JP6865584B2 - 化合物の共有結合性コンジュゲーションのためのｍＴＧ基質 - Google Patents

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Description

本発明は、グルタミンドナーとしてトランスグルタミナーゼと選択的かつ特異的に反応するペプチドに関するものである。
また、本発明は、第１分子に結合したこれらペプチドを含む、トランスグルタミナーゼの基質、及びその使用に関するものである。
発明の背景
タンパク質と、様々な機能性低分子（例えばフルオロフォア、リガンド）や高分子（例えばタンパク質、ポリマー、核酸）との間の共有結合形成は、バイオテクノロジーや生物医学応用において利用されるタンパク質コンジュゲートを創出するための重要な分子基礎を代表してきた。タンパク質と機能性分子とのそのような連結は、該タンパク質の生物学的機能に影響を及ぼしてはならない。
標的タンパク質の生物学的機能に対する機能性分子の連結の影響を最小限にするには、酵素経路が興味深い選択肢であるように思われる。
酵素の触媒特性を利用することは、ますます注目を浴び続けている研究分野である。トランスグルタミナーゼ（ＴＧアーゼ）は、タンパク質基質を高い位置選択性及び立体選択性で架橋させる能力のために、基礎研究と応用研究の両方から広い関心を常に惹きつけてきた。
ＴＧアーゼ（ＥＣ２．３．２．１３）は、翻訳後のタンパク質の架橋結合を、比較的プロテアーゼ抵抗性のイソペプチド結合の形成により触媒する、広く分布した酵素ファミリーである。この触媒作用の主要な工程は、ポリペプチド基質のグルタミン（Ｇｌｎ）残基のカルボキサミド基とＴＧアーゼの活性部位との相互作用により、Ｃｙｓ残基のレベルで反応性のチオアシル部分を生成すること、次いでアミノドナーとの反応により新たなイソペプチドアミド結合を生じることを包含する（ＦＯＬＫ ＪＥ、ＣＯＬＥ ＰＷ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９６５ Ｊｕｌ；２４０：２９５１−６０）。
ごく初期のＴＧアーゼの生物触媒としての使用は、食品業界においてであった（Ｚｈｕ，Ｙ．；Ｒｉｎｚｅｍａ，Ａ．；Ｔｒａｍｐｅｒ，Ｊ．、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９５、４４、２７７−２８２）。以来、新規のバイオテクノロジー応用により、ＴＧアーゼの使用は食品分野の外に広がっている。
Ｋａｍｉｙａらは、タンパク質の共有結合性標識におけるＴＧアーゼの潜在的な有用性について報告している（Ｎｅｗ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｐｅｐｔｉｄｅ ｔａｇ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｏｖａｌｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ「微生物トランスグルタミナーゼの新規蛍光基質、及びペプチドタグ指向性のタンパク質の共有結合性標識へのその応用」，Ｋａｍｉｙａ Ｎ．、Ａｂｅ Ｈ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０１１；７５１：８１−９４、及びＥｎｚｙｍａｔｉｃ ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ「多機能タンパク質の酵素的単一工程調製」、Ａｂｅ Ｈ．、Ｇｏｔｏ Ｍ．、Ｋａｍｉｙａ Ｎ．、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．（Ｃａｍｂ）２０１０ Ｏｃｔ １４；４６（３８）：７１６０−２）。
ＷＯ２０１３／０９２９８３には、ＴＧアーゼを用いて、免疫グロブリンを特に薬物で機能化する方法も開示されている。このアプローチは、部位特異的変異導入によって抗体重鎖内部にＱドナーを産生するための新たな部位を得るための方法を記載している。この経験法は、修飾用のグルタミン残基のＴＧアーゼによる選択を支配する規則が依然としてほとんど知られてないため、多数の突然変異体について試験することが必要である。その結果、この方法を用いてＱドナーをもつ新規抗体を開発することは時間がかかり、コスト効率が悪いものである。
さらにＷＯ２０１２／０５９８８２は、具体的な遺伝子操作されたポリペプチドコンジュゲート、及びトランスグルタミナーゼを用いてそのようなコンジュゲートを作製する方法を開示している。
タンパク質と機能性分子との共有結合のためにＴＧアーゼを使用することにおける１つの困難性は、取込み率が良好な一般的なリンカーとして使用できる機能的な第１基質を、前記第１基質の機能又は活性を改変することなく設計することである。
さらに、機能性分子が該タンパク質といったん連結したら、第１タンパク質と第２分子の両方がそれらの機能又は活性を保持しなければならない。
出願人は、産生されるか又は第１分子に結合すると、トランスグルタミナーゼの特に効率的で特異的な基質となるペプチドを見出した。
出願人が見出した第１分子に結合するペプチドを含む、トランスグルタミナーゼの基質は、この基質と第２分子との間に高率の共有結合を発揮する。
共有結合率は、多様な第１分子について、第２分子（例えば、免疫グロブリン、固体支持体に固定された分子）と効率的に連結することが困難であると知られている分子であっても、高いことが示されている。
第１分子と第２分子とを容易に連結する能力に加えて、そのようなペプチドのトランスグルタミネーションへの使用は、第１分子及び第２分子がともに元の機能特性を維持することを可能にする。
したがって、本発明は、トランスグルタミナーゼの基質に関するものであり、該基質は、３〜１５個のアミノ酸を有し、アミノ酸配列：Ｘ−４Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１ＱＸ＋１Ｘ＋２Ｘ＋３Ｘ＋４
［式中：
Ｘ−４は、非存在であるか又はいずれかのアミノ酸、好ましくは負電荷アミノ酸又は非極性アミノ酸であり；
Ｘ−３は、非存在であるか、又は芳香族アミノ酸、非極性疎水性アミノ酸、及び非極性アミノ酸から成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘ−２は、非存在であるか又はいずれかのアミノ酸、好ましくは負電荷アミノ酸又は非極性アミノ酸から成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘ−１は、極性中性アミノ酸、正電荷アミノ酸、非極性アミノ酸、及び非極性疎水性アミノ酸から成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｑは、グルタミンであり；
Ｘ＋１は、極性中性アミノ酸、正電荷アミノ酸、非極性疎水性アミノ酸、及び負電荷アミノ酸から成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘ＋２は、非存在であるか、又は極性中性アミノ酸、芳香族アミノ酸、非極性疎水性アミノ酸、及び正電荷アミノ酸から成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘ＋３は、非存在であるか又はいずれかのアミノ酸、好ましくは非極性アミノ酸であり；そして
Ｘ＋４は、非存在であるか又はいずれかのアミノ酸である］
を含むペプチドを含み、前記ペプチドは、第１分子に結合する。
特定の態様では、本発明による基質は、上記ペプチドを含むことができ、
（ｉ）Ｘ−１はセリンであり、Ｘ＋１は、ヒスチジン、チロシン、アラニン、又はグルタミン酸である；
（ｉｉ）Ｘ−１はアラニン又はバリンであり、Ｘ＋１は、リジン、アルギニン、又はアラニンであり、ここで、Ｘ−１がアラニンであるとき、Ｘ＋１はリジン又はアルギニンである；又は
（ｉｉｉ）Ｘ−１はイソロイシンであり、Ｘ＋１は、アルギニン、リジン、又はグルタミン酸である、
のいずれかである。
また、本発明は、少なくともアルキルアミン又はリジンを含む第２分子に共有結合した、本発明のトランスグルタミナーゼの基質を含む、コンジュゲートした化合物に関する。
また、本発明は、ヒト又は動物の身体の治療方法に使用するための、第１分子が抗体で第２分子が薬物である、本発明のコンジュゲートした化合物に関する。
また、本発明は、本発明のトランスグルタミナーゼの基質を、少なくともアルキルアミン又はリジン残基を含む第２分子に共有結合させるための方法に関するものであり、該方法は、トランスグルタミナーゼの基質をトランスグルタミナーゼの存在下で第２分子と反応させる工程を含む。
また、本発明は、３〜１５個のアミノ酸を有し、アミノ酸配列：Ｘ−４Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１ＱＸ＋１Ｘ＋２Ｘ＋３Ｘ＋４
［式中：
Ｘ−４は、非存在であるか又はいずれかのアミノ酸、好ましくは負電荷アミノ酸又は非極性アミノ酸であり；
Ｘ−３は、非存在であるか、又は芳香族アミノ酸、非極性疎水性アミノ酸、及び非極性アミノ酸から成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘ−２は、非存在であるか又はいずれかのアミノ酸、好ましくは負電荷アミノ酸又は非極性アミノ酸から成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘ−１は、極性中性アミノ酸、正電荷アミノ酸、非極性アミノ酸、及び非極性疎水性アミノ酸から成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｑは、グルタミンであり；
Ｘ＋１は、極性中性アミノ酸、正電荷アミノ酸、非極性疎水性アミノ酸、及び負電荷アミノ酸から成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘ＋２は、非存在であるか又はいずれかのアミノ酸、好ましくは極性中性アミノ酸、芳香族アミノ酸、非極性疎水性アミノ酸、及び正電荷アミノ酸から成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘ＋３は、非存在であるか又はいずれかのアミノ酸、好ましくは非極性アミノ酸であり；そして
Ｘ＋４は、非存在であるか又はいずれかのアミノ酸である］
を含むペプチドに関するものである。
また、本発明は、分子の共有結合性カップリングのためのリンカーとしての、本発明のペプチドの使用に関する。
また、本発明は、第１分子を、少なくともアルキルアミン又はリジンを含む第２分子に共有結合させるための方法に関するものであり、該方法は：
第１分子を本発明のペプチドに結合させて、トランスグルタミナーゼの基質を得て；
トランスグルタミナーゼの基質を第２分子と、トランスグルタミナーゼ、好ましくは細菌トランスグルタミナーゼ、例えば、ストレプトベルチシリウム・モバラエンス（Streptoverticillium mobaraense）トランスグルタミナーゼ（ｍＴＧ）の存在下で反応させる、
工程を含む。
また、本発明は、ポリペプチドに融合した本発明のペプチドを含む、融合タンパク質に関する。
また、本発明は、少なくともリジン又はアルキルアミンを含む分子を標識するためのキットに関するものであり、該キットは、第１分子がレポーター基である本発明の基質を含む。
また、本発明は、少なくともアルキルアミン又はリジンを含む分子を標識するための方法に関するものであり、該方法は、第１分子がレポーター基である本発明の基質を、該分子と反応させて、トランスグルタミナーゼの存在下で標識する工程を含む。
