JP6873917B2 - ヌクレアーゼ介在性遺伝子発現調節 - Google Patents
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Description
本出願は、2015年5月12日に出願された米国仮特許出願第62/160,396号、及び2016年3月4日に出願された米国仮特許出願第62/303,595号の利益を主張するものであり、それらの開示内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
BCL11Aエンハンサー配列を標的にすることによりHbFを増加させる機構が提供される。例えば、米国特許公開第20150132269号を参照のこと。ゲノムワイド関連解析により、HbF高レベルに関連する、BCL11Aでの一組の遺伝子変異型が同定されている。これらの変異型は、系譜が限定された段階特異的なエンハンサー領域として機能するBCL11Aの非コード領域に見られるSNPの集まりである。さらなる研究により、このBCL11Aエンハンサーは、BCL11Aが発現するために赤血球細胞においては必要とされるが、B細胞での発現には必要とされないことが明らかになった(Bauer et al,(2013)Science343:253−257を参照のこと)。エンハンサー領域はBCL11A遺伝子のイントロン2内で見出され、イントロン2内に3つのDNAseI高感受性領域(調節能に関連する、クロマチンの状態を示すことが多い)が同定された。これらの3領域は、BCL11Aの転写開始部位からのキロベース単位の距離に従って「+62」、「+58」及び「+55」として同定された。これらのエンハンサー領域は、約350(+55)、550(+58)、及び350(+62)のヌクレオチド長である(Bauer2013、同書)。
したがって、BCL11A遺伝子発現を改変して、例えば鎌状赤血球症及びベータサラセミアなどのヘモグロビン異常症を治療するためのさらなる方法及び組成物が必要とされている。
(i)F1:STGNLTN(配列番号7)、
F2:TSGSLTR(配列番号5)、
F3:DQSNLRA(配列番号2)、及び
F4:AQCCLFH(配列番号6)、または
(ii)F1:DQSNLRA(配列番号2)、
F2:RPYTLRL(配列番号3)、
F3:SRGALKT(配列番号8)、
F4:TSGSLTR(配列番号5)、
F5:DQSNLRA(配列番号2)、及び
F6:AQCCLFH(配列番号6)、
(iii)F1:DQSNLRA(配列番号2)、
F2:RNFSLTM(配列番号9)、
F3:SNGNLRN(配列番号10)もしくはSTGNLTN(配列番号7)もしくはSSYNLAN(配列番号11)、
F4:TSGSLTR(配列番号5)、
F5:DQSNLRA(配列番号2)、及び
F6:AQCCLFH(配列番号6)、または
(iv)F1:RSDHLTQ(配列番号13)、
F2:QSGHLAR(配列番号14)、
F3:QKGTLGE(配列番号15)、
F4:RHRDLSR(配列番号18)、及び
F5:RRDNLHS(配列番号17)、または
(v)F1:RNDHRTT(配列番号19)、
F2:QKAHLIR(配列番号20)、
F3:QKGTLGE(配列番号15)、
F4:RGRDLSR(配列番号21)もしくはLKRTLKR(配列番号25)、及び
F5:RRDNLHS(配列番号17)、または
(vi)F1:RSDHLTQ(配列番号13)、
F2:QRAHLTR(配列番号22)、
F3:QKGTLGE(配列番号15)もしくはQSGTRNH(配列番号24)、
F4:HRNTLVR(配列番号23)、及び
F5:RRDNLHS(配列番号17)、または
(vii)F1:RSDHLTQ(配列番号13)、
F2:QKAHLIR(配列番号20)、
F3:QKGTLGE(配列番号15)もしくはQSGTRNH(配列番号24)、
F4:RGRDLSR(配列番号21)、及び
F5:RRDNLHS(配列番号17)、または
(viii)F1:F1:RSDHLTQ(配列番号13)、
F2:QSGHLAR(配列番号14)、
F3:QSGTRNH(配列番号24)、
F4:QSSDLSR(配列番号16)、及び
F5:RRDNLHS(配列番号17)。
本明細書に開示する方法、ならびに組成物の調製と使用の実施には、特に明記しない限り、分子生物学、生化学、クロマチン構造と解析、計算化学、細胞培養、組換えDNA及び当技術分野の技能の範囲内である関連分野の従来技術が採用される。これらの技術は文献で十分に説明されている。例えば、Sambrook et al.MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,Second edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989及びThird edition,2001;Ausubel et al.,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY、John Wiley&Sons,New York,1987及び定期更新版;METHODS IN ENZYMOLOGYシリーズ,Academic Press,San Diego;Wolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION,Third edition,Academic Press,San Diego,1998;METHODS IN ENZYMOLOGY,Vol.304,“Chromatin」(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe,eds.),Academic Press,San Diego,1999;及びMETHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,Vol.119,“Chromatin Protocols」(P.B.Becker,ed.)Humana Press,Totowa,1999を参照のこと。
