JP6771644B2 - 微生物発酵によるn−アセチル−d−グルコサミン及び/又はd−グルコサミン塩の製造方法 - Google Patents
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Description
1.微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミンキナーゼ(N−acetylmannosamine kinase、NanK)の働きを向上させることにより、微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミン(N−acetyl−D−mannosamine、ManNAc)からN−アセチル−D−マンノサミン−6−リン酸(N−acetyl−D−mannosamine−6−phosphate、ManNAc−6−P)へのリン酸化を促進し、それによって当該微生物により高い効率と収率でN−アセチル−D−グルコサミン(GlcNAc)及び/又はD−グルコサミン塩を製造させる。
(1)微生物の中のマンノーストランスポーターEIIM、P/IIIman(Mannose transporter EIIM、P/IIIMan、ManXYZ)の働きを低下させ、N−アセチル−D−グルコサミン(GlcNAc)などのヘキソ−スが細胞内への輸送分解を阻害する。
(2)微生物の中のN−アセチルノイラミン酸リア−ゼ(N−acetylneuraminate lyase、NanA)の働きを低下させ、微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミン(N−acetyl−D−mannosamine、ManNAc)の分解を阻害する。
(3)微生物の中のN−アセチル−D−グルコサミン6−リン酸デアセチラ−ゼ(N−acetylGlucosamine−6− phosphate deacetylase、NagA)の働きを低下させ、微生物の中のN−アセチル−D−グルコサミン6−リン酸(N−acetyl−D−Glucosamine−6−phosphate、GlcNAc−6−P)からD−グルコサミン6−リン酸(D−Glucosamine−6−phosphate、GlcN−6−P)への変換を阻害する。
(4)微生物の中のN−アセチル−D−グルコサミン特異的酵素IINag(N−acetylGlucosamine specific enzyme IINag、NagE)の働きを低下させ、N−アセチル−D−グルコサミン(GlcNAc)が微生物細胞への輸送・分解を阻害する。
(5)微生物の中のホスホグルコサミンムタ−ゼ(phosphoGlucosamine mutase、GlmM)の働きを向上させ、微生物の中のD−グルコサミン6−リン酸(D−Glucosamine−6−phosphate、GlcN−6−P)からD−グルコサミン1−リン酸(D−Glucosamine−1−phosphate、GlcN−1−P)への変換を促進する。
(6)微生物の中の二機能性酵素N−アセチル−D−グルコサミン1−リン酸ウリジルトランスファラーゼ(bifunctional N−acetyl Glucosamine−1−phosphate uridyltransferase/Glucosamine−1−phosphate acetyl transferase、GlmU)の働きを向上させることにより、微生物の中のD−グルコサミン1−リン酸(D−Glucosamine−1−phosphate、GlcN−1−P)からN−アセチル−D−グルコサミン1−リン酸(N−acetyl−D−Glucosamine−1−phosphate、GlcNAc−1−P)への変換、さらなるUDP−N−アセチル−D−グルコサミン(UDP−N−acetyl−D−Glucosamine、UDP−GlcNAc)への変換を促進する。
A)発酵培地において微生物を培養し、前記微生物は少なくとも一種のビトレオシラヘモグロビン(Vhb)を発現させることができる遺伝子改変を含む;および
B)培養工程A)から産生されるN−アセチル−D−グルコサミン(GlcNAc)を収集する。
好ましくは、さらにC)N−アセチル−D−グルコサミン(GlcNAc)を脱アセチル化して得られるD−グルコサミン塩を含む。
本発明は、ビトレオシラヘモグロビン(Vhb)を対象として、エラ−プロ−ンPCRによるランダム突然変異誘発導入法により、ランダム塩基置換を導入し、DNA改変を行い、当該タンパク質の理想的突然変異体をスクリーニングする。エラ−プロ−ンPCRによるランダム突然変異誘発導入法はランダム塩基置換を導入することによって理想的突然変異体をスクリーニングするが、DNA組換えはランダム突然変異誘発より良性突然変異の確率を有意に向上させることができ、それによってより有用な突然変異体を得ることができる。ビトレオシラヘモグロビン(Vhb)の活性を向上させるために、エラ−プロ−ンPCR とDNA組換えを組み合わせ、それに対して改変を行い、且つ突然変異遺伝子を酸素調節型プロモーターの下に置いて発現・スクリーニングを行い、それによって酸素制限条件下で活性が野生型より高い突然変異蛋白質を得る。
もう一つの実施形態によれば、前記ビトレオシラヘモグロビン(Vhb)はSEQ ID NO:61のアミノ酸配列を有する。
もう一つの実施形態によれば、組換え核酸分子は内在性天然プロモーターを含み、内在性天然プロモーターより高い発現レベルのプロモーター、エンハンサー、融合配列などを有する。好ましくは、組換え核酸分子は天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターを含み、例えば、HCEプロモーター、gapプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーターなど;より好ましくは、組換え核酸分子はtrcプロモーターを含む。trcプロモーターは trpプロモーターと lacプロモーターが連結されるプロモーターであり、trpより高い転写効率とlacIリプレッサーによって調節される強力なプロモーター特性を有する。
(1)少なくとも1種の微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミンキナーゼ(NanK)の働きを向上させることができる遺伝子改変;
(2)少なくとも1種の微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミン−6−リン酸イソメラーゼ(NanE)の働きを向上させることができる遺伝子改変;
(3)少なくとも1種の微生物の中のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼ(NagB)の働きを向上させることができる遺伝子改変、好ましくは少なくとも1種のグルコサミン6−リン酸シンターゼ(GlmS)の働きを低下させることができる遺伝子改変;
(4)少なくとも1種の微生物の中のグルコサミン6−リン酸シンターゼ(GlmS)の働きを向上させることができる遺伝子改変を含み、それと同時に少なくとも1種のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼ(NagB)の働きを低下させることができる遺伝子改変;
(5)少なくとも1種の微生物の中のUDP−N−アセチル−D−グルコサミン2−エピメラーゼ(WecB)の働きを向上させることができる遺伝子改変。
もう一つの実施形態によれば、前記N−アセチル−D−マンノサミンキナーゼ(NanK)は、SEQ ID NO:17のアミノ酸配列を有する。
もう一つの実施形態によれば、組換え核酸分子の中のN−アセチル−D−マンノサミンキナーゼ(NanK)をコードする遺伝子のコピ−数を増加させる。
一つの実施形態によれば、N−アセチル−D−マンノサミン−6−リン酸イソメラーゼ(NanE)をコードする核酸配列は少なくとも1種のN−アセチル−D−マンノサミン−6−リン酸イソメラーゼ(NanE)の酵素活性を向上させる遺伝子改変を含む。好ましくは、前記遺伝子改変はアミノ酸配列SEQ ID NO:29に対応する次の位置での置換の1種または2種を含む:133位のシステインからアルギニンへの置換および187位のチロシンからヒスチジンへの置換。より好ましくは、前記N−アセチル−D−マンノサミン−6−リン酸イソメラーゼ(NanE)をコードする核酸配列はSEQ ID NO:56である;前記N−アセチル−D−マンノサミン−6−リン酸イソメラーゼ(NanE)をコードするアミノ酸配列はSEQ ID NO:57である。
もう一つの実施形態によれば、前記N−アセチル−D−マンノサミン−6−リン酸イソメラーゼ(NanE)は、SEQ ID NO:29のアミノ酸配列を有する。
もう一つの実施形態によれば、組換え核酸分子の中のN−アセチル−D−マンノサミン−6−リン酸イソメラーゼ(NanE)をコードする遺伝子のコピ−数を増加させる。
一つの実施形態によれば、D−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼ(NagB)をコードする核酸配列は少なくとも1種のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼ(NagB)の酵素活性を向上させる遺伝子改変を含む。
もう一つの実施形態によれば、組換え核酸分子の中のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼ(NagB)をコードする遺伝子のコピ−数を増加させる。
前記第(4)の実施形態によれば、微生物の中のグルコサミン6−リン酸シンターゼ(GlmS)の働きを向上させる遺伝子改変は、a)微生物の中のグルコサミン6−リン酸シンターゼ(GlmS)の酵素活性の向上;及び/又はb)微生物の中のグルコサミン6−リン酸シンターゼ(GlmS)の過剰発現から選ばれる。
一つの実施形態によれば、グルコサミン6−リン酸シンターゼ(GlmS)をコードする核酸配列は少なくとも1種のグルコサミン6−リン酸シンターゼ(GlmS)の酵素活性を向上させる遺伝子改変を含む。
もう一つの実施形態によれば、組換え核酸分子の中のグルコサミン6−リン酸シンターゼ(GlmS)をコードする遺伝子のコピ−数を増加させる。
もう一つの実施形態によれば、組換え核酸分子は内在性天然プロモーターを含み、内在性天然プロモーターより高い発現レベルのプロモーター、エンハンサー、融合配列などを有する。好ましくは、組換え核酸分子は天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターを含み、例えば、HCEプロモーター、gapプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーターなど;より好ましくは、組換え核酸分子はtrcプロモーターを含む。trcプロモーターは、trpプロモーターとlacプロモーターが連結されてなるプロモーターであり、trpより高い転写効率とlacIリプレッサーによって調節される強力なプロモーター特性を有する。
本発明において、微生物の中のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼ(NagB)の働きを低下させる遺伝子改変は、a)微生物の中のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼ(NagB)の酵素活性の低下;及び/又はb)微生物の中のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼ(NagB)の発現低下から選ばれ、次を含むがこれらに限らない:微生物の中のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼ(NagB)をコードする内因性遺伝子の一部または全部の欠失、または、一部または全部の不活性化、及び/又は微生物の中のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼ(NagB)をコードする遺伝子の内在性天然プロモーターの一部または全部の欠失、または、一部または全部の不活性化。好ましくは、微生物の中のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼ(NagB)の働きを低下させる遺伝子改変は、微生物の中のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼ(NagB)をコードする遺伝子の内在性天然プロモーターを完全に欠失させ、即ち削除する。
特定の実施形態によれば、微生物は少なくとも1種の微生物の中のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼ(NagB)の働きを低下させることができる遺伝子改変を含む少なくとも1種の組換え核酸分子によって改変される。
もう一つの実施形態によれば、前記UDP−N−アセチル−D−グルコサミン2−エピメラーゼ(WecB)は、SEQ ID NO:50のアミノ酸配列を有する。
もう一つの実施形態によれば、組換え核酸分子は内在性天然プロモーターを含み、内在性天然プロモーターより高い発現レベルのプロモーター、エンハンサー、融合配列などを有する。好ましくは、組換え核酸分子は天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターを含み、例えば、HCEプロモーター、gapプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーターなど;より好ましくは、組換え核酸分子はtrcプロモーターを含む。trcプロモーターは、trpプロモーターと lacプロモーターが連結されてなるプロモーターであり、trpより高い転写効率とlacIリプレッサーによって調節される強力なプロモーター特性を有する。
(1)少なくとも1種の微生物の中のマンノーストランスポーターEIIM、P/IIIman(ManXYZ)の働きを低下させることができる遺伝子改変;
(2)少なくとも1種の微生物の中のN−アセチルノイラミン酸リア−ゼ(NanA)の働きを低下させることができる遺伝子改変;
(3)少なくとも1種の微生物の中のN−アセチル−D−グルコサミン6−リン酸デアセチラ−ゼ(NagA)の働きを低下させることができる遺伝子改変;
(4)少なくとも1種の微生物の中のN−アセチル−D−グルコサミン特異的酵素IINag(NagE)の働きを低下させることができる遺伝子改変を含む;
(5)少なくとも1種の微生物の中のホスホグルコサミンムタ−ゼ(GlmM)の働きを向上させることができる遺伝子改変;
(6)包含少なくとも1種の微生物の中の二機能性酵素N−アセチル−D−グルコサミン1−リン酸ウリジルトランスファラーゼ(GlmU)の働きを向上させることができる遺伝子改変。
一つの実施形態によれば、ホスホグルコサミンムタ−ゼ(GlmM)をコードする核酸配列は、少なくとも1種のホスホグルコサミンムタ−ゼ(GlmM)の酵素活性を向上させる遺伝子改変を含む。
もう一つの実施形態によれば、組換え核酸分子の中のホスホグルコサミンムタ−ゼ(GlmM)をコードする遺伝子のコピ−数を増加させる。
一つの実施形態によれば、二機能性酵素N−アセチル−D−グルコサミン1−リン酸ウリジルトランスファラーゼ(GlmU)をコードする核酸配列は、少なくとも1種の二機能性酵素N−アセチル−D−グルコサミン1−リン酸ウリジルトランスファラーゼ(GlmU)の酵素活性を向上させる遺伝子改変を含む。
もう一つの実施形態によれば、組換え核酸分子は内在性天然プロモーターを含み、内在性天然プロモーターより高い発現レベルのプロモーター、エンハンサー、融合配列などを有する。好ましくは、組換え核酸分子は天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターを含み、例えば、HCEプロモーター、gapプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーターなど;より好ましくは、組換え核酸分子はtrcプロモーターを含む。trcプロモーターは、trpプロモーターとlacプロモーターが連結されてなるプロモーターであり、trpより高い転写効率とlacIリプレッサーによって調節される強力なプロモーター特性を有する。
A)発酵培地において微生物培養を行い、前記微生物は次を含む:少なくとも1種のビトレオシラヘモグロビン(Vhb)を発現させることができる遺伝子改変;少なくとも1種の微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミンキナーゼ(NanK)の働きを向上させることができる遺伝子改変;および
B)培養工程A)から産生されるN−アセチル−D−グルコサミン(GlcNAc)を収集する。
A)発酵培地において微生物培養を行い、前記微生物は次を含む:少なくとも1種のビトレオシラヘモグロビン(Vhb)を発現させることができる遺伝子改変;少なくとも1種の微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミン−6−リン酸イソメラーゼ(NanE)の働きを向上させることができる遺伝子改変;および
B)培養工程A)から産生されるN−アセチル−D−グルコサミン(GlcNAc)を収集する。
A)発酵培地において微生物培養を行い、前記微生物は次を含む:少なくとも1種のビトレオシラヘモグロビン(Vhb)を発現させることができる遺伝子改変;少なくとも1種の微生物の中のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼ(NagB)の働きを向上させることができる遺伝子改変;および
B)培養工程A)から産生されるN−アセチル−D−グルコサミン(GlcNAc)を収集する。 好ましくは、前記微生物は、さらに少なくとも1種のグルコサミン6−リン酸シンターゼ(GlmS)の働きを低下させることができる遺伝子改変を含む。
A)発酵培地において微生物培養を行い、前記微生物は次を含む:少なくとも1種のビトレオシラヘモグロビン(Vhb)を発現させることができる遺伝子改変;少なくとも1種の微生物の中のグルコサミン6−リン酸シンターゼ(GlmS)の働きを向上させることができる遺伝子改変;および少なくとも1種のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼ(NagB)の働きを低下させることができる遺伝子改変;および
B)培養工程A)から産生されるN−アセチル−D−グルコサミン(GlcNAc)を収集する。
A)発酵培地において微生物培養を行い、前記微生物は次を含む:少なくとも1種のビトレオシラヘモグロビン(Vhb)を発現させることができる遺伝子改変;少なくとも1種の微生物の中のUDP−N−アセチル−D−グルコサミン2−エピメラーゼ(WecB)の働きを向上させることができる遺伝子改変;および
B)培養工程A)から産生されるN−アセチル−D−グルコサミン(GlcNAc)を収集する。
A)発酵培地において微生物培養を行い、前記微生物は次を含む:少なくとも1種のビトレオシラヘモグロビン(Vhb)を発現させることができる遺伝子改変;少なくとも1種の微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミンキナーゼ(NanK)の働きを向上させることができる遺伝子改変;および少なくとも1種の微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミン−6−リン酸イソメラーゼ(NanE)の働きを向上させることができる遺伝子改変;および
B)培養工程A)から産生されるN−アセチル−D−グルコサミン(GlcNAc)を収集する。
A)発酵培地において微生物培養を行い、前記微生物は次を含む:少なくとも1種のビトレオシラヘモグロビン(Vhb)を発現させることができる遺伝子改変;少なくとも1種の微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミンキナーゼ(NanK)の働きを向上させることができる遺伝子改変;および少なくとも1種の微生物の中のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼ(NagB)の働きを向上させることができる遺伝子改変;および
B)培養工程A)から産生されるN−アセチル−D−グルコサミン(GlcNAc)を収集する。
好ましくは、前記微生物は、さらに少なくとも1種のグルコサミン6−リン酸シンターゼ(GlmS)の働きを低下させることができる遺伝子改変を含む。
A)発酵培地において微生物培養を行い、前記微生物は次を含む:少なくとも1種のビトレオシラヘモグロビン(Vhb)を発現させることができる遺伝子改変;少なくとも1種の微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミンキナーゼ(NanK)の働きを向上させることができる遺伝子改変;少なくとも1種の微生物の中のグルコサミン6−リン酸シンターゼ(GlmS)の働きを向上させることができる遺伝子改変;および少なくとも1種のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼ(NagB)の働きを低下させることができる遺伝子改変;および
B)培養工程A)から産生されるN−アセチル−D−グルコサミン(GlcNAc)を収集する。
A)発酵培地において微生物培養を行い、前記微生物は次を含む:少なくとも1種のビトレオシラヘモグロビン(Vhb)を発現させることができる遺伝子改変;少なくとも1種の微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミンキナーゼ(NanK)の働きを向上させることができる遺伝子改変;および少なくとも1種の微生物の中のUDP−N−アセチル−D−グルコサミン2−エピメラーゼ(WecB)の働きを向上させることができる遺伝子改変;および
B)培養工程A)から産生されるN−アセチル−D−グルコサミン(GlcNAc)を収集する。
A)発酵培地において微生物培養を行い、前記微生物は次を含む:少なくとも1種のビトレオシラヘモグロビン(Vhb)を発現させることができる遺伝子改変;少なくとも1種の微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミン−6−リン酸イソメラーゼ(NanE)の働きを向上させることができる遺伝子改変;および少なくとも1種の微生物の中のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼ(NagB)の働きを向上させることができる遺伝子改変;および
B)培養工程A)から産生されるN−アセチル−D−グルコサミン(GlcNAc)を収集する。
好ましくは、前記微生物は、さらに少なくとも1種のグルコサミン6−リン酸シンターゼ(GlmS)の働きを低下させることができる遺伝子改変を含む。
