JP6814632B2

JP6814632B2 - 顆粒球除去方法

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Publication number: JP6814632B2
Application number: JP2016523462A
Authority: JP
Inventors: 明彦田口; 研一山原; 彩子久松; 伸彦佐藤
Original assignee: Kaneka Corp; National Cerebral and Cardiovascular Center
Current assignee: Kaneka Corp; National Cerebral and Cardiovascular Center
Priority date: 2014-05-30
Filing date: 2015-05-22
Publication date: 2021-01-20
Anticipated expiration: 2035-05-22
Also published as: JPWO2015182501A1; WO2015182501A1

Description

本発明は、体液中の顆粒球を選択的に吸着除去する方法に関する。

近年、骨髄液、末梢血、及び臍帯血などの体液中から得られる有核細胞中の単核球画分を、脳梗塞、心筋梗塞及び肢虚血などの虚血性疾患領域に移植すると臨床的効果があることが認められている。例えば、Ｒａｍｓｈｏｒｓｔらは、虚血性心疾患の患者に、自家骨髄より分離した骨髄単核球を移植する細胞移植治療により、効果的に治療可能であることを見出している（非特許文献１）。また、田口らは、末梢動脈閉塞性疾患であるＢｕｅｒｇｅｒ病患者に、自家骨髄より分離したＣＤ３４陽性細胞を含む骨髄単核球画分を移植し、血管新生を促進することによってＢｕｅｒｇｅｒ病を効果的に治療可能であることを見出している（非特許文献２）。

一方で、有核細胞中の顆粒球は各種疾患の炎症・悪化に関与していることが多数報告されており（非特許文献３、４、及び５）、顆粒球を可能な限り除去することが望まれている。

体液中の単核球を高い効率で回収し、顆粒球を高い効率で除去する方法としては、比重密度勾配遠心法であるフィコールパック分画法（Ｆｉｃｏｌｌ法）が存在する。フィコールパック分画法は細胞分離液と細胞を分けるために遠心分離器を使用して細胞を数回洗浄する操作が必要であり、操作性が煩雑であり、遠心分離によって細胞にダメージを与える恐れがあり、開放系での操作によってコンタミネーションの危険が伴うなどの問題がある。

そこで操作性が簡便で、且つ閉鎖系で実施できる顆粒球の除去方法として、顆粒球を選択的に付着する素材を用いて、顆粒球を選択的に吸着させる方法が開示されている。例えば、特許文献１には中心線平均粗さＲａが０．２μｍ〜１０μｍであり、且つ平均間隔Ｓｍ値が５μｍ〜２００μｍの凹凸を有する、顆粒球と高い親和性を有する顆粒球吸着用担体を用いて、末梢血中の顆粒球を吸着することが開示されている。しかし、末梢血よりも多くの種類の細胞を含む骨髄液中の顆粒球吸着は記載されていない。特許文献２には、アセチル基によって置換されている水酸基の割合が全水酸基の３５〜５３％である顆粒球吸着用担体と、骨髄液を一定時間接触させることで、骨髄液中の顆粒球を分離することが開示されている。しかし、細胞移植治療への実用化のためには顆粒球除去能のさらなる向上が必要である。特許文献３には、効率的に顆粒球を除去する方法として、線速３．４ｃｍ／ｍｉｎ以下であれば顆粒球・単球の除去率を３０％以上とすることができ、更に０．５ｃｍ／ｍｉｎ以上２．７ｃｍ／ｍｉｎ以下であれば最も除去効率が高いことが開示されている。しかし、線速が小さすぎると血液が滞留し凝固することが記載されており、０．５ｃｍ／ｍｉｎ未満の線速は検討されていない。

遠心操作による細胞への負荷、操作性の煩雑さ、コンタミネーションの危険などを鑑みると、顆粒球が選択的に付着する素材を用いて顆粒球を除去することが好ましい。しかし、担体の性能を改善するだけでは顆粒球の残存率が高く、細胞移植治療への実用化のためには体液から十分に顆粒球が除去できているとはいえない。