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、及び「オリゴヌクレオチド」という用語は同じ意味で使用され、直鎖または環状のコンホメーションをした一本鎖もしくは二本鎖形態にある、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーを指す。本開示の目的の場合、これらの用語は、ポリマーの長さについて限定するものと解釈されるべきではない。これらの用語は、天然型ヌクレオチドの既知の類似体、ならびに塩基部分、糖部分及び/またはリン酸部分(例えば、ホスホロチオエート骨格)が改変されているヌクレオチドを包含し得る。一般に、特定のヌクレオチドの類似体は塩基対合の特異性が同じであり、すなわち、Aの類似体はTと塩基対合することになる。
本明細書は、導入遺伝子が標的を定めてゲノムに組み込まれるよう、導入遺伝子と、細胞ゲノムを切断するヌクレアーゼとを担持するドナー分子をインビボで切断するのに有用な組成物、特にヌクレアーゼについて記載する。ある実施形態では、ヌクレアーゼの1つ以上は天然に生じるものである。他の実施形態では、ヌクレアーゼの1つ以上は、天然には生じない、すなわち、DNA結合ドメイン及び/または切断ドメイン内で人工的に操作されている。例えば、天然に生じるヌクレアーゼのDNA結合ドメインを、選択標的部位に結合するよう改変してよい(例えば、対応する結合部位とは異なる部位に結合するよう人工的に操作されたメガヌクレアーゼ)。他の実施形態では、ヌクレアーゼは、異種のDNA結合ドメイン及び切断ドメインを含む(例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ;TALエフェクタードメインのDNA結合タンパク質;メガヌクレアーゼDNA結合ドメインと、異種の切断ドメイン)。
ある実施形態では、細胞ゲノムのインビボでの切断及び/または標的化切断に使用される1つ以上のヌクレアーゼのDNA結合ドメインは、ジンクフィンガータンパク質を含む。好ましくは、ジンクフィンガータンパク質は、天然には生じないジンクフィンガータンパク質であり、選択標的部位に結合するよう人工的に操作されたジンクフィンガータンパク質である。例えば、いずれも参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Beerli et al.(2002)Nature Biotechnol.20:135−141;Pabo et al.(2001)Ann.Rev.Biochem.70:313−340;Isalan et al.(2001)Nature Biotechnol.19:656−660;Segal et al.(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12:632−637;Choo et al.(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.10:411−416;米国特許第6,453,242号;第6,534,261号;第6,599,692号;第6,503,717号;第6,689,558号;第7,030,215号;第6,794,136号;第7,067,317号;第7,262,054号;第7,070,934号;第7,361,635号;第7,253,273号;及び米国特許公開第2005/0064474号;2007/0218528号;2005/0267061号を参照のこと。
好適な任意の切断ドメインを、本明細書に記載するDNA結合ドメインに機能的に連結して、ヌクレアーゼを形成することができる。切断ドメインは、DNA結合ドメイン、例えばジンクフィンガーDNA結合ドメイン及びヌクレアーゼ由来の切断ドメインにとって異種であってよい。異種切断ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインが由来し得る例示的なエンドヌクレアーゼには、制限エンドヌクレアーゼ及びホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されるものではない。例えば、2002−2003 Catalogue,New England Biolabs,Beverly,MA;及びBelfort et al.(1997)Nucleic Acids Res.25:3379−3388を参照のこと。DNAを切断するさらなる酵素が公知である(例えば、S1ヌクレアーゼ;マングビーンヌクレアーゼ;膵DNaseI;ミクロコッカスヌクレアーゼ;酵母HOエンドヌクレアーゼ;Linn et al.(eds.)Nucleases,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1993も参照のこと)。これらの酵素の1つ以上(またはその機能的断片)を切断ドメイン及び切断ハーフドメインの供給源として使用できる。
上記で詳述されるように、DNAドメインを人工的に操作して、どのような選択配列にも結合させることができる。人工的に操作されたDNA結合ドメインは、天然に生じるDNA結合ドメインと比べて新規な結合特異性を有し得る。ある実施形態では、DNA結合ドメインは、BCL11Aエンハンサー配列内の配列に結合し、例えば、標的部位(典型的に、塩基対は9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21またはそれ以上)はBCL11Aのエキソン2とエキソン3の間にあり、これには、表1に示すBCL11Aエンハンサー配列のDNAseI高感受性部位内の配列(例えば、+58)に結合するDNA結合ドメインが含まれる。人工的操作方法には合理的設計及び各種の選択が挙げられるが、これらに限定されるものではない。合理的設計には、例えば、3ヌクレオチド(または4ヌクレオチド)の配列及び個々のジンクフィンガーのアミノ酸配列を含むデータベースの使用が挙げられ、これにおいて、3ヌクレオチド配列または4ヌクレオチド配列の各々は、特定の3ヌクレオチド配列または4ヌクレオチド配列と結合する、ジンクフィンガーの1つ以上のアミノ酸配列に関連している。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、共有米国特許第6,453,242号及び第6,534,261号を参照のこと。TALエフェクタードメインの合理的設計も実施され得る。例えば、米国公開第20110301073号を参照のこと。
ある実施形態では、本開示は、本明細書に記載するBCL11Aエンハンサー領域結合分子を使用して外来配列を細胞のゲノムに組み込む、ヌクレアーゼ介在性の標的化組込みに関する。上記のように、外来配列(「ドナー配列」または「ドナー」または「導入遺伝子」とも呼ばれる)の挿入は、例えば、特定領域の欠損及び/または変異遺伝子の修正または野生型遺伝子の発現増加のために行う。ドナー配列が、典型的に、それが配置されるゲノム配列と同一ではないことは容易に明らかとなるであろう。ドナー配列に、相同性のある2つの領域が隣接する非相同配列を含有させて、関心対象の位置において効率的なHDRを行わせることができ、または、非相同組換え型修復機構を介してドナー配列を組み込むことができる。さらに、ドナー配列は、細胞クロマチン内の関心対象領域に相同ではない配列を含有するベクター分子を含むことができる。ドナー分子は、細胞クロマチンに対して相同性のあるいくつかの不連続領域を含有することができ、例えば、ここに記載のヌクレアーゼの1つによって誘導されたDBSの修復用基質として使用した場合に、Bcl11aエンハンサー領域(またはその断片)の欠損をもたらす。さらに、関心対象領域に通常存在しない配列を標的化挿入する場合、上記配列をドナー核酸分子に存在させ、関心対象領域内の配列に対して相同性のある領域を隣接させることができる。
本明細書に記載するヌクレアーゼ(表1)、これらのヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチド及び本明細書に記載するタンパク質及び/またはポリヌクレオチドを含む組成物は、任意の好適な手段によってインビボまたはエキソビボで任意の細胞型に送達され得る。
本明細書には、本明細書に記載するヌクレアーゼ(表1)によって内在性BCL11Aエンハンサー配列が改変される細胞及び/または細胞株も記載される。改変は、例えば、細胞の野生型配列と比較した場合のものであってよい。細胞または細胞株は、改変には、ヘテロ接合体またはホモ接合体であってよい。BCL11A配列に対する改変は、挿入、欠失及び/またはその組み合わせを含んでよい。
本明細書に開示する方法及び組成物は、タンパク質の発現を改変すること、または鎌状赤血球症またはサラセミアなどの遺伝性疾患で発現されるタンパク質をコードする異常な遺伝子配列を修正することを目的とする。したがって、方法及び組成物により、そのような遺伝性疾患の治療及び/または予防が提供される。ゲノム編集(例えば、幹細胞)を使用して、異常遺伝子の修正、野生型遺伝子の挿入、または内在性遺伝子の発現の変更が可能である。非限定的な例として、野生型遺伝子、例えば、少なくとも1つのグロビン(例えば、α及び/またはβグロビン)をコードする遺伝子を細胞に挿入して(例えば、本明細書に記載する1つ以上のヌクレアーゼを使用して内在性BCL11aエンハンサー配列に挿入)、細胞で欠損及び/または欠落しているグロビンタンパク質を提供し、これによりグロビン発現不良が原因の遺伝性疾患、例えば、異常ヘモグロビン症を治療する。あるいは、またはさらに、適切なドナー投与の有無にかかわらず、ゲノム編集により、不良な内在性遺伝子の修正、例えば、α−ヘモグロビンまたはβ−ヘモグロビンにおける点変異の修正を行って遺伝子の発現を修復すること、及び/または遺伝性疾患、例えば、鎌状赤血球症を治療すること、及び/または任意の直接もしくは間接的なグロビン調節遺伝子のノックアウトもしくは改変(過剰発現または抑制)(例えば、γグロビン調節遺伝子BCL11AまたはBCL11A調節因子KLF1の不活性化)を行うことができる。具体的には、本発明の方法及び組成物は、ヘモグロビン異常症の治療または予防に使用される。
ヒトBCL11A遺伝子に対してZFNを構築し、Miller et al.(2007)Nat.Biotechnol.25:778−785に記載のようにCEL1アッセイで試験した。エンハンサー領域の+58領域に対して特異的なZFNを記載のように作製した。ヌクレアーゼを下記表1に示す:
