KR102574252B1 - 펩티드 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 췌장암 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

펩티드 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 췌장암 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR102574252B1
KR102574252B1 KR1020200175270A KR20200175270A KR102574252B1 KR 102574252 B1 KR102574252 B1 KR 102574252B1 KR 1020200175270 A KR1020200175270 A KR 1020200175270A KR 20200175270 A KR20200175270 A KR 20200175270A KR 102574252 B1 KR102574252 B1 KR 102574252B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
nucleic acid
seq
sequence represented
bioactive
peptide nucleic
Prior art date
Application number
KR1020200175270A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20220085311A (ko
Inventor
강유선
김혜주
유지연
박희경
Original Assignee
주식회사 시선테라퓨틱스
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 시선테라퓨틱스 filed Critical 주식회사 시선테라퓨틱스
Priority to KR1020200175270A priority Critical patent/KR102574252B1/ko
Priority to CA3202307A priority patent/CA3202307A1/en
Priority to CN202180092251.5A priority patent/CN116801915A/zh
Priority to AU2021400686A priority patent/AU2021400686A1/en
Priority to PCT/KR2021/018964 priority patent/WO2022131744A1/ko
Priority to US18/257,594 priority patent/US20240042048A1/en
Priority to JP2023537575A priority patent/JP2023554124A/ja
Priority to EP21907048.9A priority patent/EP4265276A1/en
Publication of KR20220085311A publication Critical patent/KR20220085311A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102574252B1 publication Critical patent/KR102574252B1/ko

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/645—Polycationic or polyanionic oligopeptides, polypeptides or polyamino acids, e.g. polylysine, polyarginine, polyglutamic acid or peptide TAT
    • A61K47/6455—Polycationic oligopeptides, polypeptides or polyamino acids, e.g. for complexing nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/22—Heterocyclic compounds, e.g. ascorbic acid, tocopherol or pyrrolidones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1135—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against oncogenes or tumor suppressor genes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/12—Animals modified by administration of exogenous cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/318—Chemical structure of the backbone where the PO2 is completely replaced, e.g. MMI or formacetal
    • C12N2310/3181—Peptide nucleic acid, PNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3513—Protein; Peptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 췌장암 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 KRAS 유전자와 결합하는 서열을 가지는 생활성 펩티드 핵산 (Bioactive Peptide Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산 (Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체를 함유하는 췌장암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 핵산 복합체는 우수한 세포 투과능 및 세포 내 활성을 가지며, KRAS 유전자 및 그 하위 유전자의 발현을 효과적으로 억제할 수 있어, 췌장암의 예방 또는 치료에 유용하다.

Description

펩티드 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 췌장암 예방 또는 치료용 조성물 {Composition for Preventing or Treating Pancreatic Cancer Comprising Peptide Nucleic Acid Complex}
본 발명은 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 췌장암 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 KRAS 유전자와 결합하는 서열을 가지는 생활성 펩티드 핵산 (Bioactive Peptide Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산 (Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체를 함유하는 췌장암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
췌장은 위장의 뒤쪽, 몸의 가운데에 있으며 길이가 20cm 정도로 길다. 위, 십이지장, 소장, 대장, 간, 담낭, 비장 등의 장기에 둘러싸여 있다. 전체 길이는 약 15 내지 20 cm, 무게는 100g 정도이고, 두부(頭部), 체부(體部), 미부(尾部)로 구분된다. 췌장은 섭취한 음식물 중의 탄수화물, 지방, 단백질을 분해하는 소화 효소를 분비하는 외분비 기능과 혈당을 조절하는 인슐린과 글루카곤 등의 호르몬을 분비하는 내분비 기능을 갖는다.
췌장암(pancreatic cancer)이란 췌장에 생긴 암세포로 이루어진 종괴(종양덩어리)이다. 췌장암에는 여러 가지 종류가 있는데 췌관세포에서 발생한 췌관 선암종이 90% 정도를 차지하고 있어 일반적으로 췌장암이라고 하면 췌관 선암종을 말한다. 그 외에 낭종성암(낭선암), 내분비종양 등이 있다.
췌장에 생기는 종양은 수술적 절제로 치료가 가능한 양성종양에서부터 예후가 매우 불량한 악성종양에 이르기까지 유형이 매우 다양하다. 그 중에서 가장 흔한 낭성 종양(물혹)은 장액성과 점액성 낭성 종양, 췌관 내 유두상 점액 종양, 고형 유두상 종양, 그리고 림프 상피성 낭종과 낭종성 기형종 같은 종양으로 분류할 수 있으며, 악성 종양으로는 췌장 외분비 종양인 췌관 선암종, 선방세포 암종 그리고 신경내분비 종양으로 구분할 수 있다.
췌장암은 특별한 초기 증상이 없으며, 식욕이 떨어지거나, 체중감소 등의 증상이 나타나지만 이는 췌장암의 특징적인 증상이 아니기 때문에, 조기 발견이 어렵다. 또한 췌장은 두께가 2 cm 정도로 얇으며 피막만으로 싸여 있는데다가 소장에 산소를 공급하는 상장간막 동맥과 장에서 흡수한 영양분을 간으로 운반하는 간문맥 등과 밀착되어 있어 암의 침윤이 쉽게 일어나며, 췌장 후면의 신경 다발과 임파선에도 조기에 전이가 발생하는 특징이 있다. 특히 췌장 암세포는 성장 속도가 빠르다.
췌장암(Pancreatic cancer)은 세계에서 14번째로 다발하는 암으로서, 그 발병 빈도가 현저히 증가하고 있으며, 미국에서는 암으로 인한 사망의 주요 원인 중 4위에 해당한다. 췌장암은 초기 증상이 특이적이지 않으며, 이미 전신 전이가 일어난 후에 쇠약, 식욕감퇴, 체중감소 등의 임상증상이 발생하므로 정기적인 진단이 필요하다.
췌장암 환자의 1 내지 4% 만이 수술 후 5년의 생존율을 보이며, 중앙 생존기간이 5개월에 이를 정도로 예후가 불량하다. 80 내지 90%의 췌장암 환자가 진단 시 완치를 기대하는 근치적 절제가 불가능한 상태에서 발견되기 때문에, 치료는 주로 항암 요법에 의존하고 있다.
현재까지 외과적인 종양의 절제술은 췌장암 치료를 위한 가장 최선의 치료법으로 알려져 있다. 하지만, 외과적 절제술이 시행된 이후에도, 여전히 전이는 발생할 수가 있으며, 재발의 증거 없이 평균 생존 기간은 절제시술 후 약 212개월로 알려져 있다. 특히 췌장암은 상당히 암이 진행된 이후에 진단되는 경우가 많으며, 화학 요법이나 방사선 요법이 효과가 없는 경우 역시 많다.
현재 췌장암 치료에 사용되는 항암제는 젬시타빈 (gemcitabine), 타르세바 (tarceva)가 대표적이다. 췌장암 치료에 가장 많이 사용되고 있는 젬시타빈은 1997년 FDA에서 승인되었으며 췌장암의 치료를 위해 치료 초기에 적용될 수 있는 항암제이다. 젬시타빈은 뉴클레오시드 유사체로, DNA 복제 과정에서 사이티딘(cytidine)을 대체하여 정상적인 복제를 저해함으로써 암 치료효과를 나타낸다.
타르세바의 경우는 표피성장인자수용체 (EGFR)을 억제하는 경구 항암제로 세포 내에서 HER1/EGFR 신호전달 경로의 타이로신 키나아제 활종을 억제하여 종양세포의 성장을 차단함으로써 암 치료효과를 나타내며, 타세바는 젬시타빈과 병용하여 사용될 경우 다소 생존율을 높일 수 있다고 알려져 있다.
그러나, 현재까지 췌장암에 효과가 있다고 알려진 젬시타빈(gemcitabine), 타르세바(tarceva)를 포함한 몇 가지 항암제의 치료 효과는 지극히 저조하며, 항암치료에 대한 반응율은 15% 내외에 불과하고 이러한 사실은 췌장암 환자의 예후를 향상시키기 위해서는 보다 효과적인 조기진단법 및 치료법의 개발이 절실히 요구되고 있다.
KRAS는 암세포의 분화, 증식, 생존 등에 중요한 역할을 하는 단백질로 이 유전자에 변이가 생기면 GTP가 GDP로 가수분해가 되지 않고 비정상적으로 활성화 되어 세포 성장 신호가 지속적으로 전달되며, 이러한 신호 전달로 인하여 세포의 비정상적인 증식이 일어나게 되고 암이 발생한다 (Andrew M. Waters 등 Cold Spring Harb Perspect Med. 8(9), a031435, 2018).
KRAS 단백질의 과발현은 고형암 중 주로 췌장암 환자에서 발견되고 KRAS 유전자 변이는 일반적으로 12번 코돈에서 돌연변이가 가장 많은 특징을 가지고 있으며, 특히 췌장암에서는 G12D와 G12V 변이가 가장 많이 나타나는 것으로 알려져 있다(Kirsten L. 등 Trends Biochem Sci. 39(2), 91-100, 2014; Louis Buscail 등 Nature Rev Gastroenterol Hepatol 17, 153-168, 2020).
한편, 전통적인 약제와 다르게 핵산 약제는 표적 특이적 전령 RNA(messenger RNA, mRNA)의 발현을 억제하므로, 단백질을 표적으로 하는 기존 약제로 치료가 불가능 했던 연구 영역을 다룰 수 있게 되었다(Kole R. 등 Nature Rev. Drug Discov. 11;125, 2012., Wilson C. 등 Curr. Opin. Chem. Bio. 2006; 10:607, 2006). 약제로서의 성능 및 장점으로 인하여 핵산을 이용한 다양한 임상시험이 진행되고 있고, 증가하는 핵산 기반 치료제의 용도에도 불구하고 세포내 도입 또는 혈뇌장벽 투과를 위한 운반체의 사용은 극히 제한적이다.
따라서, 최근 약물의 보다 안전하고 효과적인 이용을 도모하기 위해, 약물에 적합한 제형뿐만 아니라 약물의 표적이 되는 생체 부위에 효율적으로 약물을 전달(drug delivery)하는 방법이 주목받고 있다. 특히, 약물을 필요한 때에, 필요한 양만큼, 필요한 장소로 효율적으로 운반하는 수송 시스템인 약물 전달 시스템(DDS; Drug Delivery System)의 실용화가 요구되고 있다.
이와 관련하여, 본 발명자들은 생활성 핵산과 전체적으로 양전하를 가지도록 변형된 캐리어 펩티드 핵산(Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체가 세포 투과성(cell permeability)이 놀랍게 향상되며, 이를 이용하여 표적 유전자의 발현을 매우 효율적으로 조절할 수 있음을 확인하고, 이러한 세포 독성이 낮고, 생활성 핵산의 세포 투과성 및 유전자 발현 조절능력이 향상된 새로운 구조체에 대한 특허를 출원한 바 있다 (PCT/KR2017/008636). 또한, 본 발명자들은 상기 구조체의 기능에 대한 연구를 지속적으로 수행하여, 생활성 핵산의 세포 내 활성을 현저하게 향상시키는 엔도좀 탈출을 도와주는 물질을 개발하였다(KR 10-2019-0096148).
이에, 본 발명자들은 세포 투과능이 우수한 핵산 복합체를 췌장암의 치료에 적용하고자 예의 노력한 결과, KRAS 유전자를 표적하는 생활성 펩티드 핵산 (Bioactive Peptide Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산 (Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체가 췌장암의 예방 또는 치료에 우수한 효과를 나타내는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 췌장암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 KRAS 유전자를 표적으로 하는 생활성 핵산 (Bioactive Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산 (Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 세포 투과성 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 췌장암의 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 핵산 복합체는 우수한 세포 투과능 및 세포 내 활성을 가지며, KRAS 유전자 및 그 하위 유전자의 발현을 효과적으로 억제할 수 있어, 췌장암의 예방 또는 치료에 유용하다.
도 1a는 인간 췌장암 세포(Bxpc-3)에 본 발명의 펩티드 핵산 복합체를 처리한 후, 각 조합별 세포 생존율을 확인한 결과이다.
도 1b는 돌연변이성 KRAS가 발현되는 인간 췌장암 세포(PANC-1)에 본 발명의 펩티드 핵산 복합체를 처리한 후, 각 조합별 세포 생존율을 확인한 결과이다.
도 2a는 인간 췌장암 세포(Bxpc-3)에 본 발명의 펩티드 핵산 복합체를 처리한 후, 각 조합별 KRAS 표적 유전자 및 하위 경로 유전자의 발현을 확인한 결과이다.
도 2b는 돌연변이성 KRAS가 발현되는 인간 췌장암 세포(PANC-1)에 본 발명의 펩티드 핵산 복합체를 처리한 후, 각 조합별 KRAS 표적 유전자 및 하위 경로 유전자의 발현을 확인한 결과이다.
도 3은 인간 췌장암 세포(Bxpc-3)를 이종 이식한 동물모델에 본 발명의 펩티드 핵산 복합체를 처리한 후, 시간에 따른 종양 크기(A), 종양 모양(B) 및 종양 무게(C)를 측정한 결과이다.
도 4는 인간 췌장암 세포(Bxpc-3)를 이종 이식한 동물모델에 본 발명의 펩티드 핵산 복합체를 처리한 후, 수득한 종양 샘플에서 KRAS 표적 유전자 및 하위 경로 유전자의 발현을 확인한 결과이다.
도 5는 인간 췌장암 세포(Bxpc-3)를 이종 이식한 동물모델에 본 발명의 펩티드 핵산 복합체를 처리한 후, 수득한 종양 조직의 표현형을 H&E 염색으로 확인한 결과이다.
도 6은 인간 췌장암 세포(Bxpc-3)를 이종 이식한 동물모델에 본 발명의 펩티드 핵산 복합체를 처리한 후, 수득한 종양 조직에서 KRAS 표적 유전자의 발현 변화를 IHC로 확인한 결과이다.
도 7은 인간 췌장암 세포(Bxpc-3)를 이종 이식한 동물모델에 본 발명의 펩티드 핵산 복합체를 처리한 후, 수득한 종양 조직에서 세포 사멸을 분석한 결과이다.
도 8은 돌연변이성 KRAS가 발현되는 인간 췌장암 세포(PANC-1)를 이종 이식한 동물모델에 본 발명의 펩티드 핵산 복합체를 처리한 후, 시간에 따른 종양 크기(A), 종양 모양(B) 및 종양 무게(C)를 측정한 결과이다.
도 9a는 돌연변이성 KRAS가 발현되는 인간 췌장암 세포(PANC-1)를 이종 이식한 동물모델에 본 발명의 펩티드 핵산 복합체를 1mg/kg 농도로 처리한 후, 수득한 종양 샘플에서 KRAS 표적 유전자 및 하위 경로 유전자의 발현을 확인한 결과이다.
도 9b는 돌연변이성 KRAS가 발현되는 인간 췌장암 세포(PANC-1)를 이종 이식한 동물모델에 본 발명의 펩티드 핵산 복합체를 2mg/kg 농도로 처리한 후, 수득한 종양 샘플에서 KRAS 표적 유전자 및 하위 경로 유전자의 발현을 확인한 결과이다.
도 10a는 돌연변이성 KRAS가 발현되는 인간 췌장암 세포(PANC-1)를 이종 이식한 동물모델에 본 발명의 펩티드 핵산 복합체를 1mg/kg 농도로 처리한 후, 수득한 종양 조직의 표현형을 H&E 염색으로 확인한 결과이다.
도 10b는 돌연변이성 KRAS가 발현되는 인간 췌장암 세포(PANC-1)를 이종 이식한 동물모델에 본 발명의 펩티드 핵산 복합체를 2mg/kg 농도로 처리한 후, 수득한 종양 조직의 표현형을 H&E 염색으로 확인한 결과이다.
도 11a는 돌연변이성 KRAS가 발현되는 인간 췌장암 세포(PANC-1)를 이종 이식한 동물모델에 본 발명의 펩티드 핵산 복합체를 1mg/kg 농도로 처리한 후, 수득한 종양 조직에서 KRAS 표적 유전자의 발현 변화를 IHC로 확인한 결과이다.
도 11b는 돌연변이성 KRAS가 발현되는 인간 췌장암 세포(PANC-1)를 이종 이식한 동물모델에 본 발명의 펩티드 핵산 복합체를 2mg/kg 농도로 처리한 후, 수득한 종양 조직에서 KRAS 표적 유전자의 발현 변화를 IHC로 확인한 결과이다.
도 12a는 돌연변이성 KRAS가 발현되는 인간 췌장암 세포(PANC-1)를 이종 이식한 동물모델에 본 발명의 펩티드 핵산 복합체를 1mg/kg 농도로 처리한 후, 수득한 종양 조직에서 세포 사멸을 분석한 결과이다.
도 12b는 돌연변이성 KRAS가 발현되는 인간 췌장암 세포(PANC-1)를 이종 이식한 동물모델에 본 발명의 펩티드 핵산 복합체를 2mg/kg 농도로 처리한 후, 수득한 종양 조직에서 세포 사멸을 분석한 결과이다.
도 13a는 돌연변이성 KRAS(G12D)가 발현되는 인간 췌장암 세포(PANC-1)에 본 발명의 펩티드 핵산 복합체를 처리한 후, 각 조합별 세포 생존율을 확인한 결과이다.
도 13b는 돌연변이성 KRAS(G12V)가 발현되는 인간 췌장암 세포(CFPAC-1)에 본 발명의 펩티드 핵산 복합체를 처리한 후, 각 조합별 세포 생존율을 확인한 결과이다.
도 14a는 돌연변이성 KRAS(G12D)가 발현되는 인간 췌장암 세포(PANC-1)에 본 발명의 펩티드 핵산 복합체를 처리한 후, 각 조합별 KRAS 표적 유전자 및 하위 경로 유전자의 발현을 확인한 결과이다.
도 14b는 돌연변이성 KRAS(G12V)가 발현되는 인간 췌장암 세포(CFPAC-1)에 본 발명의 펩티드 핵산 복합체를 처리한 후, 각 조합별 KRAS 표적 유전자 및 하위 경로 유전자의 발현을 확인한 결과이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 KRAS 유전자를 표적하는 생활성 펩티드 핵산 (Bioactive Peptide Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산 (Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체를 투여할 경우, 췌장암의 예방 및 치료에 효과가 있는지 확인하고자 하였다.
즉, 본 발명의 일 실시예에서는 KRAS 유전자 또는 KRAS G12D 돌연변이유전자 또는 KRAS G12V 돌연변이 유전자와 결합하는 서열을 가지는 생활성 펩티드 핵산 (Bioactive Peptide Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산 (Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체를 췌장암세포주 및 췌장암 세포 이종이식 모델에 투여할 경우, KRAS 유전자와 그 하위 유전자의 발현을 효율적으로 억제하여 췌장암 치료효과가 뛰어난 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일관점에서, KRAS 유전자를 표적으로 하는 생활성 펩티드 핵산 (Bioactive Peptide Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산(Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 췌장암의 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 생활성 핵산은 생활성 펩티드 핵산(Bioactive Peptide Nucleic Acid)일 수 있다.
본 발명에 있어서, 생활성 펩티드 핵산과 캐리어 펩티드가 상보적으로 결합된 핵산 복합체는 하기 구조식 (1)의 구조를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
[구조식 (1)]
[ A ≡ C (+) ]
상기 구조식 (1)에 있어서,
A는 목적하는 유전자와 결합할 수 있는 서열, 또는 목적하는 유전자 서열을 가지는 생활성 핵산(Bioactive Nucleic Acid)이고,
C는 생활성 핵산과 결합할 수 있는 캐리어 펩티드 핵산(Carrier Peptide Nucleic Acid)이고;
'≡는 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산 간의 상보적인 결합을 의미하며,
A로 표시되는 생활성 핵산은 펩티드 핵산(Peptide Nucleic Acid)으로, 전체적으로 음전하를 가지며,
C (+) 로 표시되는 캐리어 펩티드 핵산은 전체적으로 양전하를 가지고,
A ≡ C(+) 로 표시되는 구조식 (1)의 핵산 복합체는 전체적으로 양전하를 가지며,
상기, 캐리어 펩티드 핵산은 캐리어 펩티드 핵산 전체적으로 양전하를 띠도록 1개 이상의 gamma- 또는 alpha-backbone 변형 펩티드 핵산 단량체를 하나 이상 포함하며, 상기 gamma- 혹은 alpha-backbone 변형 펩티드 핵산 단량체는 양전하를 가지는 아미노산을 가지는 단량체가 음전하를 가지는 아미노산을 가지는 단량체에 비해 더 많이 포함되어 전체적인 캐리어 펩티드 핵산의 전하가 양성이 되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, “생활성 핵산”은 발현을 감소시키고자 하는 목적하는 표적 유전자와 결합할 수 있는 상보적인 서열, 특히 그러한 목적하는 표적 유전자의 mRNA에 결합할 수 있는 상보적인 서열을 가지거나, 발현시키고자 하는 표적 유전자의 발현을 촉진하는 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 핵산으로, 해당 유전자의 발현을 억제하거나, 촉진하는 등의 유전자 발현조절에 관여하는 핵산을 의미하며, 발현을 감소 또는 증가시키고자 하는 표적 유전자에 상보적인 서열을 가지는 핵산이거나, pre-mRNA, miRNA, mRNA 등 단일가닥 RNA 서열에 상보적인 서열의 핵산일 수 있다.
특히, 본 발명에서의 “생활성 펩티드 핵산(Bioactive Peptide Nucleic Acid)”은 생체외(in vitro) 또는 생체내(in vivo)에서 표적 유전자, 및 이를 포함하는 염기서열과 결합하여 해당 유전자의 고유 기능(예를 들어, 전사체(transcript) 발현 또는 단백질 발현)을 활성화시키거나 또는 저해하거나, pre-mRNA의 스플라이싱(splicing)을 조절(예를 들어, 엑손스키핑 (exon skipping) 하는 등의 기능을 수행하며, 상기 염기서열은 유전자 조절부위(gene regulatory sequence) 또는 유전자 부위(gene coding sequence) 또는 스플라이싱 조절 부위 (splicing regulatory sequence)인 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 유전자 조절부위는 프로모터, 전사 인핸서, 5' 비번역 영역, 3' 비번역 영역, 바이러스 팩키징 서열, 및 선택 마커에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 유전자 부위는 엑손 또는 인트론일 수 있으며, 상기 유전자 부위는 유전자의 전사 개시 부위의 10, 5, 3, 또는 1kb 또는 500, 300, 또는 200bp 내에, 예를 들어, 개시 부위의 상류(upstream) 또는 하류(downstream)에 있을 수 있다. 또한, 상기 스플라이싱 조절부위는 exon skipping, cryptic splicing, pseudo-splice site activation, intron retention, alternative splicing deregulation 관련 서열을 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명에서의 "생활성 펩티드 핵산(Bioactive Nucleic Acid)"은 췌장암 표적 유전자인 KRAS의 안티센스 펩티드 핵산인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 서열번호 1, 8 또는 9의 서열로 표시되는 서열을 포함하는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 8의 서열로 표시되는 서열을 포함하는 생활성 펩티드 핵산은 KRAS 유전자의 G12D 돌연변이를 표적으로 할 수 있고, 서열번호 9 서열로 표시되는 서열을 포함하는 생활성 펩티드 핵산은 KRAS 유전자의 G12V돌연변이를 표적으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, “캐리어 펩티드 핵산”은 생활성 핵산과 일부 혹은 전부의 염기가 상보적으로 결합하여 기능성을 부여하는 핵산을 의미하며, 본 발명에서 사용되는 캐리어 펩티드 핵산은 펩티드 핵산(PNA: Peptide Nucleic Acid) 뿐 아니라, 이와 유사한 변형된 핵산을 사용할 수 있으며, 펩티드 핵산이 바람직하지만, 이에 한정되는 의미는 아니다.
특히, 본 발명에 있어서, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 서열번호 3 내지 6 및 11 내지 18로 구성된 군에서 선택되는 서열로 표시되는 서열을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 "핵산 복합체"는 생활성 물질을 체내, 궁극적으로 세포 내로 침투시킬 수 있으며, 구체적으로는 세포 투과성을 가진다.
이에 따라 본 발명에 있어서, 상기 핵산 복합체는 세포 투과성을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산은 각각 2 내지 50개, 바람직하게는 5 내지 30개, 더욱 바람직하게는 10 내지 25개, 가장 바람직하게는 15 내지 17개의 핵산 단량체를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 복합체는 서열번호 1, 8 또는 9의 서열로 표시되는 서열을 포함하는 생활성 핵산; 및 서열번호 3 내지 6 및 11 내지 18로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 서열로 표시되는 서열을 포함하는 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 (i) 서열번호 1로 표시되는 서열을 포함하는 생활성 핵산 및 서열번호 3으로 표시되는 서열을 포함하는 캐리어 펩티드 핵산으로 구성된 핵산 복합체;
(ii) 서열번호 1로 표시되는 서열을 포함하는 생활성 핵산 및 서열번호 4로 표시되는 서열을 포함하는 캐리어 펩티드 핵산으로 구성된 핵산 복합체;
(iii) 서열번호 1로 표시되는 서열을 포함하는 생활성 핵산 및 서열번호 5로 표시되는 서열을 포함하는 캐리어 펩티드 핵산으로 구성된 핵산 복합체;
(iv) 서열번호 1로 표시되는 서열을 포함하는 생활성 핵산 및 서열번호 6으로 표시되는 서열을 포함하는 캐리어 펩티드 핵산으로 구성된 핵산 복합체;
(v) 서열번호 8로 표시되는 서열을 포함하는 생활성 핵산 및 서열번호 11로 표시되는 서열을 포함하는 캐리어 펩티드 핵산으로 구성된 핵산 복합체;
(vi) 서열번호 8로 표시되는 서열을 포함하는 생활성 핵산 및 서열번호 12로 표시되는 서열을 포함하는 캐리어 펩티드 핵산으로 구성된 핵산 복합체;
(vii) 서열번호 8로 표시되는 서열을 포함하는 생활성 핵산 및 서열번호 13으로 표시되는 서열을 포함하는 캐리어 펩티드 핵산으로 구성된 핵산 복합체;
(viii) 서열번호 8로 표시되는 서열을 포함하는 생활성 핵산 및 서열번호 14로 표시되는 서열을 포함하는 캐리어 펩티드 핵산으로 구성된 핵산 복합체;
(ix) 서열번호 9로 표시되는 서열을 포함하는 생활성 핵산 및 서열번호 15로 표시되는 서열을 포함하는 캐리어 펩티드 핵산으로 구성된 핵산 복합체;
(x) 서열번호 9로 표시되는 서열을 포함하는 생활성 핵산 및 서열번호 16으로 표시되는 서열을 포함하는 캐리어 펩티드 핵산으로 구성된 핵산 복합체;
(xi) 서열번호 9로 표시되는 서열을 포함하는 생활성 핵산 및 서열번호 17로 표시되는 서열을 포함하는 캐리어 펩티드 핵산으로 구성된 핵산 복합체; 및
(xii) 서열번호 9로 표시되는 서열을 포함하는 생활성 핵산 및 서열번호 18로 표시되는 서열을 포함하는 캐리어 펩티드 핵산으로 구성된 핵산복합체로 구성된 군에서 선택되는 핵산복합체를 유효성분으로 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 생활성 핵산 또는 캐리어 펩티드 핵산은 각각의 핵산의 5'-말단 또는 3'-말단에 엔도좀 탈출을 도와주는 물질이 추가로 결합된 것을 특징으로 할 수 있다. 즉, 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 엔도좀 탈출(endosome escape)을 도와주는 물질을 더 포함하여 하기 구조식 (2)의 구조를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
구조식 (2)
[ mA ≡ mC (+) ]
상기 구조식 (2)에 있어서,
'm'은 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 엔도좀 탈출(endosome escape)을 도와주는 물질을 의미한다.
본 발명에 있어서, “엔도좀 탈출을 도와주는 물질”은 엔도좀 내부의 삼투압을 증가시키거나, 엔도좀의 막을 불안정화 시키는 방법에 의하여 생활성 핵산의 엔도좀에서 탈출을 도와주는 것을 특징으로 할 수 있다. 생활성 핵산이 보다 효율적이고 빠르게 핵이나 세포질로 이동하여 표적 유전자를 만나 작용하도록 도와주는 것을 의미한다(D. W. Pack, A. S. Hoffman, S. Pun, P. S. Stayton, "Design and development of polymers for gene delivery", Nat. Rev. Drug. Discov., 4, 581-593 (2005).
본 발명에 있어서, 상기 엔도좀 탈출을 도와주는 물질은 펩티드, 지질 나노물질(lipid nanoparticles), 접합체 나노물질(polyplex nanoparticles), 고분자 나노구(polymer nanospheres), 무기물 나노물질(inorganic nanoparticles), 양이온 지질 나노물질(cationic lipid-based nanoparticles), 양이온 고분자(cationic polymer) 및 pH 감응 고분자(pH sensitive polymers)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 엔도좀 탈출을 도와주는 물질로서 생활성 핵산에는 GLFDIIKKIAESF(서열번호 20)의 서열을 갖는 펩티드가 링커 매개로 연결될 수 있으며, 캐리어 펩티드 핵산에는 Histidine(10)을 링커 매개로 연결하는 방법으로 결합하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 지질 나노물질(lipid nanoparticles)은 Lipid, phospholipids, acetyl palmitate, poloxamer 18, Tween 85, tristearin glyceride 및 Tween 80로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 접합체 나노물질(polyplex nanoparticles)은 poly(amidoamine) 또는 polyethylenimine (PEI)인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 고분자 나노구(polymer nanospheres)는 polycaprolactone, poly(lactide-co-glycolide, polylactide, polyglycolide, poly(d,l-lactide), chitosan 및 PLGA-polyethylene glycol로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 무기물 나노물질(inorganic nanoparticles)은 Fe2O3 Fe3O4, WO3 및 WO2.9로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 양이온 지질 나노물질(cationic lipid-based nanoparticles)은 1-(aminoethyl)iminobis[N-(oleicylcysteinyl-1-amino-ethyl)propionamide], N-alkylated derivative of PTA 및 3, 5-didodecyloxybenzamidine로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 양이온 고분자(cationic polymer)는 vinylpyrrolidone-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate acid copolymer diethyl sulphate, polyisobutylene 및 poly(N-vinylcarbazole)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 pH 감응 고분자(pH sensitive polymers)는 polyacids, poly(acrylic acid), poly(methacrylic acid) 및 hydrolyzed polyacrylamide로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생활성 핵산은 천연(natural) 핵산 염기 및/또는 변형된 핵산 단량체로 이루어져 있는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 상기 생활성 핵산과 염기서열 일부 혹은 전부가 상보적인 서열로 구성되는 것을 특징으로 할 수 있다.
특히, 캐리어 펩티드 핵산은 유니버설 염기(universal base)를 하나 이상 포함할 수 있으며, 캐리어 펩티드 핵산 모두가 유니버설 염기로 이루어질 수도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생활성 핵산은 DNA, RNA, 또는 변형된 핵산인 PNA(peptide nucleic acid), PMO(phosphorodiamidate morpholino oligonucleotide), LNA(locked nucleic acid), GNA(glycol nucleic acid) 및 TNA(threose nucleic acid), 안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotide), 앱타머(aptamer), siRNA(small interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA), 리보자임(ribozyme) 및 DNAzyme로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 상기 생활성 핵산은 DNA, RNA, 또는 변형된 핵산인 PNA(peptide nucleic acid), PMO(phosphorodiamidate morpholino oligonucleotide), LNA(locked nucleic acid), GNA(glycol nucleic acid) 및 TNA(threose nucleic acid)로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명에 있어, 생활성 핵산에 사용된 단량체가 PNA일 경우, 생활성 펩티드 핵산이라고 하며, 다른 단량체가 사용된 경우에도 동일한 방식으로 부른다.
본 발명에 있어서, 상기 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산은 포스포디에스테르(phosphodiester), 2' 0-메틸(2' 0-methyl), 2' 메톡시-에틸(2' methoxy-ethyl), 포스포르아미데이트(phosphoramidate), 메틸포스포네이트(methylphosphonate) 및 포스포로티오에이트(phosphorothioate)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 작용기를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 상기 생활성 핵산과 염기서열 일부 혹은 전부가 상보적인 서열로 구성되는 것을 특징으로 할 수 있다. 특히, 캐리어 펩티드 핵산은 유니버설 염기(universal base)를 하나 이상 포함할 수 있으며, 캐리어 펩티드 핵산 모두가 유니버설 염기로 이루어질 수도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 복합체 내의 상기 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산 각각은 전기적 특성이 전체적으로, 양전하(양성), 음전하(음성) 또는 중성 전하를 가지는 것을 특징으로 하는 복합체일 수 있다.
상기 전기적 특성의 표현에 있어, “전체적으로”의 의미는 개별 염기의 전기적 특성이 아닌 전체적인 생활성 핵산 또는 캐리어 펩티드 핵산 각각의 전하가 외부에서 볼 때 전체적인 전기적 특성을 의미하는 것으로, 예를 들어, 생활성 핵산 내의 일부 단량체가 양성을 가지더라도 음성을 가지는 단량체의 개수가 더 많이 존재하는 경우에는 생활성 핵산은 “전체적으로” 전기적 특성을 볼 때 음전하를 가지게 되는 것이며, 캐리어 펩티드 핵산 내의 일부 염기 및/또는 백본(backbone)이 음성을 가지더라도 양성을 가지는 염기 및/또는 백본의 개수가 더 많이 존재하는 경우에는 캐리어 펩티드 핵산은 “전체적으로” 전기적 특성을 볼 때 양전하를 가지게 되는 것이다.
따라서, 본 발명의 핵산 복합체는 전체적으로 양전하를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 핵산 복합체에 있어서, 바람직하게는 상기 생활성 핵산은 전체적으로 전기적 특성을 볼 때 음전하 또는 중성의 특성을 가지며, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 전체적으로 전기적 특성을 볼 때 양전하 특성을 가지는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 전기적 특성의 부여는 변형된 펩티드 핵산 단량체를 사용할 수 있고, 변형된 펩티드 핵산 단량체는 양전하를 가지는 캐리어 펩티드 핵산으로 리신(Lysine, Lys, K), 아르기닌(Arginine, Arg, R), 히스티딘(Histidine, His, H), 디아미노 부티르산(Diamino butyric acid, DAB), 오르니틴(Ornithine, Orn) 및 아미노산 유사체로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 양전하의 아미노산을 포함하고, 음전하를 가지는 캐리어 펩티드 핵산으로 음전하의 아미노산인 글루타민산(Glutamic acid, Glu, E) 또는 아미노산 유사체의 음전하의 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 전체적으로 양전하를 가지도록 1개 이상의 gamma- 또는 alpha-backbone 변형 펩티드 핵산 단량체를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 gamma- 혹은 alpha-backbone 변형 펩티드 핵산 단량체는 전기적 양성을 가지도록 리신(Lysine, Lys, K), 아르기닌(Arginine, Arg, R), 히스티딘(Histidine, His, H), 디아미노 부티르산(Diamino butyric acid, DAB), 오르니틴(Ornithine, Orn) 및 아미노산 유사체로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 양전하를 가지는 아미노산을 backbone에 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 전하 부여를 위한 펩티드 핵산 단량체의 변형은 상기 backbone 변형 이외에도 nucleobase가 변형된 펩티드 핵산 단량체를 사용할 수 있다. 바람직하게는 전기적 양성을 가지도록 amine, triazole, imidazole moiety를 nucleobase에 포함하거나, 전기적 음성을 가지도록 carboxylic acid를 염기에 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 캐리어 펩티드 핵산의 변형 펩티드 핵산 단량체는 음전하를 backbone 혹은 nucleobase에 더 포함할 수 있지만, 변형 펩티드 핵산 단량체는 양전하를 가지는 단량체가 음전하를 가지는 단량체에 비해 더 많이 포함되어 전체적으로 캐리어 펩티드 핵산의 전하가 양성이 되는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 상기 핵산 복합체에 있어, 소수성 잔기(hydrophobic moiety), 친수성 잔기(hydrophilic moiety), 표적 항원 특이적 항체, 앱타머 또는 형광/발광 표지자 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 물질이 생활성 핵산 및/또는 캐리어 펩티드 핵산에 결합된 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 상기 소수성 잔기(hydrophobic moiety), 친수성 잔기(hydrophilic moiety), 표적 항원 특이적 항체, 앱타머 및 이미징을 위한 형광/발광 표지자 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 물질은 상기 캐리어 펩티드 핵산에 결합된 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 소수성 잔기(hydrophobic moiety), 친수성 잔기(hydrophilic moiety), 표적 항원 특이적 항체, 앱타머, 소광자, 형광 표지자 및 발광 표지자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 물질과 생활성 핵산 및/또는 캐리어 펩티드 핵산의 결합은 단순 공유결합 또는 링커로 매개된 공유 결합인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 상기 핵산 운반체에 결합된 세포 투과, 용해도, 안정성, 운반 및 이미징 관련 물질(예컨대, 소수성 잔기 등)은 표적 유전자의 발현을 조절하는 생활성 핵산과 독립적으로 존재하게 된다.
본 발명에 있어서, 앞서 기술한 바와 같이, 상기 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 상보적인 결합 형태는 크게 역평행결합(antiparallel binding)과 평행결합(parallel binding)의 형태를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 상보적인 결합 형태는 생활성 핵산의 목적 서열(생활성 핵산과 상보적인 서열) 존재 하에서 분리되는 구조를 가진다.
상기 역평행결합과 평행결합은 DNA-DNA 또는 DNA-PNA의 결합 방식에 있어, 5'-방향성과 3'-방향성에 따라 결정된다. 역평행 결합은 일반적인 DNA-DNA 또는 DNA-PNA의 결합 방식으로, 본 발명에 따른 핵산 복합체를 예로 들어 설명하면, 생활성 핵산은 5'에서 3' 방향으로, 캐리어 펩티드 핵산은 3'에서 5' 방향으로 서로 결합되는 형태를 의미한다. 평행결합은 역평행결합에 비해서는 결합력이 다소 떨어지는 형태로, 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산 모두가 5'에서 3' 방향 또는 3'에서 5' 방향으로 서로 결합되는 형태를 의미한다.
본 발명에 따른 핵산 복합체에 있어서, 바람직하게는 상기 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 결합력은 생활성 핵산과 생활성 핵산의 목적하는 유전자, 특히 목적 유전자의 mRNA와의 결합력보다 낮은 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 결합력은 융해온도, melting temperature 또는 Tm에 의해 결정된다.
상기 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 결합력(융해온도, melting temperature, Tm)이 생활성 핵산과 생활성 핵산의 목적하는 유전자, 특히 목적 유전자의 mRNA와의 결합력보다 낮게 하기 위한 구체적인 방법의 예로는, 상기 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산이 평행 결합(Parallel binding) 또는 부분 특이결합(Partial specific binding)하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또 다른 예로서 상기 캐리어 펩티드 핵산이 링커, 유니버설 염기(universal base) 및 생활성 핵산의 대응되는 염기와 상보적이지 않은 염기를 가지는 펩티드 핵산 염기로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 펩티드 핵산 염기를 갖는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 유니버설 염기(universal base)는 아데닌(adenine), 구아닌(guanine), 사이토신 (cytosine), 티민(thymine), 우라실(Uracil) 등의 천연 염기와 선택성 없이 결합하고, 상보적인 결합력보다 낮은 결합력을 가지는 염기로 이노신 PNA(inosine PNA), 인돌 PNA(indole PNA), 나이트로인돌 PNA(nitroindole PNA) 및 무염기(abasic)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 사용할 수 있으며, 바람직하게는 이노신 PNA를 사용하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 복합체의 기능 조절을 위한 핵산들의 결합 형태와 전기적 성질 조합을 제공하고, 상기 핵산의 결합 형태와 전기적 성질 조합으로 입자 크기 및 작용 시점을 조절하고, 세포 투과성, 용해도 및 특이도를 향상시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생활성 펩티드 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 결합력 조절을 통해, 목적 유전자의 존재 하에서, 생활성 펩티드 핵산이 목적 서열과 결합되는 시점(생활성 핵산의 목적 서열로의 치환되는 시점, 표적 특이적 분리 및 결합 시점) 등의 조절이 가능하다.
본 발명에 따른 핵산 복합체에 있어서, 생활성 핵산의 목적 유전자로의 치환(strand displacement) 시점, 표적 특이적 분리 및 결합(target specific release and bind) 시점의 조절은 복합체의 비특이 결합을 위한 캐리어 펩티드 핵산의 비특이 염기, 유니버설 염기 및 linker의 유무, 개수 및 위치에 의하여 조절이 가능한 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 펩티드 복합체의 상보적인 결합의 형태인 평행(parallel) 또는 역평행(antiparallel) 형태의 결합 등과 상기 조건의 조합에 의하여 조절이 가능한 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 용어 "질환" 또는 "장애"는 본원에서 상호 교환적으로 사용되고, 이는 기능의 수행을 방해하거나 혼란 시키고/시키거나 불쾌감, 기능이상, 곤란과 같은 증상을 유발시키거나 또는 심지어 병에 걸린 사람을 사망시키거나 이와 접촉한 사람을 사망에 이르게 하는, 신체 상태 또는 몇몇 기관 상의 모든 변경을 지칭한다.
본 발명에 있어서, 용어 “치료용 조성물”은 "의약(약제학적, 약학적) 조성물(pharmaceutical composition)"과 혼용될 수 있으며, 본 발명의 생활성 핵산 및 상기 핵산과 결합하는 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 핵산 복합체를 유효성분으로 포함하며, 추가적으로 상기 핵산 복합체에 목적하는 질환을 치료하기 위한 치료용 약물이 결합된 형태일 수 있다.
본 발명의 치료용 조성물은 표준 의약 실시에 따라 혈뇌장벽 내로 전달되는 형태의 제형으로 제형화될 수 있다. 이들 제형은 유효성분 이외에 약학적으로 허용되는 형태의 제형에 적합한 담체, 부형제, 보조제 또는 희석제 등의 첨가물을 함유할 수 있다.
용어 "약학적으로 허용되는(physiologically acceptable)"은 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는 특성을 의미한다.
용어 "담체(carrier)"는 세포 또는 조직 내로의 핵산 복합체의 부가를 용이하게 하는 화합물로 정의된다. 예를 들어, 디메틸술폭사이드(DMSO)는 생물체의 세포 또는 조직 내로의 많은 유기 화합물들의 투입을 용이하게 하는 통상 사용되는 담체이다.
용어 "희석제(diluent)"는 대상 화합물의 생물학적 활성 형태를 안정화시킬 뿐만 아니라, 화합물을 용해시키게 되는 물에서 희석되는 화합물로 정의된다. 버퍼 용액에 용해되어 있는 염은 당해 분야에서 희석제로 사용된다. 통상 사용되는 버퍼 용액은 포스페이트 버퍼 식염수이며, 이는 인간 용액의 염 상태를 모방하고 있기 때문이다. 버퍼 염은 낮은 농도에서 용액의 pH를 제어할 수 있기 때문에, 버퍼 희석제가 화합물의 생물학적 활성을 변형하는 일은 드물다.
본 발명에서의 핵산 복합체를 함유하는 물질은, 환자에게 그 자체로서 또는 병용 요법(combination therapy)에서와 같이 다른 활성 성분들과 함께 또는 적당한 담체나 부형제와 함께 혼합된 의약 조성물로서 투여될 수 있다.
본 발명에서 사용에 적합한 의약 조성물에는, 활성 성분들이 그것의 의도된 목적을 달성하기에 유효한 양으로 함유되어 있는 조성물이 포함된다. 더욱 구체적으로, 치료적 유효량은 치료될 객체의 생존을 연장하거나, 질환의 증상을 방지, 경감 또는 완화시키는데 유효한 화합물의 양을 의미한다. 치료적 유효량의 결정은, 특히, 여기에 제공된 상세한 개시 내용 측면에서, 통상의 기술자의 능력 범위 내에 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은, 상기 핵산 복합체를 포함하는 치료용 조성물의 투여로 질환의 발병을 막거나, 이의 진행을 억제시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 용어 “개선”이란 상기 핵산 복합체를 포함하는 치료용 조성물의 투여로 질환의 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
또한, 본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는, 상기 핵산 복합체를 포함하는 치료용 조성물의 투여로 질환의 증세가 호전되거나 완치되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 따른 핵산 복합체를 포함하는 조성물은 췌장암을 치료하기 위하여 또는 췌장암의 증세를 억제(또는 완화)하기 위하여 의약으로 효과적인 양으로 적용될 수 있다. 췌장암의 종류, 환자의 연령, 체중, 증상의 특성 및 정도, 현재 치료법의 종류, 치료 회수, 적용 형태 및 경로 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 해당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 상기한 약리학적 또는 생리학적 성분을 함께 적용하거나 순차적으로 적용할 수 있으며, 또한 추가의 종래의 치료제와 병용하여 적용될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 적용될 수 있다. 이러한 적용은 단일 또는 다중적으로 적용일 수 있다.
본 발명에서, "개체"는 본 발명에 따른 핵산 복합체를 투여하여 경감, 억제 또는 치료될 수 있는 상태 또는 질환을 앓고 있거나 그러한 위험이 있는 포유동물을 의미하며, 바람직하게 사람을 의미한다.
또한, 본 발명의 화합물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여 형태, 건강 상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 70㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.001 ~ 1,000㎎/일이고, 바람직하게는 0.01 ~ 500㎎/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.
본 명세서에 기재되어 있는 핵산 복합체를 포함하는 조성물의 독성과 치료 효율성은, 예를 들어, LD50(군집의 50%에 대한 치사량), ED50(군집의 50%에 대해 치료 효과를 갖는 선량), IC50(군집의 50%에 대해 치료 억제 효과를 갖는 선량)을 결정하기 위하여, 세포 배양 또는 실험동물에서의 표준 제약 과정들에 의해 산정될 수 있다. 독성과 치료 효과 간의 선량 비가 치료 지수이고 이것은 LD50과 ED50(또는, IC50) 간의 비율로서 표현될 수 있다. 높은 치료 지수를 보이는 화합물들이 바람직하다. 이들 세포 배양 분석에서 얻어진 데이터는 인간에 사용하는 선량의 범위를 산정하는데 사용될 수 있다. 그러한 화합물들의 투여량(dosage)은 바람직하게는 독성이 없거나 거의 없는 상태에서 ED50(또는, IC50)을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있다.
본 발명의 용어 "투여"란, 어떠한 적절한 방법으로 개체에게 본 발명의 약학 조성물을 도입하는 행위를 의미하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
상기 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명의 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
본 발명의 약학조성물의 투여량은 사용목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 또는 유효성분으로서 사용되는 물질의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물을 사람을 포함하는 포유동물에 하루 동안 10 내지 100 ㎎/㎏, 보다 바람직하게는 1 내지 30 ㎎/㎏으로 투여할 수 있고, 본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 내지 3회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, KRAS 유전자와 결합하는 서열을 가지는 생활성 펩티드 핵산 (Bioactive Peptide Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산 (Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체 및/또는 상기 핵산 복합체를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 췌장암 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 췌장암 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 KRAS 유전자와 결합하는 서열을 가지는 생활성 펩티드 핵산 (Bioactive Peptide Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산 (Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체 및/또는 상기 핵산 복합체를 포함하는 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, KRAS 유전자와 결합하는 서열을 가지는 생활성 펩티드 핵산 (Bioactive Peptide Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산 (Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체 및/또는 상기 핵산 복합체를 포함하는 조성물을 췌장암 예방 또는 치료에 사용하는 용도를 제공한다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
본 발명의 핵산 복합체의 췌장암에 대한 항암 효과를 검정하기 위하여 표적 유전자로 KRAS를 사용하였다.
본 발명에서는 KRAS 야생형 (wild type)과 돌연변이성 (mutant) 췌장암에서의 항암효과를 확인하기 위해 KRAS 야생형 췌장암 세포주 (BxPC-3)와 췌장암에서 가장 많이 발생하는 G12D (PANC-1), G12V (CFPAC-1) 돌연변이성 췌장암 세포주를 이용하여 항암효과를 확인하였으며, 췌장암에 대한 항암효과를 확인하기 위해 KRAS를 표적으로 하는 생활성 펩티드 핵산(Bioactive Peptide Nucleic Acid)으로 안티센스 펩티드 핵산(antisense PNA)을 사용하였다.
KRAS 야생형 췌장암에서의 KRAS 표적 안티센스 펩티드 핵산의 치료 효과 분석
실시예 1: 생활성 펩티드 핵산(Bioactive Peptide Nucleic Acid) 및 캐리어 펩티드 핵산, 및 이들을 이용한 복합체의 제조
대조군으로 사용한 생활성 핵산 (antisense PNA)은 서열번호 2로 표시되는 서열로 구성되어 있으며, 췌장암에 대한 항암효과를 확인하기 위해 사용한 생활성 펩티드 핵산 (antisense PNA)은 서열번호 1로 표시되는 서열로 구성되어 있다.
KRAS 야생형 췌장암 세포주에서의 췌장암에 대한 항암효과를 확인하기 위해 사용된 펩티드 핵산 기반 생활성 핵산은 엔도좀 탈출능을 돕기 위한 펩타이드 GLFDIIKKIAESF를 5'에 결합하였고 염기서열, 단량체 변형 및 구조는 하기 표 1과 같으며, 캐리어 펩티드 핵산은 엔도좀 탈출능을 돕기 위한 펩타이드를 5' 내지 3' 말단에 결합하였으며, 서열번호 3번 내지 7번으로 기재되는 서열로 구성되어 있다(표 1).
사용한 모든 펩티드 핵산은 파나진(PANAGENE, 한국)에서 HPLC 정제 방법을 통해 합성하였다.
췌장암 항암 효과 검증을 위한 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 서열
구분 서열
번호		 염기서열 단량체 변형
생활성 핵산 1 5'-GLFDIIKKIAESF-O-ACT(-)TG(+)CTT(-)CCT(+)GTA(-)GG-O-K-3' -+-+-
2 5'-GLFDIIKKIAESF-O-AGT(-)CTT(+)GAC(-)TTA(+)TT(-)G-O-K-3' -+-+-

캐리어 펩티드
핵산		 3 5'-Histidine(10)-O-TGA(+)ACGAA(+)GGACAT(+)CC-O-K-3' +++
4 5'-K-O-CC(+)TACAGG(+)AAGCA(+)AGT-O-Histidine(10)-3' +++
5 5'-Histidine(10)-O-CA(+)TC(+)C-O-K-3' ++
6 5'-K-O-CC(+)TA(+)C-O-Histidine(10)-3' ++
7 5'-Histidine(10)-O-TCA(+)GAACTG(+)AATAA(+)C-O-K-3' +++
상기 표 1 은 KRAS를 표적으로 하는 췌장암 항암 효과를 확인하기 위해 사용된 생활성 펩티드 핵산과 캐리어 펩티드 핵산 및 대조군으로 사용된 생활성 펩티드 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 서열 정보를 나타내었다.
단량체의 변형은 전기적인 성질을 부여하기 위하여 펩티드핵산의 backbone을 전기적 양성은 리신(Lysine, Lys, K, (+)로 표기)을 전기적 음성은 글루타민산(Glutamic acid, Glu, E, (-)로 표기)로 변형된 펩티드 backbone을 가지도록 제작하였다.
각각의 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산 조합은 DMSO 하에서 혼성화 하였으며, 그 결과 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산으로 구성된 복합체를 제작하였다.
실시예 2: 핵산 복합체를 이용한 췌장암(Pancreatic cancer) 항암 효과 분석
실시예 1에 따라, 하기 표 2의 구조로 제조된 KRAS를 표적 유전자로 하는 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 핵산 복합체를 이용하여 췌장암 항암 효과를 분석하였다.
실시예 2-1: 세포 배양
ATCC(American Type Culture Collection, 미국)로부터 입수한 인간 췌장암 세포 Bxpc-3(ATCC NO. 1687)와 돌연변이성 KRAS가 발현되는 인간 췌장암 세포 PANC-1(ATCC NO. 1496)을 각각 RPMI 배양배지(Rosewell Park Memorial Institute Medium, 웰진, 한국)와 DMEM 배양배지(Dulbecco Modified Eagle Medium, 웰진, 한국) 10％(v/v) 소태아혈청, 페니실린 100units/㎖, 스트렙토마이신 100㎍/㎖을 동일하게 첨가하고, 37℃, 5％(v/v) CO2의 조건하에서 배양하였다.
실시예 2-2: MTT (MTT assay)으로 췌장암 세포주의 세포 생존율 분석
실시예 2-1에서의 실험 조건으로 96웰에 췌장암 세포주 Bxpc-3 와 PANC-1 을 4x103으로 씨딩하고, 24시간 배양한 후, 표 1의 구조로 제조한 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 복합체를 이용하여 처리된 세포주에 MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) 용액을 1X PBS에 5 mg/mL 농도로 제조하고 well당 20μL로 처리하여 4시간 배양 후 OD (optical density)를 spectrophotometer로 측정하여 분석하였다.
본 실시예에서 사용한 핵산 복합체 조합은 하기 표 2 와 같다.
인간 췌장암 세포주에서 세포생존율 분석을 위한 핵산 복합체 조합
조합 핵산 복합체
1 서열번호 1 및 3
2 서열번호 1 및 4
3 서열번호 1 및 5
4 서열번호 1 및 6
5 서열번호 2 및 7 (대조군)
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 Bxpc-3 인간 췌장암 세포 모델에서 표 2의 조합 1번 핵산 복합체에 의해 세포 생존율이 72시간까지 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다(도 1a). 또한, 돌연변이성 KRAS가 발현되는 인간 췌장암 세포 PANC-1 에서도 조합 1번 핵산 복합체에 의해 세포 생존율이 96시간까지 가장 많이 감소하는 것을 확인하였다 (도 1b).
실시예 2-3: 웨스턴 블랏 분석(Western blot assay)으로 유전자 발현의 분석
인간 췌장암 세포주 Bxpc-3 와 PANC-1을 6웰 플레이트에 1x105으로 세포를 씨딩하고 24시간 배양 후, 실시예 2-1의 조건으로 실험을 진행하여 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 복합체를 처리하고 24, 48, 72, 96, 120 시간 배양한 후, RIPA buffer를 각 웰에 30 μL씩 첨가하여 protein lysate를 얻었다. Protein lysate를 BCA assay kit (Thermo Fisher, 미국)를 사용하여 단백질 양을 정량하고 단백질 30 μg을 전기영동을 통해 사이즈 별로 분리하여, PVDF membrane에 단백질을 옮긴 후 1차 항체인 KRAS (Abcam, 영국), p-ERK (Cell signaling Technology, 미국), HRAS (Abcam, 영국), NRAS (Abcam, 영국) 를 1:1000으로 처리하고 4 ℃에서 하루 동안 방치하였다.
1X T BS-T를 이용하여 워싱하고 2차 항체인 Goat Anti-Rabbit (Cell signaling Technology, 미국), Mouse Anti-Goat (Santa cruz Biotechnology, 미국) 를 1:2000으로 처리하여 상온에서 1시간 방치하였다. SupersignalTM West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Fisher, 미국)을 처리하고 Image600 (Amersham, 독일) 장비를 이용하여 췌장암 세포주에서 표적 유전자의 발현 억제 효율을 분석하였다.
본 실시예 에서는 인간 췌장암 세포 모델에서의 RAS family (KRAS, HRAS, NRAS) 및 하위단계 유전자 발현 변화를 분석하였으며, 사용한 핵산 복합체 조합은 표 2와 동일하다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 서열번호 1번과 3번의 조합 핵산 복합체를 통하여 RAS family 중 KRAS 표적 유전자의 발현 및 하위 경로 유전자 p-ERK 의 발현이 Bxpc-3 인간 췌장암 세포에서 서열번호 2번과 7번의 조합 대조군 복합체 대비 모두 72시간까지 억제되는 것을 확인하였다 (도 2a). 또한, 돌연변이성 KRAS가 발현되는 인간 췌장암 세포 PANC-1 에서도 표2의 조합 1에 의해 72시간까지 KRAS 와 p-ERK가 감소되는 동일한 효과가 관측되었다 (도 2b). 조합 2,3,4 에서는 RAS family 중 HRAS, NRAS를 감소시켜 원치 않는 서열의 유전자 교정 효과(off-target effect)가 관찰되었지만 조합 1에 의해서는 off-target effect가 발생하지 않았으며 KRAS 유전자와 하위 경로 유전자에 대한 발현에 대한 유의적인 억제 효과를 관찰할 수 있었다(도 2a,b).
실시예 3: Bxpc-3 인간 췌장암 세포를 사용한 이종 이식 동물 모델 (Xenograft mouse model) 에서의 췌장암 표현형 효과 분석
이종 이식 동물 모델에서 효능을 검증하기 위하여 5주령 암컷 누드 마우스(오리엔트바이오, 한국)를 사용하였다. 종양 모델 생성을 위해 쥐의 등 쪽 피하지방층에 Bxpc-3 인간 췌장암 세포를 5x106/100ul 만큼 우측의 견갑부와 흉벽 사이의 액와부위 피하에 주사하였다. 종양이 증식하도록 3주 계류 후 각 실험군 당 세 마리를 사용하여 일주일에 두 번씩 핵산 복합체를 미정맥으로 투여하였고, 양성 대조군의 경우 췌장암 사람 환자의 1차 표준 항암제인 Gemcitabine (Sigma, 미국)을 80mg/kg의 용량으로 일주일에 두 번씩 복강 투여하였다. 핵산 복합체와 양성대조군의 3주간 총 6회 투여 후 모든 동물은 안락사 수행하였다.
본 실시예에서는 실시예 2 를 통하여 효과가 검증된 핵산 조합체를 선별하여 Bxpc-3 인간 췌장암 세포를 이종 이식한 동물 모델에서 조직학적 소견, KRAS 유전자 발현 변화를 분석하였으며, 사용한 핵산 복합체 조합은 하기 표 3과 같다.
인간 췌장암 세포를 사용한 이종 이식 동물 모델에서 항종양 효과 분석을 위한 핵산 복합체 조합
조합 핵산 복합체
1 서열번호 1 및 3
실시예 3-1: 췌장암 이종 이식 동물 모델에서의 종양 크기 변화 분석
실시예 ３의 조건으로 진행한 동물 실험에서 암세포 이식 후 군별 평균 종양크기가 32.3 m2 도달 시부터 21일째까지 1주일에 두 번씩 총 6회 개체별로 vernier calipers (Mitutoyo, 일본)를 사용하여 길이(length, L), 너비(width, W) 를 측정하였다. 또한, 최종 실험 종료일에 마우스 등 부분의 종양을 분리하여 종양의 외형을 비교해 크기 및 무게의 차이점을 관측하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 대조군(Scramble control, SC)과 양성대조군 (Gemcitabine, Positive control, PC) 그룹 대비 서열번호 1번과 3번의 핵산 복합체(조합1)를 처리한 그룹에서 평균 종양 크기가 전 기간에 걸쳐 감소 되었음을 알 수 있었다. 또한, 핵산 복합체(조합1) 투여군에서 대조군과 양성 대조군 대비 통계적으로 유의한 종양 무게 감소가 나타났다.
실시예 3-2: 웨스턴 블랏 분석(Western blot assay)으로 유전자 발현의 분석
실시예 3의 조건으로 실험을 진행하여 생검한 마우스 종양 조직의 일부를 RIPA buffer를 200 μL씩 첨가하여 protein lysate를 얻었다. Protein lysate를 BCA assay kit (Thermo Fisher, 미국)를 사용하여 단백질 양을 정량하고 단백질 30 μg을 전기영동을 통해 사이즈 별로 분리하여, PVDF membrane에 단백질을 옮긴 후 1차 항체인 KRAS (Abcam, 영국), p-ERK (Cell signaling Technology, 미국), HRAS (Abcam, 영국), NRAS (Abcam, 영국) 를 1:1000으로 처리하고 4 ℃에서 하루 동안 방치하였다.
1X TBS-T를 이용하여 워싱하고 2차 항체인 Goat Anti-Rabbit (Cell signaling Technology, 미국), Mouse Anti-Goat (Santa cruz Biotechnology, 미국) 를 1:2000으로 처리하여 상온에서 1시간 방치하였다. SupersignalTM West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Fisher, 미국)을 처리하고 Image600 (Amersham, 독일) 장비를 이용하여 췌장암 조직에서 표적 유전자의 발현 억제 효율을 분석하였다.
그 결과, 도 4와 같이 대조군 대비 핵산 복합체(조합1)를 처리한 그룹에서 RAS family 중 KRAS 표적 유전자의 발현 및 하위 경로 유전자 p-ERK 의 발현이 감소한 것을 확인할 수 있었다. 특히 p-ERK 유전자의 발현이 양성 대조군 그룹보다 더 감소하는 것을 관찰하였다.
실시예 3-3: H&E 염색으로 췌장암 이종 이식 동물 모델에서의 표현형 분석
실시예 3의 조건으로 실험을 진행하여 최종 실험 종료일에 세포주를 접종부위 종양 조직을 떼어내었다. 조직은 4% 포르말린 용액에 24시간 고정시킨 후 파라핀 포매하여 조직을 5 μm로 섹션하여 슬라이드 글라스에 마운팅하였다. 마운팅한 조직을 Hematoxylin:Eoin 염색 용액에 일정 시간 동안 염색하고 1X PBS로 수세한 후 형태학적인 소견을 현미경으로 분석하였다.
그 결과, 도 5 에서와 같이 형성된 종양의 표현형이 대조군 대비 핵산 복합체(조합1)를 처리한 그룹에서 염증성 세포들의 분포가 감소하며, 세포독성 항암제인 양성 대조군과 비슷한 표현형으로 나타난 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3-4: 면역염색으로 췌장암 이종 이식 동물 모델에서의 조직 내 KRAS 발현 변화 분석
실시예 3의 조건으로 실험을 진행하여 최종 실험 종료일에 세포주를 접종부위 종양 조직을 떼어내어 4% 포르말린 용액에 하루 동안 고정하고 고정한 조직을 파라핀 포매하여 5 μm로 섹션하여 슬라이드 글라스에 마운팅하였다. 마운팅한 조직을 0.5% BSA 용액에 1시간 동안 블락킹하고, KRAS 1차 항체(Abcam, 영국)을 4 ℃에서 하루 동안 방치하였다. 이어서 1차 항체 용액을 제거하고 1X TBS로 씻어낸 후 2차 항체 용액 Goat Anti-Rabbit (Cell signaling Technology, 미국)을 1:2000으로 상온에서 2시간 처리한 후 DAB 염색을 통해 분석하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 대조군 조직 내 갈색으로 염색된 KRAS 발현이 확인되었으며, 핵산 복합체 조합1에서 KRAS 발현이 감소한 것을 4마리 종양 조직 모두에서 관찰되었다. 이를 수치화하여 비교하였을 때에 양성 대조군과 비슷한 수준으로 핵산 복합체 조합1에 의해 감소하는 것을 확인하였다.
실시예 3-5: 사멸 세포 측정법(TUNEL assay)으로 췌장암 이종 이식 동물 모델에서의 세포사멸(apoptosis) 분석
실시예 3의 조건으로 실험을 진행하여 최종 실험 종료일에 세포주를 접종부위 종양 조직을 떼어내어 4% 포르말린 용액에 하루 동안 고정하고 고정한 조직을 파라핀 포매하여 5 μm로 섹션하여 슬라이드 글라스에 마운팅하였다. 마운팅한 조직에 리액션 TdT 버퍼(reaction TdT buffer)를 떨어뜨리고 37℃에서 70분간 반응시켰다. 이 후 BrdU-Biotin 항체 용액을 70분간 빛을 차단하여 반응시키고 DAB 용액을 이용하여 사멸 세포를 염색했다. 반응이 종료된 조직은 헤마톡실린 용액에 담궈 핵을 염색하고 흐르는 물에 10분 세척한 후 마운팅하여 광학현미경으로 세포사멸이 얼마나 일어났는지 관찰하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 대조군 조직 내 초록색으로 핵이 염색된 부분이 갈색으로 염색된 사멸 세포보다 더 많은 것이 보이며, 핵산 복합체 조합1과 양성 대조군 그룹에서는 사멸 세포의 분포가 증가함으로써 종양 조직 내 세포 사멸 증가를 확인하였다.
실시예 4: PANC-1 인체 유래 췌장암 세포를 사용한 피하 이식 동물 모델 (Xenograft mouse model) 에서의 췌장암 표현형 효과 분석
이종 이식 동물 모델에서 효능을 검증하기 위하여 5주령 암컷 누드 마우스(오리엔트바이오, 한국)를 사용하였다. 종양 모델 생성을 위해 PANC-1 인체 유래 췌장암 세포를 matrigel 을 이용하여 세포 농도를 3x107/ml 로 조절하였다. 조절된 세포 배양액을 마우스당 0.3ml(9x106/mouse)씩 우측의 견갑부와 흉벽 사이의 액와부위 피하에 주입하였다. 종양이 증식하도록 1주 계류 후 각 실험군 당 여섯 마리가 사용되어 일주일에 두 번씩 핵산 복합체를 미정맥으로 투여하였고, 양성 대조물질의 경우 췌장암 사람 환자의 1차 표준 항암제인 Gemcitabine (Sigma, 미국)을 80mg/kg의 용량으로 일주일에 두 번씩 복강 투여하였다. 핵산 복합체와 양성 대조물질의 병용투여 그룹에서는 양성 대조물질의 농도가 30mg/kg로 복강 투여되었다. 3주간 총 6회 투여 후 모든 동물은 안락사 수행하였다.
본 실시예에서는 실시예 2 를 통하여 효과가 검증된 핵산 조합체를 선별하여 PANC-1 인체 유래 췌장암 세포를 이종 이식한 동물 모델에서 조직학적 소견, KRAS 유전자 발현 변화를 분석하였으며, 사용한 핵산 복합체 조합은 상기 표 3과 같다.
실시예 4-1: 췌장암 이종 이식 동물 모델에서의 종양 크기 변화 분석
실시예 4의 조건으로 진행한 동물 실험에서 암세포 이식 후 군별 평균 종양크기가 44.1 m3 도달 시부터 21일째까지 10회 개체별로 vernier calipers (Mitutoyo, 일본)를 이용하여 길이(length, L), 너비(width, W)와 높이(height)를 측정하였다. 약물투여 개시 21일째 모든 개체들에 대해서 CO2 gas를 이용하여 치사 시킨 뒤 종양을 적출하여 종양의 외형을 비교해 크기 및 무게의 차이점을 관측하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교하여 핵산 복합체(조합1) 단독 투여 또는 양성 대조군과 병용 투여한 그룹에서 통계적으로 유의한 종양 크기 억제와 무게 감소 효과가 나타났다.
실시예 4-2: 웨스턴 블랏 분석(Western blot assay)으로 유전자 발현의 분석
실시예 4의 조건으로 실험을 진행하여 생검한 마우스 종양 조직의 일부를 RIPA buffer를 200 μL씩 첨가하여 protein lysate를 얻었다. Protein lysate를 BCA assay kit (Thermo Fisher, 미국)를 사용하여 단백질 양을 정량하고 단백질 30 μg을 전기영동을 통해 사이즈 별로 분리하여, PVDF membrane에 단백질을 옮긴 후 1차 항체인 KRAS (Abcam, 영국), p-ERK (Cell signaling Technology, 미국), HRAS (Abcam, 영국), NRAS (Abcam, 영국) 를 1:1000으로 처리하고 4 ℃에서 하루 동안 방치하였다.
1X TBS-T를 이용하여 워싱하고 2차 항체인 Goat Anti-Rabbit (Cell signaling Technology, 미국), Mouse Anti-Goat (Santa cruz Biotechnology, 미국) 를 1:2000으로 처리하여 상온에서 1시간 방치하였다. SupersignalTM West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Fisher, 미국)을 처리하고 Image600 (Amersham, 독일) 장비를 이용하여 췌장암 조직에서 표적 유전자의 발현 억제 효율을 분석하였다.
그 결과, 도 9와 같이 대조군 대비 핵산 복합체(조합1)를 처리한 그룹에서 RAS family 중 KRAS 표적 유전자의 발현 및 하위 경로 유전자 p-ERK 의 발현이 감소한 것을 확인할 수 있었다. 특히 핵산 복합체(조합1)의 2mg/kg 농도 단독 투여군 또는 양성대조군과 병용 투여군에서 표적 유전자와 하위 유전자의 발현이 현저하게 더 억제된 것을 확인하였다(도 9b).
실시예 4-3: H&E 염색으로 췌장암 이종 이식 동물 모델에서의 표현형 분석
실시예 4의 조건으로 실험을 진행하여 최종 실험 종료일에 세포주를 접종부위 종양 조직을 떼어내었다. 조직은 4% 포르말린 용액에 24시간 고정시킨 후 파라핀 포매하여 조직을 5 μm로 섹션하여 슬라이드 글라스에 마운팅하였다. 마운팅한 조직을 Hematoxylin:Eoin 염색 용액에 일정 시간 동안 염색하고 1X PBS로 수세한 후 형태학적인 소견을 현미경으로 분석하였다.
그 결과, 도 10에서와 같이 형성된 종양의 표현형이 대조군 대비 핵산 복합체(조합1)를 처리한 그룹에서 염증성 세포들의 밀도가 감소한 것을 확인할 수 있었다. 특히, 핵산 복합체(조합1)의 2mg/kg 농도 단독 투여군에서 세포 독성 항암제 양성 대조군보다 종양 세포의 분포 및 밀도가 6마리 모두 감소되어 있는 것을 확인하였다 (도 10b).
실시예 4-4: 면역염색으로 췌장암 이종 이식 동물 모델에서의 조직 내 KRAS 발현 변화 분석
실시예 4의 조건으로 실험을 진행하여 최종 실험 종료일에 세포주 접종부위 종양 조직을 떼어내어 4% 포르말린 용액에 하루 동안 고정하고 고정한 조직을 파라핀 포매하여 5 μm로 섹션하여 슬라이드 글라스에 마운팅하였다. 마운팅한 조직을 0.5% BSA 용액에 1시간 동안 블락킹하고, KRAS 1차 항체(Abcam, 영국)을 4 ℃에서 하루 동안 방치하였다. 이어서 1차 항체 용액을 제거하고 1X TBS로 씻어낸 후 2차 항체 용액 Goat Anti-Rabbit (Cell signaling Technology, 미국)을 1:2000으로 상온에서 2시간 처리한 후 DAB 염색을 통해 분석하였다.
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 음성 대조군(Negative Control, NC)과 대조군 조직 내 갈색으로 반응한 KRAS 발현이 확인되었으며, 핵산 복합체 조합1 단독 투여 또는 양성 대조군과 병용 투여 그룹에서 KRAS 갈색 반응이 현저하게 감소한 것이 관찰되었다. 이를 수치화하여 비교하였을 때에 핵산 복합체 조합과 양성 대조군을 병용투여한 그룹에서 감소되는 것을 확인하였으며, 특히 핵산 복합체 조합1 의 2mg/kg 그룹에서 가장 크게 KRAS 발현이 감소되는 것이 나타났다 (도 11 b).
실시예 4-5: 사멸 세포 측정법(TUNEL assay)으로 췌장암 이종 이식 동물 모델에서의 세포사멸(apoptosis) 분석
실시예 4의 조건으로 실험을 진행하여 최종 실험 종료일에 세포주를 접종부위 종양 조직을 떼어내어 4% 포르말린 용액에 하루 동안 고정하고 고정한 조직을 파라핀 포매하여 5 μm로 섹션하여 슬라이드 글라스에 마운팅하였다. 마운팅한 조직에 리액션 TdT 버퍼(reaction TdT buffer)를 떨어뜨리고 37℃에서 70분간 반응시켰다. 이 후 BrdU-Biotin 항체 용액을 70분간 빛을 차단하여 반응시키고 DAB 용액을 이용하여 사멸 세포를 염색했다. 반응이 종료된 조직은 헤마톡실린 용액에 담궈 핵을 염색하고 흐르는 물에 10분 세척한 후 마운팅하여 광학현미경으로 세포사멸이 얼마나 일어났는지 관찰하였다.
그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, 종양 조직 내 갈색으로 염색된 사멸 세포가 관찰되었으며, 음성 대조군과 대조군 대비 핵산 복합체 조합 1에서 갈색 반응의 사멸 세포 분포가 증가된 것을 관찰했다. 특히, 핵산 복합체 조합 1 의 2mg/kg 와 양성 대조군의 병용 투여 그룹에서 조직 내 사멸 세포 반응의 증가가 가장 많이 관찰되었다(도 12 b).
KRAS 돌연변이성 췌장암에서의 KRAS 돌연변이 G12D, G12V 표적 안티센스 펩티드 핵산의 치료 효과 분석
실시예 5: 생활성 펩티드 핵산(Bioactive Peptide Nucleic Acid) 및 캐리어 펩티드 핵산, 및 이들을 이용한 복합체의 제조
본 발명의 핵산 복합체의 췌장암에 대한 항암효과를 검정하기 위하여 표적 유전자로 췌장암 환자 조직에서 약 90%로 발견되는 KRAS codon 12의 유전자 변이 중 G12D (Glycine이 Aspartic acid로 변이된 형태) 와 G12V (Glycine이 Valine으로 변이된 형태) KRAS 돌연변이를 표적하였으며, 췌장암에서의 항암효과를 확인하기 위해 KRAS G12D 및 G12V 돌연변이에 대한 생활성 펩티드 핵산(Bioactive Peptide Nucleic Acid)으로 안티센스 펩티드 핵산(antisense PNA)을 사용하였다.
본 발명의 대조군으로 사용한 생활성 핵산 (antisense PNA)은 서열번호 10번으로 표시되는 서열로 구성되어 있으며, 췌장암 항암 효과를 확인하기 위해 사용한 생활성 펩티드 핵산(antisense PNA)은 서열번호 8번과 9번으로 표시되는 서열로 구성되어 있다.
본 실시예에서 사용된 펩티드 핵산 기반 생활성 핵산의 염기서열, 단량체 변형 및 구조는 하기 표 4 와 같다. 본 발명의 실시예에 따른 모든 캐리어 펩티드 핵산은 서열번호 11번 내지 19번으로 기재되는 서열로 구성되어 있다 (표 4).
본 발명에서 사용한 모든 펩티드 핵산은 파나진(PANAGENE, 한국)에서 HPLC 정제 방법을 통해 합성하였다.
췌장암 항암 효과 검증을 위한 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 서열
구분 서열
번호		 염기서열 단량체 변형
생활성 핵산 8 5'-AT-)CAG(+)CT-)CCA(+)ACT-)AC-O-K-3' -+-+-
9 5'-C(-)CTA(+)CGC(-)CAA(+)CAG(-)CT-O-K-3' -+-+-
10 5'-ACT(-)CCG(+)CA(-)ATT(+)ACC(-)A-O-K-3' -+-+-

캐리어 펩티드
핵산		 11 5'-TA(+)GTCGA(+)GGTTGA(+)TG-O-K-3' +++
12 5'-K-O-GT(+)AGTTGG(+)AGCTG(+)AT -3' +++
13 5'-TG(+)AT(+)G-O-K-3' ++
14 5'-K-O-GT(+)AG(+)T-3' ++
15 5'-G(+)GATGCG(+)GTTGTC(+)GA-O-K-3' +++
16 5'-K-O-AG(+)CTGTTG(+)GCGTAG(+)G-3' +++
17 5'-GT(+)CG(+)A-O-K-3' ++
18 5'-K-O-AG(+)CT(+)G-3' ++
19 5'-TGA(+)GGCGT(+)TAATGG(+)T-O-K-3' +++
상기 표 4 는 KRAS 돌연변이성 G12D와 G12V를 표적으로 하는 췌장암 항암 효과를 확인하기 위해 사용된 생활성 펩티드 핵산과 캐리어 펩티드 핵산 및 대조군으로 사용된 생활성 펩티드 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 서열 정보를 나타내었다.
단량체의 변형은 전기적인 성질을 부여하기 위하여 펩티드 핵산의 backbone을 전기적 양성은 리신(Lysine, Lys, K, (+)로 표기)을 전기적 음성은 글루타민산(Glutamic acid, Glu, E, (-)로 표기)로 변형된 펩티드 backbone을 가지도록 제작하였다.
각각의 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산 조합은 DMSO 하에서 혼성화 되었으며, 그 결과 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산으로 구성된 복합체가 제작되었다.
실시예 6: 핵산 복합체를 이용한 췌장암 (Pancreatic cancer) 항암효과 분석
실시예 5에 따라, 하기 표 5의 구조로 제조된 KRAS 돌연변이성 G12D와 G12V 를 표적 유전자로 하는 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 핵산 복합체를 이용하여 췌장암 항암 효과를 분석하였다.
실시예 6-1: 세포 배양
ATCC (American Type Culture Collection, 미국)로부터 입수한 인간 췌장암 세포 PANC-1(KRAS G12D 돌연변이성 세포) 와 CFPAC-1(KRAS G12V 돌연변이성 세포, ATCC No. 1918)를 각각 DMEM 배양배지(Dulbecco Modified Eagle Medium, 웰진, 한국)와 IMDM 배양배지(Iscove Modified Dulbecco Media, 웰진, 한국)에 10％(v/v) 소태아혈청, 페니실린 100units/㎖, 스트렙토마이신 100㎍/㎖ 을 동일하게 첨가하고, 37℃, 5％(v/v) CO2의 조건 하에서 배양하였다.
실시예 6-2: MTT (MTT assay)으로 췌장암 세포주의 세포 생존율 분석
실시예 6-1에서의 실험 조건으로 96웰에 췌장암 세포주 PANC-1(G12D mutation cell line)은 4x103, CFPAC-1 (G12V mutation cell line)은 6x103으로 씨딩하고 24시간 배양한 후, 표 5의 구조로 제조된 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 복합체를 이용하여 처리된 세포주에 5 mg MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) 용액을 1X PBS에 5 mg/mL 농도로 제조하고 well당 20μL로 처리하여 4시간 배양 후 OD (optical density)를 spectrophotometer로 측정하여 분석하였다.
본 실시예에서 사용한 핵산 복합체 조합은 하기 표 5 와 같다.
인간 췌장암 세포주에서 세포 생존율 분석을 위한 핵산 복합체 조합
조합 핵산 복합체
1 서열번호 8 및 11
2 서열번호 8 및 12
3 서열번호 8 및 13
4 서열번호 8 및 14
5 서열번호 9 및 15
6 서열번호 9 및 16
7 서열번호 9 및 17
8 서열번호 9 및 18
9 서열번호 10 및 19 (대조군)
그 결과, 도 13 에 나타낸 바와 같이 췌장암 세포 모델에서 표 5의 조합 1번과 2번 핵산 복합체에 의해 세포 생존율이 72시간까지 농도 의존적으로 감소하였으며(도 13 a), 조합 5번과 6번 핵산 복합체에 의해서 96시간까지 세포 생존율 감소가 유지된 것을 확인하였다 (도 13 b).
실시예 6-3: 웨스턴 블랏 분석(Western blot assay)으로 유전자 발현의 분석
인간 췌장암 세포주 PANC-1과 CFPAC-1을 6웰 플레이트에 1x105으로 세포를 씨딩하고 24시간 배양 후 실시예 6-1의 조건으로 실험을 진행하여 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 복합체를 처리하고 24, 48, 72, 96, 120 시간 배양한 후, RIPA buffer를 각 웰에 30 μL씩 첨가하여 protein lysate를 얻었다. Protein lysate를 BCA assay kit (Thermo Fisher, 미국)를 사용하여 단백질 양을 정량하고 단백질 30 μg을 전기영동을 통해 사이즈 별로 분리하여, PVDF membrane에 단백질을 옮긴 후 1차 항체인 RAS-G12D (Cell signaling Technology, 미국), RAS-G12V (Cell signaling Technology, 미국), KRAS (Abcam, 영국), p-ERK (Cell signaling Technology, 미국), HRAS (santa cruz Biotechnology, 미국), NRAS (Abcam, 영국) 를 1:1000으로 처리하고 4 ℃에서 하루 동안 방치하였다.
1X T BS-T를 이용하여 워싱하고 2차 항체인 Goat Anti-Rabbit (Cell signaling Technology, 미국), Mouse Anti-Goat (Santa cruz Biotechnology, 미국), Goat Anti-Rat (Thermo Fisher Scientific, 미국) 를 1:2000으로 처리하여 상온에서 1시간 방치하였다. SupersignalTM West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Fisher, 미국)을 처리하고 Image600 (Amersham, 독일) 장비를 이용하여 췌장암 세포주에서 표적 유전자의 발현 억제 효율을 분석하였다.
본 실시예 에서는 인간 췌장암 세포 모델에서의 RAS family (KRAS, HRAS, NRAS)와 G12D, G12V 돌연변이성 RAS 및 하위단계 유전자인 p-ERK 발현 변화를 분석하였으며, 사용한 핵산 복합체 조합은 표 5와 동일하다.
그 결과, 도 14 에 나타낸 바와 같이, 서열번호 8번과 12번의 조합2 핵산 복합체를 통하여 RAS family 중 KRAS 와 RAS-G12D 돌연변이성 유전자의 발현이 120 시간까지 억제되고, 하위 경로 유전자 p-ERK 의 발현도 72시간까지 감소되는 것을 확인하였다. 또한, 서열번호 9번과 15번의 조합5 핵산 복합체와 서열번호 9번과 16번의 조합6 핵산 복합체를 통하여 KRAS 와 RAS-G12V 돌연변이성 유전자의 발현이 48시간부터 120시간까지 억제되었으며, 하위 경로 유전자 p-ERK 의 발현도 72시간부터 120시간까지 감소되는 것을 확인하였다. 조합 1,3,4,8번 핵산 복합체에 의해서 RAS family 중 HRAS나 NRAS를 감소시키는 원치 않는 서열의 유전자 교정 효과(off-target effect)가 관찰되었지만 조합 2,5,6번에 의해서는 나타나지 않았다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> SEASUN THERAPEUTICS, Inc <120> Composition for Preventing or Treating Pancreatic Cancer Comprising Peptide Nucleic Acid Complex <130> P20-B324 <160> 20 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bioactive 1 <400> 1 acttgcttcc tgtagg 16 <210> 2 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bioactive 2 <400> 2 agtcttgact tattg 15 <210> 3 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> carrier 1 <400> 3 tgaacgaagg acatcc 16 <210> 4 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> carrier 2 <400> 4 cctacaggaa gcaagt 16 <210> 5 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> carrier 3 <400> 5 catcc 5 <210> 6 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> carrier 4 <400> 6 cctac 5 <210> 7 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> carrier 5 <400> 7 tcagaactga ataac 15 <210> 8 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bioactive 3 <400> 8 atcagctcca actac 15 <210> 9 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bioactive 4 <400> 9 cctacgccaa cagct 15 <210> 10 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bioactive 5 <400> 10 actccgcaat tacca 15 <210> 11 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> carrier 6 <400> 11 tagtcgaggt tgatg 15 <210> 12 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> carrier 7 <400> 12 gtagttggag ctgat 15 <210> 13 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> carrier 8 <400> 13 tgatg 5 <210> 14 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> carrier 9 <400> 14 gtagt 5 <210> 15 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> carrier 10 <400> 15 ggatgcggtt gtcga 15 <210> 16 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> carrier 11 <400> 16 agctgttggc gtagg 15 <210> 17 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> carrier 12 <400> 17 gtcga 5 <210> 18 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> carrier 13 <400> 18 agctg 5 <210> 19 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> carrier 14 <400> 19 tgaggcgtta atggt 15 <210> 20 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> endosome escaper <400> 20 Gly Leu Phe Asp Ile Ile Lys Lys Ile Ala Glu Ser Phe 1 5 10

Claims (11)

  1. KRAS 유전자를 표적으로 하고,
    (i) 서열번호 1로 표시되는 서열을 포함하는 생활성 핵산 및 서열번호 3으로 표시되는 서열을 포함하는 캐리어 펩티드 핵산으로 구성된 핵산 복합체;
    (ii) 서열번호 1로 표시되는 서열을 포함하는 생활성 핵산 및 서열번호 4로 표시되는 서열을 포함하는 캐리어 펩티드 핵산으로 구성된 핵산 복합체;
    (iii) 서열번호 1로 표시되는 서열을 포함하는 생활성 핵산 및 서열번호 5로 표시되는 서열을 포함하는 캐리어 펩티드 핵산으로 구성된 핵산 복합체;
    (iv) 서열번호 1로 표시되는 서열을 포함하는 생활성 핵산 및 서열번호 6으로 표시되는 서열을 포함하는 캐리어 펩티드 핵산으로 구성된 핵산 복합체;
    (v) 서열번호 8로 표시되는 서열을 포함하는 생활성 핵산 및 서열번호 11로 표시되는 서열을 포함하는 캐리어 펩티드 핵산으로 구성된 핵산 복합체;
    (vi) 서열번호 8로 표시되는 서열을 포함하는 생활성 핵산 및 서열번호 12로 표시되는 서열을 포함하는 캐리어 펩티드 핵산으로 구성된 핵산 복합체;
    (vii) 서열번호 8로 표시되는 서열을 포함하는 생활성 핵산 및 서열번호 13으로 표시되는 서열을 포함하는 캐리어 펩티드 핵산으로 구성된 핵산 복합체;
    (viii) 서열번호 8로 표시되는 서열을 포함하는 생활성 핵산 및 서열번호 14로 표시되는 서열을 포함하는 캐리어 펩티드 핵산으로 구성된 핵산 복합체;
    (ix) 서열번호 9로 표시되는 서열을 포함하는 생활성 핵산 및 서열번호 15로 표시되는 서열을 포함하는 캐리어 펩티드 핵산으로 구성된 핵산 복합체;
    (x) 서열번호 9로 표시되는 서열을 포함하는 생활성 핵산 및 서열번호 16으로 표시되는 서열을 포함하는 캐리어 펩티드 핵산으로 구성된 핵산 복합체;
    (xi) 서열번호 9로 표시되는 서열을 포함하는 생활성 핵산 및 서열번호 17로 표시되는 서열을 포함하는 캐리어 펩티드 핵산으로 구성된 핵산 복합체; 및
    (xii) 서열번호 9로 표시되는 서열을 포함하는 생활성 핵산 및 서열번호 18로 표시되는 서열을 포함하는 캐리어 펩티드 핵산으로 구성된 핵산 복합체;
    로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 세포 투과성 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 췌장암의 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, 상기 생활성 핵산 또는 캐리어 펩티드 핵산은 각각의 핵산의 5'-말단 또는 3'-말단에 펩티드, 지질 나노물질(lipid nanoparticles), 접합체 나노물질(polyplex nanoparticles), 고분자 나노구(polymer nanospheres), 무기물 나노물질(inorganic nanoparticles), 양이온 지질 나노물질(cationic lipid-based nanoparticles), 양이온 고분자(cationic polymer) 및 pH 감응 고분자(pH sensitive polymers)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 엔도좀 탈출을 도와주는 물질이 추가로 결합된 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 삭제
  8. 제6항에 있어서, 상기 엔도좀 탈출을 도와주는 펩티드는 GLFDIIKKIAESF(서열번호 20) 또는 Histidine(10)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 생활성 핵산은 전체적으로 음전하 또는 중성을 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 전체적으로 양전하를 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 핵산 복합체는 전체적으로 양전하를 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
KR1020200175270A 2020-12-15 2020-12-15 펩티드 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 췌장암 예방 또는 치료용 조성물 KR102574252B1 (ko)

Priority Applications (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200175270A KR102574252B1 (ko) 2020-12-15 2020-12-15 펩티드 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 췌장암 예방 또는 치료용 조성물
CA3202307A CA3202307A1 (en) 2020-12-15 2021-12-14 Composition for preventing or treating pancreatic cancer comprising peptide nucleic acid complex
CN202180092251.5A CN116801915A (zh) 2020-12-15 2021-12-14 用于预防或治疗胰腺癌的包括肽核酸复合物的组合物
AU2021400686A AU2021400686A1 (en) 2020-12-15 2021-12-14 Composition for preventing or treating pancreatic cancer comprising peptide nucleic acid complex
PCT/KR2021/018964 WO2022131744A1 (ko) 2020-12-15 2021-12-14 펩티드 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 췌장암 예방 또는 치료용 조성물
US18/257,594 US20240042048A1 (en) 2020-12-15 2021-12-14 Composition for preventing or treating pancreatic cancer comprising peptide nucleic acid complex
JP2023537575A JP2023554124A (ja) 2020-12-15 2021-12-14 ペプチド核酸複合体を有効成分として含有する膵癌予防又は治療用組成物
EP21907048.9A EP4265276A1 (en) 2020-12-15 2021-12-14 Composition for preventing or treating pancreatic cancer comprising peptide nucleic acid complex

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200175270A KR102574252B1 (ko) 2020-12-15 2020-12-15 펩티드 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 췌장암 예방 또는 치료용 조성물

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20220085311A KR20220085311A (ko) 2022-06-22
KR102574252B1 true KR102574252B1 (ko) 2023-09-07

Family

ID=82059287

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020200175270A KR102574252B1 (ko) 2020-12-15 2020-12-15 펩티드 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 췌장암 예방 또는 치료용 조성물

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20240042048A1 (ko)
EP (1) EP4265276A1 (ko)
JP (1) JP2023554124A (ko)
KR (1) KR102574252B1 (ko)
CN (1) CN116801915A (ko)
AU (1) AU2021400686A1 (ko)
CA (1) CA3202307A1 (ko)
WO (1) WO2022131744A1 (ko)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2018528781A (ja) 2015-09-24 2018-10-04 アイオニス・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＩｏｎｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ． Ｋｒａｓ発現のモジュレーター

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6283661B2 (ja) * 2012-05-09 2018-02-21 ストライク バイオ インク．Ｓｔｒｉｋｅ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ． 一塩基ＫＲＡＳ変異に特異的な二機能性低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ＢＩ−ＳＨＲＮＡ，Ｂｉ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌＳｈｏｒｔ−ＨａｉｒｐｉｎＲＮＡ）
US20180312542A1 (en) * 2015-10-20 2018-11-01 President And Fellows Of Harvard College Endosomal escape peptides
EP3498844B1 (en) * 2016-08-09 2022-09-28 Seasun Therapeutics Peptide nucleic acid complex having improved cell permeability and pharmaceutical composition comprising same
KR102262260B1 (ko) * 2018-02-08 2021-06-09 주식회사 시선테라퓨틱스 엔도좀 탈출능을 갖는 펩티드 핵산 복합체 및 이의 용도
KR102156324B1 (ko) * 2019-01-21 2020-09-15 주식회사 시선테라퓨틱스 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 혈관신생관련 질환 치료용 약학 조성물

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2018528781A (ja) 2015-09-24 2018-10-04 アイオニス・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＩｏｎｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ． Ｋｒａｓ発現のモジュレーター

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Oncotarget. 2019. Vol.10, No.46, pp.4761-4775.*

Also Published As

Publication number Publication date
WO2022131744A1 (ko) 2022-06-23
US20240042048A1 (en) 2024-02-08
JP2023554124A (ja) 2023-12-26
KR20220085311A (ko) 2022-06-22
CA3202307A1 (en) 2022-06-23
AU2021400686A1 (en) 2023-08-03
CN116801915A (zh) 2023-09-22
EP4265276A1 (en) 2023-10-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3498844B1 (en) Peptide nucleic acid complex having improved cell permeability and pharmaceutical composition comprising same
US20230193275A1 (en) Peptide nucleic acid complex having endosomal escape capacity, and use thereof
CA3090765C (en) Skin-permeating carrier containing nucleic acid complex and use thereof
AU2016363683A1 (en) Monocarboxylate transporter 4 (MCT4) antisense oligonucleotide (ASO) inhibitors for use as therapeutics in the treatment of cancer
KR102574252B1 (ko) 펩티드 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 췌장암 예방 또는 치료용 조성물
US20220282248A1 (en) Molecular targeted nucleic acid medicine for gastric cancer
KR102519059B1 (ko) 혈뇌장벽 투과능을 가지는 펩티드 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 치매 예방 또는 치료용 조성물
EP4265277A1 (en) Composition for preventing or treating glioblastoma comprising peptide nucleic acid complex as active ingredient
KR102630164B1 (ko) 펩티드 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 비알콜성 지방간염 예방 또는 치료용 조성물
WO2022080364A1 (ja) 薬物送達粒子及び医薬組成物
KR20230128690A (ko) 핵산 복합체를 포함하는 폐암 예방 또는 치료용 조성물
KR20160112375A (ko) siRNA의 암 표적화된 전달을 위한 비타민 기반 나노입자 복합체 및 이의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant