CN107207551A - 使用具有转半乳糖基化活性的酶生产含半乳糖和果糖部分的糖类的方法 - Google Patents
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Abstract
本文描述了在转半乳糖基酶存在下,生产糖类的方法,尤其是生产乳果糖或低聚乳果糖的方法。
Description
技术领域
本发明涉及使用酶生产糖类的方法,该糖类尤其是但不仅限于乳果糖或低聚乳果糖。
背景技术
乳果糖(4-O-β-D-吡喃半乳糖基-β-D-呋喃果糖)是由单糖果糖和半乳糖各自的一个分子形成的二糖。它被用作轻泻药,因为它不被人类的肠吸收,也不被人类的酶分解,并且因此其大部分时间停留在消化食团中,通过渗透造成水分滞留,导致粪便更柔软、更容易通过。它在结肠中具有继发性轻泻药作用,在结肠中它由肠道菌群发酵。
乳果糖通常用作食品添加剂以改善口感、促进肠道健康并且促进肠道通过时间。乳果糖以其良好的接受程度而闻名,具有有限的副作用,类似于许多其他食品。它用于治疗慢性便秘和肝性脑病(肝病并发症)。
如在迈尔(Mayer)等人,农业与食品化学杂志(J.Agric.Food Chem.)2004,52,6983-6990中所描述的,由于全球奶酪生产,乳糖每年以数百万吨的量在乳清中积累,并且剩余量伴随着其倾倒造成日益严重的环境问题。因此,开发利用乳糖的替代方法是具有商业利益的。
从乳糖合成乳果糖的化学和酶促方法是本领域已知的。例如,上文迈尔等人的文章描述了在果糖存在下使用酶CelB(来自强烈火球菌的α-糖苷酶)和来自米曲霉的β-半乳糖苷酶进行的乳糖生物转化。该方法在17、34、68、136、194和272g/L的乳糖浓度和18、90、144、180、270和360g/L的果糖浓度下进行。
然而,通过迈尔等人的方法获得的乳果糖的产率低-乳果糖的最大浓度为3.4g/L,等于基于所用糖总量(即,乳糖和果糖起始材料的总重量)计算按重量计2.7%的产率。具体而言,以最低果糖浓度获得的产率非常低:这是因为在这些果糖浓度下乳糖的水解占主导地位。此外,CelB酶是热稳定的,温度最佳为105℃,使得其在工业过程中难以完全失活。
此外,上文迈尔等人的文章中所述的合成方法在pH 5.0下进行。在该pH下进行的方法将不适于在奶组合物中原位进行,因为该pH低于5.5,这是奶中酪蛋白开始形成凝胶的典型水平,从而增加了奶组合物的粘度。
李(Lee)等人,应用微生物学和生物技术(Appl.Microbial Biotechnol.)2004,64,787-793描述了通过其中产生β-半乳糖苷酶的透化乳酸克鲁维酵母细胞从乳糖和果糖酶促生产乳果糖。该方法使用30%w/v至40%w/v(对应于300至400g/L)的乳糖和浓度从10%w/v至20%w/v(对应于100g/L至200g/L)不等的果糖。所获得的产率也低-使用40%w/v乳糖和20%w/v果糖的方法产生了20g/L乳果糖,等于按重量计基于所用糖总量所计算的3.33%乳果糖产率。
金(Kim)等人,酶和微生物技术(Enzyme and Microbial Technology),2006,39,903-908描述了通过来自硫磺矿硫化叶菌的热稳定β-半乳糖苷酶从乳糖和果糖酶促生产乳果糖。该方法使用最少15%w/v乳糖(对应于150g/L)和最少15%w/v果糖(对应于150g/L)。所获得的产率也低-该方法生产50g/L乳果糖,等于按重量计基于所用糖总量所计算的8.33%乳果糖产率。
瓦赫里(Vaheri)和考皮宁(Kauppinen),Fennica药理学报(Acta PharmaceuticaFennica),1978,87,75-83也描述了使用各种不同的β-半乳糖苷酶从乳糖和果糖酶促生产乳果糖。根据这些方法获得的产率也很差-从12%(w/v)乳糖和20%(w/v)果糖起始,实现的最大乳果糖浓度为9g/L,等于基于所用糖的总量所计算的2.8%的产率。
福斯特-弗罗姆等人,国际乳品期刊(International DairyJournal),2011,21,940-948还描述了使用β-半乳糖苷酶从乳糖和果糖用于生产乳果糖的方法。本文档中所述的方法使用了90g/L果糖。然而,这是一项旨在测试乳果糖的双歧杆菌作用的试点研究:高浓度的果糖会使商品变得无法接受地太甜。
格雷罗(Guerrero)等人,分子催化学报B:酶(J.Molec.Catal.B:Enzymatic),2011,72,206-212描述了使用三种不同的商业β-半乳糖苷酶从乳糖和果糖酶促生产乳果糖。然而,本文档中所述的大多数方法在pH 4.5下进行。由于与迈尔等人相关的上述相似的原因,在该pH下进行的方法将不适于在奶组合物中原位进行。本文档中所述的在高于5.5的pH下进行的方法以乳糖:果糖的1:1的摩尔比使用50%w/w总糖(对应于乳糖和果糖均为0.957mol/L)。
亚当萨克(Adamczak)等人,化学论文(Chem Pap.)2009,63,111-116描述了使用两种不同的商业β-半乳糖苷酶从乳糖和果糖酶促生产乳果糖和半乳寡糖。该方法通常在乳清超滤后在渗透液溶液中进行。然而,其中披露的方法使用最少100g/L乳糖。
王(Wang)等人,应用微生物与生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.)2013,97,6167-6180,是关于乳果糖的酶促生产的文献的综述,参照上述亚当萨克等人和格雷罗等人出版物。
因此,现有技术方法教导了使用这种酶促法可实现的乳果糖的产率差,尤其是在低果糖浓度下。尽管在更高的果糖浓度下可以改进产率,但如此高的浓度导致产品超出商业上可接受的甜度水平。因此,本领域需要一种以比现有技术可能的更好的产率而不需要使用高浓度的果糖生产乳果糖的酶促法。
低聚乳果糖,即β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-β-D-呋喃果糖是另一种寡糖,该寡糖是人类不可消化的并且被认为是益生元。还描述了其他健康益处,如预防过敏性疾病,降低癌症风险和增强钙吸收(参见谷口(Taniguchi),Y.等人,生物科学,生物技术和生物化学(Biosci.Biotechnol.Biochem.)2007,71,2766-2773;和寺本(Teramoto),F.等人,营养科学和维生素学杂志(J.Nutr.Sci.Vitaminol.)2006,52,337-346)。由于低聚乳果糖的健康益处和有利特征,其作为食品成分的使用迅速增长,特别是在欧洲和日本。
李(Li)等人,农业食品化学学报(J.Agric.Food Chem.)2009,57描述了使用来自环状芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶从蔗糖和乳糖酶促生产低聚乳果糖。然而,本文中使用的方法都使用最少30%w/v蔗糖和乳糖。此外,李等人似乎指出这种高浓度的蔗糖和乳糖是必需的,以使转半乳糖基化能够进行-在较低浓度的乳糖和/或蔗糖下,预期这些二糖的水解将占主导地位。
韩(Han)等人,微生物学和生物技术杂志(J.Microbial Biotechnol.)2009,19(10),1153-1160还描述了从蔗糖和乳糖酶促生产低聚乳果糖。然而,所使用的酶是果聚糖蔗糖酶,该果聚糖蔗糖酶是果糖基转移酶。
施罗德等人,四面体(Tetrahedron)2004,60,2601-2608描述了使用来自牛睾丸的β-半乳糖苷酶从蔗糖和乳糖酶促生产作为低聚乳果糖的区域异构体的β-D-吡喃半乳糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-β-D-呋喃果糖,以及其他三糖和四糖。然而,本文档中所述的方法都在pH 4.3下进行。由于与迈尔等人相关的上述相似的原因,在该pH下进行的方法将不适于在奶组合物中原位进行。
法卡斯(Farkas)等人,合成(Synthesis)2003,5,699-706描述了使用来自环状芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶从蔗糖和乳糖酶促生产低聚乳果糖以及其他三糖和四糖。然而,本文中用于产生低聚乳果糖的方法使用了最少0.5mol/L的乳糖。
因此,如上文所指出的,现有技术方法教导了高浓度的蔗糖和乳糖是必需的,以使转半乳糖基化能够进行:在较低浓度的乳糖和/或蔗糖下,预期这些二糖的水解将占主导地位。
发明内容
本发明提供了生产包含半乳糖部分和果糖部分的糖类的方法,其中:
(a)该半乳糖部分连接到该果糖部分;或
(b)该半乳糖部分和该果糖部分被除了半乳糖或果糖之外的至少一个单糖部分分隔;
该方法包括:
将第一糖类与第二糖类接触,所述第一糖类包含半乳糖部分,所述第二糖类包含果糖部分,
该第一糖类和第二糖类是不同的,
所述接触在能够催化半乳糖部分转移至包含该果糖部分的第二糖类的酶的存在下进行,
该方法在5.5至9.5的pH下进行;
其条件是
(i)当该半乳糖部分连接到该果糖部分时,该第一糖类的浓度小于0.43mol/L并且该第二糖类的浓度小于0.8mol/L;以及
(ii)当该半乳糖部分和该果糖部分被除了半乳糖或果糖之外的至少一个单糖部分分隔时,该第一糖类的浓度和/或该第二糖类的浓度小于0.5mol/L。
本发明还提供了生产包含半乳糖部分和果糖部分的糖类的方法,其中:
(a)该半乳糖部分连接到该果糖部分;或
(b)该半乳糖部分和该果糖部分被除了半乳糖或果糖之外的至少一个单糖部分分隔;
该方法包括:
将第一糖类与第二糖类接触,所述第一糖类包含半乳糖部分,所述第二糖类包含果糖部分,
该第一糖类和第二糖类是不同的,
所述接触在能够催化半乳糖部分转移至包含该果糖部分的第二糖类的酶的存在下进行,
其中该酶选自由以下各项组成的组:
a)包含与SEQ ID NO:1具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的多肽,其中所述多肽由至多980个氨基酸残基组成;
b)由多核苷酸编码的多肽,该多核苷酸在至少低严格条件下与以下各项杂交:
i)包含在SEQ ID NO:9中的编码SEQ ID NO:1的多肽的核酸序列;或
ii)i)的互补链。
在一方面,本发明提供了生产糖类的方法,在该糖类中半乳糖部分连接到果糖部分,该方法包括:
将第一糖类与第二糖类接触,所述第一糖类包含半乳糖部分,所述第二糖类包含果糖部分,
该第一糖类和第二糖类是不同的,
所述接触在能够催化半乳糖部分转移至包含该果糖部分的第二糖类的酶的存在下进行,
该方法在5.5至9.5的pH下进行;
其中:
该第一糖类的浓度小于0.43mol/L;以及
该第二糖类的浓度小于0.8mol/L。
在一方面,本发明提供了生产糖类的方法,在该糖类中半乳糖部分连接到果糖部分,该方法包括:
将第一糖类与第二糖类接触,所述第一糖类包含半乳糖部分,所述第二糖类包含果糖部分,
该第一糖类和第二糖类是不同的,
所述接触在能够催化半乳糖部分转移至包含该果糖部分的第二糖类的酶的存在下进行,
其中第二糖类的浓度为从0.083至0.472mol/L。
在另一方面,提供了生产糖类的方法,在该糖类中半乳糖部分连接到果糖部分,该方法包括:
将第一糖类与第二糖类接触,所述第一糖类包含半乳糖部分,所述第二糖类包含果糖部分,
该第一糖类和第二糖类是不同的,
所述接触在能够催化半乳糖部分转移至包含该果糖部分的第二糖类的酶的存在下进行,
其中该酶选自由以下各项组成的组:
a)包含与SEQ ID NO:1具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的多肽,其中所述多肽由至多980个氨基酸残基组成;
b)由多核苷酸编码的多肽,该多核苷酸在至少低严格条件下与以下各项杂交:
i)包含在SEQ ID NO:9中的编码SEQ ID NO:1的多肽的核酸序列;或
ii)i)的互补链。
在另一方面,提供了可通过本发明的方法获得的含乳果糖的组合物。
在另一方面,提供了如上定义的酶产生乳果糖的用途。该酶还可用于产生其他糖类,在该糖类中半乳糖部分连接到果糖部分。
在一方面,提供了一种生产包含半乳糖部分和果糖部分的糖类的方法,该半乳糖部分和该果糖部分被除了半乳糖或果糖之外的至少一个单糖部分分隔,该方法包括:
将第一糖类与第二糖类接触,所述第一糖类包含半乳糖部分,所述第二糖类包含果糖部分,
该第一糖类和第二糖类是不同的,
所述接触在能够催化半乳糖部分转移至包含该果糖部分的第二糖类的酶的存在下进行,
其中该第一糖类的浓度和/或该第二糖类的浓度小于0.5mol/L。
在另一方面,提供了一种生产包含半乳糖部分和果糖部分的糖类的方法,该半乳糖部分和该果糖部分被除了半乳糖或果糖之外的至少一个单糖部分分隔,该方法包括:
将第一糖类与第二糖类接触,所述第一糖类包含半乳糖部分,所述第二糖类包含果糖部分,
该第一糖类和第二糖类是不同的,
所述接触在能够催化半乳糖部分转移至包含该果糖部分的第二糖类的酶的存在下进行,
其中该酶选自由以下各项组成的组:
a)包含与SEQ ID NO:1具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的多肽,其中所述多肽由至多980个氨基酸残基组成;
b)由多核苷酸编码的多肽,该多核苷酸在至少低严格条件下与以下各项杂交:
i)包含在SEQ ID NO:9中的编码SEQ ID NO:1的多肽的核酸序列;或
ii)i)的互补链。
在另一方面,提供了如上定义的酶产生低聚乳果糖的用途。
优点和惊人的发现
诸位发明人已经惊奇地发现,甚至可以在低浓度的含果糖的糖类下,从含半乳糖的糖类(特别是乳糖)和含果糖的糖类(特别是果糖)以高产率产生其中半乳糖部分连接到果糖部分的糖类(特别是乳果糖)。这与现有技术的教导相反,因为果糖通常已知在酶促糖类缩合反应中不是良好受体。特别地,预期在低果糖浓度下,乳糖的水解和/或低聚半乳糖的产生将是由酶催化的主要反应,并且认为果糖以高浓度(导致产品超出商业上可接受的甜度水平)存在是朝向乳果糖形成推动平衡所必需的。
诸位本发明人还惊奇地发现,包含半乳糖部分和果糖部分的糖类(其中至少一个其他单糖部分将半乳糖和果糖部分分隔开,特别是低聚乳果糖)可从含半乳糖的糖类(特别是乳糖)和含糖果的糖类(特别是蔗糖),甚至在低浓度的任一种糖类下以高产率产生。这与现有技术的教导相反,因为预期在低乳糖和/或蔗糖浓度下,乳糖和/或蔗糖的水解将是由酶催化的主要反应,并且认为乳糖或蔗糖以高浓度存在是朝向低聚乳果糖形成推动平衡所必需的。
附图简述
图1说明了通过本发明的方法以4.8%(w/v)乳糖和各种浓度的果糖产生的乳果糖的量;
图2说明了通过本发明的方法以7.0%(w/v)乳糖和各种浓度的果糖产生的乳果糖的量;
图3说明了通过本发明的方法以9.0%(w/v)乳糖和各种浓度的果糖产生的乳果糖的量;并且
图4是反应4小时后酶促产生的糖混合物的层析图,1:在30.3min时的乳糖;2:在32.1min时的4-乳果糖;3:在34.5min时的乳果糖异构体反应产物,4:在36.7时的葡萄糖和5:在39.7min时的半乳糖、果糖。
图5是通过实例3中所述方法产生的100μg/ml低聚乳果糖溶液的萃取离子层析图(EIC)的实例,显示未标记的低聚乳果糖(Hex-DP3)(顶部,黑色),然后是在2小时生物转化后取得的并稀释10x的样品中的半乳糖13C12-Hex-DP3-DP6寡聚物(低聚乳果糖Gal-Glu-Fru、半乳糖基-低聚乳果糖Gal-Gal-Glu-Fru、二半乳糖基-低聚乳果糖Gal-Gal-Gal-Glu-Fru和三半乳糖基-低聚乳果糖Gal-Gal-Gal-Gal-Glu-Fru)的EIC;并且
图6显示了13C12-Hex-DP3-6寡聚物的组合的萃取离子层析图,该图显示了在生物转化时间内特征曲线的变化,其中9.3-13.0min的插图显示大于t=2h样品中13C12-Hex-DP3寡聚物的最大存在量,并且在随后的样品中量下降。
序列表
SEQ ID NO:1(在此又称为(BIF_917))是SEQ ID NO:22的887个氨基酸的截短的片段。
SEQ ID NO:2(在此又称为(BIF_995))是SEQ ID NO:22的965个氨基酸的截短的片段。
SEQ ID NO:3(在此又称为(BIF_1068))是SEQ ID NO:22的1038个氨基酸的截短的片段。
SEQ ID NO:4(在此又称为(BIF_1172))是SEQ ID NO:22的1142个氨基酸的截短的片段。
SEQ ID NO:5(在此又称为(BIF_1241))是SEQ ID NO:22的1211个氨基酸的截短的片段。
SEQ ID NO:6(在此又称为(BIF_1326))是SEQ ID NO:22的1296个氨基酸的截短的片段。
SEQ ID NO:7是两歧双歧杆菌糖苷水解酶催化核心
SEQ ID NO:8是编码来自两歧双歧杆菌DSM20215的胞外乳糖酶的核苷酸序列
SEQ ID NO:9是编码BIF_917的核苷酸序列
SEQ ID NO:10是编码BIF_995的核苷酸序列
SEQ ID NO:11是编码BIF 1068的核苷酸序列
SEQ ID NO:12是编码BIF_1172的核苷酸序列
SEQ ID NO:13是编码BIF_1241的核苷酸序列
SEQ ID NO:14是编码BIF_1326的核苷酸序列
SEQ ID NO:15是用于生成上述BIF变体的正向引物
SEQ ID NO:16是BIF917的反向引物
SEQ ID NO:17是BIF995的反向引物
SEQ ID NO:18是BIF1068的反向引物
SEQ ID NO:19是BIF1241的反向引物
SEQ ID NO:20是BIF1326的反向引物
SEQ ID NO:21是BIF1478的反向引物
SEQ ID NO:22是来自两歧双歧杆菌DSM20215的胞外乳糖酶。
SEQ ID NO:23是来自两歧双歧杆菌DSM20215的胞外乳糖酶的信号序列
详细描述
本发明的方法总体上包括将包含半乳糖部分的第一糖类与包含果糖部分的不同的第二糖类接触,这样使得半乳糖部分从第一糖类转移到第二糖类以生产包含半乳糖部分和果糖部分的产物糖类。在一个实施例中,该半乳糖部分连接到该果糖部分。在另一个实施例中,该半乳糖部分和该果糖部分被除了半乳糖或果糖之外的至少一个单糖部分(包括但不限于葡萄糖)分隔。在以下段落中,该第一糖类又被称为“供体”并且第二糖类又被称为“受体”。
糖类
在本说明书中,在其最广泛意义上的术语‘糖类’旨在涵盖所有糖类(糖),包括天然存在的与合成的和半合成的糖类。该术语涵盖单糖(即,不能水解成更简单的糖的糖类)、二糖(即,具有通过糖苷键连接在一起的两个单糖单元(部分)的化合物)、寡糖(即,具有通过糖苷键连接在一起的3至10个单糖单元的、处于支链或不分支的链或环(任选具有糖类侧链)的化合物)、和多糖(即,具有通过糖苷键连接在一起的超过10个单糖单元的、处于支链或不分支的链或环(任选具有糖类侧链)的化合物)。
该糖类可以结合到其他分子,如生物分子,例如肽/蛋白质、脂质和核酸。然而,出于本发明的目的,优选糖类仅由单糖单元形成。
在一个实施例中,该糖类是单糖,即,不能水解成更简单的糖的糖类。该单糖可以具有D-或L-构型,并且可以是醛糖或酮糖。单糖的实例包括己糖,己糖包括己醛糖,如葡萄糖、半乳糖、阿洛糖、阿卓糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖和塔罗糖,以及己酮糖,如果糖、塔格糖、阿洛酮糖和山梨糖;和戊糖,戊糖的实例包括戊醛糖,如核糖、***糖、木糖和来苏糖,以及戊酮糖,如核酮糖和木酮糖。
在可替代的实施例中,该糖类是一种高级糖类,即包括通过糖苷键连接在一起的多于一个单糖部分并且通常可水解成其组成单糖的糖类。这种高级糖类的实例包括二糖(2个单糖部分)、寡糖(3至10个单糖部分)和多糖(多于10个单糖部分)。在这方面,形成高级糖类的单糖部分可以是相同或不同的,并且可以各自独立地具有D-或L-构型,并且可以各自独立地是醛糖或酮糖部分。
形成高级糖类的单糖单元可以具有相同或不同数目的碳原子。在一个实施例中,高级糖类的单糖部分是己糖部分,其实例包括己醛糖,如葡萄糖、半乳糖、阿洛糖、阿卓糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖和塔罗糖,以及己酮糖,如果糖、塔格糖、阿洛酮糖和山梨糖。在另一个实施例中,高级糖类的单糖部分是戊醛糖部分,如核糖、***糖、木糖和来苏糖,以及戊酮糖如核酮糖和木酮糖。
形成高级糖类的单糖部分通过糖苷键连接在一起。当该单糖部分是己糖部分时,糖苷键可以是1,4'-糖苷键(其可以是1,4’-α-或1,4’-β-糖苷键)、1,6'-糖苷键(其可以是1,6’-α-或1,6’-β-糖苷键)、1,2'-糖苷键(其可以是1,2’-α-或1,2’-β-糖苷键)、或1,3'-糖苷键(其可以是1,3’-α-或1,3’-β-糖苷键),及其任何组合。
在一个实施例中,该高级糖类包括2个单糖单元(即,是二糖)。二糖的实例包括乳糖、半乳二糖、麦芽糖、纤维二糖、蔗糖、海藻糖、异麦芽酮糖和海藻酮糖(trehalulose)。在另一个实施例中,高级糖类包括3至10个单糖单元(即,是寡糖)。
第一糖类(供体)
该第一糖类可以是包含能够被转移到含果糖糖类的半乳糖部分的任何糖类。在本发明中,该第一糖类是高级糖类,其中待转移的半乳糖部分通过糖苷键连接一个或多个其他单糖部分(如上定义和示例的)。
在一个实施例中,该第一糖类是乳糖。
在一个实施例中,该第一糖类是低聚半乳糖。低聚半乳糖(GOS)由通过糖苷键连接的半乳糖部分(通常为2至10个半乳糖基部分)的短链组成。在一个实施例中,GOS可以仅包括半乳糖部分,即具有通式(Gal)n,其中n典型地是2至10,如2、3、4、5、6、7,8、9或10)实例包括半乳二糖(Gal-Gal)、半乳三糖(Gal-Gal-Gal)、半乳四糖(Gal-Gal-Gal-Gal)、半乳五糖(Gal-Gal-Gal-Gal-Gal)、以及类似物。在一个实施例中,该GOS可以包括用不同单糖部分(如上定义和示例的)终止的半乳糖部分的链,尤其是葡萄糖部分,即具有通式(Gal)n-Glu,其中n典型地是2至10,如2、3、4、5、6、7、8、9或10):具体实例包括半乳二糖基葡萄糖(Gal-Gal-Glu)、半乳三糖基葡萄糖(Gal-Gal-Gal-Glu)、以及类似物。
