JP6779866B2 - ミトコンドリアを単離するための製品および方法 - Google Patents
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Description
本出願は、参照により本明細書に組み入れられる、2014年6月13日に出願された米国出願第62/012,045号の利益を主張する。
連邦政府資金による研究開発
本明細書に記載の濾過装置は、以下でさらに説明され、図1に示される複数のフィルタを収容するように構成された本体(例えば管状本体)を特徴とする。本体(10)は、遠心分離管(90)内に適合するような形状であってもよい。本体(10)および遠心分離管(90)は、任意のサイズであってもよい。本体(10)は、それぞれ開口(30)および(70)を有する第1および第2の端部(20)および(80)を有する。本体は、試料が一方の端部で本体内に設置され、ルーメン(40)を通って移動し、例えば重力、毛管作用、および/または遠心分離により、本体内に配置された少なくとも2つのフィルタを通して試料が進行した後に、反対の端部で回収され得るように、ルーメン(40)を有する。一方または両方の端部(20および/または80)は、それぞれ開口を有するが、いくつかの実施形態において、例えば無菌性を保つ、および/または濾液を収集するための領域を提供するために可逆的にキャップされ得ることが、当業者に理解されるであろう。典型的には、本体は、本体の長さに沿ってほぼ円形の断面を有する。しかしながら、本体の断面は、任意の所望の形状、例えば楕円形、正方形、長方形、三角形等であってもよいことが、当業者に理解されるであろう。いくつかの実施形態において、本体が市販の遠心分離管(90)、例えば50mLの遠心分離管内に受容され得るように、断面はほぼ円形である。管状本体(10)は、任意の当該技術分野において知られた材料、例えばポリプロピレンまたはポリスチレンから構築されてもよいことが、当業に理解されるであろう。本体の一方の端部、例えば端部(80)は、遠心分離管内への本体の挿入を容易化するために、および/または本体内のフィルタ(複数を含む)の保持を補助するために、テーパ型構成(図1に示される)を有してもよい。
本開示はまた、生存ミトコンドリアを単離するための、本明細書に記載の濾過装置を特徴とするキットを提供する。そのようなキットは、少なくとも1個、例えば2個、3個、5個または10個の上述の濾過装置を含む。キットは、本明細書に記載のミトコンドリア単離方法を実行するのに有用な1種または複数種の溶液をさらに含んでもよい。例えば、キットは、300mMのスクロース;10mMのK+HEPES、pH7.2;および1mMのK+EGTA、pH8.0を含む第1の溶液を含んでもよい。代替として、またはそれに追加して、キットは、第1の溶液1mL当たり2mgのサブチリシンAを含む第2の溶液を含んでもよい。代替として、またはそれに追加して、キットは、第1の溶液1mL当たり10mgのBSAを含む第3の溶液を含んでもよい。代替として、またはそれに追加して、キットは、不活性ヒト血清アルブミンまたはアセチル化ヒト血清アルブミンを含む溶液を含んでもよい。代替として、またはそれに追加して、キットは、第1の溶液1mL当たり1mgのBSAを含む第4の溶液を含んでもよい。いくつかの場合において、キットは、濾過装置を適合させることができる50mLの遠心分離管を含んでもよい。代替として、またはそれに追加して、キットは、1.5mLの微小遠心分離管を含んでもよい。いくつかの一実施形態において、50mLの遠心分離管および1.5mLの微小遠心分離管は、無菌である。
例示的方法において、無傷生存ミトコンドリアは、組織、例えば哺乳動物組織、例えば組織生検からの哺乳動物組織から単離される。例えば、哺乳動物からの組織は、例えばメスを用いて切り刻み、300mMスクロース;10mMのK+HEPES、pH7.2;および1mMのK+EGTA、pH8.0を含有する第1の溶液中で、電動式乳棒を有する無菌ガラス粉砕容器(Thomas、Philadelphia、PA)内で、4℃で5から10秒間均質化することができる。次いで、第1の溶液1mL当たり2mgのサブチリシンAを含有する溶液をホモジネートに添加し、氷上で10分間インキュベートする。
無傷の生存呼吸可能ミトコンドリアを単離するために、以下の溶液を調製した。本発明の方法を使用してミトコンドリアを成功裏に単離するために、全ての溶液および組織試料を氷上に保持し、ミトコンドリアの生存を保つべきである。氷上に維持された場合であっても、単離されたミトコンドリアは、経時的に機能活性の低下を示す(Olson et al.,J Biol Chem 242:325−332,1967)。全ての溶液は、可能な場合には事前に調製されるべきである。
1MのK−HEPES原液(KOHでpHを7.2に調整)。
0.5MのK−EGTA原液(KOHでpHを8.0に調整)。
1MのKH2PO4原液。
1MのMgCl2原液。
均質化緩衝液(pH7.2):300mMのスクロース、10mMのK−HEPES、および1mMのK−EGTA。4℃で保存した。
呼吸緩衝液:250mMのスクロース、2mMのKH2PO4、10mMのMgCl2、20mMのK−HEPES緩衝液(pH7.2)、および0.5mMのK−EGTA(pH8.0)。4℃で保存した。
10×PBS原液:80gのNaCl、2gのKCl、14.4gのNa2HPO4、および2.4gのKH2PO4を、1Lの再蒸留H2O(pH7.4)に溶解させた。
100mLの10×PBSを1Lの再蒸留H2Oに滴下することにより、1×PBSを調製した。
4mgのSubtilisin Aを1.5mLの微小遠心分離管に量り入れることにより、Subtilisin A原液を調製した。使用するまで−20℃で保存した。
20mgのBSAを1.5mLの微小遠心分離管に量り入れることにより、BSA原液を調製した。使用するまで−20℃で保存した。
