｒｆｉｅｌｄ Ｊａｎｚの組織培養における植物再生
応答が不十分（即ち、胚形成が不十分）であることを観察したためである。各品種Ｃｌｅ
ａｒｆｉｅｌｄ Ｊａｎｚ遺伝子型用の種子を、小麦葉肉プロトプラストを産生するため
に先に記載した無菌的アプローチを用いて、発芽させた。発芽した実生を、増殖培地上で
継代培養することによってｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖させた。増殖後、各遺伝子型の植物を、
０、５０、１００、２００および２５０ｎＭ ＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）をそれぞれ
補った植物発根培地（１／２ ＭＳ、０．５ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ、０．８％アガー）を含有
する１０ｃｍ ＰＥＴＲＩ（商標）皿に移した。３つの植物を、各ＰＥＴＲＩ（商標）皿
内に置いた。各ＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）濃度での基礎的応答について、遺伝子型あ
たり合計６の植物を試験した。育生室における１６／８（明／暗）時間の光周期下での２
４℃にて２週間のインキュベーション後、根形成応答を記録した。
結果は、品種Ｃｌｅａｒｆｉｅｌｄ Ｊａｎｚ（Ｎ６５３／Ｎ６５３）遺伝子型の根形
成が、非処理の試料と比較して、２５０ｎＭ ＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）で制限され
ることを示した。根形成は、非処理の試料と比較して、品種Ｃｌｅａｒｆｉｅｌｄ Ｊａ
ｎｚ（Ｓ６５３／Ｓ６５３）遺伝子型において、試験したＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）
の全ての濃度で激しく制限された。
ＺＦＮ媒介ＮＨＥＪ指向性のＡＨＡＳ遺伝子編集のためのドナーＤＮＡの設計および合成
小麦における内因性ＡＨＡＳ遺伝子での正確なＺＦＮ媒介ＮＨＥＪ指向性の遺伝子編集
を促進するためのドナーＤＮＡ分子の２つのタイプを設計した。双方のドナー設計は、イ
ミダゾリノンクラスの除草剤に対する耐性をもたらすことが知られているＳ６５３Ｎ変異
（Li et al., (2008) Molecular Breeding 22:217-225）の導入を可能とした。
第１の設計は、ＺＦＮ ２９７３２および２９７３０（プラスミドｐＤＡＢ１０９３５
０上にコードされる）による内因性ＡＨＡＳ遺伝子の同祖コピーの切断によって生じる二
本鎖ＤＮＡ切断位置での９５ｂｐ二本鎖ドナー分子の組み込みに基づいた。ドナーＤＮＡ
分子、ｐＤＡＳ０００２６７（配列番号８４および配列番号８５）は、組み込みドナーポ
リヌクレオチドの２つの部分を含んだ。５’末端は、Ｄゲノム内にコードされる内因性Ａ
ＨＡＳ遺伝子とほとんど同一の配列を含み、標的ＺＦＮ切断部位から始まって、ＡＨＡＳ
停止コドンで終わった。６つの意図的な変異を、この配列中に導入した：２つの変異がＳ
６５３Ｎ変異（ＡＧＣ→ＡＡＴ）をコードし、４つの変異が同義であった（サイレント変
異をドナー配列中に組み入れた）。ドナー分子の３’末端は、事象を編集するＺＦＮ媒介
ＮＨＥＪ指向性遺伝子を検出する診断ＰＣＲに用いることができる固有の配列を含有した
。５’および３’突出末端がライゲーション突出を提供して、ＺＦＮ媒介ＮＨＥＪ指向性
のＤＮＡ修復を促進するように、ドナー分子を設計した。
第２の設計は、一対のＺＦＮ標的部位間に位置する内因性ＡＨＡＳ配列の、７９ｂｐ二
本鎖ドナー分子との置換に基づいた。具体的には、ドナーは、ＺＦＮ ２９７３２および
２９７３０（プラスミドｐＤＡＢ１０９３５０上にコードされる）ならびにＺＦＮ ３０
０１２および３００１８（プラスミドｐＤＡＢ１０９３６０上にコードされる）によって
ＡＨＡＳ遺伝子の同祖コピーの二重切断直後にクロマチンから解放される内因性ＡＨＡＳ
配列を置換するように設計した。ドナー分子、ｐＤＡＳ０００２６８（配列番号８６およ
び配列番号８７）は、Ｄゲノム内にコードされる内因性ＡＨＡＳ遺伝子とほとんど同一の
配列を含み、ＺＦＮ ２９７３２および２９７３０の切断部位から始まって、ＺＦＮ ３
００１２および３００１８の切断部位で終わった。１０の意図的な変異を、この配列中に
導入した。６つの変異がドナーの５’末端に位置した：２つの変異がＳ６５３Ｎ変異（Ａ
ＧＣ→ＡＡＴ）をコードし、４つの変異が同義であった。４つの変異が、ドナーの３’末
端に位置し、かつ非コード配列内に位置した。５’および３’突出末端がライゲーション
突出を提供して、ＺＦＮ媒介ＮＨＥＪ指向性のＤＮＡ修復を促進するように、ドナー分子
を設計した。
標準的なホスホラミダイト化学を用いて、二本鎖ＤＮＡドナー分子を合成的に合成した
（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。各ドナー分子について
、一対の相補的な一本鎖ＤＮＡオリゴマーを合成し、それぞれ５’末端に２つのホスホロ
チオエート連結を付けて、ｉｎ ｐｌａｎｔａエンドヌクレアーゼ分解に対する保護を提
供した。一本鎖ＤＮＡオリゴマーを、高速液体クロマトグラフィーによって精製して全長
分子について濃縮し、かつ合成工程由来の化学的キャリーオーバーからＮａ＋交換を用い
て精製した。二本鎖ドナー分子を、当業者によって一般的に知られている標準的な方法を
用いて、２つの相補的な一本鎖ＤＮＡオリゴマーの等モル量をアニーリングすることによ
って、形成した。コムギ（Triticum aestivum）への送達前に、二本鎖ＤＮＡ分子を滅菌
水中で、必要とされる濃度に希釈した。
ＡＨＡＳ（Ｓ６５３Ｎ）をコードするバイナリーベクターの設計および産生
標準的なクローニング法を、バイナリーベクター、ｐＤＡＳ０００１４３（配列番号８
８）（図１０）の構築に用いた。ＡＨＡＳ（Ｓ６５３Ｎ）遺伝子発現カセットは、トウモ
ロコシ（Zea mays）由来のユビキチン（Ｕｂｉ）遺伝子由来のプロモーター、５’非翻訳
領域およびイントロン（Toki et al., (1992) Plant Physiology 100; 1503-07）に続く
、塩基対１８８０および１１８１がＣＧからＡＴに変異して、アミノ酸残基６５３にてセ
リン（Ｓ）からアスパラギン（aspargine）（Ｎ）へのアミノ酸変化を誘導する、コムギ
（T. aestivum）由来のＡＨＡＳ遺伝子のコード配列（１９３５ｂｐ）からなる。ＡＨＡ
Ｓ発現カセットは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（A. tumefaciens）ｐＴｉ１
５９５５由来のノパリンシンターゼ遺伝子（ｎｏｓ）の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含ん
だ（Fraley et al.,(1983) Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A.
80(15); 4803-4807）。選択カセットは、イネ（Oryza sativa）由来のアクチン１（Ａｃ
ｔ１）遺伝子由来のプロモーター、５’非翻訳領域およびイントロン（McElroy et al.,
(1990) The Plant Cell 2(2); 163-171）に続く、フォスフィノスリシン、グルフォシネ
ート（glufosinate）およびビアラホスを含むグルタミンシンターゼの阻害剤に対する抵
抗性をもたらすタンパク質をコードする、ストレプトミセス・ビリドクロモゲネス（Stre
ptomyces viridochromogenes）から単離したフォスフィノスリシンアセチルトランスフェ
ラーゼ（ＰＡＴ）遺伝子の植物最適化合成バージョン（Wohlleben et al., (1988) Gene
70(1); 25-37）から構成された。このカセットは、カリフラワーモザイクウイルス（Ｃａ
ＭＶ）（Chenault et al., (1993) Plant Physiology 101 (4); 1395-1396）の３５Ｓ遺
伝子由来の３’ＵＴＲで終結した。
選択カセットを、商業的遺伝子合成業者（ＧｅｎｅＡｒｔ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｉｅｓ）が合成して、トウモロコシ（Zea mays）由来のユビキチン（Ｕｂｉ）遺伝子
と、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（A. tumefaciens）ｐＴｉ１５９５５由来の
ノパリンシンターゼ遺伝子（ｎｏｓ）の転写ターミネータおよびポリアデニル化部位を含
む３’非翻訳領域（ＵＴＲ）との間にＲｆＡ Ｇａｔｅｗａｙカセットが位置するＧａｔ
ｅｗａｙ対応バイナリーベクター中にクローニングした。ＡＨＡＳ（Ｓ６５３Ｎ）コード
配列を、隣接するａｔｔＢ部位により増幅して、ｐＤＯＮＲ２２１中にサブクローニング
した。生じたＥＮＴＲＹクローンを、フォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ
（ＰＡＴ）発現カセットをコードするＧａｔｅｗａｙ対応バイナリーベクターによるＬＲ
ＣＬＯＮＡＳＥ ＩＩ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｉｅｓ）反応に用いた。全てのライゲーション反応により形質転換した大腸菌（E. col
i）細胞のコロニーを最初に、ミニプレップＤＮＡの制限消化によってスクリーニングし
た。制限エンドヌクレアーゼを、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓおよびＰｒｏ
ｍｅｇａから得た。プラスミドの調製を、ＱＩＡＰＲＥＰ ＳＰＩＮ ＭＩＮＩＰＲＥＰ
ＫＩＴ（商標）またはＰＵＲＥ ＹＩＥＬＤ ＰＬＡＳＭＩＤ ＭＡＸＩＰＲＥＰ Ｓ
ＹＳＴＥＭ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＷＩ）を用いて、製造
業者の説明書に従って実行した。選択したクローンのプラスミドＤＮＡを、ＡＢＩ Ｓａ
ｎｇｅｒ ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇおよびＢＩＧ ＤＹＥ ＴＥＲＭＩＮＡＴＯＲ ｖ３．
１（商標）サイクル配列決定プロトコール（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌ
ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて配列決定した。配列データを、ＳＥＱＵＥ
ＮＣＨＥＲ（商標）ソフトウェア（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａ
ｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を用いてアセンブルし、かつ分析した。
ＡＨＡＳ編集小麦植物を生じさせる微粒子銃媒介形質転換系
ドナー小麦系統品種Ｂｏｂｗｈｉｔｅ ＭＰＢ２６ＲＨからの未熟な接合子胚の約２３
，０００個の胚盤を、先に記載したように、微粒子銃媒介ＤＮＡ送達用に調製した。ＤＮ
Ａコーティングした金粒子を、以下の配合により、先に記載したように調製した。ｐＤＡ
Ｓ０００２６７を用いて実行するトランスフェクションのために、ドナーＤＮＡを、ｐＤ
ＡＢ１０９３５０（ＺＦＮ ２９７３２および２９７３０をコードしている）用のプラス
ミドＤＮＡと５：１のモル比で混合した。ｐＤＡＳ０００２６８を用いて実行するトラン
スフェクションのために、ドナーＤＮＡを、ｐＤＡＢ１０９３５０（ＺＦＮ ２９７３２
および２９７３０をコードしている）およびｐＤＡＢ１０９３６０（ＺＦＮ ３００１２
および３００１８をコードしている）用のプラスミドＤＮＡと１０：１：１のモル比で混
合した。ｐＤＡＳ０００１４３を用いて実行するトランスフェクションは、ｐＤＡＳ００
０１４３用のプラスミドＤＮＡのみでコーティングした金粒子を用いて実行した。
微粒子銃媒介トランスフェクションを、先に記載したように実行した。合計１５，６２
０個の胚盤を、ｐＤＡＳ０００２６７を含有するＤＮＡでコーティングした金粒子で照射
し、合計７，３１０個の胚盤を、ｐＤＡＳ０００２６８を含有するＤＮＡでコーティング
した金粒子で照射し、そして合計２，１２０個の胚盤を、ｐＤＡＳ０００１４３でコーテ
ィングした金粒子で照射した。照射後、トランスフェクトした胚盤を、暗所で２６℃にて
１６時間インキュベートしてから、カルス誘導培地上に移した。
ＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）に基づく４つの異なる化学的選択戦略を用いて、ＺＦＮ
媒介ＮＨＥＪ指向性の遺伝子編集によって内因性ＡＨＡＳ遺伝子の１つまたは複数の同祖
コピー中に正確に組み込まれたＳ６５３Ｎ変異を有する再生小麦植物を濃縮した。４つの
化学的選択戦略を、表９に記載する。各戦略について、胚盤を暗所において２４℃にて２
週間、カルス誘導培地上で培養した。生じたカルスを、新鮮なカルス誘導培地上に一度継
代培養して、さらに２週間同じ条件で維持した。体細胞胚発生カルス（ＳＥＣ）を植物再
生培地上に移して、育生室における１６／８（明／暗）時間の光周期下で２４℃にて２週
間培養した。再生した小植物を発根培地上に移して、同じ条件下２〜３週間培養した。Ｓ
６５３Ｎ変異を有する再生植物の選択についてのストリンジェンシーを増大させるために
、再生植物の根を取り除いて、植物を発根培地上で同じ条件下でもう一度継代培養した。
二度目の発根小植物を土に移して、温室封じ込め条件下で育生した。他殖を防止するため
に個々の穂を袋に入れてから、Ｔ１種子を個々の植物から収穫した。
ｐＤＡＳ０００１４３でコーティングした金粒子で照射した胚盤外植片を用いて、ＡＨ
ＡＳ Ｓ６５３Ｎ変異を乗せている小麦植物を再生させる４つの化学的選択戦略の全体に
わたって、選択ストリンジェンシーをモニターした。ｐＤＡＳ０００１４３で形質転換し
た植物を、先に記載したプロセスを用いて再生させた。
Figure 0006886433
全体として、１４の推定ＺＦＮ媒介ＮＨＥＪ指向性ＡＨＡＳ編集小麦植物を、ドナー小
麦系統品種Ｂｏｂｗｈｉｔｅ ＭＰＢ２６ＲＨ由来の未熟な接合子胚の２２，９３０個の
胚盤のトランスフェクションから回復させた。推定編集植物を、ｐＤＡＳ０００２６７を
含有するＤＮＡでコーティングした金粒子で照射した胚盤についての４つ全ての選択戦略
から得た。２つの推定編集植物を、ｐＤＡＳ０００２６８を含有するＤＮＡでコーティン
グした金粒子で照射した胚盤についての第２の選択戦略から得た。ＡＨＡＳ（Ｓ６５３Ｎ
）ドナーポリヌクレオチドの少なくとも１つの無作為に組み込まれたコピーを乗せている
合計１２９の推定形質転換小麦植物を、４つの化学的選択戦略の全体にわたって回復させ
た。
編集した小麦植物の分子特徴付け
Ｓ６５３Ｎ変異をコードするドナーポリヌクレオチドによる照射に由来する小麦植物を
得て、ゲノム二本鎖切断部位でのドナー組み込みの結果として起こったＳ６５３Ｎ変異の
組み込みを含む小麦サブゲノムを同定するように分子的に特徴付けた。２つの一連の照射
を完了した。実験の第１のセットをｐＤＡＳ０００１４３で完了し、そして実験の第２の
セットをｐＤＡＳ０００２６７およびｐＤＡＳ０００２６８で完了した。個々の小麦植物
を、実験の両セットから得て、分子学的方法を介してアッセイして、Ｓ６５３Ｎ変異をコ
ードするＡＨＡＳドナーポリヌクレオチドの組み込みコピーを含有する植物を同定した。
定量ＰＣＲ分析のための加水分解プローブアッセイ（ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ベース
のアッセイに類似）を用いて、ｐＤＡＳ０００１４３で照射した回復小麦植物が、Ｓ６５
３Ｎ変異をコードするＡＨＡＳドナーポリヌクレオチドの少なくとも１つの無作為に組み
込まれたコピーを乗せていることを確かめた。サンガー配列分析を介した確認により、ｐ
ＤＡＳ０００２６７およびｐＤＡＳ０００２６８により実行した照射から回復させた小麦
植物が、ＺＦＮ媒介ＮＨＥＪ指向性の遺伝子編集について予想される位置にて、ＡＨＡＳ
遺伝子の同祖コピーの少なくとも１つにおけるＳ６５３Ｎドナーポリヌクレオチドを含む
ことが示された。
再生小麦植物からのゲノムＤＮＡの単離
ゲノムＤＮＡを、各再生小麦植物から収穫した凍結乾燥葉組織から抽出した。新鮮な収
穫葉組織を、液体窒素内で急速凍結して、ＬＡＢＣＯＮＣＯ ＦＲＥＥＺＯＮＥ ４．５
（登録商標）（Ｌａｂｃｏｎｃｏ、Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ、ＭＯ）内で−４０℃の１３
３×１０−３ｍＢａｒ圧力にて２４時間凍結乾燥させた。凍結乾燥した材料を、ＤＮＥＡ
ＳＹ（登録商標）ＰＬＡＮＴ ＤＮＡ ＥＸＴＲＡＣＴＩＯＮ ＭＩＮＩ ＫＩＴ（商標
）（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造業者の説明書に従って、ＤＮＡ抽出にかけた。
Ｓ６５３Ｎ変異をコードするＡＨＡＳドナーポリヌクレオチドの無作為な組み込みを確か
めるＰＣＲアッセイ
ｐＤＡＳ０００１４３により実行した照射由来の再生小麦植物が、Ｓ６５３Ｎ変異をコ
ードするＡＨＡＳドナーポリヌクレオチドの少なくとも１つの無作為に組み込まれたコピ
ーを乗せていることを確かめるために、二重加水分解プローブｑＰＣＲアッセイ（ＴＡＱ
ＭＡＮ（登録商標）に類似）を用いて、内因性の単一コピー遺伝子、ピュロインドリン−
ｂ（Ｐｉｎｂ）を、六倍体小麦のＤゲノムから（Gautier et al., (2000) Plant Science
153, 81-91；フォワードプライマー、リバースプライマー、およびプローブ配列につい
て、それぞれ配列番号８９、配列番号９０および配列番号９１）、そしてｐＤＡＳ０００
１４３上に存在するアクチン（Ａｃｔ１）プロモーターの領域を（フォワードプライマー
、リバースプライマー、およびプローブ配列について、それぞれ配列番号９２、配列番号
９３および配列番号９４）増幅した。加水分解プローブｑＰＣＲアッセイを、４つの化学
的選択戦略のそれぞれから回復させた２４の無作為に選択した小麦植物に実行した。ｐＤ
ＡＳ００１４３の存在および推定コピー数の評価を、Livak and Schmittgen (2001) Meth
ods 25(4): 402-8に記載される方法に従って実行した。
結果から、Ｓ６５３Ｎ変異をコードするＡＨＡＳドナーポリヌクレオチドの少なくとも
１つのコピーの、試験した各小麦植物のゲノム中への組み込みの決定的証拠が得られた。
これらの結果は、４つの化学的選択戦略が、Ｓ６５３Ｎ変異を発現する植物の回復につい
てのストリンジェントな選択を提供することを示している。
ゲノムＤＮＡのＺＦＮ媒介ＡＨＡＳ編集についてのＰＣＲアッセイ
回復小麦植物におけるＺＦＮ媒介ＮＨＥＪ指向性の遺伝子編集のサブゲノム位置および
結果を特徴付けるために、プライマーＡＨＡＳ＿３Ｆ１およびＡＨＡＳ＿３Ｒ１（配列番
号９５および配列番号９６）によるＰＣＲを用いて、ＡＨＡＳ遺伝子の同祖コピーから標
的領域を増幅した。生じたＰＣＲ産物を、プラスミドベクター中にクローニングして、Ａ
ＢＩ３７３０ＸＬ（登録商標）オートメーション化キャピラリ電気泳動プラットホームで
のＢＩＧＤＹＥ（登録商標）ｖ３．１ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ）を用いてサンガー配列決定した。最大１２０の独立したプラスミドクロー
ンのサンガー配列決定を実行して、同祖内因性ＡＨＡＳの各対立遺伝子の配列決定を確か
めた。ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ ＳＯＦＴＷＡＲＥ（商標）を用いて実行した配列分析を用
いて、各回復小麦植物におけるＡＨＡＳ遺伝子の３つの同祖コピーの各対立遺伝子につい
てのコンセンサス配列を生じさせ、かつ各編集対立遺伝子についてのサブゲノム起源およ
び配列を決定した。
結果から、内因性ＡＨＡＳ遺伝子座での正確なＺＦＮ媒介ＮＨＥＪ指向性の遺伝子編集
の決定的証拠が、ｐＤＡＢ１０９３５０およびｐＤＡＳ０００２６７を用いて形質転換し
た１２の回復小麦植物の内の１１について（表１０）、そしてｐＤＡＢ１０９３５０、ｐ
ＤＡＢ１０９３６０およびｐＤＡＳ０００２６８を用いて形質転換した回復小麦植物の双
方について（表１１）、実証された。以下を含む編集結果の範囲を有する植物が観察され
た：（１）完全なサブゲノム特異的対立遺伝子編集を有する独立した事象；（２）Ａゲノ
ム、ＢゲノムおよびＤゲノムにおける単一の完全な編集を有する事象；（３）複数のサブ
ゲノムにおける同時編集を有する事象；ならびに（４）ヘミ接合およびホモ接合のサブゲ
ノム特異的対立遺伝子編集を実証する事象。最初に開示するのが、小麦植物の３つ全ての
ゲノム内の遺伝子座を変異させるために利用され得る方法である。Ｓ６５３Ｎ変異をコー
ドする組み込みＡＨＡＳドナーポリヌクレオチドを含む小麦植物を例示する；ポリヌクレ
オチド配列の組み込みにより、イミダゾリノンクラスの除草剤に対する耐性が提供される
。小麦における内因性遺伝子座でのＺＦＮ媒介ゲノム編集の利用により、戻し交配を必要
とする時間浪費の小麦育種技術も、形質を３つ全てのサブゲノム中に浸透させるのに必要
な時間量を増大させ得る浸透交雑工程も伴わない（変異を介した）農学形質の導入が可能
となる。編集小麦植物の各サブゲノム内に存在する対立遺伝子についてのコンセンサスサ
ンガー配列を、表１０および表１１における配列番号９７〜配列番号１８０として提供す
る。
Figure 0006886433
Figure 0006886433
Figure 0006886433
Ｐ１９７アミノ酸残基をコードするＡＨＡＳ遺伝子内の領域に特異的なジンクフィンガー
結合ドメインの設計
ＡＨＡＳ遺伝子の同祖コピーのＤＮＡ配列に対するジンクフィンガータンパク質を、以
前に記載されたように設計した（実施例２も参照）。例示的な標的配列および認識ヘリッ
クスを、表１２（認識ヘリックス領域設計）および表１３（標的部位）に示す。表１３に
おいて、ＺＦＰ認識ヘリックスが接触する標的部位のヌクレオチドを大文字で示す；非接
触ヌクレオチドを小文字で示す。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）標的部位は、
プロリン１９７（Ｐ１９７）アミノ酸残基をコードするＡＨＡＳ遺伝子中の領域の上流（
２から５１０ヌクレオチド上流）にあった。
Figure 0006886433
Figure 0006886433
ＡＨＡＳジンクフィンガー設計を、実施例２に記載したように、ジンクフィンガー発現
ベクター中に組み入れて、発芽酵母系を用いて切断活性について確認した。設計し、産生
し、かつ、推定のＡＨＡＳゲノムポリヌクレオチド標的部位に結合することを試験した多
数のＺＦＮの内、１４のＺＦＮが高レベルのｉｎ ｖｉｖｏ活性を有すると同定し、さら
なる実験のために選択した。１４全てのＺＦＮを、３つの同祖ＡＨＡＳに結合するように
設計し、そして固有のＡＨＡＳゲノムポリヌクレオチド標的部位にｉｎ ｐｌａｎｔａで
効率的に結合し、かつこれを切断することができると特徴付けた。
一過性アッセイを用いた、ＡＨＡＳ遺伝子のジンクフィンガーヌクレアーゼ切断の評価
ＺＦＮ構築物アセンブリ
酵母系を用いて切断活性について確認したＺＦＮ発現構築物を含有するプラスミドベク
ター（実施例７に記載した）を、実施例３において先に記載したように設計して完成させ
た。生じた１４のプラスミド構築物：ｐＤＡＢ１１１８５０（ＺＦＮ ３４４５６−２Ａ
−３４４５７）、ｐＤＡＢ１１１８５１（ＺＦＮ ３４４５８−２Ａ−３４４５９）、ｐ
ＤＡＢ１１１８５２（ＺＦＮ ３４４６０−２Ａ−３４４６１）、ｐＤＡＢ１１１８５３
（ＺＦＮ ３４４６２−２Ａ−３４４６３）、ｐＤＡＢ１１１８５４（ＺＦＮ ３４４６
４−２Ａ−３４４６５）、ｐＤＡＢ１１１８５５（ＺＦＮ ３４４７０−２Ａ−３４４７
１）、ｐＤＡＢ１１１８５６（ＺＦＮ ３４４７２−２Ａ−３４４７３）、ｐＤＡＢ１１
１８５７（ＺＦＮ ３４４７４−２Ａ−３４４７５）、ｐＤＡＢ１１１８５８（ＺＦＮ
３４４７６−２Ａ−３４４７７）、ｐＤＡＢ１１１８５９（ＺＦＮ ３４４７８−２Ａ−
３４４７９）、ｐＤＡＢ１１１８６０（ＺＦＮ ３４４８０−２Ａ−３４４８１）、ｐＤ
ＡＢ１１１８６１（ＺＦＮ ３４４８２−２Ａ−３４４８３）、ｐＤＡＢ１１１８６２（
ＺＦＮ ３４４８４−２Ａ−３４４８５）およびｐＤＡＢ１１１８６３（ＺＦＮ ３４４
８６−２Ａ−３４４８７）は、制限酵素消化を介して、かつＤＮＡ配列決定を介して確か
めた。
ＺＦＮ構築物からのトランスフェクション用ＤＮＡの調製
コムギ（Triticum aestivum）プロトプラストへの送達の前に、各ＺＦＮ構築物のプラ
スミドＤＮＡを、ＰＵＲＥ ＹＩＥＬＤ ＰＬＡＳＭＩＤ ＭＡＸＩＰＲＥＰ ＳＹＳＴ
ＥＭ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）
またはＰＬＡＳＭＩＤ ＭＡＸＩ ＫＩＴ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉ
ａ、ＣＡ）を用いて、供給業者の説明書に従って、大腸菌（E. coli）の培養物から調製
した。
小麦葉肉プロトプラストの単離およびトランスフェクション
ドナー小麦系統品種Ｂｏｂｗｈｉｔｅ ＭＰＢ２６ＲＨ由来の葉肉プロトプラストを、
実施例３において先に記載したように調製して、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）媒介
ＤＮＡ送達を用いてトランスフェクトした。
プロトプラストゲノムＤＮＡのＺＦＮ配列切断についてのＰＣＲアッセイ
実施例３において前記したように、ゲノムＤＮＡを、トランスフェクトしたプロトプラ
ストから単離し、かつＰＣＲアッセイに用いて、Ｐ１９７をコードするＡＨＡＳ遺伝子の
領域に対して設計したＺＦＮの切断効率および標的部位特異性を評価した。星印［＊］に
よって示すホスホロチオエート連結を含有するＰＣＲプライマーの５セットを用いて、Ｚ
ＦＮ標的部位遺伝子座を増幅した（表１４）。各プライマーセットを、実施例３において
先に記載した基準に従って設計した。
Figure 0006886433
標的ＺＦＮ部位のＮＨＥＪを検出するためのデータ分析
トランスフェクトした葉肉プロトプラストについて調製した試料ライブラリーのＩｌｌ
ｕｍｉｎａショートリード配列データの生成後、バイオインフォマティクス分析（実施例
３において先に記載した）を実行して、標的ＺＦＮ部位にて欠失したヌクレオチドを同定
した。そのような欠失は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復に由来するｉｎ ｐｌ
ａｎｔａ ＺＦＮ活性の指標であることが知られている。
２つのアプローチを用いて、試験したＺＦＮの切断効率および特異性を評価した。切断
効率は、ＺＦＮ標的部位でのＮＨＥＪ欠失を含有する、サブゲノムに割り当てられた配列
の割合として表した（リードの百万分の一部）（表１５）。それらの観察された切断効率
によるＺＦＮのランク順位を用いて、ＡＨＡＳ遺伝子の標的領域についてサブゲノム特異
的な最も良い切断活性を有するＺＦＮを同定した。試験した全てのＺＦＮは、ｉｎ ｐｌ
ａｎｔａ ＺＦＮ活性について予想されるのと合致するＮＨＥＪ欠失サイズ分布を示した
。切断特異性は、３つのサブゲノムの全体にわたって観察される切断効率の比率として表
した。
Figure 0006886433
これらの結果から、３つの小麦サブゲノムのそれぞれにおける重要なゲノムＤＮＡ切断
活性の特徴を考えると、プラスミドｐＤＡＢ１１１８５５（３４４７０−２Ａ−３４４７
１）、ｐＤＡＢ１１１８５６（３４４７２−２Ａ−３４４７３）およびｐＤＡＢ１１１８
５７（３４４７４−２Ａ−３４４７５）上にコードされるＺＦＮを、以降の実験における
ｉｎ ｐｌａｎｔａ標的用に選択した。
正確なゲノム改変の特異的な組合せを有する植物を回復させるための人工交雑および分子
分析
ドナーＤＮＡおよびジンクフィンガーヌクレアーゼ構築物による形質転換を介してもた
らされる小麦事象により、ドナー分子配列の、標的内因性遺伝子座の１つまたは複数のコ
ピーでの組み込みがもたらされる。実施例６において先に示すように、ＺＦＮ媒介ゲノム
改変により、複数のサブゲノムの全体にわたる複数の対立遺伝子の同時編集が達成される
。形質転換事象の人工交雑を続いて用いて、正確なゲノム改変の特異的な組合せについて
選択することができる。例えば、Ｓ６５３Ｎ変異によりＡＨＡＳ遺伝子を正確に改変した
、実施例５においてもたらされた形質転換事象の人工交雑を用いて、特異的なサブゲノム
において、複数のサブゲノムの任意の組合せにおいて、または３つ全てのサブゲノムにお
いて、Ｓ６５３Ｎ変異を有する小麦植物を産生することができる。
同様に、標的内因性遺伝子座の複数のコピーにゲノム改変を有する形質転換事象の自家
受粉を続いて用いて、特異的なサブゲノムにのみＳ６５３Ｎ変異を有する小麦事象をもた
らすことができる。形質転換事象の以降の自家受粉が、標的内因性遺伝子座の１つまたは
複数のコピーでの不完全な編集等の不所望のゲノム改変を事象から取り除くのに、特に有
用である。
先に記載したような分子アッセイおよび表現型アッセイを用いて、形質転換事象の人工
交雑および自家受粉に由来する後代において特異的ゲノム改変の遺伝を追跡することがで
きる。
小麦における正確なゲノム改変の遺伝および発現
実施例５においてもたらされた小麦形質転換事象によって乗せられたＳ６５３Ｎ変異が
もたらすＡＨＡＳ除草剤耐性表現型の安定した発現および遺伝を確認するために、３つの
小麦事象由来のＴ１種子を分子分析および表現型分析にかけた。３つの独立した小麦事象
はそれぞれ、Ａゲノム内に位置するＡＨＡＳ遺伝子中に組み込みＳ６５３Ｎ変異を乗せて
いた。
Ｔ１種子が、各Ｔ０事象の自家受粉に由来した。先に記載したように、種子を表面滅菌
して、滅菌種子を増殖培地上で継代培養することによってｉｎ ｖｉｔｒｏで発芽させた
。１６／８（明／暗）時間の光周期下での２４℃での育生の１０日後、発芽実生の根を取
り除いて、実生を２００ｎＭ ＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）（イミダゾリノン）を含有
する発根培地上に移した。実生を同じ条件下で２〜３週間インキュベートして、根の再生
の有無を記録した。先に記載したように、各実生から収穫した葉組織をＤＮＡ抽出に用い
て、プライマーＡＨＡＳ＿３Ｆ１およびＡＨＡＳ＿３Ｒ１（配列番号９５および配列番号
９６）を用いる、改変ＡＨＡＳ遺伝子の存在について試験するＰＣＲアッセイを完了した
。生じたＰＣＲ産物の、アガロースゲルでの電気泳動的分離を用いて、改変ＡＨＡＳ遺伝
子の存在を検出した。７５０ｂｐ断片ＰＣＲ産物の増幅だけが、改変ＡＨＡＳ遺伝子の不
在を示した。比較してみると、８５０ｂｐ断片の増幅だけが、ホモ接合状態の改変ＡＨＡ
Ｓ遺伝子の存在を示した。さらに、７５０ｂｐおよび８５０ｂｐの断片の増幅は、ヘミ接
合状態の改変ＡＨＡＳ遺伝子の存在を示した。
次に、カイ二乗検定を用いて、改変ＡＨＡＳ遺伝子の遺伝を単一の遺伝的ユニットとし
て確かめた。予想されるメンデル性遺伝を、３つの小麦形質転換事象のそれぞれについて
、Ｔ１世代で観察した。改変ＡＨＡＳ遺伝子は、Ｔ１実生において、優性マーカーをもた
らすＰＣＲ試験について予想される３：１の比率で分離した（表１６）。同様に、ＩＭＡ
ＺＡＭＯＸ（登録商標）耐性は、Ｔ１実生において、Ｓ６５３Ｎ変異によってもたらされ
る優性のＡＨＡＳ除草剤耐性表現型について予想通りの３：１の分離を示した（表１７）
。
Figure 0006886433
Figure 0006886433
改変ＡＨＡＳ遺伝子の発現安定性を、ＡＨＡＳ除草剤耐性表現型との対応によって確認
した。改変ＡＨＡＳ遺伝子の１つまたは複数のコピーの存在とＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商
標）耐性との間で完全な一致が観察された。
正確なゲノム改変の特異的組合せを有する植物を回復させるための自家受粉および人工交
雑
実施例５においてもたらされた小麦形質転換事象間の人工交雑を用いて、特異的なサブ
ゲノム上に、複数のサブゲノム上に、または３つ全てのサブゲノム上に、Ｓ６５３Ｎ変異
を有する小麦植物を生じさせることができる。
特異的なサブゲノム上にＳ６５３Ｎ変異を有するホモ接合性の小麦植物を生じさせるた
めに、実施例５由来の３つの小麦事象を自家授粉させて、Ｔ１種子を産生した。３つの事
象；ｍｂ１ｋ−７７８３−１−１、ｙｗ０６−７７６２−２−１およびｙｗ０６−７８３
４−１−１を選択して、それぞれＡゲノム、ＢゲノムおよびＤゲノム上にヘミ接合性ＡＨ
ＡＳゲノム改変を持たせた。各事象由来の約１５粒のＴ１種子を発芽させて、温室封じ込
め条件下で成長してＴ２種子を産生した。各Ｔ１植物から収穫した葉材料をＤＮＡ抽出に
用いて、改変ＡＨＡＳ遺伝子の接合性を判定するＰＣＲアッセイを完了した。このＰＣＲ
接合性試験は、ＺＦＮ ２９７３２および２９７３０（プラスミドｐＤＡＢ１９０３５０
上にコードされる）の結合部位を含有する領域内の内因性ＡＨＡＳ遺伝子の３つの同祖コ
ピーのそれぞれから断片を増幅し、かつゲノムヌクレオチド配列バリエーションを含むよ
うに設計した。生じたアンプリコンが、それが由来する小麦サブゲノムによるものと（配
列レベルで）明解に考えられ得るように、同祖ＡＨＡＳを区別するのに十分なゲノムヌク
レオチド配列バリエーションを含めた。プライマー対は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（商標）ＳＰ
１およびＳＰ２配列を５’末端に有するように合成して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（商標）の合
