JP6874276B2 - Separator and column - Google Patents
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Description
本発明は、分離材及びカラムに関する。 The present invention relates to a separating material and a column.
従来、タンパク質に代表される生体高分子を分離精製する場合、一般的には合成高分子を母体とする多孔質型粒子、親水性天然高分子の架橋ゲルを母体とする粒子が用いられている。上記の多孔質型の合成高分子を母体とするイオン交換体は、塩濃度による体積変化が小さく、カラムに充填しクロマトグラフィーで用いた場合、通液時の耐圧性が良いといった利点を持っている。しかし、このイオン交換体は、タンパク質等の分離に用いた場合、疎水的相互作用に基づく不可逆吸着等の非特異吸着が起き、ピークの非対称化が発生したり、あるいは、該疎水的相互作用でイオン交換体に吸着されたタンパク質が吸着されたまま回収できない問題点があった。 Conventionally, when separating and purifying a biopolymer represented by a protein, generally, porous particles having a synthetic polymer as a base and particles having a crosslinked gel of a hydrophilic natural polymer as a base have been used. .. The above-mentioned ion exchanger based on a porous synthetic polymer has an advantage that the volume change due to salt concentration is small, and when it is packed in a column and used for chromatography, it has good pressure resistance during liquid passage. There is. However, when this ion exchanger is used for separating proteins and the like, non-specific adsorption such as irreversible adsorption based on hydrophobic interaction occurs, peak asymmetry occurs, or the hydrophobic interaction causes There is a problem that the protein adsorbed on the ion exchanger cannot be recovered while being adsorbed.
一方、デキストラン、アガロース等の多糖に代表される親水性天然高分子の架橋ゲルを母体とする上記のイオン交換体の場合、タンパク質の非特異吸着がほとんどないという利点がある。ところが、このイオン交換体は、水溶液中で著しく膨潤したり、溶液のイオン強度による体積変化及び、遊離酸形と負荷形との体積変化が大きく、機械的強度も充分ではないという欠点を有する。特に、架橋ゲルをクロマトグラフィーで使用する場合、通液時の圧力損失が大きく、通液によりゲルが圧密化するといった欠点がある。 On the other hand, the above-mentioned ion exchanger based on a crosslinked gel of a hydrophilic natural polymer typified by a polysaccharide such as dextran or agarose has an advantage that there is almost no non-specific adsorption of proteins. However, this ion exchanger has drawbacks that it swells remarkably in an aqueous solution, the volume change due to the ionic strength of the solution, and the volume change between the free acid type and the loaded type are large, and the mechanical strength is not sufficient. In particular, when the crosslinked gel is used for chromatography, there is a drawback that the pressure loss at the time of passing the liquid is large and the gel is consolidated by the passing of the liquid.
親水性天然高分子の架橋ゲルが持つ欠点を克服するため、いわば“骨格”となる剛直な物質と組み合わせる試みがこれまでになされている。 In order to overcome the drawbacks of cross-linked gels made of hydrophilic natural polymers, attempts have been made to combine them with rigid substances that form a so-called “skeleton”.
例えば特許文献１では、多孔性高分子の細孔内に天然高分子ゲル等のゲルを保持した複合体を、ペプチド合成の分野で用いるという記載があり、それにより反応性物質の負荷係数を高め、高収率で合成できることが発明の効果として挙げられている。しかもこの特許文献１では、硬質な合成高分子物質でゲルを包囲するため、カラムベッドの形態で使用しても、容積変化がなく、カラムを通過するフロースルーの圧力が変化しないという効果が挙げられている。
For example,
特許文献２及び３では、セライト等の無機多孔質体にデキストラン、セルロースといった多糖等のキセロゲルを保持させ、このゲルに収着性能を付加するためにジエチルアミノメチル（ＤＥＡＥ）基等を付与したものをヘモグロビンの除去に使用している。その効果として、カラムでの通液性の良さが挙げられている。 In Patent Documents 2 and 3, an inorganic porous material such as Celite retains a xerogel such as a polysaccharide such as dextran or cellulose, and a diethylaminomethyl (DEAE) group or the like is added to the gel in order to add sorption performance. It is used to remove hemoglobin. As an effect, good liquid permeability in the column is mentioned.
特許文献４では、いわゆるマクロネットワーク構造のコポリマの細孔を、モノマから合成した架橋共重合体のゲルで埋めたハイブリッドコポリマのイオン交換体が挙げられている。特許文献４では、架橋共重合体のゲルの架橋度が低い場合、圧力損失、体積変化等の問題があるが、ハイブリッドコポリマにすることで通液特性が改善され、圧力損失が少なくなること、また、イオン交換容量が向上し、リーク挙動が改善されることが記載されている。 Patent Document 4 mentions an ion exchanger of a hybrid copolymer in which the pores of a copolymer having a so-called macronetwork structure are filled with a gel of a crosslinked copolymer synthesized from a monoma. In Patent Document 4, when the degree of cross-linking of the cross-linked copolymer gel is low, there are problems such as pressure loss and volume change. However, by using a hybrid copolymer, the liquid passage characteristics are improved and the pressure loss is reduced. It is also described that the ion exchange capacity is improved and the leak behavior is improved.
また、有機合成ポリマ基体の細孔内に巨大網目構造を有する親水性天然高分子の架橋ゲルを充填した複合化充填材が提案されている（特許文献５及び６参照）。非特許文献１では、ポリスチレン−ジビニルベンゼン多孔質粒子にデキストランをコーティングした粒子が合成されている。特許文献７では、メタクリル酸グリシジルとアクリル架橋モノマにより構成される多孔質粒子が合成されている。
Further, a composite filler in which a crosslinked gel of a hydrophilic natural polymer having a huge network structure is filled in the pores of an organic synthetic polymer substrate has been proposed (see Patent Documents 5 and 6). In
従来の分離材では、天然高分子の課題である通液性、耐久性や、ポリマ粒子の課題である耐アルカリ性、耐圧性、非特異吸着の低減、タンパク質吸着量が低い点等を充分なレベルで解決することは難しい。 With conventional separators, the problems of natural polymers such as liquid permeability and durability, and the problems of polymer particles such as alkali resistance, pressure resistance, reduction of non-specific adsorption, and low protein adsorption amount are sufficient levels. It is difficult to solve with.
そこで、本発明は、イオン交換容量及び耐久性に優れ、かつタンパク質の吸着量の向上及び非特異吸着の低減が可能な分離材及びカラムを提供することを目的とする。 Therefore, an object of the present invention is to provide a separating material and a column which are excellent in ion exchange capacity and durability, and which can improve the adsorption amount of protein and reduce non-specific adsorption.
本発明は、下記［１］〜［１１］に記載の分離材及び下記［１２］に記載のカラムを提供する。
［１］ 多孔質ポリマ粒子と、多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する、重量平均分子量が４００００以上の多糖類又はその変性体を含む被覆層と、を備え、多糖類又はその変性体は、多糖類又はその変性体の４質量％水溶液を調製したときに、２０〜８０℃の範囲での温度変化に対する水溶液の粘度変化においてヒステリシスを有さない、分離材。
［２］ 多孔質ポリマ粒子がスチレン系モノマをモノマ単位として含む、［１］に記載の分離材。
［３］ 多糖類がデキストランである、［１］又は［２］に記載の分離材。
［４］ 多糖類又はその変性体が架橋されている、［１］〜［３］のいずれかに記載の分離材。
［５］ 多孔質ポリマ粒子の平均粒径が１０〜３００μｍである、［１］〜［４］のいずれかに記載の分離材。
［６］ 細孔径分布におけるモード径が０．０１〜０．５μｍである、［１］〜［５］のいずれかに記載の分離材。
［７］ 空隙率が４０〜７０体積％である、［１］〜［６］のいずれかに記載の分離材。
［８］ 比表面積が３０ｍ２／ｇ以上である、［１］〜［７］のいずれかに記載の分離材。
［９］ 多孔質ポリマ粒子の粒径の変動係数が５〜１５％である、［１］〜［８］のいずれかに記載の分離材。
［１０］ 多孔質ポリマ粒子１ｇ当たり３０〜５００ｍｇの被覆層を備える、［１］〜［９］のいずれかに記載の分離材。
［１１］ カラムに充填した場合、カラム圧０．３ＭＰａのときに通液速度が８００ｃｍ／ｈ以上である、［１］〜［１０］のいずれかに記載の分離材。
［１２］ ［１］〜［１１］のいずれかに記載の分離材を備えるカラム。
The present invention provides the separating material described in the following [1] to [11] and the column described in the following [12].
[1] A polysaccharide or a modification thereof comprising the porous polymer particles and a coating layer containing a polysaccharide having a weight average molecular weight of 40,000 or more or a modified product thereof, which covers at least a part of the surface of the porous polymer particles. The body is a separating material that does not have hysteresis in the change in viscosity of the aqueous solution with respect to a temperature change in the range of 20 to 80 ° C. when a 4% by mass aqueous solution of a polysaccharide or a modified product thereof is prepared.
[2] The separating material according to [1], wherein the porous polymer particles contain a styrene-based monoma as a monoma unit.
[3] The separating material according to [1] or [2], wherein the polysaccharide is dextran.
[4] The separating material according to any one of [1] to [3], wherein the polysaccharide or a modified product thereof is crosslinked.
[5] The separating material according to any one of [1] to [4], wherein the porous polymer particles have an average particle size of 10 to 300 μm.
[6] The separating material according to any one of [1] to [5], wherein the mode diameter in the pore diameter distribution is 0.01 to 0.5 μm.
[7] The separating material according to any one of [1] to [6], which has a porosity of 40 to 70% by volume.
[8] The separating material according to any one of [1] to [7], which has a specific surface area of 30 m 2 / g or more.
[9] The separating material according to any one of [1] to [8], wherein the coefficient of variation of the particle size of the porous polymer particles is 5 to 15%.
[10] The separating material according to any one of [1] to [9], which comprises a coating layer of 30 to 500 mg per 1 g of porous polymer particles.
[11] The separating material according to any one of [1] to [10], wherein when the column is filled, the liquid passing speed is 800 cm / h or more when the column pressure is 0.3 MPa.
[12] A column comprising the separating material according to any one of [1] to [11].
本発明によれば、イオン交換容量及び耐久性に優れ、タンパク質の吸着量の向上及び非特異吸着の低減が可能な分離材及びカラムを提供することが可能となる。また、本発明に係る分離材及びカラムは、一態様において、通液性及び耐アルカリ性にも優れている。 According to the present invention, it is possible to provide a separating material and a column having excellent ion exchange capacity and durability, capable of improving the amount of protein adsorbed and reducing non-specific adsorption. Further, the separating material and the column according to the present invention are also excellent in liquid permeability and alkali resistance in one aspect.
以下、本発明の詳細な説明するが、本発明はこれらの実施形態に何ら限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in detail, but the present invention is not limited to these embodiments.
＜分離材＞
本実施形態の分離材は、多孔質ポリマ粒子と、該多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する被覆層とを備える。なお、本明細書中、「多孔質ポリマ粒子の表面」とは、多孔質ポリマ粒子の外側の表面のみでなく、多孔質ポリマ粒子の内部における細孔の表面を含むものとする。また、本明細書中（メタ）アクリル酸とは、アクリル酸又はメタクリル酸を意味し、（メタ）アクリレート等の類似の表現においても同様である。
<Separation material>
The separating material of the present embodiment includes porous polymer particles and a coating layer that covers at least a part of the surface of the porous polymer particles. In the present specification, the "surface of the porous polymer particles" includes not only the outer surface of the porous polymer particles but also the surface of the pores inside the porous polymer particles. Further, in the present specification, (meth) acrylic acid means acrylic acid or methacrylic acid, and the same applies to similar expressions such as (meth) acrylate.
