JP6784603B2 - 分光測定方法および分光測定装置 - Google Patents

Description

本発明は、分光測定方法および分光測定装置、特にラマン分光測定方法およびラマン分光装置に関する。

従来、レーザー光が物質に照射されると発生するラマン散乱光を利用して、物質の構成を特定するラマン分光測定装置が知られている。ラマン散乱光は、レーザー光の照射点の物質の分子構造に応じてそれぞれ固有のスペクトルで発生する。このため、ラマン分光測定装置は、ラマン散乱光を発生させるレーザー光等の光源、ラマン分光器（検出器）に加えてレーザー光の照射点等を確認するためのカメラと撮影用照明光源を備えたものがある。例えば特許文献１の如くである。

特許文献１に記載の顕微ラマン分光装置は、カメラのレンズの光軸上にレーザー光用のハーフミラー（半透明鏡）と撮影用照明光源用のハーフミラーとが配置されている。つまり、ハーフミラーにより反射されたレーザー光の一部と別のハーフミラーにより反射された撮影用照明光の一部をカメラとレンズを結ぶ光軸上に一致させている。これにより、特許文献１に記載の顕微ラマン分光装置は、レーザー光の照射点の撮影をより正確に行うことができる。

特許文献１に記載の技術は、試料の任意の位置に照射されたレーザー光の照射点を撮影するとともに分光測定によりその照射点における試料の構造体を特定するものである。このため、照射点に異物等が付着していた場合、あるいは、分光測定に基づく構造体識別の正答率が１００％でない限り、顕微ラマン分光装置では、照射点の構造体と異なる構造体を示す分光測定結果が得られる可能性がある。しかし、顕微ラマン分光装置は、単独の照射点の分光測定結果に基づく構造体の判定が正しいか否かを判断することができない。また、顕微ラマン分光装置は、走査型の分光測定によって二次元の面状に配置した複数の照射点における分光測定結果から構造体を特定することが可能である。しかし、走査型の顕微ラマン分光装置は、単独の照射点の場合と同様に分光測定結果に基づく判定が正しいか否かを判断することができない。さらに、走査型の顕微ラマン分光装置では、測定が長時間になることに加えて、照射点以外の部分の構造体を周囲の分光測定結果から推測するしかなく、試料において同一の構造体から構成されている領域を正確に特定できない。

特開２００６−２１４８９９号

本発明の目的は、所定の領域を構成する構造体の特定を短時間で精度よく正確に行うことができる分光測定方法および分光測定装置の提供を目的とする。

本発明の解決しようとする課題は以上の如くであり、次にこの課題を解決するための手段を説明する。

即ち、試料に撮影用照明光と分光用照明光とを照射し、撮影用カメラによって前記試料の形態と前記分光用照明光の照射点の画像を取得しつつ、前記分光用照明光によって励起される光を分光測定する分光測定方法であって、前記試料に前記撮影用照明光を照射し、前記分光用照明光を複数の箇所に照射する照射工程と、前記試料の形態の画像と前記分光用照明光の複数の照射点の画像とを取得する画像取得工程と、前記分光用照明光によって複数の照射点から励起される光をそれぞれ分光測定する分光測定工程と、取得した前記試料の形態の画像において、画像情報から同一の構造体で構成される画像領域を抽出し、抽出した各画像領域を閉領域として分割する画像処理工程と、前記分光用照明光の複数の照射点毎の分光測定結果を前記各画像領域に分割された前記試料の形態の画像における前記分光用照明光の複数の照射点に重ね合わせ、前記各画像領域内における前記分光用照明光の複数の照射点の分光測定結果に基づいて前記各画像領域の構造体を特定する領域判定工程と、から構成される。

分光測定方法は、前記領域判定工程において、一つの前記画像領域内における前記分光用照明光の複数の照射点に対する同一の構造体を示す分光測定結果を有する分光用照明光の照射点の数の割合が所定値以上の場合、その前記画像領域の構造体をその分光測定結果の構造体として特定するものである。

分光測定方法は、前記照射工程において、前記分光用照明光が照明光分割手段によって複数の分光用照明光に分割されて前記試料に同時に照射され、前記画像取得工程と前記分光測定工程とが同時に実施されるものである。

分光測定方法は、前記画像処理工程において、前記画像情報が、色相、明度、彩度、輝度のうち少なくとも一つの情報から構成されているものである。

前記分光測定方法を実施する分光測定装置であって、所定波長の分光用照明光源と、分光器と、撮影用カメラと、撮影用照明光源と、ピンホールが形成されている全反射ミラーと、前記所定波長の分光用照明光とそれよりも短い波長の光のみを透過させるダイクロイックミラーと、を備え、前記全反射ミラーと前記ダイクロイックミラーとが前記分光用照明光の光軸上に配置されており、前記分光用照明光源からの分光用照明光が、前記全反射ミラーのピンホールを通過して前記試料に照射され、前記試料に照射された分光用照明光によって励起される光が前記ダイクロイックミラーに反射されて前記分光器に入射され、前記撮影用照明光源からの撮影用照明光が、前記全反射ミラーに反射されて前記分光用照明光の光軸に前記撮影用照明光の光軸を一致させた状態で前記試料に照射され、前記試料から反射した撮影用照明光が、その光軸を前記分光用照明光の光軸に一致させた状態で前記全反射ミラーに反射されて前記撮影用カメラに入射されるものである。

本発明は、以下に示すような効果を奏する。

分光測定方法においては、一つの構造体から構成される範囲として設定される画像領域内における複数箇所の分光測定結果を画像領域に適用することで、画像領域内の分光用照明光が照射されていない部分を含む画像領域全体の構造体が特定される。これにより所定の領域を構成する構造体の特定を短時間で精度よく行うことができる。また、測定密度を高くして画像領域内を測定する場合よりも測定時間を短くすることができる。

分光測定方法においては、画像領域内の各分光測定結果の全体から一つの結果を導きだして判定するので、測定結果に誤判定が含まれていても画像領域全体の構造が正確に特定される。これにより、所定の領域を構成する構造体の特定を正確に行うことができる。

分光測定方法においては、一度に画像領域内の複数の箇所に分光用照明光が照射される。これにより、所定の領域を構成する構造体の特定を精度よく行うことができる。また、測定密度を高くして画像領域内を測定する場合よりも測定時間を短くすることができる。

分光測定方法においては、試料の形態の画像がその形態に応じて適切に画像領域に分割される。これにより、所定の領域を構成する構造体の特定を精度よく行うことができる。

分光測定装置においては、複数の分光用照明光が光学系の影響を受けることなく出力を維持した状態で一度に照射され、分光測定結果を画像領域に適用することで画像領域内の分光用照明光が照射されていない部分を含む画像領域全体の構造体が特定される。これにより、所定の領域を構成する構造体の特定を精度よく正確に行うことができる。また、測定密度を高くして画像領域内を測定する場合よりも測定時間を短くすることができる。

ラマン分光測定装置の一実施形態における全体構成を示す概略図。 ラマン分光測定装置の一実施形態における制御構成を示すブロック図。 ラマン分光測定法の一実施形態における工程を示すフローチャートを表す図。 ラマン分光測定装置の一実施形態におけるレーザー光の照射態様を示す概略図。 ラマン分光測定装置の一実施形態における撮影用照明光の照射態様とその反射光の集光の態様とを示す概略図。 ラマン分光測定装置の一実施形態におけるラマン散乱光の分光器への集光の態様を示す概略図。 （ａ）ラマン分光測定装置の一実施形態における撮影用カメラによる試料の形態の画像とレーザー光の複数の照射点の画像とを示す図、（ｂ）図７（ａ）における照射点の２次元配列がマルチ光ファイバで１次元配列に再構成された状態の画像を示す図。 （ａ）ラマン分光測定装置の一実施形態における撮影用カメラによる画像において画像情報から同一の構造体からなる画像領域を抽出した画像を示す図、（ｂ）図８（ａ）における画像領域を独立した閉領域として分割した画像を示す図。 図８（ｂ）における照射点に分光測定結果を重ね合わせた画像を示す図、（ｂ）図９（ａ）の第１画像領域における照射点のラマンスペクトルを表すグラフを示す図。

初めに、図１と図２とを用いて、分光測定方法を実施する分光測定装置であるラマン分光測定装置の一実施形態であるラマン分光測定装置１について説明する。なお、本実施形態において、分光測定装置としてラマン分光測定装置１について具体的に説明するがこれに限定するものではなく、蛍光分光測定装置等の様々な分光用照明光を用いる分光測定装置においても同様である。

図１に示すように、ラマン分光測定装置１は、試料Ｓに分光用照明光としてレーザー光Ｌ１を照射することで試料Ｓから発生するラマン散乱光Ｌ２を検出するものである。ラマン分光測定装置１は、レーザー光源２、レーザー光用第１レンズ３、レーザー光用第２レンズ５、全反射ミラー６、ダイクロイックミラー７、結像レンズ８、ラマン用結像レンズ９、ラマン分光器１０、ハーフミラー１１、撮影用結像レンズ１２、撮影用カメラ１３、撮影用照明光源１４および制御装置１５を具備している。

レーザー光源２は、ラマン散乱光Ｌ２を発生させるための分光用照明光であるレーザー光Ｌ１を発振するものである。レーザー光源２は、所定波長のレーザー光Ｌ１を発振する。本実施形態において、レーザー光源２は、短波長（４００ｎｍから６００ｎｍ）レーザー光Ｌ１を発振するものとする。なお、本実施形態においてレーザー光源２の媒質は、短波長のレーザー光Ｌ１を発振するものであればよい。

レーザー光用第１レンズ３は、入射された光を平行光にするレンズである。レーザー光用第１レンズ３は、レーザー光源２からのレーザー光Ｌ１が入射されるように、レーザー光Ｌ１の光軸上にレーザー光源２と隣り合うように配置されている。