発明の詳細な説明
定義
本発明によれば、「抗体」又は「免疫グロブリン」は、同じ意味を有しており、本発明において同等に使用される。本明細書に使用される「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子、及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、即ち、抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部分を含有する分子を表す。このように、抗体という用語は、抗体分子全体だけでなく、抗原結合性の断片又は部分を含めた抗体断片、並びに抗体及び抗体断片の変異体（誘導体を含む）も包含する。慣用の抗体では、２本の重鎖がジスルフィド結合によって互いに連結しており、各重鎖はジスルフィド結合によって軽鎖に連結している。２種類の軽鎖、λ鎖及びκ鎖がある。抗体分子の機能活性を決定する５種の主要な重鎖クラス（又はアイソタイプ）：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥがある。各鎖は、別個の配列ドメインを含有する。軽鎖には２つのドメイン、可変ドメイン（ＶＬ）及び定常ドメイン（ＣＬ）が含まれる。重鎖には４つのドメイン、１つの可変ドメイン（ＶＨ）及び３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３、まとめてＣＨと称する）が含まれる。軽鎖の可変領域（ＶＬ）及び重鎖の可変領域（ＶＨ）は、抗原への結合認識と特異性を決定する。軽鎖の定常領域ドメイン（ＣＬ）及び重鎖の定常領域ドメイン（ＣＨ）は、抗体鎖の会合、分泌、経胎盤移行、補体結合、及びＦｃ受容体（ＦｃＲ）への結合といった重要な生物学的特性を付与する。Ｆｖ断片は、免疫グロブリンのＦａｂ断片のＮ末端部分であって、１本の軽鎖の可変部分と１本の重鎖の可変部分から成る。抗体の特異性は、抗体結合部位と抗原決定基との構造的相補性にある。抗体結合部位は、主に、超可変領域又は相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基で構成される。時には、非超可変領域又はフレームワーク領域（ＦＲ）由来の残基がドメイン構造全体、ひいては結合部位に影響を及ぼすことがある。相補性決定領域すなわちＣＤＲは、自然な免疫グロブリン結合部位の天然のＦｖ領域の結合親和性及び特異性を規定するアミノ酸配列を表す。免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖は、それぞれ３つのＣＤＲを有し、それぞれＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、Ｌ−ＣＤＲ３、及びＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３と称される。したがって、抗原結合部分には、重鎖及び軽鎖のＶ領域のそれぞれに由来するＣＤＲセット構成する、６つのＣＤＲが含まれる。フレームワーク領域（ＦＲ）は、ＣＤＲ間に介入されたアミノ酸配列を表す。
抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例としては、ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン、及びＣＨ１ドメインから成る１価の断片であるＦａｂ断片；ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結した２つのＦａｂ断片を含む２価の断片であるＦ（ａｂ）２断片；ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインから成るＦｄ断片；抗体の単一アームのＶＬドメイン及びＶＨドメインから成るＦｖ断片；ＶＨドメインから成るｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６）；並びに単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、又はそのような抗原結合部分を含む融合タンパク質が挙げられる。
本明細書において、抗体の残基は、カバット・スキームに従って番号付けされている。
「ヒト化抗体」という用語は、抗体分子の実質的な部分が、アミノ酸配列又は構造において、ヒト起源に由来する抗体のそれに類似する抗体を表す。
「ヒト化抗体」は、治療目的でヒトに投与される抗体の免疫原性を低減させることが望ましい事例において、より好適であると考えられる。
「Ｆａｂ」という用語は、プロテアーゼのパパインでＩｇＧを処理することによって得られる断片の中で、Ｈ鎖のＮ末端側の約半分とＬ鎖全体とがジスルフィド結合によって一緒に結合している、分子量が約５０，０００で抗原結合活性を有する抗体断片を意味する。
「Ｆ（ａｂ’）２」という用語は、プロテアーゼのペプシンでＩｇＧを処理することによって得られる断片の中で、ヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合した、Ｆａｂよりやや大きい、分子量が約１００，０００で抗原結合活性を有する抗体断片を表す。
「Ｆａｂ’」という用語は、Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することによって得られる、分子量が約５０，０００で抗原結合活性を有する抗体断片を表す。
単鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）ポリペプチドは、ペプチドをコードするリンカーによって連結されたＶＨコード遺伝子及びＶＬコード遺伝子を含む融合遺伝子から通常発現される、共有結合的に連結されたＶＨ：：ＶＬヘテロ２量体である。「ｄｓＦｖ」は、ジスルフィド結合によって安定化したＶＨ：：ＶＬヘテロ２量体である。２価及び多価の抗体断片は、１価のｓｃＦｖの会合によって自然発生的に形成されるか、又は２価のｓｃ（Ｆｖ）２のように、１価のｓｃＦｖをペプチドリンカーによってカップリングすることによって産生することができる。
「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を表し、該断片は、同一ポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）内に軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同一鎖の２つのドメイン間で対合させるには短すぎるリンカーを用いることによって、これらのドメインは、別の鎖の相補的なドメインと対合して２つの抗原結合部位を創出することを強いられる。
「精製された」及び「単離された」は、ポリペプチド（即ち、本発明による抗体）配列又はヌクレオチド配列に言及する場合、指定の分子が、同種の他の生体高分子が実質的に非存在下で存在していることを意味する。本明細書に使用される「精製された」という用語は、好ましくは、少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、さらにより好ましくは少なくとも９５重量％、そして最も好ましくは少なくとも９８重量％の同種の生体高分子が存在することを意味する。特定のポリペプチドをコードする「単離された」核酸分子は、該ポリペプチドをコードしない他の核酸分子が実質的に存在しない核酸分子を表す；しかしながら、該分子には、組成物の基本的特徴に悪影響を及ぼさない追加の塩基又は部分がいくらか含まれてもよい。
「治療有効量」は、被験者に治療上の利益を付与するのに必要な活性薬剤の最少量を意図する。例えば、哺乳動物への「治療有効量」は、病的症状、疾患の進行、又は障害に屈することに関連するか若しくはそれに抵抗性の生理的状態の改善を誘発、向上、又は他のやり方で引き起こすような量である。
本明細書に使用される「被験者」という用語は、齧歯動物、ネコ、イヌ、及び霊長動物のような哺乳動物を意味する。好ましくは、本発明による被験者はヒトである。
「治療又は治療すること」は、治療的処置及び予防的又は防止的手段を表し、その目的は、標的とする病的状態又は障害を予防するか又は遅らせる（少なくする）ことである。治療を必要とする者には、すでに障害のある者だけでなく、障害を有する傾向がある者、又は障害を予防すべき者が含まれる。従って、本発明において治療すべき被験者は、障害を有すると診断されていても、障害への素因又は感受性があってもよい。
本明細書に使用される「アルキルアミン」という用語は、式−ＮＨＲ”（モノアルキルアミン）［式中、Ｒ”はアルキルである］の基、又は式−ＮＲ”Ｒ”（ジアルキルアミン）［式中、それぞれのＲ”は独立してアルキルである］の基を表す。
本明細書に使用される「アプタマー」という用語は、タンパク質又はペプチド、より典型的にはペプチドのような標的分子に特異的に結合することができる、１本鎖又は２本鎖のオリゴＤＮＡ、オリゴＲＮＡ、又はオリゴ−ＤＮＡ／ＲＮＡ、あるいはそれらの類似体を表す。有利にも、アプタマーは、その標的に対してかなり高い特異性及び親和性（例えば１×１０９Ｍ−１のオーダーのＫ［Ａ］）を示すことができる。アプタマー産生については、とりわけ、本明細書に具体的に援用される、米国特許第５，２７０，１６３号；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ＆Ｓｚｏｓｔａｋ １９９０（Ｎａｔｕｒｅ ３４６：８１８−８２２）；Ｔｕｅｒｋ＆Ｇｏｌｄ １９９０（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：５０５−５１０）；又は「Ｔｈｅ Ａｐｔａｍｅｒ Ｈａｎｄｂｏｏｋ：Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（アプタマー便覧：機能性オリゴヌクレオチドとその応用）」Ｋｌｕｓｓｍａｎｎ編、Ｗｉｌｅｙ ＶＣＨ（２００６）、ＩＳＢＮ ３５２７３１０５９２に記載されている。
本発明のペプチド
本発明は、３〜１５個のアミノ酸を有し、アミノ酸配列：Ｘ−４Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１ＱＸ＋１Ｘ＋２Ｘ＋３Ｘ＋４
［式中：
Ｘ−４は、非存在であるか又はいずれかのアミノ酸、好ましくは負電荷アミノ酸又は非極性アミノ酸であり；
Ｘ−３は、非存在であるか、又は芳香族アミノ酸、非極性疎水性アミノ酸、及び非極性アミノ酸から成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘ−２は、非存在であるか又はいずれかのアミノ酸、好ましくは負電荷アミノ酸又は非極性アミノ酸から成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘ−１は、極性中性アミノ酸、正電荷アミノ酸、非極性アミノ酸、及び非極性疎水性アミノ酸から成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｑは、グルタミンであり；
