CN105255881A - 用于蛋白质表达的具有未修饰和修饰核苷酸的组合的rna - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有编码蛋白质或蛋白质片段的序列的多核糖核苷酸，其中该多核糖核苷酸包含未修饰和修饰核苷酸的组合，其中5至50％的尿苷核苷酸和5至50％的胞苷核苷酸为修饰的尿苷核苷酸和修饰的胞苷核苷酸。

Description

用于蛋白质表达的具有未修饰和修饰核苷酸的组合的RNA
本申请是分案申请，原申请的申请日为2010年7月30日、申请号为201080045543.5、发明名称为“用于蛋白质表达的具有未修饰和修饰核苷酸的组合的RNA”。
本发明涉及多核糖核苷酸，特别是信使RNA，其包含未修饰和修饰核苷酸的组合，用于蛋白质表达和这种RNA用于治疗疾病和诊断程序的应用。
信使RNA(mRNA)是聚合体，其由主要以腺苷、胞苷、尿苷和鸟苷作为核苷的磷酸核苷结构单元而构建，其作为中间载体将遗传信息从细胞核中的DNA引入细胞质中，在此其被翻译为蛋白质。因此其适于作为基因表达的替代物。
细胞中生物化学过程的说明和人类基因组的说明已揭示缺陷型基因与疾病之间的联系。因此通过基因治疗治愈由缺陷型基因引起的疾病的愿望由来已久。预期很高，但对此的尝试却常常失败。第一个基因治疗方法包括将缺陷型或缺损型基因的完整DNA在载体中引入细胞核，从而实现完整基因的表达，因此提供缺失或缺损型蛋白质。这些尝试常常不成功，并且不太成功的尝试伴有明显的副作用，特别是肿瘤发生提高。
此外，存在由于蛋白质缺少或蛋白质缺陷引起的疾病，而其不可归因于遗传缺陷。在这种情况下，还对通过给予DNA在体内生成相关蛋白质给予考虑。在代谢中产生影响并由于病理学或非病理学原因被破坏或抑制的因子的提供也可被零或低副作用的核酸治疗而影响。
mRNA对于治疗遗传性疾病从而治疗导致疾病的基因缺陷的应用也已被提出。其中的优势是mRNA仅必须被引入细胞的细胞质，而不必被***细胞核中。***细胞核非常困难和低效；此外，如果载体或其部分被整合到基因组中，则被改变的染色体DNA存在相当的风险。
固然，可显示体外转录的信使RNA事实上可在哺乳动物的组织中得到表达，但在利用mRNA治疗疾病的尝试中产生了进一步的障碍。mRNA稳定性的缺乏具有哺乳动物组织中所需蛋白质不能被以足量利用的影响。进一步明显的劣势源于mRNA引起相当的免疫学反应的事实。假设这些强烈的免疫反应通过结合Toll型受体如TLR3、TLR7、TLR8和解旋酶RIG-1而产生。
为防止免疫学反应，WO2007/024708提出利用其中四分之一的核糖核苷酸被修饰核苷酸取代的RNA。特别是，考察了在尿苷完全被假尿苷取代时mRNA如何行为。发现这种RNA分子具有明显减少的免疫原性。但是，这些产物的生物学活性还不足以进行成功的治疗。此外，发现其中两种或更多种类型的核苷酸完全被修饰替代的RNA序列很难制成或根本无法制成。
为能够为身体提供必要的或有益的蛋白质和/或提供核酸以治疗由于缺失的或缺陷型蛋白质引起的疾病，需要具有可转染细胞的可利用的核酸，其在细胞中足够长时间地保持稳定并提供足量的蛋白质，从而避免过度频繁的施药。但是同时，这种核酸必须不导致明显程度的免疫学反应。
因此本发明的目的是提供这样的剂：其适用于治疗缺陷型或缺损型基因引起的疾病或缺失或缺损型蛋白质引起的疾病；或可体内产生必要的或有益的蛋白质，其引起显著减少的免疫应答或不引起免疫应答，在生理环境中稳定，即在给予后不立即降解，并且总体上适于作为治疗剂。进一步，本发明的目的是提供这样的剂：用于治疗可被蛋白质的体内生成积极影响的疾病。
该问题由权利要求1限定的多核糖核苷酸解决。特别适合的是mRNA，其编码蛋白质或蛋白质片段，所述蛋白质或蛋白质片段的缺陷或缺失不利于身体或其表达有利于身体。当下文使用术语“多核糖核苷酸”或“mRNA”时，除非上下文另外陈述，应始终假定其为编码与疾病或缺失有关的蛋白质或蛋白质片段——如上所述——或编码有益或支持身体的蛋白质或蛋白质片段的多核糖核苷酸或mRNA。
已令人惊讶地发现，如果应用既包含未修饰核苷酸也包含修饰核苷酸的RNA，上述问题可由核糖核酸或多核糖核苷酸(下文也一般被称为RNA)解决，特别是由信使RNA(mRNA)解决，重要的是，预定含量的尿苷和胞苷核苷酸分别以修饰形式存在。
进一步，已令人惊讶地观察到，其中两种类型的核苷酸分别部分被修饰核苷酸替代的RNA显示高翻译和转染效力，即RNA比已知RNA所可能的转染更多的细胞，并且每个细胞产生更多的编码蛋白质。此外，根据本发明修饰的RNA比由本领域状态已知的RNA或未修饰的RNA的活性更长。
根据本发明所述的RNA实现的优势未修饰和完全修饰的RNA均不可得到。已发现，如果mRNA中修饰尿苷和胞苷核苷酸的含量均被具体限定并且为至少5％和不高于50％，可实现免疫-原性减少以及稳定性增加。如果应用无修饰的mRNA，其极具免疫原性，而当全部尿苷和胞苷核苷酸均以修饰形式存在时，生物学活性对于以治疗为目的的应用过低，而不具备可能性。其中修饰核苷酸的含量极高的RNA可在非常艰难的条件下生成或根本不能生成。因此，已确定，仅包含替代尿苷的假尿苷和仅包含修饰胞嘧啶和/或修饰腺苷的核苷酸混合物不能生成任何RNA序列。但是令人惊讶地，根据本发明所述的方式修饰的RNA序列可被容易地生成，并具有合理的效力。
此外，已发现，修饰的性质至关重要。根据本发明修饰的mRNA显示低免疫原性，并具有长寿命。
已发现，根据本发明所述的RNA的稳定性与之前应用的核酸相比得到显著提高。因此，已确定，根据本发明所述的mRNA在转染后10天可被检测到比未修饰的RNA高10倍的量。增加的寿命以及高转染率首先使根据本发明所述的mRNA能用于治疗目的，因为高稳定性和由此而来的长寿命使其能够在较长的时间间隔下完成给药，因此其也可被患者接受。
因此，根据本发明，提供了用于治疗目的的特别有利的剂。根据本发明所述的RNA满足如下需要：被置于治疗所用的产物上：作为RNA其仅需被引入细胞质，无需被引入细胞核以发挥其活性，整合到基因组中的危险不存在，根据本发明所述的修饰类型很大程度地防止免疫反应，此外修饰防止RNA迅速降解。因此用根据本发明所述的RNA能够在组织中产生或重新产生生理学功能，例如恢复已经由于缺陷型或缺损型基因而丧失的体内功能，从而治疗缺陷型或缺损型基因引起的疾病。进一步，已令人惊讶地发现，根据本发明所述的多核糖核苷酸可有利地影响疾病，原因是蛋白质在体内生成，其可直接或间接对病程造成影响。因此，根据本发明，也可提供这样的多核糖核苷酸：其编码在总体情况或具体情况下有益于和支持身体的因子，例如生长因子、血管发生因子、刺激因子、诱导因子、酶或其他生物活性分子。
以下描述和附图对本发明进行更详细的说明。
图1显示不同核苷酸修饰对不同mRNA的免疫原性和稳定性的影响。图1A是对给予具有不同修饰核苷酸的各种RNA后的TNF-α水平作图的图。未修饰和高达25％单修饰的RNA导致这种RNA的高炎性标记水平，并显示高免疫原性，而对于根据本发明双修饰的RNA，炎性标记以可耐受量存在。图1B和1C显示人类细胞和小鼠细胞中以多种方式修饰的mRNA的生物学活性(转染效力和表达)，为红色荧光蛋白质(RFP)的阳性细胞的百分率和每个细胞的RFP量。该图显示，未修饰、单修饰和完全修饰的RNA编码的蛋白质仅可被检测到较低的百分含量，而根据本发明部分双修饰的RNA由于其较高的稳定性生成明显较高的蛋白质量。
图2显示多修饰(multiplymodified)mRNA较高的稳定性和较长的表达持续时间。图2A和2B分别显示对不同的修饰和未修饰mRNA的表达持续时间作图的图。图2C显示未修饰RNA、单修饰(singlymodified)RNA和多修饰RNA的RNA免疫沉淀数据。图2D显示对体内静脉内给药后不同mRNA的免疫原性作图的图。数据显示，根据本发明双修饰的RNA呈现高稳定性和低免疫原性的组合。
图3显示SP-B条件性缺陷型小鼠的中的修饰SP-BmRNA的气管内气溶胶应用后得到的多个测试结果。图3A显示用未修饰RNA和多修饰RNA治疗的小鼠的肺的生物发光图像。明显可见的是，5天后仅根据本发明修饰的RNA仍表达足量的蛋白质，而未修饰RNA的表达在3小时后就已经很低。图3B显示将通量相对于转染后时间作图的图。明显可见，根据本发明所述的修饰延长了表达持续时间。图3C显示SP-BmRNA的用药计划。图3D显示呈现将用修饰mRNA治疗的小鼠与用对照mRNA治疗的小鼠的存活率进行比较的图，用根据本发明所述的RNA治疗的小鼠的存活率显著更长。图3E显示免疫染色，其中可见用根据本发明所述的编码SP-B的RNA可重建SP-B缺陷型小鼠的SP-B。图3F显示，由半定量蛋白质印迹分析得到的在无细胞BALF上清液中的蛋白质分布。图3G和H显示根据3C治疗的小鼠的肺组织学制备物和支气管肺泡灌洗制备物的图像。当已接受对照RNA的小鼠的肺和灌洗制备物显示SP-B缺陷常见的肺损伤时，用根据本发明所述的RNA治疗的小鼠的制备物无病理。图3I显示关于肺随时间的耐受性的图。在根据本发明所述的RNA的治疗下，肺功能保持较长的时间，而在用对照RNA治疗的动物中发现肺损伤。
图4显示将未修饰和不同修饰的mRNA产生的RFP的荧光强度相对于时间作图的图。与未修饰mRNA相比，修饰mRNA较晚被翻译并且强度较弱。
图5显示对用不同mRNA治疗的小鼠的炎性标记作图的三个图。明显可见，根据本发明修饰的RNA不导致炎性反应，而未修饰RNA导致强烈的免疫反应。
图6显示对用根据本发明所述的不同mRNA治疗的小鼠的不同典型肺参数作图的图。该参数为组织弹性(HL)、组织阻尼(GL)、组织惯性、呼吸道阻力(Rn)和肺组织组成Eta(GL/HL)。对于根据本发明所述的RNA，没有参数比阳性对照组更差。
图7在图中显示不同修饰mRNA的表达能力，在该图中对具有不同含量的修饰核苷酸的mRNA的RFP阳性细胞的百分含量作图。比较显示，仅根据本发明修饰的mRNA在人类细胞以及及同样在小鼠细胞中均导致持久表达，而非根据本发明修饰的mRNA以较低的程度表达。
图8在图中显示不同修饰mRNA的表达能力，在该图中对具有不同修饰核苷酸的mRNA的RFP阳性细胞的百分含量作图。比较显示，仅根据本发明修饰的mRNA在人类细胞以及同样在小鼠细胞中均导致持久表达，而非根据本发明修饰的mRNA以较低的程度表达。
图9显示冻干的根据本发明所述的RNA的稳定性。
图10A显示对不同修饰核苷酸的转染效力作图的图。明显可见，其中10％尿苷核苷酸和10％胞苷核苷酸以及任选地5％进一步核苷酸被修饰的RNA实现最高的转染效力。图10B显示对具有不同修饰核苷酸的RNA的TNF-α生成——作为免疫学反应标记——作图的图。这些是各自用5μgmRNA转染的人类PBMC的ELISA结果。除非另外说明，修饰率各自为10％。
明显可见，其中5至50％之间的尿苷核苷酸和胞苷核苷酸修饰的RNA与未修饰的RNA相比具有明显降低的免疫原性。
图11显示多个测试的结果，由其测定根据本发明修饰的编码EPO的mRNA的稳定性和免疫原性。图11(a)显示在给予以不同方式修饰的编码EPO的mRNA后14天可检测到的***含量。明显可见，14天后注入根据本发明修饰的mRNA的小鼠中的EPO含量比未治疗的小鼠高4.8倍，但也比用未修饰的RNA治疗的小鼠高4.8倍，并且仍比用单修饰的RNA治疗的小鼠高2.5倍。
图11(b)显示在给予具有不同修饰的编码EPO的mRNA后14天和28天的红细胞压积值。该图清楚显示，用根据本发明修饰的mRNA治疗的小鼠具有的明显较高的红细胞压积值。
在图11(c)的图中，对免疫学反应的一般性因子的生成作图。发现在给予未修饰mRNA下所有四种炎性标记全部提高，而在给予根据本发明修饰的RNA下免疫学反应几乎不可检测到。
图11(d)的图显示IFN-α和IL-12的相应值，其也是炎性标记。在此同样发现根据本发明修饰的mRNA实际上不引起免疫学反应，与未修饰mRNA形成对比。