（多孔質ポリマ粒子）
本実施形態の多孔質ポリマ粒子は、モノマと多孔質化剤とを含む組成物を反応させることにより得ることができる。多孔質ポリマ粒子は、例えば、従来の懸濁重合、乳化重合等によって合成することができる。モノマとしては、特に限定されないが、例えば、スチレン系モノマを使用することができる。すなわち、多孔質ポリマ粒子は、スチレン系モノマをモノマ単位として含んでいてよい。具体的なモノマとしては、以下のような多官能性モノマ、単官能性モノマ等が挙げられる。
(Porous polymer particles)
The porous polymer particles of the present embodiment can be obtained by reacting a composition containing a monoma and a porosifying agent. Porous polymer particles can be synthesized by, for example, conventional suspension polymerization, emulsion polymerization, or the like. The monoma is not particularly limited, but for example, a styrene-based monoma can be used. That is, the porous polymer particles may contain a styrene-based polymer as a monoma unit. Specific examples of the monoma include the following polyfunctional monomas and monofunctional monomas.
多官能性モノマとしては、例えば、ジビニルベンゼン、ジビニルビフェニル、ジビニルナフタレン、ジビニルフェナントレン等のジビニル化合物が挙げられる。これらの多官能性モノマは、１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。上記の中でも、耐久性、耐酸性及び耐アルカリ性に更に優れる観点から、ジビニルベンゼンを使用することが好ましい。 Examples of the polyfunctional monoma include divinyl compounds such as divinylbenzene, divinylbiphenyl, divinylnaphthalene, and divinylphenanthrene. These polyfunctional monomas can be used alone or in combination of two or more. Among the above, it is preferable to use divinylbenzene from the viewpoint of further excellent durability, acid resistance and alkali resistance.
単官能性モノマとしては、例えば、スチレン、ｏ−メチルスチレン、ｍ−メチルスチレン、ｐ−メチルスチレン、α−メチルスチレン、ｏ−エチルスチレン、ｍ−エチルスチレン、ｐ−エチルスチレン、２，４−ジメチルスチレン、ｐ−ｎ−ブチルスチレン、ｐ−ｔ−ブチルスチレン、ｐ−ｎ−ヘキシルスチレン、ｐ−ｎ−オクチルスチレン、ｐ−ｎ−ノニルスチレン、ｐ−ｎ−デシルスチレン、ｐ−ｎ−ドデシルスチレン、ｐ−メトキシスチレン、ｐ−フェニルスチレン、ｐ−クロロスチレン、３，４−ジクロロスチレン等のスチレン及びその誘導体が挙げられる。これらの単官能性モノマは、１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。上記の中でも、耐酸性及び耐アルカリ性に優れる観点から、スチレンを使用することが好ましい。また、カルボキシル基、アミノ基、水酸基、アルデヒド基等の官能基を有するスチレン誘導体も使用することができる。 Examples of monofunctional monomas include styrene, o-methylstyrene, m-methylstyrene, p-methylstyrene, α-methylstyrene, o-ethylstyrene, m-ethylstyrene, p-ethylstyrene, 2,4-. Dimethyl styrene, pn-butyl styrene, pt-butyl styrene, pn-hexyl styrene, pn-octyl styrene, pn-nonyl styrene, pn-decyl styrene, pn-dodecyl Examples thereof include styrene such as styrene, p-methoxystyrene, p-phenylstyrene, p-chlorostyrene, and 3,4-dichlorostyrene and derivatives thereof. These monofunctional monomas can be used alone or in combination of two or more. Among the above, it is preferable to use styrene from the viewpoint of excellent acid resistance and alkali resistance. Further, a styrene derivative having a functional group such as a carboxyl group, an amino group, a hydroxyl group or an aldehyde group can also be used.
多孔質化剤としては、重合時に相分離を促し、粒子の多孔質化を促進する有機溶媒である脂肪族又は芳香族の炭化水素類、エステル類、ケトン類、エーテル類、アルコール類等が挙げられる。具体的には、トルエン、キシレン、シクロヘキサン、オクタン、酢酸ブチル、フタル酸ジブチル、メチルエチルケトン、ジブチルエーテル、１−ヘキサノール、２−オクタノール、デカノール、ラウリルアルコール、シクロヘキサノール等が挙げられる。これらの多孔質化剤は、１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。 Examples of the porosifying agent include aliphatic or aromatic hydrocarbons, esters, ketones, ethers, alcohols, etc., which are organic solvents that promote phase separation during polymerization and promote porosification of particles. Be done. Specific examples thereof include toluene, xylene, cyclohexane, octane, butyl acetate, dibutyl phthalate, methyl ethyl ketone, dibutyl ether, 1-hexanol, 2-octanol, decanol, lauryl alcohol and cyclohexanol. These porosifying agents can be used alone or in combination of two or more.
上記多孔質化剤は、モノマ全質量に対して０〜２００質量％使用できる。多孔質化剤の量によって、多孔質ポリマ粒子の空隙率をコントロールできる。さらに、多孔質化剤の種類によって、多孔質ポリマ粒子の細孔の大きさ及び形状をコントロールすることができる。 The porosifying agent can be used in an amount of 0 to 200% by mass based on the total mass of the monoma. The porosity of the porous polymer particles can be controlled by the amount of the porosity agent. Furthermore, the size and shape of the pores of the porous polymer particles can be controlled by the type of the porosifying agent.
また、溶媒として使用する水を多孔質化剤とすることもできる。水を多孔質化剤とする場合は、モノマに油溶性界面活性剤を溶解させ、水を吸収することによって、多孔質化することが可能となる。 Further, water used as a solvent can also be used as a porosifying agent. When water is used as a porosifying agent, it can be made porous by dissolving an oil-soluble surfactant in a monoma and absorbing water.
多孔質化に使用される油溶性界面活性剤としては、分岐Ｃ１６〜Ｃ２４脂肪酸、鎖状不飽和Ｃ１６〜Ｃ２２脂肪酸又は鎖状飽和Ｃ１２〜Ｃ１４脂肪酸のソルビタンモノエステル、例えば、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノミリステート又はヤシ脂肪酸から誘導されるソルビタンモノエステル；分岐Ｃ１６〜Ｃ２４脂肪酸、鎖状不飽和Ｃ１６〜Ｃ２２脂肪酸又は鎖状飽和Ｃ１２〜Ｃ１４脂肪酸のジグリセロールモノエステル、例えば、ジグリセロールモノオレエート（例えば、Ｃ１８：１（炭素数１８個、二重結合数１個）脂肪酸のジグリセロールモノエステル）、ジグリセロールモノミリステート、ジグリセロールモノイソステアレート又はヤシ脂肪酸のジグリセロールモノエステル；分岐Ｃ１６〜Ｃ２４アルコール（例えば、ゲルベアルコール）、鎖状不飽和Ｃ１６〜Ｃ２２アルコール又は鎖状飽和Ｃ１２〜Ｃ１４アルコール（例えば、ヤシ脂肪アルコール）のジグリセロールモノ脂肪族エーテル；及びこれらの混合物が挙げられる。 Examples of the oil-soluble surfactant used for porosification include sorbitan monoesters of branched C16 to C24 fatty acids, chain unsaturated C16 to C22 fatty acids or chain saturated C12 to C14 fatty acids, for example, sorbitan monolaurate and sorbitan. Solbitan monoesters derived from monooleates, sorbitan monomillistates or coconut fatty acids; diglycerol monoesters of branched C16-C24 fatty acids, chain unsaturated C16-C22 fatty acids or chain saturated C12-C14 fatty acids, such as diglycerol monoesters. Diglycerol monoester of glycerol monooleate (eg, C18: 1 (18 carbons, 1 double bond) fatty acid), diglycerol monomillistate, diglycerol monoisostearate or diglycerol mono of coconut fatty acid Esters; diglycerol monofatty acids of branched C16-C24 alcohols (eg, gelve alcohols), chain unsaturated C16-C22 alcohols or chain saturated C12-C14 alcohols (eg palm fatty alcohols); and mixtures thereof. Can be mentioned.
これらのうち、ソルビタンモノラウレート（例えば、ＳＰＡＮ（スパン、登録商標）２０好ましくは純度約４０％を超える、より好ましくは純度約５０％を超える、最も好ましくは純度約７０％を超えるソルビタンモノラウレート）；ソルビタンモノオレエート（例えば、ＳＰＡＮ（スパン、登録商標）８０、好ましくは純度約４０％を超える、より好ましくは純度約５０％を超える、最も好ましくは純度約７０％を超えるソルビタンモノオレエート）；ジグリセロールモノオレエート（例えば、好ましくは純度約４０％を超える、より好ましくは純度約５０％を超える、最も好ましくは純度約７０％を超えるジグリセロールモノオレエート）；ジグリセロールモノイソステアレート（例えば、好ましくは純度約４０％を超える、より好ましくは純度約５０％を超える、最も好ましくは純度約７０％を超えるジグリセロールモノイソステアレート）；ジグリセロールモノミリステート（好ましくは純度約４０％を超える、より好ましくは純度約５０％を超える、最も好ましくは純度約７０％を超えるソルビタンモノミリステート）；ジグリセロールのココイル（例えば、ラウリル基、ミリストイル基等）エーテル；及びこれらの混合物が好ましい。
Of these, sorbitan monolaurate (eg,
これらの油溶性界面活性剤は、モノマ全質量に対して、５〜８０質量％の範囲で用いることが好ましい。油溶性界面活性剤の含有量が５質量％以上であると、水滴の安定性が充分となることから、大きな単一孔を形成しやすくなる。また、油溶性界面活性剤の含有量が８０質量％以下であると、重合後に多孔質ポリマ粒子が形状をより保持しやすくなる。 These oil-soluble surfactants are preferably used in the range of 5 to 80% by mass with respect to the total mass of the monoma. When the content of the oil-soluble surfactant is 5% by mass or more, the stability of the water droplet is sufficient, so that a large single pore is easily formed. Further, when the content of the oil-soluble surfactant is 80% by mass or less, the porous polymer particles are more likely to retain their shape after polymerization.
重合反応に用いられる水性媒体としては、水、水と水溶性溶媒（例えば、低級アルコール）との混合媒体等が挙げられる。水性媒体には、界面活性剤が含まれていてもよい。界面活性剤としては、アニオン系、カチオン系、ノニオン系及び両性イオン系の界面活性剤のうち、いずれも用いることができる。 Examples of the aqueous medium used in the polymerization reaction include water, a mixed medium of water and a water-soluble solvent (for example, a lower alcohol), and the like. The aqueous medium may contain a surfactant. As the surfactant, any of anionic, cationic, nonionic and zwitterionic surfactants can be used.
アニオン系界面活性剤としては、例えば、オレイン酸ナトリウム、ヒマシ油カリ等の脂肪酸油、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸アンモニウム等のアルキル硫酸エステル塩、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等のアルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキルナフタレンスルホン酸塩、アルカンスルホン酸塩、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム等のジアルキルスルホコハク酸塩、アルケルニルコハク酸塩（ジカリウム塩）、アルキルリン酸エステル塩、ナフタレンスルホン酸ホルマリン縮合物、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム等のポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキル硫酸エステル塩などが挙げられる。 Examples of the anionic surfactant include fatty acid oils such as sodium oleate and potassium castor oil, alkyl sulfates such as sodium lauryl sulfate and ammonium lauryl sulfate, alkylbenzene sulfonates such as sodium dodecylbenzene sulfonate, and alkylnaphthalene sulfone. Dialkyl sulfosuccinates such as acid salts, alkane sulfonates, sodium dioctyl sulfosuccinate, alkernyl succinate (dipotassium salt), alkyl phosphate ester salts, naphthalene sulfonate formalin condensates, polyoxyethylene alkyl phenyl ether sulfate Examples thereof include salts, polyoxyethylene alkyl ether sulfates such as sodium polyoxyethylene lauryl ether sulfate, and polyoxyethylene alkyl sulfates.
カチオン系界面活性剤としては、例えば、ラウリルアミンアセテート、ステアリルアミンアセテート等のアルキルアミン塩、ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド等の四級アンモニウム塩が挙げられる。 Examples of the cationic surfactant include alkylamine salts such as laurylamine acetate and stearylamine acetate, and quaternary ammonium salts such as lauryltrimethylammonium chloride.
ノニオン系界面活性剤としては、例えば、ポリエチレングリコールアルキルエーテル類、ポリエチレングリコールアルキルアリールエーテル類、ポリエチレングリコールエステル類、ポリエチレングリコールソルビタンエステル類、ポリアルキレングリコールアルキルアミン又はアミド類等の炭化水素系ノニオン界面活性剤、シリコンのポリエチレンオキサイド付加物類、ポリプロピレンオキサイド付加物類等のポリエーテル変性シリコン系ノニオン界面活性剤、パーフルオロアルキルグリコール類等のフッ素系ノニオン界面活性剤が挙げられる。 Examples of nonionic surfactants include hydrocarbon-based nonionic surfactants such as polyethylene glycol alkyl ethers, polyethylene glycol alkylaryl ethers, polyethylene glycol esters, polyethylene glycol sorbitan esters, polyalkylene glycol alkylamines, and amides. Examples thereof include polyether-modified silicon-based nonionic surfactants such as agents, polyethylene oxide adducts of silicon, polypropylene oxide adductants, and fluorine-based nonionic surfactants such as perfluoroalkyl glycols.
両性イオン系界面活性剤としては、例えば、ラウリルジメチルアミンオキサイド等の炭化水素界面活性剤、リン酸エステル系界面活性剤、亜リン酸エステル系界面活性剤が挙げられる。 Examples of the zwitterionic surfactant include hydrocarbon surfactants such as lauryldimethylamine oxide, phosphoric acid ester-based surfactants, and phosphite ester-based surfactants.
界面活性剤は、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。上記界面活性剤の中でも、モノマ重合時の分散安定性の観点から、アニオン系界面活性剤が好ましい。 As the surfactant, one type may be used alone or two or more types may be used in combination. Among the above-mentioned surfactants, anionic surfactants are preferable from the viewpoint of dispersion stability during monoma polymerization.
必要に応じて添加される重合開始剤としては、例えば、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウロイル、オルソクロロ過酸化ベンゾイル、オルソメトキシ過酸化ベンゾイル、３，５，５−トリメチルヘキサノイルパーオキサイド、ｔｅｒｔ−ブチルパーオキシ−２−エチルヘキサノエート、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルパーオキサイド等の有機過酸化物；２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、１，１’−アゾビスシクロヘキサンカルボニトリル、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）等のアゾ系化合物が挙げられる。重合開始剤は、モノマ１００質量部に対して、０．１〜７．０質量部の範囲で使用することができる。 Examples of the polymerization initiator added as needed include benzoyl peroxide, lauroyl peroxide, orthochlorobenzoyl peroxide, benzoyl orthomethoxy peroxide, 3,5,5-trimethylhexanoyl peroxide, and tert-butylper. Organic peroxides such as oxy-2-ethylhexanoate, di-tert-butyl peroxide; 2,2'-azobisisobutyronitrile, 1,1'-azobiscyclohexanecarbonitrile, 2,2' Examples thereof include azo compounds such as −azobis (2,4-dimethylvaleronitrile). The polymerization initiator can be used in the range of 0.1 to 7.0 parts by mass with respect to 100 parts by mass of the monoma.
重合温度は、モノマ及び重合開始剤の種類に応じて、適宜選択することができる。重合温度は、２５〜１１０℃が好ましく、５０〜１００℃がより好ましい。 The polymerization temperature can be appropriately selected depending on the type of the monoma and the polymerization initiator. The polymerization temperature is preferably 25 to 110 ° C, more preferably 50 to 100 ° C.
多孔質ポリマ粒子の合成において、粒子の分散安定性を向上させるために、高分子分散安定剤を用いてもよい。 In the synthesis of porous polymer particles, a polymer dispersion stabilizer may be used in order to improve the dispersion stability of the particles.
高分子分散安定剤としては、例えば、ポリビニルアルコール、ポリカルボン酸、セルロース類（ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース等）、ポリビニルピロリドンが挙げられ、トリポリリン酸ナトリウム等の無機系水溶性高分子化合物も併用することができる。これらのうち、ポリビニルアルコール又はポリビニルピロリドンが好ましい。高分子分散安定剤の添加量は、モノマ１００質量部に対して１〜１０質量部が好ましい。 Examples of the polymer dispersion stabilizer include polyvinyl alcohol, polycarboxylic acid, celluloses (hydroxyethyl cellulose, carboxymethyl cellulose, methyl cellulose, etc.), polyvinylpyrrolidone, and an inorganic water-soluble polymer compound such as sodium tripolyphosphate is also used in combination. can do. Of these, polyvinyl alcohol or polyvinylpyrrolidone is preferable. The amount of the polymer dispersion stabilizer added is preferably 1 to 10 parts by mass with respect to 100 parts by mass of the monoma.
モノマが単独で重合することを抑えるために、亜硝酸塩類、亜硫酸塩類、ハイドロキノン類、アスコルビン酸類、水溶性ビタミンＢ類、クエン酸、ポリフェノール類等の水溶性の重合禁止剤を用いてもよい。 In order to prevent the monoma from polymerizing alone, a water-soluble polymerization inhibitor such as nitrites, sulfites, hydroquinones, ascorbic acids, water-soluble B vitamins, citric acid, and polyphenols may be used.
多孔質ポリマ粒子の平均粒径は、好ましくは３００μｍ以下、より好ましくは１５０μｍ以下、さらに好ましくは１００μｍ以下である。多孔質ポリマ粒子の平均粒径は、通液性の向上の観点から、好ましくは１０μｍ以上、より好ましくは３０μｍ以上、さらに好ましくは５０μｍ以上である。 The average particle size of the porous polymer particles is preferably 300 μm or less, more preferably 150 μm or less, still more preferably 100 μm or less. The average particle size of the porous polymer particles is preferably 10 μm or more, more preferably 30 μm or more, still more preferably 50 μm or more, from the viewpoint of improving liquid permeability.
多孔質ポリマ粒子の粒径の変動係数（Ｃ．Ｖ．）は、通液性の向上の観点から、３〜１５％であることが好ましく、５〜１５％であることがより好ましく、５〜１０％であることがさらに好ましい。Ｃ．Ｖ．を低減する方法としては、マイクロプロセスサーバー（例えば株式会社日立製作所製）等の乳化装置により単分散化することが挙げられる。 The coefficient of variation (CV) of the particle size of the porous polymer particles is preferably 3 to 15%, more preferably 5 to 15%, and 5 to 5% from the viewpoint of improving the liquid permeability. It is more preferably 10%. C. V. As a method of reducing the amount of the above, monodisperse can be mentioned by using an emulsifying device such as a micro process server (for example, manufactured by Hitachi, Ltd.).
多孔質ポリマ粒子又は分離材の平均粒径及び粒径のＣ．Ｖ．（変動係数）は、以下の測定法により求めることができる。
１）超音波分散装置を使用して粒子を水（界面活性剤等の分散剤を含む）に分散させ、１質量％の多孔質ポリマ粒子を含む分散液を調製する。
２）粒度分布計（シスメックスフロー、シスメックス株式会社製）を用いて、上記分散液中の粒子約１万個の画像により平均粒径及び粒径のＣ．Ｖ．（変動係数）を測定する。
C.I. V. The (coefficient of variation) can be obtained by the following measurement method.
1) Using an ultrasonic disperser, the particles are dispersed in water (including a dispersant such as a surfactant) to prepare a dispersion liquid containing 1% by mass of porous polymer particles.
2) Using a particle size distribution meter (Sysmex Flow, manufactured by Sysmex Corporation), the average particle size and particle size of C.I. V. Measure (coefficient of variation).
多孔質ポリマ粒子の空隙率（細孔容積）は、多孔質ポリマ粒子の全体積基準で３０体積％以上７０体積％以下であることが好ましく、４０体積％以上７０体積％以下であることがより好ましい。多孔質ポリマ粒子は、細孔径分布におけるモード径（細孔径分布の最頻値、最大頻度径）が０．１μｍ以上０．５μｍ未満である細孔、すなわちマクロポアー（マクロ孔）を有することが好ましい。多孔質ポリマ粒子の細孔径分布におけるモード径として、より好ましくは、０．２μｍ以上０．５μｍ未満である。細孔径分布におけるモード径が０．１μｍ以上であると、細孔内に物質が入りやすくなる傾向にあり、細孔径が０．５μｍ未満であると、比表面積が充分なものになる。これらは上述の多孔質化剤により調整可能である。 The porosity (pore volume) of the porous polymer particles is preferably 30% by volume or more and 70% by volume or less based on the total volume of the porous polymer particles, and more preferably 40% by volume or more and 70% by volume or less. preferable. The porous polymer particles preferably have pores in which the mode diameter (mode, maximum frequency diameter of the pore diameter distribution) in the pore diameter distribution is 0.1 μm or more and less than 0.5 μm, that is, macropores (macropores). .. The mode diameter in the pore size distribution of the porous polymer particles is more preferably 0.2 μm or more and less than 0.5 μm. When the mode diameter in the pore diameter distribution is 0.1 μm or more, the substance tends to easily enter the pores, and when the pore diameter is less than 0.5 μm, the specific surface area becomes sufficient. These can be adjusted by the above-mentioned porosifying agent.
多孔質ポリマ粒子の比表面積は、３０ｍ２／ｇ以上であることが好ましい。より高い実用性の観点から、比表面積は３５ｍ２／ｇ以上であることがより好ましく、４０ｍ２／ｇ以上であることがさらに好ましい。比表面積が３０ｍ２／ｇ以上であると、分離する物質の吸着量が大きくなる傾向にある。 The specific surface area of the porous polymer particles is preferably 30 m 2 / g or more. From the viewpoint of higher practicality, the specific surface area is more preferably 35 m 2 / g or more, and further preferably 40 m 2 / g or more. When the specific surface area is 30 m 2 / g or more, the amount of adsorbed substances to be separated tends to increase.
（被覆層）
本実施形態の被覆層は、多糖類を含む。多糖類で多孔質ポリマ粒子を被覆することによりカラム圧の上昇を抑制することができるとともに、タンパク質の非特異吸着を抑制することが可能となる上、分離材のタンパク質吸着量を向上させることができる。さらに、多糖類が架橋されていると、カラム圧の上昇をより抑制することが可能となる。
(Coating layer)
The coating layer of this embodiment contains a polysaccharide. By coating the porous polymer particles with a polysaccharide, it is possible to suppress an increase in column pressure, suppress non-specific adsorption of proteins, and improve the amount of protein adsorbed on the separating material. it can. Furthermore, when the polysaccharide is crosslinked, it becomes possible to further suppress an increase in column pressure.
（多糖類又はその変性体）
被覆層は、多糖類又はその変性体を含む。多糖類としては、好ましくはアガロース、デキストラン、セルロース、キトサン等が挙げられ、デキストランが好ましく用いられる。
(Polysaccharide or its modified product)
The coating layer contains a polysaccharide or a modified product thereof. Examples of the polysaccharide include agarose, dextran, cellulose, chitosan and the like, and dextran is preferably used.
多糖類又はその変性体の重量平均分子量は、１００００以上であってよく、好ましくは４００００以上、より好ましくは１０００００以上、さらに好ましくは５０００００以上である。重量平均分子量が４００００以上の場合、少量の架橋剤によりデキストランを架橋させることができ、好適に非特異吸着を低減できる。また、この場合、イオン交換基の導入可能量も確保できるため、タンパク質の最大吸着量にも優れる。重量平均分子量は、８０℃に加温した高分子溶液をカラムオーブン温度５５℃、検出器温度５０℃にて、ゲル濾過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）で分析することによって測定される。 The weight average molecular weight of the polysaccharide or a modified product thereof may be 10,000 or more, preferably 40,000 or more, more preferably 100,000 or more, still more preferably 500,000 or more. When the weight average molecular weight is 40,000 or more, dextran can be crosslinked with a small amount of a cross-linking agent, and non-specific adsorption can be preferably reduced. Further, in this case, since the amount of the ion exchange group that can be introduced can be secured, the maximum amount of protein adsorbed is also excellent. The weight average molecular weight is measured by analyzing a polymer solution heated to 80 ° C. by gel filtration chromatography (GPC) at a column oven temperature of 55 ° C. and a detector temperature of 50 ° C.
被覆層は、界面吸着能を向上させる観点から、多糖類の変性体を含むことが好ましい。ここで、変性体とは、多糖類の分子中に疎水性基が導入されたものを指す。疎水性基としては、例えば、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数６〜１０のアリール基等が挙げられる。炭素数１〜６のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基等が挙げられる。炭素数６〜１０のアリール基としては、例えば、フェニル基、ナフチル基等が挙げられる。疎水性基は、水酸基と反応する官能基（例えば、エポキシ基）及び疎水基を有する化合物（例えば、グリシジルフェニルエーテル）を、多糖類と従来公知の方法で反応させることにより、導入することができる。 The coating layer preferably contains a modified product of a polysaccharide from the viewpoint of improving the interfacial adsorption ability. Here, the modified product refers to a polysaccharide in which a hydrophobic group is introduced into the molecule. Examples of the hydrophobic group include an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms and an aryl group having 6 to 10 carbon atoms. Examples of the alkyl group having 1 to 6 carbon atoms include a methyl group, an ethyl group, a propyl group and the like. Examples of the aryl group having 6 to 10 carbon atoms include a phenyl group and a naphthyl group. The hydrophobic group can be introduced by reacting a functional group (for example, an epoxy group) that reacts with a hydroxyl group and a compound having a hydrophobic group (for example, glycidyl phenyl ether) with a polysaccharide by a conventionally known method. ..
疎水性基を導入した多糖類の変性体における疎水性基の含有量は、多孔質ポリマ粒子表面に吸着するための疎水的相互作用力の保持と、タンパク質の非特異吸着の抑制とのバランスから、好ましくは５〜３０モル％、より好ましくは１０〜２０モル％、更に好ましくは１２〜１７モル％である。 The content of the hydrophobic group in the modified product of the polysaccharide into which the hydrophobic group has been introduced is determined by the balance between the retention of the hydrophobic interacting force for adsorbing on the surface of the porous polymer particles and the suppression of the non-specific adsorption of the protein. It is preferably 5 to 30 mol%, more preferably 10 to 20 mol%, still more preferably 12 to 17 mol%.
多糖類又はその変性体に多孔質ポリマ粒子を含浸させる際、多孔質ポリマ粒子の細孔内部における多糖類又はその変性体のつまりを抑制し、好適に被覆層を形成できる観点から、多糖類又はその変性体は、４質量％水溶液を調製したときに、２０〜８０℃の範囲での温度変化に対する当該水溶液の粘度変化においてヒステリシスを有さない多糖類又はその変性体である。多糖類又はその変性体が、当該水溶液の２０℃〜８０℃の範囲で温度変化させた際の粘度変化にヒステリシスを有さないことで、分子の運動性を高く保つことができ、タンパク質を立体的に吸着させやすくなる。なお、ここでの多糖類又はその変性体の４質量％水溶液は、実質的に水と多糖類又はその変性体とからなる水溶液を意味する。 When the polysaccharide or its modified product is impregnated with the porous polymer particles, the polysaccharide or its modified product can suppress clogging of the polysaccharide or its modified product inside the pores of the porous polymer particles, and can preferably form a coating layer. The modified product is a polysaccharide or a modified product thereof that does not have hysteresis in the change in viscosity of the aqueous solution with respect to a temperature change in the range of 20 to 80 ° C. when a 4% by mass aqueous solution is prepared. Since the polysaccharide or its modified product does not have hysteresis in the change in viscosity when the temperature of the aqueous solution is changed in the range of 20 ° C. to 80 ° C., the motility of the molecule can be kept high and the protein can be made three-dimensional. It becomes easy to adsorb. The 4% by mass aqueous solution of the polysaccharide or its modified product here means an aqueous solution substantially composed of water and the polysaccharide or its modified product.
２０〜８０℃の範囲での温度変化に対する水溶液の粘度変化は、以下の手順によって測定される。
１）多糖類又はその変性体を純水に溶解させて、４質量％の水溶液を調製する。
２）共軸二軸円筒型粘度計を用いて、２０〜８０℃を含む範囲で温度を変化させて上記水溶液の粘度変化を測定する。
３）具体的には、粘度変化の測定時、８０℃以上の温度（例えば８０〜１００℃のいずれかの温度。以下同様。）から開始して２℃／ｍｉｎの降温速度で２０℃以下の温度（例えば０〜２０℃のいずれかの温度。以下同様。）まで降温させ、その後、２℃／ｍｉｎの昇温速度で８０℃以上の温度まで昇温させる。縦軸に粘度、横軸に温度をとったグラフにおいて、８０℃以上の温度から２０℃以下の温度に降温させた際の粘度測定値から描かれる直線１又は曲線１と、２０℃以下の温度から８０℃以上の温度に昇温させた際の粘度測定値から描かれる直線２又は曲線２とが一致しない、すなわち、４０〜６０℃の任意の温度において、降温時（直線１又は曲線１）の粘度と昇温時（直線２又は曲線２）の粘度との差が０．０１Ｐａ・ｓ以上である場合をヒステリシスありと判断する。一方、直線１又は曲線１と直線２又は曲線２とが一致する、すなわち、４０〜６０℃の任意の温度において、降温時（直線１又は曲線１）の粘度と昇温時（直線２又は曲線２）の粘度との差が０．０１Ｐａ・ｓ未満である場合をヒステリシスなしと判断する。
The change in viscosity of the aqueous solution with respect to the temperature change in the range of 20 to 80 ° C. is measured by the following procedure.
1) Dissolve the polysaccharide or its modified product in pure water to prepare a 4% by mass aqueous solution.
2) Using a co-axis biaxial cylindrical viscometer, the change in viscosity of the above aqueous solution is measured by changing the temperature in a range including 20 to 80 ° C.
3) Specifically, when measuring the change in viscosity, start from a temperature of 80 ° C. or higher (for example, any temperature of 80 to 100 ° C.; the same shall apply hereinafter) and lower the temperature to 20 ° C. or lower at a temperature lowering rate of 2 ° C./min. The temperature is lowered to a temperature (for example, any temperature between 0 and 20 ° C.; the same applies hereinafter), and then the temperature is raised to 80 ° C. or higher at a heating rate of 2 ° C./min. In a graph with viscosity on the vertical axis and temperature on the horizontal axis, a
図１は、多糖類又はその変性体の水溶液の２０〜８０℃の範囲での温度変化に対する粘度変化の一例を示すグラフである。図１の曲線Ｃ１は、４０〜６０℃の任意の温度において、降温時の粘度と昇温時の粘度との差が０．０１Ｐａ・ｓ以上であり、ヒステリシスありと判断される。図１の曲線Ｃ２，Ｃ３は、４０〜６０℃の任意の温度において、降温時の粘度と昇温時の粘度との差が０．０１Ｐａ・ｓ未満であり、ヒステリシスなしと判断される。 FIG. 1 is a graph showing an example of a change in viscosity of an aqueous solution of a polysaccharide or a modified product thereof with respect to a temperature change in the range of 20 to 80 ° C. The curve C1 in FIG. 1 shows that the difference between the viscosity at the time of lowering the temperature and the viscosity at the time of raising the temperature is 0.01 Pa · s or more at an arbitrary temperature of 40 to 60 ° C., and it is determined that there is hysteresis. Curves C2 and C3 of FIG. 1 show that the difference between the viscosity at the time of lowering the temperature and the viscosity at the time of raising the temperature is less than 0.01 Pa · s at an arbitrary temperature of 40 to 60 ° C., and it is judged that there is no hysteresis.
（被覆層の形成方法）
多糖類又はその変性体（以下、これらをまとめて単に「多糖類」ともいう）を含む被覆層は、例えば、以下に示す方法により形成することができる。
まず、多糖類の溶液を多孔質ポリマ粒子表面に吸着させる。多糖類の溶液の溶媒としては、多糖類を溶解することのできるものであれば、特に限定されないが、水が最も一般的である。溶媒に溶解させる高分子の濃度は、５〜２０（ｍｇ／ｍＬ）が好ましい。
この溶液を、多孔質ポリマ粒子に含浸させる。含浸方法は、多糖類の溶液に多孔質ポリマ粒子を加えて一定時間放置する。含浸時間は多孔質体の表面状態によっても変わるが、通常一昼夜含浸すれば高分子濃度が多孔質体の内部で外部濃度と平衡状態となる。その後、水、アルコール等の溶媒で洗浄し、未吸着分の多糖類を除去する。
(Method of forming the coating layer)
A coating layer containing a polysaccharide or a modified product thereof (hereinafter, these are collectively simply referred to as “polysaccharide”) can be formed by, for example, the method shown below.
First, a solution of the polysaccharide is adsorbed on the surface of the porous polymer particles. The solvent for the solution of the polysaccharide is not particularly limited as long as it can dissolve the polysaccharide, but water is the most common. The concentration of the polymer dissolved in the solvent is preferably 5 to 20 (mg / mL).
The porous polymer particles are impregnated with this solution. The impregnation method is to add porous polymer particles to a solution of polysaccharide and leave it for a certain period of time. The impregnation time varies depending on the surface condition of the porous body, but usually, if impregnated all day and night, the polymer concentration becomes an equilibrium state with the external concentration inside the porous body. Then, it is washed with a solvent such as water and alcohol to remove unadsorbed polysaccharides.
（架橋処理）
次いで、架橋剤を加えて多孔質ポリマ粒子表面に吸着された多糖類を架橋反応させて、架橋体を形成する。このとき、架橋体は、水酸基を有する３次元架橋網目構造を有する。
(Crosslinking)
Next, a cross-linking agent is added to cause a cross-linking reaction of the polysaccharide adsorbed on the surface of the porous polymer particles to form a cross-linked product. At this time, the crosslinked body has a three-dimensional crosslinked network structure having a hydroxyl group.
架橋剤としては、例えばエピクロルヒドリン等のエピハロヒドリン、グルタルアルデヒド等のジアルデヒド化合物、メチレンジイソシアネート等のジイソシアネート化合物、エチレングリコールジグリシジルエーテル等のグリシジル化合物などのような水酸基に活性な官能基を２個以上有する化合物が挙げられる。また、多糖類としてキトサンのようなアミノ基を有する化合物を使用する場合には、ジクロロオクタンのようなジハライド化合物も架橋剤として使用できる。 The cross-linking agent has two or more functional groups active on hydroxyl groups such as epichlorohydrin such as epichlorohydrin, dialdehyde compound such as glutaraldehyde, diisocyanate compound such as methylene diisocyanate, and glycidyl compound such as ethylene glycol diglycidyl ether. Examples include compounds. When a compound having an amino group such as chitosan is used as the polysaccharide, a dihalide compound such as dichlorooctane can also be used as a cross-linking agent.
