JP6832670B2 - セサミノール2糖又は3糖配糖体の製造方法、および新規セサミノール配糖体 - Google Patents
セサミノール2糖又は3糖配糖体の製造方法、および新規セサミノール配糖体 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6832670B2 JP6832670B2 JP2016201846A JP2016201846A JP6832670B2 JP 6832670 B2 JP6832670 B2 JP 6832670B2 JP 2016201846 A JP2016201846 A JP 2016201846A JP 2016201846 A JP2016201846 A JP 2016201846A JP 6832670 B2 JP6832670 B2 JP 6832670B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sesaminol
- protein
- glucose
- seq
- glycoside
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- -1 sesaminol disaccharide Chemical class 0.000 title claims description 309
- KQRXQIPRDKVZPW-UHFFFAOYSA-N sesaminol Natural products C1=C2OCOC2=CC(C2OCC3C2COC3C2=CC=3OCOC=3C=C2O)=C1 KQRXQIPRDKVZPW-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 261
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 title claims description 188
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 59
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 366
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 335
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 140
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 140
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 140
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 135
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 135
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 117
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 106
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 101
- KQRXQIPRDKVZPW-ISZNXKAUSA-N sesaminol Chemical compound C1=C2OCOC2=CC([C@H]2OC[C@H]3[C@@H]2CO[C@@H]3C2=CC=3OCOC=3C=C2O)=C1 KQRXQIPRDKVZPW-ISZNXKAUSA-N 0.000 claims description 97
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 90
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 claims description 83
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 80
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 80
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 72
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims description 64
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 52
- HSCJRCZFDFQWRP-UHFFFAOYSA-N Uridindiphosphoglukose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC1C(O)C(O)C(N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 HSCJRCZFDFQWRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 50
- HSCJRCZFDFQWRP-JZMIEXBBSA-N UDP-alpha-D-glucose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 HSCJRCZFDFQWRP-JZMIEXBBSA-N 0.000 claims description 46
- 241000207961 Sesamum Species 0.000 claims description 34
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 19
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 claims description 12
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 10
- 125000000188 beta-D-glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 claims description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 6
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 125000002353 D-glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 claims description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 2
- 229930182478 glucoside Natural products 0.000 claims 2
- 150000008131 glucosides Chemical group 0.000 claims 2
- GZCGUPFRVQAUEE-VANKVMQKSA-N aldehydo-L-glucose Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O GZCGUPFRVQAUEE-VANKVMQKSA-N 0.000 claims 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 123
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 102
- DFPYCCVFXMWMJM-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-3-oxo-1,3-dihydro-benzo[c]isothiazole-5-sulfonic acid amide Chemical compound NS(=O)(=O)C1=CC=C2N(C)SC(=O)C2=C1 DFPYCCVFXMWMJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 66
- 150000002402 hexoses Chemical group 0.000 description 63
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 60
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 58
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 57
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 31
- 235000003434 Sesamum indicum Nutrition 0.000 description 29
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 27
- 239000000047 product Substances 0.000 description 27
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 27
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 26
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 26
- 108700023372 Glycosyltransferases Proteins 0.000 description 24
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 24
- 102000051366 Glycosyltransferases Human genes 0.000 description 22
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 20
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 19
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 19
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 16
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 16
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 10
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 10
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 10
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 9
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 9
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- 230000006098 transglycosylation Effects 0.000 description 9
- 238000005918 transglycosylation reaction Methods 0.000 description 9
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000007614 genetic variation Effects 0.000 description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 7
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 7
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 5
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- PEYUIKBAABKQKQ-AFHBHXEDSA-N (+)-sesamin Chemical compound C1=C2OCOC2=CC([C@H]2OC[C@H]3[C@@H]2CO[C@@H]3C2=CC=C3OCOC3=C2)=C1 PEYUIKBAABKQKQ-AFHBHXEDSA-N 0.000 description 4
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 235000009367 Sesamum alatum Nutrition 0.000 description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 4
- PEYUIKBAABKQKQ-UHFFFAOYSA-N epiasarinin Natural products C1=C2OCOC2=CC(C2OCC3C2COC3C2=CC=C3OCOC3=C2)=C1 PEYUIKBAABKQKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- VRMHCMWQHAXTOR-CMOCDZPBSA-N sesamin Natural products C1=C2OCOC2=CC([C@@H]2OC[C@@]3(C)[C@H](C=4C=C5OCOC5=CC=4)OC[C@]32C)=C1 VRMHCMWQHAXTOR-CMOCDZPBSA-N 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- XCCTYIAWTASOJW-XVFCMESISA-N Uridine-5'-Diphosphate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 XCCTYIAWTASOJW-XVFCMESISA-N 0.000 description 3
- 244000078534 Vaccinium myrtillus Species 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 150000008498 β-D-glucosides Chemical class 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TWCMVXMQHSVIOJ-UHFFFAOYSA-N Aglycone of yadanzioside D Natural products COC(=O)C12OCC34C(CC5C(=CC(O)C(O)C5(C)C3C(O)C1O)C)OC(=O)C(OC(=O)C)C24 TWCMVXMQHSVIOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PLMKQQMDOMTZGG-UHFFFAOYSA-N Astrantiagenin E-methylester Natural products CC12CCC(O)C(C)(CO)C1CCC1(C)C2CC=C2C3CC(C)(C)CCC3(C(=O)OC)CCC21C PLMKQQMDOMTZGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 description 2
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 2
- 241001470257 Nagara Species 0.000 description 2
- 241000233855 Orchidaceae Species 0.000 description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- 235000004347 Perilla Nutrition 0.000 description 2
- 244000124853 Perilla frutescens Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 235000002597 Solanum melongena Nutrition 0.000 description 2
- 244000061458 Solanum melongena Species 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 235000017537 Vaccinium myrtillus Nutrition 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 102000045442 glycosyltransferase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108700014210 glycosyltransferase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- PFOARMALXZGCHY-UHFFFAOYSA-N homoegonol Natural products C1=C(OC)C(OC)=CC=C1C1=CC2=CC(CCCO)=CC(OC)=C2O1 PFOARMALXZGCHY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930013686 lignan Natural products 0.000 description 2
- 235000009408 lignans Nutrition 0.000 description 2
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 2
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 150000004043 trisaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OWEFQTXQEHYDEJ-UHFFFAOYSA-N 2,3-dihydroxypropanal diphosphono hydrogen phosphate Chemical compound OCC(O)C=O.OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O OWEFQTXQEHYDEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 235000017166 Bambusa arundinacea Nutrition 0.000 description 1
- 235000017491 Bambusa tulda Nutrition 0.000 description 1
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 description 1
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 description 1
- 235000011299 Brassica oleracea var botrytis Nutrition 0.000 description 1
- 235000017647 Brassica oleracea var italica Nutrition 0.000 description 1
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 244000178937 Brassica oleracea var. capitata Species 0.000 description 1
- 244000308180 Brassica oleracea var. italica Species 0.000 description 1
- 235000006716 Broussonetia kazinoki Nutrition 0.000 description 1
- 240000006248 Broussonetia kazinoki Species 0.000 description 1
- 101100289995 Caenorhabditis elegans mac-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 1
- 235000002566 Capsicum Nutrition 0.000 description 1
- 240000008574 Capsicum frutescens Species 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 235000005633 Chrysanthemum balsamita Nutrition 0.000 description 1
- 244000260524 Chrysanthemum balsamita Species 0.000 description 1
- 240000007154 Coffea arabica Species 0.000 description 1
- 235000007460 Coffea arabica Nutrition 0.000 description 1
- 244000077995 Coix lacryma jobi Species 0.000 description 1
- 241001573881 Corolla Species 0.000 description 1
- 241000612152 Cyclamen hederifolium Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-WHZQZERISA-N D-aldose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-WHZQZERISA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-IVMDWMLBSA-N D-allopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 235000009355 Dianthus caryophyllus Nutrition 0.000 description 1
- 240000006497 Dianthus caryophyllus Species 0.000 description 1
- 235000013535 Dianthus superbus Nutrition 0.000 description 1
- 244000183914 Dianthus superbus Species 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000257465 Echinoidea Species 0.000 description 1
- 241000510032 Ellipsaria lineolata Species 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 241000219428 Fagaceae Species 0.000 description 1
- 235000010099 Fagus sylvatica Nutrition 0.000 description 1
- 240000000731 Fagus sylvatica Species 0.000 description 1
- 240000009088 Fragaria x ananassa Species 0.000 description 1
- 241000597000 Freesia Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 210000000712 G cell Anatomy 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 241000208152 Geranium Species 0.000 description 1
- 241000735332 Gerbera Species 0.000 description 1
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 1
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 description 1
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- 241000218228 Humulus Species 0.000 description 1
- 235000014486 Hydrangea macrophylla Nutrition 0.000 description 1
- 244000267823 Hydrangea macrophylla Species 0.000 description 1
- 244000017020 Ipomoea batatas Species 0.000 description 1
- 235000002678 Ipomoea batatas Nutrition 0.000 description 1
- 241001091572 Kalanchoe Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VSOAQEOCSA-N L-altropyranose Chemical compound OC[C@@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VSOAQEOCSA-N 0.000 description 1
- 244000165082 Lavanda vera Species 0.000 description 1
- 235000010663 Lavandula angustifolia Nutrition 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 1
- 102100031787 Myosin regulatory light polypeptide 9 Human genes 0.000 description 1
- 101710107065 Myosin regulatory light polypeptide 9 Proteins 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 241000208181 Pelargonium Species 0.000 description 1
- 240000007377 Petunia x hybrida Species 0.000 description 1
- 235000015334 Phyllostachys viridis Nutrition 0.000 description 1
- 244000082204 Phyllostachys viridis Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 235000005733 Raphanus sativus var niger Nutrition 0.000 description 1
- 244000155437 Raphanus sativus var. niger Species 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 235000001466 Ribes nigrum Nutrition 0.000 description 1
- 241001312569 Ribes nigrum Species 0.000 description 1
- 241000220317 Rosa Species 0.000 description 1
- 241000220222 Rosaceae Species 0.000 description 1
- 235000017848 Rubus fruticosus Nutrition 0.000 description 1
- 240000007651 Rubus glaucus Species 0.000 description 1
- 235000011034 Rubus glaucus Nutrition 0.000 description 1
- 235000009122 Rubus idaeus Nutrition 0.000 description 1
- 235000017276 Salvia Nutrition 0.000 description 1
- 240000007164 Salvia officinalis Species 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 101100370749 Streptomyces coelicolor (strain ATCC BAA-471 / A3(2) / M145) trpC1 gene Proteins 0.000 description 1
- 240000006909 Tilia x europaea Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- 241000722921 Tulipa gesneriana Species 0.000 description 1
- DQQDLYVHOTZLOR-OCIMBMBZSA-N UDP-alpha-D-xylose Chemical compound C([C@@H]1[C@H]([C@H]([C@@H](O1)N1C(NC(=O)C=C1)=O)O)O)OP(O)(=O)OP(O)(=O)O[C@H]1OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O DQQDLYVHOTZLOR-OCIMBMBZSA-N 0.000 description 1
- DQQDLYVHOTZLOR-UHFFFAOYSA-N UDP-alpha-D-xylose Natural products O1C(N2C(NC(=O)C=C2)=O)C(O)C(O)C1COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC1OCC(O)C(O)C1O DQQDLYVHOTZLOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000003095 Vaccinium corymbosum Nutrition 0.000 description 1
- 241000219094 Vitaceae Species 0.000 description 1
- 235000008853 Zanthoxylum piperitum Nutrition 0.000 description 1
- 244000131415 Zanthoxylum piperitum Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- HSCJRCZFDFQWRP-NYYOCOOHSA-N [[(2r,3s,4r,5r)-5-(2,4-dioxopyrimidin-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2r,3s,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl] hydrogen phosphate Chemical compound O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 HSCJRCZFDFQWRP-NYYOCOOHSA-N 0.000 description 1
- USAZACJQJDHAJH-KDEXOMDGSA-N [[(2r,3s,4r,5s)-5-(2,4-dioxo-1h-pyrimidin-6-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2r,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl] hydrogen phosphate Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](C=2NC(=O)NC(=O)C=2)O1 USAZACJQJDHAJH-KDEXOMDGSA-N 0.000 description 1
- JCPSMIOSLWKUPV-XQQPQPTDSA-N [[(3r,4r,5s)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-[(2s,3s,4r,5r)-5-(2,4-dioxopyrimidin-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)OC1C(OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 JCPSMIOSLWKUPV-XQQPQPTDSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N adenyl group Chemical group N1=CN=C2N=CNC2=C1N GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- 229940025131 amylases Drugs 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 108010045569 atelocollagen Proteins 0.000 description 1
- 239000011425 bamboo Substances 0.000 description 1
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 235000021029 blackberry Nutrition 0.000 description 1
- 235000021014 blueberries Nutrition 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000001390 capsicum minimum Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 229930186364 cyclamen Natural products 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 244000013123 dwarf bean Species 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 201000007116 gestational trophoblastic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000000762 glandular Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000007446 glucose tolerance test Methods 0.000 description 1
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 235000021021 grapes Nutrition 0.000 description 1
- 235000021331 green beans Nutrition 0.000 description 1
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical group O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004209 hair Anatomy 0.000 description 1
- 235000013402 health food Nutrition 0.000 description 1
- 150000002386 heptoses Chemical class 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000002951 idosyl group Chemical class C1([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000001102 lavandula vera Substances 0.000 description 1
- 235000018219 lavender Nutrition 0.000 description 1
- 235000021374 legumes Nutrition 0.000 description 1
- 150000005692 lignans Chemical class 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 108010083942 mannopine synthase Proteins 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 150000002972 pentoses Chemical class 0.000 description 1
- 229930015704 phenylpropanoid Natural products 0.000 description 1
- 150000002995 phenylpropanoid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 description 1
- 238000002098 selective ion monitoring Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 235000021012 strawberries Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 101150016309 trpC gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
