JP6788278B2 - ホウ素含有化合物とタンパク質とのコンジュゲートを含む医薬組成物 - Google Patents
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Description
1)タンパク質中に存在するリジン残基の数は、フリーのシステイン残基の数に比べ、非常に多いことから、タンパク質1分子に対して、非常に多くのマレイミド分子を結合させ得ること、
2)トランスフェリンのようなフリーのシステイン残基を持たないタンパク質にも、マレイミドを介してホウ素クラスターを結合させ得ること、
3)マレイミドの代わりに、イソチオシアネート基などのリジン結合基を利用して、タンパク質にホウ素クラスターを結合させ得ること、
本発明は、以上の知見に基づき完成されたものである。
(1)式(I):X−L−Y〔式中、Xは10Bを含有する基を表し、Lはリンカーを表し、Yはリジン残基と結合する基を表す。〕で表される化合物と、リジン残基を有する腫瘍集積性タンパク質とのコンジュゲートを含む医薬組成物であって、組成物中に含まれる前記化合物と前記タンパク質のモル比(前記化合物のモル数/前記タンパク質のモル数)が10を超えるモル比であることを特徴とする医薬組成物。
本発明の医薬組成物は、式(I):X−L−Y〔式中、Xは10Bを含有する基を表し、Lはリンカーを表し、Yはリジン残基と結合する基を表す。〕で表される化合物と、リジン残基を有する腫瘍集積性タンパク質とのコンジュゲートを含有することを特徴とするものである。
(1)化合物3の合成
1H NMR (400 MHz; CD3Cl): δ 3.72 (m, 6H), 3.30 (m, 18H), 1.53 (m, 16H), 0.99 (m, 24H)
1H NMR (400 MHz; CD3Cl): δ 4.59 (m, 4H), 3.94 (m, 4H), 3.20 (m, 8H), 1.63 (m, 8H), 1.25 (m, 8H), 1.00 (t, J= 14.8 Hz, 12H)
MP. 135-136 oC; IR (KBr, cm-1): 3027, 2480, 1708, 1638, 1487, 949, 829; 1H NMR (400 MHz; D2O): δ 7.09 (s, 1H), 6.65 (s, 2H), 3.44 (t, J= 5.2 Hz, 2H), 3.41-3.38 (m, 6H), 3.17 (m, 2H), 3.02 (s, 12H), 2.08 (t, J= 7.2 Hz, 2H), 1.71 (m, 2H); 13C NMR (75 MHz; CD3CN): δ 173.61, 171.57, 134.50, 72.23, 70.51, 67.49, 58.59, 39.37, 37.19, 33.09, 24.54, 23.60, 19.59, 13.10; 11B NMR (96.3 MHz; D2O): δ 1.56, -21.09, -22.45, -27.236; HRMS (ESI, negative) m/z calcd. for C12H28B12N2O5Na1 [M + Na]-: 433.3093, found: 433.3098.
1H NMR (400 MHz; D2O): δ 6.70 (s, 2H), 3.51-3.38 (m, 8H), 3.20 (m, 2H), 2.16 (t, J= 7.2 Hz, 2H), 1.76 (m, 2H); 13C NMR (75 MHz; CD3CN): δ 176.26, 173.86, 134.99, 71.50, 69.16, 68.20, 39.78, 33.46, 24.33; 11B NMR (96.3 MHz; D2O): δ 1.71, -21.15, -23.00, -27.96; HRMS (ESI, negative) m/z calcd. for C12H28B12N2O5Na1 [M + Na]-: 433.3093, found: 433.3095.
MIDとBSAをモル比が10:1になるようにPBS(pH 7.4)中で混合し、23℃で、12時間反応させ、MID-BSAコンジュゲートを生成させた。このMID-BSAコンジュゲートを、CT26(マウス大腸癌細胞株)を接種したBALB/cマウスの尾静脈に注入した。MID-BSAコンジュゲートの注入量は、3〜30mg B/kgとなるようにした。注入後の血液、腫瘍組織、肝臓、腎臓、及び脾臓のホウ素濃度を、ICP-AESを用いて測定した。
アルブミンの-SHを前もってIAA(2-iodoacetamide)、及びN-ethymaleimideによりブロックしておいてからMIDを加えることにより-SH以外のアルブミンの結合部位の同定を試みた。BSA溶液(100μM)にIAA及びN-ethymaleimide(10mM)を加えて1h撹拌した後、MID(1mM)を加えて反応を進行させ、SDS-PAGE、Western Blottingを行った。図3に示すように、SDS-PAGEの結果によりタンパク量が揃っていることが確認され、Western Blottingの結果より-SHをブロックする試薬を加えたレーン(lane 3及びlane 4)においてもアルブミンとMIDとの結合が観察された。
(1)NCS-ドデカボレート テトラブチルアンモニウム(TBA)塩(化合物9)の合成
1H NMR (400 MHz; CD3CN): δ 3.71-3.65(m, 4H), 3.58-3.54(m, 4H), 3.10-3.06(m, 16H), 1.64-1.58(m, 16H), 1.40-1.36(m, 16H), 0.98-0.95(m, 24H)
MS ESI, negative, m/z calcd. for C5H19B12NO2S [M /2]2-:143.5 , found: 144.0.
1H NMR (400 MHz; CD3CN): δ 3.71-3.69(m, 2H), 3.66-3.64(m, 2H), 3.54(m, 4H), 3.10(s, 24H);
13C NMR ( CD3CN): δ 72.56, 68.53, 67.78, 55.35, 45.42
MS ESI, negative, m/z calcd. for C5H19B12NO2S [M /2]2-:143.5 , found: 143.6.
化合物10(522mg, 1.20mmol)にNa+-Amberlite(20mL)と蒸留水(50mL)を加えて一晩中撹拌を行った。キリヤマ濾過を行うことでAmberliteを取り除き、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去した後に凍結乾燥することで化合物11(329mg, 83%)を得た。
1H NMR (400 MHz; D2O): δ 3.79(m,4H), 3.70(m, 4H)
13C NMR ( D2O): δ 71.14, 68.67, 67.66, 45.00
MS ESI, negative, m/z calcd. for C5H19B12NO2S [M /2]2-:143.5 , found: 143.6.
ヒト血清トランスフェリン(Tf)に対してNCS-ドデカボレート ナトリウム塩(化合物11)を反応させた後にSDS-PAGE及びWestern Blottingにより結合評価を行った。結果を図6に示す。ここでは反応溶液のpHを変えることにより結合評価を行った。pH=10においてTfとの結合能が最も大きいことが観察された(lane 5)。また、末端にアミノ基を有するホウ素クラスター化合物との結合は観察されなかった(lane 6)。
MID-TfコンジュゲートをWestern Blottingにより分析した。PBS緩衝液(pH 7.4)中で、12時間、Tf(0.1mM)をMID(1mM)と反応させた。比較のため、Na2B12H11SH (BSH)及び Na2B12H12もTfと反応させ、同様に分析した(図9)。
BSAとMIDの結合性とpHとの関係をSDS-PAGEとWestern Blottingにより調べた。様々なpH条件(pH 5-10)下で、BSA(0.1mM)をMID(1mM)で処理し、処理後の混合物を電気泳動し、Western Blottingを行った(図10)。Western Blottingは、抗BSH抗体を用いて行った。
マウス大腸癌細胞(colon 26細胞)へのホウ素試薬(MID又はMID-BSAコンジュゲート)の取込み量を調べた。
マウスの血液をPBS(lane 1)又はMIDを含むPBS(lane 2)中で1時間インキュベートした。処理後の血液を、抗BSH抗体を用いたWestern Blottingによって分析した(図12)。
BSAへのMIDの結合を、PBS中、12時間、37℃で実施した。腫瘍を有するマウスに、尾静脈からMID-BSAのPBS溶液を注入し、京都大学研究用原子炉(KUR)で、投与後12時間に、熱中性子を照射した。照射後、時間間隔をおいて腫瘍量を測定した。この結果を図13に示す。図中の○はMID-BSAを注入せず、熱中性子を照射した場合を示す。図中の△、●、及び■は、それぞれ7.5、15、及び30mg[10B]/kgのMID-BSAを注入し、熱中性子を照射した場合を示す。
上記実施例においてSDS-PAGE及びWestern Blottingは、以下のように行った。
(1)SDS-PAGE
Tf溶液(50μL, 100μM)に対して化合物11(0.5μL, 100mM)を加えた後、1時間ボルテックスによる撹拌を行った。反応溶液を低分子除去カラム(Micro Bio-Spin(登録商標) 6 Chromatography Columns)に通した後、DTTを含む5×sample buffer(12.5μL)を加え、95℃で5分間加熱した。得られたサンプルを30倍希釈したものを用いてSDS-PAGE(10%アクリルアミドゲル, 200V, 50min)を行い、CBB染色することでタンパク質のバンドを可視化した。
SDS-PAGEにより得られたアクリルアミドゲルをメンブレンフィルターへと転写(300mA, 45min)した後、メンブレンにイムノブロックを加えシェーカーにより1時間振とうさせた。TTBSバッファーによる10分間の洗浄を3回行った後、抗BSH抗体を用いた1次抗体結合反応を4℃環境下、一晩中撹拌を行った。TTBSバッファーによる10分間の洗浄を3回行った後、HRPを有する2次抗体結合反応を4℃環境下、3時間撹拌を行った。TTBSバッファーによる10分間の洗浄を3回行った後、化学発光検出試薬を加え、イメージャーによる検出測定を行った。
Claims (6)
- 式(I):X−L−Y〔式中、Xは10Bを含有する基を表し、Lはアルキレン基(但し、アルキレン基の1以上の-CH 2 -は、-O-、-S-、-NH-、又は-CO-で置換されていてもよい。)を表し、Yはマレイミジル基を表す。〕で表される化合物と、リジン残基を有する腫瘍集積性タンパク質とのコンジュゲートを含む医薬組成物であって、組成物中に含まれる前記化合物と前記タンパク質のモル比(前記化合物のモル数/前記タンパク質のモル数)が10を超えるモル比であることを特徴とする医薬組成物。
- リジン残基を有する腫瘍集積性タンパク質が、トランスフェリンであることを特徴とする請求項1に記載の医薬組成物。
- リジン残基を有する腫瘍集積性タンパク質が、アルブミンであることを特徴とする請求項1に記載の医薬組成物。
- 式(I)におけるXが、ホウ素クラスター中の一つの水素原子を除去することによって誘導される基であることを特徴とする請求項1乃至3のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 式(I)におけるXが、クロソドデカボレート、クロソカルボラン、又はニドカルボラン中の一つの水素原子を除去することによって誘導される基であることを特徴とする請求項1乃至3のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- ホウ素中性子捕捉療法に用いられることを特徴とする請求項1乃至5のいずれか一項に記載の医薬組成物。
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