表1:BCL11Aエンハンサー領域の+58に特異的なZFN対
簡単に言うと、ヒトK562細胞を、10%FBSを添加したRPMIで培養し、200,000細胞を、左及び右のZFNパートナーをコードするそれぞれのプラスミドDNAを最適下限濃度の25ng用いてAmaxa Nucleofector(登録商標)により製造者の指示書にしたがいトランスフェクションした(表2a)。さらに、左のZFN25ng及び右のZFN5ngを用いて実験を実施した(表2b)。Perez et al.(2008)Nat.Biotechnol.26:808−816及びGuschin et al.(2010)Methods Mol Biol.649:247−56)に記載のCel−Iアッセイ(Surveyor(商標)、Transgenomics)を使用してトランスフェクション後2日目または3日目のZFN誘導性の標的遺伝子改変を検出した。このアッセイでは、標的部位のPCR増幅の後、配列決定によって挿入及び/または欠失(「インデル」)の定量を行った。Illuminaプラットフォーム(「miSEQ」)によるディープシークエンシングを製造者の指示書にしたがって使用し、編集効率ならびに編集で作製されたアレルの性質を測定した。結果は下記表2に示され、数字は観察されたパーセントNHEJ活性を指す:
表2a:K562細胞におけるマトリックスのスクリーニング(各ZFN25ng)
表3:各種ドメインリンカーとZFN活性
本明細書に記載するZFNもまたヒトCD34+細胞で試験した。CD34+形質導入では、BTX ECM830装置で2mmギャップのキュベットを使用した。組織培養未処理プレート内で、1xCC110(Stem cell Technology)を含むx−vivo10培地(Lonza)でヒトCD34+細胞を増殖させた。細胞を計数し、室温で10分間1200rpmで遠心分離を行って採取した。細胞を室温のPBSで1〜2回洗浄した。各トランスフェクションにつき200,000細胞を使用し、それらを100μLのBTexpress溶液に再懸濁させた。CD34+の実験では、DNAではなく、ZFNをコードするRNAを使用した。mMessageMachine T7 Ultra Kit(Ambion)を使用してRNAを作製した。トランスフェクションあたり、各ZFNをコードするRNAを500ng加え、混合物をキュベットに移した。移した直後、混合物に250Vで5ミリ秒の電気穿孔を行った。予め温めた培地をキュベットに加え、培地と細胞を合わせて48ウェル組織培養未処理プレートに移し、その後37℃でインキュベートした。
表4:CD34+細胞におけるZFN活性
表5A及び5B:高濃度ZFNでもたらされる高活性
表5A
表6:mRNAインプット増量に伴うBcl11aエンハンサーの改変
表7は、リンカー同一性がZFN対の活性に与える効果を示す。
表7:CD34+細胞を用いたリンカー同一性がZFN活性に与える効果
相対的ガンマグロビン発現に対する効果を検討するため、ZFN対の代表的試料をコードするmRNAを、BTX nucleofectionで製造者の指示書にしたがいCD34+細胞(健常ドナーボランティアから入手)に導入した。その後、細胞を赤血球に分化させた。簡単に言うと、Ficoll−Paque(GE Healthcare)及びCD34+マイクロビーズ(Miltenyi Biotec)を製造者の指示にしたがって使用しCD34+細胞を精製した。増殖因子の存在下で、BIT95000(StemCell Technologies)を含むIscove’s MDMでCD34+細胞を培養した。3ステップ液体培養モデルを使用して細胞を赤血球系列へ分化させた。最初の6日間(第1段階)は、SCF(100ng/ml)、Flt3−L(100ng/ml)、及びIL−3(20ng/ml)を用いてCD34+細胞を増殖させた。次いで、増殖した細胞は、Epo(2U/ml)及びSCF(50ng/ml)を用いて、系列決定させ赤血球系列へ向けて分化させた(第2段階)。Giarratana et al.(2011)Blood118(19):5071−9を参照のこと。
表8:編集されたCD34+細胞でのアルファグロビンまたはベータグロビンに対するガンマグロビン発現の変化
表9:高比率のヒトガンマグロビン発現
ヒト末梢血から単離された、動員されたヒトCD34+細胞及び骨髄から単離されたCD34+細胞で2対のZFNの活性を試験した。簡単に言うと、CD34+細胞を以下のとおり健常ドナーから単離した。白血球除去による採取物は、低速遠心分離及び上清除去を行って血小板を除去した。血小板除去後、抗CD34磁気マイクロビーズ(Miltenyi Biotec、ドイツ)で細胞を標識化し、Miltenyi CliniMACS Plus Cell Separator Systemを使用して陽性選択を行った。選択後、陽性画分(濃縮CD34+HSPC)を洗浄し、培地(すなわち、2mM L−グルタミン、FMS様チロシンキナーゼ3−リガンド(Flt−3L)100ng/mlずつ、幹細胞因子(SCF)、及びトロンボポチエン(TPO)を添加したX−VIVO10培地)に1×106細胞/mLで再懸濁させ、VueLife培養バッグ(Saint−Gobain、Gaithersburg、MD)に移し37℃/5%CO2でインキュベートした。骨髄由来CD34+細胞の精製では、ヒドロキシエチルデンプン沈降法で採取物から赤血球(RBC)を除去した。RBC除去後、抗CD34磁気マイクロビーズ(Miltenyi Biotec、ドイツ)で細胞を標識化し、Miltenyi CliniMACS Prodigyを使用して陽性選択を行った。選択後、陽性画分(濃縮CD34+HSPC)を洗浄し、培地(すなわち、2mM L−グルタミン、FMS様チロシンキナーゼ3−リガンド(Flt−3L)100ng/mlずつ、幹細胞因子(SCF)、及びトロンボポチエン(TPO)を添加したX−VIVO10培地)に1×106細胞/mLで再懸濁させ、VueLife培養バッグ(Saint−Gobain、Gaithersburg、MD)に移し37℃/5%CO2でインキュベートした。
表10a:単一mRNA種と2つのmRNA種の比較(%インデル)
不偏捕捉分析
捕捉アッセイは、標的細胞にヌクレアーゼと二重鎖DNAドナーとを共導入することにより、結果として生じたゲノム切断部位の画分に、NHEJ DNA修復経路を介してドナーが「捕捉」されることの観察に基づいている(Orlando et al,(2010)Nucleic Acids Res.38(15)e152;Gabriel,R.et al.(2011).Nat Biotechnol.29:816−23.)。この捕捉事象は相同性で誘導されるものではないことに留意されたい(事実、二重鎖DNAドナーは、ヒトゲノムに対するいかなる相同性も含有していない)。さらに、ZFNをコードするmRNAは、DNA切断内に捕捉されることはできず、二重鎖DNAドナーのみができることにも留意されたい。一旦二重鎖ゲノムがトラップされると、切断事象の永久タグを表す。ゲノムDNA単離後、ドナーから隣接ゲノム配列内へのプライマー伸長法で捕捉部位を同定し、その後、アダプターライゲーション、PCR、及び得られるドナー−ゲノム結合の配列決定を行ってよい。
表11:骨髄由来CD34+、対A及び対Bのオフターゲット分析
次に我々は、Maxcyte GT電気穿孔装置を使用してCD34+細胞でZFN対を用いて、より大規模の実験を行った。上記のように正常ドナー由来の末梢血から単離された、動員されたCD34+細胞(PB)を以下のとおり試験した:細胞(試料あたり300万)をRT Maxcyte EP緩衝液に再懸濁させ最終濃度を30 e6細胞/mLとした。細胞をmRNAと混合し、製造者指定のプログラムを使用して電気穿孔を行った。細胞を37℃で20分間、手短に回復させた後、希釈してコールドショック条件(30℃で一晩)に供してから細胞を37℃で回復させた。2〜3日後に活性を分析した。対A及びB対の両方を用いて前述のように実験を行い、ここでは、各対を単一mRNA上に導入した(図5A)。ZFN対B(SBS51857/51949)もまた、単一mRNAまたは2つの別個のmRNAとして上記のように試験した(図5b)。これらの実験では、対Bは最も高い活性を示した。
上記のように、CD34+ヒト細胞を、+58エンハンサー特異的ZFNをコードするmRNAで処理し、その後NSGマウスに生着させる。CD34+細胞は、健常ヒトボランティアから得る。ある場合には、血液成分分離の前にG−CSF(Neupogen(登録商標))またはG−CSF+プレリキサフォル(Mozobil(登録商標))を使用して、CD34+動員戦略を実施した。血液成分分離の前に製造者の指示書にしたがってG−CSFを4日間連日投与する。プレリキサフォルを使用した場合は、やはり製造者の指示書にしたがって回収前の最終夜に投与した。標準的方法で血液成分分離を実施する。Miltenyi CliniMACsシステムを標準的方法かつ製造者の指示書にしたがって使用し、動員されたPBMC leukopakでCD34+細胞を濃縮した。
ZFNの活性をヒト末梢血から単離された、動員されたヒトCD34+細胞及び骨髄から単離されたCD34+細胞で試験した。5人のβサラセミア対象から得たHSPC(P11、P18、P04、P08及びP19とする)を動員し、記載のとおり精製した(Yannaki et al.(2012)Mol Ther20(1):230)。いずれの実験でも、解凍後2日目に、BTXエレクトロポレーター(マサチューセッツ州ホリストン、電圧=250V、パルス長=5ms)を使用して、100μLのBTX Express電気穿孔溶液中で200,000のCD34+細胞に電気穿孔を行った。トランスフェクションでは、4μgの緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードするmRNA(電気穿孔効率についての対照として、また、電気穿孔自体の非特異的効果及び細胞へのmRNA導入の非特異的効果を検査するため)、または4μg及び8μgのSB51857−2a−51949 mRNAを使用した。
表13:MiSeqによるBCL11A遺伝子改変分析
また我々は、SB ZFNで処理したCD34+細胞由来赤血球細胞の評価を、2つの主要項目に関して単一細胞レベルで行った:(1)個々の細胞間のZFN作用を評価することによるBCL11A赤血球エンハンサー領域のアレルの分布、及び(2)個々のアレル(野生型及び遺伝子改変型)の分布が胎児グロビンレベルに与える効果(γ/βグロビンmRNA比で評価)。したがって、SB ZFN HSPCに見られる単一CD34+細胞を選別しインビトロで分化させた。得られる単一細胞に由来するヘモグロビン化細胞コロニーを個別に回収した。各コロニーのゲノムDNA(gDNA)を、BCL11A赤血球エンハンサーのSB ZFN標的領域において配列決定し、遺伝子座が破壊されているかどうかを決定し、破壊されている場合、作製されている遺伝子座の正確なアレル型を決定した。さらに、同一のコロニーからトータルRNAを単離し、これらの個々のクローンにおけるグロビン発現レベルをリアルタイム定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT qPCR)で分析した。
単一細胞試験では、トランスフェクションしたSB ZFN HSPC細胞を37℃で解凍し、10mLのX VIVOに室温で加え、450×gにて5分、室温で遠心にかけた。細胞ペレットを、Flt3L、TPO、及びSCF(各100ng/mL)、ペニシリン(100U/mL)、及びストレプトマイシン(100μg/mL)を添加したX VIVO培地に1×106/mLで再懸濁させた。24ウェル組織培養未処理プレート内で37℃、5%CO2にて加湿インキュベーターで一晩培養し、細胞を採取して遠心にかけ、0.5%ウシ血清アルブミンを添加したリン酸緩衝生理食塩液(PBS)に2×106/mLで再懸濁させた。96ウェルU字底TC未処理プレートに入れたステップ1の赤血球培地(200μL/ウェル)内に2細胞/ウェルで細胞を入れ、FACS Aria IIIを使用して選別した。ステップ1の赤血球培地は、ペニシリン100U/mL、ストレプトマイシン100μg/mL、5%ヒトAB+血漿、ヒトホロトランスフェリン330μg/mL、ヒトインスリン20μg/mL、ヘパリン2U/mL、組換え型ヒトエリスロポエチン3U/mL、SCF100ng/mL、IL3 5ng/mL、及びヒドロコルチゾン1μM/mLを添加した、Glutamax含有イスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM)で構成された。ステップ1赤血球培地で37℃、5%CO2で7日間培養後、ウェルあたり150μLの培地を除去し、ステップ2赤血球培地100μLと交換した。この培地は、ステップ1培地と同様であるが、IL3及びヒドロコルチゾンを加えなかった。さらに4日培養後、ウェルあたり100μLの培地を除去し、ステップ3培地100μLと交換した。この培地は、ステップ2培地と同様であるが、SCFを含んでいなかった。
この試験では、120μg/mlまたは80μg/mlのSB ZFNをCD34+細胞にトランスフェクションしてSB ZFN HSPC細胞を作製し、トランスフェクション後3日目に細胞試料を採取して、ディープシークエンシングによりBCL11A赤血球エンハンサー領域の破壊レベルについて分析した。これにより、実験1ではSB ZFNトランスフェクション試料のBCL11Aアレル約67%が改変され、実験2では58%が改変されたことが明らかになった(表14)。
表14:SB ZFNでトランスフェクションしたHSPC由来の単一細胞赤血球培養物の遺伝子型決定
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
F1からF4、F1からF5またはF1からF6で表される4つ、5つまたは6つのフィンガーを含み、各フィンガーが標的サブサイトを認識する認識ヘリックス領域を含むジンクフィンガータンパク質であって、前記タンパク質は、
(i)以下の認識ヘリックス領域を含むタンパク質:
F1:STGNLTN(配列番号7)、
F2:TSGSLTR(配列番号5)、
F3:DQSNLRA(配列番号2)、及び
F4:AQCCLFH(配列番号6)、または
(ii)以下の認識ヘリックス領域を含むタンパク質:
F1:DQSNLRA(配列番号2)、
F2:RPYTLRL(配列番号3)、
F3:SRGALKT(配列番号8)、
F4:TSGSLTR(配列番号5)、
F5:DQSNLRA(配列番号2)、及び
F6:AQCCLFH(配列番号6)、
(iii)以下の認識ヘリックス領域を含むタンパク質:
F1:DQSNLRA(配列番号2)、
F2:RNFSLTM(配列番号9)、
F3:SNGNLRN(配列番号10)またはSTGNLTN(配列番号7)またはSSYNLAN(配列番号11)、
F4:TSGSLTR(配列番号5)、
F5:DQSNLRA(配列番号2)、及び
F6:AQCCLFH(配列番号6)、または
(iv)以下の認識ヘリックス領域を含むタンパク質:
F1:RSDHLTQ(配列番号13)、
F2:QSGHLAR(配列番号14)、
F3:QKGTLGE(配列番号15)、
F4:RHRDLSR(配列番号18)、及び
F5:RRDNLHS(配列番号17)、または
(v)以下の認識ヘリックス領域を含むタンパク質:
F1:RNDHRTT(配列番号19)、
F2:QKAHLIR(配列番号20)、
F3:QKGTLGE(配列番号15)、
F4:RGRDLSR(配列番号21)またはLKRTLKR(配列番号25)、及び
F5:RRDNLHS(配列番号17)、または
(vi)以下の認識ヘリックス領域を含むタンパク質:
F1:RSDHLTQ(配列番号13)、
F2:QRAHLTR(配列番号22)、
F3:QKGTLGE(配列番号15)またはQSGTRNH(配列番号24)、
F4:HRNTLVR(配列番号23)、及び
F5:RRDNLHS(配列番号17)、または
(vii)以下の認識ヘリックス領域を含むタンパク質:
F1:RSDHLTQ(配列番号13)、
F2:QKAHLIR(配列番号20)、
F3:QKGTLGE(配列番号15)またはQSGTRNH(配列番号24)、
F4:RGRDLSR(配列番号21)、及び
F5:RRDNLHS(配列番号17)、または
(viii)以下の認識ヘリックス領域を含むタンパク質:
F1:RSDHLTQ(配列番号13)、
F2:QSGHLAR(配列番号14)、
F3:QSGTRNH(配列番号24)、
F4:QSSDLSR(配列番号16)、及び
F5:RRDNLHS(配列番号17)
からなる群から選択される、前記ジンクフィンガータンパク質。
(項目2)
項目1に記載のジンクフィンガータンパク質及び機能性ドメインを含む、融合タンパク質。
(項目3)
前記機能性ドメインは、転写活性化ドメイン、転写抑制ドメイン、または、切断ドメインである、項目2に記載の融合タンパク質。
(項目4)
項目1〜3のいずれかに記載のジンクフィンガータンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(項目5)
項目2もしくは項目3に記載の融合タンパク質または項目4に記載のポリヌクレオチドを含む、細胞。
(項目6)
前記細胞は、幹細胞または前駆細胞である、項目5に記載の細胞。
(項目7)
前記細胞はヒト細胞である、項目6に記載の細胞。
(項目8)
前記細胞のゲノムは融合タンパク質により改変される、項目5〜7のいずれかに記載の細胞。
(項目9)
前記ゲノム改変は、挿入、欠失及びその組み合わせからなる群から選択される、項目8に記載の細胞。
(項目10)
前記ゲノム改変は、BCL11Aエンハンサー配列の+58領域内にある、項目8または9に記載の細胞。
(項目11)
項目5〜10のいずれかに記載の細胞から作製される、細胞または細胞株。
(項目12)
項目5〜11のいずれかに記載の細胞または細胞株に由来する、部分的または完全に分化した細胞。
(項目13)
前記細胞は、ゲノム改変を行わない細胞と比較した場合にガンマ及び/またはベータグロビンの発現増加を示す、項目5〜12のいずれかに記載の細胞。
(項目14)
項目2もしくは項目3に記載の融合タンパク質、項目4に記載のポリヌクレオチド、または項目5〜13のいずれかに記載の細胞を含む、医薬組成物。
(項目15)
細胞の内在性BCL11aエンハンサー配列を改変する方法であって、前記内在性BCL11aエンハンサー配列が改変されるように、項目2もしくは項目3に記載の融合タンパク質または項目4に記載のポリヌクレオチドを、前記細胞に投与することを含む、前記方法。
(項目16)
前記細胞に外来配列を導入し、前記内在性BCL11aエンハンサー配列に前記外来配列が挿入されるようにすることをさらに含む、項目15に記載の方法。
(項目17)
前記改変は欠失を含む、項目15に記載の方法。
(項目18)
対象においてグロビン生成を増加させる方法であって、
前記対象に項目5〜13のいずれかに記載の細胞を投与することを含む、前記方法。
(項目19)
前記対象はヒトであり、前記細胞はヒト幹細胞またはヒト前駆細胞である、項目18に記載の方法。
(項目20)
前記細胞を骨髄移植で投与し、前記細胞は前記対象内で生着し、分化し、かつ成熟する、項目19に記載の方法。
(項目21)
前記対象は異常ヘモグロビン症に罹患している、項目18〜20のいずれかに記載の方法。
(項目22)
前記異常ヘモグロビン症はベータサラセミアまたは鎌状赤血球症である、項目21に記載の方法。
(項目23)
内在性BCL11Aエンハンサー配列内にゲノム改変を含む遺伝子改変細胞を作製する方法であって、
a)細胞と、項目2または項目3に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドとを接触させ、ここで、前記融合タンパク質は切断ドメインを含み、
b)前記ポリヌクレオチドから前記融合タンパク質の発現が導かれる条件に前記細胞を供し、かつ
c)遺伝子改変細胞を作製するために十分な発現融合タンパク質を用いて前記内在性BCL11Aエンハンサー配列を改変する、各工程を含む、前記方法。
(項目24)
前記細胞を少なくとも1つのサイトカインで刺激することをさらに含む、項目23に記載の方法。
(項目25)
項目1〜3のいずれかに記載のタンパク質、項目4に記載のポリヌクレオチド及び/または項目5〜13のいずれかに記載の細胞を含む、キット。
Claims (23)
- 左及び右のジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)を含むジンクフィンガーヌクレアーゼであって、各ZFNが、切断ドメインと、F1からF4、F1からF5またはF1からF6で表される4つ、5つまたは6つのジンクフィンガードメインを含むジンクフィンガータンパク質とを含み、
(a)前記左のZFNが、
(i)以下の認識ヘリックス領域を含むジンクフィンガータンパク質(ZFP):
F1:DQSNLRA(配列番号2)、
F2:RNFSLTM(配列番号9)、
F3:SNGNLRN(配列番号10)またはSSYNLAN(配列番号11)、
F4:TSGSLTR(配列番号5)、
F5:DQSNLRA(配列番号2)、及び
F6:AQCCLFH(配列番号6)、または
(ii)以下の認識ヘリックス領域を含むZFP:
F1:STGNLTN(配列番号7)、
F2:TSGSLTR(配列番号5)、
F3:DQSNLRA(配列番号2)、及び
F4:AQCCLFH(配列番号6)、または
(iii)以下の認識ヘリックス領域を含むZFP:
F1:DQSNLRA(配列番号2)、
F2:RPYTLRL(配列番号3)、
F3:SRGALKT(配列番号8)、
F4:TSGSLTR(配列番号5)、
F5:DQSNLRA(配列番号2)、及び
F6:AQCCLFH(配列番号6)
を含み、かつ
(b)前記右のZFNが、