A)発酵培地において微生物培養を行い、前記微生物は次を含む:少なくとも1種のビトレオシラヘモグロビン(Vhb)を発現させることができる遺伝子改変;少なくとも1種の微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミン−6−リン酸イソメラーゼ(NanE)の働きを向上させることができる遺伝子改変;少なくとも1種の微生物の中のグルコサミン6−リン酸シンターゼ(GlmS)の働きを向上させることができる遺伝子改変;および少なくとも1種のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼ(NagB)の働きを低下させることができる遺伝子改変;及び
B)培養工程A)から産生されるN−アセチル−D−グルコサミン(GlcNAc)を収集する。
A)発酵培地において微生物培養を行い、前記微生物は次を含む:少なくとも1種のビトレオシラヘモグロビン(Vhb)を発現させることができる遺伝子改変;少なくとも1種の微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミン−6−リン酸イソメラーゼ(NanE)の働きを向上させることができる遺伝子改変;および少なくとも1種の微生物の中のUDP−N−アセチル−D−グルコサミン2−エピメラーゼ(WecB)の働きを向上させることができる遺伝子改変;および
B)培養工程A)から産生されるN−アセチル−D−グルコサミン(GlcNAc)を収集する。
A)発酵培地において微生物培養を行い、前記微生物は次を含む:少なくとも1種のビトレオシラヘモグロビン(Vhb)を発現させることができる遺伝子改変;および少なくとも1種の微生物の中のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼ(NagB)の働きを向上させることができる遺伝子改変;および少なくとも1種の微生物の中のUDP−N−アセチル−D−グルコサミン2−エピメラーゼ(WecB)の働きを向上させることができる遺伝子改変;および
B)培養工程A)から産生されるN−アセチル−D−グルコサミン(GlcNAc)を収集する。
好ましくは、前記微生物は、さらに少なくとも1種のグルコサミン6−リン酸シンターゼ(GlmS)の働きを低下させることができる遺伝子改変を含む。
A)発酵培地において微生物培養を行い、前記微生物は次を含む:少なくとも1種のビトレオシラヘモグロビン(Vhb)を発現させることができる遺伝子改変;少なくとも1種の微生物の中のグルコサミン6−リン酸シンターゼ(GlmS)の働きを向上させることができる遺伝子改変;および少なくとも1種のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼ(NagB)の働きを低下させることができる遺伝子改変;少なくとも1種の微生物の中のUDP−N−アセチル−D−グルコサミン2−エピメラーゼ(WecB)の働きを向上させることができる遺伝子改変;および
B)培養工程A)から産生されるN−アセチル−D−グルコサミン(GlcNAc)を収集する。
A)発酵培地において微生物培養を行い、前記微生物は次を含む:少なくとも1種のビトレオシラヘモグロビン(Vhb)を発現させることができる遺伝子改変;少なくとも1種の微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミンキナーゼ(NanK)の働きを向上させることができる遺伝子改変;少なくとも1種の微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミン−6−リン酸イソメラーゼ(NanE)の働きを向上させることができる遺伝子改変;および少なくとも1種の微生物の中のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼ(NagB)の働きを向上させることができる遺伝子改変;および
B)培養工程A)から産生されるN−アセチル−D−グルコサミン(GlcNAc)を収集する。
好ましくは、前記微生物さらに少なくとも1種のグルコサミン6−リン酸シンターゼ(GlmS)の働きを低下させることができる遺伝子改変を含む。
A)発酵培地において微生物培養を行い、前記微生物は次を含む:少なくとも1種のビトレオシラヘモグロビン(Vhb)を発現させることができる遺伝子改変;少なくとも1種の微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミンキナーゼ(NanK)の働きを向上させることができる遺伝子改変;少なくとも1種の微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミン−6−リン酸イソメラーゼ(NanE)の働きを向上させることができる遺伝子改変;少なくとも1種の微生物の中のグルコサミン6−リン酸シンターゼ(GlmS)の働きを向上させることができる遺伝子改変;および少なくとも1種のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼ(NagB)の働きを低下させることができる遺伝子改変;および
B)培養工程A)から産生されるN−アセチル−D−グルコサミン(GlcNAc)を収集する。
A)発酵培地において微生物培養を行い、前記微生物は次を含む:少なくとも1種のビトレオシラヘモグロビン(Vhb)を発現させることができる遺伝子改変;少なくとも1種の微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミンキナーゼ(NanK)の働きを向上させることができる遺伝子改変;少なくとも1種の微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミン−6−リン酸イソメラーゼ(NanE)の働きを向上させることができる遺伝子改変;および少なくとも1種の微生物の中のUDP−N−アセチル−D−グルコサミン2−エピメラーゼ(WecB)の働きを向上させることができる遺伝子改変;および
B)培養工程A)から産生されるN−アセチル−D−グルコサミン(GlcNAc)を収集する。
A)発酵培地において微生物培養を行い、前記微生物は次を含む:少なくとも1種のビトレオシラヘモグロビン(Vhb)を発現させることができる遺伝子改変;少なくとも1種の微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミンキナーゼ(NanK)の働きを向上させることができる遺伝子改変;少なくとも1種の微生物の中のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼ(NagB)の働きを向上させることができる遺伝子改変;および少なくとも1種の微生物の中のUDP−N−アセチル−D−グルコサミン2−エピメラーゼ(WecB)の働きを向上させることができる遺伝子改変;および
B)培養工程A)から産生されるN−アセチル−D−グルコサミン(GlcNAc)を収集する。
好ましくは、前記微生物は、さらに少なくとも1種のグルコサミン6−リン酸シンターゼ(GlmS)の働きを低下させることができる遺伝子改変を含む。
A)発酵培地において微生物培養を行い、前記微生物は次を含む:少なくとも1種のビトレオシラヘモグロビン(Vhb)を発現させることができる遺伝子改変;少なくとも1種の微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミンキナーゼ(NanK)の働きを向上させることができる遺伝子改変;少なくとも1種の微生物の中のグルコサミン6−リン酸シンターゼ(GlmS)の働きを向上させることができる遺伝子改変;少なくとも1種のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼ(NagB)の働きを低下させることができる遺伝子改変;および少なくとも1種の微生物の中のUDP−N−アセチル−D−グルコサミン2−エピメラーゼ(WecB)の働きを向上させることができる遺伝子改変;および
B)培養工程A)から産生されるN−アセチル−D−グルコサミン(GlcNAc)を収集する。
A)発酵培地において微生物培養を行い、前記微生物は次を含む:少なくとも1種のビトレオシラヘモグロビン(Vhb)を発現させることができる遺伝子改変;少なくとも1種の微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミン−6−リン酸イソメラーゼ(NanE)の働きを向上させることができる遺伝子改変;少なくとも1種の微生物の中のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼ(NagB)の働きを向上させることができる遺伝子改変;および少なくとも1種の微生物の中のUDP−N−アセチル−D−グルコサミン2−エピメラーゼ(WecB)の働きを向上させることができる遺伝子改変;および
B)培養工程A)から産生されるN−アセチル−D−グルコサミン(GlcNAc)を収集する。
好ましくは、前記微生物さらに少なくとも1種のグルコサミン6−リン酸シンターゼ(GlmS)の働きを低下させることができる遺伝子改変を含む。
A)発酵培地において微生物培養を行い、前記微生物は次を含む:少なくとも1種のビトレオシラヘモグロビン(Vhb)を発現させることができる遺伝子改変;少なくとも1種の微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミン−6−リン酸イソメラーゼ(NanE)の働きを向上させることができる遺伝子改変;少なくとも1種の微生物の中のグルコサミン6−リン酸シンターゼ(GlmS)の働きを向上させることができる遺伝子改変;少なくとも1種のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼ(NagB)の働きを低下させることができる遺伝子改変;および少なくとも1種の微生物の中のUDP−N−アセチル−D−グルコサミン2−エピメラーゼ(WecB)の働きを向上させることができる遺伝子改変;及び
B)培養工程A)から産生されるN−アセチル−D−グルコサミン(GlcNAc)を収集する。
A)発酵培地において微生物培養を行い、前記微生物は次を含む:少なくとも1種のビトレオシラヘモグロビン(Vhb)を発現させることができる遺伝子改変;少なくとも1種の微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミンキナーゼ(NanK)の働きを向上させることができる遺伝子改変;少なくとも1種の微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミン−6−リン酸イソメラーゼ(NanE)の働きを向上させることができる遺伝子改変;少なくとも1種の微生物の中のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼ(NagB)の働きを向上させることができる遺伝子改変;および少なくとも1種の微生物の中のUDP−N−アセチル−D−グルコサミン2−エピメラーゼ(WecB)の働きを向上させることができる遺伝子改変;および
B)培養工程A)から産生されるN−アセチル−D−グルコサミン(GlcNAc)を収集する。
好ましくは、前記微生物さらに少なくとも1種のグルコサミン6−リン酸シンターゼ(GlmS)の働きを低下させることができる遺伝子改変を含む。
A)発酵培地において微生物培養を行い、前記微生物は次を含む:少なくとも1種のビトレオシラヘモグロビン(Vhb)を発現させることができる遺伝子改変;少なくとも1種の微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミンキナーゼ(NanK)の働きを向上させることができる遺伝子改変;少なくとも1種の微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミン−6−リン酸イソメラーゼ(NanE)の働きを向上させることができる遺伝子改変;少なくとも1種の微生物の中のグルコサミン6−リン酸シンターゼ(GlmS)の働きを向上させることができる遺伝子改変;少なくとも1種のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼ(NagB)の働きを低下させることができる遺伝子改変;および少なくとも1種の微生物の中のUDP−N−アセチル−D−グルコサミン2−エピメラーゼ(WecB)の働きを向上させることができる遺伝子改変;及び
B)培養工程A)から産生されるN−アセチル−D−グルコサミン(GlcNAc)を収集する。
前記好ましい実施形態によれば、さらにC)N−アセチル−D−グルコサミン(GlcNAc)から脱アセチル化してD−グルコサミン塩を得ることを含む。
一つの好ましい実施形態によれば、約pH4.5−約pH8.5下で前記培養工程を行う。より好ましくは、約pH6.7−約pH7.2下で前記培養工程を行う。
本発明のもう一つの実施形態によれば、本発明は微生物に関し、前記微生物は少なくとも1種のビトレオシラヘモグロビン(Vhb)を発現させることができる遺伝子改変を含む。上文はこの遺伝子改変について詳しく説明する。
(1)少なくとも1種の微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミンキナーゼ(NanK)の働きを向上させることができる遺伝子改変;
(2)少なくとも1種の微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミン−6−リン酸イソメラーゼ(NanE)の働きを向上させることができる遺伝子改変;
(3)少なくとも1種の微生物の中のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼ(NagB)の働きを向上させることができる遺伝子改変を含み、好ましくは少なくとも1種のグルコサミン6−リン酸シンターゼ(GlmS)の働きを低下させることができる遺伝子改変;
(4)少なくとも1種の微生物の中のグルコサミン6−リン酸シンターゼ(GlmS)の働きを向上させることができる遺伝子改変を含み、それと同時に少なくとも1種のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼ(NagB)の働きを低下させることができる遺伝子改変;
(5)少なくとも1種の微生物の中のUDP−N−アセチル−D−グルコサミン2−エピメラーゼ(WecB)の働きを向上させることができる遺伝子改変。上文はこの遺伝子改変について詳しく説明する。
(1)少なくとも1種の微生物の中のマンノーストランスポーターEIIM、P/IIIman(ManXYZ)の働きを低下させることができる遺伝子改変;
(2)少なくとも1種の微生物の中のN−アセチルノイラミン酸リア−ゼ(NanA)の働きを低下させることができる遺伝子改変;
(3)少なくとも1種の微生物の中のN−アセチル−D−グルコサミン6−リン酸デアセチラ−ゼ(NagA)の働きを低下させることができる遺伝子改変;
(4)少なくとも1種の微生物の中のN−アセチル−D−グルコサミン特異的酵素IINag(NagE)の働きを低下させることができる遺伝子改変;
(5)少なくとも1種の微生物の中のホスホグルコサミンムタ−ゼ(GlmM)の働きを向上させることができる遺伝子改変;
(6)少なくとも1種の微生物の中の二機能性酵素N−アセチル−D−グルコサミン1−リン酸ウリジルトランスファラーゼ(GlmU)の働きを向上させることができる遺伝子改変。上文はこの遺伝子改変について詳しく説明する。
1.本発明の一つの好ましい実施形態によれば、本発明は微生物に関し、前記微生物は、少なくとも1種のビトレオシラヘモグロビン(Vhb)を発現させることができる遺伝子改変、少なくとも1種の微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミンキナーゼ(NanK)の働きを向上させることができる遺伝子改変を含む。
好ましくは、前記微生物は、さらに少なくとも1種のグルコサミン6−リン酸シンターゼ(GlmS)の働きを低下させることができる遺伝子改変を含む。
5.本発明のもう一つの好ましい実施形態によれば、本発明は微生物に関し、前記微生物は次を含む:少なくとも1種のビトレオシラヘモグロビン(Vhb)を発現させることができる遺伝子改変;少なくとも1種の微生物の中のUDP−N−アセチル−D−グルコサミン2−エピメラーゼ(WecB)の働きを向上させることができる遺伝子改変。
好ましくは、前記微生物は、さらに少なくとも1種のグルコサミン6−リン酸シンターゼ(GlmS)の働きを低下させることができる遺伝子改変を含む。
好ましくは、前記微生物は、さらに少なくとも1種のグルコサミン6−リン酸シンターゼ(GlmS)の働きを低下させることができる遺伝子改変を含む。
好ましくは、前記微生物は、さらに少なくとも1種のグルコサミン6−リン酸シンターゼ(GlmS)の働きを低下させることができる遺伝子改変を含む。
好ましくは、前記微生物は、さらに少なくとも1種のグルコサミン6−リン酸シンターゼ(GlmS)の働きを低下させることができる遺伝子改変を含む。
好ましくは、前記微生物は、さらに少なくとも1種のグルコサミン6−リン酸シンターゼ(GlmS)の働きを低下させることができる遺伝子改変を含む。
好ましくは、前記微生物は、さらに少なくとも1種のグルコサミン6−リン酸シンターゼ(GlmS)の働きを低下させることができる遺伝子改変を含む。
前記微生物は次を含む:少なくとも1種のビトレオシラヘモグロビン(Vhb)を発現させることができる遺伝子改変;少なくとも1種の微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミンキナーゼ(NanK)の働きを向上させることができる遺伝子改変;少なくとも1種の微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミン−6−リン酸イソメラーゼ(NanE)の働きを向上させることができる遺伝子改変;少なくとも1種の微生物の中のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼ(NagB)の働きを向上させることができる遺伝子改変;および少なくとも1種の微生物の中のUDP−N−アセチル−D−グルコサミン2−エピメラーゼ(WecB)の働きを向上させることができる遺伝子改変。
好ましくは、前記微生物は、さらに少なくとも1種のグルコサミン6−リン酸シンターゼ(GlmS)の働きを低下させることができる遺伝子改変を含む。
微生物中の酵素の働きを低下させるという用語は、当該酵素の活性を低下させ、及び/又は、当該酵素の発現を低下させ、それによって微生物の中の当該酵素によって触媒される基質の生成物の量を減少させることを意味する。
以下の実施例は、本発明を単に例示して説明するためのものであり、本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。
特に断りのない限り、実施例で使用される原料および試薬はいずれも市販品である。
この実施例はN−アセチル−D−グルコサミンが取り込まれおよび有益な中間産物が分解されることにかかわる代謝経路を遮断する大腸菌の突然変異株を構築することを記載する。
このような突然変異型宿主菌株を構築するには、その染色体のゲノムのManXYZ、NanA、NagAおよびNagE遺伝子配列を全体的または部分的に削除し、その機能を無効にし、それによってN−アセチル−D−グルコサミンを蓄積させる。
以下、具体的な操作過程について説明する:
マンノーストランスポーターEIIM、P/IIIman(mannose transporter EIIM、P/IIIMan、ManXYZ)はN−アセチル−D−グルコサミンの第二トランスポーターとすることができ、N−アセチル−D−グルコサミンなどのヘキソ−スを細胞内に輸送することができ、それによって細胞外に排出され且つ蓄積するタ−ゲット産物を細胞内に輸送して分解する。ManXYZ遺伝子配列を削除することによって、細胞外のN−アセチル−D−グルコサミンが細胞内に輸送・分解されることを阻害することができる。
1)PCRによってfKanrf断片を増幅させる
fKanrf断片、即ちFRT−Kanr−FRT断片とは、カナマイシン耐性遺伝子(Kanr)の両端にFLP組換え酵素特異的識別子をロ−ドするFRT部位の塩基配列である。
プライマ−を設計する:フォワ−ドプライマ−(mfKanf−F)はSEQ ID NO.1であり、リバ−スプライマ−(mfKanf−R)はSEQ ID NO.2である。
テンプレ−ト:pPic9K。
PCR反応条件:
第1ステップ:94℃で1min変性を行う;
第2ステップ:94℃30s、55℃30s、72℃40s、30回繰り返す;
第3ステップ:72℃で10min伸長を行う。
fKanrfサイズ:1.28kb。そのヌクレオチド配列はSEQ ID NO.3である。
PCR 産物を1%アガロ−スゲル電気泳動によって分離し、精製して断片を回収する。
ホモロジ−ア−ムプライマ−を設計する: ManXYZ配列SEQ ID NO.4によって、設計してManXYZ配列のホモロジ−ア−ムフォワ−ドプライマ−(ManXYZKO−F)SEQ ID NO.5、リバ−スプライマ−(ManXYZKO−R)SEQ ID NO.6を削除する。
テンプレ−ト:増幅されたfKanrf PCR断片。
PCR反応条件:第1ステップ:94℃で1min変性を行う;
第2ステップ:94℃30s、55℃30s、72℃40s、30回繰り返す;
第3ステップ:72℃で10min伸長を行う。
増幅産物:ホモロジ−ア−ム+fKanrf+ホモロジ−ア−ム。
PCR産物をアガロ−スゲル電気泳動により分離し、精製・回収して100ng/μlの線状DNAの完全長PCR断片を得てRed組換えタ−ゲティングに用いる。
先ず、pKD46ベクタ−を大腸菌AT−001の菌株に導入する。そして、調製された標的線形DNA断片を電気的に形質転換し、陽性クロ−ンをスクリーニングする。最後に耐性遺伝子を削除する。
pKD46ベクタ−はRed組換え酵素遺伝子を発現させるプラスミドであり、Exo、BetおよびGamの3個の遺伝子断片を発現させ、3個の遺伝子をアラビノ−スプロモーター下に置き、L−アラビノ−スにより誘導されて過剰に発現することができる。Red組換えによって染色体上のタ−ゲット遺伝子を改変する目的を達成するために、pKD46プラスミドを大腸菌に導入する必要がある。
ii)プラスミドの形質転換を行う:自然沈降された菌体250μlを取り、5μlpKD46プラスミドを加え、−4℃、30min。そして、42℃で1.5min水浴し、SOC培地 0.7mlを加え、30℃で2時間振盪する。0.2mlの菌液を取り、ペニシリン平板に塗布する。30℃で一晩(12−16時間)培養する。モノクロ−ナルを採取し、5ml LB液体培地に加えて培養し、プラスミドを抽出して同定を行う。陽性菌株を保存して必要に備える。
i)電気的形質転換コンピテントセルを作製する:pKD46 Escherichia coli ATCC 27325を含む菌株AT−001をアンピシリン(Amp)LB培地を含む試験管に接種し、250rpmで一晩振盪し、翌日1%の量でAmpを含むLB培地に接種し、30℃で培養し、OD600が約0.2に達した後、OD600が約0.4に達するまで、0.2%のL−アラビノ−スを加え、30℃で35分間誘導する。氷浴で冷却する。超純水で1回洗浄し、10%グリセリンで2回洗浄し、最後に10%グリセリンで再懸濁させ、グリセリンの用量は、菌体を500−1000倍の最終濃度に濃縮させる量であることが好ましい。
ii)電気ショック形質転換:2mm電気ショック形質転換用カップを70%エタノ−ルから取り出し、滅菌超純水で2回洗浄し、紫外線ランプで30分間照射する。4℃で30分間予備冷却する。90μlの最終的に再懸濁された細胞を取り、予備冷却用遠心管に移し、5μl(100ng以上)のステップ(1)で得られる完全長PCR断片(線形DNA)を加え、ガンでやさしく吸って均一つに混合させ、30分間氷浴する。
電気的形質転換パラメ−タ:2500V、200Ω、25μF。
iii)陽性クロ−ンの蘇生およびスクリーニング:1mlのLB液体培地を加え、37℃、100rpm、1時間。そして200μlを1つのカナマイシン(Kan)平板に塗布し、全部で5つの平板である。均一に塗布し、乾燥させる。30℃で24時間培養する。カナマイシン耐性下で成長するクロ−ンを採取し、PCR同定を行い、陽性クロ−ンをスクリーニングする。
得られる菌株の番号:AT−002−01(AT−001、△ManXYZ::fKanrf)。
今後の研究のために、得られる菌株(陽性クロ−ン)の中の耐性遺伝子を削除することができる。耐性遺伝子の削除はpCP20プラスミドによって実現される。pCP20 はアンピシリンおよびクロラムフェニコ−ルの耐性遺伝子を持つプラスミドであり、熱誘導後FLP組換え酵素を発現させることができ、当該酵素はFRT部位を特異的に識別することができ、組換えによってFRT部位間の配列を削除し、FRT部位を一つだけ残すことができる。
得られる菌株の番号:AT−002−02(AT−001、△ManXYZ)。
N−アセチルノイラミン酸リア−ゼ(N−acetylneuraminate lyase、NanA)は微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミン(ManNAc)をN−アセチル−D−ノイラミン酸(Neu5Ac)に分解することができる。NanKETAオペロンの中のNanA遺伝子配列を削除することにより、N−アセチル−D−マンノサミン(ManNAc)からN−アセチル−D−ノイラミン酸(Neu5Ac)への分解を阻害することができる。
ホモロジ−ア−ムプライマ−を設計する: NanE−NanK前半のNanA配列 SEQ ID NO.7により、NanA配列が削除されるホモロジ−ア−ムプライマ−を設計する:フォワ−ドプライマ−(NanAKO−F)はSEQ ID NO.8であり、リバ−スプライマ−(NanAKO−R)はSEQ ID NO.9である。
テンプレ−ト:増幅されたfKanrf PCR断片。
PCR反応条件:
第1ステップ:94℃で1min変性を行う;第2ステップ:94℃30s、55℃30s、72℃40s、30回繰り返す;第3ステップ:72℃で10min伸長を行う。
増幅産物:ホモロジ−ア−ム+fKanrf+ホモロジ−ア−ム。
PCR産物をアガロ−スゲル電気泳動により分離し、精製・回収して100ng/μlの線状DNAの完全長PCR断片を得てRed組換えタ−ゲティングに用いる。
先ず、pKD46ベクタ−を大腸菌AT−002−02の菌株に導入する。そして、調製された標的線形DNA断片を電気的に形質転換し、陽性クロ−ンをスクリーニングする。最後に耐性遺伝子を削除する。
i)コンピテントセルを作製する:先ず、−20℃で保存されるEscherichia coli AT−002−02(AT−001、△ManXYZ)菌液を、1:50−100で10ml LB液体培地に接種し、37℃、225rpm、2−3時間振盪培養する。そして培養液を10ml遠心管に入れ、4000g×5min、上清を捨て、氷浴用0.1M CaCl2 5mlに5min懸濁させる。最後に4000g×5min遠心分離し、上清を捨て、氷浴用0.1M CaCl2 5mlに懸濁させる。−4℃で12時間放置し、自然沈降させる。
ii)プラスミドの形質転換を行う:自然沈降された菌体250μlを取り、5μlpKD46プラスミドを加え、−4℃、30min。そして、42℃で1.5min水浴し、SOC培地 0.7mlを加え、30℃で2時間振盪する。0.2mlの菌液を取り、ペニシリン平板に塗布する。30℃で一晩(12−16時間)培養する。モノクロ−ナルを採取し、5ml LB液体培地に加えて培養し、プラスミドを抽出して同定を行う。陽性菌株を保存して必要に備える。
i)電気的形質転換コンピテントセルを作製する: pKD46 Escherichia coliを含む菌株AT−002−02をアンピシリン(Amp)LB培地を含む試験管に接種し、250rpmで一晩振盪し、翌日1%の量でAmpを含むLB培地に接種し、30℃で培養し、OD600が約0.2に達した後、0.2%のL−アラビノ−スを加え、OD600が約0.4に達するまで、30℃で35分間誘導する。氷浴で冷却する。超純水で1回洗浄し、10%グリセリンで2回洗浄し、最後に10%グリセリンで再懸濁させ、グリセリンの用量は菌体を500−1000倍の最終濃度に濃縮させることが好ましい。
ii)電気ショック形質転換: 2mm電気ショック形質転換用カップを70%エタノ−ルから取り出し、滅菌超純水で2回洗浄し、紫外線ランプで30分間照射する。4℃で30分間予備冷却する。90μlの最終的に再懸濁された細胞を取り、予備冷却用遠心管に移し、5μl(100ng以上)のステップ(1)で得られる完全長PCR断片(線形DNA)を加え、ガンでやさしく吸って均一つに混合させ、30分間氷浴する。電気的形質転換パラメ−タ:2500V、200Ω、25μF。
iii)陽性クロ−ンの蘇生およびスクリーニング: 1mlのLB液体培地を加え、37℃、100rpm、1時間。そして200μlを1つのカナマイシン(Kan)平板に塗布し、全部で5つの平板である。均一に塗布し、乾燥させる。30℃で24時間培養する。カナマイシン耐性下で成長するクロ−ンを採取し、PCR同定を行い、陽性クロ−ンをスクリーニングする。
得られる菌株の番号: AT−003−01(AT−002−02、△NanA::fKanrf)。
pCP20を前記カナマイシン耐性クロ−ンに導入し、30℃で8h培養し、そして42℃で一晩放置し、熱誘導によりFLP 組換え酵素を発現させ、プラスミドを徐々に失わせる。シクロスポリン接種液を、抗生物質を含まない培地に詰め、成長したモノクロ−ナルを選んでカナマイシン耐性平板に滴下し、成長しないものはカナマイシン耐性遺伝子がFLP組換え酵素に削除されるクロ−ンである。同定用プライマ−を使ってPCRを行ってカナマイシン耐性が消失したクロ−ンに対して同定を行う。
得られる菌株の番号:AT−003−02(AT−002−02、△NanA)。
N−アセチル−D−グルコサミン6−リン酸デアセチラ−ゼ(N−acetylGlucosamine−6−phosphate deacetylase、NagA)は微生物の中のN−アセチル−D−グルコサミン6−リン酸(GlcNAc−6−P)をD−グルコサミン6−リン酸(GlcN−6−P)に変換することができる。nagオペロン(NagE−NagBACD)の中のNagA遺伝子配列を削除することにより、N−アセチル−D−グルコサミン6−リン酸(GlcNAc−6−P)からD−グルコサミン6−リン酸(GlcN−6−P)への変換を阻害することができる。
ホモロジ−ア−ムプライマ−を設計する: NCBI からNC_000913、Escherichia coli str. K−12 N−アセチル−D−グルコサミン6−リン酸デアセチラ−ゼの遺伝子NagA配列SEQ ID NO.10を見つけ、NagA配列が削除されるホモロジ−ア−ムプライマ−を設計する:フォワ−ドプライマ−(NagAKO−F)はSEQ ID NO.11であり、リバ−スプライマ−(NagAKO−R)はSEQ ID NO.12である。
テンプレ−ト:増幅されたfKanrf PCR断片。
PCR反応条件:
第1ステップ:94℃で1min変性を行う;第2ステップ:94℃30s、55℃30s、72℃40s、30回繰り返す;第3ステップ:72℃で10min伸長を行う。
増幅産物:ホモロジ−ア−ム+fKanf+ホモロジ−ア−ム。
PCR産物をアガロ−スゲル電気泳動により分離し、精製・回収して100ng/μlの線状DNAの完全長PCR断片を得てRed組換えタ−ゲティングに用いる。
先ず、pKD46ベクタ−を大腸菌AT−003−02の菌株に導入する。そして、調製された標的線形DNA断片を電気的に形質転換し、陽性クロ−ンをスクリーニングする。最後に耐性遺伝子を削除する。
i)コンピテントセルを作製する:先ず、−20℃で保存されるEscherichia coli AT−003−02(AT−002−02、△NanA)菌液を、1:50−100で10ml LB液体培地に接種し、37℃、225rpm、2−3時間振盪培養する。そして培養液を10ml遠心管に入れ、4000g×5min、上清を捨て、氷浴用0.1M CaCl2 5mlに5min懸濁させる。最後に4000g×5min遠心分離し、上清を捨て、氷浴用0.1M CaCl2 5mlに懸濁させる。−4℃で12時間放置し、自然沈降させる。
ii)プラスミドの形質転換を行う:自然沈降された菌体250μlを取り、5μl pKD46プラスミドを加え、−4℃、30min。そして、42℃で1.5min水浴し、SOC培地 0.7mlを加え、30℃で2時間振盪する。0.2mlの菌液を取り、ペニシリン平板に塗布する。30℃で一晩(12−16時間)培養する。モノクロ−ナルを採取し、5ml LB液体培地に加えて培養し、プラスミドを抽出して同定を行う。陽性菌株を保存して必要に備える。
i)電気的形質転換コンピテントセルを作製する:pKD46 Escherichia coliを含む菌株AT−003−02をアンピシリン(Amp)LB培地を含む試験管に接種し、250rpmで一晩振盪し、翌日1%の量でAmpを含むLB培地に接種し、30℃で培養し、OD600が約0.2に達した後、0.2%のL−アラビノ−スを加え、OD600が約0.4に達するまで30℃で35分間誘導する。氷浴で冷却する。超純水で1回洗浄し、10%グリセリンで2回洗浄し、最後に10%グリセリンで再懸濁させ、グリセリンの用量は菌体を500−1000倍の最終濃度に濃縮させることが好ましい。
ii)電気ショック形質転換: 2mm電気ショック形質転換用カップを70%エタノ−ルから取り出し、滅菌超純水で2回洗浄し、紫外線ランプで30分間照射する。4℃で30分間予備冷却する。90μlの最終的に再懸濁された細胞を取り、予備冷却用遠心管に移し、5μl(100ng以上)のステップ(1)で得られる完全長PCR断片(線形DNA)を加え、ガンでやさしく吸って均一つに混合させ、30分間氷浴する。
電気的形質転換パラメ−タ:2500V、200Ω、25μF。
iii)陽性クロ−ンの蘇生およびスクリーニング: 1mlのLB液体培地を加え、37℃、100rpm、1時間。そして200μlを1つのカナマイシン(Kan)平板に塗布し、全部で5つの平板である。均一に塗布し、乾燥させる。30℃で24時間培養する。カナマイシン耐性下で成長するクロ−ンを採取し、PCR同定を行い、陽性クロ−ンをスクリーニングする。
得られる菌株の番号: AT−004−01(AT−003−02、△NagA::fKanrf)。
pCP20を前記カナマイシン耐性クロ−ンに導入し、30℃で8h培養し、そして42℃で一晩放置し、熱誘導によりFLP 組換え酵素を発現させ、プラスミドを徐々に失わせる。シクロスポリン接種液を、抗生物質を含まない培地に詰め、成長したモノクロ−ナルを選んでカナマイシン耐性平板に滴下し、成長しないものはカナマイシン耐性遺伝子がFLP組換え酵素に削除されるクロ−ンである。同定用プライマ−を使ってPCRを行ってカナマイシン耐性が消失したクロ−ンに対して同定を行う。
得られる菌株の番号: AT−004−02(AT−003−02、△NagA)。
N−アセチル−D−グルコサミン特異的酵素IINag(N−acetyl−Glucosamine−specific enzyme IINag、NagE)の遺伝子配列NagEを削除することにより、細胞外のGlcNAcが細胞内に輸送されて分解することを阻害することができる。
ホモロジ−ア−ムプライマ−を設計する: NCBI からNC_000913、Escherichia coli str. K−12 NagBプロモーターとNagE遺伝子配列SEQ ID NO.13を見つけ、NagE遺伝子配列が削除されるホモロジ−ア−ムフォワ−ドプライマ−(NagEKO−F1)SEQ ID NO.14、リバ−スプライマ−(NagEKO−R1)SEQ ID NO.15を設計する。
テンプレ−ト:増幅されたfKanrf PCR断片。
PCR反応条件:
第1ステップ:94℃で1min変性を行う。
第2ステップ:94℃30s、55℃30s、72℃40sを30回繰り返す。
第3ステップ:72℃で10min伸長を行う。
増幅産物:ホモロジ−ア−ム+fKanrf +ホモロジ−ア−ム。
PCR産物をアガロ−スゲル電気泳動により分離し、精製・回収して100ng/μlの線状DNAの完全長PCR断片を得てRed組換えタ−ゲティングに用いる。
先ず、pKD46ベクタ−を大腸菌AT−004−02の菌株に導入する。そして、調製された標的線形DNA断片を電気的に形質転換し、陽性クロ−ンをスクリーニングする。最後に耐性遺伝子を削除する。
i)コンピテントセルを作製する:先ず、−20℃で保存されるEscherichia coli AT−004−02(AT−003−02、△NagA)菌液を、1:50−100で10ml LB液体培地に接種し、37℃、225rpm、2−3時間振盪培養する。そして培養液を10ml遠心管に入れ、4000g×5min、上清を捨て、氷浴用0.1M CaCl2 5mlに5min懸濁させる。最後に4000g×5min遠心分離し、上清を捨て、氷浴用0.1M CaCl2 5mlに懸濁させる。−4℃で12時間放置し、自然沈降させる。
ii)プラスミドの形質転換を行う:自然沈降された菌体250μlを取り、5μl pKD46プラスミドを加え、−4℃、30min。そして、42℃で1.5min水浴し、SOC培地 0.7mlを加え、30℃で2時間振盪する。0.2mlの菌液を取り、ペニシリン平板に塗布する。30℃で一晩(12−16時間)培養する。モノクロ−ナルを採取し、5ml LB液体培地に加えて培養し、プラスミドを抽出して同定を行う。陽性菌株を保存して必要に備える。
i)電気的形質転換コンピテントセルを作製する: pKD46 Escherichia coliを含む菌株AT−004−02をアンピシリン(Amp)LB培地を含む試験管に接種し、250rpmで一晩振盪し、翌日1%の量でAmpを含むLB培地に接種し、30℃で培養し、待OD600が約0.2に達した後、0.2%のL−アラビノ−スを加え、OD600が約0.4に達するまで30℃で35分間誘導する。氷浴で冷却する。超純水で1回洗浄し、10%グリセリンで2回洗浄し、最後に10%グリセリンで再懸濁させ、グリセリンの用量は菌体を500−1000倍の最終濃度に濃縮させることが好ましい。
ii)電気ショック形質転換: 2mm電気ショック形質転換用カップを70%エタノ−ルから取り出し、滅菌超純水で2回洗浄し、紫外線ランプで30分間照射する。4℃で30分間予備冷却する。90μlの最終的に再懸濁された細胞を取り、予備冷却用遠心管に移し、5μl(100ng以上)のステップ(1)で得られる完全長PCR断片(線形DNA)を加え、ガンでやさしく吸って均一つに混合させ、30分間氷浴する。電気的形質転換パラメ−タ:2500V、200Ω、25μF。
iii)陽性クロ−ンの蘇生およびスクリーニング: 1mlのLB液体培地を加え、37℃、100rpm、1時間。そして200μlを1つのカナマイシン(Kan)平板に塗布し、全部で5つの平板である。均一に塗布し、乾燥させる。30℃で24時間培養する。カナマイシン耐性下で成長するクロ−ンを採取し、PCR同定を行い、陽性クロ−ンをスクリーニングする。
得られる菌株の番号: AT−005−01(AT−004−02、△NagE::fKanrf)。
pCP20を前記カナマイシン耐性クロ−ンに導入し、30℃で8h培養し、そして42℃で一晩放置し、熱誘導によりFLP 組換え酵素を発現させ、プラスミドを徐々に失わせる。シクロスポリン接種液を、抗生物質を含まない培地に詰め、成長したモノクロ−ナルを選んでカナマイシン耐性平板に滴下し、成長しないものはカナマイシン耐性遺伝子がFLP組換え酵素に削除されるクロ−ンである。同定用プライマ−を使ってPCRを行ってカナマイシン耐性が消失したクロ−ンに対して同定を行う。
得られる菌株の番号:AT−005−02(AT−004−02,△NagE)。
この実施例はN−アセチル−D−マンノサミンキナーゼ(NanK)の遺伝子NanKのクロ−ン化および大腸菌におけるNanK/ptrc99Aプラスミドの形質転換、並びにptrc− NanK遺伝子カセットの大腸菌染色体への組込みについて説明する。
Escherichia coli NanK(N−acetylmannosamine kinase、N−アセチル−D−マンノサミンキナーゼ)の遺伝子NanKを増幅させ、Trcプロモーター制御下で菌株の形質転換を行い、それを過剰に発現させることにより、ManNAc(N−acetyl−D−mannosamine、N−アセチル−D−マンノサミンまたはN−アセチル−D−マンノサミン)からManNAc−6−P(N−acetyl−D−mannosamine−6−P、N−アセチル−D−マンノサミン−6−リン酸)へのリン酸化を増強させることができる。
NCBI からU00096を見つけ、Escherichia coli NanK遺伝子のヌクレオチド配列SEQ ID NO.16、そのアミノ酸配列SEQ ID NO.17が得られる。
プライマ−を設計する:フォワ−ドプライマ−(NanK−F)はSEQ ID NO.18であり、リバ−スプライマ−(NanK−R)はSEQ ID NO.19である。
テンプレ−ト:Escherichia coli AT−001。
PCR反応条件:第1ステップ:94℃で1min変性を行う;第2ステップ:94℃30s、55℃30s、72℃40s、30回繰り返す;第3ステップ:72℃で10min伸長を行う。
増幅産物サイズ:0.9kb。
PCR 産物を1%アガロ−スゲル電気泳動によって分離し、精製して断片を回収する。
得られるPCR増幅断片とpUC57−Tベクタ−を連結して配列決定・同定を行い、NanK/pUC57が得られる。
i)プラスミドの構築:プラスミドNanK/pUC57を増幅させ、それぞれ酵素Nco IとHindIIIを使ってプラスミドNanK/pUC57とベクタ−ptrc99Aを切断し、アガロ−スゲル電気泳動によって分離させ、精製してNanK断片とptrc99A断片を回収し、T4 DNAで酵素を連結し、16℃で一晩放置し、且つ同定を行い、NanK/ptrc99Aプラスミドが得られる。
ii)コンピテントセルを作製する:先ず、−20℃で保存されるAT−005−02菌液を、1:50−100で10ml LB液体培地に接種し、37℃、225rpm、2−3時間振盪培養する。そして培養液を10ml遠心管に入れ、4000g×5min、上清を捨て、氷浴用0.1M CaCl2 5mlに5min懸濁させる。最後に4000g×5min遠心分離し、上清を捨て、氷浴用0.1M CaCl2 5mlに懸濁させる。−4℃で12時間放置し、自然沈降させる。
iii)プラスミドの形質転換を行う:自然沈降後の菌体を250μl取り、5μl NanK/ptrc99Aプラスミドに加え、−4℃、30min。そして、42℃で1.5min水浴し、SOC培地 0.7mlを加え、30℃で2時間振盪する。0.2mlの菌液を取り、ペニシリン平板に塗布する。30℃で一晩(12−16時間)培養し。モノクロ−ナルを採取し、5ml LB液体培地に入れて培養し、プラスミドを抽出して同定を行う。陽性菌株を保存して必要に備える。組換え菌 NanK/ptrc99A(AT−005−02)が得られる。
組換え菌 NanK/ptrc99A(AT−005−02)と対照菌株に対して、フラスコ振盪発酵試験を行う。新鮮培養されるLB平板培地上のモノクロ−ナル菌株を取り、3mlのLB液体培地付き試験管(13×150mm)に接種し、30℃、225rpm、約8時間培養する。LB液体培地の成分は以下のとおりである:
緩衝液:将3.5gリン酸水素二カリウムを1Lフラスコに入れ、水を加えて十分に溶解させ、0.25 mlアンモニア水を加え、そして水で希釈し、リン酸でpHを7.5に調整し、水で定容する。
移動相:アセトニトリル:緩衝液(75:25)。
希釈剤:アセトニトリルと水(50:50)。
標準溶液:1.0mg/ml USP N−アセチル−D−グルコサミン標準品(RS)を希釈剤に溶解する。
試料溶液:1.0mg/ml N−アセチル−D−グルコサミン試料を希釈剤に溶解する。
液相条件: 型番:LC 検出器:UV 195 nm
カラム:4.6−mm×15−cm; 3−μm packing L8
流速:1.5ml/min
カラム温度:35℃
注入量:10μl
ii)M9培養液の調製
先ず5×M9培地を調製する:約800mlの二重蒸留水(ddH2O)に64g Na2HPO47H2O、15g KH2PO4、2.5g NaCl、5.0g NH4Clを加え、溶解した後、水を加えて1000mlとする。121℃で30分間滅菌する。そしてそれぞれ1M MgSO4、1M CaCl2、20% グルコ−スを調製し、且つ別々に滅菌する。そして表1に従ってM9培養液を調製し、そのうち、1000×微量元素溶液は表2に従って調製される。
フラスコ発酵の収率を表3に示す。結果により、対照菌株AT−005−02の収率が非常に低く、検出されず、NanK遺伝子がTrcプロモーター制御下で過剰発現する組換え菌NanK/ptrc99A(AT−005−02)の収率が著しく向上することが示唆される。
NagE遺伝子部位をptrc−NanK 遺伝子カセットの染色体での組込み部位とする。ptrc−NanK 遺伝子カセットの大腸菌染色体への組込みを実現するために、先ず、Trcプロモーター付きのNanK断片ptrc−NanK、および両端にFLP 組換え酵素識別部位(FRT 部位)を有するカナマイシン耐性遺伝子断片:FRT−Kanr−FRT (fKanrf)を増幅させ、且つ連結する。そして、もう一度設計してNagE遺伝子配列ホモロジ−ア−ムのプライマ−を削除し、且つptrc−NanKとfKanrfで連結される断片をテンプレ−トとし、Red組換え標的線形DNA完全長断片を増幅させる。
(1)PCRによりptrc−NanK断片を増幅させる
テンプレ−ト:NanK/ptrc99A。
プライマ−を設計する:フォワ−ドプライマ−(Trcff−F)はSEQ ID NO.20であり、リバ−スプライマ−(Trcff−R)はSEQ ID NO.21である。
PCR反応条件:
第1ステップ:94℃で1min変性を行う。
第2ステップ:94℃30s、55℃30s、72℃40s、30回繰り返す。
第3ステップ:72℃で10min伸長を行う。
産物サイズ:1.05kb。
PCR 産物を1%アガロ−スゲル電気泳動によって分離し、精製して断片を回収する。
プライマ−を設計する:フォワ−ドプライマ−(mfKanf−F)はSEQ ID NO.1であり、リバ−スプライマ−(mfKanf−R)はSEQ ID NO.2である。
テンプレ−ト:pPic9K。
PCR反応条件:
第1ステップ:94℃で1min変性を行う。
第2ステップ:94℃30s、55℃30s、72℃40s、30回繰り返す。