该第一糖类以足以允许可测量量的半乳糖部分转移的量存在。精确的浓度根据该第一糖类的性质而变化。在一些实施例(具体地,在最终产物中半乳糖部分和果糖部分是连接的那些实施例)中,该第一糖类的浓度为从0.01至10mol/L;如0.02至5mol/L;如0.05至2mol/L;如0.1至1mol/L、如小于0.5mol/L、如小于0.49mol/L、如小于0.48mol/L、如小于0.47mol/L、如小于0.46mol/L、如小于0.45mol/L、如小于0.44mol/L、如小于0.43mol/L、如小于0.42mol/L、如小于0.41mol/L、如小于0.4mol/L、如小于0.39mol/L、如小于0.38mol/L、如小于0.37mol/L、如小于0.36mol/L、如小于0.35mol/L、如小于0.34mol/L、如小于0.33mol/L、如小于0.32mol/L、如小于0.31mol/L、如小于0.3mol/L、如0.088至0.380mol/L、如0.117至0.292mol/L、如0.132至0.277mol/L、如0.132至0.160mol/L、如0.190至0.220mol/L、如0.249至0.277mol/L。
在一些实施例(具体地,在最终产品中该半乳糖部分和该果糖部分被除了半乳糖或果糖之外的至少一个单糖部分分隔的那些实施例)中,该第一糖类的浓度小于0.5mol/L;如0.001至0.5mol/L;如0.005至0.4mol/L;如0.01至0.25mol/L;如0.05至0.2mol/L、如0.1至0.15mol/L。
在一个实施例(具体地,在最终产物中半乳糖部分和果糖部分是连接的那些实施例)中,该第一糖类是乳糖并且乳糖浓度为小于171.2g/L(0.5mol/L),如小于167.7g/L(0.49mol/L)、如小于164.3g/L(0.48mol/L)、如小于160.9g/L(0.47mol/L)、如小于157.5g/L(0.46mol/L)、如小于154.0g/L(0.45mol/L)、如小于150.6g/L(0.44mol/L)、如小于147.2g/L(0.43mol/L)、如小于143.8g/L(0.42mol/L)、如小于140.3g/L(0.41mol/L)、如小于136.2g/L(0.4mol/L)、如小于133.5g/L(0.39mol/L)、如小于130.1g/L(0.38mol/L)、如小于126.7g/L(0.37mol/L)、如小于123.3g/L(0.36mol/L)、如小于119.8g/L(0.35mol/L)、如小于116.4g/L(0.34mol/L)、如小于113.0g/L(0.33mol/L)、如小于109.5g/L(0.32mol/L)、如小于106.1g/L(0.31mol/L)、如小于102.7g/L(0.3mol/L)、如从30至130g/L(0.088至0.380mol/L)、如40至100g/L(0.117至0.292mol/L)、如45至95g/L(0.132至0.277mol/L)、如45至55g/L(0.132至0.160mol/L)、如65至75g/L(0.190至0.220mol/L)、如85至95g/L(0.249至0.277mol/L)。
在另一个实施例(具体地,在最终产品中该半乳糖部分和该果糖部分被除了半乳糖或果糖之外的至少一个单糖部分分隔的那些实施例)中,该第一糖类是乳糖并且乳糖的浓度小于171.2g/L(0.5mol/L),如小于167.7g/L(0.49mol/L)、如小于164.3g/L(0.48mol/L)、如小于160.9g/L(0.47mol/L)、如小于157.5g/L(0.46mol/L)、如小于154.0g/L(0.45mol/L)、如小于150.6g/L(0.44mol/L)、如小于147.2g/L(0.43mol/L)、如小于143.8g/L(0.42mol/L)、如小于140.3g/L(0.41mol/L)、如小于136.2g/L(0.4mol/L)、如小于133.5g/L(0.39mol/L)、如小于130.1g/L(0.38mol/L)、如小于126.7g/L(0.37mol/L)、如小于123.3g/L(0.36mol/L)、如小于119.8g/L(0.35mol/L)、如小于116.4g/L(0.34mol/L)、如小于113.0g/L(0.33mol/L)、如小于109.5g/L(0.32mol/L)、如小于106.1g/L(0.31mol/L)、如小于102.7g/L(0.3mol/L)、如0.001至0.5mol/L;如0.005至0.4mol/L;如0.01至0.25mol/L;如0.05至0.2mol/L、如0.1至0.15mol/L。
第二糖类(受体)
该第二糖类可以是包含果糖部分并且能够接受来自该第一糖类乳糖部分的任何糖类。第二糖类可以是果糖或高级糖类,其中接受被转移的半乳糖部分的果糖部分通过糖苷键链接到一个或多个其他单糖部分(如上定义和示例的)。
在一个实施例中,该第二糖类是果糖。在一个实施例中,该第一糖类是乳糖并且该第二糖类是果糖,这样使得所产生的糖类是乳果糖。
在一个实施例中,该第二糖类是蔗糖。在一个实施例中,第一糖类是乳糖并且该第二糖类糖是蔗糖,这样使得所产生的糖类是低聚乳果糖。
在一个实施例中,该第一糖类是乳糖并且该第二糖类是乳果糖,这样使得所产生的糖类是半乳糖基-乳果糖(Gal-Gal-Fru)。在一个实施例中,该第一糖类是乳糖并且该第二糖类是半乳糖基-乳果糖,这样使得所产生的糖类具有化学式Gal-Gal-Gal-Fru。这可以重复,以提供具有用果糖部分终止的多达10个半乳糖部分的低聚半乳糖(如上定义的)。
在一个实施例中,该第一糖类是乳糖并且该第二糖类是低聚乳果糖,这样使得所产生的糖类是半乳糖基-低聚乳果糖(Gal-Gal-Glu-Fru)。在一个实施例中,该第一糖类是乳糖并且该第二糖类是半乳糖基-低聚乳果糖,这样使得所产生的糖类是二半乳糖基-低聚乳果糖(Gal-Gal-Gal-Glu-Fru)。在一个实施例中,该第一糖类是乳糖并且该第二糖类是二半乳糖基-低聚乳果糖,这样使得所产生的糖类是三半乳糖基-低聚乳果糖(Gal-Gal-Gal-Gal-Glu-Fru)。这可以重复,以提供具有用连接到果糖部分的葡萄糖部分终止的多达10个半乳糖部分的低聚半乳糖(如上定义的)。
在一个实施例中,该第二糖类是低聚果糖(FOS)。FOS由果糖分子的短链组成,该果糖分子的短链可以任选地用另一种单糖部分,尤其是葡萄糖部分终止。在一个实施例中,该FOS可以单独包括果糖部分,即具有通式(Fru)n,其中n典型地是2至7,如2、3、4、5、6、7)实例包括菊粉二糖(Fru-Fru)、菊粉三糖(inulotriose)(Fru-Fru)、和菊粉四糖(inulotetraose)(Fru-Fru-Fru-Fru)。这些低聚果糖通常是通过菊粉的降解生产的。
在一个实施例中,该FOS可包括用不同的单糖部分(如上定义和示例的),尤其是葡萄糖部分终止的果糖部分,如具有通式Glu-(Fru)n的那些,其中n通常为1至7,如1、2、3、4、5、6或7、8、9或10):具体实例包括蔗糖(Glu-Fru)、蔗果三糖(Glu-Fru-Fru)、蔗果四糖(nystose)(Glu-Fru-Fru-Fru)、蔗果五糖(fructosylnystose)(Glu-Fru-Fru-Fru-Fru)以及类似物。在本实施例中,本发明的方法可能会使半乳糖部分与葡萄糖或果糖部分形成键。优选地,本发明的方法使半乳糖部分与葡萄糖部分形成键。
该第二糖类以足以允许可测量量的半乳糖部分转移的量存在。精确的浓度根据该第二糖类的性质而变化。在一些实施例(具体地,在最终产物中半乳糖部分和果糖部分是连接的那些实施例)中,该第二糖类的浓度为从0.01至10mol/L;如0.02至5mol/L;如0.05至2mol/L;如0.1至1mol/L;如0.02至0.5mol/L。在一些实施例中,该第二糖类浓度是小于0.8mol/L,如小于0.79mol/L、如小于0.78mol/L、如小于0.77mol/L、如小于0.76mol/L、如小于0.75mol/L、如小于0.74mol/L、如小于0.73mol/L、如小于0.72mol/L、如小于0.71mol/L、如小于0.7mol/L、如小于0.69mol/L、如小于0.68mol/L、如小于0.67mol/L、如小于0.66mol/L、如小于0.65mol/L、如小于0.64mol/L、如小于0.63mol/L、如小于0.62mol/L、如小于0.61mol/L、如小于0.6mol/L、如小于0.59mol/L、如小于0.58mol/L、如小于0.57mol/L、如小于0.56mol/L、如小于0.55mol/L、如小于0.54mol/L、如小于0.53mol/L、如小于0.52mol/L、如小于0.51mol/L、如小于0.5mol/L、如小于0.49mol/L、如小于0.48mol/L、如小于0.47mol/L、如小于0.46mol/L、如小于0.45mol/L、如小于0.44mol/L、如小于0.43mol/L、如小于0.42mol/L、如小于0.41mol/L、如小于0.4mol/L、如小于0.39mol/L、如小于0.38mol/L、如小于0.37mol/L、如小于0.36mol/L、如小于0.35mol/L、如小于0.34mol/L、如小于0.33mol/L、如小于0.32mol/L、如小于0.31mol/L、如小于0.3mol/L。在一些实施例中,该第二糖类浓度大于0.1mol/L,如大于0.11mol/L、如大于0.12mol/L、如大于0.13mol/L、如大于0.14mol/L、如大于0.15mol/L、如大于0.16mol/L、如大于0.17mol/L、如大于0.18mol/L、如大于0.19mol/L、如大于0.2mol/L、如大于0.21mol/L、如大于0.22mol/L、如大于0.23mol/L、如大于0.24mol/L、如大于0.25mol/L、如大于0.26mol/L、如大于0.27mol/L。在一些实施例中,该第二糖类浓度是0.083至0.472mol/L。在一些实施例中,该第二糖类浓度是0.278至0.444mol/L。
在本发明的一些实施例(具体地,在最终产物中半乳糖部分和果糖部分是连接的那些实施例)中,该第二糖类是果糖并且该果糖的浓度小于0.8mol/L,如小于0.79mol/L、如小于0.78mol/L、如小于0.77mol/L、如小于0.76mol/L、如小于0.75mol/L、如小于0.74mol/L、如小于0.73mol/L、如小于0.72mol/L、如小于0.71mol/L、如小于0.7mol/L、如小于0.69mol/L、如小于0.68mol/L、如小于0.67mol/L、如小于0.66mol/L、如小于0.65mol/L、如小于0.64mol/L、如小于0.63mol/L、如小于0.62mol/L、如小于0.61mol/L、如小于0.6mol/L、如小于0.59mol/L、如小于0.58mol/L、如小于0.57mol/L、如小于0.56mol/L、如小于0.55mol/L、如小于0.54mol/L、如小于0.53mol/L、如小于0.52mol/L、如小于0.51mol/L、如小于0.5mol/L、如小于0.49mol/L、如小于0.48mol/L、如小于0.47mol/L、如小于0.46mol/L、如小于0.45mol/L、如小于0.44mol/L、如小于0.43mol/L、如小于0.42mol/L、如小于0.41mol/L、如小于0.4mol/L、如小于0.39mol/L、如小于0.38mol/L、如小于0.37mol/L、如小于0.36mol/L、如小于0.35mol/L、如小于0.34mol/L、如小于0.33mol/L、如小于0.32mol/L、如小于0.31mol/L、如小于0.3mol/L。在一些实施例中,果糖的浓度为15至85g/L(0.083至0.472mol/L),如20至80g/L(0.111至0.444mol/L)、如45至85g/L(0.25至0.472mol/L)、如50至80g/L(0.278至0.444mol/L)、如45至55g/L(0.25至0.306mol/L)、如55至65g/L(0.306至0.361mol/L)、如65至75g/L(0.361至0.417mol/L)、如75至85g/L(0.417至0.472mol/L)。已经令人惊讶地发现,甚至可以在低浓度果糖下进行将半乳糖部分至果糖的酶促转移。这与现有技术的教导相反,因为预期在低浓度果糖下,其他反应(通常水解第一糖类和/或产生低聚半乳糖)将是由酶催化的主要反应。
在一些实施例(具体地,在最终产品中该半乳糖部分和该果糖部分被除了半乳糖或果糖之外的至少一个单糖部分分隔的那些实施例)中,该第二糖类的浓度小于0.5mol/L;如0.001至0.5mol/L;如0.005至0.4mol/L、如0.01至0.35mol/L、如0.1至0.3mol/L、如0.15至0.2mol/L。
在一些实施例(具体地,在最终产品中该半乳糖部分和该果糖部分被除了半乳糖或果糖之外的至少一个单糖部分分隔的那些实施例)中,该第二糖类是蔗糖并且蔗糖的浓度小于0.5mol/L、小于171.2g/L(0.5mol/L),如小于167.7g/L(0.49mol/L)、如小于164.3g/L(0.48mol/L)、如小于160.9g/L(0.47mol/L)、如小于157.5g/L(0.46mol/L)、如小于154.0g/L(0.45mol/L)、如小于150.6g/L(0.44mol/L)、如小于147.2g/L(0.43mol/L)、如小于143.8g/L(0.42mol/L)、如小于140.3g/L(0.41mol/L)、如小于136.2g/L(0.4mol/L)、如小于133.5g/L(0.39mol/L)、如小于130.1g/L(0.38mol/L)、如小于126.7g/L(0.37mol/L)、如小于123.3g/L(0.36mol/L)、如小于119.8g/L(0.35mol/L)、如小于116.4g/L(0.34mol/L)、如小于113.0g/L(0.33mol/L)、如小于109.5g/L(0.32mol/L)、如小于106.1g/L(0.31mol/L)、如小于102.7g/L(0.3mol/L)。在一些实施例中,蔗糖的浓度大于3.4g/L(0.01mol/L),如大于6.8g/L(0.02mol/L)、如大于10.3g/L(0.03mol/L)、如大于13.7g/L(0.04mol/L)、如大于17.1g/L(0.05mol/L)、如大于20.5g/L(0.06mol/L)、如大于24.0g/L(0.07mol/L)、如大于27.3g/L(0.08mol/L)、如大于30.8g/L(0.09mol/L)、如大于34.2g/L(0.1mol/L)、如大于37.7g/L(0.11mol/L)、如大于41.1g/L(0.12mol/L)、如大于44.5g/L(0.13mol/L)、如大于47.9g/L(0.14mol/L)、如大于51.3g/L(0.15mol/L)、如0.001至0.5mol/L;如0.005至0.4mol/L、如0.01至0.35mol/L、如0.1至0.3mol/L、如0.15至0.2mol/L。
酶
本发明中使用的酶没有特别限定,只要它能够催化将半乳糖部分从含半乳糖的第一糖类(尤其是乳糖)转移到含果糖的第二糖类(尤其是果糖)即可。能够催化将半乳糖部分从含半乳糖基的糖类转移至除水以外的分子(特别是第二糖类)的酶通常被称为“转半乳糖基酶”。可通过如WO 2013/182686中所述的HPLC定量或酶促测定来测量转半乳糖基化活性。
除了其转半乳糖基酶活性之外,该酶可能具有其他副活性。典型的副活性包括糖类水解酶活性(例如在糖类中水解糖苷键的能力,该糖类尤其是含半乳糖的第一糖类和/或含果糖的第二糖类);蛋白酶活性;脂肪酶活性;磷脂酶活性。优选地,酶的相对转半乳糖酶活性包括至少50%,如至少60%、如至少70%、如至少75%、如至少80%、如至少85%、如至少90%、如至少95%、如至少97%、如至少98%、如至少99%的酶总活性。在本文中,术语“转半乳糖基化活性”意指将半乳糖部分转移至除水以外的分子。该活性可以测量为[葡萄糖]-在反应期间在任何给定时间处产生的[半乳糖]或通过直接定量在反应期间的任何给定时间处产生的GOS来测量。然后可以将相对转半乳糖基化活性计算为([葡萄糖]-[半乳糖])/[葡萄糖]x 100。测量葡萄糖和半乳糖浓度的手段是本领域技术人员已知的或是在WO2013/182686中已知的。
在一个实施例中,酶是β-半乳糖苷酶。β-半乳糖苷酶是催化β-半乳糖苷水解成单糖的水解酶。这些酶在酶分类法(E.C.)中通常被分类为3.2.1.23。
在一个实施例中,该酶是细菌来源或真菌来源的。在一个实施例中,该酶是细菌来源的。在一个实施例中,该酶是双歧杆菌属来源的。在一个实施例中,该酶是两歧双歧杆菌来源的。
在一个实施例中,该酶选自由以下各项组成的组:
a)具有转半乳糖基化活性、包含与SEQ ID NO:1具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的多肽,其中所述多肽由至多980个氨基酸残基组成
b)由多核苷酸编码的多肽,该多核苷酸在至少低严格条件下与以下各项杂交:i)包含在SEQ ID NO:9中的编码SEQ ID NO:1的多肽的核酸序列;或ii)i)的互补链。WO 2013/186286中总体上并具体地披露了这些酶。
在一个实施例(具体地,在最终产物如乳果糖中半乳糖部分和果糖部分是连接的那些实施例)中,酶的浓度合适地为500至10,000单位的酶活性(U)/kg组合物(其中发生转半乳糖基化反应)。优选地,酶的浓度为1000至5000单位的酶活性(U)/kg组合物。根据WO2013/186286中披露为方法4的测定来测量这种酶活性单位,并且本文再现为实例4,方法4。
在一个实施例中,当该反应在奶组合物中原位进行时,酶的浓度适合地为500至10,000单位的酶活性(U)/升的奶组合物。优选地,酶的浓度为1000至5000单位的酶活性(U)/升的奶组合物。
在一个实施例(具体地,在最终产物如低聚乳果糖中半乳糖部分和果糖部分被除了半乳糖或果糖之外的至少一个单糖部分分隔的那些实施例)中,酶的浓度合适地为500至10,000单位的酶活性(U)/kg组合物(其中发生转半乳糖基化反应)。优选地,酶的浓度为1000至5000单位的酶活性(U)/kg组合物。根据WO 2013/186286中披露为方法4的测定来测量这种酶活性单位,并且本文再现为实例4,方法4。
在一个实施例中,当该反应在奶组合物中原位进行时,酶的浓度适合地为500至10,000单位的酶活性(U)/升的奶组合物。优选地,酶的浓度为1000至5000单位的酶活性(U)/升的奶组合物。
在一个实施例(具体地,在最终产物如乳果糖中半乳糖部分和果糖部分是连接的那些实施例)中,酶的浓度合适地为0.2至4g纯酶蛋白/kg组合物(其中发生转半乳糖基化反应)。优选地,酶的浓度为0.4至2g纯酶蛋白/kg组合物。
在本实施例中,当该反应在奶组合物中原位进行时,酶的浓度适合地为0.2至4g纯酶蛋白/升的奶组合物。优选地,酶的浓度为0.4至2g纯酶蛋白/升的奶组合物。
在一个实施例(具体地,在最终产物如低聚乳果糖中半乳糖部分和果糖部分被除了半乳糖或果糖之外的至少一个单糖部分分隔的那些实施例)中,酶的浓度合适地为0.2至4g纯酶蛋白/kg组合物(其中发生转半乳糖基化反应)。优选地,酶的浓度为0.4至2g纯酶蛋白/kg组合物。
在本实施例中,当该反应在奶组合物中原位进行时,酶的浓度适合地为0.2至4g纯酶蛋白/升的奶组合物。优选地,酶的浓度为0.4至2g纯酶蛋白/升的奶组合物。
在一方面,本文披露了具有转半乳糖基化活性的多肽,该多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少90%序列同一性的氨基酸序列,并且其中当在包括编码所述多肽的核酸的合适宿主菌株(例如,枯草芽孢杆菌)中表达产物时,所述多肽是所述核酸序列中唯一表现出转半乳糖基化活性的多肽表达产物。
在一方面,在此披露了选自由以下各项组成的组的、具有转半乳糖基化活性的多肽:
a.包含与SEQ ID NO:1具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的多肽,其中所述多肽由至多980个氨基酸残基组成,
b.包含与SEQ ID NO:2具有至少97%序列同一性的氨基酸序列的多肽,其中所述多肽由至多975个氨基酸残基组成,
c.包含与SEQ ID NO:3具有至少96.5%序列同一性的氨基酸序列的多肽,其中所述多肽由至多1300个氨基酸残基组成,
d.由多核苷酸编码的多肽,该多核苷酸在至少低严格条件下与以下各项杂交i)包括在SEQ ID NO:9、10、11、12或13中的编码SEQ ID NO:1、2、3、4、或5的多肽的核酸序列;或ii)i)的互补链,
e.由包含如下各项的多核苷酸编码的多肽:与编码SEQ ID NO:1、2、3、4或5的多肽的核苷酸序列具有至少70%同一性的核苷酸序列,或包含在SEQ ID NO:9、10、11、12或13中的编码成熟多肽的核苷酸序列,和
f.包括SEQ ID NO:1、2、3、4或5的一个或多个氨基酸残基的缺失、***和/或保守取代的多肽。
在另一方面,本文披露了选自由以下各项组成的组的、具有转半乳糖基化活性的多肽:
a.包含与SEQ ID NO:3具有至少96.5%序列同一性的氨基酸序列的多肽,其中所述多肽由至多1300个氨基酸残基组成,
b.包含与SEQ ID NO:1具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的多肽,其中所述多肽由至多980个氨基酸残基组成,
c.由多核苷酸编码的多肽,该多核苷酸在至少低严格条件下与以下各项杂交i)包括在SEQ ID NO:9、10、11、12或13中的编码SEQ ID NO:1、2、3、4、或5的多肽的核酸序列;或ii)i)的互补链,
d.由包含如下各项的多核苷酸编码的多肽:与编码SEQ ID NO:1、2、3、4或5的多肽的核苷酸序列具有至少70%同一性的核苷酸序列,或包含在SEQ ID NO:9、10、11、12或13中的编码成熟多肽的核苷酸序列,和
e.包括SEQ ID NO:1、2、3、4或5的一个或多个氨基酸残基的缺失、***和/或保守取代的多肽。
在一方面,本文披露了多肽,该多肽是SEQ ID NO:22的具有转半乳糖基化活性的C-末端截短的片段,并且当在适合的有机体(如枯草芽孢杆菌)中生产时,对于进一步截短、如通过蛋白水解降解而言,该多肽是稳定的,和/或在最终配制后的储存期间,对于进一步截短而言,该多肽是稳定的。
在一方面,本文披露了包含与SEQ ID NO:1具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的多肽,其中所述多肽由至多980个氨基酸残基组成。
在一方面,本文披露了包含与SEQ ID NO:2具有至少97%序列同一性的氨基酸序列的多肽,其中所述多肽由至多975个氨基酸残基组成。
在一方面,本文披露了包含与SEQ ID NO:3具有至少96.5%序列同一性的氨基酸序列的多肽,其中所述多肽由至多1300个氨基酸残基组成。
在一方面,本文披露了能够编码如本文所述多肽的核酸。
在一方面,本文披露了包含如本文所述核酸或能够表达如本文所述多肽的表达载体和/或质粒。
在一方面,本文披露了能够表达如本文所述多肽的细胞。
术语“分离的”意指该多肽至少实质上不含与该序列在自然界中天然缔合或者在自然界中存在的至少一种其他组分。在一方面,如在此所用“分离的多肽”是指如通过SDS-PAGE确定的是至少30%纯、至少40%纯、至少60%纯、至少80%纯、至少90%纯、和至少95%纯的多肽。
术语“实质上纯的多肽”在此意指包含按重量计至多10%,优选至多8%,更优选至多6%,更优选至多5%,更优选至多4%,至多3%,甚至更优选至多2%,最优选至多1%,并且甚至最优选至多0.5%的与其天然缔合的其他多肽材料的多肽制剂。因此,优选的是该实质上纯的多肽是按制剂中存在的所有的多肽材料的重量计至少92%纯,优选至少94%纯,更优选至少95%纯,更优选至少96%纯,更优选至少96%纯,更优选至少97%纯,更优选至少98%纯,甚至更优选至少99%纯,最优选至少99.5%纯,并且甚至最优选100%纯的。在此披露的多肽优选处于实质上纯的形式。特别地,优选的是这些多肽是“基本上纯的形式”,即多肽制剂基本上不含与其天然缔合的其他多肽材料。例如,这可以通过熟知的重组方法或通过经典的纯化方法制备多肽来完成。在此,术语“实质上纯的多肽”与术语“分离的多肽”和“处于分离形式的多肽”同义。
术语“纯化”或“纯”意指给定的组分以高水平状态存在-例如,至少约51%纯如至少51%纯,或至少约75%如至少75%纯,或至少约80%如至少80%纯,或至少约90%如至少90%纯,或至少约95%如至少95%纯,或至少约98%如至少98%纯。希望的是,该组分是组合物中存在的主要活性组分。
关于本发明的术语“微生物”包括任何“微生物”,该任何“微生物”可以包括根据本发明所述的核苷酸序列或编码具有如在此定义的特定特性的多肽的核苷酸序列和/或由其获得的产物。在上下文中,“微生物”可以包括能够发酵乳基质的任何细菌或真菌。
关于本发明的术语“宿主细胞”包括任何细胞,该任何细胞包括编码具有如在此定义的特定特性的多肽的核苷酸序列或如上所述的并用于生产具有如在此定义的特定特性的多肽的表达载体。在一方面,生产是重组生产。
在上下文中,术语“Pfam结构域”意指基于多重序列比对和隐马尔可夫基序的存在,被鉴定为Pfam-A或Pfam-B的蛋白质序列内的区域(“Pfam蛋白家族数据库(The Pfam protein families database)”:R.D.芬恩(Finn),J.米斯特里(Mistry),J.塔特(Tate),P.柯吉尔(Coggill),A.赫格尔(Heger),J.E.普林顿(Pollington),O.L.加文(Gavin),P.古恩赛卡伦(Gunesekaran),G.赛利克(Ceric),K.福斯隆德(Forslund),L.霍尔姆(Holm),E.L.松哈默(Sonnhammer),S.R.艾迪(Eddy),A.贝特曼(Bateman),核酸研究(Nucleic AcidsResearch)(2010),数据库专辑38:D211-222)。作为Pfam结构域的实例,可以提及Glyco_hydro2N(PF02837)、Glyco_hydro(PF00703)、Glyco_hydro 2C(PF02836)和细菌Ig样结构域(组4)(PF07532)。
如本文所使用的,“对应于位置......的位置”意指在特定查询多肽和参照多肽之间进行如本文所述的比对。然后将对应于参照多肽中特定位置的位置鉴定为比对中具有最高序列同一性的相应氨基酸。
“一种或多种变体”是指多肽或核酸。术语“变体”可以与术语“突变体”互换使用。变体分别在氨基酸或核苷酸序列中的一个或多个位置处包括***、取代、颠换、截短和/或倒位。短语“变体多肽”、“多肽变体”、“多肽”、“变体”和“变体酶”意指具有氨基酸序列的多肽/蛋白质,该氨基酸序列具有或包含如SEQ ID NO:1、2、3、4或5的所选氨基酸序列或与所选择的氨基酸序列相比是经修饰的。
如本文所使用的,“参照酶”、“参照序列”、“参照多肽”意指任何变体多肽所基于的酶和多肽,例如SEQ ID NO:1、2、3、4或5。“参照核酸”意指编码参照多肽的核酸序列。
如本文所使用的,术语“参照序列”和“主题序列”可互换使用。
如本文所使用的,“查询序列”意指与参照序列比对以查看其是否落入本发明的范围内的外来序列。因此,这种查询序列可以例如是现有技术序列或第三方序列。
如本文所使用的,取决于上下文,术语“序列”可以指多肽序列或核酸序列。
如本文所使用的,术语“多肽序列”和“氨基酸序列”可互换使用。
“变体”的信号序列可以相同或可以不同于野生型芽孢杆菌属信号肽的信号序列或将分泌多肽的任何信号序列。变体可以表达为包含异源多肽的融合蛋白。例如,变体可以包含另一种蛋白质的信号肽或设计用于帮助鉴定或纯化所表达的融合蛋白的序列,如His-标签序列。
为了描述预期被本披露涵盖的各种变体,将采用以下命名法以便于参考。在取代包括数字和字母时,例如592P,则这是指{根据编号***的位置/取代的氨基酸}。因此,例如,将位置592处的氨基酸被脯氨酸取代表示为592P。在取代包括字母、数字、和字母时,例如D592P,则这是指{原始氨基酸/根据编号***的位置/取代的氨基酸}。
因此,例如,用脯氨酸取代位置592处的丙氨酸被表示为A592P。
在具***置处可能有两个或更多个取代时,这将由连续的字母表示,其可以任选地用斜线符号“/”分隔,例如,G303ED或G303E/D。
参照例如SEQ ID NO:1、2、3、4或5,列出位置和取代。例如,可以通过将该序列与SEQ ID NO:1、2、3、4或5进行比对以找到具有最高百分比同一性的比对,并且然后确定哪个氨基酸对应于SEQ ID NO:1、2、3、4或5的特定位置的氨基酸,来找到另一个序列中的等同位置。作为第一参照的一个序列的这种比对和使用对于本领域普通技术人员来说仅仅是常规问题。
如在此所用,术语“表达”是指基于基因的核酸序列产生多肽的过程。此过程包括转录和翻译。
如本文所使用的,“多肽”可与术语“氨基酸序列”、“酶”、“肽”和/或“蛋白质”互换使用。如本文所使用的,“核苷酸序列”或“核酸序列”是指寡核苷酸序列或多核苷酸序列及其变体、同系物、片段及衍生物。无论是代表正义链还是反义链,核苷酸序列可以是基因组、合成或重组来源的,并且可以是双链或单链的。如本文所使用的,术语“核苷酸序列”包括基因组DNA、cDNA、合成DNA和RNA。
“同系物”意指与主题氨基酸序列和主题核苷酸序列具有一定程度的同一性或“同源性”的实体。在一方面,主题氨基酸序列是SEQ ID NO:1、2、3、4或5,并且主题核苷酸序列优选地是SEQ ID NO:9、10、11、12或13。
“同源序列”包括与另一序列具有一定百分比,例如80%、85%、90%、95%或99%的序列同一性的多核苷酸或多肽。百分比同一性意指比对时,当比较两个序列时,相同的碱基或氨基酸残基的百分比。当与主题序列相比,取代、缺失或添加了氨基酸时氨基酸序列是不同一的。通常相对于主题蛋白质的成熟序列,即,例如,除去信号序列后,测量百分比序列同一性。通常,同系物将包含与主题氨基酸序列相同的活性位点残基。尽管同系物可能具有不同于野生型的酶性质,但同系物仍保留了酶活性。
如本文所使用的,“杂交”包括核酸链通过碱基配对与互补链连接的过程,以及如在聚合酶链反应(PCR)技术中进行的扩增过程。变体核酸可以单链或双链DNA或RNA、RNA/DNA异源双链或RNA/DNA共聚物存在。如本文所使用的,“共聚物”是指包含核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的单个核酸链。可以将变体核酸进行密码子优化以进一步增加表达。
如本文所使用的,通过体外化学或酶促合成产生“合成的”化合物。其包括但不限于:用针对所选择的宿主有机体(如酵母细胞宿主或其他表达宿主)的最佳密码子使用制备的变体核酸。
如在此所用,“转化的细胞”包括已经通过使用重组DNA技术转化的细胞,包括细菌和真菌细胞。转化通常通过将一个或多个核苷酸序列***细胞而发生。所***的核苷酸序列可以是异源核苷酸序列,即,对于待转化的细胞不是天然的序列,如融合蛋白。
如在此所用,“可操作地连接”意指所描述的组分处于允许它们以其预期方式起作用的关系。例如,将可操作地连接到编码序列的调控序列以如下这样方式连接:在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。
如本文所使用的,术语“片段”在此定义为从氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(若干个)氨基酸的多肽,其中该片段具有活性。
在一方面,术语“片段”在此定义为从SEQ ID NO:1、2、3、4或5的多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(若干个)氨基酸的多肽;其中该片段具有转半乳糖基化活性。
如本文所使用的,术语“半乳糖结合结构域样”缩写为术语“GBD”并可与术语“GBD”互换。
同一性程度
两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联性由参数“同一性”描述。
在一个实施例中,通过以下方式来确定查询序列与参考序列之间的序列同一性程度:1)通过使用默认评分矩阵和默认空位罚分的任何合适的比对程序来比对两种序列,2)鉴别精确匹配的数量,其中精确匹配是比对程序已经在比对的给定位置处鉴别出两个比对序列中的同一的氨基酸或核苷酸,以及3)将精确匹配的数目除以参考序列的长度。
在一个实施例中,通过以下方式来确定查询序列与参考序列之间的序列同一性程度:1)通过使用默认评分矩阵和默认空位罚分的任何合适的比对程序来比对两种序列,2)鉴别精确匹配的数量,其中精确匹配是其中比对程序已经在比对的给定位置处鉴别出两个比对序列中的同一的氨基酸或核苷酸,以及3)将精确匹配的数目除以两个序列中最长的长度。
在另一个实施例中,通过以下方式来确定查询序列与参考序列之间的序列同一性程度:1)通过使用默认评分矩阵和默认空位罚分的任何合适的比对程序来比对两种序列,2)鉴别精确匹配的数量,其中精确匹配是其中比对程序已经在比对的给定位置处鉴别出两个比对序列中的同一的氨基酸或核苷酸,以及3)将精确匹配数目除以“比对长度”,其中该比对长度是包括序列的空位和突出部分的整个比对的长度。
序列同一性比较可以通过眼睛,或更通常地借助于容易获得的序列比较程序进行。这些商业可得的计算机程序使用复杂的比较算法来比对两个或更多个序列,其最好地反映出可能导致两个或更多个序列之间的一个或多个差异的进化事件。因此,这些算法使用评分***进行操作,评分***奖励同一或相似氨基酸的比对,并惩罚空位的***,空位延伸和不相似氨基酸的比对。比较算法的评分***包括:
i)每当***空位时指定罚分(空位罚分)
ii)每当现有的空位用额外的位置扩大时指定罚分(延伸罚分),
iii)当比对同一的氨基酸时指定高分,以及
iv)当比对非同一的氨基酸时指定可变分数。
大多数比对程序允许修改空位罚分。然而,当使用这种序列比较软件时优选使用默认值。
对于非同一的氨基酸的比对给出的得分是根据评分矩阵(也称作取代矩阵)指定的。在所述取代矩阵中提供的得分所反映的事实是:进化过程中一个氨基酸被另一个所取代的可能性是变化的并且其取决于将被取代的氨基酸的物理/化学性质。例如,与被疏水性氨基酸取代相比,极性氨基酸被另一极性氨基酸取代的可能性更高。因此,评分矩阵将为同一的氨基酸指定最高分数,为非同一但相似的氨基酸指定较低分数,并且为非同一的不相似氨基酸指定甚至更低分数。最常用的评分矩阵是PAM矩阵(戴霍夫(Dayhoff)等人,(1978),琼斯(Jones)等人,(1992))、BLOSUM矩阵(亨尼科夫(Henikoff)和亨尼科夫(1992))和贡内特(Gonnet)矩阵(贡内特等人,(1992))。
用于进行这种比对的合适的计算机程序包括但不限于Vector NTI(英杰公司(Invitrogen Corp.))和ClustalV,ClustalW和ClustalW2程序(希金斯(Higgins)DG和夏普(Sharp)PM(1988),希金斯等人(1992),汤普森(Thompson)等人(1994),拉金(Larkin)等人(2007))。可从位于www.expasy.org的ExPASy蛋白质组服务器(Proteomics server)获得不同比对工具的选择。可以执行序列比对的软件的另一个实例是BLAST(基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool)),该BLAST可从美国国家生物技术信息中心的网页获得,该网页目前可以在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/找到,并且该BLAST首先在阿尔丘尔等人(1990)分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)215;403-410中进行了描述。
在本发明的一个优选实施例中,该比对程序正在执行全局比对程序,其优化了全长序列的比对。在另一个优选实施例中,全局比对程序是基于尼德尔曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(尼德尔曼,索尔(Saul)B.;和翁施,克里斯蒂安(Christian)D.(1970),“适用于搜索两种蛋白质氨基酸序列相似性的一般方法(A general method applicable to thesearch for similarities in the amino acid sequence of two proteins)”,分子生物学杂志(Journal of Molecular Biology)48(3):443-53)。使用尼德尔曼-翁施算法执行全局比对的当前程序的实例是EMBOSS Needle和EMBOSS Stretcher程序,两者均可以在http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/上获得。
EMBOSS Needle使用德尔曼-翁施比对算法执行最佳全局序列比对,以沿其整个长度找到两个序列的最佳比对(包括空位)。
EMBOSS Stretcher使用德尔曼-翁施算法的修改版,该修改版允许更大序列进行全局比对。
在一个实施例中,通过全局比对程序对序列进行比对,并且通过鉴别由程序鉴别的精确匹配数目除以“比对长度”来计算序列同一性,其中比对长度是包括序列的空位和突出部分的整个比对的长度。
在另一个实施例中,全局比对程序使用德尔曼-翁施算法,并且通过鉴别由程序鉴别的精确匹配数目除以“比对长度”来计算序列同一性,其中比对长度是包括序列的空位和突出部分的整个比对的长度。
在又另一个实施例中,全局比对程序选自由以下各项组成的组:EMBOSS Needle和EMBOSS stretcher,并且通过鉴别由程序鉴别的精确匹配数目除以“比对长度”来计算序列同一性,其中比对长度是包括序列的空位和突出部分的整个比对的长度。
一旦软件生成了比对,就可以计算出相似度%和序列同一性%。该软件通常进行这种计算作为序列比较的一部分,并产生数值结果。
在一个实施例中,优选使用ClustalW软件来执行序列比对。优选地,使用以下成对比对的参数进行采用ClustalW的比对:
取代矩阵: | Gonnet 250 |
空位开放罚分: | 20 |
空位延伸罚分: | 0.2 |
空位终止罚分: | 无 |
例如,ClustalW2可以在互联网上由欧洲生物信息学研究所在EMBL-EBI网页www.ebi.ac.uk的工具-序列分析-ClustalW2下获得。目前,ClustalW2工具的确切地址是www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2。
在另一个实施例中,优选使用Vector NTI(英杰公司)中的程序Align X进行序列比对。在一个实施例中,Exp10可以与默认设置一起使用:
空位开放罚分:10
空位延伸罚分:0.05
空位分离罚分范围:8
在另一个实施例中,通过使用分数矩阵:blosum62mt2和VectorNTI成对比对设置来确定一个氨基酸序列与,或相对于,另一个氨基酸序列的比对设置
K-元组 1
最佳对角线数 5
窗口大小 5
空位罚分 3
空位开放罚分 10
空位延伸罚分 0,1
在一个实施例中,通过使用字号为3并且使用BLOSUM 62作为取代矩阵的Blast来确定一个氨基酸序列与,或相对于,另一个氨基酸序列的同一性的百分比
多肽
在一方面,本文披露了等于或高于3%w/w初始乳糖浓度的具有如下转半乳糖基化活性:β-半乳糖苷酶活性的比率的多肽:至少0.5、至少1、至少2、至少2.5、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、或至少12。
在一方面,本文披露了多肽,其中糖苷水解酶催化核心具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
在一方面,本文披露了包含Glyco_hydro2N(PF02837)、Glyco_hydro(PF00703)和/或Glyco_hydro 2C(PF02836)结构域的多肽。
在一方面,在此披露了包含细菌Ig样结构域(组4)(PF07532)的多肽。
在一方面,在此披露了选自由以下各项组成的组的、具有转半乳糖基化活性的多肽:
a.包含与SEQ ID NO:1具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的多肽,其中所述多肽由至多980个氨基酸残基组成,
b.包含与SEQ ID NO:2具有至少97%序列同一性的氨基酸序列的多肽,其中所述多肽由至多975个氨基酸残基组成,
c.包含与SEQ ID NO:3具有至少96.5%序列同一性的氨基酸序列的多肽,其中所述多肽由至多1300个氨基酸残基组成,
d.由多核苷酸编码的多肽,该多核苷酸在至少低严格条件下与以下各项杂交i)包括在SEQ ID NO:9、10、11、12或13中的编码SEQ ID NO:1、2、3、4或5的多肽的核酸序列;或ii)i)的互补链,
e.由包含如下各项的多核苷酸编码的多肽:与编码SEQ ID NO:1、2、3、4或5的多肽的核苷酸序列具有至少70%同一性的核苷酸序列,或包含在SEQ ID NO:9、10、11、12或13中的编码成熟多肽的核苷酸序列,和
f.包括SEQ ID NO:1、2、3、4或5的一个或多个氨基酸残基的缺失、***和/或保守取代的多肽。
在另一方面,本文披露了选自由以下各项组成的组的、具有转半乳糖基化活性的多肽:
a.包含与SEQ ID NO:3具有至少96.5%序列同一性的氨基酸序列的多肽,其中所述多肽由至多1300个氨基酸残基组成,
b.包含与SEQ ID NO:1具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的多肽,其中所述多肽由至多980个氨基酸残基组成,
c.由多核苷酸编码的多肽,该多核苷酸在至少低严格条件下与以下各项杂交i)包括在SEQ ID NO:9、10、11、12或13中的编码SEQ ID NO:1、2、3、4、或5的多肽的核酸序列;或ii)i)的互补链,
d.由包含如下各项的多核苷酸编码的多肽:与编码SEQ ID NO:1、2、3、4或5的多肽的核苷酸序列具有至少70%同一性的核苷酸序列,或包含在SEQ ID NO:9、10、11、12或13中的编码成熟多肽的核苷酸序列,和
e.包括SEQ ID NO:1、2、3、4或5的一个或多个氨基酸残基的缺失、***和/或保守取代的多肽。
在一方面,本文披露了一种多肽,其中氨基酸序列与SEQ ID NO:1、2、3、4或5的成熟氨基酸序列具有至少68%、70%、72%、74%、76%、78%、80%%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列同一性。
在一方面,本文披露了与SEQ ID NO:1的成熟氨基酸序列具有90%序列同一性的多肽。
在一方面,本文披露了与SEQ ID NO:2的成熟氨基酸序列具有90%序列同一性的多肽。
在一方面,本文披露了与SEQ ID NO:3的成熟氨基酸序列具有96.5%序列同一性的多肽。
在一方面,本文披露了与SEQ ID NO:4的成熟氨基酸序列具有96.5%序列同一性的多肽。
在一方面,本文披露了与SEQ ID NO:5的成熟氨基酸序列具有96.5%序列同一性的多肽。
在一方面,本文披露了包括SEQ ID NO:1、2、3、4或5的氨基酸序列或由其组成的多肽。
在一方面,本文披露了衍生自两歧双歧杆菌的多肽。
在一方面,本文披露了pH最佳值为6.5-7.5的多肽。
在一方面,本文披露了具有温度最佳值为30℃-60℃(如42℃-60℃)的多肽。
可以将对碳水化合物具有活性的多肽使用基于其底物特异性的IUBMB分类***或CaZy指定分类为当前125个糖苷水解酶家族之一。在CaZy数据库中,指定是基于序列和结构信息,结合底物和产品的立体化学知识而进行的。
本文披露了多肽,当在包含编码所述多肽的核酸序列的合适的宿主菌株(例如,枯草芽孢杆菌)中是表达产物时,该多肽是表现出转半乳糖基化活性的所述核酸序列的唯一多肽表达产物。这可以通过使用本领域技术人员已知的以下技术来评估。使待评估的样品进行SDS-PAGE,并使用适合于蛋白质定量的染料例如像伯乐标准(Bio-Rad Criterion)***进行可视化。然后使用适当的光密度扫描仪(例如像伯乐标准***)扫描凝胶,并确保所得图像处于动态范围内。对与衍生自SEQ ID NO:8的任何变体/片段相对应的条带进行定量,并且将多肽的百分比计算如下:
所讨论的多肽的百分比=所讨论的多肽/(表现出转半乳糖基化活性的所有多肽的总和)*100。
组合物中衍生自SEQ ID NO:8的多肽变体/片段的总数可以通过本领域技术人员已知的方法使用多克隆抗体通过蛋白质印迹检测衍生自SEQ ID NO:8的片段来确定。
在此披露的多肽包括酶内包含的至少两个分离的功能结构域。首先,如下所述,多肽应包含糖苷水解酶催化核。催化核心应属于相关糖苷水解酶家族的GH-A族。GH-A族的特征在于通过保留机制切割糖苷键,并具有基于TIM桶折叠的催化结构域(维伦加(Wierenga),2001,欧洲生化学会联合会快报(FEBS Letters),492(3),第193-8页)。催化结构域包含作为质子供体和亲核体的两个谷氨酸残基,这两个谷氨酸残基源于桶结构域的链4和7(詹金斯(Jenkins),1995,欧洲生化学会联合会快报,362(3),第281-5页)。TIM桶的总体结构是由8个β链和8个α-螺旋组成的(β/α)8折叠。在一方面,在此披露的糖苷水解酶催化核心属于糖苷水解酶家族GH-2和-35之一,这些糖苷水解酶家族GH-2和-35都是属于GH-A族的TIM-桶酶。在另一方面,糖苷水解酶催化核心属于家族GH-2或GH-35。在另一方面,糖苷水解酶催化核心属于家族GH-2。一个共同特点是这些酶是所谓的保留酶,使得底物的立体化学在产品中是保守的(亨利萨特(Henrissat),1997,结构生物学当前观点(Curr OpinStruct Biol),7(5),637-44)。
在一方面,在此披露的多肽对具有β(1→4)构象的碳水化合物键具有活性。这有效地将该酶归入β-半乳糖苷酶的IUBMB EC 3.2.1.23类。该活性可以但不限于通过利用合成底物如对硝基苯酚-β-D-吡喃半乳糖苷(PNPG)、邻硝基苯酚-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)或具有显色糖苷配基的β-D-吡喃半乳糖苷(XGal)来确定。作为确定酶是否属于β-半乳糖苷酶的EC 3.2.1.23类的替代方法是与底物如乳糖一起孵育,并通过方法如酶测定、HPLC、TLC或本领域技术人员已知的其他方法测量葡萄糖的释放。
为了预测多肽的功能实体,可以应用若干个可用的公共储存库,例如像Pfam(核酸研究(Nucl.Acids Res.)(2010)38(增刊1):D211-D222.doi:10.1093/nar/gkp985)和Interpro(核酸研究(2009)37(增刊1):D211-D215.doi:10.1093/nar/gkn785)。应当指出,当进行这种分析时,应该在从公共储存库数据库中获得的多肽的全长序列上进行分析。
在另一方面,提供了包含选自以下的一种或多种Pfam结构域的多肽:Glyco_hydro2N(PF02837)、Glyco_hydro(PF00703)、Glyco_hydro 2C(PF02836)和细菌Ig样结构域(组4)(PF07532)。在又另一方面,提供包含Pfam结构域Glyco_hydro2N(PF02837)、Glyco_hydro(PF00703)、Glyco_hydro 2C(PF02836)和细菌Ig样结构域(组4)(PF07532)的多肽。在又另一方面,提供了包含构成多肽催化结构域的Glyco_hydro2N(PF02837)、Glyco_hydro(PF00703)和Glyco_hydro 2C(PF02836)结构域的多肽。
在另一方面,提供了如本文披露的并具有如下转半乳糖基化活性:β-半乳糖苷酶活性比率的多肽,如在100ppm浓度下,在基于乳的测定中,在37℃和5w/w%乳糖下,在15、30或180如180分钟反应后所测量的,该比率为至少1、至少2.5、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、或至少12。在另一方面,该多肽衍生自两歧双歧杆菌。
在一方面,在此所披露的一种或多种多肽具有转半乳糖基化活性,这样使得如在100ppm的浓度下,在基于乳的测定中,在37℃和5w/w%乳糖下,在15、30或180如180分钟反应后所测量的,超过20%、超过30%、超过40%、高达50%的初始乳糖发生了转半乳糖基化。
在另一方面,在此披露的一种或多种多肽具有β-半乳糖苷酶活性,这样使得如在100ppm的浓度下,在基于乳的测定中,在37℃和5w/w%乳糖下,在15、30或180如180分钟反应后所测量的,小于80%、小于70%、小于60%、小于50%、小于40%、小于30%、小于20%的乳糖已被水解。
在一方面,按照WO 2013/182626的方法4中规定的,在对应于2.13LAU的100ppm的浓度下测量β-半乳糖苷酶活性和/或转半乳糖基化活性。
在另一方面,在此披露的一种或多种多肽具有以下特征中的一个或多个:
a)如在100ppm浓度下,在基于乳的测定中,在37℃和5w/w%乳糖下,在15、30或180如180分钟反应后所测量的,为至少1、至少2.5、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、或至少12的转半乳糖基化活性:β-半乳糖苷酶活性比率,和/或
b)具有转半乳糖基化活性,这样使得如在100ppm的浓度下,在基于乳的测定中,在37℃和5w/w%乳糖下,在15、30或180如180分钟反应后所测量的,超过20%、超过30%、超过40%、以及高达50%的初始乳糖已经发生了转半乳糖基化。
在一方面,提供了包含与SEQ ID NO:3具有至少96.5%序列同一性的氨基酸序列的多肽,其中所述多肽由至多1300个氨基酸残基组成。在另一方面,提供了包含与SEQ IDNO:1具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的多肽,如其中所述序列同一性是至少95%,例如像至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少100%序列同一性,并且其中所述多肽由至多980个氨基酸残基组成。在另一方面,提供了包含与SEQ ID NO:1具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的多肽,其中所述多肽由至多980个氨基酸残基组成。在又另一方面,提供了一种多肽,其中所述多肽与SEQ ID NO:1具有至少90%序列同一性,如其中所述多肽与SEQ ID NO:1具有至少90%,例如像至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列同一性。在另一方面,提供了与SEQID NO:2具有至少96,5%序列同一性的多肽,如其中所述多肽与SEQ ID NO:2具有至少97%,例如像至少98%或至少99%序列同一性。在一方面,提供了在此披露的多肽,这些多肽由至多975个氨基酸残基,例如像,至多970个氨基酸残基、如至多950个氨基酸残基、如至多940个氨基酸残基、至多930个氨基酸残基、至多920个氨基酸残基、至多910个氨基酸残基、至多900个氨基酸残基、至多895个氨基酸残基或至多890个氨基酸残基组成。在一方面,提供了由887或965个氨基酸残基组成的特定的多肽。在一方面,提供了一种多肽,该多肽包含与SEQ ID NO:2具有至少97%序列同一性的氨基酸序列,如其中所述序列同一性为至少98%,例如像至少99%或至少100%序列同一性,其中所述多肽由至多975个氨基酸残基,例如像,至多970个或至少965个氨基酸残基组成。在一方面,提供了包含与SEQ ID NO:2具有至少97%序列同一性的氨基酸序列的多肽,其中所述多肽由至多975个氨基酸残基组成。
在另一优选的方面,提供了包括SEQ ID NO:1、2、3、4或5的多肽。在又一优选方面,提供了一种由SEQ ID NO:1、2、3、4或5的氨基酸序列组成的多肽,尤其是由SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列组成的多肽。
在另一方面,提供了一种多肽,该多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少96.5%序列同一性的氨基酸序列,如其中所述序列同一性是至少97%,例如像至少98%、至少99%或至少100%序列同一性,其中所述多肽由至多1300个氨基酸残基组成。
在另一方面,提供一种多肽,其中所述多肽与SEQ ID NO:5具有至少98.5%,如至少99%或至少99.5%序列同一性。在一方面,提供了这样一种多肽,该多肽由至多1290个氨基酸残基,例如像至多1280、至多1270、至多1260、至多1250、至多1240、至多1230、至多1220或至多1215个氨基酸残基组成。在优选方面,提供了一种多肽,该多肽由1211个氨基酸残基组成。
在另一方面,提供一种多肽,其中所述多肽与SEQ ID NO:4具有至少96%,如至少97%,例如像至少98%或至少99%序列同一性。在一方面,提供了一种多肽,该多肽由至多1210个氨基酸残基,例如像至多1200、至多1190、至多1180、至多1170、至多1160、至多1150或至多1145个氨基酸残基,如1142个氨基酸残基组成。
在另一方面,提供一种多肽,其中所述多肽与SEQ ID NO:3具有至少96.5%,如至少97%,例如像至少98%或至少99%序列同一性。在一方面,提供了一种多肽,该多肽由至多1130个氨基酸残基,例如像至多1120、至多1110、至多1100、至多1090、至多1080、至多1070、至多1060、至多1050、至多1055或至多1040个氨基酸残基组成。在优选方面,提供了一种多肽,该多肽由1038个氨基酸残基组成。
在另一方面,在此披露的多肽具有高于100%,如高于150%,175%或200%的转半乳糖基化活性比率。
蛋白质通常由一个或多个功能区域(通常称为结构域)组成。不同结构域在不同蛋白质的不同组合中的存在产生了在自然界中发现的蛋白质的多样性谱。描述结构域的一种方式是借助于Pfam数据库,该Pfam数据库是如以下描述的蛋白质结构域家族的大集合:“Pfam蛋白家族数据库”:R.D.芬恩,J.米斯特里,J.塔特,P.柯吉尔,A.赫格尔,J.E.普林顿,O.L.加文,P.古恩赛卡伦,G.赛利克,K.福斯隆德,L.霍尔姆,E.L.松哈默,S.R.艾迪,A.贝特曼,核酸研究(2010),数据库专辑38:D211-222。每个家族由多个序列比对和隐马尔可夫模型(HMM)表示。在另一方面,诸位本发明人已经发现本文提供的一种或多种多肽包含Pfam结构域Glyco_hydro2N(PF02837)、Glyco_hydro(PF00703)、Glyco_hydro 2C(PF02836)和细菌Ig样结构域(组4)(PF07532)中的一种或多种。在一方面,在此提供的一种或多种多肽包含Glyco_hydro2N(PF02837)、Glyco_hydro(PF00703)、Glyco_hydro2C(PF02836)和细菌Ig样结构域(组4)(PF07532)。
在一方面,多肽在4-9,如5-8、如5.5-7.5、如6.5-7.5的pH范围内具有有效的转半乳糖基化活性。
本发明涵盖与本文定义的一种或多种氨基酸序列或与具有如本文定义的具体特性的一种或多种多肽具有一定程度的序列同一性或序列同源性的多肽。具体而言,本发明涵盖与以下定义的SEQ ID NO:1、2、3、4或5中任一个或其同系物具有一定程度的序列同一性的肽。
在一方面,同源氨基酸序列和/或核苷酸序列应提供和/或编码一种多肽,与SEQID NO:1、2、3、4或5的多肽相比,该多肽保留了功能性转半乳糖基化活性和/或增强了转半乳糖基化活性。
在上下文中,同源序列被认为包括一种氨基酸序列,该氨基酸序列可以与主题序列具有至少66%、70%、75%、78%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性。通常,同系物将包括与主题氨基酸序列相同的活性位点等。尽管同源性也可以根据相似性(即具有相似化学特性/功能的氨基酸残基)来考虑,但在本发明的上下文中,优选的是根据序列同一性来表示同源性。
因此,本发明还涵盖如本文定义的蛋白质或多肽的任何氨基酸序列的变体、同系物和衍生物,特别是以下定义的SEQ ID NO:1、2、3、4或5的那些。
这些序列,特别是以下定义的SEQ ID NO:1、2、3、4或5的变体、同系物和衍生物,还可以具有氨基酸残基的缺失、***或取代,这产生沉默变化并且形成功能上等效的物质。可以基于残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性性质的相似性进行有意的氨基酸取代,只要保留底物的次要结合活性即可。例如,带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸;带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸;并且具有不带电极性头部基团(该基团具有类似的亲水性值)的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
本发明还涵盖了可能出现的保守取代(取代和置换在此均用于意指现有氨基酸残基与替代残基的交换),即对等取代,如碱性对碱性、酸性对酸性、极性对极性等。也可以发生非保守取代,即从一类残基到另一类残基或者可替代地涉及包括非天然氨基酸如鸟氨酸(在下文中称为Z)、二氨基丁酸鸟氨酸(在下文中称为B)、正亮氨酸鸟氨酸(在下文中称为O)、吡啶基丙氨酸、噻吩丙氨酸、萘基丙氨酸以及苯基甘氨酸。
可以进行的保守取代是例如在如下组内:碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、脂肪族氨基酸(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)、羟基氨基酸(丝氨酸、苏氨酸)、大氨基酸(苯丙氨酸和色氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸)。
在一方面,本发明中使用的多肽序列处于纯化形式。
在一方面,用于本发明的多肽或蛋白质处于分离形式。
在一方面,本发明的多肽是重组生产的。
变体多肽包含与SEQ ID NO:1或2具有一定百分比,例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的多肽。
变体多肽包含与SEQ ID NO:3、4或5具有一定百分比,例如至少96%、97%、98%或99%序列同一性的多肽。
在一方面,本文披露的多肽包括与由编码转半乳糖基酶的核苷酸序列编码的、包含在两歧双歧杆菌DSM20215中、本文示为SEQ ID NO:22的成熟多肽的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列同一性的氨基酸序列。根据SEQ ID NO:1、2、3、4或5讨论的与序列同一性和功能有关的所有考虑和限制比照适用于这些多肽和核苷酸的序列同一性和官能度。
在一方面,主题氨基酸序列是SEQ ID NO:1、2、3、4或5,并且主题核苷酸序列优选地是SEQ ID NO:9、10、11、12或13。
在一方面,多肽是从SEQ ID NO:1、2、3、4或5的多肽的氨基和/或羧基末端缺失的一个或多个(若干个)氨基酸的片段;其中该片段具有转半乳糖基化活性。
在一方面,片段包含至少500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、或1000个氨基酸残基。
在另一方面,多肽变体的长度为500至1300个氨基酸残基。在另一方面,多肽变体的长度为600至1300个氨基酸。在另一方面,多肽变体的长度为700至1300个氨基酸。在另一方面,多肽变体的长度为800至1300个氨基酸。在另一方面,多肽变体的长度为800至1300个氨基酸。
SEQ ID NO:1、2、3、4或5的多肽变体
在一方面,提供了相对于SEQ ID NO:1、2、3、4或5在一个或多个位置处具有取代的SEQ ID NO:1、2、3、4或5的变体,该取代产生了改变的性质,如改进的转半乳糖基化。在本文件中为了方便起见,这样的变体多肽又称为“变体多肽”、“多肽变体”或“变体”。在一方面,与SEQ ID NO:1、2、3、4或5的多肽相比,在此定义的多肽具有改进的转半乳糖基化活性。在另一方面,与SEQ ID NO:1、2、3、4或5的多肽相比,如在此所定义的多肽具有改进的反应速度。
在一方面,如本文定义的多肽和变体表现出酶活性。在一方面,本文所述的多肽和变体多肽包含括转半乳糖基化活性。
在一方面,在如高于3%w/w初始乳糖浓度的浓度下30min反应后,转半乳糖基化活性:β-半乳糖苷酶活性的比率为至少0.5,如至少1,如至少1.5,或如至少2。
在一方面,在如高于3%w/w初始乳糖浓度的浓度下30min反应后,转半乳糖基化活性:β-半乳糖苷酶活性的比率为至少2.5、如至少3、如至少4、如至少5、如至少6、如至少7、如至少8、如至少9、如至少10、如至少11、或如至少12。
在一方面,如在此定义的多肽和变体可衍生自微生物来源,特别是可衍生自丝状真菌或酵母,或可衍生自细菌。该酶可以例如衍生自如下各项的菌株:伞菌属,例如双孢蘑菇;Ascovaginospora;曲霉属,例如黑曲霉、泡盛曲霉、臭曲霉、日本曲霉、米曲霉;念珠菌属;毛壳菌属;Chaetotomastia;网柄菌属,例如盘基网柄菌;克鲁维酵母菌属,例如脆壁克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母;毛霉属,例如爪哇毛霉、高大毛霉、细小毛霉;脉孢菌属,例如粗糙脉孢菌;根毛霉属,例如微小根毛霉;根霉属,例如少根根霉、日本根霉、匍枝根霉;核盘霉属,例如白腐核盘霉;圆酵母属;球拟酵母属;毛癣菌属,例如红色毛癣菌;维氏核盘菌属,例如大豆维氏核盘菌;芽孢杆菌属,例如凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、诺瓦利斯芽孢杆菌(B.novalis)、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌;双歧杆菌属,例如长双歧杆菌、两歧双歧杆菌、动物双歧杆菌;金黄杆菌属;柠檬酸杆菌属,例如弗氏柠檬酸杆菌;梭菌属,例如产气荚膜梭菌;色二孢属,例如棉色二孢;肠杆菌属,例如产气肠杆菌,阴沟肠杆菌;爱德华菌属,迟钝爱德华菌;欧文氏菌属,例如草生欧文氏菌;埃希氏菌属,例如大肠杆菌;克雷伯氏菌属,例如肺炎克雷伯氏菌;多球菌属(Miriococcum);漆斑菌属;毛霉属;脉孢菌属,例如粗糙脉孢菌;变形杆菌属,例如普通变形杆菌;普罗维登斯菌属,例如斯氏普罗威登斯菌;密孔菌属,例如朱红密孔菌、血红密孔菌;瘤胃球菌属,例如扭链瘤胃球菌;沙门氏菌属,例如鼠伤寒沙门菌;沙雷氏菌属,例如液化沙雷氏菌、粘质沙雷氏菌;志贺菌属,例如弗氏志贺菌;链霉菌属,例如抗生链霉菌、栗色球孢链霉菌、紫红链霉菌;栓菌属;木霉属,例如里氏木霉、绿色木霉;耶尔森氏菌属,例如小肠结肠炎耶尔森氏菌。
提供包括如在此定义的多肽或变体多肽的分离的和/或纯化的多肽。在一个实施例中,变体多肽是多肽(SEQ ID NO:1、2、3、4或5)的成熟形式。在一方面,这些变体包括C端结构域。
在一方面,如在此定义的变体多肽包括变体,其中相对于SEQ ID NO:1、2、3、4或5已经添加或缺失了在一个和约25个之间的氨基酸残基。在一方面,如在此定义的变体多肽包括变体,其中相对于SEQ ID NO:1、2、3、4或5已经取代、添加或缺失了在一个和25个之间的氨基酸残基。在一方面,该变体具有SEQ ID NO:1、2、3、4或5的氨基酸序列,其中已经取代了在一个和约25个之间任何数目的氨基酸。在另一方面,该变体具有SEQ ID NO:1、2、3、4或5的氨基酸序列,其中已经取代了在三个和十二个之间任何数目的氨基酸。在另一方面,该变体具有SEQ ID NO:1、2、3、4或5的氨基酸序列,其中已经取代了在五个和九个之间任何数目的氨基酸。
在一方面,SEQ ID NO:1、2、3、4或5中的至少两个,在另一方面,至少三个,并且在又另一方面,至少五个氨基酸已经被取代。
在一方面,在此披露的一个或多个多肽具有1、2、3、4或5的序列。
在一方面,在此披露的一个或多个多肽具有SEQ ID NO:1、2、3、4或5的序列,其中N末端中的10,如9、如8、如7、如6、如5、如4、如3、如2、如1个氨基酸被取代和/或缺失。
其酶和酶变体可以通过以下表征:其核酸和初级多肽序列、三维结构建模和/或其比活度。如在此所定义的多肽或多肽变体的另外的特征包括例如稳定性、pH范围、氧化稳定性和热稳定性。可以使用本领域技术人员已知的标准测定来评估表达水平和酶活性。在另一方面,变体表现出相对于具有SEQ ID NO:1、2、3、4或5的多肽的改进的性能特征,如在高温,例如,65℃-85℃下改进的稳定性。
提供如在此定义的具有如下氨基酸序列的多肽变体,该氨基酸序列与SEQ ID NO:1、2、3、4或5的多肽具有至少约66%、68%、70%、72%、74%、78%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%同一性。
核苷酸
在一方面,本发明涉及如上所述的具有转半乳糖基化活性的分离的多肽,这些分离的多肽由以下多核苷酸编码,这些多核苷酸在非常低严格条件下、优选低严格条件下、更优选中严格条件下、更优选中-高严格条件下、甚至更优选高严格条件下、并且最优选非常高严格条件下,与以下各项杂交:i)包括在SEQ ID NO:9、10、11、12或13中的编码SEQ IDNO:1、2、3、4、或5的成熟多肽的核酸序列;ii)i)的cDNA序列或iii)i)或ii)的互补链(J.萨姆布鲁克(Sambrook),E.F.弗里奇(Fritsch),和T.马尼亚蒂斯(Maniatis),1989,分子克隆,实验室手册(Molecular Cloning,A Laboratory Manual),第2版,冷泉港,纽约州)。SEQID NO:9、10、11、12或13的子序列包含至少100个连续核苷酸或优选至少200个连续核苷酸。此外,子序列可以编码具有乳糖酶活性的多肽片段。
可以使用SEQ ID NO:9、10、11、12或13的核苷酸序列或其子序列、连同SEQ ID NO:1、2、3、4或5的氨基酸序列或其片段来设计核酸探针,以根据本领域众所周知的方法来鉴定并克隆对来自不同属或物种的菌株的具有转半乳糖基酶活性的多肽进行编码的DNA。具体地说,这类探针可以用于按照标准DNA印迹程序与感兴趣的属或物种的基因组或cDNA杂交,以便鉴定并分离其中的相应基因。这些探针可以比完整序列短得多,但是长度应当是至少14个、优选至少25个、更优选至少35个、且最优选至少70个核苷酸。然而,优选的是核酸探针的长度是至少100个核苷酸。例如,核酸探针的长度可以是至少200个核苷酸,优选至少300个核苷酸,更优选至少400个核苷酸,或最优选至少500个核苷酸。可使用甚至更长的探针,例如长度为至少600个核苷酸,至少优选至少700个核苷酸,更优选至少800个核苷酸,或最优选至少900个核苷酸的核酸探针。DNA和RNA探针都可以使用。通常将探针标记以探测相应的基因(例如,用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白标记)。这类探针涵盖于本发明中。
因此,可以针对与以上所描述的探针杂交并且编码具有乳糖酶活性的多肽的DNA对由这类其他生物体制备的基因组DNA文库进行筛选。可通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳、或其他分离技术分离来自这类其他生物的基因组或其他DNA。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移并且固定在硝酸纤维素(nitrocellulose)或其他适合的载体材料上。为鉴定与SEQ ID NO:9、10、11、12或13或其子序列同源的克隆或DNA,在DNA印迹法中使用载体材料。
出于本发明的目的,杂交表明该核苷酸序列在非常低到非常高严格条件下与一种被标记的核酸探针杂交,该探针对应于SEQ ID NO:9、10、11、12或13中所示的核苷酸序列、其互补链、或其子序列。可以使用X射线胶片检测在这些条件下与核酸探针杂交的分子。
在另一优选方面,该核酸探针是SEQ ID NO:9、10、11、12或13的成熟多肽编码区域。
对于至少100个核苷酸长度的长探针,非常低至非常高严格性条件被定义为最佳地按照标准DNA印迹程序,在42℃下在5X SSPE、0.3%SDS、200g/ml剪切和变性的鲑鱼***DNA中,以及对于非常低和低严格性在25%甲酰胺中,对于中和中-高严格性在35%甲酰胺中,或对于高和非常高严格性在50%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。
对于长度为至少100个核苷酸的长探针而言,载体材料最终使用2XSSC、0.2%SDS,优选至少在45℃下(非常低严格性),更优选至少在50℃下(低严格性),更优选至少在55℃下(中严格性),更优选至少在60℃下(中-高严格性),甚至更优选至少在65℃下(高严格性),并且最优选至少在70℃下(非常高严格性)洗涤三次,每次15分钟。
在一个具体实施例中,洗涤使用0.2X SSC、0.2%SDS,优选至少在45℃下(非常低严格性),更优选至少在50℃下(低严格性),更优选至少在55℃下(中严格性),更优选至少在60℃下(中高严格性),甚至更优选至少在65℃下(高严格性),并且最优选至少在70℃下(非常高严格性)进行。在另一个具体实施例中,洗涤使用0.1X SSC、0.2%SDS,优选至少在45℃下(非常低严格性),更优选至少在50℃下(低严格性),更优选至少在55℃下(中严格性),更优选至少在60℃下(中高严格性),甚至更优选至少在65℃下(高严格性),并且最优选至少在70℃下(非常高严格性)进行。
对于长度为约15个核苷酸至约70个核苷酸的短探针而言,严格条件被定义为根据标准DNA印迹程序,在比使用根据博尔顿(Bolton)和麦卡锡(McCarthy)(1962,美国国家科学院院刊(Proceedings of the National Academy of Sciences USA)48:1390)的计算计算的Tm低约5℃至约10℃下,在0.9M NaCl、0.09M Tris-HCl(pH 7.6)、6mM EDTA、0.5%NP-40、1X登哈特氏溶液(Denhardt's solution)、1mM焦磷酸钠、1mM磷酸二氢钠、0.1mM ATP、以及每ml 0.2mg的酵母RNA中预杂交、杂交及杂交后洗涤。
对于长度为约15个核苷酸至约70个核苷酸的短探针而言,将载体材料在比计算的Tm低5℃至10℃下,在6X SCC加0.1%SDS中洗涤一次,持续15分钟,并且使用6X SSC洗涤两次,每次15分钟。
在含盐杂交条件下,有效的Tm是控制成功杂交的探针和过滤器结合DNA之间所需的同一性程度的Tm。可以使用以下公式确定有效Tm,以确定两种DNA在各种严格条件下杂交所需的同一性程度。
有效Tm=81.5±16.6(log M[Na+])+0.41(G+C%)-0.72(甲酰胺%)
(参见www.ndsu.nodak.edu/instruct/mcclean/plsc731/dna/dna6.htm)
SEQ ID NO:10的G+C含量为42%,并且SEQ ID NO:11的G+C含量为44%。对于中严格性,甲酰胺为35%,并且5X SSPE的Na+浓度为0.75M。
另一个相关关系是两个DNA的1%错配将Tm降低1.4℃。为了确定两个DNA在42℃的中严格条件下杂交所需的同一性程度,使用下列公式:
同源性%=100-[(有效Tm-杂交温度)/1.4]
(参见www.ndsu.nodak.edu/instruct/mcclean/plsc731/dna/dna6.htm)
变体核酸包括与编码SEQ ID NO:1、2、3、4或5的核酸具有一定百分比,例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或99%序列同一性的多核苷酸。在一方面,提供了能够编码如在此披露的多肽的核酸。在另一方面,在此披露的核酸具有与SEQ ID NO:9、10、11、12或13具有至少60%,如至少65%,如至少70%,如至少75%,如至少80%,如至少85%,如至少90%,如至少95%,如至少99%同一性的核酸序列。
在一方面,提供了包含如本文所述的核酸的质粒。
在一方面,提供了包含本文所述的核酸或能够表达本文所述的多肽的表达载体。
提供了与编码本文中所定义的任意多肽变体的核酸互补的核酸。另外,提供了能够与补体杂交的核酸。在另一个实施例中,用于本文所述方法和组合物的序列是合成序列。它包括但不限于:用最佳密码子使用制备的用于在宿主生物体如酵母中表达的序列。
根据本领域众所周知的程序,如在此提供的多肽变体可以经合成或通过在宿主细胞中重组表达来产生。在一方面,在此披露的一种或多种多肽是一种或多种重组多肽。任选地将如在此定义的所表达的多肽变体在使用前分离。
在另一个实施例中,如本文定义的多肽变体在表达后进行纯化。多肽变体的遗传修饰和重组产生的方法描述于例如美国专利号7,371,552、7,166,453;6,890,572;以及6,667,065;和美国公开申请号2007/0141693;2007/0072270;2007/0020731;2007/0020727;2006/0073583;2006/0019347;2006/0018997;2006/0008890;2006/0008888;以及2005/0137111中。这些披露的相关教导通过引用并入本文,这些相关教导包括编码多肽的多核苷酸序列、引物、载体、选择方法、宿主细胞、所表达的多肽变体的纯化和重构以及如在此定义的多肽变体的表征,包括有用的缓冲液、pH范围、Ca2+浓度、底物浓度和用于酶法测定的酶浓度。
提供编码SEQ ID NO:1、2、3、4或5的蛋白质的核酸序列或与编码SEQ ID NO:1、2、3、4或5的蛋白质的核酸具有至少约66%、68%、70%、72%、74%、78%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的核酸序列。在一个实施例中,核酸序列与SEQ ID NO:9、10、11、12或13的核酸具有至少约60%、66%、68%、70%、72%、74%、78%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性。
载体
在一方面,本发明涉及包括多核苷酸的载体。在一方面,细菌细胞包括载体。在一些实施例中,将包括编码变体的核酸的DNA构建体在包括与编码序列可操作地连接的调节序列的表达载体中转移到宿主细胞。载体可以是可以整合到真菌宿主细胞基因组中并且当被引入宿主细胞时进行复制的任何载体。密苏里大学FGSC菌株目录列出合适的载体。萨姆布鲁克等人,分子克隆:实验室手册,第3版,冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约州(2001);班尼特(Bennett)等人,真菌中更多的基因操作(More Gene Manipulations in Fungi),学术出版社,圣迭哥(1991),第396-428页;和美国专利号5,874,276中提供了合适的表达和/或整合载体的另外的实例。示例性载体包括pFB6、pBR322、PUC18、pUC100和pENTR/D、pDONTM201、pDONRTM221、pENTRTM、以及用于细菌细胞的示例包括允许在大肠杆菌中复制的pBR322和pUC19,以及例如允许在芽孢杆菌属中复制的pE194。
在一些实施例中,编码变体的核酸可操作地连接到合适的启动子,其允许在宿主细胞中转录。启动子可以衍生自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。启动子的合适的非限制性实例包括cbh1、cbh2、egl1、和egl2启动子。在一个实施例中,该启动子是对宿主细胞天然的启动子。例如,当宿主为嗜糖假单胞菌时,启动子为天然的嗜糖假单胞菌启动子。“诱导型启动子”是指在环境调节或发育调节下具有活性的启动子。在另一个实施例中,该启动子是对宿主细胞异源的启动子。
在一些实施例中,将编码序列可操作地连接到编码信号序列的DNA序列上。在另一方面,代表性的信号肽是SEQ ID NO:27。代表性的信号肽是SEQ ID NO:9,其是枯草芽孢杆菌aprE前体的天然信号序列。在其他实施例中,编码信号序列的DNA被编码来自其他细胞外枯草芽孢杆菌前体的信号序列的核苷酸序列置换。在一个实施例中,编码信号序列的多核苷酸紧邻编码多肽的多核苷酸的上游并在框内。信号序列可以选自与宿主细胞相同的物种。
在另外的实施例中,包扩待引入真菌宿主细胞的DNA构建体或载体的信号序列和启动子序列衍生自相同的来源。在一些实施例中,表达载体还包括终止序列。在一个实施例中,终止序列和启动子序列衍生自相同的来源。在另一个实施例中,终止序列与宿主细胞是同源的。
在一些实施例中,表达载体包括选可选择的标志物。合适的可选择的标志物的实例包括赋予抗微生物剂抗性的那些,例如潮霉素或腐草霉素。营养选择性标志物也是合适的,并且包括amdS、argB和pyr4。在一个实施例中,选择性标志物是编码乙酰胺酶的amdS基因;它允许转化的细胞在作为氮源的乙酰胺上生长。构巢曲菌基因作为选择性标志物的用途描述于(Kelley)等人,欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)4:475-479(1985)和(Penttila)等人,基因(Gene)61:155-164(1987)。
包含具有编码变体的多核苷酸的DNA构建体的合适的表达载体可以是能够在给定宿主生物体中自主复制的或整合到宿主DNA中的任何载体。在一些实施例中,表达载体是质粒。在一些实施例中,考虑了两种类型的表达载体,用于获得基因表达。第一表达载体包括DNA序列,其中启动子、编码区和终止子全部来源于待表达基因。在一些实施例中,在其自身的转录和翻译调节序列的控制下,通过删除不想要的DNA序列以留下待表达的结构域而获得基因截短。预先组装第二种类型表达载体,并且包含高水平转录所需的序列和可选择的标志物。在一些实施例中,将基因或其部分的编码区***到该通用表达载体中,这样使得它处于表达构建体启动子和终止子序列的转录控制下。在一些实施例中,将基因或其部分***强cbh1启动子的下游。
表达宿主/宿主细胞
在另一方面,提供一种宿主细胞,该宿主细胞包括如本文所述的质粒或如本文所述的表达载体,优选是用其转化的。
在另一方面,提供了能够表达如本文所述的多肽的细胞。
在一方面,如在此所述的宿主细胞或如在此所述的细胞是细菌、真菌或酵母细胞。
在另一方面,宿主细胞选自由以下各项组成的组:瘤胃球菌属、双歧杆菌属、乳球菌属、乳杆菌属、链球菌属、明串珠菌属、埃希氏杆菌属、芽孢杆菌属、链霉菌属、酵母菌属、克鲁维酵母菌属、念珠菌属、圆酵母属、球拟酵母属和曲霉属。
在另一方面,该宿主细胞选自由以下各项组成的组:汉逊瘤胃球菌(Ruminococcushansenii)、短双岐杆菌、长双歧杆菌、婴儿双岐杆菌、两歧双歧杆菌和乳酸乳球菌。
在另一个实施例中,合适的宿主细胞包括选自由以下各项组成的组的***:枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、变铅青链霉菌、或鼠灰链霉菌;或革兰氏阴性细菌,其中所述革兰氏阴性细菌为大肠杆菌或假单胞菌属物种。在一方面,宿主细胞是枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌。在一个实施例中,宿主细胞是枯草芽孢杆菌,并且所表达的蛋白质被工程化以包括枯草芽孢杆菌信号序列,如以下进一步详细阐述的。在一方面,宿主细胞表达如权利要求中所提出的多核苷酸。
在一些实施例中,宿主细胞被遗传工程化以表达如在此定义的具有如下氨基酸序列的多肽变体,该氨基酸序列与SEQ ID NO:1、2、3、4或5的多肽具有至少约66%、68%、70%、72%、74%、78%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%同一性。在一些实施例中,编码如在此定义的多肽变体的多核苷酸将具有编码SEQ ID NO:1、2、3、4或5的蛋白质的核酸序列或与编码SEQ ID NO:1、2、3、4或5的蛋白质的核酸具有至少约66%、68%、70%、72%、74%、78%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的核酸序列。在一个实施例中,核酸序列与SEQ ID NO:9、10、11、12或13的核酸具有至少约60%、66%、68%、70%、72%、74%、78%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性。
用于生产多肽的方法
在另一方面,表达如本文所述的多肽的方法包括获得如本文所述的宿主细胞或细胞,并从细胞或宿主细胞表达多肽,以及任选地纯化该多肽。
当变体在特定宿主细胞中产生时,表达特征意指变体的改变的表达水平。表达通常涉及使用本领域已知的标准技术在给定时间内从发酵液中回收的活性变体的量。表达还可以涉及宿主细胞内产生的或由宿主细胞分泌的变体的量或速率。表达还可以涉及编码变体多肽的mRNA的翻译速率。
宿主细胞的转化、表达和培养
将DNA构建体或载体引入宿主细胞中包括如下技术如:转化;电穿孔;核显微注射;转导;转染,例如脂质介导的转染和DEAE-糊精介导的转染;用磷酸钙DNA沉淀孵育;用DNA包被的微粒高速轰击;和原生质体融合。通用转化技术是本领域已知的。参见,例如,奥苏贝尔等人(1987),同上,第9章;萨姆布鲁克等人(2001),同上;和坎贝尔(Campbell)等人,当代遗传学(Curr.Genet.)16:53-56(1989)。木霉属中异源蛋白的表达描述于例如美国专利号6,022,725;美国专利号6,268,328;哈尔基(Harkki)等人,酶与微生物技术(EnzymeMicrob.Technol.)13:227-233(1991);哈尔基等人,生物技术(BioTechnol.)7:596-603(1989);EP 244,234;以及EP 215,594中。在一个实施例中,用载体***构建遗传稳定的转化体,由此将编码变体的核酸稳定整合到宿主细胞染色体中。然后通过已知技术纯化转化体。
在一个非限制性实例中,包括amdS标志物的稳定转化体通过其更快的生长速率和在包含乙酰胺的固体培养基上形成具有光滑而不是粗糙轮廓的圆形菌落而区别于不稳定的转化体。另外,在一些情况下,通过如下进行稳定性的进一步测试:使转化体在固体非选择性培养基(例如,缺乏乙酰胺的培养基)上生长,从这种培养基中收获孢子并且确定随后在包含乙酰胺的选择性介质上发芽并生长的这些孢子的百分比。本领域已知的其他方法可用于选择转化体。
活性的鉴别
为了评估变体在宿主细胞中的表达,测定可以测量所表达的蛋白质、相应的mRNA或β-半乳糖苷酶活性。例如,合适的测定包括使用适当标记的杂交探针的RNA印迹法和DNA印迹法、RT-PCR(逆转录酶聚合酶链式反应)和原位杂交。合适的测定还包括测量样品中的活性。该变体的活性的合适的测定包括但不限于基于ONPG的测定或确定例如像在此的方法和实例中所描述的反应混合物中的葡萄糖。
纯化本文披露的多肽的方法
通常,细胞培养物中产生的变体被分泌到介质中,并且可以例如通过从细胞培养基中除去不需要的组分来纯化或分离。在一些情况下,可以从细胞裂解物中回收变体。在此种情况中,使用本领域技术人员常规采用的技术从产生酶的细胞中纯化所述酶。实例包括但不限于,例如:亲和层析、离子交换层析法(包括高分辨率离子交换)、疏水相互作用层析、两相分配、乙醇沉淀、反相HPLC、在二氧化硅或阳离子交换树脂上进行层析(如DEAE)、层析聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀和使用Sephadex G-75的凝胶过滤。根据预期用途,本文披露的一种或多种多肽可以是例如冷冻干燥的或制备于溶液中的。在一方面,本文披露的一种或多种多肽是冷冻干燥形式的。在另一方面,本文披露的一种或多种多肽是处于溶液中的。
用于固定和配制本文披露的多肽的方法
可以根据本领域已知的方法来制备多肽组合物,并且这些多肽组合物可以处于液体或干燥组合物的形式。例如,该多肽组合物可以呈颗粒或微粒的形式。包括在该组合物中的多肽可以根据本领域中已知的方法稳定化。
以下给出了本发明方法中使用的多肽或多肽组合物的优选用途的实例。
方法
在本发明的方法中,将第一糖类和第二糖类酶与酶接触,以允许酶将半乳糖部分从第一糖类转移到第二糖类。在一个实施例中,将酶添加到第一和第二糖类混合物中。在一个实施例中,将第二糖类添加到第一糖类和酶的混合物中。在一个实施例中,将第一糖类添加到第二糖类和酶的混合物中。
在本发明的方法中,在一定温度下,将第一糖类和第二糖类酶与酶接触,这样使得酶能够催化半乳糖部分从第一糖类到第二糖类的转移。精确的温度取决于如下因素,如酶的性质和量以及第一和第二糖类性质和量。
在一个实施例(具体地,在最终产物如乳果糖中半乳糖部分和果糖部分是连接的那些实施例)中,该方法在0至100℃的温度下进行。在一个实施例中,该方法在0至10℃的温度下进行。在一个实施例中,该方法在45℃至60℃的温度下进行。
在另一个实施例(具体地,在最终产物如低聚乳果糖中该半乳糖部分和该果糖部分被除了半乳糖或果糖之外的部分分隔开的那些实施例)中,该方法在0至100℃的温度下进行。在一个实施例中,该方法在30℃至70℃的温度下进行。在一个实施例中,该方法在40℃至60℃,尤其是45℃至55℃,以及最优选50℃的温度下进行。
在本发明的方法中,将第一糖类和第二糖类酶与酶接触持续一段时间,该段时间足以使酶催化半乳糖部分从第一糖类到第二糖类的转移。精确的反应时间取决于如下因素,如酶的性质和量以及第一和第二糖类的性质和量。
在一个实施例(具体地,在最终产物如乳果糖中半乳糖部分和果糖部分是连接的那些实施例)中,该方法进行持续1分钟至24小时的时间。在一个实施例中,该方法进行持续10分钟至6小时的时间。在一个实施例中,该方法进行持续15分钟至5小时的时间。
在另一个实施例(具体地,在最终产物如低聚乳果糖中该半乳糖部分和该果糖部分被除了半乳糖或果糖之外的部分分隔开的那些实施例)中,该方法进行持续1分钟至48小时的时间。在一个实施例中,该方法进行持续10分钟至24小时的时间。在一个实施例中,该方法进行持续30分钟至12小时,尤其是2至8小时的时间。
在本发明的方法中,在一定pH下,将第一糖类和第二糖类酶与酶接触,通常这样使得酶能够催化半乳糖部分从第一糖类到第二糖类的转移。精确的pH取决于如下因素,如酶的性质和量、第一和第二糖类性质和量、以及进行该方法的组合物。
在一个实施例(具体但不仅限于在奶组合物中原位进行该方法的那些实施例)中,该方法在如下pH下进行:至少5.5,如至少5.6、如至少5.7、如至少5.8、如至少5.9、如至少6.0、如至少6.1、如至少6.2、如至少6.3、如至少6.4、如至少6.5、如5.5至9.5、如5.75至8.5、如6.0至8.0、如6.25至7.5、如6.4至7.0、如6.5至6.8。
在一个实施例(具体地,在最终产物如乳果糖中半乳糖部分和果糖部分是连接的那些实施例)中,该方法在如下pH下进行:至少5.5,如至少5.6、如至少5.7、如至少5.8、如至少5.9、如至少6.0、如至少6.1、如至少6.2、如至少6.3、如至少6.4、如至少6.5、如5.5至9.5、如5.75至8.5、如6.0至8.0、如6.25至7.5、如6.4至7.0、如6.5至6.8。
在另一个实施例(具体地,在最终产物如低聚乳果糖中该半乳糖部分和该果糖部分被除了半乳糖或果糖之外的部分分隔开的那些实施例)中,该方法在如下pH下进行:至少5.5,如至少5.6、如至少5.7、如至少5.8、如至少5.9、如至少6.0、如至少6.1、如至少6.2、如至少6.3、如至少6.4、如至少6.5、如5.5至9.5、如5.75至8.5、如6.0至8.0、如6.25至7.5、如6.4至7.0、如6.5至6.8。
优选地,温度、pH和/或孵育时间的组合是有效的,以确保存在至少5%的转移酶活性,优选地至少10%转移酶活性,优选地至少15%、20%、25%、26%、28%、30%、40%、50%、60%或75%转移酶活性。
在一个实施例中,乳果糖的产率为至少10%。在一个实施例中,乳果糖的产率为至少12%。在一个实施例中,乳果糖的产率为至少15%。
在一个实施例中,乳果糖的产率为至少18%。在一个实施例中,乳果糖的产率为至少20%。在一个实施例中,乳果糖的产率为至少22%。
在一个实施例中,乳果糖的产率为至少25%。该产率基于用作起始材料的乳糖和果糖的总重量按重量计算的。
本发明的方法可以在食物组合物中原位进行。在一个实施例中,该食物组合物是乳品组合物。在一个实施例中,食物组合物是奶或包含奶的组合物。
如本文所用的术语‘奶’可以包括来自动物或植物来源的奶,并且包括全脂奶、脱脂奶和半脱脂奶。可以单独或组合使用来自动物来源的奶,这些动物来源如水牛、(传统)奶牛、绵羊、山羊等。植物奶如豆奶也可以单独使用或与动物奶组合使用。当植物奶与动物奶组合使用时,组合通常包含低于15%、或低于20%、或低于25%v/v的(植物奶的)低百分比。
在一方面,本文披露了通过用如本文所述的多肽处理包括乳糖的底物来生产食品的方法。
在一方面,本文披露了通过用如本文所述的多肽处理包含乳糖的基于乳的底物来生产乳制品的方法。在一方面,将包括乳糖的底物进一步用水解的β-半乳糖苷酶处理。
酶制剂(如处于根据本发明制备的食物成分的形式)可以是溶液形式或作为固体-这取决于用途和/或应用模式和/或给予模式。固体形式可以是呈干燥酶粉末或呈造粒酶。
干酶配制品的实例包括喷雾干燥的产物、混合器造粒产物、层状产物如流化床颗粒、挤出或颗粒状颗粒造粒产物、冻干产物。
在一方面,提供了一种组合物,优选地是食物组合物,更优选地是包含如本文所述的细胞或多肽的乳制品。
在一个实施例中,乳糖作为乳品组合物的初始组分存在。在一个实施例中,将乳糖添加到乳品组合物中。
应用和产物
本发明方法的产物是包含半乳糖部分和果糖部分的糖类。
在一个实施例中,本发明方法的产物是一种糖类,在该糖类中半乳糖部分通常通过糖苷键连接到果糖部分。在该实施例中,糖苷键可以是1,4'-糖苷键(其可以是1,4’-α-或1,4’-β-糖苷键)、1,6'-糖苷键(其可以是1,6’-α-或1,6’-β-糖苷键)、1,2'-糖苷键(其可以是1,2’-α-或1,2’-β-糖苷键)、或1,3'-糖苷键(其可以是1,3’-α-或1,3’-β-糖苷键)。在一个实施例中,该糖苷键是1,4'-糖苷键。在一个实施例中,该糖苷键是1,4'-α-糖苷键。在一个实施例中,该糖苷键是1,4'-β-糖苷键。
在一个实施例中,该产物是乳果糖,即4-O-β-D-吡喃半乳糖基-β-D-呋喃果糖。这通常由本发明的方法形成,其中第一糖类是乳糖,并且第二糖类是果糖。
在一个实施例中,本发明方法的产物是一种糖类,其中半乳糖部分和果糖部分被除了半乳糖或果糖之外的至少一个单糖部分分隔。通常,半乳糖部分和果糖部分在产物糖类中被从1至10个,优选地1至5个,更优选地1、2或3个,甚至更优选地1或2个,并且最优选地仅1个单糖部分分隔。
分隔产物中的半乳糖部分和果糖部分的该单糖部分(或这些部分)可以是上面列出的任何单糖部分,只要它不是半乳糖或果糖。在一个实施例中,分隔半乳糖部分和果糖部分的单糖部分是葡萄糖部分。
分隔半乳糖和果糖部分的该单糖部分(或这些部分)通常通过糖苷键连接到那些部分。在该实施例中,糖苷键可以是1,4'-糖苷键(其可以是1,4’-α-或1,4’-β-糖苷键)、1,6'-糖苷键(其可以是1,6’-α-或1,6’-β-糖苷键)、1,2'-糖苷键(其可以是1,2’-α-或1,2’-β-糖苷键)、或1,3'-糖苷键(其可以是1,3’-α-或1,3’-β-糖苷键)。在一个实施例中,该糖苷键是1,4'-糖苷键。在一个实施例中,该糖苷键是1,4'-α-糖苷键。在一个实施例中,该糖苷键是1,4'-β-糖苷键。
在一个实施例中,该产物是低聚乳果糖,即β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-β-D-呋喃果糖。这通常使用本发明的方法形成,其中第一糖类是乳糖,并且第二糖类是蔗糖。
本发明的产物(通常为乳果糖和/或低聚乳果糖)可以掺入食料中。如本文所用的,术语“食料”意指适合于人类和/或动物消费的物质。
合适地,如本文所用的,术语“食料”可以意指处于可消费形式的食料。然而,可替代地或此外,如本文所用的,术语“食料”可以意指用于制备食料的一种或多种食物材料。食料可以处于乳液的溶液或悬浮液的形式或呈固体-取决于用途和/或施用方式和/或给予方式。
当用作-或用于制备-食物-如功能性食物-本发明的组合物可以与以下中的一种或多种结合使用:营养学上可接受的载体、营养学上可接受的稀释剂、营养学上可接受的赋形剂、营养学上可接受的佐剂、营养学活性成分。
食料的实例包括但不限于以下一种或多种:蛋,基于蛋的产品,包括但不限于蛋黄酱、沙拉调味品、调味汁、冰淇淋、蛋粉、改性蛋黄和由其制成的产品;烘焙品,包括面包、蛋糕、甜面团产品、层压面团、液体面糊、松饼、甜甜圈、软饼、薄脆饼干和曲奇;糕点糖果,包括巧克力、糖果、焦糖、哈拉瓦(halawa),口香糖,包括无糖和加糖口香糖、泡泡糖、软泡泡糖、香口胶和布丁;冷冻产品包括果汁冰糕,优选冷冻乳制品,包括冰淇淋和软质冰淇凌;乳制品,包括奶酪、黄油、奶、咖啡奶油、搅打过的奶油、乳蛋糕奶油、奶饮品和酸奶;慕斯,搅打过的植物奶油,肉制品,包括经加工肉制品;食用油和脂肪,加气和非加气搅打过的产品,水包油乳液,油包水乳液,人造黄油,起酥油和涂抹调味品,包括低脂肪和非常低脂肪的涂抹调味品;调味品、蛋黄酱、沙司、基于奶油的.调味汁、奶油基汤、饮料、香料乳液和调味汁。
在某些实施例中,根据本发明的食料可以是“精细食物”,包括蛋糕、糕点、糕点糖果、巧克力、软糖以及类似物。
在一方面,根据本发明的食料可以是面团产品或烘焙产品,如面包,油炸产品,小吃,蛋糕,馅饼,布朗尼,曲奇,面条,零食如薄脆饼干、全麦薄脆饼干、椒盐脆饼干、和薯片,以及意大利面。
在另一方面,根据本发明的食料可以是植物源食品,如面粉、预混物、油、脂肪、可可脂、咖啡伴侣、沙拉调味品、人造黄油、涂抹调味品、花生酱、起酥油、冰淇淋、烹饪油。
在另一方面,根据本发明的食料可以是乳制品,包括黄油,奶,奶油,奶酪如各种形式(包括切碎、块状、片状或磨碎的)的天然的、经加工的和人造的奶酪,奶油奶酪,冰淇淋,冷冻甜点,酸奶,酸奶饮品,乳脂,无水奶脂,含乳清的食物和饮品,以及其他乳制品。
在本发明的上下文中,术语“乳”应理解为从任何哺乳动物如牛、绵羊、山羊、水牛或骆驼获得的乳状分泌物。
在上下文中,术语“基于乳的底物”意指任何生的和/或加工的乳材料或衍生自乳成分的材料。有用的基于乳的底物包括但不限于包括乳糖的任何乳或乳样产品的溶液/悬浮液,如全脂或低脂乳、脱脂乳、酪乳、复原乳粉、炼乳、奶粉溶液、UHT乳、乳清、乳清渗透物、酸乳清或奶油。优选地,基于乳的底物是乳或脱脂乳粉的水溶液。基于乳的底物可以比生乳更浓。在一个实施例中,基于乳的底物的蛋白质与乳糖的比率为至少0.2,优选至少0.3,至少0.4,至少0.5,至少0.6,或最优选至少0.7。可以根据本领域已知的方法对基于乳的底物进行均化和/或巴氏杀菌。
如在此所用“均质化”意指强烈混合以获得可溶性悬浮液或乳液。可以进行该均质化以便将乳脂分解成更小的尺寸,这样使得乳脂不再与该乳分离。这可以通过在高压下使该乳通过小孔来实现。
如在此所用“巴氏杀菌”意指减少或消除活生物体如微生物在基于乳的底物中的存在。优选地,通过将规定温度保持规定的时间来实现巴氏杀菌。指定的温度通常通过加热来实现。可以选择温度和持续时间以便杀灭或使某些细菌,如有害细菌失活,和/或使该乳中的酶失活。可以遵循快速冷却步骤。本发明上下文中的“食品”或“食物组合物”可以是适合于动物或人类消费的任何可食用食品或饲料产品。
在本发明的上下文中的“乳制品”可以是主要成分之一是基于乳的任何食品。优选地,主要成分是基于乳的。更优选地,主要成分是已经用具有转半乳糖基化活性的酶处理过的基于乳的底物。如在此所述的乳制品可以是例如脱脂乳、低脂乳、全脂乳、奶油、UHT乳、具有延长的保质期的乳、发酵的乳制品、奶酪、酸奶、黄油、乳质涂抹料(dairy spread)、黄油乳、酸化乳饮料、酸奶油、乳清基饮料、冰淇淋、炼乳、牛奶焦糖酱(dulce de leche)或风味乳饮料。乳制品可以通过本领域已知的任何方法制造。
乳制品还可以包括非乳组分,例如,植物组分如植物油,植物蛋白和/或植物碳水化合物。乳制品还可以包括另外的添加剂,如酶、调味剂、微生物培养物如益生菌培养物、盐、甜味剂、糖、酸、水果、果汁或本领域已知的可作为乳制品的组分或添加到乳制品中的任何其他组分。
在本发明的一个实施例中,一种或多种乳组分和/或乳馏分占乳制品的至少50%(重量/重量),如至少70%,例如至少80%,优选地至少90%。
在本发明的一个实施例中,已经用如在此定义的具有转半乳糖基化活性的酶处理的一种或多种基于乳的底物占乳制品的至少50%(重量/重量),如至少70%,例如至少80%,优选地至少90%。
在上下文中,“主要成分之一”意指干物质的成分,该干物质占乳制品总干物质的20%以上,优选30%以上或40%以上,而“主要成分”意指干物质的成分,该干物质占乳制品总干物质的50%以上、优选60%以上或70%以上。
在上下文中,“发酵的乳制品”应被理解为任何乳制品,其中任何类型的发酵形成生产过程的一部分。发酵的乳制品的实例是产品像酸奶、酪乳、鲜奶油、奶渣和清爽干酪。发酵的乳制品的另一个实例是奶酪。发酵的乳制品可以通过本领域已知的任何方法来生产。
术语“发酵”意指通过微生物如起子培养物的作用将碳水化合物转化为醇或酸。在一方面,发酵包括将乳糖转化为乳酸。在本上下文中,“微生物”可以包括能够发酵奶底物的任何细菌或真菌。
用于大多数发酵的乳产品的微生物选自由通常称为乳酸菌的细菌组成的组。如在此所用,术语“乳酸菌”是指革兰氏阳性、微量需氧或厌氧细菌,该细菌发酵糖,并且产生酸,这些酸包括作为主要产生的酸的乳酸、乙酸和丙酸。工业上最有用的乳酸菌可在“乳杆菌(Lactobacillales)”目中找到,其中包含乳球菌属物种、链球菌属物种、乳杆菌属物种、明串珠菌属物种、假明串珠菌属物种、片球菌属物种、短杆菌属物种、肠球菌属物种和丙酸菌属物种。此外,乳酸菌组中通常包括属于厌氧细菌的组的产乳酸细菌,双歧杆菌,即双歧杆菌属物种,这些产乳酸细菌常单独或与乳酸菌组合用作食品培养物。
乳酸菌通常作为冷冻或冻干培养物供应给乳业,用于进行起子增殖(bulkstarter propagation)或者所谓的“直投式”(DVS)培养物,旨在直接接种入发酵容器或桶中用于产生发酵乳制品。这种培养物通常称作“起子培养物”或“起子”。
常用的乳酸菌的起子培养物菌株通常分成嗜常温生物体(其最适生长温度约30℃),和嗜热生物体(其最适生长温度在约40℃至约45℃的范围内)。属于嗜常温组的典型生物体包括乳酸乳球菌、乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococus lactis subsp.cremoris)、肠膜状明串珠菌乳脂亚种(Leuconostoc mesenteroides subsp.cremoris)、肠膜状假明串珠菌乳脂亚种(Pseudoleuconostoc mesenteroides subsp.cremoris)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、乳酸乳球菌乳酸亚种双乙酰生物突变株(Lactococuslactis subsp.lactis biovar.diacetylactis)、干酪乳杆菌干酪亚种(Lactococus caseisubsp.casei)和副干酪乳杆菌副干酪亚种(Lactococus paracasei subsp.paracasei)。嗜热乳酸细菌物种包括例如嗜热链球菌、屎肠球菌、德氏乳杆菌乳酸亚种、瑞士乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜酸乳杆菌。
此外,属于双歧杆菌属的厌氧细菌,包括两歧双歧杆菌、动物双歧杆菌和长双歧杆菌常用作乳品起子培养物,并且通常包括在乳酸菌组中。此外,丙酸杆菌属的菌种用作乳品起子培养物,特别是在奶酪的制造中。此外,属于双歧杆菌属的有机体通常用作食物起子培养物。
另一组微生物起子培养物是真菌培养物,包括丝状真菌的酵母培养物和培养物,其具体用于制造某些类型的奶酪和饮料。真菌的实例包括娄地青霉、白青霉(Penicilliumcandidum)、白地霉、开菲尔圆酵母、开菲尔酵母和酿酒酵母。
在本发明的一个实施例中,用于基于乳的底物发酵的微生物是干酪乳杆菌、或嗜热链球菌和德氏乳酸杆菌保加利亚亚种的混合物。
本发明的方法中使用的发酵方法是众所周知的,并且本领域的技术人员知道如何选择合适的工艺条件,如温度、氧、微生物的量和特征、添加剂如碳水化合物、调味剂、矿物质、酶、和处理时间。选择发酵条件以支持本发明的预期产物。
作为发酵的结果,将降低基于乳的底物的pH。本发明的发酵乳制品的pH可以是,例如,在3.5-6的范围内,如在3.5-5的范围内,优选在3.8-4.8的范围内。
在另一方面,根据本发明的食料可以是包含动物源成分的食品,如经加工的肉制品、食用油、起酥油。
在另一方面,根据本发明的食料可以是饮料、水果、混合水果、蔬菜、腌泡汁或酒。
一些食物是营养保健品。“营养保健品”意指携带超过并高于其营养价值的健康益处的食物。营养保健品跨越了食物和药物之间的分界线。
本发明方法的产物(通常是乳果糖)也可以掺入药物组合物中。除了本发明方法的产物之外,这样的组合物可以包括常规药物赋形剂和其他常规的药学上无活性的试剂。此外,除了本发明方法的产物之外,组合物可以包括活性剂。
组合物可以是处于液体、半液体或固体形式,以适合待使用的给予途径的方式配制。对于口服给予,通常使用胶囊和片剂。对于肠胃外给予,通常使用如本文所述制备的冻干粉末的重构。
包括本发明方法的产物的组合物可以经口服、经肠胃外、经腹膜内、经静脉内、经动脉内、经皮、经舌下、经肌内、经直肠、经***化、经鼻内、经脂质体、通过吸入、经***、经眼内、通过局部递送(例如通过导管或支架)、经皮下、经脂肪内、经关节内或经鞘内给予或共同给予。本发明方法的产物也能以缓释剂型给予或共同给予。
本发明方法的产物能以任何常规剂型给予或共同给予。在本发明的上下文中共同给予旨在意指在协调治疗过程中给予多于一种治疗剂(其中之一包括本发明方法的产物)以达到改进的临床结果。这种共同给予也可以是同延的,即,在重叠的时期发生。
用于肠胃外、皮内、皮下、或局部应用的溶液或悬浮液可以任选地包含以下组分的一种或多种:无菌稀释剂,如注射用水、盐溶液、非挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂;抗微生物剂,如苯甲醇和对羟基苯甲酸甲酯;抗氧化剂,如抗坏血酸和亚硫酸氢钠;螯合剂,如乙二胺四乙酸(EDTA);缓冲剂,如乙酸盐、柠檬酸盐和磷酸盐;用于调节张力的试剂如氯化钠或右旋糖,以及用于调节组合物的酸度或碱度的试剂,如碱性或酸化剂或缓冲剂像碳酸盐、碳酸氢盐、磷酸盐、盐酸和有机酸像乙酸和柠檬酸。肠胃外制剂可以任选地封闭在安瓿,一次性注射器或由玻璃、塑料或其他合适材料制成的单剂量或多剂量小瓶中。
在将本发明方法的产物混合或添加到组合物中时,可以形成溶液、悬浮液、乳液等。所得组合物的形式将取决于许多因素,这些因素包括预期的给予方式,以及化合物在所选载体或运载体中的溶解度。改善所治疗疾病所需的有效浓度能以经验为主确定。
任选地以单位剂型(如片剂、胶囊、丸剂、粉末、用于吸入器的干粉、颗粒、无菌肠胃外溶液或悬浮液、以及口服溶液或悬浮液、以及包含适量的本发明方法的产物的油水乳液)提供根据本发明的组合物,用于人和动物的给予。除了根据本发明的一种或多种化合物之外,组合物可以包含:稀释剂,如乳糖、蔗糖、磷酸二钙或羧甲基纤维素;润滑剂,如硬脂酸镁、硬脂酸钙和滑石;和粘合剂如淀粉、天然树胶如***树胶、明胶、葡萄糖、糖蜜、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素及其衍生物、聚维酮、交聚维酮和本领域技术人员已知的其他此类粘合剂。
液体药学上可给予的组合物可以例如通过将如上定义的活性化合物和任选的药物佐剂溶解、分散或以其他方式混合在载体例如像水、盐水、右旋糖水溶液、甘油、二醇、乙醇以及类似物中,以形成溶液或悬浮液。
剂型或组合物可以任选地包括根据本发明的方法的一种或多种范围为0.005%至100%(重量/重量)的产物,余量包括另外的物质,如本文所述的那些。对于口服给予,药学上可接受的组合物可以任选地包含任何一种或多种常用的赋形剂,例如像药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、滑石、纤维素衍生物、交联羧甲基纤维素钠、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁、糖精钠、滑石。
用于制备这些配置品的方法是本领域技术人员已知的。组合物可以任选地包含0.01%-100%(重量/重量)的根据本发明的方法的一种或多种产物,任选地是0.1%-95%,并且任选地是1%-95%。
实例
实例1-乳果糖的产生
将包含约45g乳糖/升的爱氏晨曦0.5%脂肪量奶(爱氏晨曦公司,布拉布兰,丹麦)用乳糖(西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich),施内尔多尔夫,德国)强化至乳糖浓度为45、70和90g/L。此外,向每个特定的奶中添加果糖(50、60、70和80g/L)。随后,添加实例4中披露的β-半乳糖苷酶(还在WO 2013/182626中披露为“BIF 917”)(2625U/L),并将奶在50℃下孵育长达8小时,然后通过HPLC分析乳果糖浓度。
在双蒸水(ddH2O)中制备所有标准品(乳糖、葡萄糖、半乳糖和GOS),并通过0.45μm注射器过滤器过滤。制备了浓度范围从10至200,000ppm的每种标准品系列。
为了评估酸奶/奶基质中上述系列的糖的定量,将上述标准品掺入奶和酸奶样品中并用作内部对照。将包含活性β-半乳糖苷酶的所有奶和酸奶样品通过将样品加热至95℃持续10min来失活。在96孔MTP板(康宁公司(Corning),纽约州,美国)中制备所有奶样品,并稀释至少20次,并且在分析前通过0.20μm 96孔板框过滤器过滤(康宁过滤板,PVDF亲水膜,纽约州,美国)。将包含超过50,000ppm(5%w/v)乳糖的样品加热至30℃以确保适当溶解。将所有酸奶样品称重并在ddH2O中稀释10倍,然后使用Ultra turrax Tp18/10均质化样品几分钟(扬克(Janke)和孔克尔(Kunkel)Ika-实验室技术(Ika-labortechnik),比耶(Bie)和贝恩森(Berntsen),丹麦)。将β-半乳糖苷酶通过热处理失活,并且将样品在96孔MTP板中进一步稀释,并且在分析前通过0.20μm 96孔板式过滤器过滤(康宁过滤板,PVDF亲水膜,纽约州,美国)。在用胶带密封的96孔MTP板中分析所有样品。
仪器
通过HPLC定量半乳寡聚糖(GOS)、乳糖、葡萄糖和半乳糖。样品分析在装备有DGP-3600SD双梯度分析泵、WPS-3000TSL恒温自动进样器,TCC-3000SD恒温柱温箱和RI-101折光率检测器(Shodex,JM科学公司(JM Science))的Dionex Ultimate 3000HPLC***(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))上进行。使用Chromeleon数据***软件(6.80版,DU10A Build 2826,171948)进行数据采集和分析。
层析条件
使用装备有在70℃下操作的分析保护柱(Carbo-Ag+中性,AJ0-4491,菲罗门公司(Phenomenex),荷兰)的RSO寡糖柱(Ag+4%交联的(菲罗门公司,荷兰)),通过HPLC分析样品。以0.3ml/min的流速用双蒸水(通过0.45μm的再生纤维素膜过滤并用氦气吹扫)洗脱该柱。
在整个分析中保持0.3ml/min的等度流速,总运行时间为37min,并且注射体积设定为10μL。在恒温自动进样器室中将样品保持在30℃,以确保所有组分的溶解。通过折光率检测器(RI-101,Shodex,JM科学公司)监测洗脱液,并通过相对于给定标准品的峰面积的峰面积进行定量。遵循关于产品中GOS含量的制造商声明,使用Vivinal GOS糖浆(菲仕兰食品多磨公司(Friesland Food Domo),荷兰)中具有三度或更高的峰(DP3+)作为所有低聚半乳糖的定量(DP3+)的标准。用质量平衡证实了对所有DP3+半乳寡聚糖组分的相同反应的假设。
在进行HPLC分析之前,将奶在水(95℃/15min)中稀释20倍,然后进行0.22μm过滤。
图1、2和3分别说明了使用4.5%、7.0%和9.0%(w/v)乳糖(对应于45、70和90g/L乳糖)实现的结果。如这些图中所示,产生的乳果糖浓度取决于最初应用的乳糖和果糖浓度。
表1说明了使用7%乳糖和各种浓度的果糖的乳果糖产率(总糖)[%]。
表1
实例2-乳果糖的产生
将包含约45g乳糖/升的爱氏晨曦0.5%脂肪奶(爱氏晨曦公司,布拉布兰,丹麦)用果糖(MW:180.16Da;西格玛-奥德里奇,施内尔多尔夫,德国)或13C标记的果糖(MW:181.16Da;西格玛-奥德里奇,施内尔多尔夫,德国)强化至80g/升奶。随后,添加实例4中披露的β-半乳糖苷酶(还在WO 2013/182626中披露为“BIF 917”)(2625U/L),并将奶在50℃下孵育长达4小时,然后通过HPLC-MS分析乳果糖浓度。在进行HPLC分析之前,将奶在水(95℃/15min)中稀释20倍。在安捷伦1290UPLC上使用菲罗门REZEX RSO(掺入4%Ag+的200x10mm ID,其维持在75℃下并且以0.25ml/min用在线真空脱气的milli-Q水进行洗脱)进行层析。注射液是5μl的在水中稀释10x的样品以及保持在25℃的4-乳果糖、乳糖、葡萄糖和半乳糖(均为100μg/ml)的标准品。样品和标准品在使用前以12500x g离心5分钟。在布鲁克尔(Bruker)Maxis四极杆飞行时间质谱仪(QTOF MS)中分析柱洗脱液。
如图4所示,两个层析图似乎类似地都独立于非标记的(MW:180.16g/mol)或13C标记的果糖(MW:181.16g/mol)的应用。在32.1min处的峰洗脱可以被指定为使用标准品的4-乳果糖(西格玛-奥德里奇,施内尔多尔夫,德国)。此外,在34.5min处的13C标记果糖(图4(A))的366.1086m/z的所检测的质量和使用的非标记果糖(图4(B))的365.1054m/z的所检测的质量可以被指定为包含果糖的二糖,这是一种乳果糖异构体,即果糖分子的转半乳糖基化的结果。
实例3-低聚乳果糖和半乳糖基化寡聚物的产生
材料&方法
由约4.6%(w/v)乳糖、3.6%(w/v)蛋白质和0.5%(w/v)脂肪组成的半脱脂奶(爱氏晨曦食品公司(Arla foods),维比,丹麦)补充以全13C标记的蔗糖-3C12(西格玛-奥德里奇,施内尔多尔夫,德国;分子量:354.21g/mol)或未标记的蔗糖[6%(w/v);西格玛-奥德里奇,施内尔多尔夫,德国;分子量:342.3g/mol]。通过添加实例4中披露的β-半乳糖苷酶(还在WO 2013/182626中披露为“BIF 917”)引发低聚乳果糖的产生。每升奶中添加2,625个LAU单位的总活性,对应于1.04mg酶/ml奶。将低聚乳果糖产生在艾本德恒温混匀仪(Eppendorf Thermomixer)(艾本德公司(Eppendorf),汉堡,德国)中在50℃下进行长达6小时,样品在0、2、4和6小时后取出。通过在预热水(95℃)中将奶稀释20倍并保持10min来终止反应。
样品和标准品用四份乙腈(西格玛-奥德里奇,施内尔多尔夫,德国)稀释,并在转移到注射小瓶之前离心。进行所产生的(寡聚半乳糖)-低聚乳果糖的检测和分析,其中一些修改如前文所述(埃尔南德斯-埃尔南德斯(Hernández-Hernández),卡维洛(Calvillo)等人,层析杂志A(Journal of Chromatography A),2012,1220 57-67)。
使用具有预柱和流动相乙腈/水/25%NH4OH(水溶液)800/200/1(v/v/v)(A)和乙腈/水/25%NH4OH(水溶液)200/800/1(v/v/v)的沃特斯(Waters)BEH Amide 2.1x 150,1.7μm(沃特斯,海泽胡瑟讷,丹麦)柱,通过亲水性相互作用层析对稀释的溶液进行分析。液相层析在安捷伦1290UPLC(安捷伦公司,瓦尔德布龙,德国)上进行,流速为350μl*min-1。注射体积为10μl。柱温箱温度为35℃。梯度如下0%B(0min),50%B(15min),循环时间30min。通过电喷雾阳性模式用布鲁克尔maXis QTOF-MS进行检测。
使用以下标准品(低聚麦芽糖用于校准柱上的保留时间,以便能够预测较高的低聚乳果糖寡聚物的保留时间):
麦芽三糖批号017K0679Opb:T108Kemikalieskab 5(Hylde 3)
麦芽四糖批号084K1750Opb:T108Kemikalieskab 5(Hylde 3)
麦芽五糖批号110M1442Opb:T108Kemikalieskab 5(Hylde 3)
麦芽六糖批号048K1472Opb:T108Kemikalieskab 5(Hylde 3)
麦芽七糖批号029K1194Opb:T108Kemikalieskab 5(Hylde 3)
蔗糖批号K29959887 204Opb:T216
葡萄糖一水合物批号325K19714474Opb:T108Kemikalieskab 5(Hylde2)
‘低聚乳果糖’(即,4-O-β-D-半乳糖苷蔗糖;Carbosynth)批号OG448541401Opb:T216
将储备溶液合并并且稀释以形成测试溶液,各组分的浓度为约100μg/ml。通过将全13C标记的样品(15-30min后采样以确保蔗糖完全溶解)与100μg/ml低聚乳果糖标准溶液以1:1比例混合形成掺料溶液。
结果
己糖丙糖(Hex-DP3)低聚乳果糖(Gal-Glu-Fru)的100μg/ml参考样品的萃取离子层析图(EIC)如图5中的上部轨迹所示。
该EIC是基于[M+NH4]+和[2M+NH4]+的加合物的精确单同位素质量,公差为±0.005(图5)。以类似的方式,形成的[M+NH4]+13C12-标记的己糖DP3-6寡聚物(即13C12-Hex-DP3-6)的EIC显示在轨迹(图5)中。观察到的质量符合于理论质量,公差为±0.005。每个m/z轨迹,例如针对13C12-Hex-DP4,表现出一组峰,表示若干种异构体。如针对HILIC中同源范围的碳水化合物寡聚体所预期洗脱的峰组,保留时间随着Hex-DP的数目增加。因此,层析证明生物转化2小时后标记样品中13C12-Hex DP3-6寡聚体的形成和存在。
在分析之前,使样品失活并稀释10倍。虽然本研究是定性的,但低聚乳果糖标准溶液的标称浓度为100μg/ml,峰高约为5x 105。13C12-Hex-DP3-4的峰高出现在相同的范围内,表明形成的标记的寡聚体的浓度可以在0.1mg/ml(注射的)范围内,并且在稀释之前在生物转化混合物中为约1mg/ml。13C12-Hex-DP5和-6易于检测,相对响应为13C12-Hex-DP3-4水平的1/10和1/100。
通过组合在图2中所概述的层析EIC轨迹,如图6中所示,可以概括用于生物转化反应(t=0、2、4、和6小时)的标记的材料的相对形成。
生物转化最初导致已经在第一采样点(t=0)处显著量的13C12-Hex-DP3(即全13C-标记的低聚乳果糖),该第一采样点在实践中对应于约t=0.25-0.5小时。2小时后,生物转化导致DP3 13C12-Hex-DP3的更大量和更多的异构体,而且尤其导致显著量的较高寡聚物。在生物转化6小时后,相比13C12-Hex-DP3寡聚物的较高寡聚物的量似乎减少了,然而13C12-Hex-DP3异构体(尤其是在6.0、7.0和7.5min处的峰)增加了。
结论
使用13C12-标记的蔗糖(在存在下)的生物转化过程导致13C12-Hex-DP3-Dp6寡聚物,即Gal-Glu-Fru(即,低聚乳果糖)、Gal-Gal-Glu-Fru(即,半乳糖基-低聚乳果糖)、Gal-Gal-Gal-Glu-Fru(即,二半乳糖基-低聚乳果糖)和Gal-Gal-Gal-Gal-Glu-Fru(即,三半乳糖基-低聚乳果糖)的形成。形成的材料的主要部分为13C12-Hex-DP3-4寡聚物。高于13C12-Hex-DP3寡聚物的存在增加直至反应2小时,并且然后随时间下降。
因此,实验证实,在所使用的β-半乳糖苷酶转移到作为受体分子的蔗糖上的反应期间已经产生了低聚乳果糖(半乳糖-葡萄糖-果糖;Gal-Glu-Fru;DP3),半乳糖基-低聚乳果糖(Gal-Gal-Glu-Fru;DP4)以及寡-半乳糖基-低聚乳果糖(Galn-Glu-Fru,而n为2或3)。
实例4-多肽生产并以及LAU活性确定
方法1-多肽生产
被设计成用于编码两歧双歧杆菌全长(1752个残基)基因的、具有针对在枯草芽孢杆菌中表达所优化的密码子的合成基因购自GeneART(雷根斯堡,德国)SEQ ID No.8
采用反向引物,使用聚合酶链式反应构建两歧双歧杆菌截短突变体,其允许合成基因的所选择的区域的特异性扩增。
正向引物:GGGGTAACTAGTGGAAGATGCAACAAGAAG(加下划线的SpeI)(SEQ ID NO:15)。截短突变体和相应的反向引物的SEQ ID如下表2所示。
表2
使用独特的限制性位点SpeI和PacI将合成基因克隆到pBNspe枯草芽孢杆菌表达载体中(图1),并且将分离的质粒转化到枯草芽孢杆菌菌株BG3594中。将转化体作为选择重新划线到包含10μg/mL新霉素的LB平板上。
预培养设置在包含10μg/mL的新霉素的LB介质中,并且在37℃和180rpm震荡下培养7小时。将500μL该预培养物用于接种包含10μg/mL新霉素的50mL格兰特氏(Grant′s)改良培养基,以允许在33℃和180rpm震荡下生长68小时。
通过直接添加到1mg/ml溶菌酶(西格玛-奥德里奇)和10U/ml苯甲酸酶(默克公司(Merck))终浓度的培养基中将细胞裂解,并在33℃和180rpm下孵育1hr。通过以10.000x g离心20分钟清除裂解物,并且随后进行无菌过滤。
格兰特氏改良培养基是按照以下指示制备的:
制备部分I(2w/w%大豆蛋白胨),并在121℃下高压灭菌25分钟。
制备部分II,并与部分I混合,并且用HCl/NaOH将pH调节至pH 7.3。
使体积达到最大体积,并且通过0.22-μm PES过滤器进行灭菌。
根据以下指示制备10x MOPS缓冲液:
用水使达到约900mL并且溶解。用KOH调节pH至7.4,装填至1L并且将溶液通过0.2μm PES过滤器无菌过滤。
根据以下指示制备100x微量营养物:
用水溶解并且调节体积至1L。
通过0.2μm PES过滤器进行灭菌。
在4℃下避光储存。
方法2-纯化和酶制备
将经过滤的酶分离物使用具有10kDa MW截留的VivaSpin超滤装置(Vivaspin 20,赛多利斯(Sartorius),Lot#12VS2004)浓缩,并且将浓缩物加载到PD10脱盐柱(GE医疗公司(GE Healthcare),Lot#6284601)上并在20mM Tris-HCl(pH 8.6)中洗脱。层析在***(GE医疗公司)上手动地进行。将4mL包含约20mg蛋白质的脱盐样品加载到2mL HyperQ柱(HyperCelTM,Q吸附剂)上,该柱用20mM Tris-HCl(pH 8.6)以1ml/min的流速平衡。将该柱用30CV(柱体积)洗涤缓冲液彻底洗涤,并且将结合的β半乳糖苷酶用100CV长梯度洗脱到20mM Tris-HCl(pH 8.6)250mM NaCl中。用一步洗脱使用20mM Tris-HCl(pH8.6)500mM NaCl来去除柱上剩余的杂质。针对β-半乳糖苷酶活性并且通过SDS-page分析流过液和洗脱液中的蛋白。
根据制造商规程,用英杰公司Novex 4%-12%Bis-Tris凝胶1.0mm、10孔(Cat#NP0321box)、Plus2预染标准品(Cat#LC5925)和MES SDS运行缓冲液(Cat#NP0002)运行SDS-page凝胶。凝胶用简蓝安全染料(Simply BlueSafestain,英杰公司,目录#LC6060)染色(图2)。
方法3-测量β-半乳糖苷酶活性
使用市售的底物2-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)(西格玛N1127)测量酶活性。
ONPG w/o受体
100在pH 6.0下的mM KxH3-xPO4(磷酸盐缓冲液)
12,3mM ONPG
补充有受体的ONPG
100在pH 6.0下的mM KxH3-xPO4(磷酸盐缓冲液)
20mM纤维二糖
12,3mM ONPG
终止溶液:10%Na2CO3
将10μl稀释系列的纯化的酶添加到包含90μl ONPG缓冲液的具有或没有受体的微量滴定板的孔中。将样品混合并在37℃下孵育10min,然后向每个孔中添加100μl终止溶液以终止反应。在由Softmax软件包控制的分子装置SpectraMax平板读数器上在420nm下记录吸光度测量值。
如下计算转半乳糖基化活性的比率:
对于其中吸光度在0.5和1.0之间的稀释液,转半乳糖基化活性比率=(Abs420+纤维二糖/Abs420-纤维二糖)*100(图3)。
方法4-LAU活性的测定
原理:
该测定方法的原理是乳糖酶在37℃下将2-邻硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)水解成2-邻硝基苯酚(ONP)和半乳糖。用碳酸钠停止反应,并在分光光度计或色度计在420nm下测量释放的ONP。
试剂:
MES缓冲液(pH 6.4)(100mM MES pH 6.4,10mM CaCl2):将19,52g MES水合物(Mw:195.2g/mol,西格玛-奥德里奇#M8250-250G)和1.470g CaCl2二水合物(Mw:147.01g/mol,西格玛-奥德里奇)溶解于1000ml ddH2O中,通过10M NaOH调节pH至6.4。通过0.2μm滤器过滤溶液,并在4℃下储存1个月。
ONPG底物pH 6.4(12.28mM ONPG,100mM MES pH 6.4,10mM CaCl2):将0.370g 2-邻硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG,Mw:301.55g/mol,西格玛-奥德里奇#N1127)溶解在100ml MES缓冲液pH 6.4中,并在4℃下黑暗保存长达7天。
终止试剂(10%Na2CO3):将20.0g Na2CO3溶解在200ml ddH2O中,通过0.2μm滤器过滤溶液,并在室温下保存1个月。
程序:
在MES缓冲液(pH 6.4)中制备稀释系列的酶样品,并且将10μL每个样品稀释液转移到包含90μl ONPG底物(pH 6.4)的微量滴定板(96孔格式)的孔中。将样品混合并使用恒温混匀仪(舒适型恒温混匀仪(Comfort Thermomixer),艾本德(Eppendorf))在37℃下孵育5min,并且随后向每个孔中添加100μl终止试剂以终止反应。使用MES缓冲液(pH 6.4)代替酶样品构建空白。在ELISA读数器(SpectraMax平板读数器,分子装置公司(MolecularDevice))上针对空白测量在420nm处的吸光度的增加。
酶活性计算:
确定MES缓冲液(pH 6.4)中2-邻硝基苯酚(西格玛-奥德里奇#33444-25G)的摩尔消光系数(0.5998x 10-6M-1x cm-1)。一个单位(U)的乳糖酶活性(LAU)被定义为对应于每分钟1nmol的ONPG水解的量。使用总反应体积为200μL(光路径为0.52cm)的微量滴定板,可以使用以下公式计算每mL酶样品的乳糖酶活性:
计算在此示为SEQ ID NO:1的BIF917的比活度:
BIF917浓度的确定:
使用Criterion Stain free SDS-page***(伯乐公司(BioRad))确定靶酶(BIF917)和截短产物的定量。将任何kD Stain free预制凝胶4%-20%Tris-HCl,18孔(康贝公司(Comb)#345-0418)与塞尔瓦(Serva)Tris-甘氨酸/SDS缓冲液(伯乐公司目录号42529)一起使用。使用以下参数运行凝胶:200V、120mA、25W、50min。使用BSA(1.43mg/ml)(西格玛-奥德里奇,目录号500-0007)作为蛋白质标准品,并且将Criterion Stain Free成像仪(伯乐公司)与Image Lab软件(伯乐公司)一起使用,用于使用与色氨酸含量相关的带强度进行定量。
从两种独立发酵(如方法1中所述)的粗制酵素(超滤浓缩物)并且使用5种不同稀释度(参见表3)确定BIF917的特异性LAU活性。发现BIF917比活度为21.3LAU/mg或0.0213LAU/ppm。
表3:BIF917比活度的确定
上述说明书中提及的所有出版物通过引用结合在此。本发明的所描述的方法和***的各种修改和变化对于本领域的技术人员将是显而易知的,而不背离本发明的范围和精神。虽然已结合特定优选实施例描述了本发明,但应当理解,要求保护的本发明不应不适当地限于这类特定实施例。事实上,对于化学、生物化学、生物学、或相关领域的技术人员而言显而易见的、用于执行本发明的所述模式的各种修改预期在以下权利要求的范围内。
序列表
SEQ ID NO:1(BIF_917)
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SEQ ID NO:2(BIF_995)
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SEQ ID NO:3(BIF_1068)
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SEQ ID NO:4(BIF_1172)
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SEQ ID NO:5(BIF_1241)
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SEQ ID NO:6(BIF_1326)
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SEQ ID NO:7两歧双歧杆菌糖苷水解酶催化核心
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SEQ ID NO:8编码全长的核苷酸序列
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SEQ ID NO:9编码BIF_917的核苷酸序列
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SEQ ID NO:10编码BIF_995的核苷酸序列
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SEQ ID NO:14编码BIF_1326的核苷酸序列
gttgaagatgcaacaagaagcgatagcacaacacaaatgtcatcaacaccggaagttgtttattcatcagcggtcgatagcaaacaaaatcgcacaagcgattttgatgcgaactggaaatttatgctgtcagatagcgttcaagcacaagatccggcatttgatgattcagcatggcaacaagttgatctgccgcatgattatagcatcacacagaaatatagccaaagcaatgaagcagaatcagcatatcttccgggaggcacaggctggtatagaaaaagctttacaattgatagagatctggcaggcaaacgcattgcgattaattttgatggcgtctatatgaatgcaacagtctggtttaatggcgttaaactgggcacacatccgtatggctattcaccgttttcatttgatctgacaggcaatgcaaaatttggcggagaaaacacaattgtcgtcaaagttgaaaatagactgccgtcatcaagatggtattcaggcagcggcatttatagagatgttacactgacagttacagatggcgttcatgttggcaataatggcgtcgcaattaaaacaccgtcactggcaacacaaaatggcggagatgtcacaatgaacctgacaacaaaagtcgcgaatgatacagaagcagcagcgaacattacactgaaacagacagtttttccgaaaggcggaaaaacggatgcagcaattggcacagttacaacagcatcaaaatcaattgcagcaggcgcatcagcagatgttacaagcacaattacagcagcaagcccgaaactgtggtcaattaaaaacccgaacctgtatacagttagaacagaagttctgaacggaggcaaagttctggatacatatgatacagaatatggctttcgctggacaggctttgatgcaacatcaggcttttcactgaatggcgaaaaagtcaaactgaaaggcgttagcatgcatcatgatcaaggctcacttggcgcagttgcaaatagacgcgcaattgaaagacaagtcgaaatcctgcaaaaaatgggcgtcaatagcattcgcacaacacataatccggcagcaaaagcactgattgatgtctgcaatgaaaaaggcgttctggttgtcgaagaagtctttgatatgtggaaccgcagcaaaaatggcaacacggaagattatggcaaatggtttggccaagcaattgcaggcgataatgcagttctgggaggcgataaagatgaaacatgggcgaaatttgatcttacatcaacaattaaccgcgatagaaatgcaccgtcagttattatgtggtcactgggcaatgaaatgatggaaggcatttcaggctcagtttcaggctttccggcaacatcagcaaaactggttgcatggacaaaagcagcagattcaacaagaccgatgacatatggcgataacaaaattaaagcgaactggaacgaatcaaatacaatgggcgataatctgacagcaaatggcggagttgttggcacaaattattcagatggcgcaaactatgataaaattcgtacaacacatccgtcatgggcaatttatggctcagaaacagcatcagcgattaatagccgtggcatttataatagaacaacaggcggagcacaatcatcagataaacagctgacaagctatgataattcagcagttggctggggagcagttgcatcatcagcatggtatgatgttgttcagagagattttgtcgcaggcacatatgtttggacaggatttgattatctgggcgaaccgacaccgtggaatggcacaggctcaggcgcagttggctcatggccgtcaccgaaaaatagctattttggcatcgttgatacagcaggctttccgaaagatacatattatttttatcagagccagtggaatgatgatgttcatacactgcatattcttccggcatggaatgaaaatgttgttgcaaaaggctcaggcaataatgttccggttgtcgtttatacagatgcagcgaaagtgaaactgtattttacaccgaaaggctcaacagaaaaaagactgatcggcgaaaaatcatttacaaaaaaaacaacagcggcaggctatacatatcaagtctatgaaggcagcgataaagattcaacagcgcataaaaacatgtatctgacatggaatgttccgtgggcagaaggcacaatttcagcggaagcgtatgatgaaaataatcgcctgattccggaaggcagcacagaaggcaacgcatcagttacaacaacaggcaaagcagcaaaactgaaagcagatgcggatcgcaaaacaattacagcggatggcaaagatctgtcatatattgaagtcgatgtcacagatgcaaatggccatattgttccggatgcagcaaatagagtcacatttgatgttaaaggcgcaggcaaactggttggcgttgataatggctcatcaccggatcatgattcatatcaagcggataaccgcaaagcattttcaggcaaagtcctggcaattgttcagtcaacaaaagaagcaggcgaaattacagttacagcaaaagcagatggcctgcaatcaagcacagttaaaattgcaacaacagcagttccgggaacaagcacagaaaaaacagtccgcagcttttattacagccgcaactattatgtcaaaacaggcaacaaaccgattctgccgtcagatgttgaagttcgctattcagatggaacaagcgatagacaaaacgttacatgggatgcagtttcagatgatcaaattgcaaaagcaggctcattttcagttgcaggcacagttgcaggccaaaaaattagcgttcgcgtcacaatgattgatgaaattggcgcactgctgaattattcagcaagcacaccggttggcacaccggcagttcttccgggatcaagaccggcagtcctgccggatggcacagtcacatcagcaaattttgcagtccattggacaaaaccggcagatacagtctataatacagcaggcacagtcaaagtaccgggaacagcaacagtttttggcaaagaatttaaagtcacagcgacaattagagttcaaagaagccaagttacaattggctcatcagtttcaggaaatgcactgagactgacacaaaatattccggcagataaacaatcagatacactggatgcgattaaagatggctcaacaacagttgatgcaaatacaggcggaggcgcaaatccgtcagcatggacaaattgggcatattcaaaagcaggccataacacagcggaaattacatttgaatatgcgacagaacaacaactgggccagatcgtcatgtatttttttcgcgatagcaatgcagttagatttccggatgctggcaaaacaaaaattcagatcagcgcagatggcaaaaattggacagatctggcagcaacagaaacaattgcagcgcaagaatcaagcgatagagtcaaaccgtatacatatgattttgcaccggttggcgcaacatttgttaaagtgacagtcacaaacgcagatacaacaacaccgtcaggcgttgtttgcgcaggcctgacagaaattgaactgaaaacagcgacaagcaaatttgtcacaaatacatcagcagcactgtcatcacttacagtcaatggcacaaaagtttcagattcagttctggcagcaggctcatataacacaccggcaattatcgcagatgttaaagcggaaggcgaaggcaatgcaagcgttacagtccttccggcacatgataatgttattcgcgtcattacagaaagcgaagatcatgtcacacgcaaaacatttacaatcaacctgggcacagaacaagaattt
>SEQ ID NO:15用于生成BIF变体的正向引物
GGGGTAACTAGTGGAAGATGCAACAAGAAG
>SEQ ID NO:16BIF917的反向引物
GCGCTTAATTAATTATGTTTTTTCTGTGCTTGTTC
>SEQ ID NO:17BIF995的反向引物
GCGCTTAATTAATTACAGTGCGCCAATTTCATCAATCA
>SEQ ID NO:18BIF1068的反向引物
GCGCTTAATTAATTATTGAACTCTAATTGTCGCTG
>SEQ ID NO:19BIF1241的反向引物
GCGCTTAATTAATTATGTCGCTGTTTTCAGTTCAAT
>SEQ ID NO:20BIF1326的反向引物
GCGCTTAATTAATTAAAATTCTTGTTCTGTGCCCA
>SEQ ID NO:21BIF1478的反向引物
GCGCTTAATTAATTATCTCAGTCTAATTTCGCTTGCGC
>SEQ ID NO:22两歧双歧杆菌BIF1750
vedatrsdsttqmsstpevvyssavdskqnrtsdfdanwkfmlsdsvqaqdpafddsawqqvdlphdysitqkysqsneaesaylpggtgwyrksftidrdlagkriainfdgvymnatvwfngvklgthpygyspfsfdltgnakfggentivvkvenrlpssrwysgsgiyrdvtltvtdgvhvgnngvaiktpslatqnggdvtmnlttkvandteaaanitlkqtvfpkggktdaaigtvttasksiaagasadvtstitaaspklwsiknpnlytvrtevlnggkvldtydteygfrwtgfdatsgfslngekvklkgvsmhhdqgslgavanrraierqveilqkmgvnsirtthnpaakalidvcnekgvlvveevfdmwnrskngntedygkwfgqaiagdnavlggdkdetwakfdltstinrdrnapsvimwslgnemmegisgsvsgfpatsaklvawtkaadstrpmtygdnkikanwnesntmgdnltanggvvgtnysdganydkirtthpswaiygsetasainsrgiynrttggaqssdkqltsydnsavgwgavassawydvvqrdfvagtyvwtgfdylgeptpwngtgsgavgswpspknsyfgivdtagfpkdtyyfyqsqwnddvhtlhilpawnenvvakgsgnnvpvvvytdaakvklyftpkgstekrligeksftkkttaagytyqvyegsdkdstahknmyltwnvpwaegtisaeaydennrlipegstegnasvtttgkaaklkadadrktitadgkdlsyievdvtdanghivpdaanrvtfdvkgagklvgvdngsspdhdsyqadnrkafsgkvlaivqstkeageitvtakadglqsstvkiattavpgtstektvrsfyysrnyyvktgnkpilpsdvevrysdgtsdrqnvtwdavsddqiakagsfsvagtvagqkisvrvtmideigallnysastpvgtpavlpgsrpavlpdgtvtsanfavhwtkpadtvyntagtvkvpgtatvfgkefkvtatirvqrsqvtigssvsgnalrltqnipadkqsdtldaikdgsttvdantggganpsawtnwayskaghntaeitfeyateqqlgqivmyffrdsnavrfpdagktkiqisadgknwtdlaatetiaaqessdrvkpytydfapvgatfvkvtvtnadtttpsgvvcaglteielktatskfvtntsaalssltvngtkvsdsvlaagsyntpaiiadvkaegegnasvtvlpahdnvirvitesedhvtrktftinlgteqefpadsderdypaadmtvtvgseqtsgtategpkkfavdgntstywhsnwtpttvndlwiafelqkptkldalrylprpagskngsvteykvqvsddgtnwtdagsgtwttdygwklaefnqpvttkhvrlkavhtyadsgndkfmsaseirlrkavdttdisgatvtvpakltvdrvdadhpatfatkdvtvtlgdatlrygvdylldyagntavgkatvtvrgidkysgtvaktftielknapapeptltsvsvktkpskltyvvgdafdpaglvlqhdrqadrppqplvgeqadergltcgtrcdrveqlrkhenreahrtgldhlefvgaadgavgeqatfkvhvhadqgdgrhddaderdidphvpvdhavgelaraachhviglrvdthrlkasgfqipaddmaeidritgfhrferhvg
>SEQ ID NO:23来自两歧双歧杆菌DSM20215的胞外乳糖酶的信号序列
Vrskklwisllfalaliftmafgstssaqa
Claims (47)
1.一种生产包含半乳糖部分和果糖部分的糖类的方法,其中:
(a)该半乳糖部分连接到该果糖部分;或
(b)该半乳糖部分和该果糖部分被除了半乳糖或果糖之外的至少一个单糖部分分隔;
该方法包括:
将第一糖类与第二糖类接触,所述第一糖类包含半乳糖部分,所述第二糖类包含果糖部分,
该第一糖类和第二糖类是不同的,
所述接触在能够催化半乳糖部分转移至包含该果糖部分的第二糖类的酶的存在下进行,
该方法在5.5至9.5的pH下进行;
其条件是
(i)当该半乳糖部分连接到该果糖部分时,该第一糖类的浓度小于0.43mol/L并且该第二糖类的浓度小于0.5mol/L;并且
(ii)当该半乳糖部分和该果糖部分被除了半乳糖或果糖之外的至少一个单糖部分分隔时,该第一糖类的浓度和/或该第二糖类的浓度小于0.5mol/L。
2.一种生产包含半乳糖部分和果糖部分的糖类的方法,其中:
(a)该半乳糖部分连接到该果糖部分;或
(b)该半乳糖部分和该果糖部分被除了半乳糖或果糖之外的至少一个单糖部分分隔;该方法包括:
将第一糖类与第二糖类接触,所述第一糖类包含半乳糖部分,所述第二糖类包含果糖部分,
该第一糖类和第二糖类是不同的,
所述接触在能够催化半乳糖部分转移至包含该果糖部分的第二糖类的酶的存在下进行,
其中该酶选自由以下各项组成的组:
a)包含与SEQ ID NO:1具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的多肽,其中所述多肽由至多980个氨基酸残基组成;
b)由多核苷酸编码的多肽,该多核苷酸在至少低严格条件下与以下各项杂交:
i)包含在SEQ ID NO:9中的编码SEQ ID NO:1的多肽的核酸序列;或
ii)i)的互补链。
3.一种生产糖类的方法,在该糖类中半乳糖部分连接至果糖部分,该方法包括:
将第一糖类与第二糖类接触,所述第一糖类包含半乳糖部分,所述第二糖类包含果糖部分,
该第一糖类和第二糖类是不同的,
该接触在能够催化半乳糖部分转移至包含该果糖部分的第二糖类的酶的存在下进行,
该方法在5.5至9.5的pH下进行;
其中:
该第一糖类的浓度小于0.43mol/L;并且
该第二糖类的浓度小于0.8mol/L。
4.如权利要求3所述的方法,其中该第一糖类是乳糖或低聚半乳糖。
5.如权利要求4所述的方法,其中该第一糖类是乳糖。
6.如权利要求3或权利要求4所述的方法,其中该第二糖类是果糖。
7.如权利要求3所述的方法,其中该第一糖类是乳糖并且该第二糖类是果糖,这样使得所产生的糖类是乳果糖。
8.如权利要求3所述的方法,其中该第一糖类是乳糖并且该第二糖类是乳果糖。
9.如权利要求3至8中任一项所述的方法,其中该第一糖类的浓度为从0.088mol/L至0.380mol/L。
10.如权利要求5所述的方法,其中该乳糖的浓度为从40g/L至100g/L。
11.如权利要求3至10中任一项所述的方法,其中该第二糖类的浓度为0.278mol/L至0.444mol/L。
12.如权利要求6所述的方法,其中该果糖的浓度为从50g/L至80g/L。
13.如以上权利要求中任一项所述的方法,其中该酶是β-半乳糖苷酶。
14.如以上权利要求中任一项所述的方法,其中该酶在酶分类法(E.C.)中被分类为3.2.1.23。
15.如以上权利要求中任一项所述的方法,其中该酶是细菌来源或真菌来源的。
16.如权利要求15所述的方法,其中该酶是双歧杆菌属来源的。
17.如以上权利要求中任一项所述的方法,其中该酶选自由以下各项组成的组:
a)具有转半乳糖基化活性并且包含与SEQ ID NO:1具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的多肽,其中所述多肽由至多980个氨基酸残基组成;
b)由多核苷酸编码的多肽,该多核苷酸在至少低严格条件下与以下各项杂交:
i)包含在SEQ ID NO:9中的编码SEQ ID NO:1的多肽的核酸序列;或
ii)i)的互补链。
18.一种生产糖类的方法,在该糖类中半乳糖部分连接至果糖部分,该方法包括:
将第一糖类与第二糖类接触,所述第一糖类包含半乳糖部分,所述第二糖类包含果糖部分,
该第一糖类和第二糖类是不同的,
所述接触在能够催化半乳糖部分转移至包含该果糖部分的第二糖类的酶的存在下进行,
其中该酶选自由以下各项组成的组:
a)包含与SEQ ID NO:1具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的多肽,其中所述多肽由至多980个氨基酸残基组成;
b)由多核苷酸编码的多肽,该多核苷酸在至少低严格条件下与以下各项杂交:
i)包含在SEQ ID NO:9中的编码SEQ ID NO:1的多肽的核酸序列;或
ii)i)的互补链。
19.如权利要求3至18中任一项所述的方法,该方法在0℃至10℃的温度下进行。
20.如权利要求3至18中任一项所述的方法,该方法在45℃至60℃的温度下进行。
21.如以上权利要求中任一项所述的方法,该方法在食物组合物中原位进行。
22.如权利要求21所述的方法,其中该食物组合物是乳品组合物。
23.如权利要求22所述的方法,其中乳糖作为该乳品组合物的初始组分存在。
24.如权利要求22或权利要求23所述的方法,其中将乳糖添加到该乳品组合物中。
25.如以上权利要求中任一项所述的方法,其中该乳果糖的产率为至少10%,如至少12%、如至少15%、如至少18%、如至少20%、如至少22%、如至少25%,该产率是基于用作起始材料的乳糖和果糖的总重量按重量计算的。
26.一种含乳果糖的组合物,可通过如以上权利要求中任一项所述的方法获得。
27.一种生产包含半乳糖部分和果糖部分的糖类的方法,该半乳糖部分和该果糖部分被除了半乳糖或果糖之外的至少一个单糖部分分隔,该方法包括:
将第一糖类与第二糖类接触,所述第一糖类包含半乳糖部分,所述第二糖类包含果糖部分,
该第一糖类和第二糖类是不同的,
所述接触在能够催化半乳糖部分转移至包含该果糖部分的第二糖类的酶的存在下进行,
该方法在5.5至9.5的pH下进行;
其中该第一糖类的浓度和/或该第二糖类的浓度小于0.5mol/L。
28.如权利要求27所述的方法,其中该第一糖类是乳糖或低聚半乳糖。
29.如权利要求28所述的方法,其中该第一糖类是乳糖。
30.如权利要求27或权利要求28所述的方法,其中该第二糖类是蔗糖。
31.如权利要求27所述的方法,其中该第一糖类是乳糖并且该第二糖类是蔗糖,这样使得所产生的糖类是低聚乳果糖。
32.如权利要求27至31中任一项所述的方法,其中该第一糖类的浓度为从0.01mol/L至0.25mol/L。
33.如权利要求29所述的方法,其中该乳糖的浓度为从0.1mol/L至0.2mol/L。
34.如权利要求27至33中任一项所述的方法,其中该第二糖类的浓度为0.01mol/L至0.35mol/L。
35.如权利要求30所述的方法,其中该蔗糖的浓度为从0.1mol/L至0.35mol/L。
36.如权利要求27至35中任一项所述的方法,其中该酶是β-半乳糖苷酶。
37.如权利要求27至36中任一项所述的方法,其中该酶在酶分类法(E.C.)中被分类为3.2.1.23。
38.如权利要求27至37中任一项所述的方法,其中该酶是细菌来源或真菌来源的。
39.如权利要求38所述的方法,其中该酶是双歧杆菌属来源的。
40.如权利要求27至39中任一项所述的方法,其中该酶选自由以下各项组成的组:
a)具有转半乳糖基化活性并且包含与SEQ ID NO:1具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的多肽,其中所述多肽由至多980个氨基酸残基组成;
b)由多核苷酸编码的多肽,该多核苷酸在至少低严格条件下与以下各项杂交:
i)包含在SEQ ID NO:9中的编码SEQ ID NO:1的多肽的核酸序列;或
ii)i)的互补链。
41.一种生产包含半乳糖部分和果糖部分的糖类的方法,该半乳糖部分和该果糖部分被除了半乳糖或果糖之外的至少一个单糖部分分隔,该方法包括:
将第一糖类与第二糖类接触,所述第一糖类包含半乳糖部分,所述第二糖类包含果糖部分,
该第一糖类和第二糖类是不同的,
所述接触在能够催化半乳糖部分转移至包含该果糖部分的第二糖类的酶的存在下进行,
其中该酶选自由以下各项组成的组:
a)包含与SEQ ID NO:1具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的多肽,其中所述多肽由至多980个氨基酸残基组成;
b)由多核苷酸编码的多肽,该多核苷酸在至少低严格条件下与以下各项杂交:
i)包含在SEQ ID NO:9中的编码SEQ ID NO:1的多肽的核酸序列;或
ii)i)的互补链。
42.如权利要求27至41中任一项所述的方法,该方法在30℃至70℃的温度下进行。
43.如权利要求27至42中任一项所述的方法,该方法在食物组合物中原位进行。
44.如权利要求43所述的方法,其中该食物组合物是乳品组合物。
45.如权利要求44所述的方法,其中乳糖作为该乳品组合物的初始组分存在。
46.如权利要求44或权利要求45所述的方法,其中将乳糖添加到该乳品组合物中。
47.一种含低聚乳果糖的组合物,可通过如以上权利要求中任一项所述的方法获得。
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2019392275A1 (en) | 2018-12-03 | 2021-06-24 | International N&H Denmark Aps | Use of lactase to provide high GOS fiber level and low lactose level |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1614357A1 (en) * | 2004-07-10 | 2006-01-11 | Cognis IP Management GmbH | Dietary supplements comprising prebiotics and fatty acid |
CN102168028A (zh) * | 2010-02-26 | 2011-08-31 | 江南大学 | 一种节杆菌突变株、利用该突变株生产乳糖酶的方法及用乳糖酶制备乳果糖的方法 |
CN103080329A (zh) * | 2010-07-19 | 2013-05-01 | 阿尔拉食品公司 | 含有半乳寡聚糖的组合物及其生产方法 |
KR20130101689A (ko) * | 2012-03-06 | 2013-09-16 | 고려대학교 산학협력단 | 락툴로오스 합성용 마이크로 반응기 및 락툴로오스 생산 방법 |
WO2013182686A1 (en) * | 2012-06-08 | 2013-12-12 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Polypeptides having transgalactosylating activity |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS4940957B1 (zh) * | 1970-03-23 | 1974-11-06 | ||
JPH08168393A (ja) * | 1994-12-16 | 1996-07-02 | Dainippon Ink & Chem Inc | ガラクトオリゴ糖の製造方法 |
AU6206801A (en) * | 2000-05-26 | 2001-12-03 | Arla Foods Amba | A new enzyme isolated from a bifidobacterium |
-
2015
- 2015-11-06 BR BR112017008862-2A patent/BR112017008862A2/pt not_active IP Right Cessation
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2020
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Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1614357A1 (en) * | 2004-07-10 | 2006-01-11 | Cognis IP Management GmbH | Dietary supplements comprising prebiotics and fatty acid |
CN102168028A (zh) * | 2010-02-26 | 2011-08-31 | 江南大学 | 一种节杆菌突变株、利用该突变株生产乳糖酶的方法及用乳糖酶制备乳果糖的方法 |
CN103080329A (zh) * | 2010-07-19 | 2013-05-01 | 阿尔拉食品公司 | 含有半乳寡聚糖的组合物及其生产方法 |
KR20130101689A (ko) * | 2012-03-06 | 2013-09-16 | 고려대학교 산학협력단 | 락툴로오스 합성용 마이크로 반응기 및 락툴로오스 생산 방법 |
WO2013182686A1 (en) * | 2012-06-08 | 2013-12-12 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Polypeptides having transgalactosylating activity |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN116535448A (zh) * | 2023-05-26 | 2023-08-04 | 中国海洋大学 | 一种新型乳果糖及其制备方法和应用 |
Also Published As
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AU2020203922A1 (en) | 2020-07-02 |
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