(P1−1)配列番号1又は2のアミノ酸配列からなるタンパク質
(P1−2)配列番号1又は2のアミノ酸配列に1個又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、下記一般式(1)で示されるセサミノール1糖又は2糖配糖体のヘキソース残基へのβ−1→2結合の糖転移活性を有するタンパク質
(P1−3)配列番号1又は2のアミノ酸配列に対して、90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、下記一般式(1)で示されるセサミノール1糖又は2糖配糖体のヘキソース残基へのβ−1→2結合の糖転移活性を有するタンパク質
(P1−4)配列番号3又は4のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、下記一般式(1)で示されるセサミノール1糖又は2糖配糖体のヘキソース残基へのβ−1→2結合の糖転移活性を有するタンパク質
なお、本明細書中、β−1→2結合、及び、β−1→6結合は、O−グリコシド結合である。
(P2−11)配列番号5のアミノ酸配列からなるタンパク質
(P2−12)配列番号5のアミノ酸配列に1個又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、セサミノール2’−O−β−D−グルコシル(1→12)−β−D−グルコシドの1つ目のグルコース残基へのβ−1→6結合のグルコース転移活性を有するタンパク質
(P2−13)配列番号5のアミノ酸配列に対して、90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、SG2(2)の1つ目のグルコース残基へのβ−1→6結合のグルコース転移活性を有するタンパク質
(P2−14)配列番号6のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、SG2(2)の1つ目のグルコース残基へのβ−1→6結合のグルコース転移活性を有するタンパク質
(P2−15)配列番号7のアミノ酸配列からなるタンパク質
(P2−16)配列番号7のアミノ酸配列に1個又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、SG2(2)の1つ目のグルコース残基へのβ−1→6結合のグルコース転移活性を有するタンパク質
(P2−17)配列番号7のアミノ酸配列に対して、90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、SG2(2)の1つ目のグルコース残基へのβ−1→6結合のグルコース転移活性を有するタンパク質
(P2−18)配列番号8のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、SG2(2)の1つ目のグルコース残基へのβ−1→6結合のグルコース転移活性を有するタンパク質
本発明のポリヌクレオチドは、配列番号4のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする。
本発明の発現ベクターは、上記本発明のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする。
(N1−1)配列番号3又は4のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
(N1−2)配列番号3又は4のヌクレオチド配列に1個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換及び/又は付加されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであり、かつ、上記一般式(1)で示されるセサミノール1糖又は2糖配糖体の1つ目のヘキソース残基へのβ−1→2結合の糖転移活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(N1−3)配列番号3又は4のヌクレオチド配列に対して、90%以上の同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであり、かつ、上記一般式(1)で示されるセサミノール1糖又は2糖配糖体の1つ目のヘキソース残基へのβ−1→2結合の糖転移活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(N1−4)配列番号3又は4のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドからなり、かつ、上記一般式(1)で示されるセサミノール1糖又は2糖配糖体の1つ目のヘキソース残基へのβ−1→2結合の糖転移活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(N2−1)配列番号6のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
(N2−2)配列番号6のヌクレオチド配列に1個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換及び/又は付加されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであり、かつ、上記一般式(1)で示されるセサミノール1糖又は2糖配糖体の1つ目のヘキソース残基へのβ−1→6結合の糖転移活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(N2−3)配列番号6のヌクレオチド配列に対して、90%以上の同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであり、かつ、上記一般式(1)で示されるセサミノール1糖又は2糖配糖体の1つ目のヘキソース残基へのβ−1→6結合の糖転移活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(N2−4)配列番号6のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドからなり、かつ、上記一般式(1)で示されるセサミノール1糖又は2糖配糖体の1つ目のヘキソース残基へのβ−1→6結合の糖転移活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
また、本発明によれば、新規なセサミノール3糖配糖体を提供することができる。
nは、ヘキソース残基(S1)の数であり、1又は2である。
工程(i)の基質である一般式(1)で示されるセサミノール1糖又は2糖配糖体は、1種又は2種以上用いることができる。
セサミノール配糖体(1)として、SG1、SG2(2)及びSG2(6)からなる群より選択される少なくとも1種を用いることが好ましい。
また、このようなセサミノール1糖又は2糖配糖体としては、市販品を利用することもできる。このような市販品としては、例えば、製品番号:NS185201、製造元:長良サイエンス株式会社(SG2(2)の市販品)、製品番号:NS185301、製造元:長良サイエンス株式会社(SG2(6)の市販品)等があげられる。
UDP−ペントースとしては、UDP−アラビノース、UDP−キシロース等があげられる。
UDP−ヘキソースとしては、UDP−グルコース、UDP−アロース、UDP−アルトロース、UDP−マンノース、UDP−グロース、UDP−イドース、UDP−ガラクトース、UDP−タロース等があげられる。
UDP−ヘプトースとしてはUDP−セドヘプツロース等があげられる。
これらの中では、UDP−ヘキソースであることが好ましく、UDP−グルコースであることがさらに好ましい。
UDP−糖が、UDP−グルコースであると、本発明におけるタンパク質(P1)との基質特異性が高く、タンパク質(P1)によるセサミノール2糖又は3糖配糖体の合成速度が速くなり、効率的にセサミノール2糖又は3糖配糖体を製造することができる。
具体的には、本発明におけるタンパク質(P1)は、以下のタンパク質(P1−1)〜(P1−4)からなる群より選択される少なくとも1種である。これらは、単独で用いてもよく、2種以上を併用してもよい。
(P1−2)配列番号1又は2のアミノ酸配列に1個又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、上記一般式(1)で示されるセサミノール1糖又は2糖配糖体のヘキソース残基へのβ−1→2結合の糖転移活性を有するタンパク質
(P1−3)配列番号1又は2のアミノ酸配列に対して、90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、上記一般式(1)で示されるセサミノール1糖又は2糖配糖体のヘキソース残基へのβ−1→2結合の糖転移活性を有するタンパク質
(P1−4)配列番号3又は4のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、上記一般式(1)で示されるセサミノール1糖又は2糖配糖体のヘキソース残基へのβ−1→2結合の糖転移活性を有するタンパク質
本発明において、セサミノール配糖体に転移される糖は、上述したUDP−糖における糖と同じであり、ペントース、ヘキソース、ヘプトースが挙げられ、好ましくはヘキソースであり、より好ましくはグルコースである。
一般式(1)で示されるセサミノール1糖又は2糖配糖体のヘキソース残基へのβ−1→2結合の糖転移活性は、SG1のグルコース残基へのβ−1→2結合のグルコース転移活性(I)、SG2(6)の1つ目のグルコース残基へのβ−1→2結合のグルコース転移活性(II)、及び、SG2(2)の2つ目のグルコース残基へのβ−1→2結合のグルコース転移活性(III)のいずれか1つ又は2以上の活性であることが好ましく、(I)〜(III)の全ての活性であることがより好ましい。
このような欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸の数として、1又は数個は、1〜30個であることが好ましく、1〜20個であることがより好ましく、1〜10個であることがさらに好ましく、1〜5であることが特に好ましい。
「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5%SDS、50%ホルムアミド、32℃の条件である。「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5%SDS、50%ホルムアミド、42℃又は5×SSC、1% SDS、50mM Tris−HCl(pH7.5)、50%ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5%SDS、50%ホルムアミド、50℃又は0.2×SSC、0.1% SDS、65℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い同一性を有するポリヌクレオチドが効率的に得られることが期待できる。ただし、ストリンジェンシーに影響する要素としては、温度、塩濃度、プローブの濃度及び長さ、イオン強度、時間等の複数の要素が考えられ、当業者であれば、これらの要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
「ストリンジェントな条件」は、例えば、前述したSambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor, Laboratory Press 2001等に記載の条件を採用することもできる。
なお、本明細書において、以下、配列番号1のアミノ酸配列からなるタンパク質を「タンパク質SiGGT21842」と、配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質を「タンパク質SiGGT21842R229Q」とも記載する。
セサミノール配糖体(1)の1つ目のヘキソース残基へのβ−1→6結合の糖転移活性は、SG1のグルコース残基へのβ−1→6結合のグルコース転移活性(IV)、及び、SG2(2)の1つ目のグルコース残基へのβ−1→6結合のグルコース転移活性(V)のいずれか1つ又は2つの活性であることが好ましく、(IV)及び(V)の両方の活性であることがより好ましい。
(P2−1)配列番号5のアミノ酸配列からなるタンパク質
(P2−2)配列番号5のアミノ酸配列に1個又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、セサミノール配糖体(1)の1つ目のヘキソース残基の6位に、糖をβ−1→6結合する糖転移活性を有するタンパク質
(P2−3)配列番号5のアミノ酸配列に対して、90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、セサミノール配糖体(1)の1つ目のヘキソース残基の6位に、糖をβ−1→6結合する糖転移活性を有するタンパク質