第3ステップ:72℃で10min伸長を行う。
fKanrfサイズ:1.28kb。そのヌクレオチド配列はSEQ ID NO.3である。
PCR 産物を1%アガロ−スゲル電気泳動によって分離し、精製して断片を回収する。
プライマ−を設計する:フォワ−ドプライマ−(fKanf−F)はSEQ ID NO.22であり、リバ−スプライマ−(fKanf−R)はSEQ ID NO.231である。
テンプレ−ト:fKanrf。
PCR反応条件:
第1ステップ:94℃で1min変性を行う。
第2ステップ:94℃30s、55℃30s、72℃40s、30回繰り返す。
第3ステップ:72℃で10min伸長を行う。
二次増幅されるfKanrfのサイズ:1.3kb。
ホモロジ−ア−ムプライマ−を設計する:もう一度設計してNagE遺伝子配列ホモロジ−ア−ムのフォワ−ドプライマ−(NagEKO−F2)SEQ ID NO.24、リバ−スプライマ−(NagEKO−R2)SEQ ID NO.25を削除する。
テンプレ−ト:ptrc−NanK PCR断片と二次増幅されるfKanrf PCR断片、1:1で混合する。
PCR反応条件:
第1ステップ:94℃で1min変性を行う。
第2ステップ:94℃30s、55℃30s、72℃40s、30回繰り返す。
第3ステップ:72℃で10min伸長を行う。
増幅産物:ホモロジ−ア−ム+ ptrc−NanK−fKanrf+ホモロジ−ア−ム。
PCR産物をアガロ−スゲル電気泳動により分離し、精製・回収して100ng/μlの線状DNAの完全長PCR断片を得てRed組換えタ−ゲティングに用いる。
先ず、pKD46ベクタ−を大腸菌AT−004−02の菌株に導入する。そして、調製された標的線形DNA断片を電気的に形質転換し、陽性クロ−ンをスクリーニングする。最後に耐性遺伝子を削除する。
i)コンピテントセルを作製する:先ず、−20℃で保存されるEscherichia coli AT−004−02菌液を、1:50−100で10ml LB液体培地に接種し、37℃、225rpm、2−3時間振盪培養する。そして培養液を10ml遠心管に入れ、4000g×5min、上清を捨て、氷浴用0.1M CaCl2 5mlに5min懸濁させる。最後に4000g×5min遠心分離し、上清を捨て、氷浴用0.1M CaCl2 5mlに懸濁させる。−4℃で12時間放置し、自然沈降させる。
ii)プラスミドの形質転換を行う:自然沈降された菌体250μlを取り、5μl pKD46プラスミドを加え、−4℃、30min。そして、42℃で1.5min水浴し、SOC培地 0.7mlを加え、30℃で2時間振盪する。0.2mlの菌液を取り、ペニシリン平板に塗布する。30℃で一晩(12−16時間)培養する。モノクロ−ナルを採取し、5ml LB液体培地に加えて培養し、プラスミドを抽出して同定を行う。陽性菌株を保存して必要に備える。
i)電気的形質転換コンピテントセルを作製する:pKD46 Escherichia coliを含む菌株AT−004−02をアンピシリン(Amp)LB培地を含む試験管に接種し、250rpmで一晩振盪し、翌日1%の量でAmpを含むLB培地に接種し、30℃で培養し、OD600が約0.2に達した後、0.2%のL−アラビノ−スを加え、OD600が約0.4に達するまで30℃で35分間誘導する。氷浴で冷却する。超純水で1回洗浄し、10%グリセリンで2回洗浄し、最後に10%グリセリンで再懸濁させ、グリセリンの用量は菌体を500−1000倍の最終濃度に濃縮させることが好ましい。
ii)電気ショック形質転換:2mm形質転換用カップを70%エタノ−ルから取り出し、滅菌超純水で2回洗浄し、紫外線ランプで30分間照射する。4℃で30分間予備冷却する。90μlの最終的に再懸濁された細胞を取り、予備冷却用遠心管に移し、5μl(100ng以上)のステップ(1)で得られる完全長PCR断片(線形DNA)を加え、ガンでやさしく吸って均一つに混合させ、30分間氷浴する。電気的形質転換パラメ−タ::2500V、200Ω、25μF。
iii)陽性クロ−ンの蘇生およびスクリーニング: 1mlのLB液体培地を加え、37℃、100rpm、1時間。そして200μlを1つのカナマイシン(Kan)平板に塗布し、全部で5つの平板である。均一に塗布し、乾燥させる。30℃で24時間培養する。カナマイシン耐性下で成長するクロ−ンを採取し、PCR同定を行い、陽性クロ−ンをスクリーニングする。
得られる菌株の番号: AT−006−01(AT−004−02、△NagE::ptrc−NanK−fKanrf)。
pCP20を前記カナマイシン耐性クロ−ンに導入し、30℃で8h培養し、そして42℃で一晩放置し、熱誘導によりFLP 組換え酵素を発現させ、プラスミドを徐々に失わせる。シクロスポリン接種液を、抗生物質を含まない培地に詰め、成長したモノクロ−ナルを選んでカナマイシン耐性平板に滴下し、成長しないものはカナマイシン耐性遺伝子がFLP組換え酵素に削除されるクロ−ンである。同定用プライマ−を使ってPCRを行ってカナマイシン耐性が消失したクロ−ンに対して同定を行う。
得られる菌株の番号: AT−006−02(AT−004−02,△NagE::ptrc−NanK)。
染色体のNagE遺伝子部位においてptrc−NanK遺伝子カセットが組込まれる組換え菌AT−006−02と対照菌株に対して、フラスコ発酵試験を行う。新鮮培養されるLB平板培地上のモノクロ−ナル菌株を取り、3mlのLB液体培地付き試験管(13×150mm)に接種し、30℃、225rpm、約8時間培養する。そして種培養液を取り、3%を50mlの発酵培養液(M9培養液)を含む250mlフラスコに接種する。初期OD600 は約0.5であり、37℃、225rpmで培養し、発酵サイクルは72時間である。24時間目、48時間目、10M NaOHを使って発酵液のpHを7.0に調整する。据発酵液の糖分消費状況により、65%グルコ−ス溶液を数回に分けて加えてグルコ−ス濃度を20g/lに維持する。発酵が終了し、1mlの発酵液を取り、遠心分離する。HPLC法によってN−アセチル−D−グルコサミン含量を測定する。
本実施例は突然変異するN−アセチル−D−マンノサミンキナーゼ(NanK)の遺伝子のスクリーニングについて説明し、前記遺伝子は酵素活性を向上させるN−アセチル−D−マンノサミンキナーゼ(NanK)をコードする。
さらに生産菌株の中のN−アセチル−D−グルコサミン合成量を向上させるため、酵素活性を向上させるN−アセチル−D−マンノサミンキナーゼ(NanK)をコードする遺伝子の突然変異体をスクリーニングする。当該目的を達成するため、エラ−プロ−ンPCR技術によってクロ−ン化した遺伝子を増幅させ、増幅に用いるDNA ポリメラ−ゼにより、ミスマッチが高頻度に生じる条件下で前記遺伝子を増幅させ、それによってPCR産物から突然変異が高頻度で得られる。
具体的な操作手順は次のとおりである:
Taq DNAポリメラ−ゼが3’ −5’校正機能を持たない性質を利用し、高マグネシウムイオン濃度(8mmol/L)およびdNTP濃度の異なる濃度 (そのうち、dATPとdGTPの濃度は1.5mmol/Lである;dTTPとdCTPの濃度は3.0mmol/Lである)下で、ランダム突然変異の頻度を制御し、タ−ゲット遺伝子にランダム突然変異を導入し、突然変異ライブラリ−を構築する;テンプレ−ト濃度のA260値は1000ng/mlであり、酵素の濃度は5U/μlであり、プライマ−の濃度は100μMである。
エラ−プロ−ンPCR反応系(50μl):10×PCR反応緩衝液5μl、dNTP(2.5mM)5μl、MgCl2(25mM)5μl、フォワ−ドプライマ−(NanK−F、SEQ ID NO.18)1μl、リバ−スプライマ−(NanK−R、SEQ ID NO.19)1μl、DNAテンプレ−ト(NanK/pUC57)0.1μl、Taq DNAポリメラ−ゼ0.5μl、ddH2O 32.4μl。
PCR 手順:96℃で4min予備変性を行う;94℃で1min変性を行い、56℃で1minアニ−リングを行い、75℃で2min伸長を行い、45サイクル;最後に75℃で15min伸長を行い、ゲル回収法によりPCR産物(産物サイズ:0.9kb)を回収する;5μl産物を取って1%アガロ−スゲル電気泳動を行い、−20℃で保存して必要に備える。
前記PCR産物は制限エンドヌクレア−ゼNco IとHind IIIの二重消化によって消化された後、Nco IとHind IIIエンドヌクレア−ゼで消化されたptrc99Aプラスミドとライゲ−ション反応を行い、そしてライゲ−ション産物の混合物によって大腸菌 AT−005−02の形質転換を行い、大量のクロ−ン化した形質転換体が得られ、形質転換菌体の突然変異ライブラリ−を構築する。
形質転換菌体突然変異ライブラリ−から、300個の突然変異するクロ−ンを無作為に選び、野生型NanK/ptrc99A(AT−005−02)を対照菌株とし、それぞれ50μg/mlペニシリン(Amp)を含む5ml LB培地に接種し、37℃、150rpmで18h培養した後、10000rpmで5min遠心分離し、菌体を収集する。上清を捨てた後、4℃で1ml PBS(pH値7.5、10Mmol/L)溶液に再懸濁させ、氷浴条件下で300Vの電圧を選び、6s 間隔で超音波を3s出して10Min超音波破砕を行い、遠心分離して上清を取って酵素粗抽出液とし、酵素活性測定を行う。
NagE遺伝子部位をptrc−NanKM 遺伝子カセットの染色体での組込み部位とする。ptrc−NanKM 遺伝子カセットの大腸菌染色体への組込みを実現するために、先ず、Trcプロモーター付きのNanKM断片ptrc−NanKM、および両端にFLP 組換え酵素識別部位(FRT 部位)を有するカナマイシン耐性遺伝子断片:FRT−Kanr−FRT (fKanrf)を増幅させ、且つ連結する。そして、もう一度設計してNagE遺伝子配列ホモロジ−ア−ムのプライマ−を削除し、且つptrc−NanKMとfKanrfで連結される断片をテンプレ−トとし、Red組換え標的線形DNA完全長断片を増幅させる。
テンプレ−ト:NanKM/ptrc99A。
プライマ−を設計する:フォワ−ドプライマ−(Trcff−F)はSEQ ID NO.20であり、リバ−スプライマ−(Trcff−R)はSEQ ID NO.21である。
PCR反応条件:
第1ステップ:94℃で1min変性を行う。
第2ステップ:94℃30s、55℃30s、72℃40s、30回繰り返す。
第3ステップ:72℃で10Min伸長を行う。
産物サイズ:1.05kb。
PCR 産物を1%アガロ−スゲル電気泳動によって分離し、精製して断片を回収する。
プライマ−を設計する:フォワ−ドプライマ−(mfKanf−F)はSEQ ID NO.1であり、リバ−スプライマ−(mfKanf−R)はSEQ ID NO.2である。
テンプレ−ト:pPic9K。
PCR反応条件:
第1ステップ:94℃で1min変性を行う。
第2ステップ:94℃30s、55℃30s、72℃40s、30回繰り返す。
第3ステップ:72℃で10Min伸長を行う。
fKanrfサイズ:1.28kb。そのヌクレオチド配列はSEQ ID NO.3である。
PCR 産物を1%アガロ−スゲル電気泳動によって分離し、精製して断片を回収する。
テンプレ−ト:fKanrf。
PCR反応条件:第1ステップ:94℃で1min変性を行う;第2ステップ:94℃30s、55℃30s、72℃40s、30回繰り返す;第3ステップ:72℃で10Min伸長を行う。
二次増幅されるfKanrfのサイズ:1.3kb。
PCR 産物を1%アガロ−スゲル電気泳動によって分離し、精製して断片を回収する。
ホモロジ−ア−ムプライマ−を設計する:もう一度設計してNagE遺伝子配列ホモロジ−ア−ムのフォワ−ドプライマ−(NagEKO−F2)SEQ ID NO.24、リバ−スプライマ−(NagEKO−R2)SEQ ID NO.25を削除する。
テンプレ−ト:ptrc−NanK PCR断片と二次増幅されるfKanrf PCR断片、1:1で混合する。
PCR反応条件:
第1ステップ:94℃で1min変性を行う。
第2ステップ:94℃30s、55℃30s、72℃40s、30回繰り返す。
第3ステップ:72℃で10Min伸長を行う。
増幅産物:ホモロジ−ア−ム+ ptrc−NanKM−fKanrf+ホモロジ−ア−ム。
PCR産物をアガロ−スゲル電気泳動により分離し、精製・回収して100ng/μlの線状DNAの完全長PCR断片を得てRed組換えタ−ゲティングに用いる。
先ず、pKD46ベクタ−を大腸菌AT−004−02の菌株に導入する。そして、調製された標的線形DNA断片を電気的に形質転換し、陽性クロ−ンをスクリーニングする。最後に耐性遺伝子を削除する。
i)コンピテントセルを作製する:先ず、−20℃で保存されるEscherichia coli AT−004−02菌液を、1:50−100で10Ml LB液体培地に接種し、37℃、225rpmで、2−3時間振盪培養する。さらに培養液を10Ml遠心管に入れ、4000g×5min、上清を捨て、氷浴用0.1M CaCl2 5mlに5min懸濁させる。最後に4000g×5min遠心分離し、上清を捨て、氷浴用0.1M CaCl2 5mlに懸濁させる。−4℃で12時間放置し、自然沈降させる。
ii)プラスミドの形質転換を行う:自然沈降された菌体250μlを取り、5μl pKD46プラスミドを加え、−4℃、30min。そして、42℃で1.5min水浴し、SOC培地 0.7mlを加え、30℃で2時間振盪する。0.2mlの菌液を取り、ペニシリン平板に塗布する。30℃で一晩(12−16時間)培養する。モノクロ−ナルを採取し、5ml LB液体培地に加えて培養し、プラスミドを抽出して同定を行う。陽性菌株を保存して必要に備える。
i)電気的形質転換コンピテントセルを作製する:pKD46 Escherichia coliを含む菌株AT−004−02をアンピシリン(Amp)LB培地を含む試験管に接種し、250rpmで一晩振盪し、翌日1%の量でAmpを含むLB培地に接種し、30℃で培養し、OD600が約0.2に達した後、0.2%のL−アラビノ−スを加え、OD600が約0.4に達するまで30℃で35分間誘導する。氷浴で冷却する。超純水で1回洗浄し、10%グリセリンで2回洗浄し、最後に10%グリセリンで再懸濁させ、グリセリンの用量は菌体を500−1000倍の最終濃度に濃縮させることが好ましい。
ii)電気ショック形質転換:2mm形質転換用カップを70%エタノ−ルから取り出し、滅菌超純水で2回洗浄し、紫外線ランプで30分間照射する。4℃で30分間予備冷却する。90μlの最終的に再懸濁された細胞を取り、予備冷却用遠心管に移し、5μl(100ng以上)のステップ(1)で得られる完全長PCR断片(線形DNA)を加え、ガンでやさしく吸って均一つに混合させ、30分間氷浴する。
電気的形質転換パラメ−タ::2500V、200Ω、25μF。
iii)陽性クロ−ンの蘇生およびスクリーニング: 1mlのLB液体培地を加え、37℃、100rpm、1時間。そして200μlを1つのカナマイシン(Kan)平板に塗布し、全部で5つの平板である。均一に塗布し、乾燥させる。30℃で24時間培養する。カナマイシン耐性下で成長するクロ−ンを採取し、PCR同定を行い、陽性クロ−ンをスクリーニングする。
得られる菌株の番号: AT−007−01(AT−004−02,△NagE::ptrc−NanKM−fKanrf)。
pCP20を前記カナマイシン耐性クロ−ンに導入し、30℃で8h培養し、そして42℃で一晩放置し、熱誘導によりFLP 組換え酵素を発現させ、プラスミドを徐々に失わせる。シクロスポリン接種液を、抗生物質を含まない培地に詰め、成長したモノクロ−ナルを選んでカナマイシン耐性平板に滴下し、成長しないものはカナマイシン耐性遺伝子がFLP組換え酵素に削除されるクロ−ンである。同定用プライマ−を使ってPCRを行ってカナマイシン耐性が消失したクロ−ンに対して同定を行う。
得られる菌株の番号: AT−007−02(AT−004−02,△NagE::ptrc−NanKM)。
染色体のNagE遺伝子部位においてptrc−NanKM遺伝子カセットが組込まれる組換え菌AT−007−02と対照菌株に対して、フラスコ発酵試験を行う。新鮮培養されるLB平板培地上のモノクロ−ナル菌株を取り、3mlのLB液体培地付き試験管(13×150mm)に接種し、30℃、225rpm、約8時間培養する。そして種培養液を取り、3%を50mlの発酵培養液(M9培養液)を含む250mlフラスコに接種する。初期OD600 は約0.5であり、37℃、225rpmで培養し、発酵サイクルは72時間である。24時間目、48時間目に、10M NaOHを使って発酵液のpHを7.0に調整する。据発酵液の糖分消費状況により、65%グルコ−ス溶液を数回に分けて加えてグルコ−ス濃度を20g/lに維持する。発酵が終了し、1mlの発酵液を取り、遠心分離する。HPLC法によってN−アセチル−D−グルコサミン含量を測定する。
本実施例はptrc−NanKMカセットが組込まれる大腸菌株、特にビトレオシラヘモグロビン(Vhb)を発現させる遺伝子Vhbおよびその突然変異体が、N−アセチル−D−グルコサミン収率に対する影響について説明する。
(1)Vhb遺伝子を増幅させ、且つptrc99Aを挿入する
ビトレオシラヘモグロビン遺伝子のヌクレオチド配列はSEQ ID NO.60であり、アミノ酸配列はSEQ ID NO.61である。Escherichia coliがコドン塩基を優先することにより、ビトレオシラヘモグロビン遺伝子の最適化・合成を行い、pUC57 ベクタ−をロ−ドする。得られたベクタ−はpVS/pUC57と命名される。
プライマ−を設計する:フォワ−ドプライマ−(Vhb−F)はSEQ ID NO.62であり、リバ−スプライマ−(Vhb−R)はSEQ ID NO.63である。
テンプレ−ト: pVS/pUC57。
PCR反応条件:
第1ステップ:94℃で1min変性を行う。
第2ステップ:94℃30s、55℃30s、72℃40sを30回繰り返す。
第3ステップ:72℃で10Min伸長を行う。
増幅産物サイズ:441bp。
PCR 産物を1%アガロ−スゲル電気泳動により分離し、精製して断片を回収する。
得られるPCR増幅断片とベクタ−ptrc99A をそれぞれNco IとHind IIIで消化し、アガロ−スゲル電気泳動により分離し、精製してVhb断片とptrc99A断片を回収し、T4 DNAで酵素を連結し、16℃で一晩放置し、且つ同定を行い、Vhb/ptrc99Aプラスミドが得られる。
1)コンピテントセルを作製する
i)−20℃で保存されるAT−007−02菌液を、1:50−100で10Ml LB液体培地に接種し、37℃、225rpmで、2−3時間振盪培養する。
ii)将養液を10Ml遠心管に入れ、4000g×5min、上清を捨て、氷浴用0.1M CaCl2 5mlで5min懸濁させる。
iii)4000g×5min遠心分離し、上清を捨て、氷浴用0.1M CaCl2 5mlで懸濁させる。−4℃で12時間放置し、自然沈降させる。
2)プラスミドの形質転換を行う
i)自然沈降後の菌体250μlを取り、5μl Vhb/ptrc99Aプラスミドを加え、−4℃、30min。
ii)42℃で1.5min水浴し、SOC培地 0.7mlを加え、30℃で2時間振盪する。
iii)0.2ml菌液を取り、ペニシリン平板に塗布する。
iv)30℃で一晩(12−16時間)培養する。
v)モノクロ−ナルを採取し、5ml LB液体培地に入れて培養し、プラスミドを抽出して同定を行う。
vi)陽性クロ−ンを保存して必要に備える。
得られる菌株の番号:AT−052(AT−007−02,Vhb/ptrc99A)。
さらに生産菌株の中のN−アセチル−D−グルコサミン合成量を向上させるため、活性向上を有するビトレオシラヘモグロビン(Vhb)をコードする遺伝子の突然変異体をスクリーニングする。当該目的を達成するため、エラ−プロ−ンPCR技術でクロ−ン化した遺伝子を増幅させ、増幅に用いるDNA ポリメラ−ゼにより、ミスマッチが高頻度に生じる条件下で前記遺伝子を増幅させ、それによってPCR産物から突然変異が高頻度で得られる。
(1)エラ−プロ−ンPCRによって大腸菌ビトレオシラヘモグロビン遺伝子Vhbを増幅させる
Taq DNAポリメラ−ゼが3' −5'校正機能を持たない性質を利用し、高マグネシウムイオン濃度(8mmol/L)およびdNTP濃度の異なる濃度(そのうち、dATPとdGTPの濃度は1.5mmol/Lである;dTTPとdCTPの濃度は3.0mmol/Lである)下で、ランダム突然変異の頻度を制御し、タ−ゲット遺伝子にランダム突然変異を導入し、突然変異ライブラリ−を構築する;テンプレ−ト濃度のA260値は1000ng/mlであり、酵素の濃度は5U/μlであり、プライマ−の濃度は100μMである。
エラ−プロ−ンPCR反応系(50μl):10×PCR反応緩衝液5μl、dNTP(2.5mM)5μl、MgCl2 (25mM)5μl、フォワ−ドプライマ−(Vhb−F、SEQ ID NO.62)1μl、リバ−スプライマ−(Vhb−R、SEQ ID NO.63)1μl、DNAテンプレ−ト(NanK/pUC57)0.1μl、Taq DNAポリメラ−ゼ0.5μl、ddH2O 32.4μl。
PCR 手順:
96℃で4min予備変性を行う。
94℃で1min変性を行い、56℃で1minアニ−リングを行い、75℃で2min伸長を行い、45サイクル;最後に75℃で15min伸長を行い、ゲル回収法によりPCR産物(産物サイズ:0.9kb)を回収する。
5μl産物を取って1%アガロ−スゲル電気泳動を行い、−20℃で保存して必要に備える。
前記PCR産物は制限エンドヌクレア−ゼNco IとHind IIIの二重消化によって消化された後、Nco IとHind IIIエンドヌクレア−ゼで消化されたptrc99Aプラスミドとライゲ−ション反応を行い、そしてライゲ−ション産物の混合物によって大腸菌 AT−005−02の形質転換を行い、大量のクロ−ン化した形質転換体が得られ、形質転換菌体の突然変異ライブラリ−を構築する。
形質転換菌体突然変異ライブラリ−から、突然変異するクロ−ンを420株無作為に選び、野生型Vhb/ptrc99A(AT−005−02)を対照菌株とし、それぞれ50μg/mlペニシリン(Amp)を含む5ml LB培地に接種し、37℃、150rpmで18h培養した後、10000rpmで、5min遠心分離し、菌体を収集する。上清を捨てた後、4℃で1ml PBS(pH値7.5、10Mmol/L)溶液に再懸濁させ、氷浴条件下で300Vの電圧を選び、6s間隔で超音波を3s出して10Min超音波破砕を行い、遠心分離して上清を取って酵素粗抽出液とし、活性測定を行う。
ビトレオシラヘモグロビン活性測定:CO−差吸収スペクトル法によってビトレオシラヘモグロビン(Vhb)の活性測定を行う。CO とビトレオシラヘモグロビンが結合した後約420nmの光波に強い吸収ピ−クが生じ、典型的なVhbタンパク質の特性曲線が形成され、故にこの吸収ピ−クの強さの測定結果によって、発現したVhhb タンパク質の活性を知ることができる。
スクリーニングにより、活性が最も高い突然変異菌株が得られる。
1)コンピテントセルを作製する
i)−20℃で保存されるAT−007−02菌液を、1:50−100で10Ml LB液体培地に接種し、37℃、225rpmで、2−3時間振盪培養する。
ii)将養液を10Ml遠心管に入れ、4000g×5min、上清を捨て、氷浴用0.1M CaCl2 5mlで5min懸濁させる。