照明光分割手段であるマイクロレンズアレイ４は、入射されたレーザー光Ｌ１を複数のレーザー光Ｌ１に分割するものである。マイクロレンズアレイ４は、マイクロレンズが格子状に形成されている。マイクロレンズアレイ４は、レーザー光用第１レンズ３からのレーザー光Ｌ１が入射されるように、レーザー光Ｌ１の光軸上にレーザー光用第１レンズ３と隣り合うように配置されている。マイクロレンズアレイ４は、入射されるレーザー光Ｌ１を複数の光路に分割してマイクロレンズアレイ４から出射するように構成されている。なお、本実施形態において、照明光分割手段がマイクロレンズアレイ４から構成されているがこれに限定するものではなく、回折光学素子やマルチ光ファイバなどの光路分割光学系であればよい。

レーザー光用第２レンズ５は、入射されたレーザー光Ｌ１を集束させるレンズである。レーザー光用第２レンズ５は、マイクロレンズアレイ４からのレーザー光Ｌ１が入射されるように、レーザー光Ｌ１の光軸上にマイクロレンズアレイ４と隣り合うように配置されている。レーザー光用第２レンズ５は、入射される複数の光路に分割されたレーザー光Ｌ１が所定の集束位置Ｐを通過するようにレーザー光用第２レンズ５から出射するように構成されている。

全反射ミラー６は、中央にピンホール６ａが形成されている。全反射ミラー６は、レーザー光用第２レンズ５からのレーザー光Ｌ１が入射されるように、レーザー光Ｌ１の光軸上にレーザー光用第２レンズ５と隣り合うように配置されている。また、全反射ミラー６は、レーザー光用第２レンズ５を透過した複数の光路に分割されたレーザー光Ｌ１の集束位置Ｐとピンホール６ａの位置とが一致するように配置されている。つまり、全反射ミラー６は、複数の光路に分割されたレーザー光Ｌ１が全反射ミラー６のピンホール６ａの位置で集束して全反射ミラー６と干渉することなくピンホール６ａを通過するように構成されている。

本実施形態において、全反射ミラー６は、レーザー光Ｌ１の光軸に対して４５度の傾斜角度になるように配置されている。全反射ミラー６は、レーザー光Ｌ１の光軸に対して９０度の方向から全反射ミラー６に向かって出射された光線をレーザー光Ｌ１の光軸と一致するように全反射ミラー６のピンホール６ａ以外の部分で反射させるように構成されている。一方、全反射ミラー６は、レーザー光Ｌ１の光軸方向から全反射ミラー６に向かって出射された光線をレーザー光Ｌ１の光軸に対して９０度の方向に全反射ミラー６のピンホール６ａ以外の部分で反射するように構成されている。なお、本実施形態において、全反射ミラー６、ダイクロイックミラー７およびハーフミラー１１の配置角度は、それぞれ４５度に限定されるものでは無く、機器構成上の適する配置にすればよい。

波長選択ハーフミラーであるダイクロイックミラー７は、所定の波長の光のみを選択的に透過させるものである。本実施形態において、ダイクロイックミラー７は、レーザー光Ｌ１の波長とそれよりも短い波長の光のみを選択的に透過するように構成されている。ダイクロイックミラー７は、全反射ミラー６のピンホール６ａを通過したレーザー光Ｌ１が入射するように、レーザー光Ｌ１の光軸上に全反射ミラー６と隣り合うように配置されている。また、ダイクロイックミラー７は、レーザー光Ｌ１の光軸に対して４５度の傾斜角度になるように配置されている。つまり、ダイクロイックミラー７は、長波長であるラマン散乱光Ｌ２をレーザー光Ｌ１の光軸に対して９０度の方向に反射するように構成されている。

結像レンズ８は、レーザー光Ｌ１を集光するレンズである。結像レンズ８は、ダイクロイックミラー７からのレーザー光Ｌ１が入射するように、レーザー光Ｌ１の光軸上にダイクロイックミラー７と隣り合うように配置されている。また、結像レンズ８は、試料Ｓに照射されるレーザー光Ｌ１の照射点から発生するラマン散乱光Ｌ２が結像レンズ８の試料Ｓ側から入射される。

ラマン用結像レンズ９は、ラマン散乱光Ｌ２を集光してラマン分光器１０に入射させるレンズである。ラマン用結像レンズ９は、ダイクロイックミラー７からの光が入射するように、レーザー光Ｌ１の光軸に対して９０度の位置にダイクロイックミラー７と隣り合うようにして配置されている。つまり、ラマン用結像レンズ９は、ダイクロイックミラー７によってレーザー光Ｌ１の光軸に対して９０度の方向に反射されたラマン散乱光Ｌ２が入射するように配置されている。

ラマン分光器１０は、ラマン散乱光Ｌ２からラマンスペクトルを検出するものである。ラマン分光器１０は、例えばマルチ光ファイバ、回折格子、エリアセンサとレンズ、ミラー等から構成されている。ラマン分光器１０は、ラマン用結像レンズ９からのラマン散乱光Ｌ２が入射するように、レーザー光Ｌ１の光軸に対して９０度の位置にラマン用結像レンズ９と隣り合うように配置されている。さらに本実施形態において、不要な短波長光をカットするために、ダイクロイックミラー７とラマン分光器１０の間にロングパスフィルタ１０ａを入れる構成をとることが好ましい。

ハーフミラー１１は、光の一部を透過させて一部を反射させるものである。ハーフミラー１１は、全反射ミラー６で反射される光が入射するように、レーザー光Ｌ１の光軸に対して９０度の位置に全反射ミラー６と隣り合うように配置されている。また、ハーフミラー１１は、レーザー光Ｌ１の光軸に対して４５度の傾斜角度になるように配置されている。つまり、ハーフミラー１１は、レーザー光Ｌ１の光軸に対して平行な方向に光を反射させる。

撮影用結像レンズ１２は、撮影用カメラ１３に集光するレンズである。撮影用結像レンズ１２は、ハーフミラー１１によって反射された光が入射するように、レーザー光Ｌ１の光軸に対して平行な位置にハーフミラー１１と隣り合うように配置されている。撮影用結像レンズ１２は、撮影用カメラ１３に集光するように構成されている。

撮影用カメラ１３は、試料Ｓの形態の画像とレーザー光Ｌ１の照射点の画像とを撮影するものである。撮影用カメラ１３は、ＣＭＯＳカメラ等から構成されている。撮影用カメラ１３は、撮影用結像レンズ１２からの光が入射するように、レーザー光Ｌ１の光軸に対して平行な位置に撮影用結像レンズ１２と隣り合うように配置されている。撮影用カメラ１３によって、レーザー光Ｌ１の照射点および試料Ｓの表面状態を視認することができる。

撮影用照明光源１４は、撮影用照明光Ｌ３を発生させるものである。撮影用照明光源１４は、全反射ミラー６に撮影用照明光Ｌ３を照射するように、レーザー光Ｌ１の光軸に対して９０度の位置にハーフミラー１１と隣り合うように配置されている。撮影用照明光源１４は、撮影用照明光用レンズ１４ａ、ハーフミラー１１を介して全反射ミラー６に向かって撮影用照明光Ｌ３を出射するように構成されている。

図２に示すように、制御装置１５は、ラマン分光測定装置１を制御するものである。制御装置１５は、実体的には、ＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭ、ＨＤＤ等がバスで接続される構成であってもよく、あるいはワンチップのＬＳＩ等からなる構成であってもよい。制御装置１５は、ラマン分光測定装置１を制御するために種々のプログラムやデータが格納されている。

制御装置１５は、レーザー光源２と撮影用照明光源１４とに接続され、レーザー光源２と撮影用照明光源１４とを制御することができる。

制御装置１５は、ラマン分光器１０に接続され、ラマン分光器１０を制御することができる。また、制御装置１５は、ラマン分光器１０から分光測定結果を取得することができる。

制御装置１５は、撮影用カメラ１３に接続され、撮影用カメラ１３を制御することができる。また、制御装置１５は、撮影用カメラ１３から撮影した画像を取得することができる。

このように構成されるラマン分光測定装置１は、レーザー光源２から照射されるレーザー光Ｌ１がマイクロレンズアレイ４によって複数の光路に分割された状態で一度に試料Ｓの複数の箇所にレーザー光Ｌ１が照射される。合わせて、ラマン分光測定装置１は、撮影用照明光源１４からの撮影用照明光Ｌ３が全反射ミラー６を介して試料Ｓに照射される。レーザー光Ｌ１の照射により試料Ｓから発生したラマン散乱光Ｌ２は、ダイクロイックミラー７によってラマン分光器１０に入射される。ラマン分光測定装置１は、ラマン分光器１０によってラマン散乱光Ｌ２を分光測定する。一方、撮影用照明光源１４から試料Ｓに照射された撮影用照明光Ｌ３は、試料Ｓに到達すると試料Ｓからの反射した光（以下、単に「反射光Ｌ４」と記す）になる。試料Ｓからの反射光Ｌ４は、全反射ミラー６およびハーフミラー１１によって反射されて撮影用カメラ１３に入射される。ラマン分光測定装置１は、撮影用カメラ１３によって、反射光Ｌ４から試料Ｓの形態の画像とレーザー光Ｌ１の複数の照射点の画像とを得る。ラマン分光測定装置１は、制御装置１５によって、分光測定結果と試料Ｓの形態の画像とレーザー光Ｌ１の複数の照射点の画像とから試料Ｓの構造体を特定する。

次に、図３から図９を用いて、ラマン分光測定装置１における分光測定方法について説明する。

図３に示すように、分光測定方法は、工程Ｋ１１０として、試料Ｓに撮影用照明光Ｌ３を照射し、分光用照明光であるレーザー光Ｌ１を複数の箇所に照射する照射工程と、工程Ｋ１２０として、試料Ｓの形態の画像とレーザー光Ｌ１の複数の照射点の画像とからなる画像Ｖを取得する画像取得工程と、工程Ｋ１３０として、レーザー光Ｌ１によって複数の照射点から励起されるラマン光をそれぞれ分光測定する分光測定工程と、工程Ｋ１４０として、取得した画像Ｖの試料Ｓの形態の画像において、画像情報である色相、明度、彩度、輝度から同一の構造体の画像を構成している画素の集合体を画像領域として抽出し、抽出した各画像領域を閉領域として分割する画像処理工程と、工程Ｋ１５０として、レーザー光Ｌ１の複数の照射点毎の分光測定結果を画像Ｖにおけるレーザー光Ｌ１の複数の照射点の画像に重ね合わせ、分光測定結果に基づいて各画像領域の構造体を特定する領域判定工程と、から構成されている。分光測定方法は、工程Ｋ１１０から順に工程Ｋ１５０まで実施される。

図４に示すように、工程Ｋ１１０（図３参照）において、ラマン分光測定装置１は、レーザー光Ｌ１の照射工程として、レーザー光源２で発振されたレーザー光Ｌ１（薄墨部分参照）がレーザー光用第１レンズ３に入射される。レーザー光Ｌ１は、無限遠にある点光源からの平行光としてレーザー光用第１レンズ３から出射される。レーザー光用第１レンズ３から出射されたレーザー光Ｌ１は、マイクロレンズアレイ４に入射される。レーザー光Ｌ１は、複数の光路に分割されてマイクロレンズアレイ４から出射される。マイクロレンズアレイ４から出射された複数の光路に分割されたレーザー光Ｌ１は、レーザー光用第２レンズ５に入射される。

複数の光路からなるレーザー光Ｌ１は、全反射ミラー６のピンホール６ａの位置で集束するようにレーザー光用第２レンズ５から出射される。レーザー光用第２レンズ５から出射されたレーザー光Ｌ１は、全反射ミラー６と干渉することなくピンホール６ａを通過する。全反射ミラー６を通過したレーザー光Ｌ１は、ダイクロイックミラー７に入射される。短波長光であるレーザー光Ｌ１は、長波長光を反射するダイクロイックミラー７に反射されることなく透過する。ダイクロイックミラー７を透過したレーザー光Ｌ１は、結像レンズ８に入射される。レーザー光Ｌ１は、光路毎に試料Ｓの表面に集光するように結像レンズ８から出射される。レーザー光Ｌ１は、試料Ｓの複数の箇所に照射される。これにより、レーザー光Ｌ１は、試料Ｓの照射箇所からその分子構造に応じたスペクトルを有するラマン散乱光Ｌ２（図６参照）を発生させる。

このように、ラマン分光測定装置１は、レーザー光Ｌ１が複数の光路に分割されてもレーザー光用第２レンズ５によって集束されて全反射ミラー６のピンホール６ａを干渉することなく通過するように構成されている。また、ラマン分光測定装置１は、ラマン散乱光Ｌ２を反射するダイクロイックミラー７によってレーザー光Ｌ１の一部が反射されないように構成されている。つまり、ラマン分光測定装置１においては、レーザー光Ｌ１の光軸上に配置された全反射ミラー６とダイクロイックミラー７とによってレーザー光Ｌ１が遮蔽されない。これにより、光源からのレーザー光Ｌ１が試料Ｓに至るまでの間に生じる損失を抑制することができる。

図５に示すように、工程Ｋ１１０（図３参照）において、ラマン分光測定装置１は、撮影用照明光Ｌ３の照射工程として、ハーフミラー１１に向かって撮影用照明光源１４から撮影用照明光Ｌ３が出射される。撮影用照明光Ｌ３は、その一部がハーフミラー１１を透過して全反射ミラー６に向かって出射される。全反射ミラー６に向かって出射された撮影用照明光Ｌ３は、レーザー光Ｌ１の光軸と一致するように全反射ミラー６のピンホール６ａ以外の部分で反射される。全反射ミラー６で反射された撮影用照明光Ｌ３は、レーザー光Ｌ１の光軸に沿って長波長光を反射するダイクロイックミラー７に入射される。撮影用照明光Ｌ３は、短波長領域の光のみがダイクロイックミラー７を透過して結像レンズ８に入射される。ダイクロイックミラー７を透過した撮影用照明光Ｌ３の短波長領域の光は、試料Ｓの表面に集光するように結像レンズ８から出射される。撮影用照明光Ｌ３の短波長領域の光が試料Ｓに照射されるとともに試料Ｓの表面で反射する。

工程Ｋ１２０（図３参照）において、ラマン分光測定装置１は、画像取得工程として、レーザー光Ｌ１と撮影用照明光Ｌ３の短波長領域の光との試料Ｓからの反射光Ｌ４が結像レンズ８に試料Ｓ側から入射される。（以下、結像レンズ８に光が試料Ｓ側から入射される場合、単に「試料側レンズ８」と記す）。すなわち、試料Ｓからの反射光Ｌ４は、試料側レンズ８に入射される。試料Ｓからの反射光Ｌ４は、無限遠にある点光源からの光として試料側レンズ８から出射される。試料側レンズ８から出射された試料Ｓからの反射光Ｌ４は、長波長光を反射するダイクロイックミラー７に入射される。短波長領域の光である試料Ｓからの反射光Ｌ４は、ダイクロイックミラー７を透過する。すなわち、試料Ｓからの反射光Ｌ４は、全反射ミラー６に向かって出射される。全反射ミラー６に向かって出射された試料Ｓからの反射光Ｌ４は、全反射ミラー６によってハーフミラー１１に向かって反射される。試料Ｓからの反射光Ｌ４は、その一部がハーフミラー１１によって撮影用カメラ１３に向かって反射される。

図７（ａ）に示すように、ラマン分光測定装置１は、撮影用カメラ１３（図４参照）が反射光Ｌ４から画像Ｖを生成する。画像Ｖには、試料Ｓの形態の画像とレーザー光Ｌ１の複数の照射点ｓ１・ｓ２・ｓ３・・・ｓ１６の画像とが同時に表示されている。さらに画像Ｖには、試料Ｓのうち第１構造体Ｓａの部分と第２構造体Ｓｂ（薄墨部分）の部分とが表示されている。ラマン分光測定装置１は、制御装置１５が撮影用カメラ１３から画像Ｖを取得する。このように、ラマン分光測定装置１は、複数の照射点ｓ１・ｓ２・ｓ３・・・ｓ１６における試料Ｓの表面状態とラマン散乱光Ｌ２のラマンスペクトルとを同時に確認することができる（図３参照）。

このように構成することで、ラマン分光測定装置１は、試料Ｓからの反射光Ｌ４がダイクロイックミラー７によって反射されないように構成されている。また、ラマン分光測定装置１は、試料Ｓからの反射光Ｌ４が全反射ミラー６のピンホール６ａ以外の部分で反射される。つまり、ラマン分光測定装置１においては、レーザー光Ｌ１の光軸上に配置された全反射ミラー６とダイクロイックミラー７とによって試料Ｓからの反射光Ｌ４がほとんど阻害されない。これにより、試料Ｓからの反射光Ｌ４がカメラに至るまでの間に生じる損失を抑制することができる。なお、本実施形態において、撮影用照明光源１４からの撮影用照明光Ｌ３と試料Ｓからの反射光Ｌ４とはハーフミラー１１によって同じ光軸になるように構成されているがこれに限定されるものではなく、撮影用カメラ１３と撮影用照明光源１４とを一体的に構成してハーフミラー１１を省略した構成でもよい。

図６に示すように、工程Ｋ１３０（図３参照）において、ラマン分光測定装置１は、分光測定工程として、試料Ｓの照射箇所からそれぞれ発生した長波長のラマン散乱光Ｌ２が試料側レンズ８に入射される。複数の光路からなるラマン散乱光Ｌ２は、試料側レンズ８に入射され、そして出射される。試料側レンズ８から出射されたラマン散乱光Ｌ２は、ダイクロイックミラー７に入射される。長波長のラマン散乱光Ｌ２は、長波長光を反射するダイクロイックミラー７によって反射される。すなわち、複数の光路からなるラマン散乱光Ｌ２は、ダイクロイックミラー７によってラマン用結像レンズ９に入射される。ラマン散乱光Ｌ２は、ラマン分光器１０の入射面に結像するようにラマン用結像レンズ９から出射される。

図７（ｂ）に示すように、ラマン分光測定装置１は、レーザー光Ｌ１の照射点ｓ１・ｓ２・ｓ３・・・ｓ１６からのラマン散乱光Ｌ２を、ラマン用結像レンズ９を介してマルチ光ファイバ１６の一端である２次元配列部分で受光する。ラマン分光測定装置１は、マルチ光ファイバ１６の一端で受光した２次元配列を１次元配列に変換してマルチ光ファイバ１６の他端から回析格子に出射する。出射された１次元配列に変換されたラマン散乱光Ｌ２が回折格子を介してエリアセンサに導かれるように構成されている。これにより、ラマン分光測定装置１は、複数の照射点ｓ１・ｓ２・ｓ３・・・ｓ１６のラマン分光スペクトルをラマン分光器１０で測定することができる。

このように構成することで、ラマン分光測定装置１は、複数の光路に分割されたレーザー光Ｌ１によって発生する複数の光路からなるラマン散乱光Ｌ２をダイクロイックミラー７によってラマン分光器１０にむかって反射させる。つまり、ラマン分光測定装置１においては、発生した複数の光路からなるラマン散乱光Ｌ２をラマン分光器１０に入射させることができる。従って、ラマン分光測定装置１は、複数の光路に分割されたレーザー光Ｌ１が試料Ｓに照射され、試料からのラマン散乱光Ｌ２の分光測定を行う分光測定工程と反射光Ｌ４から画像Ｖを取得する画像取得工程とを同時に実施することができる。

図８に示すように、工程Ｋ１４０（図３参照）において、ラマン分光測定装置１の制御装置１５は、画像処理工程として、取得した画像Ｖの試料Ｓの形態の画像において、画像を構成している最少単位である単位画素（以下、単に「画素」と記す）毎に割り当てられている画像情報に基づいて同一の構造体の範囲を特定する。制御装置１５は、隣接する画素間において画像情報である色相、明度、彩度、輝度のうち、任意に選択された少なくとも一つの値が規定値を超えている場合、その隣接している画素がそれぞれ異なる構造体の画像を構成していると判定する。

制御装置１５は、全ての画素において隣接する画素間での画像情報による判定結果に基づいて境界を設定し、同一の構造体の画像を構成している画素の集合体を画像領域として抽出する（図８（ａ））。同様にして、制御装置１５は、画像Ｖの試料Ｓの形態の画像において、他の同一の構造体の画像を構成している画素の集合体を画像領域として抽出し、独立した閉領域である第１画像領域Ａｒ１、第２画像領域Ａｒ２および第３画像領域Ａｒ３に分割する（図８（ｂ））。なお、本実施形態において、隣接する画素間の画像情報が規定値を超えているか否かで画像領域の境界を判定しているがこれに限定するものではなく、画像情報を用いて同一の構造体をあらわす画像領域を抽出できればよい。

図９（ａ）に示すように、工程Ｋ１５０（図３参照）において、ラマン分光測定装置１の制御装置１５は、領域判定工程として、画像Ｖにおいて同一の構造体の閉領域である第１画像領域Ａｒ１、第２画像領域Ａｒ２および第３画像領域Ａｒ３に分割された試料Ｓの形態の画像にレーザー光Ｌ１の複数の照射点ｓ１・ｓ２・ｓ３・・・ｓ１６の分光測定結果を重ね合わせる。制御装置１５は、同一の構造体からなる第１画像領域Ａｒ１内でのレーザー光Ｌ１の複数の照射点ｓ１・ｓ２・ｓ３・ｓ４・ｓ５・ｓ６の分光測定結果のうち同一の構造体を示す分光測定結果である照射点の数の割合が所定値以上であるか否かを判定し、所定値以上の場合、第１画像領域Ａｒ１内の構造体をその分光測定結果の構造体として特定する。

ラマン分光器１０（図６参照）は、照射点ｓ１・ｓ２・ｓ３・・・ｓ１６（図７参照）のラマン散乱光Ｌ２のラマンスペクトルを出力する。
図９（ｂ）に示すように、制御装置１５は、ラマン分光器１０から照射点ｓ１・ｓ２・ｓ３・ｓ４・ｓ５・ｓ６のラマンスペクトルを取得する。照射点ｓ１・ｓ２・ｓ３・ｓ４・ｓ５・ｓ６のうち照射点ｓ４・ｓ５の波形およびピーク位置が照射点ｓ１・ｓ２・ｓ３・ｓ６の波形およびピーク位置と異なる。この結果は、照射点ｓ１・ｓ２・ｓ３・ｓ６（図９（ａ）Ａｒ１内の黒丸）における構造体と、照射点ｓ４・ｓ５（図９（ａ）Ａｒ１内の白丸）における構造体とが異なることを示している。

本実施形態において、第１画像領域Ａｒ１における６点の照射点ｓ１・ｓ２・ｓ３・ｓ４・ｓ５・ｓ６の分光測定結果のうち照射点ｓ１・ｓ２・ｓ３・ｓ６の４点が同一の第１構造体Ｓａを示す分光測定結果（図９（ａ）Ａｒ１内の黒丸）である場合、第１画像領域Ａｒ１内の第１構造体Ｓａを示す分光測定結果である照射点の数の割合は、４／６≒０．６７＝６７％になる。所定値を６５％とした場合、制御装置１５は第１構造体Ｓａを示す分光測定結果である照射点の数の割合が所定値よりも大きいので、第１画像領域Ａｒ１を第１構造体Ｓａであると特定する。同様に、第２画像領域Ａｒ２における５点の照射点ｓ７・ｓ８・ｓ９・ｓ１０・ｓ１１の分光測定結果のうち照射点ｓ７・ｓ８・ｓ１０・ｓ１１の４点が同一の第２構造体Ｓｂを示す分光測定結果（図９（ａ）Ａｒ２内の黒丸）である場合、第２画像領域Ａｒ２内の第２構造体Ｓｂを示す分光測定結果である照射点の数の割合は４／５＝０．８＝８０％になる。従って、制御装置１５は、第２画像領域Ａｒ２を第２構造体Ｓｂであると特定する。

一方、第３画像領域Ａｒ３における５点の照射点ｓ１２・ｓ１３・ｓ１４・ｓ１５・ｓ１６の分光測定結果のうち照射点ｓ１４・ｓ１５・ｓ１６の３点が同一の第１構造体Ｓａを示す分光測定結果（図９（ａ）Ａｒ３内の黒丸）である場合、第３画像領域Ａｒ３内の第１構造体Ｓａを示す分光測定結果である照射点の数の割合は３／５＝０．６＝６０％になる。制御装置１５は、第１構造体Ｓａを示す分光測定結果である照射点の数の割合が本実施形態における所定値６５％未満なので、第３画像領域Ａｒ３を第１構造体Ｓａであると特定できない。従って、ラマン分光測定装置１は、第３画像領域Ａｒ３についてレーザー光Ｌ１の照射工程、画像取得工程、分光測定工程および画像処理工程および領域判定工程を再び実施する。制御装置１５は、以上の工程に沿って同一の構造体の閉領域に分割された第１画像領域Ａｒ１、第２画像領域Ａｒ２、第３画像領域Ａｒ３の構造体をその分光測定結果の割合に基づいて判定する。

このように構成することで、ラマン分光測定装置１は、試料Ｓの形態の画像とレーザー光Ｌ１の複数の照射点ｓ１・ｓ２・ｓ３・・・ｓ１６の画像とを含む画像Ｖを取得して、試料Ｓにおけるレーザー光Ｌ１の複数の照射点ｓ１・ｓ２・ｓ３・・・ｓ１６を観察することができる。さらに、ラマン分光測定装置１は、画像情報に基づいて同一の構造体から構成される範囲として設定される第１画像領域Ａｒ１内、第２画像領域Ａｒ２内、第３画像領域Ａｒ３内のそれぞれの複数箇所の分光測定結果を各画像領域に重ね合わせることで第１画像領域Ａｒ１内、第２画像領域Ａｒ２内、第３画像領域Ａｒ３内のレーザー光Ｌ１が照射されていない部分を含む各画像領域全体の構造体が特定される。これにより、第１画像領域Ａｒ１、第２画像領域Ａｒ２、第３画像領域Ａｒ３を構成する構造体の特定を精度よく行うことができる。また、走査型の顕微ラマン分光装置で第１画像領域Ａｒ１、第２画像領域Ａｒ２、第３画像領域Ａｒ３を測定する場合よりも測定時間を短くすることができる。

以上、ラマン分光測定装置の一実施形態であるラマン分光測定装置１は、複数の光路に分割したレーザー光Ｌ１を試料Ｓに照射する構成としているがこれに限定するものではない。また、レーザー光Ｌ１の光路を基準として、レーザー光源２側の位置に撮影用の光路が設けられ、試料Ｓ側の位置にラマン散乱光Ｌ２の光路が設けられているがこれに限定するものではない。ラマン分光測定装置１は、レーザー光Ｌ１の光路を基準として、全反射ミラー６を用いて撮影用の光路を確保し、ダイクロイックミラー７を用いてラマン散乱光Ｌ２の光路を確保する構成であればよい。上述の実施形態は、代表的な形態を示したに過ぎず、一実施形態の骨子を逸脱しない範囲で種々変形して実施することができる。さらに種々なる形態で実施し得ることは勿論のことであり、本発明の範囲は、特許請求の範囲の記載によって示され、さらに特許請求の範囲に記載の均等の意味、および範囲内のすべての変更を含む。

１ 分光測定装置
Ｓ 試料
Ｖ 画像
Ｌ１ レーザー光
Ｌ２ ラマン散乱光
Ｌ３ 撮影用照明光
Ｌ４ 反射光
Ａｒ１ 第１画像領域
Ａｒ２ 第２画像領域
Ａｒ３ 第３画像領域
Ｓａ 第１構造体
Ｓｂ 第２構造体

Claims (5)

1. 試料に撮影用照明光と分光用照明光とを照射し、撮影用カメラによって前記試料の形態と前記分光用照明光の照射点の画像を取得しつつ、前記分光用照明光によって励起される光を分光測定する分光測定方法であって、
   前記試料に前記撮影用照明光を照射し、前記分光用照明光を複数の箇所に照射する照射工程と、
   前記試料の形態の画像と前記分光用照明光の複数の照射点の画像とを取得する画像取得工程と、
   前記分光用照明光によって複数の照射点から励起される光をそれぞれ分光測定する分光測定工程と、
   取得した前記試料の形態の画像において、画像情報から同一の構造体で構成される画像領域を抽出し、抽出した各画像領域を閉領域として分割する画像処理工程と、
   前記分光用照明光の複数の照射点毎の分光測定結果を前記各画像領域に分割された前記試料の形態の画像における前記分光用照明光の複数の照射点に重ね合わせ、前記各画像領域内における前記分光用照明光の複数の照射点の分光測定結果に基づいて前記各画像領域の構造体を特定する領域判定工程と、
   から構成される分光測定方法。
2. 前記領域判定工程において、一つの前記画像領域内における前記分光用照明光の複数の照射点に対する同一の構造体を示す分光測定結果を有する分光用照明光の照射点の数の割合が所定値以上の場合、その前記画像領域の構造体をその分光測定結果の構造体として特定する請求項１に記載の分光測定方法。
3. 前記照射工程において、前記分光用照明光が照明光分割手段によって複数の分光用照明光に分割されて前記試料に同時に照射され、前記画像取得工程と前記分光測定工程とが同時に実施される請求項１または請求項２に記載の分光測定方法。
4. 前記画像処理工程において、前記画像情報が、色相、明度、彩度、輝度のうち少なくとも一つの情報から構成されている請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の分光測定方法。
5. 請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の分光測定方法を実施する分光測定装置であって、
   所定波長の分光用照明光源と、
   分光器と、
   撮影用カメラと、
   撮影用照明光源と、
   ピンホールが形成されている全反射ミラーと、
   前記所定波長の分光用照明光とそれよりも短い波長の光のみを透過させるダイクロイックミラーと、を備え、
   前記全反射ミラーと前記ダイクロイックミラーとが前記分光用照明光の光軸上に配置されており、
   前記分光用照明光源からの分光用照明光が、前記全反射ミラーのピンホールを通過して前記試料に照射され、
   前記試料に照射された分光用照明光によって励起される光が前記ダイクロイックミラーに反射されて前記分光器に入射され、
   前記撮影用照明光源からの撮影用照明光が、前記全反射ミラーに反射されて前記分光用照明光の光軸に前記撮影用照明光の光軸を一致させた状態で前記試料に照射され、
   前記試料から反射した撮影用照明光が、その光軸を前記分光用照明光の光軸に一致させた状態で前記全反射ミラーに反射されて前記撮影用カメラに入射される分光測定装置。

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