この架橋反応には通常触媒が用いられる。該触媒は架橋剤の種類に合わせて適宜従来公知のものを用いることができるが、例えば、架橋剤がエピクロルヒドリン等の場合には水酸化ナトリウム等のアルカリが有効であり、ジアルデヒド化合物の場合には塩酸等の鉱酸が有効である。 A catalyst is usually used for this cross-linking reaction. As the catalyst, conventionally known ones can be appropriately used according to the type of the cross-linking agent. For example, when the cross-linking agent is epichlorohydrin or the like, an alkali such as sodium hydroxide is effective, and when the cross-linking agent is a dialdehyde compound, it is effective. Mineral acids such as hydrochloric acid are effective.
架橋剤による架橋反応は、通常、分離材を適当な媒体中に分散、懸濁させた系に架橋剤を添加することによって行われる。架橋剤の添加量は、多糖類として多糖類を使用した場合、単糖類の１単位を１モルとすると、それに対して０．１〜１００モル倍の範囲内で、分離材の性能に応じて選定することができる。一般に、架橋剤の添加量を少なくすると、被覆層が多孔質ポリマ粒子から剥離しやすくなる傾向にある。また、架橋剤の添加量が過剰で、かつ、多糖類との反応率が高い場合、原料の多糖類の特性が損なわれる傾向にある。 The cross-linking reaction with a cross-linking agent is usually carried out by adding the cross-linking agent to a system in which the separating material is dispersed and suspended in a suitable medium. When a polysaccharide is used as the polysaccharide, the amount of the cross-linking agent added is within the range of 0.1 to 100 mol times, assuming that one unit of the monosaccharide is 1 mol, depending on the performance of the separating material. Can be selected. In general, when the amount of the cross-linking agent added is small, the coating layer tends to be easily peeled off from the porous polymer particles. Further, when the amount of the cross-linking agent added is excessive and the reaction rate with the polysaccharide is high, the characteristics of the raw material polysaccharide tend to be impaired.
また、触媒の使用量としては、架橋剤の種類により異なるが、通常、多糖類として多糖類を使用する場合に、多糖類を形成する単糖類の１単位を１モルとすると、これに対して０．０１〜１０モル倍の範囲、さらに好ましくは０．１〜５モル倍で使用される。 The amount of the catalyst used varies depending on the type of cross-linking agent. Normally, when a polysaccharide is used as the polysaccharide, if one unit of the monosaccharide forming the polysaccharide is 1 mol, the amount used is different from that. It is used in the range of 0.01 to 10 mol times, more preferably 0.1 to 5 mol times.
例えば、該架橋反応条件を温度条件とした場合、反応系の温度を上げ、その温度が反応温度に達すれば架橋反応が生起する。 For example, when the cross-linking reaction condition is a temperature condition, the temperature of the reaction system is raised, and when the temperature reaches the reaction temperature, a cross-linking reaction occurs.
多糖類の溶液等を含浸させた多孔質ポリマ粒子を分散、懸濁させる媒体としては含浸させた高分子溶液から高分子、架橋剤等を抽出してしまうことなく、かつ、架橋反応に不活性なものである必要がある。その具体例としては、水、アルコール、トルエン、ジクロルベンゼン、ニトロメタン等が挙げられる。 As a medium for dispersing and suspending porous polymer particles impregnated with a polysaccharide solution, etc., the polymer, cross-linking agent, etc. are not extracted from the impregnated polymer solution, and are inactive in the cross-linking reaction. It needs to be something like that. Specific examples thereof include water, alcohol, toluene, dichlorobenzene, nitromethane and the like.
架橋反応は、通常、５〜９０℃の範囲の温度で、１〜１０時間かけて行う。好ましくは、３０〜９０℃の範囲の温度である。 The cross-linking reaction is usually carried out at a temperature in the range of 5 to 90 ° C. over 1 to 10 hours. Preferably, the temperature is in the range of 30 to 90 ° C.
架橋反応終了後、生成した粒子を濾別し、次いで、水、メタノール、エタノール等の親水性有機溶媒で洗浄し、未反応の高分子、懸濁用媒体等を除去すれば、多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部が、多糖類を含む被覆層により被覆された分離材が得られる。本実施形態の分離材は、多孔質ポリマ粒子１ｇ当たり、好ましくは３０〜５００ｍｇ、より好ましくは５０〜５００ｍｇ、更に好ましくは５０〜４８０ｍｇの被覆層を備える。被覆層の量は熱分解の質量減少等で測定することができる。 After completion of the cross-linking reaction, the generated particles are filtered off, and then washed with a hydrophilic organic solvent such as water, methanol, ethanol, etc. to remove unreacted polymers, suspension medium, etc., and the porous polymer particles are obtained. A separating material is obtained in which at least a part of the surface of the solvent is coated with a coating layer containing a polysaccharide. The separating material of the present embodiment includes a coating layer of preferably 30 to 500 mg, more preferably 50 to 500 mg, still more preferably 50 to 480 mg per 1 g of the porous polymer particles. The amount of the coating layer can be measured by reducing the mass of thermal decomposition or the like.
（イオン交換基の導入）
被覆層を備える分離材は、イオン交換基、リガンド（プロテインＡ）等を表面上の水酸基等を介して導入することによりイオン交換精製、アフィニティ精製等に使用することができる。イオン交換基の導入方法として、例えば、ハロゲン化アルキル化合物を用いる方法が挙げられる。
(Introduction of ion exchange group)
The separating material provided with the coating layer can be used for ion exchange purification, affinity purification, etc. by introducing an ion exchange group, a ligand (protein A), or the like via a hydroxyl group or the like on the surface. Examples of the method for introducing an ion exchange group include a method using an alkyl halide compound.
ハロゲン化アルキル化合物としては、モノハロゲノ酢酸、モノハロゲノプロピオン酸等のモノハロゲノカルボン酸及びそのナトリウム塩、ジエチルアミノエチルクロライド等のハロゲン化アルキル基を少なくとも１つ有する１級、２級又は３級アミン、ハロゲン化アルキル基を有する４級アンモニウムの塩酸塩などが挙げられる。これらのハロゲン化アルキル化合物は、臭化物又は塩化物であることが好ましい。ハロゲン化アルキル化合物の使用量としては、イオン交換基を付与する分離材の全質量に対して０．２質量％以上であることが好ましい。 Examples of the alkyl halide compound include monohalogenocarboxylic acids such as monohalogenoacetic acid and monohalogenopropionic acid, sodium salts thereof, and primary, secondary or tertiary amines and halogens having at least one alkyl halide group such as diethylaminoethyl chloride. Examples thereof include quaternary ammonium hydrochloride having an alkylated group. These alkyl halide compounds are preferably bromides or chlorides. The amount of the alkyl halide compound used is preferably 0.2% by mass or more with respect to the total mass of the separating material to which the ion exchange group is imparted.
イオン交換基の導入には、反応を促進させるために、有機溶媒を用いることが有効である。有機溶媒としては、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、イソブタノール、１−ペンタノール、イソペンタノール等のアルコール類が挙げられる。 For the introduction of the ion exchange group, it is effective to use an organic solvent in order to promote the reaction. Examples of the organic solvent include alcohols such as ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, isobutanol, 1-pentanol and isopentanol.
通常、イオン交換基の導入は、分離材表面の水酸基に行われるので、湿潤状態の粒子を、ろ過等により水切りした後、所定濃度のアルカリ性水溶液に浸漬し、一定時間放置した後、水−有機溶媒混合系で、上記ハロゲン化アルキル化合物を添加して反応させる。この反応は温度４０〜９０℃で、０．５〜１２時間行うことが好ましい。上記の反応で使用されるハロゲン化アルキル化合物の種類により、付与されるイオン交換基が決定される。 Normally, the ion exchange group is introduced into the hydroxyl group on the surface of the separating material. Therefore, the wet particles are drained by filtration or the like, immersed in an alkaline aqueous solution having a predetermined concentration, left for a certain period of time, and then water-organic. In a solvent mixing system, the above alkyl halide compound is added and reacted. This reaction is preferably carried out at a temperature of 40 to 90 ° C. for 0.5 to 12 hours. The type of alkyl halide used in the above reaction determines the ion exchange group to be imparted.
イオン交換基として、弱塩基性基であるアミノ基を導入する方法としては、上記ハロゲン化アルキル化合物のうち、水素原子の一部が塩素原子に置換されたアルキル基を少なくとも１つ有する、モノ−、ジ−又はトリ−アルキルアミン、モノ−、ジ−又はトリ−アルカノールアミン、モノ−アルキル−モノ−アルカノールアミン、ジ−アルキル−モノ−アルカノールアミン、モノ−アルキル−ジ−アルカノールアミン等を反応させる方法が挙げられる。これらのハロゲン化アルキル化合物の使用量としては、分離材の全質量に対して０．２質量％以上であることが好ましい。反応条件は、４０〜９０℃で、０．５〜１２時間であることが好ましい。 As a method for introducing an amino group which is a weakly basic group as an ion exchange group, among the above alkyl halide compounds, a mono-alkylamine having at least one alkyl group in which a part of hydrogen atoms is replaced with chlorine atoms. , Di- or tri-alkylamine, mono-, di- or tri-alkanolamine, mono-alkyl-mono-alkanolamine, di-alkyl-mono-alkanolamine, mono-alkyl-di-alkanolamine, etc. The method can be mentioned. The amount of these alkyl halide compounds used is preferably 0.2% by mass or more with respect to the total mass of the separating material. The reaction conditions are preferably 40 to 90 ° C. and 0.5 to 12 hours.
イオン交換基として、強塩基性基の４級アンモニウム基を導入する方法としては、まず、３級アミノ基を導入し、該３級アミノ基にエピクロルヒドリン等のハロゲン化アルキル化合物を反応させ、４級アンモニウム基に変換させる方法が挙げられる。また、４級アンモニウムの塩酸塩等を分離材に反応させてもよい。 As a method for introducing a quaternary ammonium group of a strongly basic group as an ion exchange group, first, a tertiary amino group is introduced, and the tertiary amino group is reacted with an alkyl halide compound such as epichlorohydrin to be quaternary. A method of converting to an ammonium group can be mentioned. Further, a quaternary ammonium hydrochloride or the like may be reacted with the separating material.
イオン交換基として、弱酸性基であるカルボキシ基を導入する方法としては、上記ハロゲン化アルキル化合物として、モノハロゲノ酢酸、モノハロゲノプロピオン酸等のモノハロゲノカルボン酸又はそのナトリウム塩を反応させる方法が挙げられる。これらハロゲン化アルキル化合物の使用量は、イオン交換基を導入する分離材の全質量に対して０．２質量％以上であることが好ましい。 Examples of the method for introducing a carboxy group, which is a weakly acidic group, as an ion exchange group include a method in which a monohalogenocarboxylic acid such as monohalogenacetic acid or monohalogenopropionic acid or a sodium salt thereof is reacted as the alkyl halide compound. .. The amount of these alkyl halide compounds used is preferably 0.2% by mass or more with respect to the total mass of the separating material into which the ion exchange group is introduced.
イオン交換基として、強酸性基であるスルホン酸基の導入方法としては、分離材に対してエピクロロヒドリン等のグリシジル化合物を反応させ、亜硫酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム等の亜硫酸塩又は重亜硫酸塩の飽和水溶液に分離材を添加する方法が挙げられる。反応条件は、３０〜９０℃で１〜１０時間であることが好ましい。 As a method for introducing a sulfonic acid group, which is a strongly acidic group, as an ion exchange group, a glycidyl compound such as epichlorohydrin is reacted with a separating material, and a sulfite such as sodium sulfite or sodium bisulfite or a sulfite is obtained. A method of adding a separating material to the saturated aqueous solution of the above can be mentioned. The reaction conditions are preferably 30 to 90 ° C. for 1 to 10 hours.
一方、イオン交換基の導入方法として、アルカリ性雰囲気下で、分離材に１，３−プロパンスルトンを反応させる方法も挙げられる。１，３−プロパンスルトンは、分離材の全質量に対して０．４質量％以上使用することが好ましい。反応条件は、０〜９０℃で０．５〜１２時間であることが好ましい。 On the other hand, as a method of introducing an ion exchange group, a method of reacting 1,3-propane sultone with a separating material in an alkaline atmosphere can also be mentioned. It is preferable to use 1,3-propane sultone in an amount of 0.4% by mass or more based on the total mass of the separating material. The reaction conditions are preferably 0 to 90 ° C. for 0.5 to 12 hours.
本実施形態の分離材又は多孔質ポリマ粒子の細孔径分布におけるモード径、比表面積及び空隙率は、水銀圧入測定装置（オートポア：株式会社島津製作所製）にて測定した値であり、以下のようにして測定する。試料約０．０５ｇを、標準５ｍＬ粉体用セル（ステム容積０．４ｍＬ）に加え、初期圧２１ｋＰａ（約３ｐｓｉａ、細孔直径約６０μｍ相当）の条件で測定する。水銀パラメータは、装置デフォルトの水銀接触角１３０ｄｅｇｒｅｅｓ、水銀表面張力４８５ｄｙｎｅｓ／ｃｍに設定する。また、比表面積及び空隙率は、得られた細孔分布における細孔径が０．１〜３μｍである範囲に限定してそれぞれの値を算出する。 The mode diameter, specific surface area, and porosity in the pore size distribution of the separating material or the porous polymer particles of the present embodiment are values measured by a mercury intrusion measuring device (Autopore: manufactured by Shimadzu Corporation) and are as follows. And measure. About 0.05 g of a sample is added to a standard 5 mL powder cell (stem volume 0.4 mL) and measured under the condition of an initial pressure of 21 kPa (about 3 psia, equivalent to a pore diameter of about 60 μm). The mercury parameters are set to the device default mercury contact angle of 130 degrees and mercury surface tension of 485 days / cm. Further, the specific surface area and the porosity are calculated by limiting the pore diameter in the obtained pore distribution to a range of 0.1 to 3 μm.
本実施形態の分離材の細孔径分布におけるモード径は、０．０１〜０．５μｍであることが好ましく、０．０５〜０．５μｍであることがより好ましい。細孔径分布におけるモード径がこの範囲にあると、粒子中に液が流れ易くなり、動的吸着量を多くすることができる。 The mode diameter in the pore size distribution of the separating material of the present embodiment is preferably 0.01 to 0.5 μm, more preferably 0.05 to 0.5 μm. When the mode diameter in the pore size distribution is in this range, the liquid easily flows into the particles, and the amount of dynamic adsorption can be increased.
本実施形態の分離材の比表面積は、３０ｍ２／ｇ以上であることが好ましい。より高い実用性の観点から、比表面積は３５ｍ２／ｇ以上であることがより好ましく、４０ｍ２／ｇ以上であることがさらに好ましい。比表面積が３０ｍ２／ｇ以上であると、分離する物質の吸着量が大きくなる傾向にある。分離材の比表面積の上限は特に限定されないが、例えば３００ｍ２／ｇ以下とすることができる。 The specific surface area of the separating material of the present embodiment is preferably 30 m 2 / g or more. From the viewpoint of higher practicality, the specific surface area is more preferably 35 m 2 / g or more, and further preferably 40 m 2 / g or more. When the specific surface area is 30 m 2 / g or more, the amount of adsorbed substances to be separated tends to increase. The upper limit of the specific surface area of the separating material is not particularly limited, but can be, for example, 300 m 2 / g or less.
本実施形態の分離材の空隙率は、４０〜７０体積％であることが好ましい。空隙率がこの範囲にあると、蛋白質吸着量を多くすることができる。 The porosity of the separating material of the present embodiment is preferably 40 to 70% by volume. When the porosity is in this range, the amount of protein adsorbed can be increased.
本実施形態の分離材は、タンパク質を静電的相互作用による分離、アフィニティ精製に用いるのに好適である。例えば、タンパク質を含む混合溶液の中に本実施形態の分離材を添加し、静電的相互作用によりタンパク質だけを分離材に吸着させた後、該分離材を溶液からろ別し、塩濃度の高い水溶液中に添加すれば、分離材に吸着しているタンパク質を容易に脱離、回収できる。また、本実施形態の分離材は、カラムクロマトグラフィーにおいて、使用することも可能である。すなわち、本実施形態のカラムは、本実施形態の分離材を備え、例えば、本実施形態の分離材を充填してなっている。 The separating material of the present embodiment is suitable for separating proteins by electrostatic interaction and for affinity purification. For example, the separating material of the present embodiment is added to a mixed solution containing a protein, and only the protein is adsorbed on the separating material by electrostatic interaction, and then the separating material is filtered off from the solution to obtain a salt concentration. When added to a high aqueous solution, the protein adsorbed on the separating material can be easily desorbed and recovered. The separating material of the present embodiment can also be used in column chromatography. That is, the column of the present embodiment includes the separating material of the present embodiment, and is filled with, for example, the separating material of the present embodiment.
本実施形態の分離材を用いて分離できる生体高分子としては、水溶性物質が好ましい。具体的には、血清アルブミン、免疫グロブリン等の血液タンパク質などのタンパク質、生体中に存在する酵素、バイオテクノロジーにより生産されるタンパク質生理活性物質、ＤＮＡ、生理活性をするペプチド等の生体高分子などであり、好ましくは分子量が２００万以下、より好ましくは５０万以下である。また、公知の方法に従い、タンパク質の等電点、イオン化状態等によって、分離材の性質、条件等を選ぶ必要がある。公知の方法としては、例えば、特開昭６０−１６９４２７号公報等に記載の方法が挙げられる。 As the biopolymer that can be separated using the separating material of the present embodiment, a water-soluble substance is preferable. Specifically, it is a protein such as blood protein such as serum albumin and immunoglobulin, an enzyme existing in the living body, a protein physiologically active substance produced by biotechnology, DNA, a biopolymer such as a peptide having physiological activity, and the like. Yes, preferably the molecular weight is 2 million or less, more preferably 500,000 or less. In addition, it is necessary to select the properties, conditions, etc. of the separating material according to the isoelectric point, ionization state, etc. of the protein according to a known method. As a known method, for example, the method described in JP-A-60-169427 can be mentioned.
本実施形態の分離材は、多孔質ポリマ粒子上の被覆層を架橋処理後、分離材の表面にイオン交換基、プロテインＡを導入することにより、タンパク質等の生体高分子の分離において、天然高分子からなる粒子又は合成ポリマからなる粒子のそれぞれの利点を有する。特に本実施形態の分離材における多孔質ポリマ粒子は、上述の方法で得られるものであるため、耐久性及び耐アルカリ性を有する。また、本実施形態の分離材は、タンパク質の非特異吸着を低減し、タンパク質の吸脱着が起こりやすい傾向にある。さらに、本実施形態の分離材は、同一流速下でのタンパク質等の吸着量（動的吸着量）が大きい傾向にある。 The separating material of the present embodiment has a natural height in separating biopolymers such as proteins by introducing an ion exchange group and protein A into the surface of the separating material after cross-linking the coating layer on the porous polymer particles. It has the advantages of particles made of molecules or particles made of synthetic polymers. In particular, the porous polymer particles in the separating material of the present embodiment are obtained by the above-mentioned method, and therefore have durability and alkali resistance. In addition, the separating material of the present embodiment reduces non-specific adsorption of proteins and tends to cause protein adsorption / desorption. Further, the separating material of the present embodiment tends to have a large adsorption amount (dynamic adsorption amount) of proteins and the like under the same flow velocity.
本明細書における通液速度とは、φ７．８×３００ｍｍのステンレスカラムに本実施形態の分離材を充填し、液を通した際の通液速度を表す。本実施形態の分離材は、カラムに充填した場合、カラム圧０．３ＭＰａのときに通液速度が８００ｃｍ／ｈ以上であることが好ましい。カラムクロマトグラフィーでタンパク質の分離を行う場合、タンパク質溶液等の通液速度としては、一般に４００ｃｍ／ｈ以下の範囲であるが、本実施形態の分離材を使用した場合は、通常のタンパク質分離用の分離材よりも速い通液速度８００ｃｍ／ｈ以上で使用することができる。 The liquid passing speed in the present specification represents the liquid passing speed when a stainless steel column having a diameter of 7.8 × 300 mm is filled with the separating material of the present embodiment and the liquid is passed through. When the separating material of the present embodiment is packed in a column, it is preferable that the liquid passing speed is 800 cm / h or more when the column pressure is 0.3 MPa. When protein is separated by column chromatography, the flow rate of the protein solution or the like is generally in the range of 400 cm / h or less, but when the separating material of the present embodiment is used, it is used for normal protein separation. It can be used at a liquid passing speed of 800 cm / h or more, which is faster than that of the separating material.
本実施形態の分離材の平均粒径は、１０〜３００μｍであることが好ましい。分取用又は工業用のクロマトグラフィーでの使用には、カラム内圧の極端な増加を避けるために、１０〜１００μｍであることがより好ましく、５０〜１００μｍであることがさらに好ましい。 The average particle size of the separating material of the present embodiment is preferably 10 to 300 μm. For use in preparative or industrial chromatography, it is more preferably 10 to 100 μm, even more preferably 50 to 100 μm, in order to avoid an extreme increase in column internal pressure.
分離材の細孔径分布におけるモード径、平均細孔径、比表面積等は、多孔質ポリマ粒子の原料、多孔質化剤、多糖類等を適宜選択することによって、調整することができる。 The mode diameter, average pore diameter, specific surface area, etc. in the pore diameter distribution of the separating material can be adjusted by appropriately selecting the raw material of the porous polymer particles, the porosifying agent, the polysaccharide, and the like.
なお、本実施形態では、イオン交換基を導入する形態の分離材について説明したが、イオン交換基を導入しなくても分離材として用いることができる。このような分離材は、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィーに利用することができる。 In this embodiment, the separating material in which the ion exchange group is introduced has been described, but it can be used as the separating material without introducing the ion exchange group. Such a separating material can be used, for example, in gel filtration chromatography.
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples.