成による配列決定ケミストリーとの適合性を提供した。合成プライマーはまた、最後から
２番目の５’および３’ヌクレオチドにホスホロチオエート連結を含有した。５’ホスホ
ロチオエート連結は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（商標）ＳＰ１およびＳＰ２配列のエキソヌクレ
アーゼ分解に対する保護を与えた。同様に、３’ホスホロチオエート連結は、オン／オフ
ＰＣＲ（Yang et al., (2005) Biochem. Biophys. Res. Commun., Mar. 4: 328(1): 265-
72）を用いた標的ＡＨＡＳ配列の増幅について、ＰＣＲ特異性を向上させた。プライマー
対の配列を、表１８に提供する。
Figure 0006886433
先に記載したように、生じたＰＣＲアンプリコンをディープ配列決定用に調製し、そし
てＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳＥＱ（商標）機器上で配列決定して、製造業者の説明書に従
って２５０ｂｐの対末端配列リードを生成した。先に記載したように、生じた配列リード
をコンピュータ処理的に加工して、各リードを、それが由来した試料（バーコードインデ
ックスに基づく）およびサブゲノム（ＡＨＡＳ遺伝子の同祖コピーを識別するヌクレオチ
ドのバリエーションに基づく）に割り当て、かつ高い品質配列のみを以降の分析に用いる
ことを確実とするための品質フィルタリングを実行した。カスタム開発されたＰＥＲＬス
クリプトおよびＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ２０１０（商標）（Ｍｉｃｒｏｓｏｆ
ｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）におけるマニュアルデータ操作を用いて、データを加工し
、かつ各Ｔ１小麦事象における改変ＡＨＡＳ遺伝子の接合性を判定した。
内因性ＡＨＡＳ遺伝子座中へのｐＤＡＳ０００２６７の組み込みが、野生型（未改変）
対立遺伝子と、結果として生じたトランスジェニック（改変）対立遺伝子との間で９５ｂ
ｐのサイズ差異しかもたらさないので、ＰＣＲ接合性アッセイは、野生型ＡＨＡＳ遺伝子
および改変ＡＨＡＳ遺伝子の双方を増幅すると予想された。結果的に、標的ゲノム改変に
ついてホモ接合のＴ１植物は、改変ＡＨＡＳ遺伝子座のトランスジェニック対立遺伝子の
増幅に由来する配列リードのみを生成すると予想された。これらの対立遺伝子は、ｐＤＡ
Ｓ０００２６７におけるＡＨＡＳエクソン中に故意に導入した６つの変異によって、配列
レベルで区別できた（例えば、Ｓ６５３Ｎ変異をコードする２つの変異、およびＺＦＮ
２９７３２の結合部位の全体にわたって位置を定めた４つのコドン最適化同義変異は、組
み込みドナーの再切断を防止した）。標的ゲノム改変についてヘミ接合のＴ１植物は、改
変ＡＨＡＳ遺伝子座の野生型対立遺伝子およびトランスジェニック対立遺伝子の双方に由
来する配列リードを生成すると予想された。一方、改変ＡＨＡＳ遺伝子のないＴ１植物は
、改変ＡＨＡＳ遺伝子座の野生型対立遺伝子に由来する配列リードを生成するのみと予想
された。ＰＣＲ接合性試験に基づいて、Ａゲノム、ＢゲノムまたはＤゲノムのみにおける
Ｓ６５３Ｎ変異についてホモ接合のＴ１植物を同定した（表１９）。
Figure 0006886433
Figure 0006886433
当業者は、異なる小麦形質転換事象間の人工交雑の以降のラウンドを、記載したＰＣＲ
接合性試験と組み合わせて展開して、複数のサブゲノムの任意の組合せ（例えば、Ａゲノ
ムおよびＢゲノム、ＡゲノムおよびＤゲノム、またはＢゲノムおよびＤゲノム）の上に、
または３つ全てのサブゲノムの上にＳ６５３Ｎ変異を有するホモ接合性の小麦植物を産生
することができる。例えば、Ｔ１植物ｍｂ１ｋ−７７８３−１−４３（即ち、ａａＢＢＤ
Ｄ遺伝子型）の、Ｔ１植物ｙｗ０６−７７６２−２−２５（即ち、ＡＡｂｂＤＤ遺伝子型
）との人工交雑により、ＡゲノムおよびＢゲノムにおける改変ＡＨＡＳ遺伝子についてヘ
ミ接合であるＴ２種子が産生されることとなる；即ち、ＡａＢｂＤＤ遺伝子型である。Ｔ
２植物の以降の成長および自家受粉により、ＡゲノムおよびＢゲノム上の改変ＡＨＡＳ遺
伝子がホモ接合遺伝子型（即ち、ａａｂｂＤＤ遺伝子型）の分離Ｔ３種子が産生されるこ
ととなり、これは、記載したＰＣＲ接合性アッセイを用いて同定することができる。
小麦中の内因性ＡＨＡＳ遺伝子座での逐次、外因性導入遺伝子スタッキングのための形
質転換系の開発
小麦中の内因性ＡＨＡＳ遺伝子遺伝子座を、同じ遺伝子位置に的確に位置付けられた１
つまたは複数の導入遺伝子を有する植物を生成するためのＺＦＮ媒介、外因性形質転換系
を開発するためのモデル遺伝子座として選択した。形質転換系は、的確に同じ遺伝子位置
での並行（１つまたは複数の導入遺伝子の同時組み込み）または逐次スタッキング（１つ
または複数の導入遺伝子の継続的組み込み）を可能にする。加えて、形質転換系は、複数
のサブゲノムにわたる複数の対立遺伝子での同時並行または逐次スタッキングを含む。戦
略は、群Ｂ除草剤（例えば、イミダゾリノンまたはスルホニル尿素などのＡＬＳ阻害剤）
に耐性を付与するＡＨＡＳ遺伝子中に変異を組み入れることを利用する。
ドナーＤＮＡの野生型（除草剤感受性）ＡＨＡＳ遺伝子座へのＺＦＮ媒介組み込みをイ
ミダゾリノンへの耐性を付与する内因性ＡＨＡＳ遺伝子に導入遺伝子（複数可）および変
異を導入するために使用し、それによりイミダゾリノン選択薬剤への耐性を有する正確に
標的化された植物の再生を可能にする。
ＡＨＡＳ遺伝子座での第２の導入遺伝子（複数可）のスタッキングは、１つまたは複数
の追加的導入遺伝子を導入し、イミダゾリノンには感受性だが、スルホニル尿素への耐性
を付与するドナーＤＮＡの組み込みによって達成され、それによりスルホニル尿素選択薬
剤を使用して正確に標的化された植物の再生を可能にする。
第３の導入遺伝子のスタッキングは、さらなる導入遺伝子（複数可）を導入し、スルホ
ニル尿素への感受性およびイミダゾリノンへの耐性を付与するドナー分子の組み込みによ
って達成され、それによりイミダゾリノン選択薬剤を使用して正確に標的化された植物の
再生を可能にする。
したがって、逐次導入遺伝子スタッキングの連続ラウンドは、イミダゾリノンとスルホ
ニル尿素選択薬剤の間の差次的循環のために、内因性ＡＨＡＳ遺伝子に導入遺伝子（複数
可）および変異を導入するドナーＤＮＡの使用によって可能である。導入遺伝子は、ＡＨ
ＡＳ遺伝子内に組み込まれ、ＮＨＥＪおよび／またはＨＤＲ経路を介してスタックされて
よい。所望の修復および組換え経路は、ドナー導入遺伝子の設計によって決定できる。一
実施形態では、ＡＨＡＳ遺伝子内に組み込まれ、スタックされる外因性配列は、ゲノムの
組み込み部位、即ちＡＨＡＳ遺伝子に相同な５’および３’領域を含有するように設計さ
れる。相同な５’および３’領域は、ペイロード（例えば、ＡＨＡＳ変異および目的の遺
伝子）に隣接する。したがって、そのような設計は、染色体内でのドナーポリヌクレオチ
ドの組み込みおよびスタッキングのためのＨＤＲ経路を利用する。次の実施形態では、Ａ
ＨＡＳ遺伝子内に組み込まれ、スタックされる導入遺伝子は、ペイロード（例えば、ＡＨ
ＡＳ変異および目的の遺伝子）に隣接する一重または二重切断ＺＦＮ部位を含有するよう
に設計される。したがって、そのような設計は、染色体内でのドナーポリヌクレオチドの
組み込みおよびスタッキングのためのＮＨＥＪ経路を利用する。
ＮＨＥＪ指向性ＤＮＡ修復を使用する内因性ＡＨＡＳ遺伝子座での第１の逐次導入遺伝
子スタッキングのためのドナーＤＮＡの設計および産生
導入遺伝子スタッキングの第１のラウンドのためのドナーＤＮＡをＺＦＮ媒介、ＮＨＥ
Ｊ指向性修復を介する内因性ＡＨＡＳ遺伝子座での的確なドナー組み込みを促進するため
に設計した。設計は、ＺＦＮ２９７３２および２９７３０（プラスミドｐＤＡＢ１０９３
５０にコードされている、図１）による内因性ＡＨＡＳ遺伝子の同祖コピーの切断によっ
て作られた二本鎖ＤＮＡ切断の位置での二本鎖ドナー分子の組み込みに基づいた。
ｐＤＡＳ０００４３３（配列番号７１、図１２）のドナー分子骨格は、いくつかのポリ
ヌクレオチド配列特性を含んだ。５’末端は、Ｄゲノムにコードされる内因性ＡＨＡＳ遺
伝子とほとんど同一である配列を含有した。この配列は、標的ＺＦＮ切断部位からＡＨＡ
Ｓ終止コドンまで広がる断片でできていた。加えて、７個の計画的変異を配列に導入した
：ＺＦＮ２９７３２の結合部位にわたって位置付けられたＳ６５３Ｎ変異および５個のコ
ドン最適化、同義変異をコードする２個の変異。５個のコドン最適化、同義変異を組み込
まれるドナーの再切断を妨げるために含めた。次いで終止コドンには、ＡＨＡＳ同祖にわ
たる保存された３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）に対応する３１６ｂｐの非コード配列が続
いた。加えて、３’ＵＴＲ配列にはＺＦＮ３４４８０および３４４８１（プラスミドｐＤ
ＡＢ１１１８６０にコードされている）ならびにＺＦＮ３４４８２および３４４８３（プ
ラスミドｐＤＡＢ１１１８６１にコードされている）についてのジンクフィンガー結合部
位が続いた。これらのジンクフィンガー結合部位は、導入遺伝子スタッキングの第２のラ
ウンドの際に内因性遺伝子座に組み込まれたドナー由来ＡＨＡＳ（コーディングおよび３
’ＵＴＲ）配列の自己切除を可能にする。自己切除ジンクフィンガー結合部位には１００
ｂｐの無作為配列によって隣接された２個の追加的ジンクフィンガー結合部位が続いた。
これら２個の追加的ジンクフィンガー結合部位には導入遺伝子発現カセット（即ち、下に
記載のＰＡＴ発現カセット）を挿入するために使用した一対の固有の制限エンドヌクレア
ーゼ切断部位がすぐに続いた。次の２個の固有の制限エンドヌクレアーゼ部位は、２個の
さらなるジンクフィンガー結合部位であり、１００ｂｐの無作為配列によって再び隣接さ
れていた。４個の追加的ジンクフィンガー結合部位の含有は、逐次マーカーを含まない導
入遺伝子スタッキング、または代替的スタッキング方法を使用する同じ遺伝子位置での連
続逐次導入遺伝子スタッキングによってＡＨＡＳ遺伝子座に組み込まれた導入遺伝子のさ
らなる切除を可能にする。
ドナー骨格カセットは、ＺＦＮ２９７３２および２９７３０（プラスミドｐＤＡＢ１０
９３５０にコードされている）によって、内因性ＡＨＡＳ遺伝子座の切断において生成さ
れたライゲーション突出と適合性であった突出した５’および３’末端を有するドナー分
子の生成を可能にする追加的隣接配列の短いストレッチを５’および３’末端に含んで商
業的遺伝子サービス業者（ＧｅｎｅＡｒｔ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によ
って合成された。
ＰＡＴ発現カセットを当業者に公知の標準的方法を使用して、ドナー分子カセット「Ｑ
Ａ＿ｐＤＡＳ０００４３４」（配列番号３１４、図１９）を産生するために、ｐＤＡＳ０
００４３３の２個の固有の制限エンドヌクレアーゼ部位の間のドナー骨格カセットに挿入
した。ＰＡＴ選択カセットは、イネ（Oryza sativa）由来のアクチン（Ａｃｔ１）遺伝子
由来のプロモーター、５’非翻訳領域およびイントロンから構成され（McElroyら、(1990
)The Plant Cell、2(2):163-171）、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Strepto
myces viridochromogenes）から単離され、ホスフィノトリシン、グルホシネートおよび
ビアラホスを含むグルタミン合成酵素の阻害剤への抵抗性を付与するタンパク質をコード
する合成、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）遺伝子の植物最適
化バージョンが続く（Wohllebenら、(1988)Gene、70(1):25-37）。このカセットは、カリ
フラワーモザイクウイルス（cauliflower mosaic virus）（ＣａＭＶ）の３５ｓ遺伝子由
来の転写終結因子およびポリアデニル化部位を含む３’ＵＴＲで終結した（Chenaultら、
(1993)Plant Physiology、101(4):1395-1396）。「ＱＡ＿ｐＤＡＳ０００４３４」につい
てのプラスミドＤＮＡをＰＵＲＥ ＹＩＥＬＤ ＰＬＡＳＭＩＤ ＭＡＸＩＰＲＥＰ Ｓ
ＹＳＴＥＭ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＷＩ）を製造業者の説
明書に従って使用して調製した。
「ＱＡ＿ｐＤＡＳ０００４３４」のＰＣＲ増幅に続く制限エンドヌクレアーゼＢｂｓＩ
での消化を、内因性ＡＨＡＳ遺伝子座の切断においてＺＦＮ２９７３２および２９７３０
（プラスミドｐＤＡＢ１０９３５０にコードされている）によって生成されたライゲーシ
ョン突出と適合性である突出した５’および３’末端を有する直鎖状二本鎖ＤＮＡドナー
分子を産生するために使用した。ＰＣＲ増幅を、ドナー骨格カセット「ＱＡ＿ｐＤＡＳ０
００４３４」の５’および３’末端に付加された付加配列の短いストレッチに設計された
プライマーＡＨＡＳ＿ＴＳｄｎｒ１＿Ｆ１およびＡＨＡＳ＿ＴＳｄｎｒ１＿Ｒ１（それぞ
れ配列番号２９７および２９８）で実施した。生じた増幅産物をＡｇｅｎｃｏｕｒｔ Ａ
ＭＰｕｒｅ（商標）ＸＰ−ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ
Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して精製し、ＢｂｓＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａ
ｂｓ）で消化した。増幅産物を２回目にＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ（商標）ＸＰ
−ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使
用して精製し、エタノール沈殿および小麦形質転換に適切なＤＮＡ濃度で滅菌水での再懸
濁が続いた。当業者に公知の標準的方法を直鎖状二本鎖ＤＮＡドナー分子を調製するため
に使用した。
ＡＨＡＳ（Ｓ６５３Ｎ）をコードする対照バイナリーベクターの産生
ＡＨＡＳ（Ｓ６５３Ｎ）発現およびＰＡＴ選択カセットを含有するバイナリーベクター
ｐＤＡＳ０００１４３（配列番号８８、図１０）を既に記載の当技術分野において一般に
知られている技能および技術を使用して設計およびアセンブルした。バイナリーのための
プラスミドＤＮＡをＰＵＲＥ ＹＩＥＬＤ ＰＬＡＳＭＩＤ ＭＡＸＩＰＲＥＰ ＳＹＳ
ＴＥＭ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＷＩ）を製造業者の説明書
に従って使用して調製した。バイナリーベクターｐＤＡＳ０００１４３を対照として小麦
細胞に形質転換した。
ＮＨＥＪ指向性ＤＮＡ修復を使用する内因性ＡＨＡＳ遺伝子座での第１の逐次導入遺伝
子スタックを含む小麦事象を生成するための微粒子銃媒介形質転換
ドナー小麦系統栽培品種Ｂｏｂｗｈｉｔｅ ＭＰＢ２６ＲＨ由来の未成熟接合子胚の合
計５５，４６８個の胚盤を既に記載のとおり微粒子銃媒介ＤＮＡ送達のために調製した。
ＤＮＡコート金粒子を上に記載の処方で調製した「ＱＡ＿ｐＤＡＳ０００４３４」または
ｐＤＡＳ０００４３３由来の直鎖状二本鎖ドナーＤＮＡを使用して実施するトランスフェ
クションのために、ドナーＤＮＡをモル比５：１でｐＤＡＢ１０９３５０（ＺＦＮ２９７
３２および２９７３０をコードする）についてのプラスミドＤＮＡと混合した。ｐＤＡＳ
０００１４３を使用して実施するトランスフェクションは、ｐＤＡＳ０００１４３につい
てのプラスミドＤＮＡだけでコートされた金粒子を使用して実施した。
微粒子銃媒介トランスフェクションを既に記載のとおり実施した。照射に続いて、トラ
ンスフェクトされた胚盤をカルス誘導のための培地に移す前に２６℃、暗所、１６時間イ
ンキュベートした。
２つの異なる化学的選択戦略を組み込まれた直鎖状二本鎖ドナー分子を有する再生小麦
植物を濃縮するために使用した。ＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）に基づく第１の戦略をＺ
ＦＮ媒介ＮＨＥＪ指向性遺伝子編集による内因性ＡＨＡＳ遺伝子の１つまたは複数の同祖
コピーに的確に組み込まれたドナー分子を有する小麦事象を回収するために使用した。そ
のような事象は、Ｓ６５３Ｎ変異によって付与されたＡＨＡＳ除草剤耐性表現型を有する
と予測される。ＢＡＳＴＡ（登録商標）（ＤＬ−ホスフィノトリシン）に基づく第２の戦
略をＺＦＮ媒介ＮＨＥＪ指向性遺伝子編集によって小麦ゲノム中の無作為な（非標的化）
位置に組み込まれた、または内因性ＡＨＡＳ遺伝子の１つまたは複数の同祖コピーに不完
全に組み込まれたいずれかのドナー分子を有する事象を回収するために使用した。これら
の事象は、ＰＡＴ遺伝子によって付与されるＢＡＳＴＡ（登録商標）除草剤耐性表現型を
表すと予測されるが、Ｓ６５３Ｎ変異によって付与されるＡＨＡＳ除草剤耐性表現型であ
る必然性はない。第２の化学的選択戦略の目的は、的確な（オン標的）対無作為（オフ標
的）ドナー組み込みの頻度ならびに内因性ＡＨＡＳ遺伝子座での完全なおよび不完全な組
み込みの頻度を定量されるようにすることである。２つの化学的選択戦略は表２０に記載
されている。
Figure 0006886433
合計３４，５４６個および２３，５５０個のトランスフェクトされた胚盤をそれぞれＩ
ＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）およびＢＡＳＴＡ（登録商標）選択に供した。各戦略につい
て胚盤をカルス誘導培地上、暗所、２４℃、２週間培養した。得られたカルスを一度、新
鮮カルス誘導培地に継代培養し、同じ条件でさらに２週間保持した。体細胞胚発生カルス
（ＳＥＣ）を植物再生培地に移し、２週間、２４℃、１６／８（明／暗）時間光周期下、
育生室で培養した。再生された小植物を発根培地に移し、同じ条件下で２〜３週間培養し
た。ＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）選択のために、再生された植物を発根培地上で合計３
回継代培養した。各ラウンドの最後に、再生された植物の根を除去し、植物を同じ条件下
で発根培地上で再び継代培養した。根を有する小植物を土に移し、温室封じ込め条件下で
育生した。他殖を防ぐために個々の穂を袋に入れた後にＴ１種子を個々の植物から採取し
た。
ｐＤＡＳ０００１４３でコートした金粒子で照射した胚盤外植片をＩＭＡＺＡＭＯＸ（
登録商標）およびＢＡＳＴＡ（登録商標）化学的選択戦略の両方にわたる選択ストリンジ
ェンシーをモニターするために使用した。ｐＤＡＳ０００１４３で形質転換した植物を上
に記載の工程を使用して再生させた。
合計３６個の小麦植物をｐＤＡＳ０００１４３でトランスフェクトした胚盤外植片につ
いて各化学的選択戦略から回収した。実施例６に記載の加水分解プローブアッセイを使用
するこれらの事象の分子検査は、回収された全ての小麦植物がｐＤＡＳ０００１４３挿入
物の少なくとも１つの無作為に組み込まれたコピーを保有することを確認した。これらの
結果は、ＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）およびＢＡＳＴＡ（登録商標）選択条件が、低い
エスケープ率（即ち、形質転換されなかった小麦植物の回収）を確実にする一方で、ＡＨ
ＡＳ（Ｓ６５３Ｎ）およびＰＡＴドナーポリヌクレオチドそれぞれの１つまたは複数の組
み込まれたコピーを保有する事象の回収を可能にするために十分ストリンジェントであっ
たことを示した。
Ｓ６５３Ｎ変異によって付与されたＡＨＡＳ除草剤耐性表現型を有する小麦植物は、上
に記載の特異的選択条件下でＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）選択から回収されなかった。
ＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）選択が同祖ＡＨＡＳ遺伝子の１つまたは複数のコピーへの
ドナー分子の的確な組み込みを有する小麦植物だけを回収すると予測されることから、こ
れらの結果は化学的選択レジメンが準最適であり、条件が内因性ＡＨＡＳ遺伝子座でのｐ
ＤＡＳ０００４３３ドナーの的確なＺＦＮ媒介ＮＨＥＪ指向性組み込みのために変更され
るべきである、または形質転換規模がこの作業において使用された化学的選択条件のため
に適していなかったことを示唆している。対照的に、１，６５２個の小麦植物がＢＡＳＴ
Ａ（登録商標）選択から回収された。ＢＡＳＴＡ（登録商標）が、標的化および非標的化
（無作為）ドナー組み込みの両方を有する小麦植物を回収することが予測されることから
、これらの事象の分子特徴付けは、標的化および非標的化ドナー組み込みの間を識別でき
、ＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）選択条件を改良するための指針を提供できる。
内因性ＡＨＡＳ遺伝子座での第１の導入遺伝子スタッキングの証拠に関するＢＡＳＴＡ
（登録商標）選択小麦植物の分子特徴付け
ＢＡＳＴＡ（登録商標）選択から回収された合計１，１６２個の小麦植物を標的化およ
びオフ標的（無作為）ドナー組み込みの頻度、ならびに内因性ＡＨＡＳ遺伝子座での標的
化完全および不完全ドナー組み込みの頻度を評価するために分子的に特徴付けた。
３つの分子アッセイを、凍結乾燥葉組織から既に記載のとおりＤＮＥＡＳＹ（登録商標
）ＰＬＡＮＴ ＤＮＡ ＥＸＴＲＡＣＴＩＯＮ ＭＩＮＩ ＫＩＴ（商標）（Ｑｉａｇｅ
ｎ）で抽出したゲノムＤＮＡを使用して、各小麦植物について実施した。
第１の分子検査を「ＱＡ＿ｐＤＡＳ０００４３４」由来の直鎖状二本鎖ＤＮＡの少なく
とも１つの組み込まれたコピーを保有している再生された小麦植物を確認するために使用
した。この検査は、「ＱＡ＿ｐＤＡＳ０００４３４」に存在するアクチン（Ａｃｔ１）プ
ロモーターの領域を増幅するためのＰＣＲアッセイ（フォワードおよびリバースプライマ
ーについてそれぞれ配列番号９２および９３）に続く、生じた増幅産物のアガロースゲル
上での電気泳動分離を含んだ。予測されるサイズ（２１８ｂｐ）のＰＣＲ断片の存在は、
ドナー分子の少なくとも１つのコピーの組み込みを示した。１，１６２個の小麦事象のう
ち、１，０６５個（９２％）は予測されたサイズのＰＣＲ断片を生じた。
第２の分子検査を内因性ＡＨＡＳ遺伝子座の１つまたは複数のコピーに組み込まれたと
推定されるドナー分子を有する小麦植物を同定するために使用した。この検査は、内因性
ＡＨＡＳ遺伝子の各同祖コピー中のＺＦＮ２９７３２および２９７３０（プラスミドｐＤ
ＡＢ１９０３５０にコードされている）についての結合部位の上流領域にハイブリダイズ
するように設計されたプライマー、および「ＱＡ＿ｐＤＡＳ０００４３４」中のＺＦＮ３
４４８０および３４４８１（プラスミドｐＤＡＢ１１１８６０にコードされている）につ
いての結合部位に隣接する無作為配列１００ｂｐ内の領域にハイブリダイズするように設
計されたプライマー（フォワードおよびリバースプライマーについてそれぞれ配列番号２
９９および３００）を使用するオンオフＰＣＲアッセイを含んだ。各プライマーは、ＰＣ
Ｒ増幅の際のプライマー伸長について特異性を最大化するために最後から２番目の塩基に
ホスホロチオエート連結を有するように設計された。アガロースゲル上で電気泳動によっ
て分離される場合に３００ｂｐより大きなサイズを有するＰＣＲ断片の増幅は、内因性Ａ
ＨＡＳ遺伝子の１つまたは複数のコピーへのドナー分子（少なくとも一部）の標的化組み
込みについて示唆される証拠とみなされた。検査した１，０６５個の小麦事象のうち、５
４３個（５１％）がサイズで３００ｂｐより大きいＰＣＲ断片を増幅した。
第３の分子アッセイを内因性ＡＨＡＳ遺伝子の１つまたは複数のコピーへのドナー分子
の標的化組み込みについて示唆される証拠を示す小麦植物をさらに特徴付けるために使用
した。この検査は、内因性ＡＨＡＳ遺伝子の３個の同祖コピー由来の２５６ｂｐ領域を増
幅するために設計されたプライマー一対を使用するＰＣＲアッセイを含んだ。この領域は
ＺＦＮ２９７３２および２９７３０（プラスミドｐＤＡＢ１９０３５０にコードされてい
る）についての結合部位を含有し、ゲノムのヌクレオチド配列のバリエーションを含む。
ＡＨＡＳ同祖間を識別するために十分なゲノムのヌクレオチド配列のバリエーションが含
まれ、生じた増幅産物は、それらが由来した小麦サブゲノムに（配列レベルで）明確に帰
属できた。プライマー対は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（商標）の合成による配列決定ケミストリ
ーに適合性であるように、それぞれ５’末端にＩｌｌｕｍｉｎａ（商標）ＳＰ１およびＳ
Ｐ２配列を有して合成された。合成されたプライマーは、最後から２番目の５’および３
’ヌクレオチドにホスホロチオエート連結も含有した。５’ホスホロチオエート連結は、
Ｉｌｌｕｍｉｎａ（商標）ＳＰ１およびＳＰ２配列のエクソヌクレアーゼ分解に対する保
護を与えた、一方３’ホスホロチオエート連結は、オンオフＰＣＲを使用する標的ＡＨＡ
Ｓ配列の増幅についてのＰＣＲ特異性を改善した。プライマー対のこれらの配列を表２１
に示す。
Figure 0006886433
第３の分子アッセイによって産生されたＰＣＲ増幅産物を、増幅されたＤＮＡ断片にＩ
ｌｌｕｍｉｎａ（商標）Ｐ５およびＰ７配列ならびに配列リードをそれらが由来する試料
に明確に帰属させるために使用できる配列バーコードインデックスを導入するためにＰＣ
Ｒの追加的ラウンドを実施することによるディープシーケンシングのために調製した。こ
れを増幅の第１のラウンドにおいて追加されたＳＰ１およびＳＰ２配列に部分的に相補的
であるが、試料インデックスＰ５およびＰ７配列も含有したプライマーを使用して達成し
た。増幅後に、生成された産生物を２５０ｂｐ対末端配列リードを生成するＩｌｌｕｍｉ
ｎａ ＭｉＳＥＱ（商標）装置で、製造業者の説明書に従って配列決定した。
生じた２５０ｂｐ対末端配列リードを、各リードを試料に（バーコードインデックスに
基づいて）およびそれから由来したサブゲノムに割り当てる（ＡＨＡＳ遺伝子の同祖コピ
ー間を識別するヌクレオチドのバリエーションに基づいて）ために、ならびに品質の高い
配列だけを続く分析に使用することを確実にするための品質フィルタリングを実施するた
めに既に記載のとおり計算的に処理した。下に記載のとおり、ＭＩＣＲＯＳＯＦＴ ＥＸ
ＣＥＬ ２０１０（商標）（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）でのカスタ
ム開発ＰＥＲＬスクリプトおよび手動データ操作を、内因性ＡＨＡＳ遺伝子の１つまたは
複数のコピーへのドナーの標的化組み込みについての証拠を含有するリードを同定するた
めに使用した。
プライマーＡＨＡＳｓ６５３ＺＦＮ．Ｒ３（表２１）に対するハイブリダイゼーション
部位が「ＱＡ＿ｐＤＡＳ０００４３４」中のＡＨＡＳ３’非翻訳領域（ＵＴＲ）にも存在
することから、第３の分子アッセイは標的化および無作為ドナー組み込みの間、ならびに
内因性ＡＨＡＳ遺伝子座の１つまたは複数のコピーでの完全および不完全ドナー組み込み
の間を識別することを可能にした。完全な半接合性オン標的編集を有する小麦植物は、改
変された各ＡＨＡＳ遺伝子座での野生型（未編集）および編集された対立遺伝子の両方の
増幅が起源である配列リードを生じると予測される。これらの対立遺伝子は、「ＱＡ＿ｐ
ＤＡＳ０００４３４」中のＡＨＡＳエクソンに導入された７個の計画的変異（即ち、Ｓ６
５３Ｎ変異をコードする２個の変異およびＺＦＮ２９７３２の結合部位にわたって位置付
けられ、組み込まれたドナーの再切断を妨げるために組み入れられた５個のコドン最適化
された同義の変異）によって配列レベルで識別可能である。理論的には、野生型および編
集された対立遺伝子に対応するリードの頻度は、完全な半接合性編集を有する各内因性Ａ
ＨＡＳ遺伝子座について１：１の比で生じるはずである。対照的に、完全なホモ接合性オ
ン標的編集を有する小麦植物は、それぞれの改変された内因性ＡＨＡＳ遺伝子座で編集さ
れた対立遺伝子対から生じる配列リードだけを生成すると予測される。第３の分子アッセ
イにおいて使用されるプライマー対がＡＨＡＳ遺伝子の３つ全ての同祖コピーを増幅する
ように設計されたことから、３つ全ての小麦サブゲノムから生じるリードの予測される生
成は、オン標的不完全ドナー組み込み（例えば、部分的なドナー断片の組み込み、または
誤った方向でのドナー断片の組み込み）を検出するためにも使用できる。不完全オン標的
ドナー組み込みは、ＰＣＲ競合がより短い野生型断片の増幅に有利であることから、それ
ぞれの改変された内因性ＡＨＡＳ遺伝子座からの野生型（未編集）対立遺伝子だけの増幅
を生じると予測される。結果として、半接合性オン標的不完全ドナー組み込みは、未編集
サブゲノムと比較して、組み込みが生じたサブゲノムに由来するリードの約半分を生成す
ることが予測される。ホモ接合性オン標的不完全ドナー組み込みについて、組み込みが生
じたサブゲノムからはリードが生じないと予測される。逆に、オフ標的（無作為）ドナー
組み込みは、ＡＨＡＳ遺伝子の３つ全ての同祖コピーに由来する同じ割合の配列リードを
生成すると予測される。
検査した５４３個の小麦植物の配列分析は、内因性ＡＨＡＳ遺伝子の１つまたは複数の
コピーにおけるオン標的ドナー組み込みについての分子証拠を有する３８個の事象を明ら
かにした。事象ｄｉ０１−９６３２−１−１は、Ｂゲノムに位置するＡＨＡＳ遺伝子座に
完全な半接合性ドナー組み込みを有した。これらの結果は、Ｂゲノムに由来する野生型お
よび完全に編集されたリードの両方、ならびにＡおよびＤゲノムに由来する野生型対立遺
伝子だけの存在によって示された（表２２）。２つの事象は、それぞれＡおよびＤゲノム
上のＡＨＡＳ遺伝子座に不完全な半接合性ドナー組み込みを有した。事象ｙｌ０２−９４
５３−１−２は、Ｄゲノムに由来する野生型および不完全に編集されたリードの両方、な
らびにＡおよびＢゲノムに由来する野生型対立遺伝子だけを有した。比較的に、事象ｙｌ
０２−９５５２−２１−１は、Ａゲノムに由来する野生型および不完全に編集されたリー
ドの両方、ならびに他のサブゲノムに由来する野生型対立遺伝子だけを有した。
残りの３５個の事象は、内因性ＡＨＡＳ遺伝子の少なくとも１つのコピーへの不完全な
ドナー組み込みについての分子証拠を示し、ドナー分子は切断されるかまたは誤った方向
に組み込まれる可能性が高かった（表２２）。これらの事象は、予測されるより低い頻度
での小麦サブゲノムの１つまたは複数に由来するリードによって特徴付けられた。例えば
、事象ｙｌ０２−９５５２−７−１は、未編集遺伝子座について予測されるものよりも統
計的に有意に低い頻度のＢゲノムに由来する野生型ＡＨＡＳリードを有した。残りの４５
３個の事象は、小麦ゲノム中の他所でのドナーの無作為組み込みについての証拠だけを示
し、第２の分子アッセイ由来の増幅産生物がＰＣＲキメラ現象から起きる可能性が最も高
いことを示した。小麦事象ｄｉ０１−９６３２−１−１、ｙｌ０２−９４５３−１−２お
よびｙｌ０２−９５５２−２１−１のＢ、ＤおよびＡサブゲノムに存在する編集された対
立遺伝子についての共通配列をそれぞれ配列番号３０３、３０４および３０５として示す
。
Figure 0006886433
Figure 0006886433
Figure 0006886433
Figure 0006886433
全体として、ＢＡＳＴＡ（登録商標）選択小麦事象の３％（３８／１，１６２）が内因
性ＡＨＡＳ遺伝子の同祖コピーの１つまたは複数への標的化ドナー組み込みについての分
子証拠を示した。
小麦中の内因性ＡＨＡＳ遺伝子座での逐次、外因性マーカーを含まない導入遺伝子スタ
ッキングのための形質転換系の開発
Ｓ６５３Ｎ変異を導入するためにＡＨＡＳ遺伝子座内にドナーの組み込まれたポリヌク
レオチドを含有する小麦植物を既に記載の方法を介して産生する。例えば、小麦のＢゲノ
ム中の「ＱＡ＿ｐＤＡＳ０００４３４」での完全な半接合性組み込みの分子証拠を示して
いる事象ｄｉ０１−９６３２−１−１（表２３）の再生は、ドナーＤＮＡおよびジンクフ
ィンガーヌクレアーゼ構築物が、小麦中の標的内因性ＡＨＡＳ遺伝子座の１つまたは複数
のコピーでのドナー分子配列の組み込みのために利用できることを示している。いかなる
追加的トランスジェニック選択可能マーカーも含まないそのような事象を産生することは
、小麦ゲノム中の内因性ＡＨＡＳ遺伝子座でのドナーポリヌクレオチドの逐次、外因性ト
ランスジェニック選択可能マーカーを含まないスタッキングのための開始作用である。編
集された植物事象は、実施例１０に既に記載のとおり代替的選択条件を介して得られる。
既に記載の選択条件は、多数の方法によって改変されてよい。他の手法は、内因性ＡＨ
ＡＳ遺伝子座の１つまたは複数のコピーへのＳ６５３Ｎ変異（「ＱＡ＿ｐＤＡＳ０００４
３４」またはｐＤＡＳ０００４３３にコードされている）の的確な組み込みを有する小麦
植物の回収を増強するために、トランスジェニック選択可能マーカーを使用することなく
実行できる。
２つの追加的手法は、内因性ＡＨＡＳ遺伝子座の１つまたは複数のコピーへのＳ６５３
Ｎ変異の的確な組み込みを有する小麦植物の回収を増強するために、トランスジェニック
選択可能マーカーの使用を伴わずに実行できる。
例えば、ＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）選択条件は、培養の異なる段階での選択および
／または低濃度の除草剤を含んで改変される。それにより植物再生段階での選択は、植物
再生培地に添加されるＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）の濃度を低下させることによって低