組織解離および分別濾過を使用したミトコンドリアの単離における手順ステップの概要を説明した図を、図2に示す。2つの6mm生検穿孔試料を、解離C管内の5mLの均質化緩衝液に移し、試料を組織解離器の1分間の均質化プログラムを使用して均質化した(A)。サブチリシンA原液(250μL)を解離C管内のホモジネートに添加し、10分間氷上でインキュベートした(B)。氷上の50mLの円錐遠心分離管内に、事前に湿潤させた40μmメッシュフィルタを通してホモジネートを濾過し、次いで250μLのBSA原液を濾液に添加した(C)。氷上の50mLの円錐遠心分離内に、新しい事前に湿潤させた40μmのメッシュフィルタを通して濾液を再び濾過した(D)。氷上の50mLの円錐遠心分離管内に、新しい事前に湿潤させた10μmのメッシュフィルタを通して濾液を再び濾過した(E)。濾液を1.5mLの微小遠心分離管に移し、4℃で10分間9000×gで遠心分離した(F)。上清を除去し、ミトコンドリアを含有するペレットを再び懸濁させ、1mLの呼吸緩衝液に組み合わせた(G)。
単離されたミトコンドリアの代謝活性を決定するために、ATPアッセイキットを使用してATP発光アッセイを行った。プロトコル、試薬および標準は、アッセイキットに提供されていた。手順の要約を以下に記載する。
6mm生検穿孔を使用して組織試料を得た。組織重量は0.18±0.04g(湿潤重量)であった。粒子サイズ計数により決定された単離されたミトコンドリアの数は、骨格筋において2.4×1010±0.1×1010ミトコンドリア、および肝臓調製物において2.75×1010±0.1×1010ミトコンドリアであった(図3A)。また、比較を可能とするために、血球計によりミトコンドリア数を決定した。血球計により決定した場合、ミトコンドリアの数は少なく見積もられ、骨格筋において0.11×1010±0.04×1010ミトコンドリア、および肝臓調製物において0.34×1010±0.09×1010ミトコンドリアであった(図3A)。サイズに基づく粒子カウンタにより決定されたミトコンドリア直径を、図3Bに示す。代表的なトレースは、単離されたミトコンドリアが、以前の報告と一致して、0.38±0.17μmの平均直径で1つのピーク下に局在することを示している(Hogeboom et al.,J Biol Chem 172:619−635,1948)。
本発明をその詳細な説明と併せて、説明してきたが、上記説明は本発明を例示することを意図し、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の範囲を限定する意図はないことを理解されたい。他の態様、利点、および修正は、以下の特許請求の範囲内である。
Claims (16)
- 生存し呼吸可能なミトコンドリアを単離するための方法であって、
生存ミトコンドリアを含む細胞ホモジネートを提供することと;
前記細胞ホモジネートを、30μmから50μmの細孔サイズを有する第1のフィルタを通過させ;次に
5μmから20μmの細孔サイズを有する第2のフィルタを通過させ、それにより濾液を形成させることと;
前記濾液を収集し、濾液を遠心分離し、上清を除去し、それにより前記生存し呼吸可能なミトコンドリアを単離することと
を含む、上記方法。 - さらに、前記細胞ホモジネートを前記第2のフィルタを通過させる前に、15μmから50μmの細孔サイズを有する第3のフィルタに前記細胞ホモジネートを通過させることを含む、請求項1に記載の方法。
- 300mMのスクロース;10mMのK+HEPES;および1mMのK+EGTAを含む溶液中で組織を均質化し、それにより前記細胞ホモジネートを提供することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞ホモジネートを導入する前に、300mMのスクロース;10mMのK+HEPES;および1mMのK+EGTAを含む溶液1mL中の1mgのBSAを含む溶液で、前記第2のフィルタを湿潤させることを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記濾液を収集する前に、前記第1のフィルタ及び第2のフィルタを装置に配置し、前記装置を1×gで遠心分離する、請求項1に記載の方法。
- 前記濾液は、9000×gで遠心分離される、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞ホモジネートは、無菌容器内で組織を均質化することにより提供される、請求項1に記載の方法。
- 前記第1のフィルタの細孔サイズは40μmであり、前記第2のフィルタの細孔サイズは10μmであり、かつ前記第3のフィルタの細孔サイズは40μmである、請求項2に記載の方法。
- さらに、細胞ホモジネートを第4のフィルタに通過させることを含む、請求項2に記載の方法。
- 前記濾液を収集する前に、前記装置を1×gで3分間遠心分離する、請求項5に記載の方法。
- 前記細胞ホモジネートが無菌容器内で4℃で組織を均質化することにより提供される、請求項7に記載の方法。
- ミトコンドリア単離に要する時間は30分未満である、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞ホモジネートを、遠心分離せずに前記第1のフィルタ及び第2のフィルタに通過させる、請求項1に記載の方法。
- 前記フィルタを4℃で遠心分離する、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞ホモジネートを、遠心分離せずに前記第1のフィルタ、第2のフィルタ及び第3のフィルタに通過させる、請求項2に記載の方法。
- 前記細胞ホモジネートを、遠心分離せずに前記第1のフィルタ、第2のフィルタ、第3のフィルタ及び第4のフィルタに通過させる、請求項9に記載の方法。
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