特開平５−１６８７０６号公報国際公開第２００６／０２５３７１号特開２００９−１９５４４３号公報

Ｒａｍｓｈｏｒｓｔ．ｅｔａｌ．：ＩｎｔｒａｍｙｏｃａｒｄｉｎａｌＢｏｎｅＭａｒｒｏｗＣｅｌｌＩｎｊｅｃｔｉｏｎｆｏｒＣｈｒｏｎｉｃＭｙｏｃａｒｄｉｎａｌＩｓｃｈｅｍｉａ：ＡＲａｍｄｏｍｉｚｅｄＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＴｒｉａｌ，ＪＡＭＡ３０１（１９）：１９９７−２００４（２００９）Ｔａｇｕｃｈｉ．ｅｔａｌ．：ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＡｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓｂｙＡｕｔｏｌｏｇｏｕｓＢｏｎｅ−ｍａｒｒｏｗＴｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎｉｎａＧｅｎｅｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌＳｅｔｔｉｎｇ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｖａｓｃ．Ｅｎｄｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．２５：２７６−２７８（２００３）Ｃａｒｌｅｓ．ｅｔａｌ．：ＮｅｕｔｒｏｐｈｉｌＩｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎｉｎｃｒｅａｓｅＭａｔｒｉｘＭｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−９ｉｎｔｈｅＩｓｃｈｅｍｉｃＢｒａｉｎａｆｔｅｒＯｃｃｌｕｓｉｏｎ／ＲｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎｏｆｔｈｅＭｉｄｄｌｅＣｅｒｅｂｒａｌＡｒｔｅｒｙｉｎＲａｔｓ，Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ．Ｆｌｏｗ．Ｍｅｔａｂ．２３（１２）：１４３０−１４４０（２００３）Ｔａｇｕｃｈｉ．ｅｔａｌ．：Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒｈａｓａｎｅｇａｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｏｎｓｔｒｏｋｅｏｕｔｃｏｍｅｉｎａｍｕｒｉｎｅｍｏｄｅｌ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒ．２６：１２６−１３３（２００７）Ｓｕｚｕｋｉ．ｅｔａｌ．：潰瘍性大腸炎に対する顆粒球吸着療法の効果と機序に対する考察日本アフェレーシス学会誌２０（１）：１７−２６（２００１）

本発明の目的は、顆粒球を選択的に除去できる担体を充填したフィルターを用いた有核細胞の分離方法における、前述の問題点を解決することを課題とする。具体的には、特定の担体を用いて、特定の線速で体液を処理することで、顆粒球の除去率を向上させる方法を提供する。さらに、特定の担体を用いて、特定の線速で体液を処理することで、単核球の回収率を向上させる方法を提供する。

発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、驚くべきことに、骨髄液、末梢血、及び臍帯血などの、単核球を含む体液を、特定の顆粒球吸着剤を収容した容器に、特定の線速で導入させることで、単核球を高い効率で回収でき、顆粒球を高い効率で除去できることを見出した。

すなわち、本発明は、（ａ）流入部と流出部を備え、アセチル基によって置換されている水酸基の割合が全水酸基の２３〜５４％である酢酸セルロースからなる担体を合計表面積が１５７〜６２７ｃｍ^２となるように収容した容器の前記流入部から、体液を０．１１ｃｍ／ｍｉｎ以上０．３３ｃｍ／ｍｉｎ未満の線速で送液する工程、及び（ｂ）前記流出部から顆粒球濃度が低下した体液を回収する工程を含む、体液から顆粒球を除去する方法に関する。

工程（ｂ）で回収される体液中の顆粒球濃度が、工程（ａ）で送液される体液中の顆粒球濃度の１０％以下であることが好ましい。

工程（ａ）で送液される体液が骨髄液、末梢血、又は臍帯血であることが好ましい。

工程（ｂ）で回収される体液における単核球、幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、及びそれらの混合物からなる群から選択される有核細胞の濃度が、工程（ａ）で送液される体液における有核細胞の濃度よりも高いことが好ましい。

本発明は、体液中の単核球回収及び顆粒球吸着を、簡便に高い効率で行うことを可能とし、細胞移植治療に用いることが可能な細胞懸濁液を提供し、細胞治療の普及を促進する。

本発明は、（ａ）流入部と流出部を備え、アセチル基によって置換されている水酸基の割合が全水酸基の２３〜５４％である酢酸セルロースからなる担体を合計表面積が１５７〜６２７ｃｍ^２となるように収容した容器の前記流入部から、体液を０．１１ｃｍ／ｍｉｎ以上０．３３ｃｍ／ｍｉｎ未満の線速で送液する工程、及び（ｂ）前記流出部から顆粒球濃度が低下した体液を回収する工程を含む、体液から顆粒球を除去する方法に関する。

本発明における体液としては、血液、骨髄液、末梢血、臍帯血、リンパ液、それらの希釈液などを使用することができる。前記体液に由来する細胞懸濁液も使用できる。細胞懸濁液としては、血液、骨髄液、臍帯血、リンパ液などを哺乳動物から採取し、所望によりフィコール、パーコール、バクティナーチューブ、リフォプレップ、ＨＥＳ（ヒドロキシエチルスターチ）などを使用し、比重密度遠心分離法により赤血球を除去した、単核球画分、間葉系幹細胞、造血幹細胞、血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ）、顆粒球などの細胞が含まれる画分が挙げられる。細胞懸濁液としては、また、前記画分を再度遠心分離して濃縮して得られる液体が挙げられる。

本発明の方法により、体液から顆粒球を除去する際には、事前に体液を抗凝固剤で処理することが好ましい。抗凝固剤としては、ヘパリン、低分子量ヘパリン、メシル酸ナファモスタット、メシル酸ガベキサート、アルガトロバン、アシッド・シトレート・デキストロース液（ＡＣＤ液）、シトレート・フォスフェート・デキストロース液（ＣＰＤ液）などのクエン酸含有抗凝固剤などが挙げられる。なかでもヘパリンは一般的に最も好ましく用いられる抗凝固剤として挙げることができる。

本発明において、吸着担体として、酢酸セルロースからなる担体を使用する。酢酸セルロースは、顆粒球と一定の親和性を有することが知られており、酢酸セルロースからなる担体を使用することにより、体液から顆粒球を効率的に除去することができる。

酢酸セルロースは、酢酸とセルロースを、適切な触媒、例えば硫酸の存在下、エステル結合を形成させることによって製造し得る。酢酸セルロースは、例えば国際公開第２００６／０２５３７１号に記載のように、（ａ）セルロースの水酸基と酢酸とを、アルカリ性条件下で切断可能な様式で結合させてセルロース−酢酸の結合体を得る工程、及び（ｂ）前記結合体をアルカリ性条件下で処理して、セルロースの水酸基と酢酸との結合の一部を切断する工程を含む方法により得られるものでもよい。

酢酸セルロースは、酢酸に由来するアセチル基を有する。アセチル基を導入する前に、周知の水酸基の保護基を利用してもよい。水酸基の保護基は、例えば、Ｔ．Ｈ．Ｇｒｅｅｎｅ及びＰ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，ＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅＧｒｏｕｐｓｉｎＯｒｇａｎｉｃＳｙｎｔｈｅｓｉｓ、第３版、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ニューヨーク（１９９９年）に記載されている。

水酸基の保護基の例としては、エーテル系の保護基、アセタール系の保護基、シリル系の保護基又はエステル系の保護基が挙げられる。エーテル系の保護基とは水酸基を保護する目的でエーテル結合を形成する保護基を意味し、水酸基のＨと置換されたメチル基、エチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、オクチル基、アリル基、ベンジル基、ｐ−メトキシメチル基、フルオレニル基、トリチル基、ベンズヒドリル基などを挙げることができる。アセタール系の保護基とは水酸基を保護する目的でアセタール結合を形成する保護基を表わし、例えば、メトキシエチル基、エトキシエチル基、テトラヒドロピラニル基、テトラヒドロフラニル基などを挙げることができる。シリル系の保護基とは、水酸基を保護する目的でシリルオキシ基結合を形成する保護基を意味し、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基などを挙げることができる。また、エステル系の保護基とは、水酸基を保護する目的でエステル結合を形成する保護基を表わし、アセチル基、プロピオニル基、イソプロピオニル基、ピバロイル基、ベンゾイル基、トリフルオロアセチル基、トリクロロアセチル基などを挙げることができる。

酢酸セルロースにおいて、アセチル基によって置換されている水酸基の割合は、全水酸基（無置換水酸基と置換水酸基を含む）の２３〜５４％であることが好ましく、４３〜５４％であることがより好ましい。２３％未満では、担体の親水性が高すぎて担体の顆粒球吸着能が低下する傾向がある。５４％を超えると担体の水酸基量が少なすぎて顆粒球が活性化されず担体へ吸着されにくくなる傾向がある。

酢酸セルロースにおいて、アセチル基によって置換されている水酸基の割合を、「水酸基のアセチル基による置換率」、「アセチル基による置換率」、「アセチル基置換率」又は単に「置換率」と称することがある。

酢酸セルロースの水酸基のアセチル基による置換率（％）は、例えば以下のように測定することができる。被検物質を十分に乾燥させた後、乾燥重量を精密天秤にて測定し（０．５ｇ前後）、フラスコに入れる。被検物質を溶解し得る溶媒（例えばアセトン水溶液）を５０ｍＬ添加し、室温にて１時間、スターラーにて攪拌する。次に０．２規定水酸化ナトリウム水溶液５０ｍＬを添加し、５分間攪拌後、３時間室温にて静置する。次に０．２規定塩酸５０ｍＬを該フラスコ中に入れ５分間攪拌後、１時間室温にて静置する。次にフェノールフタレイン液２、３滴をフラスコ中に入れ、０．１規定水酸化ナトリウム水溶液をビュレットにて滴下し、溶液が淡い赤色に変化したときを終点として、滴定量（Ａ（ｍＬ））を求める。また被検物質を入れない以外は前記と同様の操作を行って同様に滴定量（Ｂ（ｍＬ））を求める。以上の測定から酢酸セルロースのアセチル基による置換率（％）は、下式により求めることができる。
置換率（％）＝（Ａ−Ｂ）Ｆ×０．６００５／被検物質重量（ｇ）
Ｆ：滴定に使用した０．１規定水酸化ナトリウム水溶液のファクター

酢酸セルロースからなる担体は、球状、粒状などであることが好ましい。球状又は粒状の場合、平均粒径は約５０μｍ以上２０００μｍ未満であることが好ましく、約８０μｍ以上２０００μｍ未満であることがより好ましく、約１００μｍ以上１０００μｍ以下であることが最も好ましい。

球状又は粒状の酢酸セルロースからなる担体は、例えば以下の方法により調製される。１種又は２種以上の原料モノマー化合物を、適当な粘性の溶媒、例えば水中に分散、懸濁させ、懸濁液を攪拌しつつ重合反応に適当な条件下で重合化させ所定の形状の重合体を得る。あるいは、ポリマーを溶媒に溶解し、特開昭６３−１１７０３９号公報に記載された方法（振動法）により液滴化し、凝固浴で捕捉することにより凝固させ所定の形状のものを得る。

所望により、酢酸セルロースからなる担体の表面を、物理的あるいは化学的手段によって粗面化する処理を行ってもよい。

酢酸セルロースからなる担体の表面は多孔質体、非多孔質体、あるいはスキン層構造など、あらゆる種類の構造をとり得る。表面が多孔質体の場合、顆粒球吸着と同時に、顆粒球を含む血液細胞が産生するサイトカイン類、活性化に伴い産生される酵素、惹起物質などの、生体にとって好ましくない物質を合わせて吸着除去することもできる。

細孔の大きさは排除限界分子量で規定される。酢酸セルロースからなる担体が多孔質体である場合は、排除限界分子量が１．５×１０^５以下であることが好ましく、１．４×１０^５以下であることがより好ましい。１．５×１０^５より大きくなると非特異吸着が大きくなり、体液中の有用蛋白質の損失が起こる場合がある。非特異吸着の影響をより少なくするためには、排除限界分子量が１．３×１０^５以下であることがさらに好ましく、１．２×１０^５以下であることがさらにより好ましく、１．０×１０^５以下であることが最も好ましい。排除限界分子量とは、例えば「実験高速液体クロマトグラフィ」（波多野博行及び花井俊彦著、（株）化学同人発行）などの成書に記載されているごとく、ゲル浸透クロマトグラフィにおいて細孔内に侵入できない、すなわち排除される分子のうち最も小さい分子量を有するものの分子量をいう。本発明において酢酸セルロースからなる担体は水不溶性であることが好ましい。

酢酸セルロースからなる担体として、酢酸セルロース単独からなる担体を用いてもよいが、任意の硬質基材、軟質基材の外表面を酢酸セルロースで被覆したものを用いることができる。基材としては、ガラス、シリカゲル、活性炭などの無機材料からなる基材、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレンなどの合成高分子や架橋アガロース、架橋デキストリンなどの多糖類からなる有機材料からなる基材、セルロース、ポリビニルアルコール、エチレン−酢酸ビニル共重合体ケン化物、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリル酸グラフト化ポリエチレン、ポリアクリルアミドグラフト化ポリエチレン、さらにはこれらの組み合わせによって得られ得る有機−有機、有機−無機などの複合材料からなる基材などが挙げられるが、これらには限定されない。基材の形状としては、球状、粒状などいずれも有効に用いられる。

本発明において「顆粒球」は、哺乳類末梢血、骨髄、臍帯血中の顆粒球、アファレーシスにより濃縮された白血球中の顆粒球、フィコール、バクティナーチューブ、ＨＥＳ（ヒドロキシエチルスターチ）などを用いた密度勾配遠心法にて分取された白血球画分中の顆粒球、又は、これらの方法にて分取された白血球画分を緩衝液中や培養液、生理食塩液中に懸濁した細胞懸濁液中の顆粒球などを指す。

本発明において、顆粒球の吸着器として、体液を流入させるための流入部、及び体液を流出させるための流出部を有する容器を使用する。容器は、その流出部に、体液は通過するが酢酸セルロースは通過しないフィルターを装着していてもよい。体液は通過するが酢酸セルロースは通過しないフィルターとして、例えばメッシュ、不織布、綿栓などのフィルターが挙げられる。

前記容器の形態、材質、大きさに特に限定されない。形態は、球、コンテナ、バッグ、チューブ、カラムなど任意の形態であってよい。好ましい具体例としては、例えば容量約０．１〜５００ｍＬ程度、直径約０．１〜１０ｃｍ程度の透明又は半透明の筒状容器などが挙げられる。容器は、任意の構造材料を使用して作成することができる。具体的な構造材料としては例えば非反応性ポリマー又は生物親和性金属もしくは合金が挙げられる。該ポリマーとしては、アクリロニトリルポリマー（例えばアクリロニトリルブタジエンスチレンターポリマーなど）、ハロゲン化ポリマー（例えばポリテトラフルオロエチレン、ポリクロロトリフルオロエチレン、コポリマーテトラフルオロエチレン、ヘキサフルオロプロピレンなど）、ポリアミド、ポリスルホン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリビニルクロリドアクリルコポリマー、ポリカーボネートアクリロニトリルブタジエンスチレン、ポリスチレンなどが挙げられる。容器のために有用な金属材料としては、例えばステンレス鋼、チタン、白金、タンタル、金、及びそれらの合金、並びに金メッキ合金鉄、白金メッキ合金鉄、コバルトクロミウム合金、及び窒化チタン被覆ステンレス鋼が挙げられる。耐滅菌性を有する素材が特に好ましく、具体的にはシリコンコートされたガラス、ポリプロピレン、塩化ビニル、ポリカーボネート、ポリサルフォン、ポリメチルペンテンなどが挙げられる。

前記容器には、酢酸セルロースからなる担体が、合計表面積が１５７〜６２７ｃｍ^２となるように収納される。合計表面積は、１５７〜６２７ｃｍ^２であることが好ましく、３１４〜６１５ｃｍ^２であることがより好ましい。

酢酸セルロースの合計表面積は、容器内に酢酸セルロースを最密充填（充填率７４％）した際の充填個数を求め、該充填個数と酢酸セルロース一個の表面積の積により得られる値である。

体液を容器の流入部から送液することにより、体液が、容器に収容された酢酸セルロースに接触し、顆粒球が酢酸セルロースに吸着される。体液の送液方法としては例えば、体液を送液ポンプなどにより灌流状態で送液して酢酸セルロースに接触させる方法や、灌流せずに送液して酢酸セルロースに接触させる方法が挙げられる。

体液は、容器の流入部から、０．１１ｃｍ／ｍｉｎ以上０．３３ｃｍ／ｍｉｎ未満の線速で送液される。線速は、０．１１ｃｍ／ｍｉｎ以上０．３３ｃｍ／ｍｉｎ未満であることが好ましく、０．１１〜０．１９ｃｍ／ｍｉｎであることがより好ましい。０．１１ｃｍ／ｍｉｎ未満では、線速が小さすぎて血液が滞留し凝固する傾向がある。０．３３ｃｍ／ｍｉｎ以上では、線速が大きすぎて血液と吸着担体との接触時間が短く、十分に顆粒球を除去できない傾向がある。本発明における線速は、容器から１分間に流出する体液量を、酢酸セルロースを収容した顆粒球吸着部の断面積で除して得られる値のことである。

本発明の方法において、容器から回収される体液中の顆粒球濃度が、容器に送液される体液中の顆粒球濃度の１０％以下であることが好ましい。容器に送液される体液からの顆粒球除去率が９０％以上であることが好ましい。

本発明の方法において、単核球回収率は、従来の比重密度勾配遠心法であるフィコールパック分画法で回収し得る３９％以上であることが好ましく、移植に使用する細胞数を考慮し５０％以上であることがより好ましい。

本発明の方法において、容器から回収される体液における有核細胞の濃度が、容器に送液される体液における有核細胞の濃度よりも高いことが好ましい。このような有核細胞としては、単核球、幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、及びそれらの混合物が挙げられる。なお、ここで有核細胞の濃度とは、体液に含まれる有核細胞数を、体液に含まれる全細胞数で除した値を指す。

顆粒球が除去された体液中の目的とする細胞の濃度は、更に遠心分離操作を行うことにより高めることができる。或いは、顆粒球が吸着除去された体液中の、目的とする細胞を、フィコール、フィコールハイパック（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）、パーコール、バクティナーチューブ、リフォプレップなどを使用して濃縮することもできる。

本発明の方法により得られる顆粒球が除去された体液は、調製後に直ちに使用してもよいし、冷蔵保存、凍結保存後に解凍して使用してもよい。

本発明の方法により得られる顆粒球が除去された体液は、薬学的に許容される他の担体、賦形剤などと組み合せることにより、医薬組成物として使用することができる。かかる医薬組成物は、典型的には、輸血、点滴、注射などの方法により患部に直接投与するための、或いは経血管的に患部に投与するための医薬組成物である。かかる医薬組成物は、許容される薬学的手法に従って製造可能である。

以下、本発明の方法を実施例に基づいて具体的に説明する。

（実施例１）
（１）ブタ骨髄液の調製
体重約３０ｋｇの家畜ブタに筋肉注射にてケタラール、セラクタールを注入し、その後ネンブタールを静脈注射にて追加することにより麻酔を行った。１０ｍＬのシリンジに約２０ＩＵ／ｍＬになるように予めヘパリンを入れておき、腸骨より１５Ｇの穿刺針を用いて骨髄液を採取した。次に採取した骨髄プールにヘパリンを最終濃度で５０ＩＵ／ｍＬになるように添加して、十分に転倒混和を行った後、７０μｍセルストレーナーを通過させることにより血餅、骨粉などを取り除いた。

自動血液細胞数カウンター（Ｋ４５００、ｓｙｓｍｅｘ）で骨髄液の白血球濃度を測定した。フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｎｔｏ、ベクトンディッキンソン）で骨髄液の単核球／顆粒球画分比率を測定した。用いた骨髄液量、白血球濃度、及び単核球／顆粒球画分比率の積により、単核球／顆粒球全数を求めた。用いた式を以下に示す。
（単核球／顆粒球全数）＝（用いた骨髄液量）×（白血球濃度）×（単核球／顆粒球画分比率）÷１００

（２）顆粒球吸着カラム処理による顆粒球除去
酢酸セルロースからなる担体として、国際公開第２００６／０２５３７１号に記載の酢酸セルロースビーズを用いた。酢酸セルロースビーズを生理食塩液（最終濃度で５ＩＵ／ｍＬのヘパリンを含む）に懸濁した。酢酸セルロースビーズのアセチル基による置換率は４９％であり、粒子径は約５００μｍであった。沈降体積で３．５ｍＬの酢酸セルロースビーズをミニカラム（アクリル製、断面積０．７９ｃｍ^２、高さ４．５ｃｍ）に充填した。酢酸セルロースビーズ合計表面積は３１４ｃｍ^２であった。カラム入口側にポリ塩化ビニル製のチューブ（内径１ｍｍ、外径３ｍｍ、長さ８５ｃｍ）を装着し、またカラム出口側にも同様のポリ塩化製ビニル（長さ４０ｃｍ）を装着した。先に調製した骨髄液をテフロン（登録商標）製三角フラスコ内（内容量５０ｍＬ、サンワ）に入れ、３７℃恒温槽内に静置し、４ｍｉｎに一度、穏やかに攪拌した。次に線速０．１１ｃｍ／ｍｉｎ（骨髄液が酢酸セルロースビーズに接触する時間（以後、接触時間）４１分）で通液実験を開始した。カラム出口側から骨髄液が出始めたことを目視で確認した時点を開始時点として、８．２ｍＬ採取した。得られた採取液を回収液とした。

回収液量、回収液の白血球濃度、及び単核球／顆粒球画分比率の積により、単核球／顆粒球回収数を求め、先に求めた単核球／顆粒球全数より単核球回収率及び顆粒球除去率を求めた。単核球回収率は６８％であり、顆粒球除去率は９５％であった。用いた式を以下に示した。
（単核球／顆粒球回収数）＝（回収液量）×（白血球濃度）×（単核球／顆粒球画分比率）÷１００
（単核球回収率（％））＝（単核球回収数）÷（単核球全数）×１００
（顆粒球除去率（％））＝１００−（顆粒球回収数）÷（顆粒球全数）×１００

（実施例２）
線速を０．１７ｃｍ／ｍｉｎ（接触時間２７分）に変更した点、及び回収液を１０．４ｍＬ採取した点以外は、実施例１と同様の操作を行った。単核球回収率は７２％であり、顆粒球除去率は９４％であった。

（実施例３）
ミニカラムの酢酸セルロースビーズ量、酢酸セルロースビーズ合計表面積、及び断面積を、酢酸セルロースビーズ量６．９ｍＬ、酢酸セルロースビーズ合計表面積６１５ｃｍ^２、断面積１．５ｃｍ^２に変更した点、線速を０．１９ｃｍ／ｍｉｎ（接触時間２４分）に変更した点、及び回収液を４０．９ｍＬ採取した点以外は、実施例１と同様の操作を行った。単核球回収率は７５％であり、顆粒球除去率は９５％であった。

（比較例１）
線速を０．３３ｃｍ／ｍｉｎ（接触時間１３分）に変更した点以外は、実施例２と同様の操作を行った。単核球回収率は６０％であり、顆粒球除去率は４６％であった。

（比較例２）
ミニカラムの酢酸セルロースビーズ量、酢酸セルロースビーズ合計表面積、断面積、及び高さを、酢酸セルロースビーズ量３．７ｍＬ、酢酸セルロースビーズ合計表面積３２９ｃｍ^２、断面積０．１３ｃｍ^２、高さ２８．５ｃｍに変更した点、線速を１．３ｃｍ／ｍｉｎ（接触時間２２分）に変更した点、及び回収液を１２．０ｍＬ採取した点以外は、実施例１と同様の操作を行った。単核球回収率は８４％であり、顆粒球除去率は３５％であった。

（実施例４）
酢酸セルロースビーズとして、酢酸セルロースをジメチルスルホキシドとプロピレングリコールの混合溶剤に溶解し、この溶液を特開昭６３−１１７０３９号公報に記載された方法（振動法）により液滴化し、凝固させて得た酢酸セルロースビーズを用いた点、及び回収液を８．３ｍＬ採取した点以外は、実施例２と同様の操作を行った。回収液の単核球回収率、及び顆粒球の除去率を求めた。酢酸セルロースビーズのアセチル基による置換率は５４％であり、粒子径は約０．５ｍｍであった。単核球回収率は７６％であり、顆粒球除去率は９１％であった。

（実施例５）
酢酸セルロースビーズのアセチル基による置換率を４８％に変更した点以外は、実施例２と同様の操作を行った。単核球回収率は６９％であり、顆粒球除去率は９３％であった。

（実施例６）
酢酸セルロースビーズのアセチル基による置換率を４３％に変更した点以外は、実施例２と同様の操作を行った。単核球回収率は７２％であり、顆粒球除去率は９０％であった。

（比較例３）
酢酸セルロースビーズのアセチル基による置換率を２２％に変更した点以外は、実施例２と同様の操作を行った。単核球回収率は７３％であり、顆粒球除去率は８６％であった。

（比較例４）
酢酸セルロースビーズとして、購入した酢酸セルロースビーズ（ａｄａｃｏｌｕｍｎ、ＪＩＭＲＯ）を用いた点以外は実施例２と同様の操作を行った。酢酸セルロースビーズのアセチル基による置換率は５５％であり、粒子径は２０００μｍであった。酢酸セルロースビーズ合計表面積は７８ｃｍ^２であった。単核球回収率は８１％であり、顆粒球除去率は５２％であった。

（実施例７）
ミニカラムの酢酸セルロースビーズ量、酢酸セルロースビーズ合計表面積、及び高さを、酢酸セルロースビーズ量１．８ｍＬ、酢酸セルロースビーズ合計表面積１５７ｃｍ^２、高さ２．３ｃｍに変更した点以外は、実施例２と同様の操作を行った。単核球回収率は６９％であり、顆粒球除去率は９０％であった。

（実施例８）
ミニカラムの酢酸セルロースビーズ量、酢酸セルロースビーズ合計表面積、及び高さを、酢酸セルロースビーズ量７．１ｍＬ、酢酸セルロースビーズ合計表面積６２７ｃｍ^２、高さ９．０ｃｍに変更した点以外は、実施例２と同様の操作を行った。単核球回収率は６２％であり、顆粒球除去率は９５％であった。

（参考例１）
（１）ブタ骨髄液の調製
実施例１と同様の方法で調製した骨髄液を用いた。

（２）Ｆｉｃｏｌｌ法による単核球画分の回収
先に調製した骨髄液を２ｍＬ用いて、生理食塩液２ｍＬと混合して希釈した。次に、容量１５ｍＬの遠沈管（ＩＷＡＫＩ）に、ＦｉｃｏｌｌＰａｑｕｅ−Ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケア）溶液を３ｍＬ添加し、該Ｆｉｃｏｌｌ溶液の上層に、上述の希釈した骨髄液を重層した。遠心分離機ＣＦ７Ｄ２（日立製作所）にて、回転数１４００ｒｐｍで３０分間遠心分離することにより、得られた単核球画分層を回収した。Ｆｉｃｏｌｌ溶液を除去する目的で、回収した単核球画分層に生理食塩液を１０ｍＬ添加し、遠心分離機ＣＦ７Ｄ２にて、回転数１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を除いた。再度生理食塩液を１０ｍＬ添加して、回転数１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。再び上清を除き、生理食塩水を、液量が１ｍＬになるように加えた。

実施例１と同様の方法で回収液の単核球回収率、及び顆粒球の除去率を求めた。単核球回収率は３９％、顆粒球除去率は９７％であった。

（実施例９）
体液をヒト末梢血に変更した点以外は、実施例２と同様の操作を行った。ヒト末梢血は、健常人ボランティアより１８Ｇの注射針を用い上腕部より注意深く採血し、抗凝固剤としてヘパリンを使用し、血液中のヘパリン濃度は５ＩＵ／ｍＬとすることにより調製した。単核球回収率は７３％であり、顆粒球除去率は９２％であった。

（実施例１０）
体液をウシ末梢血に変更した点以外は、実施例２と同様の操作を行った。ウシ末梢血はジャパン・ラム株式会社より購入し、抗凝固剤としてＣＰＤ液（テルモ）を使用し、血液１００ｍＬに対するＣＰＤ液量は２８ｍＬとした。単核球回収率は９０％であり、顆粒球除去率は９２％であった。

実施例１〜１０、比較例１〜４、及び参考例１の、酢酸セルロースビーズのアセチル基置換率、合計表面積、処理条件（処理検体、及び線速）、単核球回収率、及び顆粒球除去率を表１にまとめた。

Claims

（ａ）流入部と流出部を備え、アセチル基によって置換されている水酸基の割合が全水酸基の２３〜５４％である酢酸セルロースからなる球状又は粒状の担体を合計表面積が１５７〜６２７ｃｍ^２となるように収容した容器の前記流入部から、体液を０．１１ｃｍ／ｍｉｎ以上０．１９ｃｍ／ｍｉｎ以下の線速で送液する工程、及び
（ｂ）前記流出部から顆粒球濃度が低下した体液を回収する工程
を含む、体液から顆粒球を除去する方法（ただし、体外循環回路に用いる方法を除く）。
工程（ｂ）で回収される体液中の顆粒球濃度が、工程（ａ）で送液される体液中の顆粒球濃度の１０％以下である、請求項１に記載の方法。
工程（ａ）で送液される体液が骨髄液、末梢血、又は臍帯血である、請求項１又は２に記載の方法。
工程（ｂ）で回収される体液における単核球、幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、及びそれらの混合物からなる群から選択される有核細胞の濃度が、工程（ａ）で送液される体液における有核細胞の濃度よりも高い、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。