iii)4000g×5min遠心分離し、上清を捨て、氷浴用0.1M CaCl2 5mlで懸濁させる。−4℃で12時間放置し、自然沈降させる。
2)プラスミドの形質転換を行う
i)自然沈降後の菌体250μlを取り、5μl Vhb/ptrc99Aプラスミドを加え、−4℃、30min。
ii)42℃で1.5min水浴し、SOC培地 0.7mlを加え、30℃で2時間振盪する。
iii)0.2ml菌液を取り、ペニシリン平板に塗布する。
iv)30℃で一晩(12−16時間)培養する。
v)モノクロ−ナルを採取し、5ml LB液体培地に入れて培養し、プラスミドを抽出して同定を行う。
vi)陽性クロ−ンを保存して必要に備える。
得られる菌株の番号:AT−053(AT−007−02,VhbM/ptrc99A)。
ptrc−NanKMカセットが組込まれる菌株、ビトレオシラヘモグロビンを発現させる遺伝子およびその突然変異菌株 AT−052、AT−053に対して、フラスコ発酵試験を行う。新鮮培養されるLB平板培地上のモノクロ−ナル菌株を取り、3mlのLB液体培地付き試験管(13×150mm)に接種し、30℃、225rpmで、約8時間培養する。そして種培養液を取り、3%を50mlのM9培養液を含む250mlフラスコに接種する。初期OD600 は約0.5であり、37℃、225rpmで培養し、発酵サイクルは72時間である。24時間目、48時間目に、10M NaOHを使って発酵液のpHを7.0に調整する。発酵液の糖分消費状況により、65%グルコ−ス溶液を数回に分けて加えてグルコ−ス濃度を20g/lに維持する。発酵が終了し、1ml発酵液を取り、遠心分離する。HPLC法によってN−アセチル−D−グルコサミン含量を測定する。
組換え菌のフラスコ発酵収率を表6に示す。結果により、Vhbの発現は、Vhb/ptrc99Aの形質転換であれ、VhbM/ptrc99Aプラスミドの形質転換であれ、収率を著しく向上させることができ、且つVhbM/ptrc99Aプラスミドの形質転換により収率をより著しく向上させることが示唆される。
本実施例はN−アセチル−D−マンノサミン−6−Pエピメラーゼ(NanE)の遺伝子NanEのクロ−ン化および大腸菌でのNanE/ptrc99Aプラスミドの形質転換、並びにptrc− NanE遺伝子カセットの大腸菌染色体への組込みについて説明する。
Escherichia coli NanE(N−acetylmannosamine−6−pHospHate epimerase、N−アセチル−D−マンノサミン−6−Pエピメラーゼ)の遺伝子NanEを増幅させ、Trcプロモーター制御下で菌株の形質転換を行い、それを過剰発現させることにより、N−アセチル−D−マンノサミン−6−リン酸(ManNAc−6−P)からN−アセチル−D−グルコサミン6−リン酸(GlcNAc−6−P)への変換を促進することができる。
NCBI からU00096を見つけ、Escherichia coli NanEの遺伝子のヌクレオチド配列SEQ ID NO.28、そのアミノ酸配列SEQ ID NO.29が得られる。
プライマ−を設計する:フォワ−ドプライマ−(NanE−F)はSEQ ID NO.30であり、リバ−スプライマ−(NanE−R)はSEQ ID NO.31である。
テンプレ−ト: AT−001(Escherichia coli ATCC 27325)ゲノム。
PCR反応条件:
第1ステップ:94℃で1min変性を行う。
第2ステップ:94℃30s、55℃30s、72℃40sを30回繰り返す。
第3ステップ:72℃で10Min伸長を行う。
増幅産物サイズ:690bp。
PCR 産物を1%アガロ−スゲル電気泳動により分離し、精製して断片を回収する。
得られるPCR増幅断片とpUC57−Tベクタ−を連結して配列決定・同定を行い、NanE/ pUC57が得られる。
i)プラスミドの構築:プラスミドNanE/ pUC57を増幅させ、それぞれ酵Nco IとHindIIIを使ってプラスミドNanE/pUC57とベクタ−ptrc99Aを切断し、アガロ−スゲル電気泳動によって分離し、精製してNanE断片とptrc99A断片を回収し、T4 DNAで酵素を連結し、16℃で一晩放置し、且つ同定を行い、NanE/ptrc99Aプラスミドが得られる。
ii)コンピテントセルを作製する:先ず、−20℃で保存されるAT−005−02菌液を、1:50−100で10Ml LB液体培地に接種し、37℃、225rpm、2−3時間振盪培養する。そして培養液を10Ml遠心管に入れ、4000g×5min、上清を捨て、氷浴用0.1M CaCl2 5mlに5min懸濁させる。最後に4000g×5min遠心分離し、上清を捨て、氷浴用0.1M CaCl2 5mlに懸濁させる。−4℃で12時間放置し、自然沈降させる。
iii)プラスミドの形質転換を行う:自然沈降後の菌体250μlを取り、5μl NanE/ptrc99Aプラスミドに加え、−4℃、30min。そして、42℃で1.5min水浴し、SOC培地 0.7mlを加え、30℃で2時間振盪する。0.2mlの菌液を取り、ペニシリン平板に塗布する。30℃で一晩(12−16時間)培養する。モノクロ−ナルを採取し、5ml LB液体培地に入れて培養し、プラスミドを抽出して同定を行う。陽性菌株を保存して必要に備える。組換え菌 NanE/ptrc99A(AT−005−02)が得られる。
将組換え菌 NanE/ptrc99A(AT−005−02)と対照菌株に対して、フラスコ振盪発酵試験を行う。新鮮培養されるLB平板培地上のモノクロ−ナル菌株を取り、3mlのLB液体培地付き試験管(13×150mm)に接種し、30℃、225rpmで、約8時間培養する。LB液体培地の成分は以下のとおりである:5g/l 酵母パウダ−、10g/l ペプトン、10g/l NaCl。そして取種培養液を取り、3%を50mlの発酵培養液(M9培養液)を含む250mlフラスコに接種する。初期OD600 は約0.5であり、37℃下、225rpmで培養し、発酵サイクルは72時間である。24時間目、48時間目に、10M NaOHを使って発酵液のpHを7.0に調整する。発酵液の糖分消費状況により、65%グルコ−ス溶液を数回に分けて加えてグルコ−ス濃度を20g/lに維持する。発酵が終了し、1mlの発酵液を取り、遠心分離し。HPLC法によってN−アセチル−D−グルコサミン含量を測定する。
NagE遺伝子部位をptrc−NanE 遺伝子カセットの染色体での組込み部位とする。ptrc−NanE 遺伝子カセットの大腸菌染色体への組込みを実現するために、先ず、Trcプロモーター付きのNanE断片ptrc−NanEおよび両端にFLP 組換え酵素識別部位(FRT 部位)を有するカナマイシン耐性遺伝子断片:FRT−Kanr−FRT (fKanrf)を増幅させ、且つ連結する。そして、もう一度設計してNagE遺伝子配列ホモロジ−ア−ムのプライマ−を削除し、且つptrc−NanEとfKanrfで連結される断片をテンプレ−トとし、Red組換え標的線形DNA完全長断片を増幅させる。
(1)PCRにより ptrc−NanE断片を増幅させる
テンプレ−ト:NanE/ptrc99A。
プライマ−を設計する:フォワ−ドプライマ−(Trcff−F)はSEQ ID NO.20であり、リバ−スプライマ−(Trcff−R)はSEQ ID NO.21である。
PCR反応条件:第1ステップ:94℃で1min変性を行う;
第2ステップ:94℃30s、55℃30s、72℃40sを30回繰り返す;
第3ステップ:72℃で10Min伸長を行う。
産物サイズ:0.86kb。
PCR 産物を1%アガロ−スゲル電気泳動によって分離し、精製して断片を回収する。
プライマ−を設計する:フォワ−ドプライマ−(mfKanf−F)はSEQ ID NO.1であり、リバ−スプライマ−(mfKanf−R)はSEQ ID NO.2である。
テンプレ−ト:pPic9K。
PCR反応条件:第1ステップ:94℃で1min変性を行う;第2ステップ:94℃30s、55℃30s、72℃40s、30回繰り返す;第3ステップ:72℃で10Min伸長を行う。
fKanrfサイズ:1.28kb。そのヌクレオチド配列はSEQ ID NO.3である。
PCR 産物を1%アガロ−スゲル電気泳動によって分離し、精製して断片を回収する。
プライマ−を設計する:フォワ−ドプライマ−(fKanf−F)はSEQ ID NO.22であり、リバ−スプライマ−(fKanf−R)はSEQ ID NO.231である。
テンプレ−ト:fKanrf。
PCR反応条件:
第1ステップ:94℃で1min変性を行う。
第2ステップ:94℃30s、55℃30s、72℃40s、30回繰り返す。
第3ステップ:72℃で10Min伸長を行う。
二次増幅されるfKanrfのサイズ:1.3kb。
PCR 産物を1%アガロ−スゲル電気泳動によって分離し、精製して断片を回収する。
ホモロジ−ア−ムプライマ−を設計する:もう一度設計してNagE遺伝子配列ホモロジ−ア−ムのフォワ−ドプライマ−(NagEKO−F2)SEQ ID NO.24、リバ−スプライマ−(NagEKO−R2)SEQ ID NO.25を削除する。
テンプレ−ト:ptrc−NanE PCR断片と二次増幅されるfKanrf PCR断片、1:1で混合する。
PCR反応条件:第1ステップ:94℃で1min変性を行う;
第2ステップ:94℃30s、55℃30s、72℃40sを30回繰り返す;
第3ステップ:72℃で10Min伸長を行う。
増幅産物:ホモロジ−ア−ム+ ptrc−NanE−fKanrf+ホモロジ−ア−ム。
PCR産物をアガロ−スゲル電気泳動により分離し、精製・回収して100ng/μlの線状DNAの完全長PCR断片を得てRed組換えタ−ゲティングに用いる。
先ず、pKD46ベクタ−を大腸菌AT−004−02の菌株に導入する。そして、調製された標的線形DNA断片を電気的に形質転換し、陽性クロ−ンをスクリーニングする。最後に耐性遺伝子を削除する。
i)コンピテントセルを作製する:先ず、−20℃で保存されるEscherichia coli AT−004−02菌液を、1:50−100で10Ml LB液体培地に接種し、37℃、225rpmで、2−3時間振盪培養する。そして培養液を10Ml遠心管に入れ、4000g×5min、上清を捨て、氷浴用0.1M CaCl2 5mlに5min懸濁させる。最後に4000g×5min遠心分離し、上清を捨て、氷浴用0.1M CaCl2 5mlで懸濁させる。−4℃で12時間放置し、自然沈降させる。
ii)プラスミドの形質転換を行う:自然沈降された菌体250μlを取り、5μl pKD46プラスミドを加え、−4℃、30min。そして、42℃で1.5min水浴し、SOC培地 0.7mlを加え、30℃で2時間振盪する。0.2mlの菌液を取り、ペニシリン平板に塗布する。30℃で一晩(12−16時間)培養する。モノクロ−ナルを採取し、5ml LB液体培地に加えて培養し、プラスミドを抽出して同定を行う。陽性菌株を保存して必要に備える。
i)電気的形質転換コンピテントセルを作製する: pKD46 Escherichia coliを含む菌株AT−004−02をアンピシリン(Amp)LB培地を含む試験管に接種し、250rpmで一晩振盪し、翌日1%の量でAmpを含むLB培地に接種し、30℃で培養し、待OD600が約0.2に達した後、0.2%のL−アラビノ−スを加え、OD600が約0.4に達するまで30℃で35分間誘導する。氷浴で冷却する。超純水で1回洗浄し、10%グリセリンで2回洗浄し、最後に10%グリセリンで再懸濁させ、グリセリンの用量は菌体を500−1000倍の最終濃度に濃縮させることが好ましい。
ii)電気ショック形質転換:2mm電気ショック形質転換用カップを70%エタノ−ルから取り出し、滅菌超純水で2回洗浄し、紫外線ランプで30分間照射する。4℃で30分間予備冷却する。90μlの最終的に再懸濁された細胞を取り、予備冷却用遠心管に移し、5μl(100ng以上)のステップ(1)で得られる完全長PCR断片(線形DNA)を加え、ガンでやさしく吸って均一つに混合させ、30分間氷浴する。
電気的形質転換パラメ−タ:2500V、200Ω、25μF。
iii)陽性クロ−ンの蘇生およびスクリーニング: 1mlのLB液体培地を加え、37℃、100rpm、1時間。そして200μlを1つのカナマイシン(Kan)平板に塗布し、全部で5つの平板である。均一に塗布し、乾燥させる。30℃で24時間培養する。カナマイシン耐性下で成長するクロ−ンを採取し、PCR同定を行い、陽性クロ−ンをスクリーニングする。
得られる菌株の番号:AT−030−01(AT−004−02,△NagE::ptrc−NanE−fKanrf)。
pCP20を前記カナマイシン耐性クロ−ンに導入し、30℃で8h培養し、そして42℃で一晩放置し、熱誘導によりFLP組換え酵素を発現させ、プラスミドを徐々に失わせる。シクロスポリン接種液を、抗生物質を含まない培地に詰め、成長したモノクロ−ナルを選んでカナマイシン耐性平板に滴下し、成長しないものはカナマイシン耐性遺伝子がFLP組換え酵素に削除されるクロ−ンである。同定用プライマ−を使ってPCRを行ってカナマイシン耐性が消失したクロ−ンに対して同定を行う。
得られる菌株の番号: AT−030−02(AT−004−02,△NagE::ptrc−NanE)。
染色体NagE遺伝子部位においてptrc−NanE遺伝子カセットが組込まれる組換え菌AT−030−02と対照菌株に対して、フラスコ発酵試験を行う。新鮮培養されるLB平板培地上のモノクロ−ナル菌株を取り、3mlのLB液体培地付き試験管(13×150mm)に接種し、30℃、225rpm、約8時間培養する。そして種培養液を取り、3%を50mlの発酵培養液(M9培養液)を含む250mlフラスコに接種する。初期OD600 は約0.5であり、37℃、225rpmで培養し、発酵サイクルは72時間である。24時間目、48時間目、10M NaOHを使って発酵液のpHを7.0に調整する。据発酵液の糖分消費状況により、65%グルコ−ス溶液を数回に分けて加えてグルコ−ス濃度を20g/lに維持する。発酵が終了し、1mlの発酵液を取り、遠心分離する。HPLC法によってN−アセチル−D−グルコサミン含量を測定する。
本実施例は突然変異したN−アセチル−D−マンノサミン−6−Pエピメラーゼ(NanE)の遺伝子のスクリーニングについて説明し、前記遺伝子は酵素活性を向上させるN−アセチル−D−マンノサミン−6−Pエピメラーゼをコードする。
具体的な操作手順は次のとおりである:
Taq DNAポリメラ−ゼが3' −5'校正機能を持たない性質を利用し、高マグネシウムイオン濃度(8mmol/L)およびdNTP濃度の異なる濃度 (そのうち、dATPとdGTPの濃度は1.5mmol/Lである;dTTPとdCTPの濃度は3.0mmol/Lである)下で、ランダム突然変異の頻度を制御し、タ−ゲット遺伝子にランダム突然変異を導入し、突然変異ライブラリ−を構築する;テンプレ−ト濃度のA260値は1000ng/mlであり、酵素の濃度は5U/μlであり、プライマ−の濃度は100μMである。
エラ−プロ−ンPCR反応系(50μl):10×PCR反応緩衝液5μl、dNTP(2.5mM)5μl、MgCl2(2.5mM) 5μl、フォワ−ドプライマ−(NanE−F、SEQ ID NO.30)1μl、リバ−スプライマ−(NanE−R、SEQ ID NO.31)1μl、DNAテンプレ−ト(NanE/pUC57)0.1μl、Taq DNAポリメラ−ゼ0.5μl、ddH2O 32.4μl。
PCR 手順:96℃で4min予備変性を行う;94℃で1min変性を行い、56℃で1minアニ−リングを行い、75℃で2min伸長を行い、45サイクル;最後に75℃で15min伸長を行い、ゲル回収法によりPCR産物(産物サイズ:0.7kb);を回収する; 5μl産物を取って1%アガロ−スゲル電気泳動を行い、−20℃で保存して必要に備える。
前記PCR産物は制限エンドヌクレア−ゼNco IとHind IIIの二重消化によって消化された後、Nco IとHind IIIエンドヌクレア−ゼで消化されたptrc99Aプラスミドとライゲ−ション反応を行い、そしてライゲ−ション産物の混合物によって大腸菌 AT−005−02の形質転換を行い、大量のクロ−ン化した形質転換体が得られ、形質転換菌体の突然変異ライブラリ−を構築する。
形質転換菌体の突然変異ライブラリ−から、突然変異するクロ−ンを350株無作為に選び、野生型NanE/ptrc99A(AT−005−02)を対照菌株として、それぞれ50μg/mlペニシリン(Amp)を含む5ml LB培地に接種し、37℃、150rpmで18h培養した後、10000rpmで、5min遠心分離して菌体を収集する。上清を捨てた後、在4℃下で1ml PBS(pH値7.5、10Mmol/L)溶液に再懸濁させ、氷浴条件下で300Vの電圧を選び、6s 間隔で超音波を3s出して10Min超音波破砕を行い、遠心分離し上清を取って酵素粗抽出液とし、活性測定を行う。
NagE遺伝子部位をptrc−NanEM 遺伝子カセットの染色体での組込み部位とする。ptrc−NanEM 遺伝子カセットの大腸菌染色体への組込みを実現するために、先ず、Trcプロモーター付きのNanEM断片ptrc−NanEM、および両端にFLP 組換え酵素識別部位(FRT 部位)を有するカナマイシン耐性遺伝子断片:FRT−Kanr−FRT (fKanrf)を増幅させ、且つ連結する。そして、もう一度設計してNagE遺伝子配列ホモロジ−ア−ムのプライマ−削除し、且つptrc−NanEMとfKanrf連結される断片をテンプレ−トとし、Red組換え標的線形DNA完全長断片を増幅させる。
具体的な操作手順は次のとおりである:
テンプレ−ト:NanEM/ptrc99A。
プライマ−を設計する:フォワ−ドプライマ−(Trcff−F)はSEQ ID NO.20であり、リバ−スプライマ−(Trcff−R)はSEQ ID NO.21である。
PCR反応条件:
第1ステップ:94℃で1min変性を行う。
第2ステップ:94℃30s、55℃30s、72℃40sを30回繰り返す。
第3ステップ:72℃で10Min伸長を行う。
産物サイズ:0.86kb。
PCR 産物を1%アガロ−スゲル電気泳動によって分離し、精製して断片を回収する。
プライマ−を設計する:フォワ−ドプライマ−(mfKanf−F)はSEQ ID NO.1であり、リバ−スプライマ−(mfKanf−R)はSEQ ID NO.2である。
テンプレ−ト:pPic9K。
PCR反応条件:
第1ステップ:94℃で1min変性を行う。
第2ステップ:94℃30s、55℃30s、72℃40sを30回繰り返す。
第3ステップ:72℃で10Min伸長を行う。
fKanrfサイズ:1.28kb。そのヌクレオチド配列はSEQ ID NO.3である。
PCR 産物を1%アガロ−スゲル電気泳動によって分離し、精製して断片を回収する。
プライマ−を設計する:フォワ−ドプライマ−(fKanf−F)はSEQ ID NO.22であり、リバ−スプライマ−(fKanf−R)はSEQ ID NO.231である。
テンプレ−ト:fKanrf。
PCR反応条件:第1ステップ:94℃で1min変性を行う;
第2ステップ:94℃30s、55℃30s、72℃40sを30回繰り返す;
第3ステップ:72℃で10Min伸長を行う。
二次増幅されるfKanrfのサイズ:1.3kb。
PCR 産物を1%アガロ−スゲル電気泳動によって分離し、精製して断片を回収する。
ホモロジ−ア−ムプライマ−を設計する:もう一度設計してNagE遺伝子配列ホモロジ−ア−ムのフォワ−ドプライマ−(NagEKO−F2)SEQ ID NO.24、リバ−スプライマ−(NagEKO−R2)SEQ ID NO.25を削除する。
テンプレ−ト:ptrc−NanK PCR断片と二次増幅されるfKanrf PCR断片、1:1で混合する。
PCR反応条件:
第1ステップ:94℃で1min変性を行う。
第2ステップ:94℃30s、55℃30s、72℃40sを30回繰り返す。
第3ステップ:72℃で10Min伸長を行う。
増幅産物:ホモロジ−ア−ム+ ptrc−NanEM−fKanrf+ホモロジ−ア−ム。
PCR産物をアガロ−スゲル電気泳動により分離し、精製・回収して100ng/μlの線状DNAの完全長PCR断片を得てRed組換えタ−ゲティングに用いる。
先ず、pKD46ベクタ−を大腸菌AT−004−02の菌株に導入する。そして、調製された標的線形DNA断片を電気的に形質転換し、陽性クロ−ンをスクリーニングする。最後に耐性遺伝子を削除する。
i)コンピテントセルを作製する:先ず、−20℃で保存されるEscherichia coli AT−004−02菌液を、1:50−100で10Ml LB液体培地に接種し、37℃、225rpmで、2−3時間振盪培養する。そして培養液を10Ml遠心管に入れ、4000g×5min、上清を捨て、氷浴用0.1M CaCl2 5mlに5min懸濁させる。最後に4000g×5min遠心分離し、上清を捨て、氷浴用0.1M CaCl2 5mlで懸濁させる。−4℃で12時間放置し、自然沈降させる。
ii)プラスミドの形質転換を行う:自然沈降された菌体250μlを取り、5μl pKD46プラスミドを加え、−4℃、30min。そして、42℃で1.5min水浴し、SOC培地 0.7mlを加え、30℃で2時間振盪する。0.2mlの菌液を取り、ペニシリン平板に塗布する。30℃で一晩(12−16時間)培養する。モノクロ−ナルを採取し、5ml LB液体培地に加えて培養し、プラスミドを抽出して同定を行う。陽性菌株を保存して必要に備える。
i)電気的形質転換コンピテントセルを作製する: pKD46 Escherichia coliを含む菌株AT−004−02をアンピシリン(Amp)LB培地を含む試験管に接種し、250rpmで一晩振盪し、翌日1%の量でAmpを含むLB培地に接種し、30℃で培養し、待OD600が約0.2に達した後、0.2%のL−アラビノ−スを加え、OD600が約0.4に達するまで30℃で35分間誘導する。氷浴で冷却する。超純水で1回洗浄し、10%グリセリンで2回洗浄し、最後に10%グリセリンで再懸濁させ、グリセリンの用量は菌体を500−1000倍の最終濃度に濃縮させることが好ましい。
ii)電気ショック形質転換:2mm形質転換用カップを70%エタノ−ルから取り出し、滅菌超純水で2回洗浄し、紫外線ランプで30分間照射する。4℃で30分間予備冷却する。90μlの最終的に再懸濁された細胞を取り、予備冷却用遠心管に移し、5μl(100ng以上)のステップ(1)で得られる完全長PCR断片(線形DNA)を加え、ガンでやさしく吸って均一つに混合させ、30分間氷浴する。電気的形質転換パラメ−タ::2500V、200Ω、25μF。
iii)陽性クロ−ンの蘇生およびスクリーニング: 1mlのLB液体培地を加え、37℃、100rpm、1時間。そして200μlを1つのカナマイシン(Kan)平板に塗布し、全部で5つの平板である。均一に塗布し、乾燥させる。30℃で24時間培養する。カナマイシン耐性下で成長するクロ−ンを採取し、PCR同定を行い、陽性クロ−ンをスクリーニングする。
得られる菌株の番号: AT−031−01(AT−004−02,△NagE::ptrc−NanEM−fKanrf)。
pCP20を前記カナマイシン耐性クロ−ンに導入し、30℃で8h培養し、そして42℃で一晩放置し、熱誘導によりFLP 組換え酵素を発現させ、プラスミドを徐々に失わせる。シクロスポリン接種液を、抗生物質を含まない培地に詰め、成長したモノクロ−ナルを選んでカナマイシン耐性平板に滴下し、成長しないものはカナマイシン耐性遺伝子がFLP組換え酵素に削除されるクロ−ンである。同定用プライマ−を使ってPCRを行ってカナマイシン耐性が消失したクロ−ンに対して同定を行う。
得られる菌株の番号: AT−031−02(AT−004−02,△NagE::ptrc−NanEM)。
染色体のNagE遺伝子部位においてptrc−NanEM遺伝子カセットが組込まれる組換え菌AT−031−02と対照菌株に対して、フラスコ振盪発酵試験を行う。新鮮培養されるLB平板培地上のモノクロ−ナル菌株を取り、3mlのLB液体培地付き試験管(13×150mm)に接種し、30℃、225rpm、約8時間培養する。そして種培養液を取り、3%を50mlの発酵培養液(M9培養液)を含む250mlフラスコに接種する。初期OD600 は約0.5であり、37℃、225rpmで培養し、発酵サイクルは72時間である。24時間目、48時間目に、10M NaOHを使って発酵液のpHを7.0に調整する。据発酵液の糖分消費状況により、65%グルコ−ス溶液を数回に分けて加えてグルコ−ス濃度を20g/lに維持する。発酵が終了し、1mlの発酵液を取り、遠心分離する。HPLC法によってN−アセチル−D−グルコサミン含量を測定する。
本実施例はptrc−NanEMカセットが組込まれる大腸菌株、特にビトレオシラヘモグロビン(Vhb)を発現させる遺伝子Vhb及びその突然変異体が、N−アセチル−D−グルコサミン収率に対する影響について説明する。
(1)Vhb遺伝子を増幅させ、且つptrc99Aを挿入する
ビトレオシラヘモグロビン遺伝子のヌクレオチド配列はSEQ ID NO.60であり、アミノ酸配列はSEQ ID NO.61である。Escherichia coliがコドン塩基を優先することにより、ビトレオシラヘモグロビン遺伝子の最適化・合成を行い、pUC57 ベクタ−をロ−ドする。得られたベクタ−はVhb/pUC57と命名される。
プライマ−を設計する:フォワ−ドプライマ−(Vhb−F)はSEQ ID NO.62であり、リバ−スプライマ−(Vhb−R)はSEQ ID NO.63である。
テンプレ−ト: Vhb/pUC57。
PCR反応条件:
第1ステップ:94℃で1min変性を行う。
第2ステップ:94℃30s、55℃30s、72℃40sを30回繰り返す。
第3ステップ:72℃で10Min伸長を行う。
増幅産物サイズ:441bp。
PCR産物を1%アガロ−スゲル電気泳動により分離し、精製して断片を回収する。
得られるPCR増幅断片とベクタ−ptrc99A をそれぞれNco IとHind IIIで消化し、アガロ−スゲル電気泳動により分離し、精製してVhb断片とptrc99A断片を回収し、T4 DNAで酵素を連結し、16℃で一晩放置し、且つ同定を行い、Vhb/ptrc99Aプラスミドが得られる。
1)コンピテントセルを作製する
i)−20℃で保存されるAT−031−02菌液を、1:50−100で10Ml LB液体培地に接種し、37℃、225rpmで、2−3時間振盪培養する。
ii)培養液を10Ml遠心管に入れ、4000g×5min、上清を捨て、氷浴用0.1M CaCl2 5mlに5min懸濁させる。
iii)4000g×5min遠心分離し、上清を捨て、氷浴用0.1M CaCl2 5mlに懸濁させる。−4℃で12時間放置し、自然沈降させる。
2)プラスミドの形質転換を行う
i)自然沈降後の菌体250μlを取り、5μl Vhb/ptrc99Aプラスミドを加え、−4℃、30min。
ii)42℃で1.5min水浴し、SOC培地 0.7mlを加え、30℃で2時間振盪する。
iii)0.2ml菌液を取り、ペニシリン平板に塗布する。
iv)30℃で一晩(12−16時間)培養し。
v)モノクロ−ナルを選び、5ml LB液体培地に入れて培養し、プラスミドを抽出して同定を行う。
vi)陽性クロ−ンを保存して必要に備える。
得られる菌株の番号:AT−054(AT−031−02、Vhb/ptrc99A)。
1)コンピテントセルを作製する
i)−20℃で保存されるAT−031−02菌液を、1:50−100で10Ml LB液体培地に接種し、37℃、225rpmで、2−3時間振盪培養する。
ii)培養液を10Ml遠心管に入れ、4000g×5min、上清を捨て、氷浴用0.1M CaCl2 5mlに5min懸濁させる。
iii)4000g×5min遠心分離し、上清を捨て、氷浴用0.1M CaCl2 5mlに懸濁させる。−4℃で12時間放置し、自然沈降させる。
i)自然沈降後の菌体250μlを取り、5μl Vhb/ptrc99Aプラスミドを加え、−4℃、30min。
ii)42℃で1.5min水浴し、SOC培地 0.7mlを加え、30℃で2時間振盪する。
iii)0.2ml菌液を取り、ペニシリン平板に塗布する。
iv)30℃で一晩(12−16時間)培養し。
v)モノクロ−ナルを選び、5ml LB液体培地に入れて培養し、プラスミドを抽出して同定を行う。
vi)陽性クロ−ンを保存して必要に備える。
得られる菌株の番号:AT−055(AT−031−02,VhbM/ptrc99A)。
ptrc−NanEMカセットが組込まれる菌株、ビトレオシラヘモグロビンを発現させる遺伝子およびその突然変異菌株 AT−052、AT−053に対して、フラスコ発酵試験を行う。新鮮培養されるLB平板培地上のモノクロ−ナル菌株を取り、3mlのLB液体培地付き試験管(13×150mm)に接種し、30℃、225rpmで、約8時間培養する。そして種培養液を取り、3%を50mlのM9培養液を含む250mlフラスコに接種する。初期OD600 は約0.5であり、37℃、225rpmで培養し、発酵サイクルは72時間である。24時間目、48時間目、10M NaOHを使って発酵液のpHを7.0に調整する。発酵液の糖分消費状況により、65%グルコ−ス溶液を数回に分けて加えてグルコ−ス濃度を20g/lに維持する。発酵が終了し、1ml発酵液を取り、遠心分離する。HPLC法によってN−アセチル−D−グルコサミン含量を測定する。
組換え菌のフラスコ発酵の収率を表10に示す。結果により、Vhbの発現により、Vhb/ ptrc99Aの形質転換であれ、VhbM/ ptrc99Aプラスミドの形質転換であれ、収率を著しく向上させることができ、且つVhbM/ ptrc99Aプラスミドの形質転換が収率の向上に対する影響がより大きいことが示唆される。
本実施例はUDP−N−アセチル−D−グルコサミン2−エピメラーゼ(WecB)の遺伝子WecBのクロ−ン化及び大腸菌におけるWecB/ptrc99Aプラスミドの形質転換、並びにptrc−WecB遺伝子カセットの大腸菌染色体への組込みについて説明する。
大腸菌UDP−N−アセチルグルコサミン2−エピメラーゼ(UDP−N−acetyl−D−Glucosamine −2−epimerase、WecB)の遺伝子WecBを、Trcプロモーター制御下に置いて菌株の形質転換を行い、それを過剰発現させることにより、UDP−GlcNAc(UDP−N−acetyl Glucosamine、UDP−N−アセチル−D−グルコサミン)からManNAc(N−acetyl−D−mannosamine、N−アセチル−D−マンノサミンまたはN−アセチル−D−マンノサミン)への変換を促進することができる。
NCBI から大腸菌WecB 遺伝子のヌクレオチド配列SEQ ID NO.49、そのアミノ酸配列SEQ ID NO.50を見つける。
プライマ−を設計する:フォワ−ドプライマ−(TrcWecB−F)はSEQ ID NO.51であり、リバ−スプライマ−(TrcWecB−R)はSEQ ID NO.52である。
テンプレ−ト: AT−001 (Escherichia coli ATCC 27325)ゲノム。
PCR反応条件:
第1ステップ:94℃で1min変性を行う。
第2ステップ:94℃30s、55℃30s、72℃40sを30回繰り返す。
第3ステップ:72℃で10Min伸長を行う。
増幅産物サイズ:1.13kb。
PCR 産物を1%アガロ−スゲル電気泳動によって分離し、精製して断片を回収する。
得られるPCR増幅断片とpUC57−Tベクタ−を連結して配列決定・同定を行い、WecB/ pUC57が得られる。
i)プラスミドの構築:プラスミドWecB/ pUC57を増幅させ、それぞれNco IとHindIIIを使ってプラスミドWecB/ pUC57とベクタ−ptrc99Aを切断し、アガロ−スゲル電気泳動によって分離し、精製してWecB断片とptrc99A断片を回収し、T4 DNAで酵素を連結し、16℃で一晩放置し、且つ同定を行い、WecB/ptrc99Aプラスミドが得られる。
ii)コンピテントセルを作製する:先ず、−20℃で保存されるAT−005−02菌液を、1:50−100で10Ml LB液体培地に接種し、37℃、225rpm、2−3時間振盪培養する。そして培養液を10Ml遠心管に入れ、4000g×5min、上清を捨て、氷浴用0.1M CaCl2 5mlに5min懸濁させる。最後に4000g×5min遠心分離し、上清を捨て、氷浴用0.1M CaCl2 5mlに懸濁させる。−4℃で12時間放置し、自然沈降させる。
iii)プラスミドの形質転換を行う:自然沈降後の菌体250μlを取り、5μl WecB/ptrc99Aプラスミドに入れ、−4℃、30min。そして、42℃で1.5min水浴し、SOC培地 0.7mlを加え、30℃で2時間振盪する。0.2ml菌液を取り、ペニシリン平板に塗布する。30℃で一晩(12−16時間)培養する。モノクロ−ナルを採取し、5ml LB液体培地に入れて培養し、プラスミドを抽出して同定を行う。陽性菌株を保存して必要に備える。組換え菌 WecB/ptrc99A(AT−005−02)が得られる。
組換え菌 WecB/ptrc99A(AT−005−02)と対照菌株に対して、フラスコ発酵試験を行う。新鮮培養されるLB平板培地上のモノクロ−ナル菌株を取り、3mlのLB液体培地付き試験管(13×150mm)に接種し、30℃、225rpmで、約8時間培養する。LB液体培地の成分は以下のとおりである:
5g/l 酵母パウダ−、10g/lペプトン、10g/l NaCl。
そして種培養液を取り、3%を50mlの発酵培養液(M9培養液)を含む250mlフラスコに接種する。初期OD600 は約0.5であり、37℃下、225rpmで培養し、発酵サイクルは72時間である。24時間目、48時間目に、10M NaOHを使って発酵液のpHを7.0に調整する。発酵液の糖分消費状況により、65%グルコ−ス溶液を数回に分けて加えてグルコ−ス濃度を20g/lに維持する。発酵が終了した後、発酵液1mlを取り、遠心分離する。HPLC法によってN−アセチル−D−グルコサミン含量を測定する。
NagE遺伝子部位をptrc−WecB 遺伝子カセットの染色体での組込み部位とする。ptrc−WecB 遺伝子カセットの大腸菌染色体への組込みを実現するために、先ず、Trcプロモーター付きのWecB断片ptrc−WecB、および両端にFLP 組換え酵素識別部位(FRT 部位)を有するカナマイシン耐性遺伝子断片:FRT−Kanr−FRT (fKanrf)を増幅させ、且つ連結する。そして、もう一度設計してNagE遺伝子配列ホモロジ−ア−ムのプライマ−を削除し、且つptrc−WecBとfKanrfで連結される断片をテンプレ−トとし、Red組換え標的線形DNA完全長断片を増幅させる。
具体的な操作手順は次のとおりである:
テンプレ−ト:WecB/ptrc99A。
プライマ−を設計する:フォワ−ドプライマ−(Trcff−F)はSEQ ID NO.20であり、リバ−スプライマ−(Trcff−R)はSEQ ID NO.21である。
PCR反応条件:第1ステップ:94℃で1min変性を行う;
第2ステップ:94℃30s、55℃30s、72℃40sを30回繰り返す;
第3ステップ:72℃で10Min伸長を行う。
産物サイズ:1.3kb。
PCR 産物を1%アガロ−スゲル電気泳動によって分離し、精製して断片を回収する。
プライマ−を設計する:フォワ−ドプライマ−(mfKanf−F)はSEQ ID NO.1であり、リバ−スプライマ−(mfKanf−R)はSEQ ID NO.2である。
テンプレ−ト:pPic9K。
PCR反応条件:第1ステップ:94℃で1min変性を行う;
第2ステップ:94℃30s、55℃30s、72℃40sを30回繰り返す;
第3ステップ:72℃で10Min伸長を行う。
fKanrfサイズ:1.28kb。そのヌクレオチド配列はSEQ ID NO.3である。
PCR 産物を1%アガロ−スゲル電気泳動によって分離し、精製して断片を回収する。
プライマ−を設計する:フォワ−ドプライマ−(fKanf−F)はSEQ ID NO.22であり、リバ−スプライマ−(fKanf−R)はSEQ ID NO.231である。
テンプレ−ト:fKanrf。
PCR反応条件:
第1ステップ:94℃で1min変性を行う。
第2ステップ:94℃30s、55℃30s、72℃40sを30回繰り返す。
第3ステップ:72℃で10Min伸長を行う。
二次増幅されるfKanrfのサイズ:1.3kb。
PCR 産物を1%アガロ−スゲル電気泳動によって分離し、精製して断片を回収する。
ホモロジ−ア−ムプライマ−を設計する:もう一度設計してNagE遺伝子配列ホモロジ−ア−ムのフォワ−ドプライマ−(NagEKO−F2)SEQ ID NO.24、リバ−スプライマ−(NagEKO−R2)SEQ ID NO.25を削除する。
テンプレ−ト:ptrc−NanK PCR断片と二次増幅されるfKanrf PCR断片、1:1で混合する。
PCR反応条件:
第1ステップ:94℃で1min変性を行う。
第2ステップ:94℃30s、55℃30s、72℃40sを30回繰り返す。
第3ステップ:72℃で10Min伸長を行う。
増幅産物:ホモロジ−ア−ム+ ptrc−WecB−fKanrf+ホモロジ−ア−ム。
PCR産物をアガロ−スゲル電気泳動により分離し、精製・回収して100ng/μlの線状DNAの完全長PCR断片を得てRed組換えタ−ゲティングに用いる。
先ず、pKD46ベクタ−を大腸菌AT−004−02の菌株に導入する。そして、調製された標的線形DNA断片を電気的に形質転換し、陽性クロ−ンをスクリーニングする。最後に耐性遺伝子を削除する。
1)pKD46プラスミドの形質転換を行う
i)コンピテントセルを作製する:先ず、−20℃で保存されるEscherichia coli AT−004−02菌液を、1:50−100で10Ml LB液体培地に接種し、37℃、225rpmで、2−3時間振盪培養する。そして培養液を10Ml遠心管に入れ、4000g×5min、上清を捨て、氷浴用0.1M CaCl2 5mlに5min懸濁させる。最後に4000g×5min遠心分離し、上清を捨て、氷浴用0.1M CaCl2 5mlで懸濁させる。−4℃で12時間放置し、自然沈降させる。
ii)プラスミドの形質転換を行う:自然沈降された菌体250μlを取り、5μl pKD46プラスミドを加え、−4℃、30min。そして、42℃で1.5min水浴し、SOC培地 0.7mlを加え、30℃で2時間振盪する。0.2mlの菌液を取り、ペニシリン平板に塗布する。30℃で一晩(12−16時間)培養する。モノクロ−ナルを採取し、5ml LB液体培地に加えて培養し、プラスミドを抽出して同定を行う。陽性菌株を保存して必要に備える。
i)電気的形質転換コンピテントセルを作製する: pKD46 Escherichia coliを含む菌株AT−004−02をアンピシリン(Amp)LB培地を含む試験管に接種し、250rpmで一晩振盪し、翌日1%の量でAmpを含むLB培地に接種し、30℃で培養し、OD600が約0.2に達した後、OD600が約0.4に達するまで、0.2%のL−アラビノ−スを加え、30℃で35分間誘導する。。氷浴で冷却する。超純水で1回洗浄し、10%グリセリンで2回洗浄し、最後に10%グリセリンで再懸濁させ、グリセリンの用量は菌体を500−1000倍の最終濃度に濃縮させることが好ましい。
ii)電気ショック形質転換: 2mm電気ショック形質転換用カップを70%エタノ−ルから取り出し、滅菌超純水で2回洗浄し、紫外線ランプで30分間照射する。4℃で30分間予備冷却する。90μlの最終的に再懸濁された細胞を取り、予備冷却用遠心管に移し、5μl(100ng以上)のステップ(1)で得られる完全長PCR断片(線形DNA)を加え、ガンでやさしく吸って均一つに混合させ、30分間氷浴する。電気的形質転換パラメ−タ:2500V、200Ω、25μF。
iii)陽性クロ−ンの蘇生およびスクリーニング: 1mlのLB液体培地を加え、37℃、100rpm、1時間。そして200μlを1つのカナマイシン(Kan)平板に塗布し、全部で5つの平板である。均一に塗布し、乾燥させる。30℃で24時間培養する。カナマイシン耐性下で成長するクロ−ンを採取し、PCR同定を行い、陽性クロ−ンをスクリーニングする。
得られる菌株の番号:AT−042−01(AT−004−02,△NagE::ptrc−WecB−fKanrf)。
pCP20を前記カナマイシン耐性クロ−ンに導入し、30℃で8h培養し、そして42℃で一晩放置し、熱誘導によりFLP組換え酵素を発現させ、プラスミドを徐々に失わせる。シクロスポリン接種液を、抗生物質を含まない培地に詰め、成長したモノクロ−ナルを選んでカナマイシン耐性平板に滴下し、成長しないものはカナマイシン耐性遺伝子がFLP組換え酵素に削除されるクロ−ンである。同定用プライマ−を使ってPCRを行ってカナマイシン耐性が消失したクロ−ンに対して同定を行う。
得られる菌株の番号: AT−042−02(AT−004−02,△NagE::ptrc−WecB)。
染色体のNagE遺伝子部位においてptrc−WecB遺伝子カセットが組込まれる組換え菌AT−042−02と対照菌株対して、フラスコ発酵試験を行う。新鮮培養されるLB平板培地上のモノクロ−ナル菌株を取り、3mlのLB液体培地付き試験管(13×150mm)に接種し、30℃、225rpm、約8時間培養する。そして種培養液を取り、3%を50mlの発酵培養液(M9培養液)を含む250mlフラスコに接種する。初期OD600 は約0.5であり、37℃、225rpmで培養し、発酵サイクルは72時間である。24時間目、48時間目、10M NaOHを使って発酵液のpHを7.0に調整する。据発酵液の糖分消費状況により、65%グルコ−ス溶液を数回に分けて加えてグルコ−ス濃度を20g/lに維持する。発酵が終了し、1mlの発酵液を取り、遠心分離する。HPLC法によってN−アセチル−D−グルコサミン含量を測定する。
本実施例は突然変異するUDP−N−アセチルグルコサミン2−エピメラーゼ(WecB)の遺伝子をスクリーニングすることについて説明し、前記遺伝子は酵素活性が向上するUDP−N−アセチルグルコサミン2−エピメラーゼをコードする。
さらに生産菌株の中のN−アセチル−D−グルコサミン合成量を向上させるため、酵素活性を向上させるUDP−N−アセチルグルコサミン2−エピメラーゼをコードする遺伝子の突然変異体をスクリーニングする。当該目的を達成するため、エラ−プロ−ンPCR技術によってクロ−ン化した遺伝子を増幅させ、増幅に用いるDNA ポリメラ−ゼにより、ミスマッチが高頻度に生じる条件下で前記遺伝子を増幅させ、それによってPCR産物から突然変異が高頻度で得られる。
1,エラ−プロ−ンPCRにより大腸菌のUDP−N−アセチルグルコサミン2−エピメラーゼの遺伝子WecBを増幅させる
Taq DNAポリメラ−ゼが3' −5'校正機能を持たない性質を利用し、高マグネシウムイオン濃度(8mmol/L)およびdNTP濃度の異なる濃度 (そのうち、dATPとdGTPの濃度は1.5mmol/Lである;dTTPとdCTPの濃度は3.0mmol/Lである)下で、ランダム突然変異の頻度を制御し、タ−ゲット遺伝子にランダム突然変異を導入し、突然変異ライブラリ−を構築する;テンプレ−ト濃度のA260値は1000ng/mlであり、酵素の濃度は5U/μlであり、プライマ−の濃度は100μMである。
エラ−プロ−ンPCR反応系(50μl):10×PCR反応緩衝液5μl、dNTP(2.5mM)5μl、MgCl2 (25mM)5μl、フォワ−ドプライマ−(TrcWecB−F、SEQ ID NO.51)1μl、リバ−スプライマ−(TrcWecB−R、SEQ ID NO.52)1μl、DNAテンプレ−ト(WecB/pUC57)0.1μl、Taq DNAポリメラ−ゼ0.5μl、ddH2O 32.4μl。
PCR 手順:96℃で4min予備変性を行う;
94℃で1min変性、56℃で1minアニ−リング、75℃で2min伸長を、45サイクル繰り返す;
最後に75℃で15min伸長を行い、ゲル回収法によりPCR産物(産物サイズ:1.13kb)を回収する;
5μl産物を取って1%アガロ−スゲル電気泳動を行い、−20℃で保存して必要に備える。
前記PCR産物は制限エンドヌクレア−ゼNco IとHind IIIの二重消化によって消化された後、Nco IとHind IIIエンドヌクレア−ゼで消化されたptrc99Aプラスミドとライゲ−ション反応を行い、そしてライゲ−ション産物の混合物によって大腸菌 AT−005−02の形質転換を行い、大量のクロ−ン化した形質転換体が得られ、形質転換菌体の突然変異ライブラリ−を構築する。
形質転換菌体の突然変異ライブラリ−から、突然変異するクロ−ンを640株無作為に選び、野生型WecB/ptrc99A(AT−005−02)を対照菌株とし、それぞれ50μg/mlペニシリン(Amp)を含む5ml LB培地に接種し、37℃、150rpmで18h培養した後、10000rpmで、5min遠心分離して菌体を収集する。上清を捨てた後、4℃で1ml PBS(pH値7.5、10Mmol/L)溶液に再懸濁させ、氷浴条件下で300Vの電圧を選び、6s 間隔で超音波を3s出して10Min超音波破砕を行い、遠心分離し上清を取って酵素粗抽出液とし、活性測定を行う。
NagE遺伝子部位をptrc−WecBM遺伝子カセットの染色体での組込み部位とする。ptrc−WecBM 遺伝子カセットの大腸菌染色体への組込みを実現するために、先ず、Trcプロモーター付きのWecBM断片ptrc−WecBM、および両端にFLP組換え酵素識別部位(FRT 部位)を有するカナマイシン耐性遺伝子断片:FRT−Kanr−FRT (fKanrf)を増幅させ、且つ連結する。そして、もう一度設計してNagE遺伝子配列ホモロジ−ア−ムのプライマ−を削除し、且つptrc−WecBMとfKanrfで連結される断片をテンプレ−トとし、Red組換え標的線形DNA完全長断片を増幅させる。
具体的な操作手順は次のとおりである:
テンプレ−ト:WecBM/ptrc99A。
プライマ−を設計する:フォワ−ドプライマ−(Trcff−F)はSEQ ID NO.20であり、リバ−スプライマ−(Trcff−R)はSEQ ID NO.21である。
PCR反応条件:
第1ステップ:94℃で1min変性を行う。
第2ステップ:94℃30s、55℃30s、72℃40sを30回繰り返す。
第3ステップ:72℃で10Min伸長を行う。
産物サイズ:1.3kb。
PCR 産物を1%アガロ−スゲル電気泳動によって分離し、精製して断片を回収する。
プライマ−を設計する:フォワ−ドプライマ−(mfKanf−F)はSEQ ID NO.1であり、リバ−スプライマ−(mfKanf−R)はSEQ ID NO.2である。
テンプレ−ト:pPic9K。
PCR反応条件:
第1ステップ:94℃で1min変性を行う。
第2ステップ:94℃30s、55℃30s、72℃40sを30回繰り返す。
第3ステップ:72℃で10Min伸長を行う。
fKanrfサイズ:1.28kb。そのヌクレオチド配列はSEQ ID NO.3である。
PCR 産物を1%アガロ−スゲル電気泳動によって分離し、精製して断片を回収する。
プライマ−を設計する:フォワ−ドプライマ−(fKanf−F)はSEQ ID NO.22であり、リバ−スプライマ−(fKanf−R)はSEQ ID NO.231である。
テンプレ−ト:fKanrf。
PCR反応条件:第1ステップ:94℃で1min変性を行う;第2ステップ:94℃30s、55℃30s、72℃40s、30回繰り返す;第3ステップ:72℃で10Min伸長を行う。
二次増幅されるfKanrfのサイズ:1.3kb。
PCR 産物を1%アガロ−スゲル電気泳動によって分離し、精製して断片を回収する。
ホモロジ−ア−ムプライマ−を設計する:もう一度設計してNagE遺伝子配列ホモロジ−ア−ムのフォワ−ドプライマ−(NagEKO−F2)SEQ ID NO.24、リバ−スプライマ−(NagEKO−R2)SEQ ID NO.25を削除する。
テンプレ−ト:ptrc−NanK PCR断片と二次増幅されるfKanrf PCR断片、1:1で混合する。
PCR反応条件:第1ステップ:94℃で1min変性を行う;
第2ステップ:94℃30s、55℃30s、72℃40sを30回繰り返す;
第3ステップ:72℃で10Min伸長を行う。
増幅産物:ホモロジ−ア−ム+ ptrc−WecBM−fKanrf+ホモロジ−ア−ム。
PCR産物をアガロ−スゲル電気泳動により分離し、精製・回収して100ng/μlの線状DNAの完全長PCR断片を得てRed組換えタ−ゲティングに用いる。
先ず、pKD46ベクタ−を大腸菌AT−004−02の菌株に導入する。そして、調製された標的線形DNA断片を電気的に形質転換し、陽性クロ−ンをスクリーニングする。最後に耐性遺伝子を削除する。
i)コンピテントセルを作製する:先ず、−20℃で保存されるEscherichia coli AT−004−02菌液を、1:50−100で10Ml LB液体培地に接種し、37℃、225rpmで、2−3時間振盪培養する。さらに培養液を10Ml遠心管に入れ、4000g×5min、上清を捨て、氷浴用0.1M CaCl2 5mlに5min懸濁させる。最後に4000g×5min遠心分離し、上清を捨て、氷浴用0.1M CaCl2 5mlに懸濁させる。−4℃で12時間放置し、自然沈降させる。
ii)プラスミドの形質転換を行う:自然沈降された菌体250μlを取り、5μl pKD46プラスミドを加え、−4℃、30min。そして、42℃で1.5min水浴し、SOC培地0.7mlを加え、30℃で2時間振盪する。0.2mlの菌液を取り、ペニシリン平板に塗布する。30℃で一晩(12−16時間)培養する。モノクロ−ナルを採取し、5ml LB液体培地に加えて培養し、プラスミドを抽出して同定を行う。陽性菌株を保存して必要に備える。
i)電気的形質転換コンピテントセルを作製する:pKD46 Escherichia coliを含む菌株AT−004−02をアンピシリン(Amp)LB培地を含む試験管に接種し、250rpmで一晩振盪し、翌日1%の量でAmpを含むLB培地に接種し、30℃で培養し、OD600が約0.2に達した後、OD600が約0.4に達するまで、0.2%のL−アラビノ−スを加え、30℃で35分間誘導する。氷浴で冷却する。超純水で1回洗浄し、10%グリセリンで2回洗浄し、最後に10%グリセリンで再懸濁させ、グリセリンの用量は菌体を500−1000倍の最終濃度に濃縮させることが好ましい。
ii)電気ショック形質転換:2mm形質転換用カップを70%エタノ−ルから取り出し、滅菌超純水で2回洗浄し、紫外線ランプで30分間照射する。4℃で30分間予備冷却する。90μlの最終的に再懸濁された細胞を取り、予備冷却用遠心管に移し、5μl(100ng以上)のステップ(1)で得られる完全長PCR断片(線形DNA)を加え、ガンでやさしく吸って均一つに混合させ、30分間氷浴する。
電気的形質転換パラメ−タ::2500V、200Ω、25μF。
iii)陽性クロ−ンの蘇生およびスクリーニング:1mlのLB液体培地を加え、37℃、100rpm、1時間。そして200μlを1つのカナマイシン(Kan)平板に塗布し、全部で5つの平板である。均一に塗布し、乾燥させる。
30℃で24時間培養する。カナマイシン耐性下で成長するクロ−ンを採取し、PCR同定を行い、陽性クロ−ンをスクリーニングする。
得られる菌株の番号: AT−043−01(AT−004−02,△NagE::ptrc−WecBM−fKanrf)。
pCP20を前記カナマイシン耐性クロ−ンに導入し、30℃で8h培養し、そして42℃で一晩放置し、熱誘導によりFLP 組換え酵素を発現させ、プラスミドを徐々に失わせる。シクロスポリン接種液を、抗生物質を含まない培地に詰め、成長したモノクロ−ナルを選んでカナマイシン耐性平板に滴下し、成長しないものはカナマイシン耐性遺伝子がFLP組換え酵素に削除されるクロ−ンである。同定用プライマ−を使ってPCRを行ってカナマイシン耐性が消失したクロ−ンに対して同定を行う。
得られる菌株の番号: AT−043−02(AT−004−02,△NagE::ptrc−WecBM)。
染色体のNagE遺伝子部位においてptrc−WecBM遺伝子カセットが組込まれる組換え菌AT−043−02と対照菌株に対して、フラスコ発酵試験を行う。新鮮培養されるLB平板培地上のモノクロ−ナル菌株を取り、3mlのLB液体培地付き試験管(13×150mm)に接種し、30℃、225rpm、約8時間培養する。そして種培養液を取り、3%を50mlの発酵培養液(M9培養液)を含む250mlフラスコに接種する。初期OD600 は約0.5であり、37℃、225rpmで培養し、発酵サイクルは72時間である。24時間目、48時間目、10M NaOHを使って発酵液のpHを7.0に調整する。据発酵液の糖分消費状況により、65%グルコ−ス溶液を数回に分けて加えてグルコ−ス濃度を20g/lに維持する。発酵が終了し、1mlの発酵液を取り、遠心分離する。HPLC法によってN−アセチル−D−グルコサミン含量を測定する。
本実施例はptrc−WecBMカセットが組込まれる大腸菌株、特にビトレオシラヘモグロビン(Vhb)を発現させる遺伝子Vhb及びその突然変異体が、N−アセチル−D−グルコサミン収率に対する影響について説明する。
(1)Vhb遺伝子を増幅させ、且つptrc99Aを挿入する
ビトレオシラヘモグロビン遺伝子のヌクレオチド配列はSEQ ID NO.60であり、アミノ酸配列はSEQ ID NO.61である。Escherichia coliがコドン塩基を優先することにより、ビトレオシラヘモグロビン遺伝子の最適化・合成を行い、pUC57 ベクタ−をロ−ドする。得られたベクタ−はVhb/pUC57と命名される。
プライマ−を設計する:フォワ−ドプライマ−(Vhb−F)はSEQ ID NO.62であり、リバ−スプライマ−(Vhb−R)はSEQ ID NO.63である。
テンプレ−ト: Vhb/pUC57。
PCR反応条件:第1ステップ:94℃で1min変性を行う;第2ステップ:94℃30s、55℃30s、72℃40s、30回繰り返す;第3ステップ:72℃で10Min伸長を行う。
増幅産物サイズ:441bp。
PCR 産物を1%アガロ−スゲル電気泳動によって分離し、精製して断片を回収する。
得られたPCR増幅断片とベクタ−ptrc99A を、それぞれNco IとHind IIIで消化し、アガロ−スゲル電気泳動により分離し、精製してVhb断片とptrc99A断片を回収し、T4 DNAで酵素を連結し、16℃で一晩放置し、且つ同定を行い、Vhb/ptrc99Aプラスミドが得られる。
1)コンピテントセルを作製する
i)−20℃で保存されるAT−043−02菌液を、1:50−100で10Ml LB液体培地に接種し、37℃、225rpmで、2−3時間振盪培養する。
ii)培養液を10Ml遠心管に入れ、4000g×5min、上清を捨て、氷浴用0.1M CaCl2 5mlに5min懸濁させる。
iii)4000g×5min遠心分離し、上清を捨て、氷浴用0.1M CaCl2 5mlに懸濁させる。−4℃で12時間放置し、自然沈降させる。
2)プラスミドの形質転換を行う
i)自然沈降後の菌体250μlを取り、5μl Vhb/ptrc99Aプラスミドを加え、−4℃、30min。
ii)42℃で1.5min水浴し、SOC培地 0.7mlを加え、30℃で2時間振盪する。
iii)0.2ml菌液を取り、ペニシリン平板に塗布する。
iv)30℃で一晩(12−16時間)培養する。
v)モノクロ−ナルを選び、5ml LB液体培地に入れて培養し、プラスミドを抽出して同定を行う。
vi)陽性クロ−ンを保存して必要に備える。
得られる菌株の番号:AT−056(AT−043−02,Vhb/ptrc99A)。
1)コンピテントセルを作製する
i)−20℃で保存されるAT−043−02菌液を、1:50−100で10Ml LB液体培地に接種し、37℃、225rpmで、2−3時間振盪培養する。
ii)培養液を10Ml遠心管に入れ、4000g×5min、上清を捨て、氷浴用0.1M CaCl2 5mlに5min懸濁させる。
iii)4000g×5min遠心分離し、上清を捨て、氷浴用0.1M CaCl2 5mlに懸濁させる。−4℃で12時間放置し、自然沈降させる。
2)プラスミドの形質転換を行う
i)自然沈降後の菌体250μlを取り、5μl Vhb/ptrc99Aプラスミドを加え、−4℃、30min。
ii)42℃で1.5min水浴し、SOC培地 0.7mlを加え、30℃で2時間振盪する。
iii)0.2ml菌液を取り、ペニシリン平板に塗布する。
iv)30℃で一晩(12−16時間)培養する。
v)モノクロ−ナルを選び、5ml LB液体培地に入れて培養し、プラスミドを抽出して同定を行う。
vi)陽性クロ−ンを保存して必要に備える。
得られる菌株の番号:AT−057(AT−043−02,VhbM/ptrc99A)。
ptrc−WecBMカセットが組込まれる菌株、ビトレオシラヘモグロビンを発現させる遺伝子およびその突然変異菌株 AT−056、AT−057に対して、フラスコ発酵試験を行う。新鮮培養されるLB平板培地上のモノクロ−ナル菌株を取り、3mlのLB液体培地付き試験管(13×150mm)に接種し、30℃、225rpmで、約8時間培養する。そして種培養液を取り、3%を50mlのM9培養液を含む250mlフラスコに接種する。初期OD600 は約0.5であり、37℃、225rpmで培養し、発酵サイクルは72時間である。24時間目、48時間目に、10M NaOHを使って発酵液のpHを7.0に調整する。発酵液の糖分消費状況により、65%グルコ−ス溶液を数回に分けて加えてグルコ−ス濃度を20g/lに維持する。発酵が終了し、1ml発酵液を取り、遠心分離する。HPLC法によってN−アセチル−D−グルコサミン含量を測定する。
本実施例はNagB遺伝子の内在性天然プロモーターをTrcプロモーターに置換し、さらにGlmS遺伝子の内在性天然プロモーターを削除することが、N−アセチル−D−グルコサミン収率に対する影響について説明する
nagレギュレ−タ(NagE−NagBACD)の中のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼ(D−Glucosamine−6−pHospHate deaminase、NagB)の遺伝子のプロモーターを削除し、Trcプロモーターに置換する。D−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼ(D−Glucosamine−6−pHospHate deaminase、NagB)による触媒反応は可逆的であり、NagBを過剰発現させ、NagBの順方向触媒反応を加速し、D−グルコサミン6−リン酸(GlcN−6−P)を増加させるという目的を達成する。
先ず、Trcプロモーター断片とfKanrf断片を増幅させ、且つ連結する。そして、ホモロジ−ア−ムプライマ−を設計する、Red組換え標的線形DNA完全長断片を増幅させる。
開示情報から、Trcプロモーター配列:SEQ ID NO.32を見つける。
プライマ−を設計する:フォワ−ドプライマ−(KanTrcRed−F)はSEQ ID NO.33であり、リバ−スプライマ−(KanTrcRed−R)はSEQ ID NO.34である。
テンプレ−ト:ptrc99A
PCR反応条件:
第1ステップ:94℃で1min変性を行う。
第2ステップ:94℃30s、55℃30s、72℃40sを30回繰り返す。
第3ステップ:72℃で10Min伸長を行う。
産物サイズ:166bp。
PCR 産物を1%アガロ−スゲル電気泳動によって分離し、精製して断片を回収する。
プライマ−を設計する:フォワ−ドプライマ−(mfKanf−F)はSEQ ID NO.1であり、リバ−スプライマ−(mfKanf−R)はSEQ ID NO.2である。
テンプレ−ト:pPic9K。
PCR反応条件:第1ステップ:94℃で1min変性を行う;
第2ステップ:94℃30s、55℃30s、72℃40sを30回繰り返す;
第3ステップ:72℃で10Min伸長を行う。
fKanrfサイズ:1.28kb。そのヌクレオチド配列はSEQ ID NO.3である。
PCR 産物を1%アガロ−スゲル電気泳動によって分離し、精製して断片を回収する。
プライマ−を設計する:フォワ−ドプライマ−(fKanfRed−F1)はSEQ ID NO.35であり、リバ−スプライマ−(fKanfRed−R1)はSEQ ID NO.36である。
テンプレ−ト:fKanrf。
PCR反応条件:
第1ステップ:94℃で1min変性を行う。
第2ステップ:94℃30s、55℃30s、72℃40s、30回繰り返す。
第3ステップ:72℃で10Min伸長を行う。
二次増幅されるfKanrfのサイズ:1.3kb。
PCR 産物を1%アガロ−スゲル電気泳動によって分離し、精製して断片を回収する。
ホモロジ−ア−ムプライマ−を設計する: NCBI からNC_000913、Escherichia coli str. K−12 NagBプロモーターの配列とNagE遺伝子の配列SEQ ID NO.13を見つけ、設計してNagBプロモーターホモロジ−ア−ムのフォワ−ドプライマ−(NagBKO−F1)SEQ ID NO.40、リバ−スプライマ−(NagBKO−R1)SEQ ID NO.41を削除する。
テンプレ−ト:Trc プロモーターPCR断片と二次増幅されるfKanrf PCR断片を1:1で混合する。
PCR反応条件:第1ステップ:94℃で1min変性を行う;第2ステップ:94℃30s、55℃30s、72℃40s、30回繰り返す;第3ステップ:72℃で10Min伸長を行う。
増幅産物:ホモロジ−ア−ム+ fKanrf+ Trcプロモーター+ホモロジ−ア−ム。
PCR産物をアガロ−スゲル電気泳動により分離し、精製・回収して100ng/μlの線状DNAの完全長PCR断片を得てRed組換えタ−ゲティングに用いる。
先ず、pKD46ベクタ−を大腸菌AT−005−02の菌株に導入する。そして、調製された標的線形DNA断片を電気的に形質転換し、陽性クロ−ンをスクリーニングする。最後に耐性遺伝子を削除する。
得られる菌株の番号:AT−048(AT−005−02、△NagB promotor::Trc promoter)。
グルコサミン6−リン酸シンターゼ(Glucosamine−6−pHospHate synthase、GlmS)の遺伝子のプロモーター配列を削除する。グルコサミン6−リン酸シンターゼ(GlmS)はL−グルタミン−6−リン酸アミノトランスファラーゼ(L−glutamine:D−fructose−6−pHospHate aminotransferase)とも呼ばれ、グルコ−ス−6−リン酸(Glc−6−P)からD−グルコサミン6−リン酸(GlcN−6−P)へのアミノ化に触媒として作用することができるが、深刻な産物抑制問題があり、そのプロモーターの配列を削除し、当該酵素に発現を失わせることにより、GlcN−6−Pの産物抑制を解除することができる。
(1)両端にFLP 組換え酵素識別部位(FRT 部位)を有するカナマイシン耐性遺伝子:fKanrfを増幅させる
プライマ−を設計する:フォワ−ドプライマ−(mfKanf−F)はSEQ ID NO.1であり、リバ−スプライマ−(mfKanf−R)はSEQ ID NO.2である。
テンプレ−ト:pPic9K。
PCR反応条件:第1ステップ:94℃で1min変性を行う;
第2ステップ:94℃30s、55℃30s、72℃40sを30回繰り返す;第3ステップ:
72℃で10Min伸長を行う。
fKanrfサイズ:1.28kb。そのヌクレオチド配列はSEQ ID NO.3である。
PCR 産物を1%アガロ−スゲル電気泳動によって分離し、精製して断片を回収する。
ホモロジ−ア−ムプライマ−を設計する: NCBI からNC_000913、Escherichia coli str. K−12 L−グルタミン−6−リン酸アミノトランスファラーゼ(GlmS)遺伝子のプロモーター配列SEQ ID NO.42を見つけ、GlmS遺伝子プロモーター配列が削除されるホモロジ−ア−ムフォワ−ドプライマ−(ProGlmSKO−F)SEQ ID NO.43、リバ−スプライマ−(ProGlmSKO−R)SEQ ID NO.44を設計する。
テンプレ−ト:fKanrf PCR断片。
PCR反応条件:
第1ステップ:94℃で1min変性を行う。
第2ステップ:94℃30s、55℃30s、72℃40s、30回繰り返す。
第3ステップ:72℃で10Min伸長を行う。
増幅産物:ホモロジ−ア−ム+ fKanf+ホモロジ−ア−ム。
PCR産物をアガロ−スゲル電気泳動により分離し、精製・回収して100ng/μlの線状DNAの完全長PCR断片を得てRed組換えタ−ゲティングに用いる。
先ず、pKD46ベクタ−を大腸菌AT−048の菌株に導入する。そして、調製された標的線形DNA断片を電気的に形質転換し、陽性クロ−ンをスクリーニングする。最後に耐性遺伝子を削除する。
得られる菌株の番号:AT−049(AT−048,△GlmS promotor)。
NagBプロモーターを発現レベルがより高いプロモーターに置換する菌株、及びさらにGlmSプロモーターを削除する組換え菌株に対して、フラスコ発酵試験を行う。新鮮培養されるLB平板培地上のモノクロ−ナル菌株を取り、3mlのLB液体培地付き試験管(13×150mm)に接種し、30℃、225rpm、約8時間培養する。そして種培養液を取り、3%を50mlの発酵培養液(M9培養液)を含む250mlフラスコに接種する。初期OD600 は約0.5であり、37℃、225rpmで培養し、発酵サイクルは72時間である。24時間目、48時間目、10M NaOHを使って発酵液のpHを7.0に調整する。据発酵液の糖分消費状況により、65%グルコ−ス溶液を数回に分けて加えてグルコ−ス濃度を20g/lに維持する。発酵が終了し、1mlの発酵液を取り、遠心分離する。HPLC法によってN−アセチル−D−グルコサミン含量を測定する。
本実施例はGlmS遺伝子の内在性天然プロモーターをTrcプロモーターに置換し、さらにNagB遺伝子の内在性天然プロモーター削除することが、N−アセチル−D−グルコサミン収率に対する影響について説明する
L−グルタミン−6−リン酸アミノトランスファラーゼ(L−glutamine:D−fructose−6−pHospHate aminotransferase)の遺伝子のプロモーター配列をTrcプロモーター配列に置換する。L−グルタミン−6−リン酸アミノトランスファラーゼはグルコサミン6−リン酸シンターゼ(Glucosamine−6−pHospHate synthase、GlmS)とも呼ばれ、そのプロモーター配列をTrcプロモーター配列に置換することにより、GlmSを過剰発現させ、GlmSの触媒機能を向上させることができ、ぞれによってD−グルコサミン6−リン酸(GlcN−6−P)を増加させるという目的を達成する。
先ず、Trcプロモーター配列断片とfKanrf断片を増幅させ、且つ連結する。そして、ホモロジ−ア−ムプライマ−を設計する、Red組換え標的線形DNA完全長断片を増幅させる。
ホモロジ−ア−ムプライマ−を設計する: GlmS遺伝子のプロモーター配列SEQ ID NO.42により、設計してTrcプロモーターのホモロジ−ア−ムフォワ−ドプライマ−(ProGlmSptrc−F)SEQ ID NO.45、リバ−スプライマ−(ProGlmSptrc−R)SEQ ID NO.46に置換する。
テンプレ−ト:Trc プロモーター PCR断片と二次増幅されたfKanrf PCR断片を1:1で混合する。
PCR反応条件:
第1ステップ:94℃で1min変性を行う。
第2ステップ:94℃30s、55℃30s、72℃40sを30回繰り返す。
第3ステップ:72℃で10Min伸長を行う。
増幅産物:ホモロジ−ア−ム+ fKanrf+ Trcプロモーター+ホモロジ−ア−ム。
PCR産物をアガロ−スゲル電気泳動により分離し、精製・回収して100ng/μlの線状DNAの完全長PCR断片を得てRed組換えタ−ゲティングに用いる。
先ず、pKD46ベクタ−を大腸菌AT−005−02の菌株に導入する。そして、調製された標的線形DNA断片を電気的に形質転換し、陽性クロ−ンをスクリーニングする。最後に耐性遺伝子を削除する。
得られる菌株の番号:AT−050(AT−005−02,△GlmS promotor::Trc promoter)。
nagレギュレ−タ(NagE−NagBACD)の中のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼ(D−Glucosamine−6−pHospHate deaminase、NagB)の遺伝子のプロモーター配列を削除し、NagBに機能を失わせることにより、NagBの逆方向触媒機能を削除し、GlcN−6−PからGlc−6−Pへの生成を低下させることができる。
先ず、fKanrf断片を増幅させ、そして、ホモロジ−ア−ムプライマ−を設計し、Red組換え標的線形DNA完全長断片を調製する。
ホモロジ−ア−ムプライマ−を設計する: NagBプロモーターとNagE遺伝子配列SEQ ID NO.13により、設計してNagBプロモーター配列のホモロジ−ア−ムフォワ−ドプライマ−(NagBKO−F2)SEQ ID NO.47、リバ−スプライマ−(NagBKO−R2)SEQ ID NO.48を削除する。
テンプレ−ト:fKanrf PCR断片
PCR反応条件:第1ステップ:94℃で1min変性を行う;
第2ステップ:94℃30s、55℃30s、72℃40sを30回繰り返す;
第3ステップ:72℃で10Min伸長を行う。
増幅産物:ホモロジ−ア−ム+fKanrf+ホモロジ−ア−ム。
PCR産物をアガロ−スゲル電気泳動により分離し、精製・回収して100ng/μlの線状DNAの完全長PCR断片を得てRed組換えタ−ゲティングに用いる。
先ず、pKD46ベクタ−を大腸菌AT−050の菌株に導入する。そして、調製された標的線形DNA断片を電気的に形質転換し、陽性クロ−ンをスクリーニングする。最後に耐性遺伝子を削除する。