(P2−4)配列番号6のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、セサミノール配糖体(1)の1つ目のヘキソース残基の6位に、糖をβ−1→6結合する糖転移活性を有するタンパク質
(P2−5)配列番号7のアミノ酸配列からなるタンパク質
(P2−6)配列番号7のアミノ酸配列に1個又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、セサミノール配糖体(1)の1つ目のヘキソース残基の6位に、糖をβ−1→6結合する糖転移活性を有するタンパク質
(P2−7)配列番号7のアミノ酸配列に対して、90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、セサミノール配糖体(1)の1つ目のヘキソース残基の6位に、糖をβ−1→6結合する糖転移活性を有するタンパク質
(P2−8)配列番号8のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、セサミノール配糖体(1)の1つ目のヘキソース残基の6位に、糖をβ−1→6結合する糖転移活性を有するタンパク質
なお、本明細書において、以下、配列番号5のアミノ酸配列からなるタンパク質を「タンパク質SiGGT21646」と、配列番号7のアミノ酸配列からなるタンパク質を「UGT94D1」とも記載する。
セサミノール1糖又は2糖配糖体及びUDP−糖に、タンパク質(P2)を作用させる工程を行うことにより、β−1→6結合を分子内に1個含むセサミノール2糖又は3糖配糖体を得ることができる。UDP−糖及びその好ましい態様は、上述した通りである。
この場合、形質転換体の宿主としては、植物、好ましくはゴマ属植物(より好ましくはゴマ);大腸菌、酵母、麹菌等の微生物を用いることが好ましい。
本発明のセサミノール2糖又は3糖配糖体の製造方法によりセサミノール3糖配糖体を製造する場合、該セサミノール3糖配糖体は、上記式(5)で示されるSG3(2,2)、又は、上記式(4)で示されるSG3(2,6)であることが好ましい。
本発明のセサミノール2糖又は3糖配糖体の製造方法は、これらのセサミノール2糖又は3糖配糖体の製造方法として好適である。
SG2(2)の製造方法は、SG1及びUDP−グルコースにタンパク質(P1)を作用させる工程(i)を含む。この工程を行う前にSG1を準備する工程を行ってもよい。
SG1を準備する方法としては、特に限定されない。例えば、上述したように、特許文献1又は非特許文献1に記載のUGT71A9を、セサミノール及びUDP−グルコースに作用させることにより得ることができる。
また、ゴマ種子等から抽出、精製を行いSG1を準備してもよい。
SG1及びUDP−グルコースにタンパク質(P1)を作用させることにより、SG1のグルコース残基へのβ−1→2結合のグルコース転移によりSG2(2)を合成する。
上記では、タンパク質(P1)は、SG1のグルコース残基へのβ−1→2結合のグルコース転移活性(I)を有するセサミノールGGTとして機能する。
上記第一の方法において、タンパク質(P2)は、上記糖転移活性として、SG1のグルコース残基へのβ−1→6結合のグルコース転移活性(IV)を有することが好ましい。このようなタンパク質(P2)として、以下タンパク質(P2−11)〜(P2−18)からなる群より選択される少なくとも1種であることが好ましい。これらは、単独で用いてもよく、2種以上を併用してもよい。
(P2−12)配列番号5のアミノ酸配列に1個又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、SG2(2)の1つ目のグルコース残基へのβ−1→6結合のグルコース転移活性を有するタンパク質
(P2−13)配列番号5のアミノ酸配列に対して、90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、SG2(2)の1つ目のグルコース残基へのβ−1→6結合のグルコース転移活性を有するタンパク質
(P2−14)配列番号6のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、SG2(2)の1つ目のグルコース残基へのβ−1→6結合のグルコース転移活性を有するタンパク質
(P2−15)配列番号7のアミノ酸配列からなるタンパク質
(P2−16)配列番号7のアミノ酸配列に1個又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、SG2(2)の1つ目のグルコース残基へのβ−1→6結合のグルコース転移活性を有するタンパク質
(P2−17)配列番号7のアミノ酸配列に対して、90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、SG2(2)の1つ目のグルコース残基へのβ−1→6結合のグルコース転移活性を有するタンパク質
(P2−18)配列番号8のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、SG2(2)の1つ目のグルコース残基へのβ−1→6結合のグルコース転移活性を有するタンパク質
タンパク質(P2−11)及び(P2−15)は、タンパク質(P2−1)及び(P2−5)と同じである。タンパク質(P2−12)〜(P2−14)及び(P2−16)〜(P2−18)は、タンパク質(P2−2)〜(P2−4)及び(P2−6)〜(P2−8)の好ましい態様の一例であり、アミノ酸の同一性等の好ましい態様は、タンパク質(P2−2)〜(P2−4)及び(P2−6)〜(P2−8)と同じである。
本工程では、タンパク質(P2)を用いることにより、SG2(2)と、UDP−グルコースとを反応させ、SG2(2)の1つ目のグルコース残基へのβ−1→6結合のグルコース転移によりSG3(2,6)を合成する。反応は、水溶液中で行うことが好ましい。この工程における反応条件は、特に限定されないが、10〜50℃、pH5〜8であることが好ましい。反応温度は、30〜40℃とすることがより好ましい。基質とタンパク質(P2)の割合は適宜設定すればよい。
反応条件は、特に限定されず、上記のタンパク質(P2)を用いる反応と同じとすればよい。
本工程では、タンパク質(P2)を用いることにより、SG1と、UDP−グルコースとを反応させ、SG2(6)を合成する。
なお、好ましい反応条件は、上記のタンパク質(P2)を使用する際と同様である。
タンパク質(P1)用いることにより、SG2(6)と、UDP−グルコースとを反応させ、SG2(6)の1つ目のグルコース残基へのβ−1→2結合のグルコース転移によりSG3(2,6)を合成する。
上記において、タンパク質(P1)は、SG2(6)の1つ目のグルコース残基へのβ−1→2結合のグルコース転移活性(II)を有するタンパク質として機能する。
SG3(2,2)を製造する方法は、SG2(2)及びUDP−グルコースにタンパク質(P1)を作用させる工程(i)を含む。SG2(2)は、上述したSG1及びUDP−グルコースにタンパク質(P1)を作用させる工程(i)を行って製造してもよい。この場合、製造方法は、SG1のグルコース残基へのβ−1→2結合のグルコース転移によりSG2(2)を生成させる工程(i)、及び、該SG2(2)及びUDP−グルコースに上記タンパク質(P1)を作用させ、SG3(2,2)を生成させる工程を含む。また、上記のSG1を準備する工程を含んでいてもよい。
本工程では、タンパク質(P1)を用いることにより、SG1とUDP−グルコースとを反応させ、SG1のグルコース残基へのβ−1→2結合のグルコース転移によりSG2(2)を合成する。
タンパク質(P1)を用いることにより、SG2(2)と、UDP−グルコースとを反応させ、SG2(2)の2つ目のグルコース残基へのβ−1→2結合のグルコース転移によりSG3(2,2)を合成する。
上記において、タンパク質(P1)は、SG2(2)の2つ目のグルコース残基へのβ−1→2結合のグルコース転移活性(III)を有するタンパク質として機能する。
そのため、SG3(2,2)を製造する方法の反応系には、タンパク質(P2)が存在していないことが好ましい。
図1に示すように、タンパク質(P1)及び所望によりタンパク質(P2)を用い、セサミノール1糖又は2糖配糖体を原料としてセサミノール2糖又は3糖配糖体を製造することができる。
これらの各反応は、別々の反応系で行ってもよく、同一の反応系で行ってもよい。
現在まで、配列番号1及び2のアミノ酸配列からなるタンパク質の機能は知られていなかった。
すなわち、これらタンパク質は、SG1のグルコース残基へのβ−1→2結合のグルコース転移活性(I)、SG2(6)の1つ目のグルコース残基へのβ−1→2結合のグルコース転移活性(II)、及び、SG2(2)の2つ目のグルコース残基へのβ−1→2結合のグルコース転移活性(III)を有する。上述したようにタンパク質(P1)はUDP−糖特異的糖転移酵素である。
配列番号2のアミノ酸配列は新規なアミノ酸配列である。すなわち、タンパク質SiGGT21842R229Qは新規なタンパク質である。配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質も、本発明の1つである。
配列番号4のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドも、本発明の1つである。
これらタンパク質の製造方法としては、以下の方法があげられる。
例えば、配列番号3又は4のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドをベクターに組み込んで発現ベクターを作製する。上記発現ベクターを宿主に導入し、宿主の形質転換を行い形質転換体とする。形質転換体及びその製造方法は後述する。
そして、該形質転換体にタンパク質を発現させ、タンパク質を精製することにより上記タンパク質(P1)を得ることができる。
これらの中では、ゴマ属植物が好ましく、ゴマの植物体又はその部分であることが好ましい。
宿主の培養方法及びタンパク質の発現方法は、宿主の種類に応じた公知の方法を適用することができる。
このような方法により、タンパク質(P1−1)を製造することができる。
(N1−2)配列番号3又は4のヌクレオチド配列に1個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換及び/又は付加されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであり、かつ、上記一般式(1)で示されるセサミノール1糖又は2糖配糖体のヘキソース残基へのβ−1→2結合の糖転移活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(N1−3)配列番号3又は4のヌクレオチド配列に対して、90%以上の同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであり、かつ、上記一般式(1)で示されるセサミノール1糖又は2糖配糖体のヘキソース残基へのβ−1→2結合の糖転移活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(N1−4)配列番号3又は4のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドからなり、かつ、上記一般式(1)で示されるセサミノール1糖又は2糖配糖体のヘキソース残基へのβ−1→2結合の糖転移活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
タンパク質(P2−5)は、配列番号7のアミノ酸配列からなるタンパク質である。
現在まで、配列番号5のアミノ酸配列からなるタンパク質の機能は知られていなかった。
すなわち、これらタンパク質は、SG1のグルコース残基へのβ−1→6結合のグルコース転移活性(IV)、及び、SG2(2)の1つ目のグルコース残基へのβ−1→6結合のグルコース転移活性(V)を有する。上述したようにタンパク質(P2)はUDP−糖特異的糖転移酵素である。
上記タンパク質(P1)を製造する方法において、配列番号3又は4のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの代わりに、以下のポリヌクレオチド(N2−1)〜(N2−8)のいずれか又は2以上をベクターに組み込んで発現ベクターを作製することにより、タンパク質(P2−1)(タンパク質SiGGT21646)等のタンパク質(P2)を製造することができる。
(N2−1)配列番号6のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