Ｘ＋１は、極性中性アミノ酸、正電荷アミノ酸、非極性疎水性アミノ酸、及び負電荷アミノ酸から成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘ＋２は、非存在であるか又はいずれかのアミノ酸、好ましくは極性中性アミノ酸、芳香族アミノ酸、非極性疎水性アミノ酸、及び正電荷アミノ酸から成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘ＋３は、非存在であるか又はいずれかのアミノ酸、好ましくは非極性アミノ酸であり；そして
Ｘ＋４は、非存在であるか又はいずれかのアミノ酸である］
を含むペプチドに関する。
典型的には、本発明のペプチドは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のアミノ酸を有する。
好ましくは、該ペプチドは、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２個のアミノ酸を有する。
本明細書に使用される「負電荷アミノ酸」という用語は、好ましくは、以下のアミノ酸：グルタミン酸（Ｅ）及びアスパラギン酸（Ｄ）を表す。
本明細書に使用される「芳香族アミノ酸」という用語は、好ましくは、以下のアミノ酸：チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、及びフェニルアラニン（Ｆ）を表す。
本明細書に使用される「非極性アミノ酸」という用語は、好ましくは、以下のアミノ酸：イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、及びシステイン（Ｃ）を表す。
本明細書に使用される「正電荷アミノ酸」という用語は、好ましくは、以下のアミノ酸：ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）を表す。
本明細書に使用される「非極性疎水性アミノ酸」という用語は、好ましくは、以下のアミノ酸：ロイシン（Ｌ）、アラニン（Ａ）、及びバリン（Ｖ）を表す。
本明細書に使用される「極性中性アミノ酸」という用語は、好ましくは、以下のアミノ酸：セリン（Ｓ）及びグルタミン（Ｑ）を表す。
具体的な態様では、該ペプチドは、アミノ酸配列：Ｘ−４Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１ＱＸ＋１Ｘ＋２Ｘ＋３Ｘ＋４
［式中：
Ｘ−４は、非存在であるか又はいずれかのアミノ酸、好ましくはアスパラギン酸又はプロリンであり；
Ｘ−３は、非存在であるか、又はチロシン、トリプトファン、フェニルアラニン、プロリン、バリン、及びロイシンから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘ−２は、非存在であるか、又はグルタミン酸、プロリン、チロシン、トリプトファン、リジン、システイン、ロイシン、ヒスチジン、及びセリンから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘ−１は、セリン、ヒスチジン、イソロイシン、バリン、及びアラニンから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｑは、グルタミンであり；
Ｘ＋１は、アルギニン、リジン、ヒスチジン、グルタミン酸、セリン、及びアラニンから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘ＋２は、非存在であるか又はいずれかのアミノ酸、好ましくはヒスチジン、チロシン、リジン、グルタミン、ロイシン、及びセリンから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘ＋３は、非存在であるか又はいずれかのアミノ酸、好ましくはプロリンであり；そして
Ｘ＋４は、非存在であるか又はいずれかのアミノ酸である］
を含む。
具体的な態様では、Ｘ−３はチロシン又はトリプトファンである。
別の具体的な態様では、Ｘ−２はグルタミン酸又はプロリンである。
好ましい態様では、Ｘ−１は、セリン、アラニン、バリン、ヒスチジン、又はイソロイシンである。別の具体的な態様では、Ｘ−１は、セリン、アラニン、又はイソロイシンである。別の具体的な態様では、Ｘ−１は、イソロイシン、アラニン、又はバリンである。
好ましい態様では、Ｘ＋１は、ヒスチジン、グルタミン酸、又はセリンである。より好ましくは、Ｘ＋１はセリンである。別の好ましい態様では、Ｘ＋１はリジン又はアルギニンである。
関連する好ましい態様では、Ｘ＋１はリジン又はアルギニンであり、Ｘ−１はアラニン又はイソロイシンである。
好ましい態様では、Ｘ−３はチロシン又はトリプトファンであり、Ｘ−２はグルタミン酸又はプロリンであり、Ｘ−１は、イソロイシン、アラニン、又はバリンであり、Ｘ＋１はリジン又はアルギニンである。
他の好ましい態様では、
（ｉ）Ｘ−１はセリンであり、Ｘ＋１は、ヒスチジン、チロシン、アラニン、又はグルタミン酸である；
（ｉｉ）Ｘ−１はアラニン又はバリンであり、Ｘ＋１は、リジン、アルギニン、又はアラニンであり、ここで、Ｘ−１がアラニンであるとき、Ｘ＋１はリジン又はアルギニンである；又は
（ｉｉｉ）Ｘ−１はイソロイシンであり、Ｘ＋１は、アルギニン、リジン、又はグルタミン酸である。
好ましい態様では、該ペプチドは、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、及び配列番号３３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む。
アミノ酸配列を以下の表１に示す。
Figure 0006865584
好ましい態様では、該ペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号２０、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、及び配列番号３３から成る群より選択されるアミノ酸配列を有する。
また、本発明は、分子を共有結合的にカップリングするためのリンカーとしての本発明のペプチドの使用に関する。
また、本発明は、タンパク質又は抗体を第２分子に共有結合的にカップリングするためのリンカーとしての本発明のペプチドの使用に関するものであり、第２分子は、タンパク質、抗体、薬物、核酸、放射性元素、レポーター基、安定化分子、及び固体支持体に固定された分子から成る群より選択される。
また、本発明は、第１分子を、少なくともアルキルアミン残基又はリジンを含む第２分子に共有結合させるための方法に関するものであり、該方法は：
第１分子を本発明のペプチドに結合させて、トランスグルタミナーゼの基質を得、
トランスグルタミナーゼの基質を、トランスグルタミナーゼの存在下で第２分子と反応させる、
工程を含む。
本発明のトランスグルタミナーゼのグルタミンドナー基質
本発明は、トランスグルタミナーゼの基質、より具体的には、Ｑドナー基質に関するものであり、該基質は、３〜１５個のアミノ酸を有し、アミノ酸配列：Ｘ−４Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１ＱＸ＋１Ｘ＋２Ｘ＋３Ｘ＋４
［式中：
Ｘ−４は、非存在であるか又はいずれかのアミノ酸、好ましくは負電荷アミノ酸又は非極性アミノ酸であり；
Ｘ−３は、非存在であるか、又は芳香族アミノ酸、非極性疎水性アミノ酸、及び非極性アミノ酸から成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘ−２は、非存在であるか又はいずれかのアミノ酸、好ましくは負電荷アミノ酸又は非極性アミノ酸から成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘ−１は、極性中性アミノ酸、正電荷アミノ酸、非極性アミノ酸、及び非極性疎水性アミノ酸から成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｑは、グルタミンであり；
Ｘ＋１は、極性中性アミノ酸、正電荷アミノ酸、非極性疎水性アミノ酸、及び負電荷アミノ酸から成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘ＋２は、非存在であるか又はいずれかのアミノ酸、好ましくは、極性中性アミノ酸、芳香族アミノ酸、非極性疎水性アミノ酸、及び正電荷アミノ酸から成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘ＋３は、非存在であるか又はいずれかのアミノ酸、好ましくは非極性アミノ酸であり；そして
Ｘ＋４は、非存在であるか又はいずれかのアミノ酸である］
を含み、第１分子へ結合するペプチド、を含む。
トランスグルタミナーゼ（ＴＧアーゼ）は、例えば、組織トランスグルタミナーゼ（ＴＧ２）（Ｇｅｎｔｉｌｅ Ｖ．、Ｓａｙｄａｋ Ｍ．、Ｃｈｉｏｃｃａ Ｅ．Ａ．、Ａｋａｎｄｅ Ｏ．、Ｂｉｒｃｋｂｉｃｈｌｅｒ Ｐ．Ｊ．、Ｌｅｅ Ｋ．Ｎ．、Ｓｔｅｉｎ Ｊ．Ｐ．、Ｄａｖｉｅｓ Ｐ．Ｊ．Ａ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：４７８−４８３（１９９１））でも、微生物トランスグルタミナーゼ（ｍＴＧ）（Ａｎｄｏ Ｈ、Ａｄａｃｈｉ Ｍ、Ｕｍｅｄａ Ｋ、Ｍａｔｓｕｕｒａ Ａ、Ｎｏｎａｋａ Ｍ、Ｕｃｈｉｏ Ｒ、Ｔａｎａｋａ Ｈ、Ｍｏｔｏｋｉ Ｍ：Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８９；５３：２６１３−２６１７）でもよい。
好ましくは、トランスグルタミナーゼは、微生物トランスグルタミナーゼ、例えばストレプトベルチシリウム・モバラエンス由来のトランスグルタミナーゼである。
典型的には、Ｑドナー基質に使用するための本発明のペプチドは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のアミノ酸を有する。
好ましくは、Ｑドナー基質に使用するためのペプチドは、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸を有する。
好ましい態様では、Ｑドナー基質に使用するためのペプチドは、アミノ酸配列：Ｘ−４Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１ＱＸ＋１Ｘ＋２Ｘ＋３Ｘ＋４
［式中：
Ｘ−４は、非存在であるか又はいずれかのアミノ酸、好ましくはアスパラギン酸又はプロリンであり；
Ｘ−３は、非存在であるか、又はフェニルアラニン、プロリン、バリン、チロシン、トリプトファン、及びロイシンから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘ−２は、非存在であるか、又はグルタミン酸、プロリン、チロシン、トリプトファン、リジン、システイン、ロイシン、ヒスチジン、及びセリンから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘ−１は、セリン、ヒスチジン、イソロイシン、バリン、及びアラニンから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｑは、グルタミンであり；
Ｘ＋１は、リジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン酸、セリン、及びアラニンから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘ＋２は、非存在であるか又はいずれかのアミノ酸、好ましくはヒスチジン、チロシン、リジン、グルタミン、ロイシン、及びセリンから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘ＋３は、非存在であるか又はいずれかのアミノ酸、好ましくはプロリンであり；そして
Ｘ＋４は、非存在であるか又はいずれかのアミノ酸である］
を含む。
具体的な態様では、Ｘ−３はチロシン又はトリプトファンである。
別の具体的な態様では、Ｘ−２はグルタミン酸又はプロリンである。
好ましい態様では、Ｘ−１は、セリン、アラニン、バリン、ヒスチジン、又はイソロイシンである。別の具体的な態様では、Ｘ−１は、セリン、アラニン、又はイソロイシンである。別の具体的な態様では、Ｘ−１は、イソロイシン、アラニン、又はバリンである。
好ましい態様では、Ｘ＋１は、ヒスチジン、グルタミン酸、又はセリンである。より好ましくは、Ｘ＋１はセリンである。別の好ましい態様では、Ｘ＋１はリジン又はアルギニンである。
関連する好ましい態様では、Ｘ＋１はリジン又はアルギニンであり、Ｘ−１はアラニン又はイソロイシンである。
好ましい態様では、Ｘ−３はチロシン又はトリプトファンであり、Ｘ−２はグルタミン酸又はプロリンであり、Ｘ−１は、イソロイシン、アラニン、又はバリンであり、Ｘ＋１はリジン又はアルギニンである。
好ましい態様では、
（ｉ）Ｘ−１はセリンであり、Ｘ＋１は、ヒスチジン、チロシン、アラニン、又はグルタミン酸である；
（ｉｉ）Ｘ−１はアラニン又はバリンであり、Ｘ＋１は、リジン、アルギニン、又はアラニンであり、ここで、Ｘ−１がアラニンであるとき、Ｘ＋１はリジン又はアルギニンである；又は
（ｉｉｉ）Ｘ−１はイソロイシンであり、Ｘ＋１は、アルギニン、リジン、又はグルタミン酸である、
のいずれかである。
好ましい態様では、Ｑドナー基質に使用するためのペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号２０、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、及び配列番号３３から成る群より選択されるアミノ酸配列を有する。
好ましい態様では、Ｑドナー基質に使用するためのペプチドは、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、及び配列番号３３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む。
好ましい態様では、第１分子は、タンパク質、抗体、薬物、核酸、放射性元素、レポーター基、安定化分子、アプタマー、リボザイム、ドメイン抗体、ナノボディ、非免疫グロブリン骨格、ベクター粒子、及び固体支持体に固定された分子から成る群より選択される。
核酸は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＳｉＲＮＡであり得る。
ベクター粒子は、例えば、ナノ粒子、小胞、ウイルスベクター粒子、又はウイルス様粒子であり得る。
放射性元素は、例えば、放射性ヨウ化物又は放射性同位体であり得る。
レポーター基は、例えば、放射性標識化合物、イソチオシアネートのような蛍光化合物（例えばＦＩＴＣ又はＴＲＩＴＣ）、スクシンイミジルエステル（例えばＮＨＳ−フルオレセイン）、マレイミド活性化フルオロフォア（例えばフルオレセイン−５−マレイミド）、ペルオキシダーゼのような酵素、親和性ペプチドタグ、又はＮＭＲ若しくはＥＳＲ分光法によって検出され得る化合物であり得る。
安定化分子は、例えばＰＥＧのようなポリマーであり得る。
非免疫グロブリン骨格は、例えば、アドネクチン、アンキリン、リポカリン、アフィリン、タンパク質エピトープ模倣体などであり得る。
薬物は、ペプチド及びポリペプチド、比較的大きい化学成分、負電荷化学成分、及び／又は疎水性化学成分であり得る。
薬物は、好ましくは細胞傷害薬である。細胞傷害薬は、例えば、デュオカルマイシン、メイタンシノイド、アルキル化剤、タキサン、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦであり得る。
より好ましい態様では、第１分子は抗体である。
Ｑドナー基質に使用するためのペプチドは、第１分子に結合している。
本明細書に使用される「結合している（bound）」という用語は、例えば化学的カップリングによる共有結合性でも、又は例えばイオン性相互作用、疎水性相互作用、水素結合などの非共有結合性でもよい結合を表す。
共有結合は、例えば、エステル、エーテル、ホスホエステル、アミド、ペプチド、イミド、炭素−イオウ結合、炭素−リン結合などであり得る。この用語には、物質の封入又は部分的封入も含まれる。「結合している」という用語は、「カップリングしている」、「融合している」、「封入されている」、「パッケージされている」、「偽型化されている」、「脂質２重層で発現されている」、及び「付着している」のような用語より広義であって、これらの用語を包含する。
好ましい態様では、ペプチドは第１分子に共有結合している。
好ましい態様では、第１分子はポリペプチドであり、ペプチドは第１分子に融合している。
本明細書に使用される「融合」又は「融合している」という用語は、１つのポリペプチド鎖における起源の異なるアミノ酸配列の、それらをコードするヌクレオチド配列をインフレームで組み合わせることによる、組み合わせを表す。１つの所与のアミノ酸配列は、遺伝子コードの縮重性により１以上のヌクレオチド配列によってコードされ得ることに留意しなければならない。「融合」という用語は、明示的に内部融合（即ち、ポリペプチド鎖の一方の末端への融合に加えて、その内部への起源の異なる配列の挿入）を包含する。
したがって、１つの態様では、本発明は、ポリペプチドに融合した本発明のペプチドを含む融合タンパク質にも関するものである。
融合タンパク質の１つの態様では、ポリペプチドは、抗体の重鎖若しくは軽鎖ポリペプチド、又はそれらの抗原結合部分であって、例えばＶＨドメイン又はＶＬドメインを含むポリペプチドが含まれる。
融合タンパク質の好ましい態様では、抗体の重鎖及び／又は軽鎖は、本発明のペプチドにＣ末端又はＮ末端で融合している。関連する融合タンパク質の具体的な態様では、重鎖及び／又は軽鎖は、配列番号７、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、及び配列番号３３から成る群より選択されるペプチドにＣ末端で融合している。
１つの態様では、融合タンパク質は、少なくともアルキルアミン残基又はリジンを含む第２分子にさらにコンジュゲートしている。
また、本発明は、本発明のトランスグルタミナーゼの基質を、少なくともアルキルアミン残基又はリジンを含む第２分子に共有結合させるための方法に関するものであり、該方法は、トランスグルタミナーゼの基質をトランスグルタミナーゼの存在下で第２分子と反応させる工程を含む。
また、本発明は、少なくともリジン又はアルキルアミン残基を含む分子を標識するためのキットに関するものであり、該キットは、第１分子がレポーター基である本発明のトランスグルタミナーゼの基質を含む。
また、本発明は、少なくともリジン又はアルキルアミン残基を含む分子を標識するための方法に関するものであり、該方法は、第１分子がレポーター基である本発明のトランスグルタミナーゼの基質を、トランスグルタミナーゼの存在下で該分子と反応させて標識する工程を含む。
本発明のコンジュゲートした化合物
また、本発明は、少なくともリジン又はアルキルアミン残基を含む第２分子に共有結合した、本発明のトランスグルタミナーゼの基質を含む、コンジュゲートした化合物に関するものである。
そのようなコンジュゲートした化合物は、ＴＧ介在反応によって容易に産生される。さらに、第１分子及び第２分子は、その特異的な機能特性をともに維持する。例えば、そのＦｃ断片に融合したペプチドを含む抗体の場合、コンジュゲートした抗体は、抗原結合特性を維持する。
好ましい態様では、第２分子は、タンパク質、抗体、薬物、核酸、放射性元素、レポーター基、安定化分子、アプタマー、リボザイム、ドメイン抗体、ナノボディ、非免疫グロブリン骨格、ベクター粒子、及び固体支持体に固定された分子から成る群より選択される。
ベクター粒子は、例えば、ナノ粒子、小胞、又はウイルスベクター粒子、ウイルス様粒子であり得る。
核酸は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＳｉＲＮＡであり得る。放射性元素は、例えば、放射性ヨウ化物又は放射性同位体であり得る。レポーター基は、例えば、放射性標識化合物、イソチオシアネートのような蛍光化合物（例えばＦＩＴＣ又はＴＲＩＴＣ）、スクシンイミジルエステル（例えばＮＨＳ−フルオレセイン）、マレイミド活性化フルオロフォア（例えばフルオレセイン−５−マレイミド）、ペルオキシダーゼのような酵素、親和性ペプチドタグ、又はＮＭＲ若しくはＥＳＲ分光法によって検出され得る化合物であり得る。
安定化分子は、例えばＰＥＧのようなポリマーであり得る。
非免疫グロブリン骨格は、例えば、アドネクチン、アンキリン、リポカリン、アフィリン、タンパク質エピトープ模倣体などであり得る。
薬物は、ペプチド及びポリペプチド、比較的大きい化学成分、負電荷化学成分、及び／又は疎水性化学成分であり得る。
薬物は、好ましくは細胞傷害薬である。
細胞傷害薬は、例えば、デュオカルマイシン、メイタンシノイド、アルキル化剤、タキサン、モノメチルオーリスタチン−Ｅ（ＭＭＡＥ）、モノメチルオーリスタチン−Ｆ（ＭＭＡＦ）であり得る。
好ましい態様では、第２分子は薬物、好ましくは細胞傷害薬である。
より好ましい態様では、第１分子は抗体であり、第２分子は薬物、好ましくは細胞傷害薬である。
細胞傷害薬にコンジュゲートした抗体は、有望な治療用化合物である。しかしながら、それらを生成することは特に困難である。本発明の方法は、それらを容易に生成することを可能にする。
本発明は、本発明のコンジュゲートした化合物及び医薬的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。
また、本発明は、ヒト又は動物の身体の治療方法に使用するための、本発明のコンジュゲートした化合物に関する。
また、本発明は、それを必要とする被験者における病的状態又は障害の治療方法に関するものであり、該方法は、本発明のコンジュゲートした化合物の有効量を被験者に投与することを含む。
また、本発明は、医薬を調製するための、本発明のコンジュゲートした化合物の使用に関する。
本発明について、以下の図面及び実施例によってさらに例解する。しかしながら、これらの実施例及び図面は、決して本発明の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。
図面
図１は、ｃｏｖａｂｔｅｓｔプレートにカップリングしたペプチドへの、ｍＴＧ介在性のビオチン−Ｘ−カダベリンの取込みを示す。 図２は、ｃｏｖａｂｔｅｓｔプレートにカップリングしたペプチドへの、ＴＧ２介在性のビオチン−Ｘ−カダベリンの取込みを示す。 図３は、好ましい基質、及びＱ残基をＮに置換した対応する変異類似体を用いた、ｍＴＧ反応の測定を示す。 図４は、ＢＳＡ−ＨＨ１２Ｑ１１コンジュゲートに対するビオチン−カダベリンのｍＴＧ介在性架橋結合の特異性の確認を示す（Ａ：ＢＳＡ（対照ウェル）；Ｂ、Ｃ：ＢＳＡ−ＨＨ１２Ｑ１１）。ペプチド阻害剤をＣ：ＨＨ１２Ｑ１１に加えた。 図５は、吸着したＩｇＧ−ＨＨ１２Ｑ１１コンジュゲート及び遊離ＩｇＧ対照へのビオチン−カダベリンの取込みの測定を示す。実験条件は、Ｂ−Ｉ−３、Ｂ−Ｉ−４、及びＢ−ＩＩ−２に記載されている。 図６は、遊離ＩｇＧ及びペプチドがコンジュゲートしたＩｇＧへのｍＴＧによるビオチン−カダベリンの取込みのウエスタンブロットによる分析を示す。アミン基質の酵素的取込みは、Ｂ−ＩＩ−５に記載のように、トリス緩衝液（ｐＨ８）中で室温にて２時間インキュベートした。ＩｇＧの重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）の位置を示す。 図７は、ペプチドがコンジュゲートしたＩｇＧ及び遊離ＩｇＧへのビオチン−カダベリンの取込みの反応速度試験のウエスタンブロット分析を示す。触媒反応のために、ｍＴＧをトリス緩衝液（ｐＨ８）中で室温にて指定の反応時間インキュベートした。ＩｇＧの重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）の位置を示す。 図７は、ペプチドがコンジュゲートしたＩｇＧ及び遊離ＩｇＧへのビオチン−カダベリンの取込みの反応速度試験のウエスタンブロット分析を示す。触媒反応のために、ｍＴＧをトリス緩衝液（ｐＨ８）中で室温にて指定の反応時間インキュベートした。ＩｇＧの重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）の位置を示す。 図８は、トランスグルタミナーゼによって触媒される反応のスキームである。 図９は、トランスグルタミナーゼの基質と第２分子との共有結合形成のスキームである。 図１０は、ｍＴＧによる、（Ａ）ＲｅｃＡｂ、（Ｂ）Ｄ１−３、及び（Ｃ）Ｈｅｒ２Ａｂへのビオチン−Ｘ−カダベリンの取込みである。ｍＴＧ架橋結合の特異性の確認のために、タグなしの対応抗体を使用した。 図１１は、ｍＴＧによる、Ｄ１−３−タグ抗体へのビオチン−Ｘ−カダベリンの取込みの動態である。 図１２は、タグなし対応抗体と比較した、組換えタグ付き抗体の免疫反応性のＥＬＩＳＡによる確認である。（Ａ）抗リゾチーム抗体、（Ｂ）抗Ｈｅｒ２抗体。Ａ及びＢでは、抗ヒトＩｇＧＡＭ−ＨＲＰ抗体を用いた。 図１２は、タグなし対応抗体と比較した、組換えタグ付き抗体の免疫反応性のＥＬＩＳＡによる確認である。（Ｃ）抗Ｈｅｒ２抗体。Ｃでは、ストレプトアビジン−ＨＲＰを用いた。
材料及び方法
Ａ）材料及び試薬
ウシ血清アルブミン（照会番号：Ａ７９０６）、ヒトＩｇＧ（照会番号：Ｉ４５０６）、グルタルアルデヒド（照会番号：Ｇ６２５７）、スペルミン（ｓｐｍ）（照会番号：Ｓ２８７６）、ホウ水素化ナトリウム（照会番号：２１，３４６−２）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＡＣ）（照会番号：Ｅ７７５０）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（照会番号：１３，０６７２）、透析チューブセルロース膜、平面幅１０ｍｍ（照会番号：Ｄ９２７７）、及びアクリルアミド／ビス−アクリルアミド、３０％溶液（照会番号：Ａ３５７４）は、シグマ・アルドリッチ（フランス）より購入した。ニトロセルロース膜アマシャムＨｙｂｏｎｄＴＭ−Ｃ Ｅｘｔｒａ（照会番号：ＲＰＮ２０３Ｅ）は、Ｄｕｔｃｈｅｒ（フランス）より提供された。高結合マイクロタイタープレート（コースター照会番号：３５９０）は、コーニング社（フランス）からのものである。組換え微生物トランスグルタミナーゼ（ｍＴＧ）（照会番号：ｏｐｒ ００５４）、組換えヒトトランスグルタミナーゼ２（ｈＴＧ２）（照会番号：ｏｐｒ ００２７）、ビオチン−Ｘ−カダベリン（照会番号：ｏｐｒ ０００７）、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ｏｐｒ ００１１）、Ｃｏｖａｂｔｅｓｔ アミンプレート（照会番号：ｏｐｒ ０００４）、ＴＭＢ−ＲＴＵ（照会番号：ｏｐｒ ００５２）は、Ｃｏｖａｌａｂ（フランス）より提供された。使用したすべてのペプチドは、Ｃｏｖａｌａｂ（フランス）によって合成された。ペプチドの配列及び純度は、ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒ、フランス）及び質量分光光度計で検査した。
Figure 0006865584
Ｂ）方法
Ｂ−Ｉ： コンジュゲートした基質の調製法
Ｂ−Ｉ−１： ９６ウェルマイクロタイタープレートに共有結合的にカップリングしたペプチド（Ｃｏｖａｂｔｅｓｔ−ペプチド）の調製
カップリング法は、すでに出願人によって記載されており（Ｖ．Ｔｈｏｍａｓら、２００４）、Ｃｏｖａｌａｂより市販されているＣｏｖａｂｔｅｓｔ−ｐｌａｔｅＴＭ（照会番号：ｏｐｒ ０００４）の対応するデータシートにも記載されている。簡潔に言えば、別々のチューブにおいて、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５）に溶解させた１５０μＭの各ペプチド、５ｍＭ ＥＤＡＣ、及び５ｍＭ ＮＨＳを含有する溶液混合物を穏やかに攪拌しながら３０分間インキュベートした。得られた各ペプチド（１５ナノモル）の活性化ＮＨＳ−カルボキシル末端部分を使用して、各ウェルにあたり１５０μｌの０．６％重炭酸ナトリウムで１５分間予め脱プロトン化したＣｏｖａｂｔｅｓｔ−プレートＴＭの各ウェルにコンジュゲートさせた。次いで、マイクロタイタープレートを室温で２時間インキュベートしてから、トリス緩衝生理食塩水でしっかり洗浄した。
Ｂ−Ｉ−２： ＢＳＡに共有結合的にカップリングしたペプチド（ＢＳＡ−ペプチドコンジュゲート）の調製
２ｍｇの各ペプチドを１ｍｌの脱イオン水に溶解し、１５０ナノモルを、５０ｍＭ重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．５）に溶解させた０．５ｍｇのＢＳＡと混合した。攪拌後、グルタルアルデヒドを最終濃度０．２５％（ｖ／ｖ）で加えた。混合物を、穏やかに攪拌しながら室温にて１６時間維持した。このインキュベーション時間の最後に水素化ホウ素ナトリウムを最終濃度１０ｍｇ／ｍｌで加え、ＢＳＡとペプチドの間の架橋結合を安定化させた。２時間後、ペプチド−ＢＳＡの各混合物を別々にＰＢＳ中で透析して遊離ペプチドを除去した。
Ｂ−Ｉ−３： ＩｇＧに共有結合的にカップリングしたペプチド（ＩｇＧ−ペプチドコンジュゲート）の調製
脱イオン水に溶解させた６００ナノモルのＨＨ１２Ｑ１１ペプチドを、０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５）中の６０μモルのＥＤＡＣ及び６０μモルのＮＨＳと混合して、Ｃ末端アミノ酸のαカルボキシルを活性化した。穏やかに攪拌しながら室温で３０分インキュベーション後、５００μＬのペプチド溶液を、０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）で１ｍｇ／ｍｌに希釈した０．５ｍｇのヒトＩｇＧに加えた。次いで、最終混合物を穏やかに攪拌しながら室温で１６時間インキュベートした。次いで、各溶液をＭ−１に記載したように別々にＰＢＳ中で透析した。
Ｂ−Ｉ−４： ＢＳＡ−ペプチドコンジュゲート及びｈＩｇＧ−ペプチドコンジュゲートでコーティングしたマイクロタイタープレートの調製
高結合９６ウェルマイクロタイタープレート（コースター）を用いて、Ｍ−４及びＭ−５に記載のように調製したＢＳＡ−ペプチドコンジュゲート及びヒトＩｇＧ−ペプチドコンジュゲートを固定化した。これらの実験では、コンジュゲートを５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９）で５０μｇ／ｍｌに調製し、１００μｌの各溶液を、実験に必要とされるウェル数に分注した。４℃にて一晩インキュベーション後、プレートをトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）でしっかり洗浄し、ＴＧ活性のために使用する準備をした。
Ｂ−Ｉ−５： ９６ウェルマイクロタイタープレートに共有結合的にカップリングしたスペルミン（Ｃｏｖａｂｔｅｓｔ−ｓｐｍ）の調製
Ｃｏｖａｂｔｅｓｔ−ｓｐｍプレートを作製するために、Ｍｉｌｙら（２００９）に記載の手順を用いた。
Ｂ−ＩＩ： トランスグルタミナーゼ活性の測定方法
Ｂ−ＩＩ−１： Ｃｏｖａｂｔｅｓｔ−プレートにカップリングしたペプチド（Ｂ−Ｉ−１）へのビオチン−Ｘ−カダベリンのトランスグルタミナーゼ介在性の取込み
この実験のために、Ｖ Ｔｈｏｍａｓら（２００４）に記載され、Ｃｏｖａｌａｂの市販キット（ｏｐｒ ００３３）にも記載された同一手順を使用した。簡潔に言えば、凍結乾燥したトランスグルタミナーゼを４０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８）でもどし、５０μｌの２００ｎｇ／ｍｌ及び４０ｎｇ／ｍｌの各ｍＴＧを、５０μｌのビオチン−Ｘ−カダベリンを含有するウェルに加えた。この酵素混合物を穏やかに攪拌しながら室温で１５分間インキュベートした。次いで、プレートをＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄し、続いて１００μｌの希釈ＨＲＰ標識ストレプトアビジン（ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０、０．５％ＢＳＡで１／２０００）を各ウェルに加えた。室温にて３０分後、そしてＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄後、１００μＬのＴＭＢ基質を加え、５分後に１００μｌの０．５Ｍ硫酸により発色を止めた。マイクロプレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ、Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ、ヘルシンキ、フィンランド）を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
Ｂ−ＩＩ−２： ＢＳＡ−ペプチドでコーティングしたプレート（Ｂ−Ｉ−２）へのビオチン−Ｘ−カダベリンのトランスグルタミナーゼ介在性の取込み
Ｂ−ＩＩ−１に記載したのと同一の手順を使用した。
Ｂ−ＩＩ−３： ＢＳＡ−ペプチドコンジュゲート（Ｂ−Ｉ−２）を用いた競合アッセイによるトランスグルタミナーゼ酵素反応の特異性の確認
この実験では、ペプチド−１（ＴＧｐａｎ（表２））をＢ−Ｉ−２に記載の方法に従ってＢＳＡにコンジュゲートさせ、Ｂ−Ｉ−４に記載のように９６ウェルマイクロタイタープレートをコーティングするために使用した。次いで、表２に記載のペプチド（非ビオチン化ペプチド）を、４０ｍＭ ＴＢＳ（ｐＨ８）中にて６００μＭの濃度で推定競合剤として使用した。各ウェルに以下の試薬を同一２検体で加えた：２５μｌのペプチド競合剤、２５μＬの４００ｎｇ／ｍｌ ｍＴＧ、及び５０μｌのビオチン−Ｘ−カダベリン。室温にて１５分インキュベーション後、プレートをＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄し、先の方法に記載の手順に従って、１００μｌのＨＲＰ標識ストレプトアビジンを加えた。陰性対照として、Ｇｌｕ（Ｑ）ドナーを含有しないＹＶ１０ペプチドを使用した。
Ｂ−ＩＩ−４： 好ましいｍＴＧの基質のスクリーニング