＜実施例１＞
（多孔質ポリマ粒子１の合成）
５００ｍＬの三口フラスコ中で、モノマとして純度９６％のジビニルベンゼン（新日鉄住金株式会社製、商品名：ＤＶＢ９６０）１６ｇ、多孔質体としてヘキサノール１６ｇ及びジエチルベンゼン１６ｇ、開始剤として過酸化ベンゾイル０．６４ｇをポリビニルアルコール（０．５質量％）水溶液に加え、マイクロプロセスサーバーを使用して乳化させた。得られた乳化液をフラスコに移し、８０℃のウォーターバスで加熱しながら、撹拌機を用いて約８時間撹拌をして粒子を得た。得られた粒子をろ過後、アセトンで洗浄を行い、多孔質ポリマ粒子１を得た。得られた多孔質ポリマ粒子１の粒径をフロー型粒径測定装置で測定し、平均粒径及び粒径のＣ．Ｖ．値（変動係数）を算出した。また、多孔質ポリマ粒子１の細孔径分布におけるモード径、比表面積、空隙率を水銀圧入法にて測定した。結果を表１に示す。
<Example 1>
(Synthesis of Porous Polymer Particle 1)
In a 500 mL three-necked flask, 16 g of divinylbenzene (manufactured by Nippon Steel & Sumitomo Metal Corporation, trade name: DVB960) with a purity of 96% as a monoma, 16 g of hexanol and 16 g of diethylbenzene as a porous body, and 0.64 g of benzoyl peroxide as an initiator are polyvinyl. It was added to an aqueous solution of alcohol (0.5% by mass) and emulsified using a microprocess server. The obtained emulsion was transferred to a flask and stirred with a stirrer for about 8 hours while heating in a water bath at 80 ° C. to obtain particles. The obtained particles were filtered and then washed with acetone to obtain
（被覆層の形成）
重量平均分子量（Ｍｗ）が４００００００であるデキストランの水溶液（２質量％）４８０ｍＬに水酸化ナトリウム０．９８ｇ、グリシジルフェニルエーテル９．８０ｇを投入して６０℃で６時間反応させ、デキストランにフェニル基を導入した。得られた変性デキストランをイソプロピルアルコールで再沈殿させ、洗浄した。変性デキストランの疎水性基含有量を下記方法により算出したところ、１４．２モル％であった。
(Formation of coating layer)
0.98 g of sodium hydroxide and 9.80 g of glycidyl phenyl ether were added to 480 mL of an aqueous solution (2% by mass) of dextran having a weight average molecular weight (Mw) of 4000000 and reacted at 60 ° C. for 6 hours to add a phenyl group to dextran. Introduced. The obtained modified dextran was reprecipitated with isopropyl alcohol and washed. The hydrophobic group content of the modified dextran was calculated by the following method and found to be 14.2 mol%.
（デキストランの変性体における疎水性基含有量の評価）
乾燥状態の粉末デキストラン（変性されていないデキストラン）と揮発分０．１質量％未満まで乾燥させた疎水性基導入デキストランをそれぞれ７０℃の純水に溶解させ、０．０５質量％の水溶液サンプルを調製した。分光光度計により各水溶液の２６９ｎｍの吸光度を測定して濃度を求めることで、下記式より疎水性基含有量を算出した。
・疎水性基含有量（％）＝（ＣＡＧ／（ＣＨＡＧ＋ＣＡＧ））×１００
・ＣＡＧ：変性されているデキストラン構成単位の濃度（ｍｍｏｌ／ｌ）＝Ａ／εＧＰＥ＊１０００
・Ａ：疎水性基導入デキストランの真の吸光度＝疎水性基を導入したデキストランの吸光度−変性されていないデキストランの吸収
・変性されていないデキストランの吸収＝変性されてないデキストランの吸光度×（疎水性基を導入したデキストランのサンプル濃度（ｍｍｏｌ／ｌ）／変性されてないデキストランのサンプル濃度（ｍｍｏｌ／ｌ））
・εＧＰＥ：グリシジルフェニルエーテルの吸光係数＝１３７２（ｌ／（ｍｏｌ・ｃｍ））
・ＣＨＡＧ：変性されていないデキストラン構成単位の濃度（ｍｍｏｌ／ｌ）＝（変性されてないデキストラン構成単位の濃度（ｇ／ｌ）／デキストラン構成単位（３０６ｇ／ｍｏｌ））×１０００
・変性されてないデキストランス構成単位の濃度（ｇ／ｌ）＝疎水性基を導入したデキストランのサンプル濃度（質量％）×１０−変性されているデキストラン構成単位の濃度（ｇ／ｌ）
・変性されているデキストラン成単位の濃度（ｇ／ｌ）＝（ＣＡＧ×変性されているデキストラン構成単位（４５６ｇ／ｍｏｌ））／１０００
(Evaluation of hydrophobic group content in modified dextran)
A dry powdered dextran (undaturated dextran) and a hydrophobic group-introduced dextran dried to a volatile content of less than 0.1% by mass are each dissolved in pure water at 70 ° C., and a 0.05% by mass aqueous solution sample is prepared. Prepared. The hydrophobic group content was calculated from the following formula by measuring the absorbance of each aqueous solution at 269 nm with a spectrophotometer to determine the concentration.
Hydrophobic group content (%) = (C AG / (C HAG + C AG )) × 100
CAG : Concentration of denatured dextran constituent unit (mmol / l) = A / ε GPE * 1000
-A: True absorbance of hydrophobic group-introduced dextran = Absorbance of hydrophobic group-introduced dextran-Absorption of unmodified dextran-Absorption of unmodified dextran = Absorbance of unmodified dextran × (hydrophobicity) Group-introduced dextran sample concentration (mmol / l) / undenatured dextran sample concentration (mmol / l))
Ε GPE : Absorption coefficient of glycidyl phenyl ether = 1372 (l / (mol · cm))
C HAG : Concentration of unmodified dextran constituent unit (mmol / l) = (concentration of unmodified dextran constituent unit (g / l) / dextran constituent unit (306 g / mol)) × 1000
Concentration of unmodified dextran constituent unit (g / l) = sample concentration of dextran introduced with hydrophobic group (% by mass) x 10-concentration of modified dextran constituent unit (g / l)
Concentration of modified dextran building unit (g / l) = ( CAG x modified dextran building block (456 g / mol)) / 1000
また、上記で得られた変性デキストランを純水に溶解させて４質量％水溶液を調製し、共軸二軸円筒型粘度計（商品名：ＡＲ−Ｇ２、ティー・エイ・インスツルメント社製）を用いて、温度を２０〜８０℃の範囲で変化させたときの水溶液の粘度変化を測定したところ、粘度変化にヒステリシスは見られなかった。
なお、粒子に吸着した変性デキストランの疎水性基含有量を測定する場合は、粒子０．２ｇを１Ｍ硫酸１０ｍｌ中にて、７０℃、５時間処理し、処理液を分光光度計にて２６９ｎｍの吸光度を測定して処理液濃度を求めることで、同様に算出できる。
Further, the modified dextran obtained above was dissolved in pure water to prepare a 4% by mass aqueous solution, and a co-axis biaxial cylindrical viscometer (trade name: AR-G2, manufactured by TA Instruments Co., Ltd.) was prepared. When the change in viscosity of the aqueous solution was measured when the temperature was changed in the range of 20 to 80 ° C., no hysteresis was observed in the change in viscosity.
When measuring the hydrophobic group content of the modified dextran adsorbed on the particles, 0.2 g of the particles was treated in 10 ml of 1 M sulfuric acid at 70 ° C. for 5 hours, and the treated liquid was treated with a spectrophotometer at 269 nm. It can be calculated in the same manner by measuring the absorbance and obtaining the concentration of the treatment liquid.
上記で得られた変性デキストランを２０ｍｇ／ｍＬの変性デキストラン水溶液とし、その水溶液に多孔質ポリマ粒子１を７０ｍＬ／粒子ｇの濃度で投入した後、５５℃で２４時間撹拌して、多孔質ポリマ粒子１に変性デキストランを吸着させた。吸着後、ろ過を行い、熱水で洗浄した。
The modified dextran obtained above is used as a 20 mg / mL modified dextran aqueous solution, and the
次いで、粒子に吸着したデキストランを次のようにして架橋させた。変性デキストランが吸着した粒子１０ｇを分散させた０．４Ｍ水酸化ナトリウム水溶液に０．４Ｍエピクロロヒドリンを添加し、室温にて８時間撹拌した。その後、加熱した２質量％のドデシル硫酸ナトリウム水溶液で洗浄後、純水で洗浄して分離材を得た。得られた分離材を乾燥後、熱質量分析により被覆層の質量（多孔質ポリマ粒子１ｇに対する質量）を測定した。結果を表２に示す。 Next, the dextran adsorbed on the particles was crosslinked as follows. 0.4M epichlorohydrin was added to a 0.4M aqueous sodium hydroxide solution in which 10 g of particles adsorbed by the modified dextran were dispersed, and the mixture was stirred at room temperature for 8 hours. Then, after washing with heated 2 mass% sodium dodecyl sulfate aqueous solution, it was washed with pure water to obtain a separating material. After the obtained separating material was dried, the mass of the coating layer (mass with respect to 1 g of porous polymer particles) was measured by thermogravimetric analysis. The results are shown in Table 2.
（イオン交換基の導入）
分離材の分散液をろ過して得られた分離材（乾燥質量２０ｇ）を５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液２００ｍＬに投入し、室温で１時間放置した。さらに、ジエチルアミノエチルクロライド塩酸塩水溶液２００ｍＬ（ジエチルアミノエチルクロライド塩酸塩６０ｇ相当）を添加し、水溶液の温度を７０℃まで上げ、撹拌しながら８時間反応させた。反応終了後、水溶液をろ過し、水／エタノール（体積比５／１）で３回洗浄して、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基をイオン交換基として有する分離材（ＤＥＡＥ変性分離材）を得た。得られた粒子の細孔径分布におけるモード径、空隙率及び比表面積を、水銀圧入法にて測定した。結果を表２に示す。
(Introduction of ion exchange group)
The separation material (dry mass 20 g) obtained by filtering the dispersion liquid of the separation material was put into 200 mL of a 5 M sodium hydroxide aqueous solution and left at room temperature for 1 hour. Further, 200 mL of an aqueous diethylaminoethyl chloride hydrochloride solution (corresponding to 60 g of diethylaminoethyl chloride hydrochloride) was added, the temperature of the aqueous solution was raised to 70 ° C., and the reaction was carried out for 8 hours with stirring. After completion of the reaction, the aqueous solution was filtered and washed 3 times with water / ethanol (volume ratio 5/1) to obtain a separating material (DEAE modified separating material) having a diethylaminoethyl (DEAE) group as an ion exchange group. The mode diameter, porosity and specific surface area of the obtained particles in the pore size distribution were measured by a mercury intrusion method. The results are shown in Table 2.
（タンパク質の非特異吸着能評価）
得られた分離材０．２ｇをＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ）濃度２４ｍｇ／ｍＬのＴｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）２０ｍＬに投入し、室温で２４時間撹拌を行った。その後、遠心分離で上澄みをとった後、分光光度計を用いたろ液の吸光度を測定し、２８０ｎｍの吸光度からＢＳＡ濃度を求めることにより、粒子に吸着したＢＳＡ量を算出した。非特異吸着量が１ｍｇ／ｍＬ粒子以下の場合を○、１ｍｇ／ｍＬ粒子を超え１０ｍｇ／ｍＬ以下の場合を△、１０ｍｇ／ｍＬを超える場合を×とした。結果を表３に示す。
(Evaluation of non-specific adsorption capacity of protein)
0.2 g of the obtained separating material was put into 20 mL of Tris-hydrochloric acid buffer (pH 8.0) having a BSA (Bovine Serum Albumin) concentration of 24 mg / mL, and the mixture was stirred at room temperature for 24 hours. Then, after the supernatant was obtained by centrifugation, the absorbance of the filtrate was measured using a spectrophotometer, and the BSA concentration was determined from the absorbance at 280 nm to calculate the amount of BSA adsorbed on the particles. The case where the non-specific adsorption amount was 1 mg / mL particles or less was evaluated as ◯, the case where the non-specific adsorption amount exceeded 1 mg / mL particles and 10 mg / mL or less was evaluated as Δ, and the case where the amount exceeded 10 mg / mL was evaluated as ×. The results are shown in Table 3.