(iv)以下の認識ヘリックス領域を含むZFP:
F1:RNDHRTT(配列番号19)、
F2:QKAHLIR(配列番号20)、
F3:QKGTLGE(配列番号15)、
F4:LKRTLKR(配列番号25)、及び
F5:RRDNLHS(配列番号17)、
(v)以下の認識ヘリックス領域を含むZFP:
F1:RSDHLTQ(配列番号13)、
F2:QSGHLAR(配列番号14)、
F3:QKGTLGE(配列番号15)、
F4:RHRDLSR(配列番号18)、及び
F5:RRDNLHS(配列番号17)、または
(vi)以下の認識ヘリックス領域を含むZFP:
F1:RSDHLTQ(配列番号13)、
F2:QRAHLTR(配列番号22)、
F3:QKGTLGE(配列番号15)またはQSGTRNH(配列番号24)、
F4:HRNTLVR(配列番号23)、及び
F5:RRDNLHS(配列番号17)、または
(vii)以下の認識ヘリックス領域を含むZFP:
F1:RSDHLTQ(配列番号13)、
F2:QKAHLIR(配列番号20)、
F3:QKGTLGE(配列番号15)またはQSGTRNH(配列番号24)、
F4:RGRDLSR(配列番号21)、及び
F5:RRDNLHS(配列番号17)、または
(viii)以下の認識ヘリックス領域を含むZFP:
F1:RSDHLTQ(配列番号13)、
F2:QSGHLAR(配列番号14)、
F3:QSGTRNH(配列番号24)、
F4:QSSDLSR(配列番号16)、及び
F5:RRDNLHS(配列番号17)
を含む、前記ジンクフィンガーヌクレアーゼ。 - 野生型または操作した切断ドメイン、あるいは、野生型または操作した切断ハーフドメインを含む、請求項1に記載のジンクフィンガーヌクレアーゼ。
- 請求項1または請求項2に記載のZFNをコードする1つ以上のポリヌクレオチド。
- 請求項1もしくは請求項2に記載のZFNまたは請求項3に記載の1つ以上のポリヌクレオチドを含む、単離細胞。
- 前記細胞は、幹細胞または前駆細胞である、請求項4に記載の単離細胞。
- 前記細胞はヒト細胞である、請求項5に記載の単離細胞。
- 前記細胞のゲノムのBCL11Aエンハンサー領域は前記ヌクレアーゼによる切断後に改変される、請求項4〜6のいずれかに記載の単離細胞。
- 前記ゲノム改変は、挿入、欠失及びその組み合わせからなる群から選択される、請求項7に記載の単離細胞。
- 赤血球(RBC)またはCD34+造血幹細胞のような前駆細胞からなる群より選択される、請求項7または8に記載の単離細胞。
- 請求項4〜9のいずれかに記載の単離細胞と、前記細胞に由来する遺伝子改変細胞を含む組成物であって、前記単離細胞に由来する前記遺伝子改変細胞は、BCL11Aエンハンサー領域において遺伝子改変されている、組成物。
- 前記遺伝子改変細胞は、ゲノム改変を行わない細胞と比較した場合にガンマ及び/またはベータグロビンの発現増加を示す、請求項10に記載の組成物。
- 請求項1もしくは請求項2に記載のジンクフィンガーヌクレアーゼ、請求項3に記載の1つ以上のポリヌクレオチド、または請求項4〜9のいずれかに記載の細胞を含む、医薬組成物。
- 単離細胞の内在性BCL11aエンハンサー配列を改変するための組成物であって、請求項1もしくは請求項2に記載のジンクフィンガーヌクレアーゼまたは請求項3に記載の1つ以上のポリヌクレオチドを含み、前記内在性BCL11aエンハンサー配列が改変されるように、前記組成物が前記単離細胞に投与されることを特徴とする、前記組成物。
- 外来配列が前記細胞にさらに導入され、前記内在性BCL11aエンハンサー配列に前記外来配列が挿入されるようにすることを特徴とする、請求項13に記載の組成物。
- 前記改変は欠失を含む、請求項14に記載の組成物。
- 対象においてグロビン生成を増加させるための組成物であって、請求項4〜9のいずれかに記載の単離細胞または請求項10もしくは11に記載の組成物を含み、前記対象に投与されることを特徴とする、前記組成物。
- 前記対象はヒトであり、前記細胞はヒト幹細胞またはヒト前駆細胞である、請求項16に記載の組成物。
- 前記組成物が骨髄移植で投与され、前記細胞は前記対象内で生着し、分化し、かつ成熟することを特徴とする、請求項17に記載の組成物。
- 前記対象は異常ヘモグロビン症に罹患している、請求項16〜18のいずれかに記載の組成物。
- 前記異常ヘモグロビン症はベータサラセミアまたは鎌状赤血球症である、請求項19に記載の組成物。
- 内在性BCL11Aエンハンサー配列内にゲノム改変を含む遺伝子改変細胞を作製するインビトロの方法であって、
a)細胞と、請求項3に記載の1つ以上のポリヌクレオチドとを接触させ、
b)前記ポリヌクレオチドから前記ジンクフィンガーヌクレアーゼの発現が導かれる条件に前記細胞を供し、かつ
c)発現された前記ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いて前記内在性BCL11Aエンハンサー配列を改変して、前記遺伝子改変細胞を作製する、各工程を含む、前記方法。 - 前記細胞を少なくとも1つのサイトカインで刺激することをさらに含む、請求項21に記載のインビトロの方法。
- 請求項1もしくは請求項2に記載のジンクフィンガーヌクレアーゼ、請求項3に記載の1つ以上のポリヌクレオチド、請求項4〜9のいずれかに記載の単離細胞、および/または、請求項10もしくは11に記載の組成物を含む、キット。
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