(N2−2)配列番号6のヌクレオチド配列に1個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換及び/又は付加されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであり、かつ、上記一般式(1)で示されるセサミノール1糖又は2糖配糖体の1つ目のヘキソース残基へのβ−1→6結合の糖転移活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(N2−3)配列番号6のヌクレオチド配列に対して、90%以上の同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであり、かつ、上記一般式(1)で示されるセサミノール1糖又は2糖配糖体の1つ目のヘキソース残基へのβ−1→6結合の糖転移活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(N2−4)配列番号6のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドからなり、かつ、上記一般式(1)で示されるセサミノール1糖又は2糖配糖体の1つ目のヘキソース残基へのβ−1→6結合の糖転移活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(N2−5)配列番号8のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
(N2−6)配列番号8のヌクレオチド配列に1個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換及び/又は付加されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであり、かつ、上記一般式(1)で示されるセサミノール1糖又は2糖配糖体の1つ目のヘキソース残基へのβ−1→6結合の糖転移活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(N2−7)配列番号8のヌクレオチド配列に対して、90%以上の同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであり、かつ、上記一般式(1)で示されるセサミノール1糖又は2糖配糖体の1つ目のヘキソース残基へのβ−1→6結合の糖転移活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(N2−8)配列番号8のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドからなり、かつ、上記一般式(1)で示されるセサミノール1糖又は2糖配糖体の1つ目のヘキソース残基へのβ−1→6結合の糖転移活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
好ましくは、ポリヌクレオチド(N1−1)〜(N1−4)からなる群より選択される少なくとも1つのポリヌクレオチドを含む発現ベクターが導入された非ヒト宿主である形質転換体であり、この形質転換体に、さらに、ポリヌクレオチド(N2−1)〜(N2−4)からなる群より選択される少なくとも1つのポリヌクレオチドを含む発現ベクターが導入されていてもよい。
この他に、例えば、ゴマ種子からタンパク質(P1)及び(P2)を抽出、精製することにより、タンパク質(P1)及び(P2)を得てもよい。
セサミノール2糖又は3糖配糖体合成能が異なる植物体としては、例えば、既存品種と比較してセサミノール2糖又は3糖配当体合成能が高い、又は、低い植物体があげられる。
セサミノール2糖又は3糖配糖体としては、上述した製造方法により製造されるセサミノール2糖又は3糖配糖体が挙げられ、好ましくは、SG2(2)、SG3(2,6)、SG3(2,2)、及び、SG2(6)からなる群より選択される1種又は2種以上である。
各工程について以下に詳述する。
まず、植物体又はその部分からDNA又はRNAであるポリヌクレオチドを抽出する。
抽出したポリヌクレオチドがRNAである場合、RNAを逆転写してcDNAを合成する。
ポリヌクレオチドの抽出、及び、cDNAの合成は公知の方法を用いることができる。
DNA又はRNAを抽出する被検植物の部位は特に限定されないが、例えば、ゴマの植物体を選別する場合には、ゴマの種子等が好ましい。
次に、DNA又はcDNAから配列番号3、4又は6のヌクレオチド配列の少なくとも一部の配列を含むポリヌクレオチドを増幅し、増幅DNA断片を作製する。
ポリヌクレオチドを増幅する方法としては、特に限定されないが、例えばPCRを用いることができる。
DNAの増幅方法や、PCRで用いるプライマーの設計及び合成は、当該技術分野において周知であり、当業者であれば配列に基づき容易に実施可能である。
次に、増幅DNA断片のヌクレオチド配列と配列番号3、4又は6のヌクレオチド配列とを比較することにより、セサミノールGGTの活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の遺伝的変異を特定し、遺伝的変異を含む遺伝子を有する変異植物体を選別する。
なお、本明細書において、「遺伝的変異」とは、突然変異及び/又は遺伝子多型のことを意味する。
次に、変異植物体における遺伝的変異を含む遺伝子の発現量、又は、遺伝的変異を含む遺伝子がコードするタンパク質のセサミノールGGTの活性と、既存品種の配列番号3、4又は6のヌクレオチド配列を含む遺伝子の発現量、又は、配列番号3、4又は6のヌクレオチド配列を含む遺伝子がコードするタンパク質のセサミノールGGTの活性とを比較する。
また、変異植物体における遺伝的変異を含む遺伝子の発現量が、既存品種の配列番号3、4又は6のヌクレオチド配列を含む遺伝子の発現量よりも少ない場合や、遺伝的変異を含む遺伝子がコードするタンパク質のセサミノールGGTの活性が、配列番号3、4又は6のヌクレオチド配列を含む遺伝子がコードするタンパク質のセサミノールGGTの活性よりも低い場合、このような変異植物体は、既存品種と比較してセサミノール2糖又は3糖配糖体合成能が低い植物体であると選別することができる。
本発明の植物体の選別方法の第2例は、配列番号3、4又は6のヌクレオチド配列の少なくとも一部の配列を含むポリヌクレオチドの発現量を測定する工程を含み、該発現量を指標として、セサミノール2糖又は3糖配糖体合成能が異なる植物体を選別する。
ポリヌクレオチドは、配列番号3、4又は6のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであり、より好ましくは配列番号3、4又は6のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドである。本発明においては、配列番号3、4又は6のヌクレオチド配列のポリヌクレオチドの発現量を指標とすることが好ましい。これらの2以上のヌクレオチド配列の発現を指標として用いてもよい。本発明のポリヌクレオチドの発現量の測定方法は特に限定されず、上述した方法により植物体又はその部分からRNAを抽出し、上記ポリヌクレオチドのmRNAを定量すればよい。
配列番号3、4又は6のヌクレオチド配列を有する遺伝子の発現量が多い植物体は、タンパク質SiGGT21842、タンパク質SiGGT21842R229Q、又は、タンパク質SiGGT21646の発現量が多いことになる。
そのため、配列番号3、4又は6のヌクレオチド配列を有する遺伝子の発現量が多い植物体を、セサミノール2糖又は3糖配糖体合成能が高い植物体であると選別することができる。
また、配列番号3、4又は6のヌクレオチド配列を有する遺伝子の発現量が少ない植物体は、タンパク質SiGGT21842、タンパク質SiGGT21842R229Q、又は、タンパク質SiGGT21646の発現量が少ないことになる。
そのため、配列番号3、4又は6のヌクレオチド配列を有する遺伝子の発現量が少ない植物体を、セサミノール2糖又は3糖配糖体合成能が低い植物体であると選別することができる。
セサミノール2糖又は3糖配糖体合成能が高い植物体は、好ましくは、その植物の種に含まれる既存品種に対してセサミノール2糖又は3糖配糖体合成能が高い植物体である。例えば、ある植物体(被検植物体)と既存品種の植物体との間で上記ポリヌクレオチドの発現量を比較し、既存品種よりも該発現量が多い植物体を選別することにより、既存品種に対してセサミノール2糖又は3糖配糖体合成能が高い植物体を選別することができる。
また、例えば、被検植物体と既存品種の植物体との間で上記ポリヌクレオチドの発現量を比較し、既存品種よりも該発現量が少ない植物体を選別することにより、既存品種に対してセサミノール2糖又は3糖配糖体合成能が低い植物体を選別することができる。
SG1 :セサミノール2’−O−β−D−グルコシド
Epi−SG1 :セサミノール2’−O−β−D−グルコシドのエピマー
SG2(2) :セサミノール2’−O−β−D−グルコシル(1→2)−β
−D−グルコシド
SG2(6) :セサミノール2’−O−β−D−グルコシル(1→6)−β
−D−グルコシド
Epi−SG2(6) :セサミノール2’−O−β−D−グルコシル(1→6)−β
−D−グルコシドのエピマー
SG3(2,2) :セサミノール2’−O−β−D−グルコシル(1→2)−O
−[β−D−グルコシル(1→2)]−β−D−グルコシド
SG3(2,6) :セサミノール2’−O−β−D−グルコシル(1→2)−O
−[β−D−グルコシル(1→6)]−β−D−グルコシド
Epi−SG3(2,6):セサミノール2’−O−β−D−グルコシル(1→2)−O
−[β−D−グルコシル(1→6)]−β−D−グルコシド
のエピマー
本明細書において用いる分子生物学的手法は、他で詳述しない限り、Molecular Cloning(Sambrookら, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 2001)に記載の方法に従った。
ゴマ種子のExpressed Tag Seq(EST)の中から先行技術文献(非特許文献1)の配糖体化酵素遺伝子(UGT)とは異なるUGT様配列を相同性検索により探索を行った。その結果、配列番号7のアミノ酸配列からなるUGT94D1とDNAレベルで54%、アミノ酸レベルで42%の配列同一性を示す配列番号1のアミノ酸配列からなるタンパク質SiGGT21842と、DNAレベルで56%、アミノ酸レベルで45%の配列同一性を示す配列番号5のアミノ酸配列からなるタンパク質SiGGT21646を見出した。なお、これらタンパク質を「SiGGTタンパク質」とも記載し、これらのタンパク質をコードする遺伝子を以下「SiGGT遺伝子」とも記載する。
これらのSiGGT遺伝子は両者とも約1400bpのヌクレオチド長を有し、完全長オープンリーディングフレーム(ORF)を含むと考えられたため、下記のプライマーセット(配列番号9及び10、並びに、配列番号11及び12)でゴマ種子から調製したcDNAを鋳型にPCRによる増幅を行った。
なお、ゴマ種子cDNAについてはゴマ種子からRNeasy Plant Miniキット(QIAGEN)を用いて総RNAを抽出し、そのうち0.5μgをRandom Oligo−dTプライマーで逆転写(RT)反応することによって得た。
5’−TGCCGCGCGGCAGCCATATGGAGAAAAAAGAAGCTAAATTCAG−3’(配列番号9)
タンパク質SiGGT21842用リバースプライマー(SiGGT−21842−pET−RV):
5’−GTTAGCAGCCGGATCCTCACTTTTCACTGCCTAATCTG−3’(配列番号10)
5’−TGCCGCGCGGCAGCCATATGGGTTCAGACAAAGAGTGC−3’(配列番号11)
タンパク質SiGGT21646用リバースプライマー(BamHI−SiGGT−21646−pET−RV):
5’−GTTAGCAGCCGGATCCTTAATTCCCACAAATTTGTGCTAACTTG−3’(配列番号12)
図2の(a)は、ゴマ種子cDNAを鋳型として、タンパク質SiGGT21842用フォワードプライマー及びタンパク質SiGGT21842用リバースプライマーを用いて得られたPCR産物のアガロースゲル電気泳動の写真であり、(b)は、ゴマ種子cDNAを鋳型として、タンパク質SiGGT21646用フォワードプライマー及びタンパク質SiGGT21646用リバースプライマーを用いて得られたPCR産物のアガロースゲル電気泳動の写真である。
図2の(a)中、Aのレーンは、タンパク質SiGGT21842用プライマーを用いたPCR産物であり、図2の(b)中、Bのレーンは、タンパク質SiGGT21646用プライマーを用いたPCR産物であり、図2(a)及び(b)中のMはマーカーである。
また、図2(a)及び(b)の1400bp付近のバンドを矢印で示す。
なお、図2中、Mは、サイズマーカーである。
次に、PCR産物をGeneArt Seamless Cloning and Assembly Enzyme Mix(Thermo Fisher Scientific)を用いて製造業者が推奨する方法で大腸菌発現ベクターpET15b(Novagene)にサブクローニングした。本ベクターのNdeIサイト上流にあるHisタグをコードするサイトとSiGGT遺伝子のORFが合っており、SiGGTタンパク質のN末端にHisタグが融合されたキメラタンパク質として発現するよう設計した。
また、各発現ベクターの接続部分にエラーがないことも確認した。
SiGGT21842発現ベクター、SiGGT21646発現ベクター及びネガティブコントロールとして発現ベクターpET15b(空のpET15bベクター)を用い、定法に従って大腸菌BL21(DE3)株を形質転換した。
得られた各形質転換体を、50μg/mLのアンピシリンを含むLB培地(10g/L typtone pepton, 5g/L yeast extract, 1g/L NaCl)4mLにて、37℃で一晩振盪培養した。静止期に達した培養液2mLを同組成の培地98mLに接種し、Overnight Express Autoinduction System 1(Novagen社)を用いて25℃で20時間振盪培養した。
培養した形質転換体を遠心分離(5,000×g、10min)にて集菌し、Buffer S[20mM HEPESバッファー(pH7.5)、20mM imidazol、 14mM β−メルカプトエタノール]を1mL/g cellとなるように添加して懸濁した。
続いて、超音波破砕(15sec×8回)を行い、遠心分離(15,000×g、15min)を行った。得られた上清を粗酵素液として回収した。
粗酵素液をBuffer Sにて平衡化したHis SpinTrap(GE Healthcare社)に負荷し、遠心分離(70×g、30sec)した。
Buffer Sで洗浄後、100mM、及び、500mMのイミダゾールを含むBuffer S 各5mLにて、カラムに結合したタンパク質を段階的に溶出した。
各溶出画分をMicrocon YM−30(Amicon社)を用いて20mM HEPESバッファー(pH7.5)、14mM β−メルカプトエタノールにバッファー置換した。このバッファー置換した生成酵素溶液を以下の反応に用いた。
SiGGT21842発現ベクター及びSiGGT21646発現ベクターを用いて得られた粗酵素液から得られた500mM イミダゾール溶出画分において、HisTag融合SiGGTタンパク質の推定分子質量である分子質量50kDa付近の位置にタンパク質のバンドが観察された。
SiGGT21842発現ベクター及びSiGGT21646発現ベクターを用いて得られた各粗酵素液から得られた500mM イミダゾール溶出画分において、分子質量約50kDa付近にタンパク質が検出された。一方、発現ベクターpET15bを用いて得られた粗酵素液から得られた溶出画分(以下、「ネガティブコントロール画分」とも記載する)には、上記分子質量約50kDaのタンパク質が検出されなかった。
以下のに示す方法で、タンパク質SiGGT21842とSG1との反応を解析した。
装置名:LCMS−IT−TOF(製造元:島津製作所:Prominence LC20シリーズ)
カラム:Waters Sunfire C18 3.5um 2.0mm I.D.×20mm
移動相:A:10mM 酢酸アンモニウム水溶液 B: アセトニトリル
流速:0.4mL/min
カラムオーブン:40℃
グラジエント:B(v/v%):20%(0min)−80%(6min)−80%(8min)−20%(8.1min)−20%(12min)
本条件では、セサミノール2糖配糖体のSG2(2)のピークは保持時間3.91分、SG2(6)のピークは保持時間3.77分であり、これらは分離される。
ESI (negative mode)
Selected ion monitoring:m/z 317,479,641,687,803及び849
図3の(a)は、SG1及び精製タンパク質SiGGT21842溶液を用いた反応液の逆相LC−MS分析のチャートであり、図3の(b)は、SG2(2)の標準品の逆相LC−MS分析のチャートであり、図3の(c)は、SG1及びネガティブコントロール画分を用いた反応液の逆相LC−MS分析のチャートである。
すなわち、図3の(a)は、実施例1の反応液の逆相LC−MS分析のチャートであり、図3の(b)は、実施例1のポジティブコントロールとして標準品のSG2(2)を用いた逆相LC−MS分析のチャートであり、図3の(c)は、実施例1のネガティブコントロールの反応液の逆相LC−MS分析のチャートである。
なお、図3(c)に示す保持時間4.39分のピークは、SG1であり、保持時間4.46分のピークは、Epi−SG1のピークであると考えられる。
以下に示す方法で、タンパク質SiGGT21842とSG2(2)との反応を解析した。
図4の(a)は、SG2(2)及び精製タンパク質SiGGT21842溶液を用いた反応液の逆相LC−MS分析のチャートであり、図4の(b)は、SG2(2)及びネガティブコントロール画分を用いた反応液の逆相LC−MS分析のチャートである。
すなわち、図4の(a)は、実施例2の反応液の逆相LC−MS分析のチャートであり、図4の(b)は、実施例2のネガティブコントロールの反応液の逆相LC−MS分析のチャートである。
なお、図4(a)において保持時間3.90分のピークは、SG2(2)のピークである。
また、図4(b)に示す、保持時間3.89分のピークは、SG2(2)のピークである。
以下に示す方法で、タンパク質SiGGT21842とSG2(6)との反応を解析した。
図5の(a)は、SG2(6)及び精製タンパク質SiGGT21842溶液を用いた反応液の逆相LC−MS分析のチャートであり、図5の(b)は、SG3(2,6)及びネガティブコントロール画分を用いた反応液の逆相LC−MS分析のチャートであり、図5の(c)は、SG2(6)及びネガティブコントロール画分を用いた反応液の逆相LC−MS分析のチャートである。
すなわち、図5の(a)は、実施例3の反応液の逆相LC−MS分析のチャートであり、図5の(b)は、実施例3のポジティブコントロールの反応液の逆相LC−MS分析のチャートであり、図5の(c)は、実施例3のネガティブコントロールの反応液の逆相LC−MS分析のチャートである。
なお、図5(b)において保持時間3.30分のピークは、SG3(2,6)のピークである。
なお、図5(c)において保持時間3.80分のピークは、SG2(6)のピークである。
以下に示す方法で、セサミノールを出発物質としてSG3(2,6)を製造する方法を検討した。
反応液(2mM UDP−グルコース,糖受容体基質として0.1mM セサミノール,100mM リン酸カリウムバッファー(pH7.5),ネガティブコントロール画分25μLを蒸留水で50μLに調製)を、30℃、1時間反応させた。反応後の反応液5μLについて上記条件で逆相LC−MS分析を行った。結果を図6(a)に示す。
図6の(a)は、実施例4のネガティブコントロールの反応液の逆相LC−MS分析のチャートである。
反応液(2mM UDP−グルコース,糖受容体基質として0.1mM セサミノール,100mM リン酸カリウムバッファー(pH7.5),UGT71A9,UGT94D1を蒸留水で50μLに調整)を、30℃、1時間反応させた。反応後の反応液5μLについて上記条件で逆相LC−MS分析を行った。結果を図6(b)に示す。
図6の(b)は、実施例4の第1反応の反応液の逆相LC−MS分析のチャートである。
なお、UGT71A9及びUGT94D1は、非特許文献1に記載の方法で準備した。
反応液(2mM UDP−グルコース,糖受容体基質として0.1mM セサミノール,100mM リン酸カリウムバッファー(pH7.5),UGT71A9、UGT94D1,精製タンパク質SiGGT21842溶液25μLを蒸留水で50μLに調製し、30℃、1時間反応させた。反応後の反応液5μLについて上記条件で逆相LC−MS分析を行った。結果を図6(c)に示す。
図6の(c)は、実施例4の第2反応の反応液の逆相LC−MS分析のチャートである。
図6(b)では、保持時間3.77分、及び、保持時間3.85分の位置にピークが認められた。
図6(c)では、保持時間3.30分、及び、保持時間3.40分の位置にピークが認められた。
この結果より、UGT71A9及びUGT94D1により、SG2(6)が生成することが確認された。またこれらの酵素は、エピマーを厳密に区別していないことが示唆された。
つまり、第1反応として、UGT71A9及びUGT94D1とセサミノールとが反応し、
SG2(6)が生成し、第2反応として、タンパク質SiGGT21842とSG2(6)とが反応しSG3(2,6)が生成することが確認できた。
また、タンパク質SiGGT21842は、エピマーを厳密に区別していないことが示唆された。
タンパク質SiGGT21842の代わりにタンパク質SiGGT21842R229Qを用いて上記(タンパク質SiGGT21842の機能解析1)〜(タンパク質SiGGT21842の機能解析4)と同様の試験を行ったところ、タンパク質SiGGT21842R229Qはタンパク質SiGGT21842と同じ機能を有していることが判明した。
以下の試験例1〜7に示す方法で、タンパク質SiGGT21646の機能を解析した。
糖受容体基質及び酵素の組み合わせを表2に示すようにして試験例1〜7の反応液を準備した。
各反応液は、2mM UDP−グルコース,0.1mM 糖受容体基質、100mM リン酸カリウムバッファー(pH7.5)、酵素溶液又はネガティブコントロール画分を25μL含み、蒸留水で50μLに調製された。
すなわち、試験例1の反応液は、糖受容体基質としてセサミノールを含み、酵素としてタンパク質SiGGT21646を含む。
試験例2の反応液は、糖受容体基質としてSG2(2)を含み、酵素としてタンパク質SiGGT21646を含む。
試験例3の反応液は、糖受容体基質としてセサミノールを含み、酵素としてUGT71A9及びタンパク質SiGGT21646を含む。
試験例4の反応液は、糖受容体基質としてSG2(2)を含み、酵素としてUGT94D1を含む。
試験例5の反応液は、糖受容体基質としてセサミノールを含み、酵素としてUGT71A9及びUGT94D1を含む。
試験例6の反応液は、糖受容体基質としてSG2(6)を含み、酵素としてタンパク質SiGGT21646を含む。
試験例7の反応液は、糖受容体基質としてSG2(6)を含み、酵素としてUGT94D1を含む。
図7は、試験例1の反応液の逆相LC−MS分析のチャートである。
図8は、試験例2の反応液の逆相LC−MS分析のチャートである。
図9は、試験例3の反応液の逆相LC−MS分析のチャートである。
図10は、試験例4の反応液の逆相LC−MS分析のチャートである。
図11は、試験例5の反応液の逆相LC−MS分析のチャートである。
図12は、試験例6の反応液の逆相LC−MS分析のチャートである。
図13は、試験例7の反応液の逆相LC−MS分析のチャートである。
一方、図8に示すようにタンパク質SiGGT21646をSG2(2)と反応させたところグルコースが1分子付加されたピークが認められ、これは保持時間からセサミノSG3(2,6)と同定された。
また、図9に示すように、UGT71A9及びタンパク質SiGGT21646をセサミノールと反応させたところ、グルコースが2分子付加されたピークが認められ、これは保持時間からセサミノールSG2(6)と同定された。
図10及び図11に示すようにこれらの反応はUGT94D1でも同様にみられることと、及び、図12及び図13に示すようにこれらタンパク質はSG2(6)をグルコシル化する活性がほとんどないことから、タンパク質SiGGT21646はUGT94D1と同じように、SG1のグルコース残基の6位、及び、SG2(2)の一つ目のグルコース残基の6位をグルコシル化する糖特異的糖転移酵素であることが示された。
さらにタンパク質(P1)を利用して、SG2(2)の2つ目のグルコース残基の2位をグルコシル化することができ、SG3(2,2)を製造することができる。
今回、タンパク質(P1)に含まれるタンパク質SiGGT21842及びタンパク質SiGGT21842R229Qの機能を解析することにより、セサミノールからSG3(2,6)までの生合成経路の全容が明らかになった。そのため、植物のみならず微生物において水溶性リグナン配糖体であるセサミノール3糖配糖体、その他類縁化合物を生産させるための育種マーカーおよび分子ツールを与えうる。
Claims (14)
- セサミノール2糖又は3糖配糖体の製造方法であって、
下記一般式(1)で示されるセサミノール1糖又は2糖配糖体及びUDP−グルコースに、下記タンパク質(P1−1)〜(P1−3)からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質(P1)を作用させる工程(i)を含むことを特徴とするセサミノール2糖又は3糖配糖体の製造方法。
(P1−1)配列番号1又は2のアミノ酸配列からなるタンパク質
(P1−2)配列番号1又は2のアミノ酸配列に1個又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、下記一般式(1)で示されるセサミノール1糖又は2糖配糖体のグルコース残基へのβ−1→2結合のグルコース転移活性を有するタンパク質
(P1−3)配列番号1又は2のアミノ酸配列に対して、90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、下記一般式(1)で示されるセサミノール1糖又は2糖配糖体のグルコース残基へのβ−1→2結合のグルコース転移活性を有するタンパク質
- 前記一般式(1)で示されるセサミノール1糖又は2糖配糖体のグルコース残基へのβ−1→2結合のグルコース転移活性が、