表２に列挙したペプチド（ビオチン化ペプチド）のスクリーニングのために、トランスグルタミナーゼ２（ＴＧ２）架橋結合活性を測定するための、照会番号：ｏｐｒ ００３３で市販されている比色分析アッセイ（Ｍｉｌｙら、２００９）を用いた。ここでは、ＴＧ２の代わりに、本実験において記載されるｍＴＧを使用した。本法の原理は、カルボキシ置換ポリスチレンプレートに共有結合的にカップリングしたスペルミンとビオチン化ペプチドを使用する、ｍＴＧのアミド基転移活性に基づいている。本アッセイは、グルタミンのγ−カルボキサミド基の、固定化スペルミンへの取込みから成る。ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼの活性によって測定される、プレートに結合するビオチン化ペプチドの量は、ＴＧ活性に正比例する。マイクロプレートリーダーを使用して、４５０ｎｍで吸光度を測定した。
好ましい基質に対するｍＴＧの親和性を比較するために、ペプチドを、１６０、８０、４０、２０、１０、５、２．５、及び０μＭの異なる濃度で使用した。次いで、各ペプチドについて見かけのＫｍを測定し、ラインウィーバー＝バーク法（１／吸光度＝ｆ（１／［ｍＴＧ（μＭ）］））によって計算した。
Ｂ−ＩＩ−５： ビオチン−Ｘ−カダベリンのｍＴＧによるヒトＩｇＧへの酵素的取込みのウエスタンブロットによる分析
２０μｇのペプチドコンジュゲートＩｇＧ（ＩｇＧ−ＹＶ１０、ＩｇＧ−ＣＷ９Ｑ３、及びＩｇＧ−ＨＨ１２Ｑ１１）及び遊離ＩｇＧ（対照）を、１３ナノモルのビオチン−Ｘ−カダベリン及び０．６ｎｇのｍＴＧと、最終容量１５０μｌで混合した。反応混合物を、エンドポイント実験のために室温で２時間、そして反応速度試験のために０、１０、２０、及び６０分間インキュベートした。各時間の最後に、４μｌの電気泳動ローディング緩衝液（０．３Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、０．６Ｍジチオスレイトール、１２％ＳＤＳ、０．６％ブロモフェノールブルー、及び５０％グリセロール）を含有するチューブに２０μｌの各溶液を移し、９０℃で５分間煮沸した。Ｌａｅｍｍｌｉら、１９７０に記載のように、変性条件のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により、ｍＴＧとｈＩｇＧの各種サブユニットとを分離させた。簡潔に言えば、１５μｌ（１、３μｇ）の各試料を１０％ポリアクリルアミドゲルにロードし、１００Ｖで１時間泳動を行った。この時間の最後に、Ｔｏｗｂｉｎら、１９７９の方法により、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルからＨｙｂｏｎｄウエスタンブロット−Ｃニトロセルロース膜（アマシャム・ライフサイエンス、イギリス）へのタンパク質の転写を１００Ｖにて１時間行った。ｈＩｇＧに共有結合的にカップリングしたビオチン−Ｘ−カダベリンを検出するために、０．５％ＢＳＡを含有するトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）中で３７℃にて１時間膜をインキュベートしてから、ＴＢＳ、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０、０．５％ＢＳＡで１／２０００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンでプローブした。３７℃で３０分のインキュベーション後、膜を、ＴＢＳ、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回、ＰＢＳで２回洗浄した。ペルオキシダーゼ活性を検出するために、膜を化学発光試薬のＣｏｖａｌｉｇｈｔ（登録商標）中で２分間インキュベートし、最後にウエスタンブロットイメージャーで分析した。本試験におけるウエスタンブロットの結果は、多重測定の代表的なものである。
Ｂ−ＩＩＩ−１： Ｑ−ペプチドタグ付き組換え抗体
３種の異なるＱ−ペプチドタグ付き組換え抗体を産生した。ＲｅｃＡｂ−タグ抗体は、重鎖のカルボキシル末端にＱ−ペプチドタグＤＨＱ６Ｑ７（配列番号７）をもつ、ヒト組換え抗ＲｈＤ１抗体（ＩｇＧ１）（Ｓｉｂｅｒｉｌ Ｓ．、Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００６）１１８：１７０−９；Ｓａｕｒａｂｈ Ｋ．Ｇｕｐｔａ、ＪＢＣ（２００７）；２８２、２９４３１−２９４４０）である。Ｄ１−３−タグ抗体は、重鎖のカルボキシル末端にＱ−ペプチドタグ（配列番号３２）をもつ、ヒト組換え抗リゾチーム抗体（ＩｇＧ２）である。Ｈｅｒ２−タグ抗体は、重鎖のカルボキシル末端にＱ−ペプチドタグ（配列番号３２）をもつ、ヒト組換え抗Ｈｅｒ２抗体（ＩｇＧ２）である。いずれの抗体も、Ｃｈａｐｐｌｅ ＳＤ、ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００６）Ｄｅｃ ２２；６：４９；Ｍａｒｔｉｎ ＣＤ、ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００６）Ｄｅｃ ７；６：４６に従って産生した。
Ｂ−ＩＩＩ−２： ビオチン−Ｘ−カダベリンのｍＴＧによる組換えＩｇＧのＱ−ペプチドタグへの酵素的取込みのウエスタンブロットによる分析
２０μｇの組換えＩｇＧ（タグ付き抗体及びタグなし抗体）を、１３ナノモルのビオチン−Ｘ−カダベリン及び０．６ｎｇのｍＴＧと、最終容量１５０μｌで混合した。反応混合物を、エンドポイント実験のために室温で１５分、そして反応速度試験のために５、１５、６０分、及び一晩インキュベートした。各時間の最後に、４μｌの電気泳動ローディング緩衝液（０．３Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、０．６Ｍジチオスレイトール、１２％ＳＤＳ、０．６％ブロモフェノールブルー、及び５０％グリセロール）を含有するチューブに２０μｌの各溶液を移し、９０℃で５分間煮沸した。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動及びウエスタンブロットを、Ｂ−ＩＩ−５に記載のように実施した。
Ｂ−ＩＩＩ−３： 組換え抗リゾチームＩｇＧの免疫反応性のＥＬＩＳＡによる確認
５０ｍＭ ＮａＨＣＯ３／Ｎａ２ＣＯ３（ｐＨ９．５）で希釈した１μｇ／ウェルの鶏卵リゾチーム（照会番号：Ｌ６８７６−１Ｇ；シグマ・アルドリッチ、フランス）を、９６ウェルマイクロタイタープレート（高結合、コースター）にコーティングした。４℃で１６時間のインキュベーション後、非特異的な結合を防ぐために、１５０μｌ／ウェルの０．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液を加えた。この溶液を３７℃で３０分インキュベートし、プレートをＰＢＳで２回洗浄した。次いで、１００μｌのタグ付きＤ１−３及びタグなしＤ１−３組換え抗リゾチーム抗体を、１０、５、２．５、１．２５μｇ／ｍｌにて１時間インキュベートした。無関係なヒトＩｇＧ（ｉｈＩｇＧ）を陰性対照として用いた。ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄後、１／１０００に希釈した１００μｌ／ウェルの西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧＡＭ抗体（ＰＡＲＩＳ、フランス）を３７℃で３０分インキュベートした。ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０でしっかり洗浄後、Ｂ−ＩＩ−Ｉに記載のように、ＴＭＢ／Ｈ２Ｏ２基質（Ｃｏｖａｌａｂ、フランス）を用いて、ペルオキシダーゼ活性を測定した。
Ｂ−ＩＩＩ−４： 組換え抗Ｈｅｒ２ ＩｇＧの免疫反応性のＥＬＩＳＡによる確認
５０ｍＭ ＮａＨＣＯ３／Ｎａ２ＣＯ３（ｐＨ９．５）で希釈した０．１μｇ／ウェルの組換えヒトＥｒｂＢ−２／ＨＥＲ２タンパク質（Ｂｉａｆｆｉｎ Ｇｍｂ、ドイツ）を、９６ウェルマイクロタイタープレート（高結合、コースター）にコーティングした。４℃で１６時間のインキュベーション後、Ｂ−ＩＩＩ−３に記載のようにＢＳＡを加えた。次いで、ｍＴＧ／ビオチン−Ｘ−カダベリン処理又は未処理の、１００μｌ／ウェルのタグ付きＲｅｃ−Ｈｅｒ２及び抗リゾチームＡＤ１−３（無関係なタグ付きＩｇＧとして）を、１０、５、２．５、１．２５μｇ／ｍｌにて１時間インキュベートした。ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄後、１つの実験では、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧＡＭ抗体を加えて１次抗体の存在を検出し、別の実験では、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で１／２０００に希釈）を加えて、ｍＴＧによって取り込まれたビオチン−Ｘ−カダベリンを検出した。次いで、Ｂ−ＩＩ−１に記載のようにＨＲＰ活性を測定した。
結果
すべての実験において、ｍＴＧ（微生物／細菌トランスグルタミナーゼ）を標的酵素として、Ｓａｔｏら（２００１）によって記載されるペプチドＧＳ１２Ｑ７及びそのビオチン化誘導体ｂＧＳ１２Ｑ７を標準基質として用い、新規ペプチド基質の反応性及び特異性を比較した。また、ｍＴＧとの酵素反応性を比較するため、またペプチド基質の特異性を確認するために、ＴＧ２（組織トランスグルタミナーゼ）を適宜使用した。
Ｒ−１： Ｂ−ＩＩ−１に記載の方法による、好ましいｍＴＧ基質のスクリーニング
ペプチドライブラリー（Ｃｏｖａｌａｂ）をスクリーニングして、ｍＴＧの推定される新規基質を同定するために、ペプチドがプレートに共有結合的にカップリングしており、アミン基質のビオチン−カダベリンが溶液中に遊離しているＣｏｖａｂｔｅｓｔ−ペプチド（Ｂ−Ｉ−１に記載）を使用した。この実験では、１５ナノモルの各ペプチド（表２）をマイクロタイタープレートに共有結合的にコンジュゲートさせて、ｍＴＧ（１０ｎｇ／ウェル）によって触媒されるビオチン−カダベリン（０．１ｍｇ／ｍｌ）の取込みをＢ−ＩＩ−１に記載の実験に従って定量した。図１に示すように、試験したすべてのペプチドの中で、ｍＴＧによってＧｌｎ（Ｑ）ドナーとして認識され、ビオチン−カダベリンを取り込んだのは、ごく少数のペプチドであった。酵素活性は、ペプチド基質間でさまざまであった。ペプチドＦＥ５Ｑ４、ＨＨ１２Ｑ１１、及びＤＨ６Ｑ７はｍＴＧの良好な基質であり、ペプチドＦＥ５Ｑ４及びＨＨ１２Ｑ１１はより反応性に富むことが見出された。ＱをＮに置換する（ペプチドＨＨ１２Ｎ１１）と、ｍＴＧの反応性が観測されず、酵素のＧｌｎドナーへの特異性が確認された。さらに、４種のペプチド（ＨＨ１２Ｑ１１、ＤＨ６Ｑ７、ＨＧ１４Ｑ１１、及びＷＧ１０Ｑ７）の反応性を比較すると、Ｇｌｎの反応性はペプチド配列内のその位置に依存することが観測され得る。最も反応性に富むペプチドでは、ＱはＣ末端に位置している。トランスグルタミナーゼの良好な基質であることが知られているペプチドＧＳ１２Ｑ７及びＴＧｐａｎは、他のペプチドと比較して、ｍＴＧに対する反応性が低かった。ＹＶ１０は、その配列にＱがない陰性対照ペプチドである。表１に列挙した他のペプチドは、ｍＴＧとの反応性を示さなかった。
Ｒ−２： Ｂ−ＩＩ−１に記載の方法による、好ましいＴＧ２基質のスクリーニング
第２の実験では、ＴＧ２酵素をｍＴＧと同じ条件で使用して、上記と同じペプチドを試験した。図２に提示した結果は、ＴＧｐａｎがＴＧ２の良好な基質であることを明らかに示しており、この酵素に対する特異性が確認された。ＨＨ１２Ｑ１１は、ｍＴＧよりＴＧ２との反応性が低い。この実験条件では、他のペプチドのいずれもこの酵素と反応せず、ＴＧ２の基質として使用できない。これらの結果は、グルタミンドナーの位置とそのグルタミンの周囲にあるアミノ酸が、酵素の特異性にとって重要であることを示している。
Ｒ−３： スクリーニングしたペプチドの親和性の決定
以下の表３は、ｍＴＧのペプチド基質の見かけのＫｍの決定について開示している（（ｂ）ビオチンタグ付きペプチド、（ｎｒ）酵素に認識されないペプチド）。Ｑドナーに太字で下線を施した。いくつかのペプチドでは、ＱをＮに置換した。
Figure 0006865584
上記の実験では、いくつかのペプチドがｍＴＧの良好な基質であることが見出された。この試験において、ｍＴＧの基質であることが知られていない、Ｇｌｎ残基を含有するペプチドの最適配列を決定した。その目的のために、Ｑを異なる位置に加えたいくつかのペプチドを作製し、Ｇｌｎドナーの周囲にあるアミノ酸を変化させた（表１参照）。
この実験では、Ｂ−ＩＩ−４に記載のように、スペルミンをプレートにコンジュゲートさせた。表３に記載のビオチン化ペプチドを、ｍＴＧとともに異なる濃度（１６０、８０、４０、２０、１０、５、２．５、及び０μＭ）でインキュベートした。基質に対するｍＴＧの親和性を比較するために、各ペプチドについて見かけのＫｍを決定し、ラインウィーバー＝バーク法（１／吸光度＝ｆ（１／［ｍＴＧ（μＭ）］））によって計算した。表３から、ペプチドＨＨ１２Ｑ１１とその短い誘導体（ＷＨ８Ｑ７及びＤＨ６Ｑ５）が、ｍＴＧとの反応性に富むことが明らかである。これらのペプチドでは、Ｇｌｎドナーが、ｍＴＧによる認識に必須であるセリン（Ｘ−１の位置）及びヒスチジン（Ｘ＋１の位置）に囲まれている。ＤＥ６Ｑ５においてヒスチジン（Ｘ＋１の位置）をグルタミン酸（Ｅ）に変更すると、その反応性は失われるようである。ペプチドＰＨ６Ｑ４及びＰＳ６Ｑ４でも同じ結果が得られた。Ｅがペプチドの反応性を消失させるように見えても、これは、その負電荷のみによるものではなく、Ｘ＋１、Ｘ＋２、及びＸ＋３の位置にあるアミノ酸の性質にもよる可能性がある。実際、Ｘ＋１の位置にＥを有するＦＥ５Ｑ４ペプチドは、このペプチドの反対側にあるアミノ酸の環境により、ｍＴＧとの高い反応性を示す。このことは、ＬＮ１１Ｑ８Ｑ１０ペプチドで確認される。このペプチドでは、８位にあるＱだけがｍＴＧの基質となる。なぜなら、ＬＮ１１Ｑ１０においてそれをＳに置換すると、ペプチドの反応性が完全に阻害されるからである。
表３は、配列番号２９、３０、３１、３２、及び３３のペプチドが、トランスグルタミナーゼの優れた基質であることも示している。
この表の他のペプチドに関しては、Ｇｌｎの位置と周囲にあるアミノ酸のために、反応性が得られなかった。
Ｒ−４： 選択したペプチドのｍＴＧ酵素反応に対する特異性の確認
高反応性ペプチドＨＨ１２Ｑ１１とその小型誘導体ＤＨ６Ｎ５に対するｍＴＧ反応の特異性を確認するために、Ｇｌｎドナー（Ｑ）をアスパラギン（Ｎ）に置換した変異類似体ペプチドを合成した。図４は、これらのペプチド（ＨＨ１２Ｑ１１／ＨＨ１２Ｎ１１及びＤＨ６Ｑ５／ＤＨ６Ｎ５）を用いて得られた結果を示す。これらの最も好ましいｍＴＧの基質において、ＱをＮに置換すると酵素反応性が完全に失われるので、結果は決定的である。
Ｒ−５： 好ましいｍＴＧ基質とコンジュゲートしたＢＳＡは、酵素の良好な基質になる。
多くのタンパク質は、その構造中に多数のグルタミン残基が存在していたとしてもトランスグルタミナーゼの基質でないことが、文献でよく知られている（Ｇｏｒｍａｎ ＪＪ、Ｆｏｌｋ ＪＥ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８４、Ｊｕｌ ２５；２５９（１４）：９００７−１０）。これらのタンパク質には、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び免疫グロブリン（Ｉｇ）がある。本実験では、ｍＴＧ基質にコンジュゲートしたＢＳＡが酵素によって認識され得るかどうかを検証した。このようにするために、Ｂ−Ｉ−２に記載のように、ペプチドＨＨ１２Ｑ１１をＢＳＡに共有結合的にコンジュゲートさせた。次いで、１μｇ／ｍｌの非修飾ＢＳＡ及びＢＳＡ−ＨＨ１２Ｑ１１コンジュゲートを、ｍＴＧによるビオチン−カダベリン取込み用の９６ウェルマイクロタイタープレートにコーティングした。別のアッセイでは、遊離ＨＨ１２Ｑ１１を反応混合物に加え、ｍＴＧに対するその阻害効果を分析した。この競合アッセイの明確化のために、ｍＴＧを１００ｎｇ／ｍｌで用い、１５０μＭの遊離ペプチド及び０．１ｍｇ／ｍｌのビオチン−カダベリンを使用した。
図４の結果は、ＢＳＡ−ＨＨ１２Ｑ１１コンジュゲートではビオチン−カダベリンの良好な取込みが得られ、遊離ＢＳＡでは反応性がなかったことを示しており、ＢＳＡはｍＴＧの基質でないことが確認された。ＢＳＡ−ＨＨ１２Ｑ１１に対するｍＴＧの反応性は、遊離ペプチドを加えると減少し、このペプチドに対する酵素の特異性を実証しており、Ｒ１において得られた結果が確認された。
Ｒ−６： 好ましいｍＴＧ基質とコンジュゲートしたヒトＩｇＧは、酵素の良好な基質になる。
この実験では、好ましい基質ペプチドＨＨ１２Ｑ１１を、Ｂ−１−２に記載のようにヒトＩｇＧに共有結合的にカップリングさせて、その対照（遊離ＩｇＧ）とともに、それらをＢ−Ｉ−４に示すように９６ウェルマイクロタイタープレートにコーティングした（１ｍｇ／ｍｌ）。図５に示すように、ビオチン−カダベリン（０．１ｍｇ／ｍｌ）の取込みについて、異なる量のｍＴＧを使用して検討した。
結果は、遊離ヒトＩｇＧがｍＴＧの基質ではないこと、そしてＨＨ１２Ｑ１１ペプチドにコンジュゲートさせると、１級アミン（ビオチン−カダベリン）の強い取込みが得られたことを明らかに示している。遊離ＩｇＧで得られる低い光学密度は、ｍＴＧ無添加で得られるバックグラウンドレベルと同等である。
Ｒ−７： ビオチン−カダベリンのｍＴＧによるヒトＩｇＧ−ＨＨ１２Ｑ１１コンジュゲートへの酵素的取込みのウエスタンブロット分析
ｍＴＧ基質の担体としてヒトＩｇＧを使用し得るかどうか判定するために、ＨＨ１２Ｑ１１及びＦＥ５Ｑ４（ｍＴＧペプチド基質）及びＹＶ１０（ペプチド対照）をヒトＩｇＧにコンジュゲートさせて、Ｂ−ＩＩ−５に記載のようにウエスタンブロットによって分析した。
図６に提示する結果は、ＨＨ１２Ｑ１１ペプチドとコンジュゲートさせたＩｇＧ及びＦＥ５Ｑ４ペプチドとコンジュゲートさせたＩｇＧがともに、ｍＴＧと２時間インキュベーション後にビオチン−カダベリンを取り込むことができたことを示している。ＩｇＧ−ＨＨ１２Ｑ１１は、染色強度によって示されるように、より多くのビオチン−カダベリンを取り込んだように見える。さらに、ＩｇＧ−ＨＨ１２Ｑ１１は、アミン基質の取込みが酵素反応初期（Ｔ０）（矢印）から始まったので、ｍＴＧへの親和性がＩｇＧ−ＦＥ５Ｑ４より高い。遊離ＩｇＧ及びペプチド対照（ＹＶ１０）とコンジュゲートしたＩｇＧは、染色を示さなかった。これらの結果より、Ｒ−３で言及したこれまでの結果が確認される。
図７に提示する反応速度試験の結果は、ＨＨ１２Ｑ１１とのＩｇＧコンジュゲート及びＦＥ５Ｑ４とのＩｇＧコンジュゲートがともに、ビオチン−カダベリンを１０分未満で速やかに取り込み、この取込みが経時的に増加して、１時間で高い取込みとなったことを示している。ここでも、遊離ＩｇＧ及びペプチド対照（ＹＶ１０）とコンジュゲートしたＩｇＧは染色を示さず、遊離ＩｇＧがｍＴＧの基質でないことを示した。
Ｒ−８： 組換えタグ付き抗体
Ｑ−ペプチドタグをその重鎖の最もＣ末端のドメインに含有する３種の異なる抗体を遺伝子操作してＨＥＫ−２９３細胞において産生した。Ｑ−ペプチド（配列番号７）をヒト組換え抗ＲｈＤ１抗体（ＩｇＧ１）の重鎖のカルボキシル末端で融合させた。別の実験では、Ｑ−ペプチド（配列番号３２）を用いて組換えヒト抗リゾチーム抗体（Ｄ１−３）及びヒト抗Ｈｅｒ２抗体にタグ付けして構築した。タグは重鎖のＣ末端で融合させた。次に、ｍＴＧがビオチン−Ｘ−カダベリンをＱ−ペプチドタグ付き抗体に取り込むことができるかどうか検証した。図１０のウエスタンブロットの結果は、配列番号７（図１０Ａ）及び配列番号３２（図１０Ｂ及び図１０Ｃ）でタグ付けした抗体の重鎖の明瞭な染色を示したが、一方でタグなし抗体は染色されなかったことを示している。これらの知見より、Ｑ−ペプチド配列は、全長の抗体配列に融合したときも、ｍＴＧの良好な基質であることが確認される。染色強度の差異は、ゲル中をロードした抗体の量によるものである。
Ｒ−９： ビオチン−Ｘ−カダベリンのｍＴＧによる取込みの反応速度試験
この実験では、配列番号３２でタグ付けした組換えヒト抗リゾチーム抗体（Ｄ１−３）を、ｍＴＧ及びビオチン−Ｘ−カダベリンとともに、０、１５、及び１２０分間インキュベートし、材料及び方法に記載のように、酵素的架橋結合反応をストレプトアビジン−ペルオキシダーゼによって測定した。図１１の結果は、ビオチン−Ｘ−カダベリンのｍＴＧによる取込みが速やかで、取込み（図１１中のシグナル強度によって評価）の最大値（＞５０％）が１５分以内に得られたことを示している。この良好で特異的なｍＴＧ反応性は、図７に示された、配列ＨＨ１２Ｑ１１及びＦＥ５Ｑ４を用いて得られた結果を確認するものである。
Ｒ−１０： 組換え抗リゾチームＩｇＧ及び抗Ｈｅｒ２ ＩｇＧの免疫反応性のＥＬＩＳＡによる確認
ポリヒスチジン及び他のペプチドは、免疫反応性に影響を及ぼすことなく抗体にタグ付けするために使用できることがよく知られている。この実験では、タグ付き抗リゾチーム抗体（Ｄ１−３）及び抗Ｈｅｒ２抗体の、対応するタンパク質に対する免疫反応性について、Ｂ−ＩＩＩ−３及びＢ−ＩＩＩ−４の方法に記載のように、ＥＬＩＳＡによって測定した。図１２Ａの結果は、タグ−Ｄ１−３が、タグなし対照抗体Ｄ１−３に匹敵する免疫反応性を有することを明らかに示している。ｈＩｇＧは、陰性対照抗体として使用した。図１２Ｂでは、タグ付き抗Ｈｅｒ２に関して、そのタグなし抗体と比較して同様の結果を得た。図１２Ｃでは、ｍＴＧを介してビオチン−Ｘ−カダベリンにコンジュゲートしたとき、抗Ｈｅｒ２抗体の免疫反応性が安定していることを確認した。このＥＬＩＳＡ試験の対照は、タグ付き及びタグなしの抗リゾチームを使用して作製した。これらの実験から、抗体の重鎖のＣ末端にｍＴＧの基質として小ペプチド配列を付加しても、免疫反応性に影響を及ぼさないことが確認される。
本願は以下の発明を包含する。
［項目１］ トランスグルタミナーゼの基質であって、
３〜１５個のアミノ酸を有し、アミノ酸配列：Ｘ −４ Ｘ −３ Ｘ −２ Ｘ −１ ＱＸ ＋１ Ｘ ＋２ Ｘ ＋３ Ｘ ＋４
［式中：
Ｘ −４ は、非存在であるか又はいずれかのアミノ酸、好ましくは負電荷アミノ酸又は非極性アミノ酸であり；
Ｘ −３ は、非存在であるか、又は芳香族アミノ酸、非極性疎水性アミノ酸、及び非極性アミノ酸から成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘ −２ は、非存在であるか又はいずれかのアミノ酸、好ましくは負電荷アミノ酸又は非極性アミノ酸から成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘ −１ は、極性中性アミノ酸、正電荷アミノ酸、非極性アミノ酸、及び非極性疎水性アミノ酸から成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｑは、グルタミンであり；