（イオン交換容量の評価）
ＤＥＡＥ変性分離材のイオン交換容量を以下のように測定した。５ｍＬ容量の分離材を、０．１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液２０ｍＬに１時間浸漬し、室温で撹拌した。その後、洗浄液として用いた水のｐＨが７以下となるまで洗浄を行った。洗浄した分離材を０．１Ｎの塩酸２０ｍＬに浸漬し、１時間撹拌させた。分離材をろ過で取り除いた後、ろ液の塩酸水溶液を中和滴定することによって、分離材のイオン交換容量を測定した。結果を表３に示す。
(Evaluation of ion exchange capacity)
The ion exchange capacity of the DEAE modified separator was measured as follows. A 5 mL volume of separator was immersed in 20 mL of 0.1 N aqueous sodium hydroxide solution for 1 hour and stirred at room temperature. Then, washing was performed until the pH of the water used as the washing liquid became 7 or less. The washed separator was immersed in 20 mL of 0.1 N hydrochloric acid and stirred for 1 hour. After removing the separating material by filtration, the ion exchange capacity of the separating material was measured by neutralizing and titrating the aqueous hydrochloric acid solution of the filtrate. The results are shown in Table 3.
（カラム特性評価）
分離材をφ７．８×３００ｍｍのステンレスカラムにスラリー（溶媒：メタノール）濃度３０質量％にて１５分間かけて充填した。その後、カラムに流速を変えて水を流し、流速とカラム圧との関係を測定し、カラム圧０．３ＭＰａ時の線流速を算出した。結果を表３に示す。
また、動的吸着量を以下のようにして測定した。２０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）をカラムに１０カラム容量流した。その後、ＢＳＡ濃度２ｍｇ／ｍＬの２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液を流し、ＵＶによりカラム出口でのＢＳＡ濃度を測定した。カラム入口と出口のＢＳＡ濃度が一致するまで液を流し、５カラム容量分の１Ｍ ＮａＣｌのＴｒｉｓ−塩酸緩衝液で希釈した。１０％ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈにおける動的吸着量は以下の式を用いて算出した。結果を表３に示す。
ｑ１０＝ｃｆＦ（ｔ１０−ｔ０）／ＶＢ
ｑ１０：１０％ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈにおける動的吸着量（ｍｇ／ｍＬ ｗｅｔ ｒｅｓｉｎ）
ｃｆ：注入しているＢＳＡ濃度
Ｆ：流速（ｍＬ／ｍｉｎ）
ＶＢ：ベッド体積（ｍＬ）
ｔ１０：１０％ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈにおける時間
ｔ０：ＢＳＡ注入開始時間
(Column characterization)
The separating material was filled in a stainless steel column having a diameter of 7.8 × 300 mm at a slurry (solvent: methanol) concentration of 30% by mass over 15 minutes. Then, water was flowed through the column at different flow velocities, the relationship between the flow velocities and the column pressure was measured, and the linear flow velocity at a column pressure of 0.3 MPa was calculated. The results are shown in Table 3.
In addition, the amount of dynamic adsorption was measured as follows. A 20 mmol / L Tris-hydrochloric acid buffer (pH 8.0) was flowed through the column by 10 column volumes. Then, a 20 mmol / L Tris-hydrochloric acid buffer having a BSA concentration of 2 mg / mL was flowed, and the BSA concentration at the column outlet was measured by UV. The solution was run until the BSA concentrations at the column inlet and outlet were the same, and diluted with Tris-hydrochloric acid buffer of 1 M NaCl in 5 column volumes. The amount of dynamic adsorption at 10% breakthrough was calculated using the following formula. The results are shown in Table 3.
q 10 = c f F (t 10 −t 0 ) / V B
q 10 : Dynamic adsorption amount at 10% breakthrough (mg / mL wet resin)
c f : Injecting BSA concentration F: Flow velocity (mL / min)
V B : Bed volume (mL)
t 10 : Time at 10% breakthrough t 0 : BSA injection start time
（耐アルカリ性評価）
分離材を０．５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液中で２４時間撹拌し、Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄後、カラム特性評価と同様の条件にて充填した。ＢＳＡの１０％ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈ動的吸着量を測定し、アルカリ処理前の動的吸着量と比較した。動的吸着量の減少率が３％以下である場合を○、３％を超え２０％以下である場合を△、２０％を超える場合を×とした。結果を表３に示す。
(Evaluation of alkali resistance)
The separating material was stirred in a 0.5 M aqueous sodium hydroxide solution for 24 hours, washed with Tris-hydrochloric acid buffer (pH 8.0), and then filled under the same conditions as for column characteristic evaluation. The 10% breakthrough dynamic adsorption amount of BSA was measured and compared with the dynamic adsorption amount before the alkali treatment. The case where the reduction rate of the dynamic adsorption amount was 3% or less was evaluated as ◯, the case where it exceeded 3% and 20% or less was evaluated as Δ, and the case where it exceeded 20% was evaluated as ×. The results are shown in Table 3.
（耐久性評価）
８００ｃｍ／ｈの流速で水をカラムに流し、カラム圧を測定後、３０００ｃｍ／ｈに流速を上昇させ、１時間通液させた。再度８００ｃｍ／ｈにカラム圧を下げた際に、カラム圧が初期値（３０００ｃｍ／ｈに流速を上げる前）より１０％以上上昇した場合を×、１０％未満の上昇である場合を○とした。結果を表３に示す。
(Durability evaluation)
Water was flowed through the column at a flow rate of 800 cm / h, the column pressure was measured, the flow rate was increased to 3000 cm / h, and the liquid was passed for 1 hour. When the column pressure was lowered to 800 cm / h again, the case where the column pressure increased by 10% or more from the initial value (before increasing the flow velocity to 3000 cm / h) was evaluated as ×, and the case where the increase was less than 10% was evaluated as ○. .. The results are shown in Table 3.
＜実施例２＞
重量平均分子量（Ｍｗ）が１００００００であるデキストランを使用した以外は、実施例１と同様にして分離材の作製及び評価を行った。変性デキストランの４質量％水溶液について、温度を２０〜８０℃の範囲で変化させたときの水溶液の粘度変化を測定したところ、図１の曲線Ｃ２で示されるように、粘度変化にヒステリシスは見られなかった。また、変性デキストランの疎水性基含有量は、１４．０モル％であった。
<Example 2>
A separating material was prepared and evaluated in the same manner as in Example 1 except that dextran having a weight average molecular weight (Mw) of 1,000,000 was used. When the viscosity change of the 4% by mass aqueous solution of modified dextran was measured when the temperature was changed in the range of 20 to 80 ° C., hysteresis was observed in the viscosity change as shown by the curve C2 in FIG. There wasn't. The hydrophobic group content of the modified dextran was 14.0 mol%.
＜実施例３＞
重量平均分子量（Ｍｗ）が５０００００であるデキストランを使用した以外は、実施例１と同様にして分離材の作製及び評価を行った。変性デキストランの４質量％水溶液について、温度を２０〜８０℃の範囲で変化させたときの水溶液の粘度変化を測定したところ、図１の曲線Ｃ３で示されるように、粘度変化にヒステリシスは見られなかった。また、変性デキストランの疎水性基含有量は、１４．３モル％であった。
<Example 3>
A separating material was prepared and evaluated in the same manner as in Example 1 except that dextran having a weight average molecular weight (Mw) of 500,000 was used. When the viscosity change of the 4% by mass aqueous solution of modified dextran was measured when the temperature was changed in the range of 20 to 80 ° C., hysteresis was observed in the viscosity change as shown by the curve C3 in FIG. There wasn't. The hydrophobic group content of the modified dextran was 14.3 mol%.
＜比較例１＞
重量平均分子量（Ｍｗ）が１００００であるデキストランを使用した以外は、実施例１と同様にして分離材の作製及び評価を行った。変性デキストランの４質量％水溶液について、温度を２０〜８０℃の範囲で変化させたときの水溶液の粘度変化を測定したところ、粘度変化にヒステリシスは見られなかった。また、変性デキストランの疎水性基含有量は、１４．１モル％であった。
<Comparative example 1>
A separating material was prepared and evaluated in the same manner as in Example 1 except that dextran having a weight average molecular weight (Mw) of 10000 was used. When the viscosity change of the 4% by mass aqueous solution of the modified dextran was measured when the temperature was changed in the range of 20 to 80 ° C., no hysteresis was observed in the viscosity change. The hydrophobic group content of the modified dextran was 14.1 mol%.
＜比較例２＞
変性デキストランに代えて重量平均分子量が１００００であるポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を使用した以外は、実施例１と同様にして分離材の作製及び評価を行った。ポリビニルアルコールの４質量％水溶液について、温度を２０〜８０℃の範囲で変化させたときの水溶液の粘度変化を測定したところ、粘度変化にヒステリシスは見られなかった。
<Comparative example 2>
A separating material was prepared and evaluated in the same manner as in Example 1 except that polyvinyl alcohol (PVA) having a weight average molecular weight of 10000 was used instead of the modified dextran. When the change in viscosity of the aqueous solution of 4% by mass of polyvinyl alcohol was measured when the temperature was changed in the range of 20 to 80 ° C., no hysteresis was observed in the change in viscosity.
（比較例３）
変性デキストランに代えて重量平均分子量が１００００である変性アガロースを使用した以外は、実施例１と同様にして分離材の作製及び評価を行った。変性デキストランの４質量％水溶液について、温度を２０〜８０℃の範囲で変化させたときの水溶液の粘度変化を測定したところ、粘度変化にヒステリシスが見られた。
(Comparative Example 3)
A separating material was prepared and evaluated in the same manner as in Example 1 except that modified agarose having a weight average molecular weight of 10000 was used instead of the modified dextran. When the viscosity change of the 4% by mass aqueous solution of modified dextran was measured when the temperature was changed in the range of 20 to 80 ° C., hysteresis was observed in the viscosity change.
（比較例４）
市販のアガロース粒子（Ｃａｐｔｏ ＤＥＡＥ、ＧＥヘルスケア、「多孔質ポリマ粒子２」という）を分離材として使用して、実施例１と同様にして分離材の評価を行った。
(Comparative Example 4)
Commercially available agarose particles (Capto DEAE, GE Healthcare, referred to as "porous polymer particles 2") were used as the separating material, and the separating material was evaluated in the same manner as in Example 1.
表２，３の結果より、多糖類又はその変性体の４質量％水溶液を調製したときに、２０〜８０℃の範囲での温度変化に対する水溶液の粘度変化においてヒステリシスを有さないような多糖類又はその変性体を被覆層に用いることで、イオン交換容量及び耐久性に優れ、かつタンパク質の吸着量の向上及び非特異吸着の低減できることが分かる。 From the results in Tables 2 and 3, when a 4% by mass aqueous solution of a polysaccharide or a modified product thereof was prepared, a polysaccharide having no hysteresis in the change in viscosity of the aqueous solution with respect to a temperature change in the range of 20 to 80 ° C. Alternatively, it can be seen that by using the modified product as the coating layer, the ion exchange capacity and durability are excellent, the amount of protein adsorbed can be improved, and non-specific adsorption can be reduced.
Claims (11)
前記多糖類又はその変性体は、該多糖類又はその変性体の４質量％水溶液を調製したときに、２０〜８０℃の範囲での温度変化に対する前記水溶液の粘度変化においてヒステリシスを有さない、分離材。 It comprises a porous polymer particle and a coating layer containing a polysaccharide having a weight average molecular weight of 40,000 or more or a modified product thereof, which covers at least a part of the surface of the porous polymer particle.
The polysaccharide or a modified product thereof does not have hysteresis in the change in viscosity of the aqueous solution with respect to a temperature change in the range of 20 to 80 ° C. when a 4% by mass aqueous solution of the polysaccharide or the modified product thereof is prepared. Separator.
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