減される、または別の代替法としてこの植物再生段階での除草剤の使用は完全に除外され
る。したがって、再生された植物のより強い増殖が観察され、それにより、発根培地に継
代培養された場合に組織損傷にあまり感受性でないより大きな小植物を確実にする。さら
に、小植物は、それが由来する胚発生カルスから切除される必要がある場合がある。より
小さな小植物は、組織損傷にさらに感受性であり、継代培養の際に形質転換された小植物
の組織壊死および潜在的損失を生じる場合がある。カルス誘導段階でのＩＭＡＺＡＭＯＸ
（登録商標）選択の維持は、未形質転換細胞からの胚発生を制限する助けとなる一方で、
発根段階でのその維持は、Ｓ６５３Ｎ変異によって付与されたＡＨＡＳ除草剤耐性表現型
を産生するために必要である、内因性ＡＨＡＳ遺伝子座の１つまたは複数のコピーでのｐ
ＤＡＳ０００４３３の的確な組み込みを有する小植物についての強い選択を提供する。的
確に編集された小麦植物を生成するためのそのようなＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）選択
戦略の成功を実施例５において実証した。
別の例では、異なる形質転換系を的確に組み込まれたドナーＤＮＡを有する小麦植物を
生成するために使用する。例えば、プロトプラストに基づく形質転換は、個々のカルスを
産生するために使用でき、各カルスは単一の細胞に由来する。プロトプラスト由来カルス
は、未成熟接合子胚の微粒子銃照射胚盤に由来するカルスを超える、いくつかの利点を提
供する。形質転換および未形質転換細胞の両方に関するキメラである微粒子銃照射由来の
カルスとは異なり、プロトプラスト由来カルスはクローンである。したがって、的確なｐ
ＤＡＳ０００４３３組み込みが生じた形質転換プロトプラストに由来するカルスでの細胞
生存は、ＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）選択に供された場合、隣接する未形質転換細胞の
存在によって損なわれない。微粒子銃照射に由来するカルスの場合、カルスのキメラ組成
物は、ＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）選択に供された場合に、的確に形質転換されたもの
の生存が周囲の未形質転換細胞の死によって損なわれる場合があることを意味する。プロ
トプラストに基づく形質転換系は、さらに多い細胞を一定の試みで形質転換でき、それに
より内因性ＡＨＡＳ遺伝子の１つまたは複数のコピー中のｐＤＡＳ０００４３３の的確な
組み込みを有する小麦植物を回収するさらに高い可能性を提供することから、微粒子銃照
射と比較して拡張性の利点も提供する。小麦についてのいくつかのプロトプラストに基づ
く形質転換系は刊行された科学文献に記載されている（Qiaoら(1992)Plant Cell Reorts
11:262-265;AhmedおよびSagi(1993)Plant Cell Reorts 12:175-179;Paukら(1994)Plant C
ell,Tissue and Organ Culture 38:1-10; Heら(1994)Plant Cell Reorts 14:92-196;Guお
よびLang(1997)Plant Cell,Tissue and Organ Culture 50:139-145;ならびにLiら(1999)P
lant Cell,Tissue and Organ Culture 58:119-125）。
一連の実験は、ＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）への耐性を付与するＡＨＡＳ（Ｓ６５３
Ｎ）変異を発現している小麦植物を、上に記載のものなどのプロトプラストに基づく形質
転換系から再生するための最適な選択条件を決定するために実施される。
ＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）選択条件を小麦系統栽培品種Ｂｏｂｗｈｉｔｅ ＭＰＢ
２６ＲＨの体細胞胚発生カルス（ＳＥＣ）由来細胞懸濁培養由来のプロトプラストを使用
して最適化する。Ｂｏｂｗｈｉｔｅ ＭＰＢ２６ＲＨに由来するプロトプラストは非全能
性（即ち、植物全体を再生するためには使用できない）であるが、ＡＨＡＳ（６５３Ｎ）
変異を発現している事象を濃縮するために確立された選択条件は、当業者が認識する全能
性小麦遺伝子型に基づく任意のプロトプラストに基づく形質転換系に移行できると予測さ
れる。実行された実験は、野生型ドナー小麦系統栽培品種Ｂｏｂｗｈｉｔｅ ＭＰＢ２６
ＲＨ（Ｓ６５３／Ｓ６５３遺伝子型、イミダゾリノンへの感受性を付与する）のＩＭＡＺ
ＡＭＯＸ（登録商標）への基礎的耐性を確立する。基礎的耐性より強いＩＭＡＺＡＭＯＸ
（登録商標）選択条件の使用は、ＡＨＡＳ（Ｓ６５３Ｎ）変異を発現している形質転換細
胞を強く濃縮する。
さらなる形質転換方法は、適用可能である。例えば小麦系統栽培品種Ｂｏｂｗｈｉｔｅ
ＭＰＢ２６ＲＨについて細胞懸濁培養を確立できる。体細胞胚発生カルス（ＳＥＣ）は
、既に記載のとおり小麦系統栽培品種Ｂｏｂｗｈｉｔｅ ＭＰＢ２６ＲＨの未成熟接合子
胚から誘導される。急速増殖カルス系統をカルス誘導培地での６サイクルの継代培養の後
に選択する。継代培養の各サイクルについて、急速増殖カルスを新たなカルス誘導培地に
移し、暗所、２６℃、１４日間培養した。
細胞懸濁培養物を、急速増殖カルス系統のカルス１グラムを２０ｍｌ液体増殖培地を含
有するフラスコに移し、２５℃、暗所、９０ｒｐｍの旋回シェーカーで培養することによ
って開始する。７日ごとに細胞懸濁培養物を直径２ｍｍより大きな細胞クランプを除去す
るために微細なガーゼに通し、培養培地の３分の２を新鮮培地で置き換えることによって
継代培養する。３ヵ月間ろ過および継代培養を繰り返した後、急速増殖ＳＥＣ由来細胞懸
濁培養物を確立する。
次にプロトプラストをＳＥＣ由来細胞懸濁培養物から単離する。新鮮重量約４グラムの
細胞クランプを、７日後のＳＥＣ由来細胞懸濁培養物を微細格子に通すことによって得る
。細胞クランプを既に記載のとおりプロトプラストを遊離するために小麦カルス消化混合
物で消化する。ＳＥＣ由来細胞懸濁培養プロトプラストの収量をＮｅｕｂａｕｅｒ（商標
）ヘモサイトメーターを使用して推定する。エバンスブルー染色を回収した生細胞の割合
を決定するために使用する。
除草剤ＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）でのプロトプラスト培養選択条件を選択する。ア
ガロースビーズ型培養系をプロトプラスト培養のために使用する。プロトプラスト約１ｘ
１０６個を穏やかな遠心分離によって沈殿させ、上清を除去する。プロトプラストを穏や
かな撹拌によって４０℃に冷却した融解１．２％Ｓｅａ−Ｐｌａｑｕｅ（商標）アガロー
ス１ｍｌに再懸濁し、３．５ｃｍペトリ皿に移す。アガロース固化に続いて、培養培地１
ｍｌをペトリ皿に添加し、プレートを２５℃、暗所、１週間インキュベートする。アガロ
ースプラグを培養培地１０ｍｌを含有する２０ｃｍペトリ皿に移し、２５℃、暗所、９０
ｒｐｍの旋回シェーカーでインキュベートする。１４日ごとに培養培地を新鮮培地で置き
換える。プロトプラスト細胞***がアガロースへの包埋の３日後に典型的には観察され、
７日後に複数の細胞のクランプが見える。
小麦系統栽培品種Ｂｏｂｗｈｉｔｅ ＭＰＢ２６ＲＨのＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）
への基礎的耐性を０、５０、１００、２００、４００および６００ｎＭ ＩＭＡＺＡＭＯ
Ｘ（登録商標）を補充した培地中でアガロースビーズ型培養物をインキュベートすること
によって決定し、２週間後のカルス増殖速度を評価する。２００ｎＭより高いＩＭＡＺＡ
ＭＯＸ（登録商標）濃度は、カルス発生を遅らせ、２００ｎＭ以上の濃度がＡＨＡＳ（Ｓ
６５３Ｎ）変異を有する小麦細胞を濃縮するおよび選択するために最適であることを示し
ている。
ＡＨＡＳ遺伝子座内にＳ６５３Ｎ変異を生じるドナーに組み込まれた断片を有するトラ
ンスジェニック植物を得るための組織培養選択条件の確立を得る。編集された植物事象を
トランスフェクションの第２のラウンドのための外植片材料（例えば、プロトプラストま
たは未成熟接合子胚の胚盤）を生成するために使用する。次の実施例において記載のとお
り、続いて外植片材料をドナーＤＮＡ分子および、Ｐ１９７アミノ酸残基をコードする領
域の上流のＡＨＡＳ遺伝子に位置付けられたジンクフィンガー結合部位を標的とするよう
に設計されるＺＦＮをコードするプラスミドで同時トランスフェクトする。
小麦中の内因性ＡＨＡＳ遺伝子座での逐次、外因性マーカーを含まない導入遺伝子スタ
ッキングのための代替形質転換系
再生された小麦植物事象ｄｉ０１−９６３２−１−１について実施例１０で提供された
分子証拠は、小麦中の内因性ＡＨＡＳ遺伝子座での逐次、外因性マーカーを含まない導入
遺伝子スタッキングについての技術的実現可能性を実証する。ＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商
標）選択条件の改良または異なる形質転換系の使用は、内因性ＡＨＡＳ遺伝子座で逐次的
にスタックされた導入遺伝子を有する小麦植物の産生を可能にする。本実施例は、さまざ
まな選択的薬剤（例えば、イミダゾリノンおよびスルホニル尿素）と対応するＡＨＡＳ変
異（例えば、Ｓ６５３ＮおよびＰ１９７Ｓ）の間を変更することによって、内因性ＡＨＡ
Ｓ遺伝子座での外因性マーカーを含まない逐次導入遺伝子スタッキングを達成するための
手法を記載する。最初にスルホニル尿素についての選択条件を決定した。
化学的選択条件の最適化、ＡＨＡＳ（Ｐ１９７Ｓ）発現構築物を有する低コピー、無作
為に組み込まれたＴ−ＤＮＡ小麦植物の生成
ＡＨＡＳ（Ｐ１９７Ｓ）発現およびＰＡＴ選択カセットを含有するバイナリーベクター
ｐＤＡＳ０００１６４（配列番号２８９、図１１）を当技術分野において一般に知られて
いる技能および技術を使用して設計およびアセンブルした。ＡＨＡＳ（Ｐ１９７Ｓ）発現
カセットは、トウモロコシ（Zea mays）由来のユビキチン（Ｕｂｉ）遺伝子由来のプロモ
ーター、５’非翻訳領域およびイントロンからなり（Tokiら、(1992)Plant Physiology、
100:1503-07）、プロリン（Ｐ）からセリン（Ｓ）へのアミノ酸変更を導入するためにＣ
からＴに変異されたヌクレオチド５１１を有する、コムギ（T.aestivum）栽培品種Ｂｏｂ
ｗｈｉｔｅ ＭＰＢ２６ＲＨ由来ＡＨＡＳ遺伝子のコード配列（１，９３５ｂｐ）が続く
。ＡＨＡＳ発現カセットは、Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）ｐＴｉ１５９５５
からのノパリン合成酵素遺伝子（ｎｏｓ）の転写終結因子およびポリアデニル化部位を含
む３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含んでいた（Fraleyら、(1983)Proceedings of the Natio
nal Acadimy of Sciences U.S.A.、80(15):4803-4807）。選択カセットは、イネ（Oryza
sativa）由来のアクチン（Ａｃｔ１）遺伝子由来のプロモーター、５’非翻訳領域および
イントロンから構成され（McElroyら、(1990)The Plant Cell、2(2):163-171）、ストレ
プトマイセス・ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridochromogenes）から単離され、
ホスフィノトリシン、グルホシネートおよびビアラホスを含むグルタミン合成酵素の阻害
剤への抵抗性を付与するタンパク質をコードするホスフィノトリシンアセチルトランスフ
ェラーゼ（ＰＡＴ）遺伝子の合成、植物最適化バージョンが続く（Wohllebenら、(1988)G
ene、70(1):25-37）。このカセットは、カリフラワーモザイクウイルス（cauliflower mo
saic virus）（ＣａＭＶ）の３５ｓ遺伝子由来の転写終結因子およびポリアデニル化部位
を含む３’ＵＴＲで終結した（Chenaultら、(1993)Plant Physiology、101(4):1395-1396
）。
選択カセットは、商業的遺伝子合成業者（例えば、ＧｅｎｅＡｒｔ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｉｅｓなど）によって合成され、トウモロコシ（Zea mays）由来のユビキチ
ン（Ｕｂｉ）遺伝子とＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）ｐＴｉ１５９５５由来の
ノパリン合成酵素遺伝子（ｎｏｓ）の転写終結因子およびポリアデニル化部位を含む３’
非翻訳領域（ＵＴＲ）との間に位置付けられるＲｆＡ Ｇａｔｅｗａｙカセットと共に、
ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）−ｅｎａｂｌｅｄバイナリーベクターにクローニングする。
ＡＨＡＳ（Ｐ１９７Ｓ）コード配列を隣接するａｔｔＢ部位で増幅し、ｐＤＯＮＲ２２１
にサブクローニングした。得られたＥＮＴＲＹクローンを、ホスフィノトリシンアセチル
トランスフェラーゼ（ＰＡＴ）発現カセットをコードしているＧａｔｅｗａｙ−ｅｎａｂ
ｌｅｄバイナリーベクターと共に、ＬＲ ＣＬＯＮＡＳＥ ＩＩ（登録商標）（Ｉｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）反応に使用した。アセンブルされ
た全てのプラスミドのコロニーをミニプレップＤＮＡの制限消化によって最初にスクリー
ニングした。制限エンドヌクレアーゼはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（ＮＥ
Ｂ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）およびＰｒｏｍｅｇａ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔ
ｉｏｎ、ＷＩ）から得た。プラスミド調製をＱＩＡＰＲＥＰ ＳＰＩＮ ＭＩＮＩＰＲＥ
Ｐ ＫＩＴ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ）またはＰＵＲＥ ＹＩＥＬＤ
ＰＬＡＳＭＩＤ ＭＡＸＩＰＲＥＰ ＳＹＳＴＥＭ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏ
ｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＷＩ）を供給業者の説明書に従って使用して実施した。選択したク
ローンのプラスミドＤＮＡをＡＢＩ Ｓａｎｇｅｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ｂ
ＩＧ ＤＹＥ ＴＥＲＭＩＮＡＴＯＲ Ｖ３．１（登録商標）サイクル配列決定プロトコ
ール（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
を使用して配列決定した。配列データをＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ（商標）ソフトウェア（Ｇ
ｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を使用して
アセンブルし、分析した。
生じたバイナリー発現クローンｐＤＡＳ０００１６４をアグロバクテリウム・ツメファ
シエンス（Agrobacterium tumefaciens）株ＥＨＡ１０５に形質転換した。無作為に組み
込まれたＴ−ＤＮＡを有するトランスジェニック小麦植物を、Ｗｕら（２００８）Ｔｒａ
ｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １７：４２５〜４３６に類似のプロトコールに従っ
て、ドナー小麦系統栽培品種Ｂｏｂｗｈｉｔｅ ＭＰＢ２６ＲＨを使用するアグロバクテ
リウム媒介形質転換によって生成した。ＡＨＡＳ（Ｐ１９７）発現構築物を発現している
推定Ｔ０トランスジェニック事象をホスフィノトリシン（ＰＰＴ）耐性、ＰＡＴトランス
ジェニック選択可能マーカーによって付与された表現型について選択し、土に移した。Ｔ
０植物を温室封じ込め条件下で育生し、Ｔ１種子が産生された。
各Ｔ０植物からのゲノムＤＮＡを葉組織から実施例６に既に記載のプロトコールを使用
して抽出し、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株
のキャリーオーバーの存在または不在について、およびＡＨＡＳ（Ｐ１９７Ｓ）をコード
するＴ−ＤＮＡの組み込まれたコピーの数について検査した。Ａ．ツメファシエンス（A.
tumefaciens）株の存在または不在は、小麦ゲノムからの内因性ユビキチン遺伝子（フォ
ワードおよびリバースプライマーならびにプローブ配列についてそれぞれ配列番号２９０
、配列番号２９１および配列番号２９２）、ならびにｐＴｉＢｏ５４２からのｖｉｒＣ（
フォワードおよびリバースプライマーならびにプローブ配列についてそれぞれ配列番号２
９３、配列番号２９４および配列番号７０）を増幅するための二重加水分解プローブｑＰ
ＣＲアッセイ（ＴＡＱＭＡＮ（商標）と同様）を使用して実施した。組み込まれたＴ−Ｄ
ＮＡコピーの数は、二重加水分解プローブｑＰＣＲアッセイを使用して、実施例６に記載
のとおり、六倍体小麦のＤゲノムからのピューロインドリン−ｂ遺伝子（Ｐｉｎｂ）およ
びｐＤＡＳ０００１６４に存在するアクチン（Ａｃｔ１）プロモーターの領域に基づいて
推定した。全体として、３個未満の無作為に組み込まれたＴ−ＤＮＡのコピーを有する３
５個の独立したＴ０事象が生成された。
化学的選択条件の最適化、スルホメチュロンメチルでの小麦植物再生のための条件
一連の実験をスルホニル尿素クラス除草剤への耐性を付与するＡＨＡＳ（Ｐ１９７Ｓ）
変異を発現している小麦植物を再生するための最適選択条件を決定するために実施した。
これらの実験は、確立された小麦形質転換系のカルス誘導、植物再生および発根段階で野
生型ドナー小麦系統栽培品種Ｂｏｂｗｈｉｔｅ ＭＰＢ２６ＲＨ（Ｐ１９７／Ｐ１９７遺
伝子型、スルホニル尿素への感受性を付与する）の基礎的耐性を検査することに基づいた
。同様の実験をスルホニル尿素選択薬剤への耐性を付与するＡＨＡＳ（Ｐ１９７Ｓ）変異
を発現している無作為に組み込まれたＴ−ＤＮＡを有するトランスジェニック栽培品種Ｂ
ｏｂｗｈｉｔｅ ＭＰＢ２６ＲＨ事象の基礎的耐性を決定するために実施した。
カルス誘導段階でのスルホメチュロンメチルへの野生型ドナー小麦系統の基礎的耐性を
次のとおり決定した：未成熟接合子胚の胚盤を実施例４に既に記載のとおり単離し、０、
１００、５００、１０００、１５００および２０００ｎＭスルホメチュロンメチルをそれ
ぞれ補充したＣＩＭ培地を含有する１０ｃｍペトリ皿に置いた。胚盤２０個を各ペトリ皿
に置いた。胚盤合計６０個を各スルホメチュロンメチル濃度で検査した。２４℃、暗所、
４週間でのインキュベーション後、各スルホメチュロンメチル濃度での体細胞胚発生カル
ス形成（ＳＥＣ）の量を記録した。結果は、栽培品種Ｂｏｂｗｈｉｔｅ ＭＰＢ２６ＲＨ
についてのＳＥＣ形成が未処置試料と比較して１００ｎＭスルホメチュロンメチルで約７
０％低減されたことを示した。
植物再生段階でのスルホメチュロンメチルへの野生型ドナー小麦系統の基礎的耐性を次
のとおり決定した：ドナー小麦系統由来未成熟接合子胚の胚盤を単離し、ＣＩＭ培地を含
有する１０ｃｍペトリ皿に置いた。次いでＳＥＣを２４℃、暗所、４週間インキュベート
することによって形成させた。ＳＥＣを０、１００、５００、１０００、１５００、２０
００、２５００および３０００ｎＭスルホメチュロンメチルをそれぞれ補充したＤＲＭ培
地を含有する１０ｃｍペトリ皿に移した。２０個のＣＩＭを各ペトリ皿に置いた。合計６
０個のＣＩＭを基礎的耐性応答について各スルホメチュロンメチル濃度で検査した。２週
間、２４℃、１６／８（明／暗）時間光周期下、育生室でのインキュベーション後に、再
生応答を記録した。結果は、植物再生が未処置試料と比較して２０００ｎＭスルホメチュ
ロンメチルで約８０％低減したことを示した。
植物発根段階でのスルホメチュロンメチルへの野生型ドナー小麦系統の基礎的耐性を次
のとおり決定した：未成熟接合子胚の胚盤を単離し、ＣＩＭ培地を含有する１０ｃｍペト
リ皿に置いた。次いでＳＥＣを２４℃、暗所、４週間インキュベートすることによって形
成させた。ＳＥＣをＤＲＭ培地を含有する１０ｃｍペトリ皿に移し、２週間、２４℃、１
６／８（明／暗）時間光周期下で植物再生が起きるようにインキュベートした。再生され
た植物を０、１００、２００、２５０、３００、４００、５００、１０００および２００
０ｎＭスルホメチュロンメチルをそれぞれ補充したＲＭ培地を含有する１０ｃｍペトリ皿
に移した。１０個の再生された植物を各ペトリ皿に置いた。合計３０個の再生された植物
を各スルホメチュロンメチル濃度での基礎的耐性応答について検査した。３週間、２４℃
、１６／８（明／暗）時間光周期下、育生室でのインキュベーション後、根形成応答を記
録した。結果は、根形成が未処置試料と比較して４００ｎＭより高いスルホメチュロンメ
チルの濃度で大幅に阻害されたことを示した。
ｐＤＡＳ０００１６４由来のＡＨＡＳ（Ｐ１９７Ｓ）変異を発現している無作為に組み
込まれた、低コピー（≦３）Ｔ−ＤＮＡを有するトランスジェニック小麦事象の植物の発
根段階でのスルホメチュロンメチルへの基礎的耐性を次のとおり決定した：４個の独立し
たトランスジェニック事象を無作為に選択し、増殖培地で継代培養することによってｉｎ
ｖｉｔｒｏで増殖させた。増殖後、各事象についての植物を０、４００、４５０、５０
０、５５０および６００ｎＭスルホメチュロンメチルをそれぞれ補充したＲＭ培地を含有
する１０ｃｍペトリ皿に移した。４個の植物（４個の事象それぞれから１個）を各ペトリ
皿に置いた。１事象あたり合計３個の植物を各スルホメチュロンメチル濃度で基礎的耐性
について検査した。２週間、２４℃、１６／８（明／暗）時間光周期下、育生室でのイン
キュベーション後、根形成応答を記録した。結果は、根形成が未処置対照と比較して検査
したいずれの濃度でも制限されなかったことを示し、ＡＨＡＳ（Ｐ１９７Ｓ）変異がスル
ホメチュロンメチルへの高い耐性を付与したことを示している。
ＮＨＥＪ指向性ＤＮＡ修復を使用する内因性ＡＨＡＳ遺伝子座での第１の逐次導入遺伝
子スタッキングのためのドナーＤＮＡの設計および合成
導入遺伝子スタッキングの第１のラウンドのためのｐＤＡＳ０００４３３構築物（図１
２）のドナーＤＮＡをＺＦＮ媒介、ＮＨＥＪ指向性修復を介する内因性ＡＨＡＳ遺伝子座
での的確なドナー組み込み（Ｓ６５３Ｎ変異を含有する）を促進するように実施例１０お
よび１１に記載のとおり設計および合成する。ＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）に抵抗性で
ある植物全体を得て、導入するための標的化の第２のラウンドのために調製する。
ＮＨＥＪ指向性ＤＮＡ修復を使用する内因性ＡＨＡＳ遺伝子座での第２の逐次導入遺伝
子スタックのためのドナーＤＮＡの設計および合成
導入遺伝子スタッキングの第２のラウンドのためのＰ１９７Ｓ変異を含有するドナーＤ
ＮＡ（ｐＤＡＳ０００４３４、図１３、配列番号７２）を、ＺＦＮ媒介、ＮＨＥＪ指向性
修復を介する第１の導入遺伝子スタックにおいて標的とされた同じＡＨＡＳ遺伝子座での
的確なドナー組み込みを促進するように設計する。設計は、ＺＦＮ３４４８０および３４
４８１（プラスミドｐＤＡＢ１１１８６０にコードされている）またはＺＦＮ３４４８２
および３４４８３（プラスミドｐＤＡＢ１１１８６１にコードされている）による第１の
スタックされた導入遺伝子を含有するＡＨＡＳ遺伝子コピーの切断により作られた二本鎖
ＤＮＡ切断での二本鎖ドナー分子の組み込みに基づく。ｐＤＡＳ０００４３４ドナー分子
は、ポリヌクレオチド配列のいくつかの部分を含む。５’末端は、標的ＺＦＮ切断部位か
ら開始し、ＡＨＡＳ終止コドンで終わるＤゲノムにコードされた内因性ＡＨＡＳ遺伝子と
ほとんど同一の配列を含有する。いくつかの計画的変異がこの配列に導入される：組み込
まれたドナーの再切断を妨げるためにＺＦＮ３４４８１および３４４８３の結合部位にわ
たって位置付けられたＰ１９７Ｓ変異およびコドン最適化、同義変異をコードする変異。
終止コドンに続くのは、ＡＨＡＳ同祖中の保存された３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）に対
応する３１６ｂｐの非コード配列である。３’ＵＴＲ配列には、ＺＦＮ３４４７４および
３４４７５（プラスミドｐＤＡＢ１１１８５７にコードされている）ならびにＺＦＮ３４
４７６および３４４７７（プラスミドｐＤＡＢ１１１８５８にコードされている）につい
てのジンクフィンガー結合部位が続く。これらのジンクフィンガー結合部位は、導入遺伝
子スタッキングの次のラウンドにおいて内因性遺伝子座に組み込まれたドナー由来ＡＨＡ
Ｓ（コードおよび３’ＵＴＲ）配列の自己切除を可能にする。自己切除ジンクフィンガー
結合部位には固有の制限エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接しているいくつかの追加的ジ
ンクフィンガー結合部位（それぞれは１００ｂｐの無作為配列によって分離されている）
が続き、導入遺伝子発現カセット（例えば、米国特許公開第２０１３０２０５４４０号に
記載のＤＧＴ−２８発現カセット）の挿入を可能にする。追加的ジンクフィンガー結合部
位は、逐次マーカーを含まない導入遺伝子スタッキング、または代替的スタッキング方法
を使用する同じ遺伝子位置での連続逐次導入遺伝子スタッキングによってＡＨＡＳ遺伝子
座に組み込まれてよい導入遺伝子の今後の切除を可能にする。ドナーカセットは、ＺＦＮ
３４４７４および３４４７５（プラスミドｐＤＡＢ１１１８５７にコードされている）ま
たはＺＦＮ３４４７６および３４４７７（プラスミドｐＤＡＢ１１１８５８にコードされ
ている）によって、内因性ＡＨＡＳ遺伝子座の切断において生成されるライゲーション突
出と適合性である突出した５’および３’末端を有するドナー分子の生成を可能にする追
加的隣接配列の短いストレッチを５’および３’末端に有して商業的遺伝子サービス業者
（例えば、ＧｅｎｅＡｒｔ、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって合成される。
突出した５’および３’末端を有するドナー分子を、当業者に公知の標準的方法を使用
して制限エンドヌクレアーゼＢｂｓＩでドナー分子を含有する、または「ＱＡ＿ｐＤＡＳ
０００４３４」および／もしくはｐＤＡＳ０００４３３について記載のＰＣＲ増幅に続い
てプラスミドＤＮＡを消化することによって生成する。
ＮＨＥＪ指向性ＤＮＡ修復を使用する小麦中の、内因性ＡＨＡＳ遺伝子座での外因性マ
ーカーを含まない、逐次導入遺伝子スタッキングのための形質転換系
同じ内因性ＡＨＡＳ遺伝子座でスタックされた複数の導入遺伝子を有するトランスジェ
ニック小麦事象は、ドナーｐＤＡＳ０００４３３ならびにＺＦＮ２９７３２および２９７
３０（プラスミドｐＤＡＢ１０９３５０にコードされている）での外因性マーカーを含ま
ない、形質転換を介する逐次導入遺伝子スタッキングによって産生される。的確なＺＦＮ
媒介ＮＨＥＪ指向性ドナー組み込みは、第１の導入遺伝子およびイミダゾリノンへの耐性
を付与するＳ６５３Ｎ変異をＡＨＡＳ遺伝子座に導入し、実施例５に記載のとおり、それ
によりＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）を選択薬剤として使用して正確に標的化された植物
の再生を可能にする。図１４ａは、組み込みを表す。第１の導入遺伝子がスタックされた
事象由来の小麦細胞のドナーｐＤＡＳ０００４３４ならびにＺＦＮ３４４８０および３４
４８１（プラスミドｐＤＡＢ１１１８６０にコードされている）での続く形質転換は、Ｐ
１９７の上流に位置付けられたＺＦＮ結合部位と、ドナー分子での第１の導入遺伝子スタ
ックの際に組み込まれた自己切除部位との間に位置付けられた内因性クロマチンの置き換
えを生じる。これは、第２の導入遺伝子および、スルホニル尿素への耐性を付与するＰ１
９７Ｓ変異の組み込みを生じ、それによりスルホメチュロンメチルを選択薬剤として使用
して正確に標的化された植物の再生を可能にする。同時に、第２のドナーの組み込みはＳ
６５３Ｎ変異を除去し、それによりイミダゾリノンへの感受性を回復させる（図１４ｂ）
。当業者は、第３の導入遺伝子のスタッキングが適切なジンクフィンガーヌクレアーゼ、
ならびに追加的導入遺伝子を含有し、スルホニル尿素への感受性およびイミダゾリノンへ
の耐性を付与するドナーでの形質転換により達成でき、それによりＩＭＡＺＡＭＯＸ（登
録商標）を選択薬剤として使用して正確に標的化された植物の再生を可能にすることを理
解する。したがって、逐次導入遺伝子スタッキングの連続ラウンドは、イミダゾリノンと
スルホニル尿素選択薬剤との間の差次的循環のために、内因性ＡＨＡＳ遺伝子に導入遺伝
子および変異を導入するドナーでの形質転換を介して可能である。
内因性ＡＨＡＳ遺伝子座に逐次的にスタックされた導入遺伝子を有する小麦植物を再生
するために使用される形質転換系は、未成熟接合子小麦胚の胚盤への微粒子銃媒介ＤＮＡ
送達のために既に記載された手法、または当業者に公知の手法を使用する小麦プロトプラ
ストへの直接ＤＮＡ送達、例えば、Heら(1994)Plant Cell Reorts 14:92-196の方法、ま
たは実施例１１に記載のいずれかの方法を使用することに基づく。
ＨＤＲ指向性ＤＮＡ修復を使用する内因性ＡＨＡＳ遺伝子座での第１の逐次導入遺伝子
スタッキングのためのドナーＤＮＡの設計および合成
第１のラウンドの導入遺伝子スタッキングのためのドナーＤＮＡをＺＦＮ媒介、ＨＤＲ
指向性相同修復を介する内因性ＡＨＡＳ遺伝子座での的確なドナー組み込みを促進するた
めに設計する。設計は、ＺＦＮ２９７３２および２９７３０（プラスミドｐＤＡＢ１０９
３５０にコードされている）による内因性ＡＨＡＳ遺伝子の同祖コピーの切断によって作
られた二本鎖ＤＮＡ切断の位置での二本鎖ドナー分子の組み込みに基づく。ドナー分子（
ｐＤＡＳ０００４３５、図１６、配列番号２９５）は、ｐＤＡＳ０００４３３と配列にお
いて同一である（図１２）。
ドナーカセットは、各末端に７５０ｂｐ相同腕を有して商業的遺伝子サービス業者（例
えば、ＧｅｎｅＡｒｔ、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓなど）によって合成される。ドナー
の５’および３’末端での相同腕は、ＺＦＮ２９７３２および２９７３０（プラスミドｐ
ＤＡＢ１０９３５０にコードされている）によって作られた二本鎖ＤＮＡ切断の直接上流
および下流の内因性ＡＨＡＳ配列に対応する。
ＨＤＲ指向性ＤＮＡ修復を使用する内因性ＡＨＡＳ遺伝子座での第２の逐次導入遺伝子
スタッキングのためのドナーＤＮＡの設計および合成
導入遺伝子スタッキングの第２のラウンドのためのドナーＤＮＡをＺＦＮ媒介、ＨＤＲ
指向性相同修復を介する第１の導入遺伝子スタックで標的化された同じＡＨＡＳ遺伝子座
での的確なドナー組み込みを促進するように設計する。設計は、ＺＦＮ３４４８０および
３４４８１（プラスミドｐＤＡＢ１１１８６０にコードされている）またはＺＦＮ３４４
８２および３４４８３（プラスミドｐＤＡＢ１１１８６１にコードされている）による第
１のスタックされた導入遺伝子を含有するＡＨＡＳ遺伝子コピーの切断によって作られた
二本鎖ＤＮＡ切断での二本鎖ドナー分子の組み込みに基づく。ドナー分子（ｐＤＡＳ００
０４３６、図１７、配列番号２９６）はｐＤＡＳ０００４３４と配列において同一である
（図１３）。
ドナーカセットは、各末端に７５０ｂｐ相同腕を有して商業的遺伝子サービス業者（例
えば、ＧｅｎｅＡｒｔ、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓなど）によって合成される。ドナー
の５’末端での相同腕は、ＺＦＮ３４４８０および３４４８１（プラスミドｐＤＡＢ１１
１８６０にコードされている）によって作られた二本鎖ＤＮＡ切断の直接上流の内因性Ａ
ＨＡＳ配列に対応する。ドナーの３’末端での相同腕は、第１の導入遺伝子スタック中に
組み込まれたドナーＤＮＡにおいてＺＦＮ３４４８０および３４４８１によって作られた
二本鎖ＤＮＡ切断に近接するＧＯＩ−１配列に対応する。
ＨＤＲ指向性ＤＮＡ修復を使用する小麦における内因性ＡＨＡＳ遺伝子座での外因性マ
ーカーを含まない、逐次導入遺伝子スタッキングのための形質転換系
同じ内因性ＡＨＡＳ遺伝子座でスタックされた複数の導入遺伝子を有するトランスジェ
ニック小麦事象をドナーｐＤＡＳ０００４３５ならびにＺＦＮ２９７３２および２９７３
０（プラスミドｐＤＡＢ１０９３５０にコードされている）での形質転換を介して形質を
コードしている導入遺伝子の外因性トランスジェニックマーカーを含まない（トランスジ
ェニックマーカーを使用しない）逐次スタッキングによって産生する。的確なＺＦＮ媒介
、ＨＤＲ指向性ドナー組み込みは、第１の導入遺伝子およびイミダゾリノンへの耐性を付
与するＳ６５３Ｎ変異をＡＨＡＳ遺伝子座に導入し、それにより実施例５に既に記載のと
おりＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）を選択薬剤として使用して正確に標的化された植物の
再生を可能にする。図１５ａは、組み込みを表す。第１の導入遺伝子がスタックされた事
象由来の小麦細胞のドナーｐＤＡＳ０００４３６ならびにＺＦＮ３４４８０および３４４
８１（プラスミドｐＤＡＢ１１１８６０にコードされている）での続く形質転換は、Ｐ１
９７の上流に位置付けられたＺＦＮ結合部位と、ドナー分子での第１の導入遺伝子スタッ
クの際に組み込まれた自己切除部位の間に位置付けられた内因性クロマチンの置き換えを
生じる。これは、第２の導入遺伝子および、スルホニル尿素への耐性を付与するＰ１９７
Ｓ変異の組み込みを生じる。結果として、第２の導入遺伝子の組み込みは、スルホメチュ
ロンメチルを選択薬剤として使用して正確に標的化された植物の再生を可能にする。同時
に、第２のドナーの組み込みはＳ６５３Ｎ変異を除去し、それによりイミダゾリノンへの
感受性を回復させる（図１５ｂ）。当業者に明らかであるとおり、第３の導入遺伝子のス
タッキングは適切なジンクフィンガーヌクレアーゼ、ならびに追加的導入遺伝子を含有し
、スルホニル尿素への感受性およびイミダゾリノンへの耐性を付与するドナーでの形質転
換により達成でき、それによりＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）を選択薬剤として使用して
正確に標的化された植物の再生を可能にする。したがって、逐次導入遺伝子スタッキング
の連続ラウンドは、イミダゾリノンとスルホニル尿素選択薬剤との間の差次的循環のため
に、内因性ＡＨＡＳ遺伝子に導入遺伝子および変異を導入するドナーでの形質転換を介し
て可能である。
内因性ＡＨＡＳ遺伝子座で逐次的にスタックされた導入遺伝子を有する小麦植物を再生
するために使用される形質転換系は、未成熟接合子小麦胚の胚盤への微粒子銃媒介ＤＮＡ
送達について既に記載された手法、または当業者に公知である手法を使用する小麦プロト
プラストへの直接ＤＮＡ送達、例えば、Heら(1994)Plant Cell Reorts 14:92-196、また
は実施例１１に記載のいずれかの方法を使用することに基づく。
小麦中の選択不可能な形質遺伝子座での外因性マーカーを含まないゲノム編集のための
形質転換系の開発
内因性遺伝子座の的確なゲノム改変は、形質発現を改変するために効果的な手法を提供
する。１つまたは複数の選択不可能な内因性形質遺伝子座での的確なゲノム改変を含む外
因性マーカーを含まない形質転換事象の生成は、収穫物の改善のための新しいおよび新規
の高価値対立遺伝子を作る機会を提供する。本明細書で本発明者らは、組み込みおよび非
組み込み形質改変の両方に適合できる小麦中の選択不可能な形質遺伝子座でのＺＦＮ媒介
、外因性マーカーを含まない、的確なゲノム編集のための形質転換系の開発を記載する。
形質転換系は、２ステップ工程に基づいている。第１のステップでは、ＺＦＮ媒介する
的確なゲノム改変を植物ゲノム中の２つの独立の遺伝子座を同時に改変するために使用す
る、一方の遺伝子座は選択可能マーカーへの耐性を付与するために改変し、他方は目的の
選択不可能な形質について発現を変更するために改変する。両方の遺伝子座で同時編集さ
れた形質転換Ｔ０事象は、導入された外因性選択可能マーカーについて選択することによ
って生成される。第２のステップでは、改変された形質遺伝子座だけを有するマーカーを
含まない事象が、隔離しているＴ１植物のＰＣＲスクリーニングによって回収される。手
法は、選択不可能な内因性遺伝子の切除、または選択不可能な内因性遺伝子のヌクレオチ
ド配列の書き換え（編集）のいずれかを生じる非組み込みの的確なゲノム改変に適合でき
る。代替的に、手法は、選択不可能な内因性遺伝子の機能が変更されている組み込みの的
確なゲノム改変に適合できる。さらに広くみると、手法は、既に組み込まれた外因性ＤＮ
Ａ、例えば導入遺伝子が、切除されている非組み込みの的確なゲノム改変に適合できる。
小麦中の内因性ＡＨＡＳ遺伝子を、小麦中の選択不可能な形質遺伝子座での外因性マー
カーを含まない的確なゲノム編集のための形質転換系を確立し、検証するためのモデル遺
伝子座として選択した。
ＺＦＮ媒介ＮＨＥＪ指向性ＡＨＡＳ遺伝子編集のためのドナーＤＮＡの調製
ドナーＤＮＡ分子、ｐＤＡＳ０００２６７（配列番号８４および配列番号８５）を実施
例６に記載のとおり設計および合成した。簡潔には、ドナーＤＮＡは、ＺＦＮ２９７３２
および２９７３０（プラスミドｐＤＡＢ１０９３５０にコードされている）による内因性
ＡＨＡＳ遺伝子の同祖コピーの切断によって作られた二本鎖ＤＮＡ切断の位置に組み込ま
れるように設計された９５ｂｐ二本鎖分子からなった。ｐＤＡＳ０００２６７構築物は、
２つの部分からなった。５’末端は、標的ＺＦＮ切断部位から開始し、ＡＨＡＳ終止コド
ンで終了するＤゲノムにコードされた内因性ＡＨＡＳ遺伝子とほとんど同一の配列を含有
した。６個の意図的変異をこの配列に導入した：Ｓ６５３Ｎ変異をコードした２個の変異
（ＡＧＣ→ＡＡＴ）、４個の同義変異（サイレント変異をドナー配列に組み入れた）。ド
ナー分子の３’末端は、ＺＦＮ媒介ＮＨＥＪ指向性遺伝子編集事象を検出するための診断
用ＰＣＲのために使用できる固有の配列を含有した。ドナー分子を、ＺＦＮ媒介ＮＨＥＪ
指向性ＤＮＡ修復を促進するためのライゲーション突出を提供するために突出した５’お
よび３’末端を有して設計した。
ＺＦＮ構築物ＤＮＡの調製
ＺＦＮ２９７３２および２９７３０をコードしているｐＤＡＢ１０９３５０（図１）に
ついてのプラスミドＤＮＡを大腸菌（E. coli）の培養物からＰＵＲＥ ＹＩＥＬＤ Ｐ
ＬＡＳＭＩＤ ＭＡＸＩＰＲＥＰ ＳＹＳＴＥＭ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒ
ｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を製造業者の説明書に従って使用して調製し
た。
ＰＡＴ選択カセットをコードするバイナリーベクターの設計および産生
標準的クローニング方法をバイナリーベクターｐＤＡＳ０００００４（配列番号３０３
、図１８）を構築するために使用した。ＰＡＴ選択カセットは、イネ（Oryza sativa）由
来のアクチン（Ａｃｔ１）遺伝子由来のプロモーター、５’非翻訳領域およびイントロン
からなり（McElroyら、(1990)The Plant Cell、2(2):163-171）、ストレプトマイセス・
ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridochromogenes）から単離され、ホスフィノトリ
シン、グルホシネートおよびビアラホスを含むグルタミン合成酵素の阻害剤への抵抗性を
付与するタンパク質をコードするホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡ
Ｔ）遺伝子の合成、植物最適化バージョンが続く（Wohllebenら、(1988)Gene、70(1):25-
37）。このカセットは、カリフラワーモザイクウイルス（cauliflower mosaic virus）（
ＣａＭＶ）の３５ｓ遺伝子由来の転写終結因子およびポリアデニル化部位を含む３’ＵＴ
Ｒで終結した（Chenaultら、(1993)Plant Physiology、101(4):1395-1396）。
選択カセットは、商業的遺伝子合成供給業者（ＧｅｎｅＡｒｔ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓなど）によって合成され、Ｇａｔｅｗａｙ−ｅｎａｂｌｅｄバイナリーベ
クターにクローニングした。アセンブルされたプラスミドのコロニーは、Ｎｅｗ Ｅｎｇ
ｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓおよびＰｒｏｍｅｇａから得た制限エンドヌクレアーゼを使用
するミニプレップＤＮＡの制限消化によってスクリーニングした。プラスミド調製をＱＩ
ＡＰＲＥＰ ＳＰＩＮ ＭＩＮＩＰＲＥＰ ＫＩＴ（商標）を製造業者の説明書に従って
使用して実施した。選択されたクローンのプラスミドＤＮＡをＡＢＩ Ｓａｎｇｅｒ Ｓ
ｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ＢＩＧ ＤＹＥ ＴＥＲＭＩＮＡＴＯＲ ｖ３．１（商標
）サイクル配列決定プロトコール（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して配列決定した。配列データをＳＥＱＵＥＮＣＨＥ
Ｒ（商標）ソフトウェア（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｎｎ Ａ
ｒｂｏｒ、ＭＩ）を使用してアセンブルおよび分析した。トランスフェクションのために
使用したプラスミドＤＮＡを大腸菌（E. coli）の培養物からＰＵＲＥ ＹＩＥＬＤ Ｐ
ＬＡＳＭＩＤ ＭＡＸＩＰＲＥＰ ＳＹＳＴＥＭ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒ
ｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を製造業者の説明書に従って使用して調製し
た。
選択不可能な内因性形質遺伝子座での的確なゲノム改変を有する、外因性マーカーを含
まない小麦植物を生成するための微粒子銃媒介形質転換系
ドナー小麦系統栽培品種Ｂｏｂｗｈｉｔｅ ＭＰＢ２６ＲＨ由来の未成熟接合子胚の合
計２，３２０個の胚盤を、既に記載のとおり微粒子銃媒介ＤＮＡ送達のために調製した。
ＤＮＡコート金粒子をドナーｐＤＡＳ０００２６７およびプラスミドｐＤＡＢ１０９３５
０、２．５μｇ（それぞれモル比７：１）ならびにプラスミドｐＤＡＳ０００００４、２
．５μｇを含むＤＮＡ混合物を使用して上に記載のとおり調製した。
照射に続いて、トランスフェクトされた胚盤をカルス誘導のための培地に移す前に２６
℃、暗所、１６時間インキュベートした。胚盤を暗所、カルス誘導培地で、２４℃、２週
間培養した。生じたカルスを新鮮カルス誘導培地に１回継代培養し、同じ条件にさらに２
週間保った。ＳＥＣを５ｍｇ／ｍｌ ＢＡＳＴＡ（登録商標）を含有する植物再生培地に
移し、２週間、２４℃、１６／８（明／暗）時間光周期下、育生室で培養した。再生され
た小植物を５ｍｇ／ｍｌ ＢＡＳＴＡ（登録商標）を含有する発根培地に移し、同じ条件
下で２〜３週間培養した。根を産生している再生された小植物は、植物ゲノムに無作為に
挿入されたＰＡＴ選択カセットの１つまたは複数のコピーを有すると予測された。これら
の小植物の根を除去し、植物を２００ｎＭ ＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）を含有する発
根培地で同じ条件下で２〜３週間再び継代培養した。再増殖した根を有する植物は、内因
性ＡＨＡＳ遺伝子の１つまたは複数のコピーにＳ６５３Ｎ変異（ｐＤＡＳ０００２６７の
的確な組み込みから生じる）を有すると予測された。
ＢＡＳＴＡ（登録商標）を含有する発根培地で強い根の増殖を産生する合計１７０個の
小麦植物を、ドナー小麦系統栽培品種Ｂｏｂｗｈｉｔｅ ＭＰＢ２６ＲＨ由来の未成熟接
合子胚の胚盤２，３２０個のトランスフェクションから得た。これらのうち２個の小麦植
物は、ＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）を含有する発根培地に移した場合に根を産生した。
これらの植物を土に移し、Ｔ１種子を産生するための温室封じ込め条件下で育生した。
小麦プロトプラストに基づく形質転換系での形質転換された事象の濃縮のためのＢＡＳ
ＴＡ（登録商標）化学的選択の最適化
一連の実験は、ＢＡＳＴＡ（登録商標）への耐性を付与するＰＡＴ遺伝子を発現してい
る小麦植物をQiaoら(1992)Plant Cell Reorts 11:262-265;AhmedおよびSagi(1993)Plant
Cell Reorts 12:175-179;Paukら(1994)Plant Cell,Tissue and Organ Culture 38:1-10;H
eら(1994)Plant Cell Reorts 14:92-196;GuおよびLang(1997)Plant Cell,Tissue and Org
an Culture 50:139-145;ならびにLiら(1999)Plant Cell,Tissue and Organ Culture 58:1
19-125によって記載されたものなどのプロトプラストに基づく形質転換系から再生するた
めの最適な選択条件を決定するために実施する。
ＢＡＳＴＡ（登録商標）選択条件を小麦系統栽培品種Ｂｏｂｗｈｉｔｅ ＭＰＢ２６Ｒ
Ｈの体細胞胚発生カルス（ＳＥＣ）由来細胞懸濁培養由来のプロトプラストを使用して最
適化する。Ｂｏｂｗｈｉｔｅ ＭＰＢ２６ＲＨ由来のプロトプラストは非全能性である（
即ち、植物全体を再生するためには使用できない）が、ＰＡＴ遺伝子を発現している事象
を濃縮するために確立された選択条件は、全能性小麦遺伝子型に基づく任意のプロトプラ
ストに基づく形質転換系に移すことができると予測される。実験を実施し、野生型ドナー
小麦系統栽培品種Ｂｏｂｗｈｉｔｅ ＭＰＢ２６ＲＨのＢＡＳＴＡ（登録商標）への基礎
的耐性を確立する。基礎的耐性より強いＢＡＳＴＡ（登録商標）選択条件の使用を、同定
し、ＰＡＴ遺伝子を発現している形質転換された細胞について選択するために使用した。
アガロースビーズ型培養およびＢＡＳＴＡ（登録商標）選択条件の確立
プロトプラストを確立されたＳＥＣ由来細胞懸濁培養から単離し、既に記載のとおりア
ガロースビーズ型培養を確立するために使用した。小麦系統栽培品種Ｂｏｂｗｈｉｔｅ
ＭＰＢ２６ＲＨのＢＡＳＴＡ（登録商標）への基礎的耐性を、０、０．５、２．５、５、
７．５、１０、２０、３０、４０および５０ｍｇ／Ｌ ＢＡＳＴＡ（登録商標）を補充し
た培地でアガロースビーズ型培養物をインキュベートし、２週間後のカルス増殖の速度を
評価することによって決定する。カルス発生を大幅に遅らせるＢＡＳＴＡ（登録商標）濃
度（例えば２０ｍｇ／Ｌより高い）をＰＡＴ遺伝子を有する小麦細胞を濃縮および選択す
るために最適化する。
ＢＡＳＴＡ（登録商標）およびＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）耐性表現型を有する形質
転換された小麦植物の分子特徴付け
ＢＡＳＴＡ（登録商標）およびＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）除草剤耐性表現型の両方
を有する２個の小麦植物を、ｐＤＡＢ１０９３５０にコードされたＺＦＮ２９７３２およ
び２９７３０によって作られたゲノムの二重切断部位でのｐＤＡＳ０００２６７ドナーの
組み込みから生じたＳ６５３Ｎ変異を含有する内因性ＡＨＡＳ遺伝子を同定するために分
子的に特徴付けた。
２つの分子アッセイを、凍結乾燥葉組織から既に記載のとおりＤＮＥＡＳＹ（登録商標
）ＰＬＡＮＴ ＤＮＡ ＥＸＴＲＡＣＴＩＯＮ ＭＩＮＩ ＫＩＴ（商標）（Ｑｉａｇｅ
ｎ）で抽出したゲノムＤＮＡを使用して、各小麦植物について実施した。
第１の分子検査を、再生された小麦植物がＰＡＴ遺伝子の少なくとも１つの無作為に組
み込まれたコピーを有することを確認するために使用した。二重加水分解プローブｑＰＣ
Ｒアッセイ（ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）と同様）を六倍体小麦のＤゲノムから内因性単一
コピー遺伝子、ピューロインドリン−ｂ（Ｐｉｎｂ）遺伝子（Gautierら、(2000)Plant S
cience 1153、81-91、フォワードプライマー、リバースプライマーおよびプローブ配列に
ついてそれぞれ配列番号８９、配列番号９０および配列番号９１）およびｐＤＡＳ０００
００４に存在するアクチン（Ａｃｔ１）プロモーターの領域（フォワードプライマー、リ
バースプライマーおよびプローブ配列についてそれぞれ配列番号９２、配列番号９３およ
び配列番号９４）を増幅するために使用した。ｐＤＡＳ０００００４の存在および推定さ
れるコピー数についての評価をLivakおよびSchmittgen(2001)Methods 25(4):402-8に記載
の方法により実施した。結果から、小麦植物事象ｙｃ０６−９１１０−１およびｙｒ００
−９３１１−１のゲノムへのＰＡＴポリヌクレオチド配列の組み込みについての証拠をそ
れぞれ得た。
第２の分子検査を内因性ＡＨＡＳ遺伝子でのＺＦＮ媒介ＮＨＥＪ指向性ドナー組み込み
についてのサブ遺伝子位置および結果を特徴付けるために使用した。プライマーＡＨＡＳ
ｓ６５３ＺＦＮ．Ｆ２およびＡＨＡＳｓ６５３ＺＦＮ．Ｒ１（配列番号３０１および３０
２、表１８）でのＰＣＲを内因性ＡＨＡＳ遺伝子の３つそれぞれの同祖コピーからのＤＮ
Ａ断片を増幅するために使用した。増幅断片は、ＺＦＮ２９７３２および２９７３０（プ
ラスミドｐＤＡＢ１９０３５０にコードされている）についての結合部位を含有する領域
を含有し、ゲノムのヌクレオチド配列のバリエーションを含む。十分なゲノムのヌクレオ
チド配列のバリエーションがＡＨＡＳ同祖の間を識別するために含まれており、生じた増
幅産物は、それらが由来した小麦サブゲノムに（配列レベルで）明確に帰属できた。生じ
た増幅産物を実施例１２に記載のとおりディープシーケンシングのために調製し、製造業
者の説明書に従って、２５０ｂｐ末端対の配列リードを生成するＩｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉ
ＳＥＱ（商標）装置で配列決定した。得られた配列リードを、各リードを試料に（バーコ
ードインデックスに基づいて）およびそれらが由来したサブゲノムに（ヌクレオチドのバ
リエーションに基づいて、ＡＨＡＳ遺伝子の同祖コピー間を識別する）割り当てるために
既に記載のとおり計算的に処理した。実施例９に記載のとおり、ｐＤＡＳ０００２６７の
内因性ＡＨＡＳ遺伝子座への組み込みは、野生型（未改変）と生じたトランスジェニック
（改変された）対立遺伝子との間で９５ｂｐのサイズの差異を生じる。それにより、野生
型および改変ＡＨＡＳ遺伝子遺伝子座の両方のＰＣＲ増幅が予測される。カスタム開発Ｐ
ＥＲＬスクリプトおよびＭＩＣＲＯＳＯＦＴ ＥＸＣＥＬ ２０１０（商標）（Ｍｉｃｒ
ｏｓｏｆｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）での手動データ操作をサブ遺伝子位置および内因
性ＡＨＡＳ遺伝子へのドナー組み込みの結果を特徴付けるために使用した。
第２の分子アッセイの結果から、内因性ＡＨＡＳ遺伝子座での的確なＺＦＮ媒介ＮＨＥ
Ｊ指向性遺伝子編集についての決定的証拠を、両方の小麦植物について実証した。事象ｙ
ｃ０６−９１１０−１は、完全な半接合性ドナー組み込みをＢゲノムに有した（表２４）
。事象ｙｒ００−９３１１−１は、複数のサブゲノムへの同時ドナー組み込みを有した。
Ａゲノムにおいては、両方の内因性ＡＨＡＳ遺伝子座の独立した編集が観察された。一方
の対立遺伝子は、ＡＨＡＳ除草剤耐性表現型の発現に関するＳ６５３Ｎ変異の予測される
組み込みを生じる部分的ドナー組み込みを有した。しかし、２４ｂｐヌクレオチドにわた
る断片がドナー分子の３’末端から欠失されていた。他方の対立遺伝子は、由来不明の５
１ｂｐポリヌクレオチド配列の組み込みを有した。Ｂゲノムに由来する配列リードは得ら
れず、大きなポリヌクレオチド配列の各内因性ＡＨＡＳ遺伝子座（表２４）への独立の組
み込みを示唆している。２つの再生された小麦植物について各サブゲノムに存在する対立
遺伝子についての共通配列は、配列番号３０４〜３１３として示されている。両方の小麦
植物事象においてｐＤＡＳ００００００４に由来する配列の証拠がないことは、ＢＡＳＴ
Ａ（登録商標）へ耐性を付与するＰＡＴ遺伝子が植物ゲノム中の異なる遺伝子座に無作為
に組み込まれたことを示している。
Figure 0006886433
これらの結果は、１つまたは複数の選択不可能な形質遺伝子座での的確なゲノム改変を
有する外因性マーカーを含まない小麦植物を生成するために利用できる形質転換方法を初
めて開示する。イミダゾリノンクラス除草剤への耐性を付与するＳ６５３Ｎ変異をコード
する、組み込まれたＡＨＡＳドナーポリヌクレオチドを含む小麦植物を例示する。当業者
に理解されるとおり、外因性トランスジェニック選択可能マーカー（例えば、ＰＡＴ）を
含まない小麦植物は、ＰＡＴまたは改変ＡＨＡＳ遺伝子のいずれかに特異的なＰＣＲアッ
セイを使用してこれらの事象由来のＴ１植物をスクリーニングすることによって回収でき
る。
本明細書に述べる全ての特許、特許出願および刊行物は、その全体が参照により本明細
書に組み入れられる。
開示は、理解の明確さの目的のために例示および例によっていくらか詳細に提供されたが、種々の変更および改変が開示の精神および範囲から逸脱することなく実行され得ることは当業者に明らかである。したがって、前述の記載および例は限定として解釈されるべきではない。
本発明は以下を提供する。
＜１＞
植物細胞中の内因性遺伝子の１つまたは複数の対立遺伝子に対する標的化ゲノム改変を含む植物細胞であって、前記ゲノム改変が、部位特異的ヌクレアーゼによる切断に続き、前記ゲノム改変が、内因性遺伝子において変異を生じ、その結果、前記内因性遺伝子が、除草剤耐性植物細胞をもたらす産物を産生する、植物細胞。
＜２＞
前記ゲノム改変が、１つまたは複数の外因性配列の組み込みを含む、＜１＞に記載の植物細胞。
＜３＞
前記ゲノム改変が、前記内因性遺伝子の発現を破壊する１つまたは複数のインデルの導入を含む、＜１＞に記載の植物細胞。
＜４＞
前記ゲノム改変を伴う前記内因性遺伝子が、スルホニル尿素除草剤に対する耐性を付与するタンパク質をコードする、＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の植物細胞。
＜５＞
前記ゲノム改変を伴う前記内因性遺伝子が、イミダゾリノン除草剤に対する耐性を付与するタンパク質をコードする、＜１＞から＜３＞に記載の植物細胞。
＜６＞
前記外因性配列が、トランスジェニックの選択可能マーカーをコードしない、＜２＞に記載の植物細胞。
＜７＞
前記外因性配列が、収穫量を増加させるタンパク質、疾患抵抗性をコードするタンパク質、成長を増加させるタンパク質、昆虫抵抗性をコードするタンパク質、除草剤耐性をコードするタンパク質、およびこれらの組合せからなる群から選択されるタンパク質をコードする、＜２＞に記載の植物細胞。
＜８＞
前記収穫量の増加が、果実収量、穀物収量、バイオマス、果肉含量、サイズ、乾燥重量、固形含量、重量、色強度、色の均一性、化学的特性の変化、またはこれらの組合せにおける増加を含む、＜７＞に記載の植物細胞。
＜９＞
前記内因性遺伝子が、内因性アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）遺伝子である、＜１＞から＜８＞のいずれかに記載の植物細胞。
＜１０＞
２つ以上の外因性配列が、前記内因性遺伝子中に組み込まれている、＜２＞に記載の植物細胞。
＜１１＞
倍数体植物細胞である、＜１＞から＜１０＞のいずれかに記載の植物細胞。
＜１２＞
前記部位特異的ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよびＦｏｋＩ切断ドメインを含む、＜１＞から＜１１＞のいずれかに記載の植物細胞。
＜１３＞
前記ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインが、配列番号３５〜５６および２６３〜２７８からなる群から選択される標的部位に結合するタンパク質をコードする、＜１２＞に記載の植物細胞。
＜１４＞
前記植物が、小麦、大豆、トウモロコシ、ジャガイモ、アルファルファ、イネ、オオムギ、ヒマワリ、トマト、シロイヌナズナ（Arabidopsis）、綿、アブラナ（Brassica）種、およびオオアワガエリからなる群から選択される、＜１＞から＜１３＞のいずれかに記載の植物細胞。
＜１５＞
＜１＞から＜１４＞のいずれかに記載の１つまたは複数の植物細胞を含む植物、植物部分、種子、または果実。
＜１６＞
前記内因性遺伝子とは異なる１つまたは複数の遺伝子座で、前記植物細胞のゲノム中に組み込まれた１つまたは複数の導入遺伝子をさらに含む、＜１＞から＜１４＞のいずれかに記載の植物細胞。
＜１７＞
＜１＞から＜１６＞のいずれかに記載の植物細胞を作製するための方法であって、
前記植物細胞において１つまたは複数の部位特異的ヌクレアーゼを発現させるステップ；および
倍数体植物細胞の複数のゲノムにわたり内因性遺伝子の１つまたは複数の対立遺伝子を改変するステップ
を含む、方法。
＜１８＞
前記内因性遺伝子が、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）遺伝子である、＜１７＞に記載の方法。
＜１９＞
前記改変が、前記内因性遺伝子の発現を破壊する、＜１７＞または＜１８＞に記載の方法。
＜２０＞
前記改変が、前記内因性遺伝子の１つまたは複数の対立遺伝子中への１つまたは複数の外因性配列の組み込みを含む、＜１７＞に記載の方法。
＜２１＞
＜１７＞から＜２０＞のいずれかに記載の方法により産生される１つまたは複数の植物細胞を含む植物、植物部分、種子、または果実。
＜２２＞
配列番号３５〜５６および２６３〜２７８からなる群から選択される標的部位に結合するジンクフィンガータンパク質。
＜２３＞
表２または表１２の単一の列に示す認識ヘリックス領域を含む、＜２２＞に記載のジンクフィンガータンパク質。
＜２４＞
植物細胞のゲノム中に１つまたは複数の外因性配列を組み込む方法であって、
ａ）前記植物細胞において１つまたは複数の部位特異的ヌクレアーゼを発現させるステップであって、前記１つまたは複数のヌクレアーゼが、１つまたは複数の内因性遺伝子座の染色体ＤＮＡを標的とし切断する、ステップ；
ｂ）前記植物細胞の前記ゲノム内の前記１つまたは複数の内因性遺伝子座中に１つまたは複数の外因性配列を組み込むステップであって、前記１つまたは複数の内因性遺伝子座が改変され、その結果、内因性遺伝子が変異して、前記植物細胞において選択可能な表現型をもたらす産物を発現する、ステップ；および
ｃ）前記選択可能な表現型を発現する植物細胞を選択するステップであって、前記１つまたは複数の外因性配列を組み入れた植物細胞が選択される、ステップ
を含む、方法。
＜２５＞
前記１つまたは複数の外因性配列が、ドナーポリヌクレオチド、導入遺伝子、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される、＜２４＞に記載の方法。
＜２６＞
前記１つまたは複数の外因性配列の組み込みが、相同組換えまたは非相同末端結合によって起こる、＜２４＞または＜２５＞に記載の方法。
＜２７＞
前記１つまたは複数の外因性配列が、前記１つまたは複数の内因性遺伝子座中に同時にまたは連続的に組み入れられる、＜２４＞から＜２６＞のいずれかに記載の方法。
＜２８＞
前記１つまたは複数の内因性遺伝子座が、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）遺伝子を含む、＜２４＞から＜２７＞のいずれかに記載の方法。
＜２９＞
前記ＡＨＡＳ遺伝子が、倍数体ゲノムのＡ、Ｂ、またはＤゲノム上に位置する、＜２８＞に記載の方法。
＜３０＞
前記１つまたは複数の外因性配列が、前記ＡＨＡＳ遺伝子中に組み込まれる、＜２８＞に記載の方法。
＜３１＞
前記１つまたは複数の外因性配列が、Ｓ６５３Ｎ ＡＨＡＳ変異をコードする、＜３０＞に記載の方法。
＜３２＞
前記１つまたは複数の外因性配列が、Ｐ１９７Ｓ ＡＨＡＳ変異をコードする、＜３０＞に記載の方法。
＜３３＞
前記部位特異的ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬエフェクタードメインヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、およびＣｒｉｓｐｒ／ＣａｓシングルガイドＲＮＡヌクレアーゼからなる群から選択される、＜２４＞から＜３２＞のいずれかに記載の方法。
＜３４＞
前記部位特異的ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよびＦｏｋＩ切断ドメインを含む、＜３３＞に記載の方法。
＜３５＞
前記１つまたは複数の外因性配列が、導入遺伝子をコードする、またはＲＮＡ分子を産生する、＜２４＞から＜３４＞のいずれかに記載の方法。
＜３６＞
前記導入遺伝子が、収穫量を増加させるタンパク質、疾患抵抗性をコードするタンパク質、成長を増加させるタンパク質、昆虫抵抗性をコードするタンパク質、除草剤耐性をコードするタンパク質、およびこれらの組合せからなる群から選択されるタンパク質をコードする、＜３５＞に記載の方法。
＜３７＞
前記導入遺伝子の組み込みが、前記１つまたは複数の内因性遺伝子座の発現を破壊し、前記選択可能な表現型を生じる１つまたは複数のインデルの導入をさらに含む、＜３５＞または＜３６＞に記載の方法。
＜３８＞
ｄ）前記１つまたは複数の外因性配列を含む前記選択された植物細胞を培養するステップ；および
ｅ）前記植物ゲノムの前記１つまたは複数の内因性遺伝子座内に組み込まれた前記１つまたは複数の外因性配列を含む植物全体を得るステップ
をさらに含む、＜２４＞から＜３７＞のいずれかに記載の方法。
＜３９＞
イミダゾリノンを含む選択剤、またはスルホニル尿素選択剤を使用して、前記植物細胞を選択する、＜２４＞から＜３８＞のいずれかに記載の方法。
＜４０＞
前記植物ゲノムの前記１つまたは複数の内因性遺伝子座内に組み込まれた前記１つまたは複数の外因性配列を含む前記植物全体が、前記植物ゲノムの前記内因性遺伝子座内に追加の外因性配列を組み入れるようにさらに改変される、＜３８＞に記載の方法。
＜４１＞
前記１つまたは複数の外因性配列が、トランスジェニック選択可能マーカーをコードしない、＜３８＞に記載の方法。

Claims (10)

  1. ジンクフィンガータンパク質を含むジンクフィンガーヌクレアーゼであって、
    前記ジンクフィンガータンパク質の標的部位が、配列番号３５〜５６または２６３〜２７８のいずれか１つに示される、内因性アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）遺伝子中の配列を含み、
    前記ジンクフィンガータンパク質が、４〜６個のジンクフィンガードメインを含み、
    各ジンクフィンガードメインが認識ヘリックス領域を含み、
    前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、次のように順序付けられた、配列番号１８１、１８２、１８２、１８３、１８４および１８５に示される認識ヘリックス領域を含み、配列番号３５の標的部位またはその近くで切断する；
    前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、次のように順序付けられた、配列番号１８６、１８７、１８８、１８９、１９０および１９１に示される認識ヘリックス領域を含み、配列番号３６の標的部位またはその近くで切断する；
    前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、次のように順序付けられた、配列番号１８２、１８３、１８４、１８５、１９２および１９３に示される認識ヘリックス領域を含み、配列番号３７の標的部位またはその近くで切断する；
    前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、次のように順序付けられた、配列番号１８２、１８３、１８４、１８５、１９４および１９５に示される認識ヘリックス領域を含み、配列番号３８の標的部位またはその近くで切断する；
    前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、次のように順序付けられた、配列番号１９６、１９７、１９８、１９９および２００に示される認識ヘリックス領域を含み、配列番号３９の標的部位またはその近くで切断する；
    前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、次のように順序付けられた、配列番号２０１、２０２、１８６、１８７、１８８および１８９に示される認識ヘリックス領域を含み、配列番号４０の標的部位またはその近くで切断する；
    前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、次のように順序付けられた、配列番号１８４、１８５、１９４、１９５、２０３および２０４に示される認識ヘリックス領域を含み、配列番号４１の標的部位またはその近くで切断する；
    前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、次のように順序付けられた、配列番号２０１、２０２、１９６、１９７および１９８に示される認識ヘリックス領域を含み、配列番号４２の標的部位またはその近くで切断する；
    前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、次のように順序付けられた、配列番号２０５、２０６、１９９、２０７、１９９および２０８に示される認識ヘリックス領域を含み、配列番号４３の標的部位またはその近くで切断する；
    前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、次のように順序付けられた、配列番号１９４、２０９、２１０、２１１および２１２に示される認識ヘリックス領域を含み、配列番号４４の標的部位またはその近くで切断する；
    前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、次のように順序付けられた、配列番号２１３、２１４、１８２、２１５および２１６に示される認識ヘリックス領域を含み、配列番号４５の標的部位またはその近くで切断する；
    前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、次のように順序付けられた、配列番号２０５、２１７、２１８、２１９および２２０に示される認識ヘリックス領域を含み、配列番号４６の標的部位またはその近くで切断する；
    前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、次のように順序付けられた、配列番号２２１、２２２、１９９、２０７および１８４に示される認識ヘリックス領域を含み、配列番号４７の標的部位またはその近くで切断する；
    前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、次のように順序付けられた、配列番号２２３、２２４、２２５および２２６に示される認識ヘリックス領域を含み、配列番号４８の標的部位またはその近くで切断する；
    前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、次のように順序付けられた、配列番号２２７、２２８、２２９、２３０および２３１に示される認識ヘリックス領域を含み、配列番号４９の標的部位またはその近くで切断する；
    前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、次のように順序付けられた、配列番号２２３、２２４、２２５および２２６に示される認識ヘリックス領域を含み、配列番号５０の標的部位またはその近くで切断する；
    前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、次のように順序付けられた、配列番号１８４、２３２、２３３、２３４および１８６に示される認識ヘリックス領域を含み、配列番号５１の標的部位またはその近くで切断する；
    前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、次のように順序付けられた、配列番号２０４、２２３、２２４、２２５または２２６に示される認識ヘリックス領域を含み、配列番号５２の標的部位またはその近くで切断する；
    前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、次のように順序付けられた、配列番号２０４、２２３、２２４、１９２および２３５に示される認識ヘリックス領域を含み、配列番号５３の標的部位またはその近くで切断する；
    前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、次のように順序付けられた、配列番号１８４、２３２、２３３、２３４および３４に示される認識ヘリックス領域を含み、配列番号５４の標的部位またはその近くで切断する；
    前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、次のように順序付けられた、配列番号１８４、３３、２３３、３２および２２３に示される認識ヘリックス領域を含み、配列番号５５の標的部位またはその近くで切断する；
    前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、次のように順序付けられた、配列番号３１、３０、１９２、２９、２３３および２８に示される認識ヘリックス領域を含み、配列番号５６の標的部位またはその近くで切断する；
    前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、次のように順序付けられた、配列番号２２７、１８２、１８２、２３６、２３７および１８２に示される認識ヘリックス領域を含み、配列番号２６３の標的部位またはその近くで切断する；
    前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、次のように順序づけられた、配列番号１８４、２３８、１８２、２３９および２４０に示される認識ヘリックス領域を含み、配列番号２６４の標的部位またはその近くで切断する；
    前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、次のように順序付けられた、配列番号２４１、２４２、２４３、２３３および２４４に示される認識ヘリックス領域を含み、配列番号２６５の標的部位またはその近くで切断する；
    前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、次のように順序付けられた、配列番号１８４、２４５、１８２、２４６、２２７および２４７に示される認識ヘリックス領域を含み、配列番号２６６の標的部位またはその近くで切断する；
    前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、次のように順序付けられた、配列番号２２７、１９８、２３７、１８２、２１８および２４８に示される認識ヘリックス領域を含み、配列番号２６７の標的部位またはその近くで切断する；
    前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、次のように順序付けられた、配列番号２１９、２４９、２１０、２５０、２３７および２２４に示される認識ヘリックス領域を含み、配列番号２６８の標的部位またはその近くで切断する；
    前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、次のように順序付けられた、配列番号２３７、１８２、２１８、２４８および１９８に示される認識ヘリックス領域を含み、配列番号２６９の標的部位またはその近くで切断する；
    前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、次のように順序付けられた、配列番号２４９、７３、２０１、２１６、２３３および２５１に示される認識ヘリックス領域を含み、配列番号２７０の標的部位またはその近くで切断する；
    前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、次のように順序付けられた、配列番号２１８、２４８、２３３、１８４および１９８に示される認識ヘリックス領域を含み、配列番号２７１の標的部位またはその近くで切断する；
    前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、次のように順序付けられた、配列番号２３７、２４９、２５２、２５３および２１６に示される認識ヘリックス領域を含み、配列番号２７２の標的部位またはその近くで切断する；
    前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、次のように順序付けられた、配列番号２５４、２５５、２２４、２５６および２０５に示される認識ヘリックス領域を含み、配列番号２７３の標的部位またはその近くで切断する；
    前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、次のように順序付けられた、配列番号２５２、２５３、２０３、２５４、２３７および２２４に示される認識ヘリックス領域を含み、配列番号２７４の標的部位またはその近くで切断する；
    前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、次のように順序付けられた、配列番号２５５、２２４、２５６、２０５、２４９および２５７に示される認識ヘリックス領域を含み、配列番号２７５の標的部位またはその近くで切断する；
    前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、次のように順序付けられた、配列番号２２４、２５２、２５３、２０３および２５４に示される認識ヘリックス領域を含み、配列番号２７６の標的部位またはその近くで切断する；
    前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、次のように順序付けられた、配列番号２５８、２５４、２２１、２５９、２６０および２６１に示される認識ヘリックス領域を含み、配列番号２７７の標的部位またはその近くで切断する；または、
    前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、次のように順序付けられた、配列番号２１６、２５９、２１８、２１９および２６２に示される認識ヘリックス領域を含み、配列番号２７８の標的部位またはその近くで切断する、ジンクフィンガーヌクレアーゼ。
  2. 配列番号３５〜５６または２６３〜２７８のいずれか１つに示される配列を含む内因性ＡＨＡＳ遺伝子を含む植物細胞のゲノム中に、１つまたは複数の外因性配列を組み込む方法であって、
    ａ）請求項１に記載のジンクフィンガーヌクレアーゼの１つまたは複数を発現させて、その結果、前記内因性ＡＨＡＳ遺伝子を切断させるステップ；
    ｂ）前記植物細胞の前記ゲノム内の前記内因性ＡＨＡＳ遺伝子座に１つまたは複数の外因性配列を組み込むステップであって、該内因性ＡＨＡＳ遺伝子座が改変され、その結果、前記内因性ＡＨＡＳ遺伝子が変異して、前記植物細胞においてイミダゾリノン除草剤またはスルホニル尿素除草剤に対する耐性をもたらす産物を発現する、ステップ；および
    ｃ）イミダゾリノン除草剤またはスルホニル尿素除草剤に対する耐性を示す植物細胞を選択するステップであって、前記１つまたは複数の外因性配列を組み入れた植物細胞が選択される、ステップ；
    を含む、方法。
  3. 前記１つまたは複数の外因性配列の組み込みが、相同組換えまたは非相同末端結合によって起こる、請求項２に記載の方法。
  4. 前記１つまたは複数の外因性配列が、前記内因性ＡＨＡＳ遺伝子座中に同時にまたは連続的に組み入れられる、請求項２または３に記載の方法。
  5. 前記内因性ＡＨＡＳ遺伝子が、倍数体ゲノムのＡ、Ｂ、またはＤゲノム上に位置し、前記１つまたは複数の外因性配列が、イミダゾリノン除草剤に対する耐性を付与する変異ＡＨＡＳタンパク質をコードする、請求項２または３に記載の方法。
  6. 前記１つまたは複数の外因性配列が、導入遺伝子をコードする、またはＲＮＡ分子を産生し、
    前記導入遺伝子が、収穫量を増加させるタンパク質、疾患耐性を付与するタンパク質、成長を増加させるタンパク質、昆虫耐性を付与するタンパク質、除草剤耐性を付与するタンパク質、およびこれらの組合せからなる群より選択されるタンパク質をコードし、および／または、
    前記導入遺伝子の組込みが、前記１つまたは複数の内因性ＡＨＡＳ遺伝子の発現を破壊し、前記イミダゾリノン除草剤またはスルホニル尿素除草剤に対する耐性をもたらす産物を発現させる１つまたは複数のインデルの導入をさらに含む、請求項２〜５のいずれかに記載の方法。
  7. ｄ）前記１つまたは複数の外因性配列を含む前記選択された植物細胞を培養するステップ；および
    ｅ）前記植物ゲノムの前記１つまたは複数の内因性ＡＨＡＳ遺伝子座内に組み込まれた前記１つまたは複数の外因性配列を含む植物全体を得るステップ
    をさらに含む、請求項２〜６のいずれかに記載の方法。
  8. イミダゾリノンを含む選択剤、またはスルホニル尿素選択剤を使用して、前記植物細胞を選択する、請求項２〜７のいずれかに記載の方法。
  9. 前記植物ゲノムの前記１つまたは複数の内因性ＡＨＡＳ遺伝子座内に組み込まれた前記１つまたは複数の外因性配列を含む前記植物全体が、前記植物ゲノムの前記内因性ＡＨＡＳ遺伝子座内に追加の外因性配列を組み入れるようにさらに改変される、または、
    前記１つまたは複数の外因性配列が、トランスジェニック選択マーカーをコードしない、請求項７に記載の方法。
  10. 前記ステップｃ）において、前記１つまたは複数の外因性配列が、ドナーポリヌクレオチド、導入遺伝子、またはこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項２〜９のいずれかに記載の方法。
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