Ｘ ＋１ は、極性中性アミノ酸、正電荷アミノ酸、非極性疎水性アミノ酸、及び負電荷アミノ酸から成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘ ＋２ は、非存在であるか、又は極性中性アミノ酸、芳香族アミノ酸、非極性疎水性アミノ酸、及び正電荷アミノ酸から成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘ ＋３ は、非存在であるか又はいずれかのアミノ酸、好ましくは非極性アミノ酸であり；そして
Ｘ ＋４ は、非存在であるか又はいずれかのアミノ酸である］
を含み、第１分子に結合するペプチドを含む、前記基質。
［項目２］ Ｘ −４ は、非存在であるか又はいずれかのアミノ酸、好ましくはアスパラギン酸又はプロリンであり；
Ｘ −３ は、非存在であるか、又はフェニルアラニン、プロリン、バリン、チロシン、トリプトファン、及びロイシンから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘ −２ は、非存在であるか、又はグルタミン酸、プロリン、チロシン、トリプトファン、リジン、システイン、ロイシン、ヒスチジン、及びセリンから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘ −１ は、セリン、ヒスチジン、イソロイシン、バリン、及びアラニンから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｑは、グルタミンであり；
Ｘ ＋１ は、アルギニン、リジン、ヒスチジン、グルタミン酸、セリン、及びアラニンから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘ ＋２ は、非存在であるか又はいずれかのアミノ酸、好ましくはヒスチジン、チロシン、リジン、グルタミン、ロイシン、及びセリンから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘ ＋３ は、非存在であるか又はいずれかのアミノ酸、好ましくはプロリンであり；そして
Ｘ ＋４ は、非存在であるか又はいずれかのアミノ酸である、
項目１に記載の基質。
［項目３］ （ｉ）Ｘ −１ はセリンであり、Ｘ ＋１ は、ヒスチジン、チロシン、アラニン、又はグルタミン酸である；
（ｉｉ）Ｘ −１ はアラニン又はバリンであり、Ｘ ＋１ は、リジン、アルギニン、又はアラニンであり、ここで、Ｘ −１ がアラニンであるとき、Ｘ ＋１ はリジン又はアルギニンである；又は
（ｉｉｉ）Ｘ −１ はイソロイシンであり、Ｘ ＋１ は、アルギニン、リジン、又はグルタミン酸である、
のいずれかである、項目１又は２に記載の基質。
［項目４］ 第１分子が、タンパク質、抗体、薬物、核酸、放射性元素、レポーター基、安定化分子、アプタマー、リボザイム、ドメイン抗体、ナノボディ、非免疫グロブリン骨格、ベクター粒子、及び固体支持体に固定された分子から成る群より選択される、項目１、２、又は３に記載の基質。
［項目５］ 第１分子が抗体である、項目１〜４のいずれか１項に記載の基質。
［項目６］ 該ペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号２０、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、及び配列番号３３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む、項目１〜５のいずれか１項に記載の基質。
［項目７］ 少なくともアルキルアミン又はリジン残基を含む第２分子に共有結合した、項目１〜６のいずれか１項に記載のトランスグルタミナーゼの基質を含む、コンジュゲートした化合物。
［項目８］ 第２分子が、タンパク質、抗体、薬物、核酸、放射性元素、レポーター基、安定化分子、アプタマー、リボザイム、ドメイン抗体、ナノボディ、非免疫グロブリン骨格、ベクター粒子、及び固体支持体に固定された分子から成る群より選択される、項目７に記載のコンジュゲートした化合物。
［項目９］ 第１分子が抗体であり、第２分子が薬物、好ましくは細胞傷害薬である、項目７又は８に記載のコンジュゲートした化合物。
［項目１０］ ヒト又は動物の身体の治療方法に使用するための、項目９に記載のコンジュゲートした化合物。
［項目１１］ 項目１〜６のいずれか１項に記載のトランスグルタミナーゼ基質を、少なくともアルキルアミン又はリジン残基を含む第２分子に共有結合させるための方法であって：
トランスグルタミナーゼ基質を第２分子と、トランスグルタミナーゼ、好ましくは細菌トランスグルタミナーゼ、例えば、ストレプトベルチシリウム・モバラエンス（Streptoverticillium mobaraense）トランスグルタミナーゼ（ｍＴＧ）の存在下で反応させる工程を含む、前記方法。
［項目１２］ ３〜１５個のアミノ酸を有し、アミノ酸配列：Ｘ −４ Ｘ −３ Ｘ −２ Ｘ −１ ＱＸ ＋１ Ｘ ＋２ Ｘ ＋３ Ｘ ＋４
［式中：
Ｘ −４ は、非存在であるか又はいずれかのアミノ酸、好ましくは負電荷アミノ酸又は非極性アミノ酸であり；
Ｘ −３ は、非存在であるか、又は芳香族アミノ酸、非極性疎水性アミノ酸、及び非極性アミノ酸から成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘ −２ は、非存在であるか又はいずれかのアミノ酸、好ましくは負電荷アミノ酸又は非極性アミノ酸から成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘ −１ は、極性中性アミノ酸、正電荷アミノ酸、非極性アミノ酸、及び非極性疎水性アミノ酸から成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｑは、グルタミンであり；
Ｘ ＋１ は、極性中性アミノ酸、正電荷アミノ酸、非極性疎水性アミノ酸、及び負電荷アミノ酸から成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘ ＋２ は、非存在であるか、又は極性中性アミノ酸、芳香族アミノ酸、非極性疎水性アミノ酸、及び正電荷アミノ酸から成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘ ＋３ は、非存在であるか又はいずれかのアミノ酸、好ましくは非極性アミノ酸であり；そして
Ｘ ＋４ は、非存在であるか又はいずれかのアミノ酸である］
を含むペプチド。
［項目１３］ Ｘ −４ は、非存在であるか又はいずれかのアミノ酸、好ましくはアスパラギン酸又はプロリンであり；
Ｘ −３ は、非存在であるか、又はフェニルアラニン、プロリン、バリン、チロシン、トリプトファン、及びロイシンから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘ −２ は、非存在であるか、又はグルタミン酸、プロリン、チロシン、トリプトファン、リジン、システイン、ロイシン、ヒスチジン、及びセリンから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｑは、グルタミンであり；
Ｘ −１ は、セリン、ヒスチジン、イソロイシン、バリン、及びアラニンから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘ ＋１ は、リジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン酸、セリン、及びアラニンから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘ ＋２ は、非存在であるか、又はヒスチジン、チロシン、リジン、グルタミン、ロイシン、及びセリンから成る群より選択され；
Ｘ ＋３ は、非存在であるか又はいずれかのアミノ酸、好ましくはプロリンであり；そして
Ｘ ＋４ は、非存在であるか又はいずれかのアミノ酸である、
項目１２に記載のペプチド。
［項目１４］ 配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号２０、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、及び配列番号３３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む、項目１２又は１３に記載のペプチド。
［項目１５］ ポリペプチドに融合した、項目１２〜１４のいずれか１項に記載のペプチドを含む、融合タンパク質。
［項目１６］ 抗体の重鎖及び／又は軽鎖、あるいはＦａｂ若しくは（Ｆａｂ）’ ２ のようなそれらの可変断片領域を含み、前記重鎖及び／又は軽鎖、あるいはそれらの可変断片は、項目１２〜１４のいずれか１項に記載のペプチドに融合している、項目１５に記載の融合タンパク質。
参考文献
本願を通して、様々な参考文献が、本発明が関連する当該技術分野の技術水準を記載する。
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Claims (9)

  1. トランスグルタミナーゼの基質であって、
    ５〜１５個のアミノ酸を有し、アミノ酸配列：Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１ＱＸ＋１
    ［式中：
    Ｘ−３は、チロシン又はトリプトファンであり；
    Ｘ−２は、グルタミン酸又はプロリンであり；
    Ｘ−１は、アラニン、又はバリンであり；
    Ｑは、グルタミンであり；そして
    Ｘ＋１は、リジン又はアルギニンである］
    を含むペプチド含み、該ペプチドは第１分子に結合している、前記基質。
  2. 第１分子が、タンパク質、抗体、薬物、核酸、放射性元素、レポーター基、安定化分子、アプタマー、リボザイム、ドメイン抗体、ナノボディ、非免疫グロブリン骨格、ベクター粒子、及び固体支持体に固定された分子から成る群より選択される、請求項１に記載の基質。
  3. 第１分子が、抗体又は抗体の抗原結合部分である、請求項１又は２に記載の基質。
  4. 該ペプチドが、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、及び配列番号３３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の基質。
  5. 少なくともアルキルアミン又はリジン残基を含む第２分子に共有結合した、請求項１〜４のいずれか１項に記載のトランスグルタミナーゼの基質を含む、コンジュゲートした化合物。
  6. 第２分子が、タンパク質、抗体、薬物、核酸、放射性元素、レポーター基、安定化分子、アプタマー、リボザイム、ドメイン抗体、ナノボディ、非免疫グロブリン骨格、ベクター粒子、及び固体支持体に固定された分子から成る群より選択される、請求項５に記載のコンジュゲートした化合物。
  7. 第１分子が抗体であり、第２分子が薬物である、請求項５又は６に記載のコンジュゲートした化合物。
  8. ヒト又は動物の身体の治療方法に使用するための、請求項７に記載のコンジュゲートした化合物。
  9. 請求項１〜４のいずれか１項に記載のトランスグルタミナーゼ基質を、少なくともアルキルアミン又はリジン残基を含む第２分子に共有結合させるための方法であって：
    トランスグルタミナーゼ基質を第２分子と、トランスグルタミナーゼの存在下で反応させる工程を含む、前記方法。
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