图12显示对在一周两次给予根据本发明修饰的SP-BmRNA(B)或在28天一周两次给予根据本发明修饰的SP-BmRNA(C)或在对照组给予修饰EGFPLucmRNA(A)的三组小鼠的存活率作图的图。发现只有小鼠被给予SP-BmRNA(B、C)才能存活。不提供SP-BmRNA，则小鼠死亡(A)。
图13显示给予未修饰的SP-BmRNA、根据本发明修饰的SP-BmRNA或SP-B质粒DNA后8小时小鼠支气管肺泡灌洗的细胞因子水平。结果显示，与气管内给予未修饰的mRNA或质粒DNA——各自导致炎性标记IFNγ和IL-12显著增加——相反，在给予根据本发明修饰的SP-BmRNA下，炎性标记与未治疗的组或全氟碳治疗组相比实际上没有增加。
图14显示在重复给予根据本发明修饰的mEPOmRNA后得到的红细胞压积值。结果显示，重复给予根据本发明修饰的mEPOmRNA被良好地耐受，并且造成红细胞压积持久升高。
图15显示与钛植入体温育的细胞的荧光素酶表达，该钛植入体被提供有包含不同形式的根据本发明修饰的RNA的涂层。发现根据本发明修饰的RNA——其被包含在已施加于钛板上的延迟释放的聚合物涂层中并且逐渐自其释放——没有丧失其活性。
图16显示施加于钛植入体上、包含修饰mRNA的涂层的荧光素酶表达。发现根据本发明修饰的mRNA的蛋白质表达与未处理的RNA相比大幅提高，但也高于质粒DNA。
图17A和17B分别显示具有微RNA142-3p的微RNA结合位点的mRNA的RFP-阳性细胞的相对含量和相对RFP表达。发现具有微RNA结合位点的RNARFP-阳性细胞的含量较低，并且包含相应微RNA142-3p的细胞中的编码蛋白质的表达明显较低。
图18显示通过并入编码RFP的微RNA结合位点修饰的RNA的序列。以灰色背景显示RFP序列。带有间隔序列(无背景)的微RNA142-3p的微RNA结合位点的四倍串联重复(浅灰色背景)具有下划线。
根据本发明，提供了具有部分多修饰核苷酸、部分多修饰mRNA、IVTmRNA的多核糖核苷酸分子和该RNA分子用于生成治疗由于缺陷型或缺损型基因引起的疾病或治疗通过体内提供蛋白质如因子、刺激因子、诱导因子或酶缓解或治愈的疾病的药物的应用。在进一步的实施方式中，将根据本发明所述的mRNA与靶结合位点、靶向序列和/或与微RNA结合位点结合，从而使所需mRNA的活性仅存在于相关的细胞中。在进一步的实施方式中，将根据本发明所述的RNA与微RNA或shRNA下游的3’聚A尾部结合。在进一步的实施方式中，提供了其作用持续时间已通过进一步特定修饰被调节或延长的RNA。
因此，本发明的主题是稳定性提高并且免疫原性降低的RNA。根据本发明所述的RNA可以本身已知的方式制成。通常，其通过转录编码完整或所需的可对疾病或其中的引发疾病的缺失或缺陷形式产生影响的蛋白质的DNA而制成。
在本发明的上下文中，应理解RNA意为如下任何多核糖核苷酸分子：如果其进入细胞，则适于蛋白质或其片段表达；或可被翻译为蛋白质或其片段。术语“蛋白质”在此包括任何种类的氨基酸序列——即各自通过肽键连接的两种或更多种氨基酸的链，也包括肽和融合蛋白质。
根据本发明所述的RNA包含编码如下蛋白质或其片段的核糖核苷酸序列：所述蛋白质或其片段在细胞中或细胞周围的功能是需要或有益的，例如这样的蛋白质，其缺失或缺损型形式引起疾病或病症、其的提供可缓解或预防疾病或病症或其可在细胞中或细胞周围促进有益于身体的过程。通常，根据本发明所述的RNA包含完整蛋白质或其功能性变体的序列。进一步，核糖核苷酸序列可编码充当因子，诱导因子、调节因子、刺激因子或酶的蛋白质或其功能性片段，其中该蛋白质是其功能为治疗疾病——特别是代谢疾病——或为启动体内过程如新血管、组织等的形成所必需的蛋白质。在此，功能性变体被理解意为在细胞中可承担如下蛋白质的功能的片段：其在细胞中的功能是被需要的或其缺失或缺损型形式是致病的。此外，根据本发明所述的RNA还可具有进一步的功能区和/或3’或5’非编码区。3’和/或5’非编码区可以是天然地在编码蛋白质或其他有助于RNA稳定的人造序列的侧翼的区域。本领域技术人员通过常规实验可发现在各种情况下对此适合的序列。
在优选的实施方式中，RNA包含m7GpppG帽、内部核糖体进入位点(IRES)和/或3’末端的多A尾部，特别是从而提高翻译。RNA可具有促进翻译的进一步区域。根据本发明所述的RNA的关键是其修饰核苷酸的含量。
根据本发明所述的稳定性提高和免疫原性降低的RNA通过将其中修饰胞苷核苷酸和修饰尿苷核苷酸的含量被设定的核苷酸混合物用于其生产而得到。根据本发明所述的RNA优选地用包含未修饰以及修饰核苷酸的核苷酸混合物生产，其中5至50％的胞苷核苷酸和5至50％的尿苷核苷酸被修饰。包含腺苷和鸟苷的核苷酸可未被修饰。也可应用其中ATP和/或GTP中的一些也被修饰的核苷酸混合物，其中其含量应不超过20％，并且其中其含量——如存在——应优选在0.5至10％的范围内。
因此，在优选的实施方式中，提供了具有5至50％修饰胞苷核苷酸和5至50％尿苷核苷酸和50至95％未修饰胞苷核苷酸和50至95％未修饰尿苷核苷酸的mRNA，并且腺苷和鸟苷核苷酸可以是未修饰的或部分修饰的，并且它们优选以未修饰形式存在。
优选10至35％的胞苷和尿苷核苷酸是修饰的，特别优选修饰胞苷核苷酸的含量在7.5至25％的范围内并且修饰尿苷核苷酸的含量在7.5至25％的范围内。已发现，事实上，相对低的含量，例如分别仅10％的修饰胞苷和尿苷核苷酸，在其为根据本发明所述的修饰的先决条件下可实现所需性质。
核苷修饰的本质对mRNA的稳定性从而寿命和生物学活性具有影响。适当的修饰在下表中显示：
对于根据本发明所述的RNA，全部尿苷核苷酸和胞苷核苷酸均可各自以相同的形式被修饰，或者对各自应用修饰核苷酸的混合物。修饰核苷酸可具有天然或非天然存在的改变。可应用不同修饰核苷酸的混合物。因此，例如，修饰核苷酸的一部分可具有天然改变，而另一部分具有非天然存在的改变，或可应用天然存在的修饰和/或非天然存在的修饰核苷酸的混合物。同样，部分修饰核苷酸可具有碱基修饰，另一部分具有糖修饰。在相同的方式下，所有修饰均可以是碱基修饰或所有修饰均是糖修饰或其任何适当的混合物是可能的。通过修饰的不同，根据本发明所述的RNA的稳定性和/或作用持续时间可被选择性地调节。
在本发明的一个实施方式中，至少两种不同的修饰被用于一种类型的核苷酸，其中一种类型的修饰核苷酸具有官能团，通过该官能团可连接更多基团。也可应用具有不同官能团的核苷酸，以提供不同基团连接的结合位点。因此，例如，部分修饰核苷酸可具有叠氮基、氨基、羟基、巯基或在预定条件下适于反应的一些其他活性基团。官能团也可以是其可在特定条件下激活能够结合的天然存在的基团使得具有功能的分子可偶联的基团。经修饰从而其提供结合位点的核苷酸也可被引入作为腺苷或鸟苷修饰。具体适当的修饰的选择和将可利用的结合位点的选择取决于引入什么基团和其将以什么频率存在。因此，提供官能团和/或活性基团的核苷酸的含量取决于将要偶联的基团的含量有多高，并且其可容易由本领域技术人员确定。通常，官能团和/或活性基团修饰的核苷酸的含量——如存在——为修饰核苷酸的1至25％。如必要，本领域技术人员通过常规实验可确定各种情况下最适合的基团及其最佳含量。
已发现，在根据本发明所述的RNA的2’-硫尿苷作为包含修饰尿苷的核苷酸时可实现特别好的结果。此外，优选根据本发明所述的RNA包含5’-甲基胞苷作为修饰胞苷核苷酸。因此这两种核苷酸是优选的。还优选的是这两种修饰的组合。在特别优选的实施方式中，这两种核苷酸各自以10至30％的含量存在。以另一种方式修饰的核苷酸也可任选地存在，只要修饰核苷酸的总含量不超过具体核苷酸类型的50％。
优选其中5至50％，特别优选5至30％，特别是7.5至25％的尿苷核苷酸是2’-硫尿苷核苷酸，以及5至50％，特别优选5至30％，特别是7.5至25％的胞苷核苷酸是5’-甲基胞苷核苷酸的多核糖核苷酸，其中腺苷和鸟苷核苷酸可以是未修饰或部分修饰的核苷酸。在优选的实施方式中，该根据本发明所述的mRNA另外具有7’-甲基鸟苷帽和/或多(A)末端。因此，在优选的实施方式中，mRNA以其成熟形式生成，即具有GppG帽、IRES和/或多A尾部。
具体RNA的修饰尿苷核苷酸和胞苷核苷酸的最佳类型和含量可由常规实验确定。在该背景下，免疫原性过低使被治疗的生物体不进行应激并且具有预定的稳定性和因此预定的表达持续时间的mRNA被描述为最佳。测试和确定这些性质的方法对于本领域技术人员是已知的，并且在下文和实施例中得到描述。
根据本发明所述的RNA可以本身已知的方式生成。例如如下方法是适当的：其中根据本发明所述的mRNA通过体外转录从ATP、CTP、GTP和UTP的混合物生成，其中5至50％，优选地5至30％，特别是7.5至25％的胞苷核苷酸和5至50％，优选地5至30％，特别是7.5至25％的尿苷核苷酸被修饰，而其余未被修饰。鸟苷和腺苷核苷，特别是腺苷，也可任选地被修饰。但是，所述范围内的UTP和CTP的修饰是本发明的重点。如果修饰UTP和/或修饰CTP的含量较低或较高，有利的性质不再被实现。因此，已发现，在所要求保护范围外的mRNA不再如此稳定。此外，随着修饰含量较低，将预料到免疫学反应。为设定未修饰和修饰核苷酸的适当的比例，利用核苷酸混合物适当地制备RNA，根据所需比例其核苷含量部分是修饰的，部分是未修饰的，其中根据本发明至少5％尿苷核苷和至少5％胞苷核苷是修饰的，但各自总共不高于50％的尿苷核苷和胞苷核苷是修饰的。更多核苷，即腺苷和鸟苷，可以是修饰的，但是这些核苷也应不超过50％修饰，优选20％的上限。优选地仅适当含量的尿苷核苷和胞苷核苷是修饰的。
将被修饰的核苷可具有如下修饰：如也被发现于天然存在的核苷，例如甲基化或结合改变，但还也可以是“合成的”，即自然界中不存在，具有天然和/或合成的修饰的修饰或核苷混合物可被应用。因此，至少一种类型的天然修饰核苷可与如下组合：相同类型或另一类型的合成修饰核苷；或具有另一类型的单独天然、单独合成或混合天然/合成的修饰核苷的一种类型的其他天然和合成修饰核苷，其中在此“类型”指核苷的类型，即ATP、GTP、CTP或UTP。在许多情况下，如上所述，对于提高免疫原性和稳定性或对于调节性质，将修饰核苷与提供结合位点的官能团、非功能性修饰的核苷组合可以是有益的。最适合的类型或组合可容易由本领域技术人员通过常规实验发现，如例如，同样在下文所述。特别优选地，2-硫尿苷和5-甲基胞苷被用作修饰核苷。如果述及功能性修饰的核苷，则优选考虑2’-叠氮基和2’-氨基核苷。
根据本发明所用的mRNA的长度取决于所要提供或补充的基因产物或蛋白质或蛋白质片段。因此mRNA可以非常短，例如具有仅20或30个核苷酸，或者相应于基因长度具有数千个核苷酸。本领域技术人员可在每次以常用方式选择适当的序列。
至关重要的是，可提供mRNA所应用的引发疾病的蛋白质、缓解或预防疾病的蛋白质或控制有益性质的蛋白质的功能。
2’-硫尿苷优选地被用作生产根据本发明所述的RNA的含尿苷的修饰核苷酸。此外，优选将5’-甲基胞苷用作修饰胞苷核苷酸。因此，对于根据本发明所述的RNA的生产，优选应用如下核苷酸混合物：其与ATP和GTP分别包含95至50％未修饰的CTP和95至50％未修饰的UTP和5至50％的2’-硫尿苷核苷酸和5至50％的甲基胞苷核苷酸。因此，特别优选如下多核糖核苷酸：其中5至50％，优选地5至30％，特别是7.5至25％的尿苷核苷酸是2’-硫尿苷核苷酸；和5至50％，优选地5至30％，特别是7.5至25％的胞苷核苷酸是5’-甲基胞苷核苷酸；并且腺苷和鸟苷核苷酸是未修饰的核苷酸。这种组合导致特征在于特别高的稳定性的部分修饰的RNA生成。可显示，用如分别包含5至50％的2-硫尿苷和5-甲基胞苷核苷酸的CTP和UTP的核苷酸混合物生成的RNA尤其稳定，即与未修饰的RNA或以已知方式修饰的RNA相比具有增加高达10倍的寿命。
在进一步优选的实施方式中，5至50％修饰尿苷或胞苷核苷酸中1至50％，优选地2至25％是具有生成或激活结合位点的基团作为修饰的核苷酸，即0.5至20％，优选地1至10％的胞苷核苷酸和/或尿苷核苷酸可具有生成结合位点如例如叠氮基、NH、SH或OH基团的修饰。通过该组合，提供了既特别稳定又多功能的RNA。
进一步，优选由未修饰和修饰的核苷酸构建的多核糖核苷酸分子具有7’-甲基鸟苷帽和/或多(A)末端。此外，RNA也可具有额外的序列，例如非翻译区和功能核酸，如本领域技术人员公知的。
根据本发明所述的RNA优选被提供作为体外转录的RNA(IVTRNA)。进行体外转录所必需的材料对于本领域技术人员已知，并且可商业获得，特别是缓冲液、酶和核苷酸混合物。用于生成根据本发明所述的RNA的DNA的特性也不重要；通常其为克隆的DNA。
如上所述，提供RNA，特别是mRNA，其具有预定含量的修饰尿苷核苷和修饰胞苷核苷。具体mRNA的修饰尿苷核苷和胞苷核苷的最佳含量可通过本领域技术人员公知的常规实验得到确定。
根据本发明所述的RNA被优选用于治疗疾病或提供有益于身体的蛋白质。当根据本发明所述的RNA被用于治疗疾病时，其优选地具有蛋白质或蛋白质片段的体外转录体，所述蛋白质或蛋白质片段的缺陷或缺失导致疾病症状或其的提供造成的疾病缓解。对于根据本发明所述RNA的生成，优选应用编码蛋白质或蛋白质片段的DNA，所述蛋白质或蛋白质片段的缺陷或缺失导致疾病或与疾病有关。在一个实施方式中，基因的DNA被用于生成根据本发明所述的RNA，所述基因的缺陷或缺失导致疾病或生病。在另一个实施方式中，编码其存在——或许临时的存在——对生物体有益或可治愈生物体的蛋白质的DNA被用于生成根据本发明所述的RNA。在此，其中身体和/或精神/心理疾病或改变主观和/或客观存在；或身体、精神或心理过程的异常过程使医疗护理成为必要；和可导致不能工作的的任何状态均被认定为疾病或疾患。
在此，其存在可缓解疾病或有益于或支持身体的蛋白质或蛋白质片段被理解意为这样的蛋白质或蛋白质片段：不存在遗传缺陷、在由于一些种类的疾病或天然环境造成其缺失后将可被完全或临时用于身体；或其在特定条件下可有益于身体，例如在治疗缺陷过程中或在植入前后。这些也包括蛋白质或蛋白质片段的改变形式，即在代谢过程中改变的蛋白质形式，例如成熟的蛋白质形式等。在生长过程和血管发生中发挥作用的蛋白质——例如，受控再生所必需，然后通过引入根据本发明所述的mRNA可特异性形成的蛋白质，也可被提供。其可例如用于生长过程或治疗骨缺陷、组织缺陷和用于植入和移植背景中。
已发现，根据本发明修饰的mRNA可有利地被用于促进植入假体的向内生长。如果其可用于所要***的假体——如牙齿植入体、髋内用假体、膝内用假体或脊椎融合体——的表面上，根据本发明所述的mRNA可以释放可促进向内生长、血管新形成和新***的假体必要的其他功能的因子。因此，例如，在植入假体或其后的背景下给予生物活性物质如生长因子如BMP-2或血管发生因子是已知的。由于生物学物质常常具有极短的半衰期，以前必须使用非常高的剂量，这使患者遭受严重的副作用。根据本发明，该不利被避免，因为利用根据本发明所述的RNA，理想和/或需要的蛋白质可被选择性地使用，并被适当地用药。这对患者减少或甚至完全免除了副作用。在该实施方式中，根据本发明所述的编码理想和/或需要的物质如生长因子、血管发生因子等的RNA可被施加于在以可测的方式释放RNA的涂层中的植入体上，然后以可测的方式逐渐被从中释放，使得植入体周围的细胞可连续或间歇地生成，并且，如必要，释放所需的因子。其释放性质可被具体调节的载体——通常生物相容的、合成的、天然的或天然-合成混合的聚合体，是众所周知的，因此，无需在此更详细的说明。例如应用聚交酯或聚交酯/乙交酯聚合物。在这种方式下，有可能选择连续、间歇、经过较长或较短的时间以及在所需位点释放所需的因子。
在本发明的上下文中，缺陷型或缺损型基因或缺陷或缺失被理解意为未被表达、被不正确表达或表达量不足从而例如通过引发代谢疾病而引发疾病或疾患的基因。
根据本发明所述的RNA可被适当地用于要向身体提供应天然存在于身体中却由于基因缺陷或疾病不存在或以缺陷型形式存在或存在量过低的蛋白质的任何情况。其缺陷或缺损与疾病有关的蛋白质及其编码基因已知。下文列举了在其缺失情况下根据本发明所述的RNA可用的多种蛋白质和基因。
表2
基于缺损型基因的其他疾病如下所述：
因此，上表显示其中缺陷导致可通过用根据本发明所述的RNA进行的转录体替代治疗进行治疗的疾病的基因实例。特别是在此如下遗传性疾病可被述及：例如影响肺的遗传性疾病，如SPB缺陷、ABCA3缺陷、囊性纤维化和α1-抗胰蛋白酶缺陷；影响血浆蛋白质和引起凝血缺陷和补体缺陷、免疫缺陷的遗传性疾病，如例如SCID、脓毒性肉芽肿病和贮积病。在所有这些疾病中，蛋白质，例如酶，是缺陷型的，其可通过用根据本发明所述的RNA进行的治疗进行治疗，根据本发明所述的RNA使缺损型基因或其功能性片段编码的蛋白质具有可用性。
因此，可由根据本发明所述的RNA编码的蛋白质的实例是***(EPO)、生长激素(促生长激素，hGH)、囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)、生长因子如GM-SCF、G-CSF、MPS、蛋白质C、铁调节素、ABCA3和表面活性剂蛋白质B。可用根据本发明所述的RNA治疗的疾病的进一步实例可以是血友病A/B、法布里病、CGD、ADAMTS13、胡尔勒病、X染色体介导的A-γ-球蛋白血症、腺苷脱氨酶相关免疫缺陷和新生儿呼吸窘迫综合征——其与SP-B有关。特别优选地，根据本发明所述的mRNA包含表面活性剂蛋白质B(SP-B)或***的序列。可由根据本发明修饰的RNA编码的蛋白质的进一步实例是生长因子，如BMP-2或血管发生因子。
根据本发明所述的RNA的进一步应用领域存在于这样的疾病或疾患中：其中身体不再或不形成蛋白质，例如由于器官衰竭。目前，给予重组蛋白以在这种疾病中进行替代。根据本发明，现为此提供RNA以使对缺失蛋白质的替代可以在转录体水平发生。其具有若干优势。如果蛋白质具有糖基化，那么转录体水平的替代具有如下影响：人中一般的糖基化发生在身体中。重组的——即微生物通常产生的——蛋白质的糖基化通常不同于将进行替代的身体中的糖基化。这可导致副作用。一般，假设根据本发明所述的RNA表达的蛋白质于内源蛋白质在结构和糖基化方面一致，其通常不是重组蛋白的情况。
其蛋白质替代或引入可能理想的实例是功能性蛋白质，如***和生长因子如促生长激素(hGH)、G-CSF、GM-CSF和血小板形成素。
可应用根据本发明所述的RNA的进一步领域是再生药物领域。通过疾病进程或通过衰老，变性疾病出现，其可通过引入由于疾病或衰老过程而生成过少或不生成的蛋白质而治疗和缓解甚至治愈。通过引入编码这些蛋白质相关的RNA，可停止变性过程或甚至可开始再生。其实例是用于组织再生的生长因子，其可用于例如生长疾病、变性疾病如骨质疏松、关节病或伤口愈合受损。在此，根据本发明所述的RNA不仅提供可选择性并以正确的剂量提供缺失蛋白质的优势，此外还可以按时间窗提供蛋白质。因此，例如，关于伤口愈合受损，可通过定剂量给予RNA来提供相关的愈合因子或生长因子限定的时间。此外，通过稍后解释的机制，可进行如下安排：RNA被选择性引至其所需作用位点。
可用根据本发明所述的RNA表达从而具有再生作用的因子的实例是成纤维细胞生长因子(FGF)，例如FGF-1-23；转化生长因子(TGF)，例如TGF-α和TGF-β；BMP(骨形态发生蛋白)，例如BMP1至7、8a和b、10和15；血小板衍生的生长因子(PDGF)，例如PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C和PDGF-D；表皮生长因子(EGF)；粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；血管内皮生长因子(VEGF-A至F和PIGF)；***，例如IgF1和IgF2；肝细胞生长因子(HGF)；白细胞介素，例如白细胞介素-1B、IL-8和IL-1至31；神经生长因子(NGF)和其他刺激红细胞、嗜中性白细胞、血管等形成的因子。
根据本发明所述的RNA也可选择性地用于癌症疾病领域。通过在识别特异性肿瘤相关抗原的T淋巴细胞中表达量身定做的(tailor-made)T细胞受体，它们可变得更加有效。理论已显示，mRNA可成功地用于本领域。但直到现在，其应用仍被上文已述的免疫原性作用阻止。利用根据本发明提供的较低免疫原性和高度稳定的RNA，现可以适当地表达T细胞受体。
根据本发明所述的RNA也可用于表达转录因子，该转录因子确保体细胞被重编到胚胎干细胞中。其实例是O-cp3/4、Sox2、KLF4和c-MYC。根据本发明所述的编码这些转录因子的稳定RNA，特别是mRNA，可因此导致干细胞生成，而不产生可随之前考虑的通过病毒或非病毒载体的基因转移一起发生的副作用。
应用根据本发明所述的RNA的优势是，与DNA载体相反，治疗的持续时间是可调控的。在诱导干细胞的情况下，通常需要转录因子仅暂时地具有活性，从而将体细胞重编到干细胞中。通过定剂量给予编码转录因子的相关RNA，可随时间而控制活性。与此相反，利用之前已知的方法具有所给予的基因整合的危险，其导致并发症，例如肿瘤发生，此外还使持续时间不可控。
在疫苗领域，根据本发明所述的RNA还提供新的可能性。疫苗的标准开发取决于被杀死或弱化的病原体。近来，编码病原体蛋白质的DNA也已被纳入考虑中。这些疫苗的生产费力且非常费时。通常产生副作用并导致疫苗接种遭到拒绝。利用根据本发明所述的mRNA，有可能提供不具有与病原体或DNA相关问题的疫苗。此外，只要病原体的抗原序列已知，就可非常迅速地生产这种疫苗。这在大流行病威胁的情况下特别有利。因此，在本发明的一个实施方式中，提供了编码疾病病原体的抗原部分例如表面抗原的RNA。还可能提供编码氨基酸序列的mRNA，该氨基酸序列具有任选地由间隔段连接的数个表位的组合。通过编码融合蛋白质的RNA或作为核酸组合，与免疫调节物的组合也是可能的。
此外，根据本发明所述的RNA也可编码作为因子——刺激因子，诱导因子等——影响疾病进程的蛋白质。实例是不直接归因于基因缺陷但其中疾病过程可借助mRNA表达而被积极影响的疾病。实例是：刺激红细胞形成的***、用于嗜中性白细胞形成的G-CSF或GM-SCF、用于新血管形成、用于骨和伤口愈合的生长因子，作为“组织工程”、通过诱导凋亡或通过形成蛋白质细胞毒素例如白喉毒素A、通过诱导多能干细胞(iPS)等***的因子。
已发现，仅根据本发明所述的具有预定含量的修饰和未修饰核苷酸的多核糖核苷酸具有低免疫原性，同时具有高稳定性。未能够确定对于特定多核糖核苷酸的修饰和未修饰核苷酸的最佳组合，可以本身已知的方式测定免疫原性和稳定性。关于测定RNA的免疫原性，可利用本领域技术人员公知的多种方法。非常适合的方法是测定细胞中由于对RNA给予的反应产生的炎性标记。这种方法在实施例中得到描述。通常测量本领域技术人员已知的与炎症相关的细胞因子，如例如，TNF-α、IFN-α、IFN-β、IL-8、IL-6、IL-12或其他细胞因子。DC活化标记的表达也可用于评价免疫原性。免疫学反应的进一步指示是，检测到与Toll样受体TLR-3、TLR-7和TLR-8和与解旋酶RIG-1的结合。
免疫原性通常相对于对照而确定。在常用的方法中，向细胞给予根据本发明所述的RNA或未修饰或以另一种方式修饰的RNA，并且测定在限定时间间隔内由对RNA给予的反应引起的炎性标记分泌。作为用于比较的标准，可使用未修饰的RNA——在该情况下免疫应答应当较低，或已知引起极少或不引起免疫应答的RNA——在该情况下对于根据本发明所述RNA的免疫应答应当因此在相同范围内，并且不应升高。利用根据本发明所述的RNA可以使免疫应答相对于未修饰的RNA降低至少30％，通常至少50％或甚至75％或甚至完全防止免疫应答。
免疫原性可通过测量上述因子，特别是通过测量TNF-α和IL-8的水平和结合TLR-3、TLR-7、TLR-8和解旋酶RIG-1的能力确定。因此，为确定mRNA是否具有所需的低免疫原性，可在给予所述多核糖核苷酸后测量上述因子中的一种或多种的量。因此，例如，可通过尾静脉或i.p.给予小鼠所要测试的mRNA量，然后在预定时间后，例如7或14天后，可测量血液中上述因子的一种或多种。然后将该因子量与存在于未治疗的动物的血液中的因子量进行对比。关于免疫原性的测定，已发现测定结合TLR-3、TLR-7、TLR-8和/或解旋酶RIG-1的能力非常重要。TNF-α水平和IL-8水平也提供良好的指示。利用根据本发明所述的mRNA，可以使结合TLR-3、TLR-7、TLR-8和RIG-1的能力相对于未修饰的RNA降低至少50％。通常可以使结合所述因子减少至少75％或甚至80％。在优选的实施方式中，对于根据本发明所述的mRNA和不给予mRNA的动物，结合TLR-3、TLR-7、TLR-8和RIG-1的能力在相同的范围内。换句话说，根据本发明所述的mRNA实际上不引起炎性或免疫学反应。
在每种情况下，根据本发明所述的RNA具有低免疫原性，使得患者的总体情况不受影响。因此，只要总体情况不由此变差，上述因子的略微增加也是可以承受的。根据本发明所述的mRNA的进一步性质是其效力和稳定性。对此，蛋白质表达的转录效力、转染效力、翻译效力和持续时间至关重要，并且可通过本身已知的方法确定。
转录效力表明RNA如何可有效地由DNA生成。在此，随着高含量修饰核苷酸的应用出现问题。根据本发明修饰的RNA可以高转录效力地生成。
为实现RNA编码的蛋白质稳定且充足的表达，重要的是，足够的RNA到达期望细胞。这可以通过如下得到确定：在给予标记RNA后，通过测量标记确定已到达细胞的RNA量。流式细胞术可用于测定标记。当标记受荧光分子影响时，可计算转染效力，例如，为细胞群的百分比，其中荧光强度高于仅用PBS治疗的对照细胞。已发现，与其中两种或更多种核苷酸类型已被修饰核苷酸100％替代的RNA相反，根据本发明修饰的RNA可有效地生成，并且根据本发明所述的其中仅部分核苷酸修饰的RNA的转染效力远远高于其中核苷酸的任一种类型100％修饰的RNA的转染效力。
翻译效力表示RNA翻译成蛋白质的效力。翻译效力越高，然后治疗必须施用的RNA剂量可越低。翻译效力可通过比较根据本发明修饰的RNA的翻译比例与未修饰的RNA的翻译比例而确定。通常，根据本发明所述的RNA的翻译效力略低于未修饰RNA的翻译效力。但这可通过大大提高的稳定性而充分补偿，其在蛋白质表达持续过程中得以显现。
根据本发明所述的RNA特别是提供了高稳定性，其造成长期持续的蛋白质表达。特别是当意图将根据本发明修饰的RNA用于治疗由基因缺陷引起的疾病时，其在细胞中的停留越长，其越有价值。RNA降解越快，蛋白质表达终止越快，并且RNA的给予必须越频繁。相反，利用长时间留在细胞中的稳定的RNA，给药频率可大大减少。已发现，根据本发明修饰的RNA稳定表达长达4周。
对于其他实施方式，即当仅意图将RNA暂时表达时，可通过影响稳定性来调节蛋白质表达的持续时间。
因此，根据本发明所述的RNA的更有价值的性质是作用的持续时间可通过稳定性被选择性地调节，使得蛋白质表达的持续时间可被量身定做，以使其按所需的时间窗发生。其次，非常长期作用的RNA可被用于必要的情况。根据本发明修饰的RNA，其表达可持续长达4周，因此理想地适于治疗慢性疾病，因为在此其仅需每4周被给予。对于其中RNA编码将长期给予身体从而缓解或预防疾病的因子的实施方式，高稳定性和长期持续的蛋白质表达也是有利的，例如对于编码***的RNA的应用。根据本发明所述的RNA也可特别有利地用于治疗血友病。在此，以前有必要每周给予缺失的因子。关于根据本发明所述的RNA的提供，给予频率可减少，使得编码因子的RNA仅需每2周或甚至每4周被给予。
根据本发明所述的mRNA的稳定性可通过本身已知的方法测定。特别适当的是测定包含根据本发明修饰的RNA的细胞相对于包含未修饰或完全修饰的RNA的细胞，例如相对于未修饰或以已知方式修饰的RNA的成活力的方法。编码蛋白质的生成也可被随时监测。在此RNA的稳定性被理解意为，当其已被引入细胞时，可表达所需蛋白质或可翻译成蛋白质或其功能性片段的RNA，仍然能够长期表达，不立即被降解，并且不被失活。
因此，测试RNA在细胞中的稳定性和存活时间的方法在于测定RNA编码的蛋白质多久可在细胞中被检测到或发挥其功能。其方法在实施例中得到描述。因此，例如，具有编码报道分子的序列的mRNA可被引入细胞——任选地与编码所需蛋白质的RNA一起，以及然后在预定时间后，测定报道分子和任选地蛋白质的存在。适当的报道分子在本领域状态下是公知的，常用的报道分子也可在此应用。在优选的实施方式中，RFP，红色荧光蛋白质，被用作报道分子。
如上所述，根据本发明所述的RNA可被用于治疗，使得在RNA所被引入的细胞中可形成不天然表达至所需程度或根本不天然表达的蛋白质。在此，在蛋白质由于基因缺陷未形成时以及蛋白质由于疾病未形成时的情况下或蛋白质引入有利于身体的情况下均可应用根据本发明所述的RNA。RNA也可被用于补充未表达至足够程度的蛋白质。各情况下所用的剂量取决于RNA所要满足的功能。如上所述，根据本发明所述的RNA的作用持续时间可被有意地调节。治疗的持续时间取决于特定指示。如果RNA被用于慢性治疗由于缺陷型基因引起的疾病，则作用的持续时间将尽可能长，此时以其他指示，其可被有意地调节为时间窗。
根据特别优选的实施方式，编码表面活性蛋白B的IVTmRNA被用作RNA。当该蛋白质在哺乳动物中缺乏时，其导致早产儿和新生儿的呼吸窘迫综合征发生。在新生儿中，该综合征通常由于肺病导致死亡。多修饰的体外转录的编码SP-B的mRNA——其中5至50％的尿苷核苷和5至50％的胞苷核苷被修饰——的应用造成蛋白质形成，以及疾病缓解或痊愈。
根据进一步优选的实施方式，编码***的IVTmRNA被用作RNA。***是对身体非常重要的蛋白质，例如，在肾病时不再以足量可用，因此必须得到补充。重组的***——其已在微生物或动物细胞中生成，因此具有非天然存在的糖基化——目前被应用于此。关于重组EPO的应用，极少具有严重副作用——例如红细胞发育不全——的情况。
根据本发明提供的IVTmRNA包含编码***的核糖核酸，其中5至50％的尿苷核苷酸和5至50％的胞苷核苷酸被修饰。在特别优选的实施方式中，提供了编码EPO的mRNA——其中15至25％的尿苷核苷酸和15至25％的胞苷核苷酸被修饰。已发现，该mRNA相对于未修饰的RNA已显著降低免疫原性。同时其显示超过90％的转染效力和稳定性——使得红细胞压积值在14天后仍然升高。由于根据本发明所述的RNA在身体中生成的EPO具有正确的糖基化，将预期不到副作用。通过定向性的间歇给予根据本发明修饰的编码EPO的RNA，红细胞压积值可长期保持在理想水平。
根据本发明，提供了非免疫原性的稳定RNA，其可体内用于哺乳动物并提供必要的蛋白质，该蛋白质的形式如果不与天然存在的内源蛋白质相同则也非常相似，特别是具有内源性糖基化。
根据本发明所述的mRNA可由此被直接应用。但是，也存在进一步修饰mRNA从而引入进一步有益的性质的可能性。首先，mRNA可通过将其他编码或非编码序列连接于编码链被修饰。其次，其也可通过将进一步的分子结合于修饰核苷酸中提供的官能团被修饰。
在一个实施方式中，根据本发明所述的mRNA可与靶向配体组合，该靶向配体结合靶细胞的特异性表面受体，使得靶细胞中受体介导的转染成为可能。对此，首先适于将mRNA引入细胞的载体或者mRNA本身可用配体修饰。将mRNA引入细胞的适当载体实例是阳离子剂。其包括阳离子脂质、阳离子聚合物或纳米颗粒、纳米胶囊、磁性纳米颗粒和纳米乳液。适当的载体对于本领域技术人员已知，并被描述于专业文献中。适当的配体也对于本领域技术人员公知，并被描述于文献中且可用。作为配体，例如，转铁蛋白、乳铁蛋白、克伦特罗、糖、糖醛酸、抗体、适配体、等可被应用。
但是，mRNA本身也可被配体修饰。对此，优选在核糖2’位具有伯氨基或叠氮基的具有修饰核苷的mRNAs。上表中可找到实例。这种修饰特别优选，因为其有助于生物学活性。通过这些修饰，配体可容易地通过酰胺形成或“点击(click)”化学，例如通过生物共轭技术被并入。
在进一步的实施方式中，在mRNA的5’末端引入可结合蛋白质例如受体(适配体)的RNA序列。该程序具有如下优势：配体已经可以在DNA水平被直接引入基质，并通过IVT被克隆和引入mRNA中。因此，mRNA随后用配体修饰不再有必要。
在进一步的实施方式中，mRNA通过惰性聚合物例如聚乙二醇(PEG)的另外修饰而修饰。其方法对于本领域技术人员公知，并且可应用如关于配体已知的过程。因此，例如，转录后PEG结合的聚乙二醇结合位点可被提供在小部分用于根据本发明所述的mRNA修饰核苷酸中。聚乙二醇作用于mRNA的胞外稳定，即其保护多核糖核苷酸分子直到其已到达细胞中。在进入细胞时，PEG被切离。因此PEG与RNA之间的键优选被设计使得进入细胞时的切割容易。对此，例如，可提供pH依赖性切离的官能团。也可通过修饰核苷酸上的适当活性位提供其他稳定RNA的分子。在这种方式下，mRNA可通过空间稳定防止酶降解，以及防止与生物流体组分的相互作用。由此修饰的mRNA可被称为“隐形”mRNA。
优选的保护和稳定RNA的方法被述及于EP1198489，其内容在此被明确作为参考。根据本发明所述的RNA优选地通过EP1198489所述的方法得到保护。已发现，首先根据本发明修饰的RNA也可通过该方法有利地被稳定和保护，其次由此处理的根据本发明所述的RNA的活性不受到限制或不明显受到限制。因此，在本发明的优选实施方式中，根据EP1198489处理根据本发明修饰的RNA。
细胞特异性调节的实例是将微RNA结合位点并入微RNA142-3p，其被表达在造血细胞中，而非其他来源的细胞中。因此，表达得到控制，使得造血细胞中的mRNA翻译相对于其他细胞显著减少。类似地，其他细胞类型中的表达可通过并入相关适当的微RNA结合位点被选择性地控制，其对于本领域技术人员是已知的。
在进一步的实施方式中，根据本发明所述的mRNA与目标或仅存在于健康细胞而不存在于受疾病感染的细胞的至少一种微RNA的结合位点组合。因此，mRNA编码的蛋白质仅在需要该蛋白质的细胞中生成。适当目标的选择通过本领域技术人员公知的常规方法进行。在DNA水平上进行的常用方法是将微RNA结合位点克隆到3’UTR中(Guetal,NatStructMolBiol.2009Feb；16(2):144-50、Brownetal,NatBiotechnol.2007Dec；25(12):1457-67、Brownetal,NatMed.2006May；12(5):585-91、WO2007000668)。在优选的实施方式中，当RNA编码细胞毒素时应用装配微RNA结合位点的RNA。在这种情况下，特别需要仅将蛋白质毒素送至意图发挥其作用的细胞。对于该实施方式，通过特异性修饰RNA以使其稳定性处于预定时间窗中而调节RNA作用的持续时间也可以是有利的。
进一步，根据本发明所述的RNA可与3’多A尾部的微RNAs或shRNAs下游结合。这具有如下优势：mRNA-微RNA/shRNA杂合体可通过Dicer在胞内被切割，从而可释放干预不同致病级联的两种活性分子。这种杂合体可被提供用于治疗疾病如癌症或哮喘。因此，根据本发明所述的RNA适于同时地补体缺陷型mRNA和干预缺损型微RNA级联。
因此，根据本发明，提供了具有有利性质的RNA，其可用其中应用编码报道蛋白例如红色荧光蛋白质(RFP)的序列的筛选方法进行测试。当未修饰、单修饰或具有不同修饰的多修饰核苷酸的报道基因序列的毒性和稳定性被测试其免疫原性和转染效力时，发现仅根据本发明所述的mRNA——即多重修饰，其中分别至少5％的尿苷核苷和胞苷核苷被修饰核苷替代，导致对人类血液中初生单核细胞免疫原性显著降低，同时可产生高于80％的高转染率。其可例如在人类或小鼠的肺泡上皮细胞类型II中得到测试。此外，根据本发明修饰的RNAs的RNA表达持续时间明显长于已知的RNA。已发现，主要是由于根据本发明多修饰的mRNA较高的稳定性和较低的免疫原性，表达比已知的制剂持续更久。在定量评价中，根据本发明修饰的衍生体显示转染后10天的表达产物量比未修饰或仅单修饰RNA高10倍。
本发明的进一步主题是筛选核苷酸序列从而测试免疫原性和表达质量的方法，其中使mRNA序列接触选自TLR3、TLR3、TLR8和解旋酶RIG-1的至少一种受体，并相对于对照序列测量结合能力。结合能力已知的序列被用作对照序列。与这些受体其中至少一种的结合越弱，序列更有希望。
根据本发明所述的mRNA——特别是IVTmRNA——的性质，可用对表达报道蛋白的RNA的筛选方法进行测试。红色荧光蛋白质(RFP)优选作为报道蛋白。编码该蛋白质的序列——其核苷酸具有不同修饰——可被测试其免疫原性和转染效力。因此，mRNA的不同修饰可被用于测试，例如尿苷核苷可被2-硫尿苷核苷(下文中也称s2U)部分替代，胞苷核苷可被5-甲基胞苷核苷(下文中也称m5C)部分替代。
图1A、1B、1C、2A和2B显示实施这种筛选方法时得到的结果。更具体的细节将在实施例中找到。图中显示的结果基于对RFPRNA进行的实验，并显示仅多修饰mRNA——其中至少5％的尿苷核苷和至少5％的胞苷核苷分别被修饰——在体外和体内均导致对血液中人初级单核细胞的免疫原性显著降低，同时可在人类以及小鼠的肺泡上皮细胞类型II中均产生高于80％的高转染率。此外，根据本发明修饰的mRNA的表达持续时间明显长于未修饰mRNA。
在进一步的实施方式中，提供了利用mRNA免疫沉淀测试(RIP)测试所考虑的RNA是否适于治疗的方法。适当的RIP测试在实施例中得到更具体的描述。研究已显示，免疫***的细胞被未修饰的报道mRNA通过RNA结合Toll样受体(TLR)3、TLR7、TLR8和解旋酶RIG-1激活。当结果显示，测试mRNA与TLR3、TLR7、TLR8和/或RIG-1的结合相对于未修饰的mRNA显著减少时，其是免疫原性降低的指示。可表明，在这方面根据本发明应用的多修饰明显比单s2U修饰更加有效。在实施例中，研究了在RNA已被静脉内注射入小鼠后RNA对IFN-γ、IL-12和IFN-α水平的影响。发现多修饰s2U(0.25)m5C(0.25)RFPmRNA防止免疫应答。实施例得到的结果一起显示，多修饰mRNA显著减少TLR与RIG-1结合，因此降低免疫应答，同时提高和延长表达。因此，多修饰的RNA，特别是IVTmRNA，是体内治疗由于缺陷型基因引起的疾病的适当候选者。特别有希望的候选者在下文中进行简要说明，并在实施例中得到更具体的描述。
为测试可以将根据本发明修饰的RNA用于肺的治疗，多修饰的mRNA——其编码增强的绿色荧光蛋白质和荧光素酶(EGFPLuc)的融合蛋白质，被直接引入小鼠的肺，并关于荧光素酶相对于未修饰的EGFPLucRNA是否表达进行测试。3小时后肺中荧光素酶的表达达到最大值，尽管总荧光通量在24小时后迅速降至极低的比例——治疗后5天。与此相反，已用多修饰EGFPLucmRNA治疗的小鼠被观察到高表达值直至治疗后5天。
在特别优选的实施方式中，提供了其治疗潜力允许治疗源于SP-B缺陷的疾病的RNA，即s2U(0.25)m5C(0.25)SP-BmRNA。SP-B是相对小的两亲肽，其由单个基因编码，并在覆盖肺泡的类型II肺泡上皮细胞中通过蛋白质水解过程生成具有381个氨基酸的前体。其改善降低肺泡中的表面张力必要的表面活性剂脂质的分布、吸收和稳定性。带有SP-B的缺陷，出现症状如肺泡壁增厚、细胞浸润和间质性水肿。这种肺损伤伴有充血，即支气管肺泡流体中的红细胞数量增加和巨噬细胞、嗜中性白细胞数量和炎性细胞因子的相应比例增加。人类的先天性缺陷和对转基因小鼠的研究已证实，SP-B对于出生后存活具有重要作用。通过SP-B基因突变发生的先天性SP-B缺陷对于表面活性体的替代至关重要，并在生命第一个月期间导致新生儿呼吸道的致命故障。因此，肺移植体是目前唯一可利用的治疗干预。因此，利用根据本发明所述的RNA而成为可能SP-B缺陷的mRNA治疗，是重要的可供选择的治疗。
根据本发明所述的RNA可被用于治疗这种疾病，优选地以全氟碳作为载体。因此在优选的实施方式中，提供了包含全氟碳和s2U(0.25)m5C(0.25)SP-BmRNA的药物制剂。该组合能在SP-B缺陷患者的肺中重新构建SP-B，使得存活机会增加。由于根据本发明所述的RNA的高稳定性，定期间隔——例如每周1至3次——的给予对此足以。优选地，对此通过高压喷雾气管内以气溶胶给予SP-BmRNA。已发现，根据本发明所述的mRNA可改善上述症状，因此改善肺功能，其可通过测试肺参数证明，具体如实施例所述。
根据本发明所述的mRNA可有效用于治疗程序，并能治疗由缺失或缺损型蛋白质引起的疾病。可以全身给予多修饰mRNA。可以存在如下情况：其中未受基因缺陷影响的细胞中的mRNA翻译是不理想的，例如因为产生不需要的副作用。为使mRNA仅选择性地在需要编码蛋白质的细胞——例如，存在基因缺陷的细胞——中翻译，相应载体可由能够寻找到受影响组织的序列——例如通过配体补充。在进一步的实施方式中，内源微RNAs所结合的序列——其在靶细胞中不表达，可被添加至包含mRNA的载体，使得mRNA在所有包含相关的内源微RNAs的细胞中降解，而其在靶细胞中保留。因此，副作用可被最小化。
根据本发明所述的RNA可以本身已知的方式被给予需要RNA编码的蛋白质或蛋白质片段的患者，例如因为其患有由缺陷型基因引起的疾病。对此，RNA与常规药学可接受的添加剂一起被制成药物制剂。制剂形式取决于给予的位置和性质。由于根据本发明所述的RNA的特征是在于特别高的稳定性，其可以多种方式制备，取决于所要施用的位置和形式。已发现，根据本发明所述的RNA非常稳定，以致于其可被冻干，以这种形式处理——例如粉碎或研磨和储存，然后在需要时可被重新构建并保持其生物学活性。
当全身给予RNA时，其通常与常规添加剂如张度调节剂和稳定剂一起被制成可注射的液体，优选地为单位剂量形式。作为稳定剂，采用公知的试剂，如例如，脂质、聚合物和纳米***或脂质体。在优选的实施方式中，提供了适于胃肠外给予的组合物，其包含根据本发明编码EPO的修饰的RNA。
在优选的实施方式中，特别是当RNA编码SP-B蛋白时，以适于通过肺摄取例如通过吸入的形式提供根据本发明所述的RNA。对此适当的配方对于本领域技术人员是已知的。在这种情况下，制剂是可通过常规的雾化器或吸入器被引入呼吸道的形式，例如作为雾化液或粉末。用于以液体给予的装置已知，并且以低剪切力操作的超声雾化器或具有穿孔振动膜的雾化器比喷嘴射流雾化器更适合。同样适合的是粉末气溶胶。与阳离子脂质复合的mRNA和暴露的mRNA在与糖，蔗糖冻干为粉末后均是可利用的——该粉末然后可被粉碎至可呼吸的尺寸，此外还显示生物学活性。
在优选的实施方式中，将意图肺部给予的药物组合物与预先或同时与药物组合物给予以增加转染效力的全氟碳组合。
在进一步优选的实施方式中，根据本发明修饰的RNA被提供在延迟释放的聚合物中，该延迟释放的聚合物作为涂布植入体的载体。对此，根据本发明修饰的RNA可被如此应用或者以受涂布聚合物和/或聚合物复合物保护的RNA应用。
本发明的进一步主题是表面上具有延迟释放的聚合物涂层的植入体，该涂层包含编码有益于植入体向内生长的因子。根据本发明，在此，包含仅编码一种因子的mRNA的涂层和包含编码多种因子的mRNAs的涂层均是可能的，该多种因子例如是多种生长因子或生长因子和血管发生因子或促进向内生长的更多因子。该多种因子也可以使其以交错的间隔释放的形式提供。
此外，表达“编码一种或多种生长因子和一种或多种血管发生因子的RNA”应被理解为指编码一种以上蛋白质——单独的蛋白质或作为融合蛋白质——的RNA序列以及编码不同蛋白质——其中各RNA序列编码一种蛋白质——的不同RNA序列的混合物。
本发明进一步通过下列实施例进行说明。
实施例1
为能评估IVTmRNA的治疗有效性，评估非免疫原性IVTmRNA是否可被获得以用于体内应用。因此，第一步，关于免疫原性和转染效力研究用修饰核苷体外转录的红色荧光蛋白质(RFP)的mRNA。结果显示，多修饰mRNA——其中25％的尿苷被2-硫尿苷(s2U)替代并且25％的胞苷被5-甲基胞苷(m5C)替代，生成s2U(0.25)m5C(0.25)IVTmRNA，其具有对人类初生单核血液细胞显著降低的免疫原性——如图1A所示，和在人类(图1B)和小鼠(图1C)肺泡类型II的上皮细胞中高于80％的高转染率。此外，mRNA表达的持续时间明显延长(图2A)。结果显示，该延长的表达主要是由于根据本发明多修饰的mRNA的较高的稳定性。绝对定量评估显示转染后7天s2U(0.25)m5C(0.25)RFPmRNA的量增加约10倍(图2B)。修饰RFPmRNA的翻译效力略降，因此不可能有助于较高和较长的活性(图4)。
下一步，利用修饰RNA免疫沉淀测试(RIP分析)研究免疫应答减弱所基于的机制。研究已显示，免疫***的细胞通过RNA结合Toll样受体(TLR)3(2)、TLR7(3)、TLR8(4)和解旋酶RIG-1(5)被未修饰报道mRNA(1)激活。结果显示，根据本发明所述的多修饰RFPmRNA与TLR3、TLR7、TLR8和RIG-1的结合相对于未修饰的RFPmRNA显著减少。在此方面，多修饰比单s2U修饰明显更有效(图2C)。如结合研究预期，未修饰的RFPmRNA在被静脉内注入小鼠时使IFN-γ、IL-12和IFN-α增加至相当高的程度，而多修饰的s2U(0.25)m5C(0.25)RFPmRNA阻止免疫应答(图2D)。总之，这些结果显示，根据本发明多修饰的mRNA显著减少TLR和RIG-1的结合，从而减少免疫应答，同时增加和延长表达，其使这种mRNA成为用于体内测试的非常有希望的选择。
因此，测试直接被引入小鼠肺部的编码增强的绿色荧光蛋白质和荧光素酶(EGFPLuc)的融合蛋白质的s2U(0.25)m5C(0.25)mRNA相对于未修饰的EGFPLucmRNA是否可强化和延长体内的荧光素酶表达。为此，应用本身已知的用于气管内给予的高压喷雾装置，如例如(6)所述，预先给予全氟碳(氟化FC-77)以增加转染效力(7)。3小时后，体内肺中的荧光素酶表达达到最大值，尽管治疗后5天总荧光迅速在24小时后降至低水平(图3A和B)。与此相反，在用s2U(0.25)m5C(0.25)EGFPLucmRNA治疗的小鼠中观察到高表达值直到治疗后5th天(图3A和B)。
这表明，根据本发明所述的多修饰mRNA对于治疗的治疗潜力是非常有希望的。因此，测试根据本发明多修饰的s2U(0.25)m5C(0.25)SP-BmRNA对SP-B缺陷型小鼠的治疗。SP-B是相对小的两亲肽，其由单个基因编码，并在肺泡类型II的上皮细胞中通过蛋白质水解处理被转化为包被肺泡(8，9)的具有381个氨基酸的前体中。其改善降低肺泡中的表面张力所必需的表面活性脂质的分布、吸收和稳定性。如果此蛋白质的基因是缺陷的，则出生后出现呼吸道疾病，该疾病可迅速导致死亡。已观察到，人类和转基因小鼠的遗传缺陷在死后的存活中具有重要作用(10)。通过SP-B基因的突变引起的遗传SP-B缺陷阻止表面活性脂质的形成，其导致出生后第一个月内呼吸衰竭(11)。肺移植体是唯一目前可能的治疗干预(12)。因此，SP-B缺陷的mRNA治疗将是可供选择的治疗，以确保该缺陷下的成活力。
因此，选择SP-B缺陷的敲除小鼠模型以测试利用根据本发明所述的SP-B的多修饰mRNA的基因治疗。对此，选择这样的小鼠模型：其中小鼠SP-BcDNA在SP-B-/-敲除小鼠中外源多西环素的控制下表达。在成年SP-B-/-小鼠中停用多西环素造成肺中SP-B的含量减少，当SP-B浓度跌落在正常水平的25％以下时其导致呼吸衰竭。条件转基因小鼠——其接受多西环素，正常存活(13，14)。采用的治疗策略包括如下：(i)在引入SP-BmRNA前用全氟碳预治疗小鼠，从而增加表达；和(ii)每周两次、每三天或四天重复施用SP-BmRNA四周(图3C)。为进行实验以证明该理论，利用高压雾化器将s2U(0.25)m5C(0.25)SP-BmRNA以气溶胶气管内给予条件SP-B-/-小鼠。该治疗防止小鼠呼吸衰竭，并延长其平均寿命至第28.8±1.1天(图3D)，直至限定的研究终点。与此相反，在停用多西环素后，未治疗的SP-B-/-小鼠在3至4天内显示急性呼吸问题的症状。这也在单独给予全氟碳或给予全氟碳和s2U(0.25)m5C(0.25)EGFPLucmRNA作为对照后被观察到，然后小鼠在3.8±0.4天内死亡(图3D，数据未显示)。此外，SP-B在用s2U(0.25)m5C(0.25)SP-BmRNA治疗的小鼠的肺中成功的重新构建通过SP-B的免疫染色(图3E)和半定量蛋白质印迹分析(图3F)而确定。已用s2U(0.25)m5C(0.25)SP-BmRNA治疗4周的小鼠的肺部组织学正常，而已接受s2U(0.25)m5C(0.25)EGFPLuc对照mRNA的小鼠的肺在4天后显示肺泡壁增厚、细胞浸润和间质性水肿(图3G)。该肺损伤伴有支气管-肺泡灌洗流体(BALF)中的充血(红细胞数量增加)和巨噬细胞和嗜中性白细胞数量增加以及炎性细胞因子水平升高(图3H和图S4)，而其在用SP-BmRNA治疗的小鼠中被很大程度地阻止。已显示，多西环素停用使未治疗的肺部功能恶化(14，15)。已观察到，SP-B-/-小鼠用s2U(0.25)m5C(0.25)SP-BmRNA延长的治疗保持正常的肺部功能，如接受多西环素的SP-B-/-小鼠中(图3I和图S5)。
总而言之，这些结果显示，肺的SP-B缺陷的所有功能和病理学参数大幅提高，并且与接受多西环素的条件(conditional)SP-B-/-小鼠相当。
结果显示小鼠模型中多修饰mRNA对致死肺病的治疗效力。但是，仍可改进mRNA治疗的进一步应用，如下：(i)未感染组织的细胞中不需要的mRNA翻译可导致目标区域外不需要的效应，(ii)如果多修饰的mRNA也到达未感染的组织，必须提供足量的mRNA，和(iii)重复用药对于短持续的mRNA活性是必要的。为使其改善，可采用微RNA生物学以防止未被疾病感染的细胞中不需要的mRNA翻译。通过并入目标内源微RNAs序列——其在靶细胞中不表达，mRNA降解可选择性地在未被疾病感染的细胞中发生，但在该过程中mRNA保留在靶细胞中，因此其副作用被最小化(16，17)。
在进一步的方法中，可组合释放***——靶向配体，其可使特异性受体结合至细胞表面，使得靶细胞中能够进行受体介导的转染。由于当今mRNA可大量生产(18)并且甚至多修饰mRNA的大规模生产的高效生产方法是可能的，根据本发明所述的mRNA的临床应用是可能的，并且这使其能够建立对各种疾病特别量身定做的mRNA***(19，20)，因此用药频率和短持续活性可被保持在最低限度，这是当前已知治疗所不能的。在这种方式下，根据本发明提供了治疗对由基因缺陷引起的疾病的有效分子治疗。
实施例2
为显示SP-B缺陷型小鼠中症状的改善或预期寿命的增加仅由根据本发明修饰的编码SP-B的mRNA的应用来实现，进行了进一步实验。利用实施例1所述的小鼠模型和条件。
设立三组小鼠。一组SP-B缺陷型小鼠一周两次接受根据本发明修饰的mRNA(b)，第二组28天一周两次接受根据本发明修饰的mRNA(c)，以及用于对照第三组小鼠接受修饰的EGFP-LucmRNA(a)。
发现未接受根据本发明修饰的SPBmRNA的小鼠经过短时间后死亡。接受根据本发明所述的RNA的小鼠仅在其被给予根据本发明所述的SP-BRNA的时候存活。这证明，根据本发明所述的RNA具有生物活性，并可替代必要的蛋白质。
详细地，实验如下进行。SP-BKO小鼠，如实施例1所述，一周两次接受修饰的EGFP-LucmRNA(a)(n＝10)或修饰的SP-BmRNA(b)(n＝4)或28天一周两次接受修饰的SP-BmRNA(c)(n＝4)。对Kaplan-Meier存活曲线作图，并进行Wilcoxon-Gehan测试。发现开始治疗前一周两次气管内给予双修饰的SP-BmRNA到转基因SP-B小鼠——其中SP-B基因受控于饮水中添加多西环素——的肺中(B)延长饮水中停用多西环素后的小鼠平均存活时间至10.2±0.5天(B)，与之相比，给予EGFP-Luc对照mRNA后为3.4±0.2天。
结果显示在图12的图中。发现气管内给予根据本发明所述的双修饰SP-BmRNA事实上挽救了生命。不添加根据本发明所述的mRNA时，小鼠经过短时间后死亡。该实验也显示，首先SP-BmRNA在体内产生生命必需的SP-B，其次SP-BmRNA必须被连续给予以防止实验动物死亡。
实施例3
在进一步实验中——其中利用实施例1所述全部接受多西环素的小鼠，研究了根据本发明所述的RNA是否在给予后早期阶段引起炎性反应。对此，设立5组，并且在给予不同制剂后8小时测量小鼠支气管肺泡灌洗液的细胞因子水平、IFNγ和IL-12。六组接受下列制剂：a)对照，未经治疗，即全氟碳或RNA均无，b)对照，全氟碳，c)对照，全氟碳和未修饰SP-BmRNA，d)发明，全氟碳和修饰s2U(0.25)m5C(0.25)SP-BmRNA和e)对照，全氟碳和SP-B质粒DNA，(n＝4)。在各情况下，给予20μg(50μl)制剂。结果显示在图13中。在图13中，显示平均值±标准偏差。图13中采用下列缩写：Doxy-多西环素，Pfc-全氟碳，pDNA-质粒DNA(*P<0.05，相对于未治疗的组)。
结果显示，相对于未治疗的小鼠，在气管内给予未修饰mRNA或质粒DNA时，支气管肺泡灌洗液中的炎性标记IL-12明显升高，而给予双修饰mRNA不导致IL-12升高。给予双修饰mRNA确实略增加炎性标记IFNγ的水平，但仅达到给予全氟碳后同样观察到的水平。与此相反，给予未修饰mRNA或给予质粒DNA也导致IFNγ水平显著升高。因此，利用根据本发明修饰的mRNA，将预期不到炎性反应，而给予未修饰mRNA或质粒DNA很快引起炎性反应。
实施例4
为证明根据本发明修饰的mRNA的应用可能性，研究多种类型的修饰及其对转染和翻译效力和对免疫原性的影响。在各情况下用200ngmRNA转染A459细胞，然后研究多少细胞已被转染和多少细胞中的荧光蛋白质已被翻译。该评价利用平均荧光强度(MFI)进行。结果显示在图10A中。测试根据本发明修饰的mRNA和与之相比的非根据本发明修饰的mRNA——其中采用两种不同的尿苷核苷酸修饰——和未修饰mRNA。根据本发明修饰的mRNA分子是：
s2U/m5C和s4U/m5C，其中修饰核苷酸各具有10％的含量和这样的RNA分子：除10％/10％的s2U/m5C和s2U/5mC外各进一步包含5％的修饰核苷酸，即一个是C2’NH2，一个是5％G’N3。结果显示，根据本发明修饰的mRNA呈现极高的转染效力，而未修饰mRNA和非根据本发明修饰的mRNA分别显示大大降低的转染和翻译效力。
通过在给予5μg各种mRNA后研究人类PBMCs的TNF-α水平，还测试了前述修饰mRNA的免疫原性。结果显示在图10B中。清楚可见，在给予未修饰mRNA或其中采用两种修饰尿苷核苷酸类型的mRNA时，TNF-α水平显著升高。根据本发明修饰的RNAs随之的TNF-α水平比未修饰的RNA低至少50％。
实施例5
用于生产根据本发明多修饰的所述的mRNA的方法。
a)体外转录的构建体
对于体外转录RFPcDNA(678bp)，利用包含SP6启动子的质粒，pCS2+DsRedT4。对于SP-BcDNA(1146bp)的体外转录，利用包含T7启动子的pVAX1质粒(Invitrogen)。为生成EGFPLuc(2.4kb)体外转录的载体，利用包含T7启动子的pST1-2β-globin-UTR-A-(120)构建体，其如(19)所述获得。利用标准分子生物学技术克隆构建体。
修饰mRNA的生成
为生成体外转录的模板，用XbaI使pCS2+DsRed.T4、EGFPLuc和SP-B质粒线性化。线性化的载体DNA用NucleoSpin提取II试剂盒(Macherey-Nagel)进行纯化，并通过分光光度法评估。用mMESSAGE-mMACHINESP6或T7Ultrakit(Ambion)进行体外转录。SP-6试剂盒用7-甲基GpppG为mRNA加帽，而T7试剂盒以超高产率在转录反应中生成抗反向帽类似物(ARCA；7-甲基-(3’-O-甲基)GpppGm7G(5’)ppp(5’)G。为生成RNA修饰体，以所述比例将下列修饰核糖核酸三磷酸添加到反应***：2’-硫尿苷5’-三磷酸、5’-甲基胞苷5’-三磷酸、假-尿苷5’-三磷酸和N6-甲基腺苷5’-三磷(全部来自TriLinkBioTechnologies，并用HPLC和31PNMR检测纯度)。在体外转录后，利用多(A)尾部试剂盒(Ambion)将来自pVAX1SP-B质粒的RNA酶促多腺苷化。多(A)尾部长约200nt。所有加帽的mRNAs(RFP、EGFPLuc和SP-B)用MEGAclear试剂盒(Ambion)进行纯化，并在生物分析仪器2100(AgilentTechnologies)上用AgilentRNA6000纳米分析对大小和纯度进行分析。
细胞转染
肺细胞转染
人类和小鼠的类型II肺泡上皮细胞系，A549和MLE12，分别在最低必需培养基(Invitrogen)中生长，该最低必需培养基补充有10％胎牛血清(FCS)、1％青霉素-链霉素和0.5％庆大霉素。转染前一天，每孔80000个细胞在24孔板中铺平板。根据制造商的说明利用Lipofectamin2000(Invitrogen)用200ngmRNA转染细胞(多于90％汇合)。4小时后，用PBS洗涤细胞，并添加含血清的介质。为进行长期表达的分析，将细胞有规律地再分(当汇合>90％时)。
人类PBMC转染
将液氮中冷冻保存的人类PBMCs(CTL-EuropeGmbH)用CTL抗聚集洗涤补充物在37℃下小心解冻，其间缓慢添加过滤灭菌的RPMI-1640(Invitrogen)。对于所述全部实验，利用PBMCs的单特征批次以使数据可再现。
流式细胞术
对已用RFPmRNA转染的A549和MLE12细胞进行流式细胞术分析，如上所述。将细胞用0.25％胰蛋白酶/EDTA从平板表面去除，用PBS洗涤三次，并再次悬浮在PBS中，从而利用FACSCalibur(BDBiosciences)测量荧光性。由超过对照细胞荧光强度的细胞群的百分比计算转染效力，该对照细胞仅被用PBS治疗。每管数出至少2500个细胞。用CellquestPro分析该数据。
细胞因子检测
用人类IL-8和TNF-α试剂盒(RayBio)、小鼠IFN-γ和IL-12(P40/P70)试剂盒(RayBio)和小鼠IFN-α试剂盒(RnD***)进行酶联免疫吸附分析(ELISA)。
实时体外翻译
利用ReticLysateIVT(Ambion)在体外翻译500ng的RFPmRNA。将蛋氨酸添加至最终浓度50μM。在30℃下于水浴中温育该混合物，在不同的时间抽取样本，并在WallacVictor21420多标记计数器(PerkinElmer)上测量590nm下的荧光强度。
定量RT-PCR
总RNA用RNeasy微型试剂盒(Qiagen)提取自A549细胞，或提取自人类PBMCs(参见下文RIP方案)，并根据产品手册利用iScriptcDNA合成试剂盒(Bio-Rad)使20μl的一批经过反向转录(RT)。利用iQSYBRGreenSupermix和iCycler(Bio-Rad)用下列引物双批扩增cDNA：RFP：5’-GCACCCAGACCGCCAAGC(正向)和RFP：5’-ATCTCGCCCTTCAGCACGC(反向)。利用自动计算基线周期和阈值的iCyclerIQ软件3.1(Bio-Rad)得到Ct值。
RNA免疫沉淀(RIP)
用5μgmRNA转染1×106个人类PBMCs(CTL-EuropeGmbH)——利用12.8μlLipofectamin2000，1mlOptiMEM1。4小时后，用10％FCS补充培养基。24小时后，将细胞悬浮液转移至管中，并通过350rpm下10分钟的离心使细胞沉淀。接着，利用ChIP-IT表达方案(ActiveMotive)的改良版进行RIP。DEPC处理的水(Serva电泳)被用于制备所有必要的反应剂。根据ChIP-IT手册，将固定液然后甘氨酸停止固定液和冰冷的1×PBS添加至细胞，并且在4℃下使细胞沉淀。然后，将细胞再次悬浮在其中已加入蛋白酶抑制剂PIC和PMSF的溶解缓冲液中，并在冰上温育30min。在4℃、2400rpm下10分钟离心后，上清液进行俘获反应。TLR-mRNA/RIG-mRNA复合物在8孔PCR带中俘获在磁珠上过夜，如ChIP-IT表达手册所述。此外，将SUPERaseRNA酶抑制剂(AppliedBiosystems/Ambion)添加至最终浓度1U/μl。抗人类TLR3小鼠IgG1、抗人类TLR7兔IgG1、抗人类TLR8小鼠IgG1(全部来自Imgenex)和抗人类RIG-1兔IgG1(ProSciIncorporated)被用作抗体。洗涤磁珠，然后将TLR-mRNA/RIG-mRNA抗体复合物洗脱，反向交联，并根据ChIP-IT表达方案用蛋白酶K处理。最后，洗脱的mRNA进行反向转录和定量RT-PCR，如上所述。
体内生物荧光
将D-荧光素底物溶于水，调节pH至7，并调整最终体积从而达到浓度30mg/ml。将50μl该溶液施用于麻醉后小鼠的鼻孔上，并通过鼻吸吸入(1.5mg荧光素/小鼠)。10min后，利用下列相机设置如(21)所述用IVIS100成像***(Xenogen)测量生物荧光：可视领域10；f1f-停止；高分辨率；和照明时间1至10min。定量评估和分析肺部区域的信号，利用生命图像软件(LivingImageSoftware)2.50版(Xenogen)减去背景。
动物研究
将6至8周龄雌性BALB/C小鼠(查尔斯河实验室)保持在无特定病原体条件下，并且分别保持在12小时光亮：12小时黑暗循环下的通气笼，并提供任用的食物和水。在实验开始前使动物适应至少7天。所有动物操作均得到本地伦理委员会批准和检查，并根据德国动物保护法指南进行。对于除注入尾静脉外的所有实验，动物均用美托咪定(medetomidine)(0.5mg/kg)、咪达***(midazolam)(5mg/kg)和芬太尼(fentanyl)(50μg/kg)的混合物腹腔麻醉。各实验后，将由阿替美唑(atipamezol)(50μg/kg)、氟马西尼(flumazenil)(10μg/kg)和纳洛酮(24μg/kg)组成的解毒剂皮下注射给予动物。通过用肝素化的1.3mm毛细管(Marienfeld)穿刺眼球后静脉在不同时间获得用于ELISA测试的血液。
注入尾静脉
以mRNA与脂质0.25的比例将25μg的RFPmRNA与Megafectin(MPBiomedicalsEurope)在体内混合，并根据制造商的建议加入增强子-3。利用动态光散射(DLS)用ζ-PALS/ζ电势分析仪(BrookhavenInstrumentsCorp.)测定被注射的复合物的完整性和颗粒大小。将小鼠置于限制器中，并用27号针头和1ml注射器将100μlmRNA/Megafectin溶液(相当于5μgmRNA)在30秒内注入尾静脉。
通过高压雾化气管内给药
将BALB/c和SP-B-/-小鼠如(14)所述麻醉，并固定在板***(HalowellEMC)上，使得上齿的角度为45°。利用改良的冷光耳镜测试版200(HeineOptotechnik)最优化照明咽部。用小型压舌板打开小鼠下颌，并用钝头夹钳将舌头推到旁边，和最大限度地暴露口咽。将连接于FMJ-250型高压注射器的1A-1C型微型喷雾器(均来自PennCenturyInc.)在气管内***，并连续地施用25μl的FluroinertFC-77(Sigma)和25μl的荧光素酶mRNA溶液(10μg)或50μl的SP-BmRNA溶液(20μg)。5sec后，撤出微型喷雾器注射器，并在5min后从支撑物取走小鼠。
肺部功能测量
如上所述麻醉纯合的SP-B-/-小鼠±多西环素±修饰mRNA。为防止自主呼吸，腹膜内注射维库溴铵(0.1mg/kg)。如(22)所述进行肺部机械测量。简而言之，以气管造口术将钝口钢套管(外径1mm)***气管中。活塞泵呼吸器既充当呼吸器又充当测量装置(flexiVent，SAV)。在呼吸气通气过程中，呼吸器被设置为受控体积和压力限定的通气(Vt＝10μl/g，Pmax＝30cmH2O，PEEP2-3cmH2O，在2.5Hz和100％氧气下)。接受多西环素的动物所用的Vt是8.4±1.4μl/g，接受多西环素和mRNA的动物所用的Vt是8.9±0.4μl/gBW(N.S.)。在两次1sec吹入15μl/g后，以5分钟间隔测量动物中的呼吸***的动力学-机械性质以及肺部进入阻力，从而建立标准体积历史(history)。对于振动测量，通气在PEEP水平停止。为确定由8sec的伪随机振动信号组成的强迫振动(FOT)的呼吸***的阻力(Zrs)，采用3ml/g的振幅。强迫信号的频率在1.75至19.6Hz之间(23，24)。在256Hz收集数据并用4sec的时间窗进行分析，66％重叠。肺部阻力数据表现为呼吸***在频率区域内的阻力(实部)和活性(虚部)。用肺的恒定相模型将肺部阻力数据(Zrs)再分，如Hantos等所提出。(25)。在该模型中，根据如下等式Zrs由呼吸阻力(Rn)、呼吸道惯性(惯性)、组织弹性(HL)和组织阻尼(GL)构成：
Zrs＝Raw+jωlaw+(GL-jHL)/ωα，
其中ω是角频率，并且ω，Zrs的频率依赖性(ω＝(2/ωtan-1(1/ω))。肺迟滞性(hysteresivity)(eta＝GL/HL)是肺组织构成的量度，其中组织阻尼以及组织弹性均被包括在内(26，27)。对于各测量，自动测试恒定相模型的适配。适配性质表现为决策相干性(COD)，如COD在0.85以下则数据被否定。
表面活性蛋白的分析
用Bio-Rad蛋白质分析试剂盒(Bio-Rad)测定灌洗上清液的总蛋白质含量。在非还原条件下于NuPage10％bis-tris凝胶上用NOVEXX细胞II微型细胞***(Novex)分离10μg总蛋白质。电泳后，将蛋白质移至具有的NuPage印迹模块(Novex)PVDF膜(ImmobilonP)上。用针对SP-B的多克隆兔抗血清(c329，由DrW.Steinhilber，AltanaAG赠送)检测表面活性蛋白B(SP-B)，然后用辣根过氧化物酶偶联的多克隆山羊抗兔抗IgG(1:10000，Dianova)进行改良的化学发光测试(AmershamBiosciences)。在这些条件下，该测试每通道可检测到约2.5ngSP-B(28)。使用DIANAIIIdev.1.0.54——其带有Aida图像分析仪(RaytestGmbH)，作为化学发光检测***，并以数量I4.6.7(Bio-Rad)定量评估数据。
荧光显微镜分析
固定(3％多聚甲醛)和嵌入石蜡的部分经受免疫组织化学，如制造商推荐的(Abcam，www.abcam.com/technica)。将玻片用抗人类抗小鼠SP-B抗体和用Texas红色偶联的抗兔IgG抗体(均来自Abcam，1:500)温育，并用DAPI复染。通过ZeissAxiovert135得到荧光图像。
统计学
通过用REST2005软件(29)配对固定再分配随机分组测试来分析组与组之间mRNA表达的差异。用Prism5.0计算生物荧光衰减的半衰期。所有其他分析利用Wilcoxon-Mann-Whitney测试以SPSS15(SPSSInc.)进行。数据被描述为平均值±SEM(平均值的标准偏差)或中值±IQR(四分位距)，并且P<0.05(两边的)被指定为统计学上显著的。
实施例6
根据本发明的编码EPO的多修饰mRNA
利用主要如实施例3所述的方法，生成修饰的mRNA，其包含编码EPO的部分。测试该mRNA的表达效力。对此，将5μg根据本发明修饰的mRNA或未修饰的mRNA肌内注入小鼠。每组小鼠具有四个成员。在给予RNA后第14天和第28天，用ELISA测试定量评估血清中EPO的含量。评估同一实验的小鼠的全血的红细胞压积值。显示在附图11中的数据均表示平均值±SEM。散点表示各自的红细胞压积值。条线表示中值。*P<0.05，在各时间点相对于未治疗的组；+P<0.05，在各时间点相对于未修饰mEPO组。
(c)数据显示平均值±SEM。人类PBMCs用5μg未修饰或修饰RFPmRNA转染，并且回收率利用RIP用对TLR-3、TLR-7和TLR-8具有特异性的抗体测定。方块表示平均值±IQR。线表示最小值和最大值。*P<0.5，**P<0.01，***P<0.001，相对于未修饰mEPO组。
(d)5μg未修饰和修饰mEPOmRNA被静脉内注入小鼠(分别n＝4)。24小时后，通过ELISA定量评估血清中的干扰素-γ、IL-12和干扰素-α水平。
由图可见，根据本发明修饰的RNA的炎性标记在这种非病理范围内，而未修饰RNA或仅以修饰尿苷核苷酸修饰的RNA的炎性标记显著升高。
因此，根据本发明，提供了编码EPO的mRNA，其非常稳定，同时很少引起或不引起免疫学反应。这种mRNA可有利地被用于治疗***缺陷。由于高稳定性，仅需每2至4周给予。
实施例7
研究根据本发明修饰的编码EPO的mRNA的重复给予如何影响红细胞压积值。其表明根据本发明修饰的mRNA是否在其被给予身体中时在较长时间内还保持活性。对根据本发明所述的mRNA的免疫学反应例如将使活性降低。
因此，将10μg修饰mEPOmRNA(如实施例6所述)在第0、21和34天肌内给予小鼠(n＝10)。然后测定第0、21、34、42和51天小鼠全血的红细胞压积值。结果显示在图14中。图中数据表示平均值±标准偏差。*P<0.05，相对于第0天的红细胞压积值。
结果确定，重复给予根据本发明修饰的mRNA导致红细胞压积值持久升高。这表明，尽管在其被多次给予时mRNA仍保持活性。
实施例8
根据本发明修饰的mRNA也适于将促进愈合或向内生长的蛋白质引入植入体周围，从而促进愈合过程或向内生长。为表明根据本发明修饰的mRNA在其被以钛表面上的涂层形式施用时稳定且持续地表达，将包含编码荧光素酶的mRNA的涂层施加于钛板上。然后研究荧光素酶是否可在附近、游离或在细胞中被检测到和可检测到多久。
编码不同蛋白质的两个序列被用于实验，即从表达其的细胞分泌的荧光素酶的RNA，作为将释放到附近的蛋白质——如例如，生长因子或血管发生因子——的模型。进一步，编码不分泌但保持在细胞中的荧光素酶的RNA被用作将在细胞中将具有某种作用的蛋白质的模型。对于分泌模型，采用编码Metridia荧光素酶的RNA，其中相对于野生型，25％的尿苷单位被s2U替代，并且25％的胞苷单位被m5C替代。对于非分泌蛋白质模型，采用编码萤火虫荧光素酶的mRNA，其中同样25％的尿苷单位被s2U替代，并且25％的胞苷单位被修饰m5C替代。
发现根据本发明所述的mRNA制剂——其被保护为与聚合物一起形成的复合物，在从涂层材料释放后保持活性，并长期表达。发现根据本发明修饰的mRNA编码的各个蛋白质均可长期被检测到。
对于测试，将通过聚合物复合物保护的根据本发明修饰的mRNA嵌入载体材料，该载体材料被用作钛板上的层。载体材料是聚交酯(PDLLA)——此用途的公知材料，其可逐渐选择性释放包含的mRNA。这种涂层的优势在于，释放可被具体调整。结果显示，降解时释放的聚交酯片段不损害mRNA的活性，使得该***是非常适合的。mRNA本身通过涂层聚合物而稳定。
对于实验，采用编码Metridia荧光素酶的质粒DNA(pDNA)或修饰mRNA。将200μlH2O(+如必要500μg乳糖)中分别9μg的Metridia荧光素酶pDNA或双修饰s2U(0.25)m5C(0.25)mRNA与200μlH2O中9.4μg的L-PEI(L-聚乙烯亚胺)复合。其后，将复合物引入100μl涂层聚合物溶液(2.4μl的409.1mMP6YE5C)，并冻干过夜(涂层聚合物P6YE5C如EP1198489所述制备)。然后，在冰上将复合物悬浮于72μl的PDLLA(聚-DL丙交酯)/EtOAc(50mg/mlPDLLA)混合物中，并通过micropotter手段进行分散。将96孔板中高压灭菌的钛板(r＝3mm，分别18μl)涂布该分散液。进一步冻干过夜后，添加A549细胞的200μlRPMI-1640培养基(5000个细胞/200μl)。从第2天起，各情况中取50μl上清液，更换培养基，并在之后的日子里各自通过100μl腔肠素(coelenterazine)溶液(0.003mM最终浓度)的手段测定Metridia荧光素酶的表达。
在进一步实验中，在其已沉积至磷酸钙颗粒上并以此形式被引入涂层时测试根据本发明修饰的编码Metridia荧光素酶的mRNA的活性。对此，将600μl1×HBS中的4μgMetridia荧光素酶s2U(0.25)m5C(0.25)mRNA的在各时间与33μl2.5MCaCl2混合。30min后，以此涂布96孔板中的高压灭菌的钛板(r＝3mm，分别18μl)。冻干过夜后，添加200μlRPMI-1640培养基中的A549细胞(5000个细胞/200μl)。从第2天起，分别提取50μl上清液，更换培养基，并在之后的日子里各自通过100μl腔肠素溶液(0.003mM最终浓度)的手段测定Metridia荧光素酶的表达。
结果可在图15的图中看到。结果清楚显示，根据本发明修饰的mRNA保持活性——即使在其受聚合物涂层保护，被引入延迟释放的基质，并且被施于钛植入体上时。此外，根据本发明修饰的mRNA保持生物活性，并被持续翻译为经编码的蛋白质。分泌能力同样被保持，由如下事实可见：细胞培养基中(作为分泌的骨生长因子如例如，BMP-2的模型)可检测到Meridia荧光素酶。此外，结果令人惊讶地显示，具有修饰mRNA的涂层(包被)导致蛋白质表达比具有类似质粒DNA的钛植入体涂层更高。当mRNA/PEI复合物在并入到钛植入体涂层前被提供涂层聚合物时，得到比相同复合物但不具有涂层聚合物的应用还要更高的蛋白质表达(图中修饰的mRNA/IPEI-P6YE5C)。此外，发现添加乳糖作为添加剂是可能的，而修饰mRNA不丧失其生物学活性。
结果还显示，沉淀在磷酸钙颗粒上的修饰mRNA保持其活性，并可在钛植入体涂层中发挥其有利的性质。生物学活性得到保持。这具有特别的重要性，因为磷酸钙可直接并入到骨中。
如上所述，用编码萤火虫荧光素酶的DNA或RNA进行进一步的实验。对此，将分别在200μlH2O中的9μg萤火虫荧光素酶pDNA或修饰s2U(0.25)m5C(0.25)mRNA复合200μlH2O中的9.4μgL-PEI。其后，将复合物引入100μl涂层聚合物溶液(2.4μl409.1mMP6YE5C)，并冻干过夜。接着，在冰上将复合物溶于72μl聚-DL-乳酸(PDLLA)/乙酸乙酯(EtOAc)(50mg/mlPDLLA)混合物，并通过micropotter法进行分散。用该分散液涂布96孔板中的高压灭菌的钛板(r＝3mm，分别18μl)。进一步冻干过夜后，添加200μlRPMI-1640培养基中的A549细胞(5000个细胞/200μl)。在第2天，向各孔添加1μl350μMD-荧光素，温育20min，并通过生物成像测定荧光素酶的表达。结果显示在中图16。由图16的图可见，钛植入体可被涂布根据本发明修饰的mRNA，在这期间mRNA还进一步保持生物活性，并翻译编码的蛋白质。形成的蛋白质留在细胞中，并可在胞内被检测到。此外，结果显示，具有修饰mRNA的涂层导致比具有类似质粒DNA的钛植入体涂层更高的蛋白质表达。
实施例9
为控制根据本发明修饰的mRNA的表达以使编码的蛋白质仅在对其需要的细胞而不在其他细胞中表达，微RNA结合位点被并入到mRNA中，从而能够进行mRNA表达的细胞特异性调控。
对此，在具有10％FCS和1％青霉素-链霉素的MEM中培养HEK293细胞。在转染前24hr，将100000个细胞/孔接种到24孔板中。在转染前直接将培养基替换为400μlOptimem(Invitrogen)。在具有10％FCS和1％青霉素-链霉素的RPMI-1640培养基中培养U937细胞。在转染前直接将每孔400μlOptimem培养基(Invitrogen)中的800000个U937细胞接种到24孔板中。对于各孔，用Optimem将100ngEGFPmRNA和250ngRFPmiRNA-BSmRNA(见下文)稀释至50μl。用Optimem将2μlLipofectamine2000定容至50μl，并在室温下温育5min。然后将mRNA溶液移入Lipofectamine2000溶液并在室温下再温育20min。将产生的溶液和细胞移入孔中，并在4hr后加入青霉素-链霉素(5μl)，在培养箱中保持温育过夜。其后，将HEK293细胞用PBS洗涤，并通过添加胰蛋白酶然后在300G下离心5min从孔底分离。同样将U937细胞在300G下离心5min。去除上清液，然后用PBS洗涤各细胞两次。接着，将细胞再次悬浮于500μlPBS中，用于FACS分析。在图17的两个图中，EGFP表达与RFP表达的比显示为阳性细胞数(图17a)和平均RFP荧光强度(图17b)。
结果显示，通过将微RNA结合位点并入到体外转录的mRNA中，可细胞特异性地调控表达。在RFPmiRNA-BSmRNA中，微RNA结合位点——其通过短间隔序列彼此分开——四倍重复的未翻译的序列位于自RFP序列的3’端和自多A尾部的5’端(SEQIDNo.1)。结合于微RNA142-3p的微RNA结合位点被采用。该微RNA在造血细胞如U937细胞而不在其他来源细胞如HEK-293细胞中表达。当微RNA142-3p结合RFPmiRNA-BSmRNA——例如在U937细胞中——时，mRNA的降解通过RNA干预起始。因此，相比微RNA142-3p不存在的细胞，RFP的形成减少，即较少细胞以较低的强度表达RFP。为表明本理论对根据本发明修饰的mRNA也很好地起作用，各自用EGFPmRNA(无微RNA结合位点)和RFPmiRNA-BSmRNA(具有微RNA142-3p的微RNA结合位点的四倍串联重复)共转染U937和HEK-293细胞，然后通过FACS测定EGFP和RFP的表达。由于U937细胞中的RFPmiRNA-BSmRNA因为RNA干预而比在HEK-293细胞中更快地降解，同时两种细胞中的EGFPmRNA同样稳定，预期HEK-293细胞中EGFP与RFP的比将高于U937细胞。这可在进行的实验确定。图清楚显示，基于EGFP-阳性细胞数标准化后的RFP-阳性的U937细胞数明显低于HEK-293细胞。同样应用于每个细胞形成的RFP数量。结果因此清楚表明，体外转录mRNA的生物学活性大小可通过并入微RNA结合位点在转染细胞后受到控制。mRNA翻译因此可在不需要mRNA翻译的细胞中得到抑制。副作用也可因此减少。
本实施例中用于实验的mRNA具有如下序列(SEQIDNo.1)。RFP序列以灰色背景显示。下划线的序列表示具有间隔序列的微RNA142-3p的微RNA结合位点的四倍串联重复。合成后，利用BamHI-EcoRv该序列被克隆到载体pVAX1中。
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Claims (30)

1.具有编码蛋白质或蛋白质片段的序列的多核糖核苷酸，其中所述多核糖核苷酸包含未修饰和修饰核苷酸的组合，其中5至50％的尿苷核苷酸和5至50％的胞苷核苷酸分别为修饰的尿苷核苷酸和修饰的胞苷核苷酸。
2.具有编码蛋白质或蛋白质片段的序列的多核糖核苷酸，其可得自核苷酸ATP、GTP、CTP和UTP的核苷酸混合物，其中5至50％的胞苷核苷酸和5至50％的尿苷核苷酸被修饰。
3.权利要求1或权利要求2所述的多核糖核苷酸，其特征在于所述多核糖核苷酸是mRNA。
4.权利要求3所述的多核糖核苷酸，其特征在于所述mRNA是体外转录的mRNA(IVTmRNA)。
5.前述权利要求中的一项所述的多核糖核苷酸，其特征在于所述RNA编码蛋白质或蛋白质片段，所述蛋白质或蛋白质片段的缺陷或缺失可引起疾病，所述蛋白质或蛋白质片段可缓解、预防或治愈疾病或可有助于有益的或必要的功能。
6.前述权利要求中的一项所述的多核糖核苷酸，其特征在于15至30％，优选地7.5至25％的尿苷核苷和15至30％，优选地7.5至25％的胞苷核苷被修饰。
7.前述权利要求中的一项所述的多核糖核苷酸，其特征在于其包含至少两种类型的修饰尿苷核苷和/或至少两种类型的修饰胞苷核苷。
8.权利要求7所述的多核糖核苷酸，其特征在于至少一种类型的修饰尿苷核苷和/或胞苷核苷具有用于连接一个或多个功能载体的官能团，作为修饰。
9.前述权利要求中的一项所述的多核糖核苷酸，其特征在于修饰尿苷选自2-硫尿苷、5-甲基尿苷、假尿苷、5-甲基尿苷5’-三磷酸(m5U)、5-碘尿苷5’-三磷酸(I5U)、4-硫尿苷5’-三磷酸(S4U)、5-溴尿苷5’-三磷酸(Br5U)、2’-甲基-2’-脱氧尿苷5’-三磷酸(U2’m)、2’-氨基-2’-脱氧尿苷5’-三磷酸(U2’NH2)、2’-叠氮基-2’-脱氧尿苷5’-三磷酸(U2’N3)和2’-氟-2’-脱氧尿苷5’-三磷酸(U2’F)。
10.前述权利要求中的一项所述的多核糖核苷酸，其特征在于修饰胞苷选自5-甲基胞苷、3-甲基胞苷、2-硫代-胞苷、2’-甲基-2’-脱氧胞苷5’-三磷酸(C2’m)、2’-氨基-2’-脱氧胞苷5’-三磷酸(C2’NH2)、2’-氟-2’-脱氧胞苷5’-三磷酸(C2’F)、5-碘胞苷5’-三磷酸(I5U)、5-溴胞苷5’-三磷酸(Br5U)和2’-叠氮基-2’-脱氧胞苷5’-三磷酸(C2’N3)。
11.前述权利要求中的一项所述的多核糖核苷酸，其特征在于其在5’末端具有m7GpppG帽和/或至少一个IRES和/或多A尾部。
12.前述权利要求中的一项所述的多核糖核苷酸，其用于转录体替代治疗。
13.前述权利要求中的一项所述的多核糖核苷酸，其特征在于其包含mRNA序列，所述mRNA序列编码至少一种总体上或在特定情况下有益于和支持身体的因子。
14.前述权利要求中的一项所述的多核糖核苷酸，其特征在于其包含RNA序列，所述RNA序列编码生长因子、血管发生因子、刺激因子、诱导因子、酶或其他生物活性分子。
15.前述权利要求中的一项所述的多核糖核苷酸，其特征在于其包含mRNA序列，所述RNA序列编码表面活性蛋白B(SP-B)、EPO、ABCA3、BMP-2或其片段。
16.权利要求13所述的多核糖核苷酸，其包含编码SP-B的序列，用于治疗新生儿呼吸窘迫综合征。
17.权利要求13所述的多核糖核苷酸，其包含编码EPO的序列，用于治疗EPO缺陷。
18.权利要求13所述的多核糖核苷酸，其包含至少一种编码生长因子、血管发生因子、刺激因子、诱导因子或酶的序列，用于植入体的涂层。
19.前述权利要求中的一项所述的多核糖核苷酸，进一步包含至少一个靶序列或在靶细胞中不表达的内源微RNA的靶定序列。
20.权利要求8所述的多核糖核苷酸，其特征在于所述功能载体是靶序列、PEG基团和/或靶向配体。
21.药物组合物，包含至少一种前述权利要求中的一项所述的RNA和药学可接受的添加剂。
22.权利要求21所述的药物组合物，其是气管内和/或肺部给予的形式，或是施用于植入体上的层的形式。
23.权利要求22所述的药物组合物，其另外包含用于在给予包含RNA的组合物前或期间给予的至少一种全氟碳。
24.权利要求23所述的药物组合物，其包含全氟碳和s2U(0.25)m5C(0.25)SP-BmRNA。
25.植入体，其具有权利要求1至20中的一项所述的修饰RNA的涂层，所述修饰RNA在作为载体的延迟释放的聚合物中。
26.权利要求25所述的植入体，其是牙齿植入体、髋内用假体，膝内用假体或脊椎融合体。
27.权利要求25或26所述的植入体，其中所述载体聚合物包含至少一种类型的修饰RNA。
28.权利要求25至27中的一项所述的的植入体，其中所述载体聚合物包含编码至少一种对植入有益的蛋白质的RNA。
29.权利要求25至28中的一项所述的的植入体，其中所述载体聚合物包含编码一种或多种生长因子和一种或多种血管发生因子的RNA。
30.筛选核苷酸序列从而测试免疫原性和表达性质的方法，其中使RNA序列接触至少一种选自TLR3、TLR7、TLR8和解旋酶RIG-1的受体，并且测定结合能力。
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