セサミノール2’−O−β−D−グルコシドのグルコース残基へのβ−1→2結合のグルコース転移活性(I)、
セサミノール2’−O−β−D−グルコシル(1→6)−β−D−グルコシドの1つ目のグルコース残基へのβ−1→2結合のグルコース転移活性(II)、及び、
セサミノール2’−O−β−D−グルコシル(1→2)−β−D−グルコシドの2つ目のグルコース残基へのβ−1→2結合のグルコース転移活性(III)のいずれか1つ又は2以上である請求項1に記載のセサミノール2糖又は3糖配糖体の製造方法。 - 前記式(3)に示されるセサミノール2’−O−β−D−グルコシル(1→2)−β−D−グルコシド及びUDP−グルコースに下記タンパク質(P2−11)〜(P2−13)及び(P2−15)〜(P2−17)からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質(P2)を作用させ、下記式(4)に示されるセサミノール2’−O−β−D−グルコシル(1→2)−O−[β−D−グルコシル(1→6)]−β−D−グルコシドを生成させる工程(ii)を含む請求項3に記載のセサミノール2糖又は3糖配糖体の製造方法。
(P2−11)配列番号5のアミノ酸配列からなるタンパク質
(P2−12)配列番号5のアミノ酸配列に1個又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、セサミノール2’−O−β−D−グルコシル(1→2)−β−D−グルコシドの1つ目のグルコース残基へのβ−1→6結合のグルコース転移活性を有するタンパク質
(P2−13)配列番号5のアミノ酸配列に対して、90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、セサミノール2’−O−β−D−グルコシル(1→2)−β−D−グルコシドの1つ目のグルコース残基へのβ−1→6結合のグルコース転移活性を有するタンパク質
(P2−15)配列番号7のアミノ酸配列からなるタンパク質
(P2−16)配列番号7のアミノ酸配列に1個又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、セサミノール2’−O−β−D−グルコシル(1→2)−β−D−グルコシドの1つ目のグルコース残基へのβ−1→6結合のグルコース転移活性を有するタンパク質
(P2−17)配列番号7のアミノ酸配列に対して、90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、セサミノール2’−O−β−D−グルコシル(1→2)−β−D−グルコシドの1つ目のグルコース残基へのβ−1→6結合のグルコース転移活性を有するタンパク質
- 配列番号2のアミノ酸配列からなることを特徴とするタンパク質。
- 配列番号4のヌクレオチド配列を含むことを特徴とするポリヌクレオチド。
- 請求項9に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする発現ベクター。
- 発現ベクターが導入された非ヒト宿主である形質転換体であって、
前記発現ベクターは、下記ポリヌクレオチド(N1−1)〜(N1−3)及びポリヌクレオチド(N2−1)〜(N2−3)からなる群より選択される少なくとも1つのポリヌクレオチドを含むことを特徴とする形質転換体。
(N1−1)配列番号3又は4のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
(N1−2)配列番号3又は4のヌクレオチド配列に1個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換及び/又は付加されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであり、かつ、下記一般式(1)で示されるセサミノール1糖又は2糖配糖体の1つ目のグルコース残基へのβ−1→2結合のグルコース転移活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(N1−3)配列番号3又は4のヌクレオチド配列に対して、90%以上の同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであり、かつ、下記一般式(1)で示されるセサミノール1糖又は2糖配糖体の1つ目のグルコース残基へのβ−1→2結合のグルコース転移活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(N2−1)配列番号6のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
(N2−2)配列番号6のヌクレオチド配列に1個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換及び/又は付加されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであり、かつ、下記一般式(1)で示されるセサミノール1糖又は2糖配糖体の1つ目のグルコース残基へのβ−1→6結合のグルコース転移活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(N2−3)配列番号6のヌクレオチド配列に対して、90%以上の同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであり、かつ、下記一般式(1)で示されるセサミノール1糖又は2糖配糖体の1つ目のグルコース残基へのβ−1→6結合のグルコース転移活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
- 前記非ヒト宿主が、植物体又はその部分である、請求項11に記載の形質転換体。
- 前記非ヒト宿主が、ゴマの植物体又はその部分である、請求項11又は12に記載の形質転換体。
- 請求項11〜13のいずれかに記載の形質転換体を栽培又は培養する工程を含むことを特徴とするセサミノール2糖又は3糖配糖体の製造方法。
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2016201846A JP6832670B2 (ja) | 2016-10-13 | 2016-10-13 | セサミノール2糖又は3糖配糖体の製造方法、および新規セサミノール配糖体 |
JP2020122875A JP6945042B2 (ja) | 2016-10-13 | 2020-07-17 | セサミノール2糖又は3糖配糖体の製造方法、および新規セサミノール配糖体 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2016201846A JP6832670B2 (ja) | 2016-10-13 | 2016-10-13 | セサミノール2糖又は3糖配糖体の製造方法、および新規セサミノール配糖体 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020122875A Division JP6945042B2 (ja) | 2016-10-13 | 2020-07-17 | セサミノール2糖又は3糖配糖体の製造方法、および新規セサミノール配糖体 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2018061476A JP2018061476A (ja) | 2018-04-19 |
JP6832670B2 true JP6832670B2 (ja) | 2021-02-24 |
Family
ID=61966158
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016201846A Active JP6832670B2 (ja) | 2016-10-13 | 2016-10-13 | セサミノール2糖又は3糖配糖体の製造方法、および新規セサミノール配糖体 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP6832670B2 (ja) |
-
2016
- 2016-10-13 JP JP2016201846A patent/JP6832670B2/ja active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2018061476A (ja) | 2018-04-19 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US9957539B2 (en) | Method for using hexenol glycosyl transferase | |
JP5705550B2 (ja) | フラボノイド3位グルクロン酸転移酵素、及びそれをコードするポリヌクレオチド | |
JPWO2010026666A1 (ja) | グルクロン酸転移酵素およびそれをコードするポリヌクレオチド | |
CN113136373A (zh) | 新型碳苷糖基转移酶及其应用 | |
JP6698028B2 (ja) | モグロール配糖体化酵素およびそれをコードする遺伝子 | |
JP2021515555A (ja) | ステビオール配糖体レバウジオシドj及びレバウジオシドnの生合成による製造 | |
JP7012293B2 (ja) | 形質転換植物、およびその利用 | |
JP5680860B2 (ja) | フラボノイド3位ガラクトース・グルコース転移酵素、及びそれをコードするポリヌクレオチド | |
WO2017207484A1 (en) | Mutant sucrose synthases and their uses | |
US7935802B2 (en) | Lignan glycosidase and utilization of the same | |
JP6945042B2 (ja) | セサミノール2糖又は3糖配糖体の製造方法、および新規セサミノール配糖体 | |
JP6832670B2 (ja) | セサミノール2糖又は3糖配糖体の製造方法、および新規セサミノール配糖体 | |
JP2013531976A (ja) | spnK菌株 | |
JP5698663B2 (ja) | フロフラン型リグナン4位グルコース転移酵素、及びそれをコードするポリヌクレオチド | |
CN115678952A (zh) | 鼠李糖高度专一的糖基转移酶及其应用 | |
WO2022131130A1 (ja) | プレニルフラボノイド配糖化酵素、それをコードするポリヌクレオチド及びプレニルフラボノイド配糖体の製造方法 | |
JP5638807B2 (ja) | リグナン水酸化酵素 | |
WO2011142019A1 (ja) | リグナンメチル化酵素をコードする遺伝子およびその用途 | |
JP5502347B2 (ja) | リグナンメチル化酵素をコードする遺伝子およびその用途 | |
CN110872594B (zh) | 黑莓糖基转移酶基因及其应用 | |
CN109868265B (zh) | 新型糖基转移酶及其应用 | |
TW201817877A (zh) | 芝麻素酚或芝麻素酚配糖體之生產方法 | |
CN117844777A (zh) | 珠芽艾麻中黄酮糖苷类糖基转移酶LbUGT71BX2及其编码基因与应用 | |
CN118028261A (zh) | 珠芽艾麻中黄酮糖苷类糖基转移酶LbUGT71BX1及其编码基因与应用 | |
TW201011106A (en) | Glucuronyl transferase and polynucleotide encoding the same |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20190402 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20200414 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200612 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20200707 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200717 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20201222 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20201225 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20210126 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20210202 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6832670 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |