JP6867305B2 - 磁性キトサン微粒子を使用するポリメラーゼ連鎖反応に対するシングルステップdna調製 - Google Patents
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Description
本願は、2015年5月20日に出願された米国仮特許出願第62/164394号、2016年4月15日に出願された米国仮特許出願第62/323188号に対する優先権の利益を主張するものであり、その米国仮特許出願は、引用することによりその全体が本明細書の一部をなす。
キトサンは正に帯電していることから、適度に低いpHでDNAを効率的に捕捉することが当該技術分野においてよく知られている。本発明の非限定的な一実施形態では、マイクロチューブ中の一連のバッファー変動によりDNA捕捉アッセイを行った。微粒子をチューブの片側に引っ張って保持する磁性チューブスタンドによってバッファー変動を容易にした。上清をqPCR分析のために保存した。各バッファー変動の後、チューブを3分間、最高速度でボルテックスに供した。40μgの架橋したキトサン微粒子を、低pHロードバッファー(pH6、10mM MES、0.1% Triton X−100)中で30分間に亘って2回予備洗浄することにより、低pH DNA吸着アッセイを行った。99μLの低pHロードバッファー、及び脱イオン水で希釈した1μLのpUC19プラスミドDNAを添加することにより、DNAを微粒子にロードした。その後、微粒子を100μLの低pHロードバッファー中で洗浄した。最後に、該微粒子を100μLの溶出バッファー(pH9、10mM Tris、0.1% Triton X−100、及び50mM KCl)中でボルテックスした。各工程の上清中のDNAの量をqPCRで定量した。反応物は、10μLのiQ SYBR Green Supermix、2μLの2.5μMフォワードプライマー(GTC TCATGA GCG GAT ACA A)(配列番号2)、2μLの2.5μMリバースプライマー(CTC GTG ATA CGC CTA TTT TT)(配列番号3)、及び6μLの試料からなるものとした。反応は、95℃で3分間のホットスタートに続く30回の熱サイクルであった。各サイクルは、95℃で3秒間の溶融工程、56℃で30秒間のアニール工程からなるものとした。ロードバッファー及び溶出バッファー中のプラスミドpUC19の段階希釈を使用して検量線を作成し、未知の試料を定量した。試料から実際のシグナルを検出するのに要するサイクル数として定義される閾値サイクルCtに対してテンプレートの開始量の対数をプロットすることにより、検量線を構築した。
本発明による方法に基づき、キトサン微粒子上に捕捉されたプラスミドDNAを放出せずにPCRによって増幅することができた。非限定的な例として、反応混合物は、1×iQ SYBR Green Supermix、0.36nMフォワードプライマー、及び0.36nMリバースプライマーからなっていてもよい。高pH捕捉に続いて、微粒子を30μLの高pHローディングバッファーに再懸濁し、PCRウェルに移した。ローディングバッファーを20μLの反応混合物で置き換えた後、ピペットで吸引した。リアルタイムPCRの結果を図7に提示する。具体的には、図7は、微粒子を用いて行われたPCR反応(黒丸)、及び微粒子を用いずに行われたPCR反応(灰色の円)に対するPCR検量線を示す。反応物へのキトサン微粒子の添加は、微粒子を用いない反応、E=90.6%よりも効率的ではないPCR、E=67.6%をもたらした。しかしながら、微粒子からのDNAの増幅を成功させるため、酵素及びプライマーの濃度を僅かに増加した。PCR産物を溶融(変性)分析及びゲル電気泳動によって検証した。同じ熱サイクル(cycler)による微粒子PCRの直後に溶融分析を行った。温度を65℃から95℃まで、5秒毎に0.5℃増加させ、蛍光を各温度段階で測定した。また、微粒子PCR上清を、1%アガロース、及び1.6×SYBR Green Iゲル上で、75Vで1.5時間に亘って泳動させた。検量線をpUC19の標準試料から構築し、4桁超に亘って直線的であることがわかった。プラスミドDNAは増幅したが、PCRの効率は、酵素及びプライマーは同じ濃度であるが微粒子のない反応で見られる90.6%に対して67.6%まで減少した。反応物へのキトサン微粒子の添加によるPCR効率の減少は、おそらく、反応中のプライマー及び/又はアンプリコンの吸着に起因する可能性が考えられる。プライマーの吸着を、キトサン微粒子と混合したプライマー溶液の上清を用いてPCR反応を行うことにより測定した。最初に、30分間架橋した40μgのキトサン微粒子を高pHローディングバッファーで2回予備洗浄した。その後、100μLのpH8.5の10mM Tris、2.5μMフォワードプライマー、2.5μMリバースプライマー、及び0.1% Triton X−100をピペットにより微粒子とともに吸引した。プライマー溶液を除去し、リアルタイムPCR(qPCR)に使用した。反応混合物は、10μLのiQ SYBR Green Supermix、2μLのプライマー溶液、2μLの脱イオン水、及び6μLのpUC19スタンダードからなるものとした。微粒子とともに3分間ボルテックスした溶液は、DNAを増幅しなかった。しかしながら、ウェル内でPCR反応物を混合するには、通常、ボルテックスではなくピペットによる吸引が使用される。ピペットによって微粒子とともに吸引された溶液は、pUC19を効率的に増幅し、より穏やかな混合が微粒子上に(又はその中に)DNAが効率的に浸透及び吸収することを防止したことを示した。図8は、0.5時間に亘って架橋されたキトサン微粒子とともに吸引されたプライマーから構築されたPCR検量線を提示するものである。反応の効率は112%であったことから、最小のプライマーが吸収された。キトサン微粒子を用いる熱サイクルに供したPCR反応物の希釈試料を吸引することにより、また溶液中に残されたアンプリコンを測定するためのqPCRを使用して、アンプリコンの吸着を測定した。最初に、40μgのキトサン微粒子を高pHローディングバッファーで2回予備洗浄した。99μLの高pHロードバッファー及び脱イオン水に希釈されたアンプリコン1μLを添加することによって微粒子上にアンプリコンをロードした。微粒子をボルテックスしない代わりに、ピペットにより吸引した。添加するアンプリコンは、検量線を作成するために使用した標準的なpUC19 PCRから産生し、104倍又は106倍に希釈した。上清に残ったDNAを、qPCR及びアンプリコンの検量線で定量した。微粒子に添加したアンプリコンの半分は、穏やかな混合であっても捕捉された。アンプリコンはプライマーよりも吸収しやすかったため、微粒子を用いたPCR反応効率は、微粒子が重合するにつれ吸収されるアンプリコンに起因して失われた。溶液中に代えて、キトサン微粒子上で蛍光の増加を直接測定することにより、PCR効率を回復することができるかもしれない。
高pHでキトサン微粒子へのDNA吸着機構を調査するため、アニオン染料であるブリリアントイエロー(BY)の吸着をpHの関数として測定した。BYをpH5からpH12.5までの10mMバッファー及び0.1% Triton X−100に溶解させた溶液をスタンダードとし、試料をロードする。最初に、BYを含まないバッファーで40μgのキトサン微粒子を2回予備洗浄した。その後、100μLの5μM BYを微粒子上にロードした。3分間ボルテックスした後、Evolution 60分光光度計による397nmでの吸光度をスタンダード溶液と比較することによって、上清に残ったBYを定量した。また、0.5時間に亘って架橋されたキトサン微粒子へのメチレンブルー(Sigma)及び金ナノ粒子の吸着(それぞれ670nm及び530nmで測定された吸光度)をpH6及びpH8.5で測定した。
キトサン微粒子の製造プロセスは、室温で調製及び保存される、2%(体積/体積(v/v))の酢酸中の2%(重量/重量(w/w))の先に記載される低分子量キトサンのストック溶液と、ヘキサデカン中の2%(w/w)のSpan 80の油剤とを利用する。微粒子の製造に先立って、1%(v/v)の酢酸中の1%(w/w)の低分子量キトサン及び0.5%(w/w)の磁性酸化鉄(III)ナノ粒子の水溶液、並びに油剤中0.44gのグルタルアルデヒド(正:glutaraldehyde)(グレード1、水中70%、Sigma)の架橋混合物を調製する。1600rpmにセットしたホモジナイザーにより持続的に混合しながら、19mLの油剤中へ1mLの水溶液を滴らせることにより、100mLビーカー中でキトサンを乳化した。3分間乳化した後、架橋混合物を滴加し、その後、更に5分間、ホモジナイザーにより更に混合した。微粒子は、キトサンアミン基と反応するグルタルアルデヒドによって架橋され、シッフ塩基を形成する。次に、微粒子を50mLのチューブに移し、旋回装置上で所望時間に亘って架橋する。微粒子を1000rpmで2分間遠心分離した後、グルタルアルデヒドを含むヘキサデカンを除去することにより架橋反応を停止してもよい。
図4Aは、本発明によるMCF7ヒト乳癌細胞から得られた精製hgDNAのリアルタイムPCR増幅に関する。図4A中の増幅曲線は、複数の異なる試料に対する各PCRサイクルでの蛍光強度(相対蛍光単位すなわちRFUで示される)を表す。キトサンビーズに付着した精製MCF7 DNAを、キトサンビーズの表面から直接増幅する。増幅曲線402は、ビーズ表面から直接行われた、精製MCF7 DNAの増幅を立証するものである。増幅曲線404は、MCF7細胞を溶解し、MCF7 DNAを抽出するため、キトサンビーズを含むMCF7試料溶液を機械的に撹拌することによるキトサンビーズに付着したMCF7 DNAの増幅に関する。具体的には、キトサンビーズとMCF7試料溶液とをボルテックスすることによりキトサンビーズ上にMCF7 DNAが捕捉される。曲線406は、キトサンビーズを使用せずに従来の技術によって溶液から増幅された陽性対照の精製MCF7 DNAに対する増幅曲線である。曲線408は、汚染及びプライマー二量体形成をモニタリングすることを可能とする非テンプレート対照曲線である。グリセルアルデヒド−3−ホスフェートデヒドロゲナーゼ(GAPDH)プライマーセットを使用することにより増幅を行い、600塩基対(bp)長のアンプリコンを産生した。増幅曲線402及び増幅曲線404は、本発明に従ってビーズ表面から直接行われた精製MCF7 DNAの増幅を立証するものである。
図5A及び図5Bは、MCF7ヒト乳癌細胞から得られ、G6PCプライマーを使用することによって増幅されて40bpのアンプリコンをもたらす、精製hgDNAに対する増幅曲線(502及び514)及び対応する変性曲線(504及び516)を実証するものである。
Claims (34)
- 1以上の細胞を含む生体試料から核酸を精製する方法であって、
PCR増幅に適合するpHを有する前記生体試料に微粒子を添加する工程であって、前記微粒子はキトサン微粒子であり、前記キトサン微粒子は、油中にキトサン小滴を作り、その後、前記小滴を前記微粒子へと架橋することによって製造される、工程と、
前記生体試料を機械的に撹拌することにより、前記生体試料中の前記1以上の細胞を溶解する工程と、
放出された核酸を前記微粒子上に捕捉する工程と、
を含み、
電荷切り替え可能なシェルの下の前記キトサン微粒子の内側が高pHにおいて正に帯電したままであり、前記キトサン微粒子は高pHにおいて、低pHにおけるのと同じように効率的に細胞の溶解と核酸の捕捉とを可能にする、方法。 - 前記微粒子が磁性微粒子である、請求項1に記載の方法。
- 前記小滴の微粒子への架橋が経時的に微粒子のコアに入る、請求項1に記載の方法。
- 磁性ナノ粒子を個々の微粒子内に包埋することを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記磁性ナノ粒子が直径20nm〜40nmの鉄ナノ粒子である、請求項4に記載の方法。
- 前記微粒子の表面から前記核酸を精製することに続いて、増幅することを更に含み、該精製が該増幅と同じバッファーを用いて行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記溶解が、前記微粒子を含む前記生体試料をボルテックスすることを含む、前記生体試料を機械的に撹拌することによって行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記生体試料中の前記1以上の細胞を溶解する工程が、前記生体試料を加熱することと、前記生体試料をボルテックスすることとを含む、請求項1に記載の方法。
- 捕捉された核酸を含む微粒子を分離及び洗浄することを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記キトサン微粒子が、細胞溶解及び同時のDNA捕捉を提供した後、PCR増幅反応の間、DNAテンプレートに対する固体支持体としてはたらく、請求項1に記載の方法。
- 核酸がプラスミド、細菌DNA、及びヒトゲノムDNAからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 生体試料から核酸を増幅する方法であって、
前記生体試料に微粒子を添加する工程であって、前記微粒子はキトサン微粒子であり、前記キトサン微粒子は、油中にキトサン小滴を作り、その後、前記小滴を前記微粒子へと架橋することによって製造される、工程と、
前記生体試料を機械的に撹拌して前記生体試料中の細胞を溶解する工程と、
放出された核酸を前記微粒子上に捕捉する工程と、
前記捕捉された核酸に対して直接増幅を行う工程と、
を含み、
電荷切り替え可能なシェルの下の前記キトサン微粒子の内側が高pHにおいて正に帯電したままであり、前記キトサン微粒子は高pHにおいて、低pHにおけるのと同じように効率的に細胞の溶解と核酸の捕捉とを可能にする、方法。 - 前記微粒子が磁性微粒子である、請求項12に記載の方法。
- 前記生体試料がPCR増幅に適合するpHを有する、請求項12に記載の方法。
- 前記精製が前記増幅と同じバッファーを用いて行われる、請求項12に記載の方法。
- 前記溶解が、前記微粒子を含む前記生体試料をボルテックスすることを含む、前記生体試料を機械的に撹拌することによって行われる、請求項12に記載の方法。
- 前記生体試料中の前記1以上の細胞を溶解する工程が、前記生体試料を加熱することと、前記生体試料をボルテックスすることとを含む、請求項12に記載の方法。
- 捕捉された核酸を含む微粒子を分離及び洗浄することを更に含む、請求項12に記載の方法。
- 核酸がプラスミド、細菌DNA、及びヒトゲノムDNAからなる群から選択される、請求項12に記載の方法。
- 前記架橋が油水界面で開始し、経時的に前記微粒子のコアへと続く、請求項12に記載の方法。
- 油剤で前記微粒子を2回洗浄することと、
前記油剤中に再懸濁することと、
前記油剤に気流バブリングを通して乾燥させることと、
を更に含み、
前記微粒子を2回洗浄することによって前記油剤を除去する、請求項12に記載の方法。 - 磁性ナノ粒子を個々の微粒子内に包埋することを更に含む、請求項12に記載の方法。
- 前記磁性ナノ粒子が直径20nm〜40nmの鉄ナノ粒子である、請求項22に記載の方法。
- 生体試料から核酸を増幅する微小流体システムであって、
微粒子と合わせた生体試料であって、前記微粒子はキトサン微粒子であり、前記キトサン微粒子は、油中にキトサン小滴を作り、その後、前記小滴を前記微粒子へと架橋することによって製造される、生体試料と、
前記微粒子と合わされた前記生体試料を機械的に撹拌して前記生体試料中の細胞を溶解するように構成される、溶解ユニットであって、該細胞から放出された核酸が前記微粒子上に捕捉される、溶解ユニットと、
溶解の結果として前記生体試料中に放出された前記核酸を精製するように構成される、精製ユニットと、
前記精製された核酸を受け取って、前記捕捉された核酸に対して直接増幅を行うように構成される、増幅ユニットと、
を含み、
電荷切り替え可能なシェルの下の前記キトサン微粒子の内側が高pHにおいて正に帯電したままであり、前記キトサン微粒子は高pHにおいて、低pHにおけるのと同じように効率的に細胞の溶解と核酸の捕捉とを可能にする、微小流体システム。 - 前記微粒子が磁性微粒子である、請求項24に記載のシステム。
- 前記小滴の微粒子への架橋が経時的に微粒子のコアに入る、請求項24に記載のシステム。
- ナノ粒子が個々の微粒子内に包埋される、請求項24に記載のシステム。
- 前記ナノ粒子が直径20nm〜40nmの鉄ナノ粒子である、請求項27に記載のシステム。
- 前記核酸が前記微粒子の表面から増幅され、前記精製が、前記増幅と同じバッファーを用いて行われる、請求項24のシステム。
- 前記溶解ユニットが、前記微粒子を含む前記生体試料をボルテックスすることによって前記生体試料を機械的に撹拌するように構成される、請求項24に記載のシステム。
- 前記生体試料中での前記1以上の細胞の溶解が、そこに微粒子を有する前記生体試料をボルテックスする前に、前記生体試料を加熱することを含む、請求項24に記載のシステム。
- 前記精製ユニットが、捕捉された核酸を含む微粒子を分離及び洗浄するように構成される、請求項24に記載のシステム。
- 前記キトサン微粒子が細胞溶解及び同時のDNA捕捉を提供し、その後、PCR増幅反応の間、DNAテンプレートに対する固体支持体としてはたらく、請求項24に記載のシステム。
- 前記核酸がプラスミド、細菌DNA、及びヒトゲノムDNAからなる群から選択される、請求項24に記載のシステム。
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