得られる菌株の番号:AT−051(AT−050,△NagB promotor)。
GlmSプロモーターを発現レベルがより高いプロモーターに置換する菌株、およびNagBプロモーターを削除する組換え菌株に対して、フラスコ発酵試験を行う。新鮮培養されるLB平板培地上のモノクロ−ナル菌株を取り、3mlのLB液体培地付き試験管(13×150mm)に接種し、30℃、225rpm、約8時間培養する。そして種培養液を取り、3%を50mlの発酵培養液(M9培養液)を含む250mlフラスコに接種する。初期OD600 は約0.5であり、37℃、225rpmで培養し、発酵サイクルは72時間である。24時間目、48時間目、10M NaOHを使って発酵液のpHを7.0に調整する。据発酵液の糖分消費状況により、65%グルコ−ス溶液を数回に分けて加えてグルコ−ス濃度を20g/lに維持する。発酵が終了し、1mlの発酵液を取り、遠心分離する。HPLC法によってN−アセチル−D−グルコサミン含量を測定する。
本実施例はGlmS遺伝子とNagB遺伝子の内在性天然プロモーターを置換及び/又は削除する大腸菌株、ビトレオシラヘモグロビン(Vhb)を発現させる遺伝子Vhb及びその突然変異体が、N−アセチル−D−グルコサミン収率に対する影響について説明する。
ビトレオシラヘモグロビン(Vhb)の遺伝子Vhbを増幅させ、且つptrc99Aを挿入し、それによってVhbをTrcプロモーターの制御下で菌株の形質転換を行い、またはビトレオシラヘモグロビン(Vhb)の遺伝子Vhbの突然変異体をスクリーニングしてptrc99Aを挿入し、菌株の形質転換を行い、それによって微生物の溶存酸素を利用する能力を向上させ、N−アセチルグルコサミン発酵生産収率を向上させる。
(1)Vhb遺伝子を増幅させ、且つptrc99Aを挿入する
ビトレオシラヘモグロビン遺伝子のヌクレオチド配列はSEQ ID NO.60であり、アミノ酸配列はSEQ ID NO.61である。Escherichia coliがコドン塩基を優先することにより、ビトレオシラヘモグロビン遺伝子の最適化・合成を行い、pUC57 ベクタ−をロ−ドする。得られたベクタ−はVhb/pUC57と命名される。
プライマ−を設計する:フォワ−ドプライマ−(Vhb−F)はSEQ ID NO.62であり、リバ−スプライマ−(Vhb−R)はSEQ ID NO.63である。
テンプレ−ト: Vhb/pUC57。
PCR反応条件:第1ステップ:94℃で1min変性を行う;
第2ステップ:94℃30s、55℃30s、72℃40sを30回繰り返す;
第3ステップ:72℃で10Min伸長を行う。
増幅産物サイズ:441bp。
PCR 産物を1%アガロ−スゲル電気泳動によって分離し、精製して断片を回収する。
得られるPCR増幅断片とベクタ−ptrc99AをそれぞれNco IとHind IIIで消化し、アガロ−スゲル電気泳動により分離し、精製してVhb断片とptrc99A断片を回収し、T4 DNAで酵素を連結し、16℃で一晩放置し、且つ同定を行い、Vhb/ptrc99Aプラスミドが得られる。
1)コンピテントセルを作製する
i)−20℃で保存されるAT−049菌液を、1:50−100で10Ml LB液体培地に接種し、37℃、225rpmで、2−3時間振盪培養する。
ii)培養液を10Ml遠心管に入れ、4000g×5min、上清を捨て、氷浴用0.1M CaCl2 5mlに5min懸濁させる。
iii)4000g×5min遠心分離し、上清を捨て、氷浴用0.1M CaCl2 5mlに懸濁させる。−4℃で12時間放置し、自然沈降させる。
2)プラスミドの形質転換を行う
i)自然沈降後の菌体250μlを取り、5μl Vhb/ptrc99Aプラスミドを加え、−4℃、30min。
ii)42℃で1.5min水浴し、SOC培地 0.7mlを加え、30℃で2時間振盪する。
iii)0.2ml菌液を取り、ペニシリン平板に塗布する。
iv)30℃で一晩(12−16時間)培養し。
v)モノクロ−ナルを選び、5ml LB液体培地に入れて培養し、プラスミドを抽出して同定を行う。
vi)陽性クロ−ンを保存して必要に備える。
得られる菌株の番号:AT−058(AT−049,Vhb/ptrc99A)、AT−059(AT−049,VhbM/ptrc99A)。
1)コンピテントセルを作製する
i)−20℃で保存されるAT−051菌液を、1:50−100で10Ml LB液体培地に接種し、37℃、225rpmで、2−3時間振盪培養する。
ii)培養液を10Ml遠心管に入れ、4000g×5min、上清を捨て、氷浴用0.1M CaCl2 5mlに5min懸濁させる。
iii)4000g×5min遠心分離し、上清を捨て、氷浴用0.1M CaCl2 5mlに懸濁させる。−4℃で12時間放置し、自然沈降させる。
2)プラスミドの形質転換を行う
i)自然沈降後の菌体250μlを取り、5μl Vhb/ptrc99Aプラスミドを加え、−4℃、30min。
ii)42℃で1.5min水浴し、SOC培地0.7mlを加え、30℃で2時間振盪する。
iii)0.2ml菌液を取り、ペニシリン平板に塗布する。
iv)30℃で一晩(12−16時間)培養する。
v)モノクロ−ナルを選び、5ml LB液体培地に入れて培養し、プラスミドを抽出して同定を行う。
vi)陽性クロ−ンを保存して必要に備える。
得られる菌株の番号:AT−060(AT−051,Vhb/ptrc99A)、AT−061(AT−051,VhbM/ptrc99A)。
GlmS遺伝子とNagB遺伝子の内在性天然プロモーターを置換及び/又は削除する菌株、ビトレオシラヘモグロビンを発現させる遺伝子及びその突然変異菌株AT−058、AT−059、AT−060、AT−061に対して、フラスコ発酵試験を行う。新鮮培養されるLB平板培地上のモノクロ−ナル菌株を取り、3mlのLB液体培地付き試験管(13×150mm)に接種し、30℃、225rpmで、約8時間培養する。そして種培養液を取り、3%を50mlのM9培養液を含む250mlフラスコに接種する。初期OD600 は約0.5であり、37℃、225rpmで培養し、発酵サイクルは72時間である。24時間目、48時間目、10M NaOHを使って発酵液のpHを7.0に調整する。発酵液の糖分消費状況により、65%グルコ−ス溶液を数回に分けて加えてグルコ−ス濃度を20g/lに維持する。発酵が終了し、1ml発酵液を取り、遠心分離し。HPLC法によりN−アセチル−D−グルコサミン含量を測定する。
本実施例はptrc−NanKMカセットが組込まれる大腸菌株、且つNanE遺伝子の内在性天然プロモーターをTrcプロモーターに置換し、さらにビトレオシラヘモグロビン(Vhb)を発現させる遺伝子Vhb及びその突然変異体が、N−アセチル−D−グルコサミン収率に対する影響について説明する。
先ず、Trcプロモーター配列断片とfKanrf断片を増幅させ、且つ連結する。そして、ホモロジ−ア−ムプライマ−を設計する、Red組換え標的線形DNA完全長断片を増幅させる。
開示情報から、Trcプロモーター配列:SEQ ID NO.32を見つける。
プライマ−を設計する:フォワ−ドプライマ−(KanTrcRed−F)はSEQ ID NO.33であり、リバ−スプライマ−(KanTrcRed−R)はSEQ ID NO.34である。
テンプレ−ト:ptrc99A
PCR反応条件:
第1ステップ:94℃で1min変性を行う。
第2ステップ:94℃30s、55℃30s、72℃40sを30回繰り返す。
第3ステップ:72℃で10Min伸長を行う。
産物サイズ:166bp。
PCR 産物を1%アガロ−スゲル電気泳動によって分離し、精製して断片を回収する。
プライマ−を設計する:フォワ−ドプライマ−(mfKanf−F)はSEQ ID NO.1であり、リバ−スプライマ−(mfKanf−R)はSEQ ID NO.2である。
テンプレ−ト:pPic9K。
PCR反応条件:第1ステップ:94℃で1min変性を行う;第2ステップ:94℃30s、55℃30s、72℃40s、30回繰り返す;第3ステップ:72℃で10Min伸長を行う。
fKanrfサイズ:1.28kb。そのヌクレオチド配列はSEQ ID NO.3である。
PCR 産物を1%アガロ−スゲル電気泳動によって分離し、精製して断片を回収する。
プライマ−を設計する:フォワ−ドプライマ−(fKanfRed−F1)はSEQ ID NO.35であり、リバ−スプライマ−(fKanfRed−R1)はSEQ ID NO.36である。
テンプレ−ト:fKanrf。
PCR反応条件:
第1ステップ:94℃で1min変性を行う。
第2ステップ:94℃30s、55℃30s、72℃40sを30回繰り返す。
第3ステップ:72℃で10Min伸長を行う。
二次増幅されるfKanrfのサイズ:1.3kb。
PCR 産物を1%アガロ−スゲル電気泳動によって分離し、精製して断片を回収する。
ホモロジ−ア−ムプライマ−を設計する: NanE遺伝子のプロモーター配列SEQ ID NO.37により、設計してTrcプロモーターのホモロジ−ア−ムフォワ−ドプライマ−(ProNanEptrc−F)SEQ ID NO.38、リバ−スプライマ−(ProNanEptrc−R)SEQ ID NO.39に置換する。
テンプレ−ト:Trc プロモーター PCR断片と二次増幅されるfKanrf PCR断片を、1:1で混合する。
PCR反応条件:
第1ステップ:94℃で1min変性を行う。
第2ステップ:94℃30s、55℃30s、72℃40sを30回繰り返す。
第3ステップ:72℃で10Min伸長を行う。
増幅産物:ホモロジ−ア−ム+ fKanrf+ Trcプロモーター+ホモロジ−ア−ム。
PCR産物をアガロ−スゲル電気泳動により分離し、精製・回収して100ng/μlの線状DNAの完全長PCR断片を得てRed組換えタ−ゲティングに用いる。
先ず、pKD46ベクタ−を大腸菌AT−007−02の菌株に導入する。そして、調製された標的線形DNA断片を電気的に形質転換し、陽性クロ−ンをスクリーニングする。最後に耐性遺伝子を削除する。
得られる菌株の番号: AT−009(AT−007−02、△NanE promotor::Trc promoter)。
先ず、組換え大腸菌株AT−009のコンピテントセルを作製し、そして、Vhb/ptrc99AとVhbM/ptrc99AプラスミドをCaCl2形質転換法によってAT−009に導入し、モノクロ−ナルを採取して培養し、プラスミドを抽出して陽性クロ−ンの同定を行う。
得られる菌株の番号:AT−062(AT−009、Vhb/ptrc99A)、AT−063(AT−009、VhbM/ptrc99A)。
本実施例はptrc−NanKMカセットが組込まれる大腸菌株、且つグルコサミン6−リン酸シンターゼ(GlmS)の遺伝子GlmS及び/又はD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼ(NagB)の遺伝子NagBの内在性天然プロモーターを置換及び/又は削除し、そしてビトレオシラヘモグロビン(Vhb)を発現させる遺伝子Vhb及びその突然変異体が、N−アセチル−D−グルコサミン収率に対する影響について説明する。
組換え大腸菌株AT−011、AT−013のコンピテントセルを作製し、そして、Vhb/ptrc99AとVhbM/ptrc99AプラスミドをCaCl2形質転換法によってAT−011、AT−013に導入し、モノクロ−ナルを採取して培養して、プラスミドを抽出して陽性クロ−ンの同定を行う。
得られる菌株の番号:AT−064(AT−011,Vhb/ptrc99A)、AT−065(AT−011,VhbM/ptrc99A)、AT−066(AT−013,Vhb/ptrc99A)、AT−067(AT−013,VhbM/ptrc99A)。
本実施例はptrc−NanKMカセットが組込まれる大腸菌株、且つWecB遺伝子の内在性天然プロモーターをTrcプロモーターに置換し、そしてビトレオシラヘモグロビン(Vhb)を発現させる遺伝子Vhb及びその突然変異体が、N−アセチル−D−グルコサミン収率に対する影響について説明する。
先ず、Trcプロモーター配列断片とfKanrf断片を増幅させ、且つ連結する。そして、ホモロジ−ア−ムプライマ−を設計し、Red組換え標的線形DNA完全長断片を増幅させる。
ホモロジ−ア−ムプライマ−を設計する:NCBI からNC_000913を見つけ、Escherichia coli UDP−N−アセチルグルコサミン2−エピメラーゼ(WecB)遺伝子のプロモーターのヌクレオチド配列SEQ ID NO.53が得られ、設計してTrcプロモーターのホモロジ−ア−ムフォワ−ドプライマ−(ProWecBptrc−F)SEQ ID NO.54、リバ−スプライマ−(Pro WecBptrc−R)SEQ ID NO.55に置換する。
テンプレ−ト:Trc プロモーター PCR断片と二次増幅されるfKanrf PCR断片を、1:1で混合する。
PCR反応条件:
第1ステップ:94℃で1min変性を行う。
第2ステップ:94℃30s、55℃30s、72℃40sを30回繰り返す。
第3ステップ:72℃で10Min伸長を行う。
増幅産物:ホモロジ−ア−ム+ fKanrf+ Trcプロモーター+ホモロジ−ア−ム。
PCR産物をアガロ−スゲル電気泳動により分離し、精製・回収して100ng/μlの線状DNAの完全長PCR断片を得てRed組換えタ−ゲティングに用いる。
先ず、pKD46ベクタ−を大腸菌AT−007−02の菌株に導入する。そして、調製された標的線形DNA断片を電気的に形質転換し、陽性クロ−ンをスクリーニングする。最後に耐性遺伝子を削除する。
得られる菌株の番号:AT−019(AT−007−02,△WecB promotor::Trc promoter)。
先ず、組換え大腸菌株AT−019のコンピテントセルを作製し、そして、Vhb/ptrc99AとVhbM/ptrc99AプラスミドをCaCl2形質転換法によってAT−019に導入し、モノクロ−ナルを採取して培養し、プラスミドを抽出して陽性クロ−ンの同定を行う。
得られる菌株の番号:AT−068(AT−019,Vhb/ptrc99A)、AT−069(AT−019,VhbM/ptrc99A)。
本実施例はptrc−NanEMカセットが組込まれる大腸菌株、且つグルコサミン6−リン酸シンターゼ(GlmS)の遺伝子GlmS及び/又はD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼ(NagB)の遺伝子NagBの内在性天然プロモーターを置換及び/又は削除し、そしてビトレオシラヘモグロビン(Vhb)を発現させる遺伝子Vhb及びその突然変異体が、N−アセチル−D−グルコサミン収率に対する影響について説明する。
ptrc−NanEMカセットが組込まれる大腸菌株GlmSの遺伝子の内在性天然プロモーターをTrcプロモーターに置換してAT−034(AT−031−02、△GlmS promotor::Trc promoter)が得られ、さらにNagB遺伝子の内在性天然プロモーターを削除してAT−035(AT−034、△NagB promotor)が得られる。
得られる菌株の番号:AT−070(AT−033,Vhb/ptrc99A)、AT−071(AT−033,VhbM/ptrc99A)、AT−072(AT−035,Vhb/ptrc99A)、AT−073(AT−035,VhbM/ptrc99A)。
本実施例はptrc−NanEMカセットが組込まれる大腸菌株、且つWecB遺伝子の内在性天然プロモーターをTrcプロモーターに置換し、そしてビトレオシラヘモグロビン(Vhb)を発現させる遺伝子Vhb及びその突然変異体が、N−アセチル−D−グルコサミン収率に対する影響について説明する。
組換え大腸菌株AT−037のコンピテントセルを作製し、そして、Vhb/ptrc99AとVhbM/ptrc99AプラスミドをCaCl2形質転換法によってAT−037に導入し、モノクロ−ナルを採取して培養し、プラスミドを抽出して陽性クロ−ンの同定を行う。
得られる菌株の番号:AT−074(AT−037,Vhb/ptrc99A)、AT−075(AT−037,VhbM/ptrc99A)。
本実施例はptrc−WecBMカセットが組込まれる大腸菌株、グルコサミン6−リン酸シンターゼ(GlmS)の遺伝子GlmS及び/又はD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼ(NagB)の遺伝子NagBの内在性天然プロモーターを置換及び/又は削除し、そしてビトレオシラヘモグロビン(Vhb)を発現させる遺伝子Vhb及びその突然変異体が、N−アセチル−D−グルコサミン収率に対する影響について説明する。
得られる菌株の番号:AT−076(AT−045,Vhb/ptrc99A)、AT−077(AT−045,VhbM/ptrc99A)、AT−078(AT−047,Vhb/ptrc99A)、AT−079(AT−047,VhbM/ptrc99A)。
本実施例はptrc−NanKMカセットが組込まれ、NanE遺伝子の内在性天然プロモーターをTrcプロモーターに置換する大腸菌株、GlmS遺伝子とNagB遺伝子の内在性天然プロモーターを置換及び/又は削除し、WecB遺伝子の内在性天然プロモーターをTrcプロモーターに置換し、そしてビトレオシラヘモグロビン(Vhb)を発現させる遺伝子Vhb及びその突然変異体が、N−アセチル−D−グルコサミン収率に対する影響について説明する。
得られる菌株の番号:AT−080(AT−027、Vhb/ptrc99A)、AT−081(AT−027、VhbM/ptrc99A)、AT−082(AT−029、Vhb/ptrc99A)、AT−083(AT−029、VhbM/ptrc99A)。
本実施例は10L発酵槽でN−アセチル−D−グルコサミンを製造するための発酵試験について説明する
組換えエンジニアリング菌株AT−083を生産菌株とし、10L発酵槽でN−アセチル−D−グルコサミンを製造するための発酵試験を行う。
(1)一次種培養:新鮮培養されるLB平板培地上のモノクロ−ナル菌株を選び、8mlのLB液体培地に接種し、37℃、225rpmで8時間培養する。
(2)二次種培養:6mlの一次種培養液を取り、200mlのM9培養液を含む1000mlフラスコに接種し、37℃、225rpmで16時間培養する。OD600値が6.0−10になるまで、大抵対数増殖期にある。
(3)発酵培地を表25に従って調製し、そのうち、微量元素溶液を表26に従って調製し、マルチビタミン溶液を表27に従って調製する。
i)微量元素溶液を滅菌後別々に加え、ビタミン溶液を濾過後加える;
ii)グルコ−ス:濃度65%(w/v)、別々に滅菌し、接種前に加える。グルコ−ス添加量: 6.0g/l;
iii)前記ものを混合した後、10M NH4OHを使ってpHを7.0に調整する;
iv)発酵培地はグルコ−スを加える前に基礎培地であり、基礎培地の初期液量(培地の初期体積が発酵槽の総容量に占める割合):50%。
二次種液を40ml/Lで発酵槽に接種する。
接種量:2.55%(体積として),初期OD600は0.3−0.5。
10L自己制御型発酵槽を使って高密度発酵を行い、付属ソフトウェアを使ってデ−タ収集を行い、コンピュ−タオンライン制御を実現する。制御パラメ−タは次のとおりである:エア流量0.5−1 vvm.;溶存酸素≧20%、それによって回転速度を向上させ換気を調整する;温度37℃;pH値7.0、自動流動プラス飽和アンモニア水によって一定に保つ。基礎培地におけるグルコ−スが消費され、即ち溶存酸素が回復するとき糖分を補充する。糖分補充速度は残糖濃度0.45g/l以下を基準とする。糖分補充液はグルコ−ス濃度65%(w/v)であり、且つ2.5%グルコン酸ナトリウムまたは6%リボ−スを加える。60−72 h後発酵終了する。総液体量は75−80%である。
(1)菌株の番号:AT−083。ロット番号:1019。
(2)種液濃度:OD600は2.8である。
(3)基材:4L。
(4)接種量200ml。
(5)糖分補充速度:残糖濃度0.45g/l以下となるように制御する。
(6)糖分補充液:グルコ−ス濃度65%(w/v)であり、且つ2.5%グルコン酸ナトリウムを加える。
(7)追跡指数: OD600、残糖含量(発酵液中の残存グルコ−ス)を測定する。
(8)産物: N−アセチル−D−グルコサミン。力価:72時間156g/l。
本実施例はN−アセチル−D−グルコサミンとD−グルコサミン塩酸塩を分離・精製する後処理工程について説明する。
(1)不活性化:発酵液80℃、30min。
(2)固液分離:4000−8000rpmで遠心分離し、残渣と蛋白質を捨て、発酵液を取る。また、セラミック膜でろ過しても良い。
(3)脱色:製品:水:活性炭=1:(1.5−3):(0.01−0.1)、0.5−5h撹拌する。
(4)脱塩:電気透析によって脱塩する。高濃度槽に発酵液を加える時の初期塩濃度:0.01−0.05mol/L。低濃度槽中の発酵液の流速:40−80L/h、高濃度槽中の発酵液の流速:40−80L/h、シングルフィルム接地電圧0.5−1.4V。また陰・陽イオン交換樹脂により脱塩しても良い。
(5)濃縮:脱塩後の発酵液を真空条件(0.095MPa)下で50−80℃まで加熱し、8−15h濃縮し、過飽和となり、約4−6倍である。
(6)結晶化:濃縮後の発酵液を先ず25℃の水で25−35℃まで温度低下させ、そして0℃の水で1−3h温度低下させ、0−10℃になる。無水エタノ−ル(用量が製品重量の5−20倍)を加え、700−1500rpmで15min−1h撹拌する。
(7)洗浄:無水エタノ−ル(製品と等量)を加え、10−100rpmで、0.5−2h撹拌する。
(8)乾燥:50−100℃、3−10h。純度:99.96%。総収率:91.5%。
(1)不活性化:発酵液80℃、30min。
(2)固液分離:4000−8000rpmで遠心分離し、残渣と蛋白質を捨て、発酵液を取る。また、セラミック膜でろ過しても良い。
(3)脱色:製品:水:活性炭=1:(1.5−3):(0.01−0.1)、0.5−5h撹拌する。
(4)脱塩:電気透析によって脱塩する。高濃度槽に発酵液を加える時の初期塩濃度:0.01−0.05mol/L。低濃度槽中の発酵液の流速:40−80L/h、高濃度槽中の発酵液の流速:40−80L/h、シングルフィルム接地電圧0.5−1.4V。また陰・陽イオン交換樹脂により脱塩しても良い。
(5)濃縮:脱塩後の発酵液を真空条件(0.095MPa)下で50−80℃まで加熱し、8−15h濃縮し、過飽和となり、約4−6倍である。
(6)加水分解:濃縮後の発酵液をエナメルまたはガラス容器に入れ、濃塩酸(37%)を加えて最終濃度を12−16%にし、均一に撹拌し、70℃で90min温度を維持する。塩酸をリサイクルすることができる。
(7)結晶化:まず25℃の水で温度を25−35℃まで下げ、そして0℃の水で1−3h温度低下させ、4℃になる。
(8)洗浄:無水エタノ−ル(製品と等量)を加え、10−100rpmで0.5−2h撹拌する。700−1500rpmで、15−60min遠心分離し、グルコサミン塩酸塩が得られ、転換率は89.5%である。
(9)溶解:洗浄後の製品を水に溶解し、水の用量は最初の発酵液の体積である。
(10)脱色:活性炭(用量は1%)を加える。30分間混合する。700−1500rpmで、15−60min遠心分離する。あるいは濾過し、無色の濾液が得られる。
(11)再結晶化:50℃と55cmHg真空下で濾液を真空蒸発させて過飽和となる。無水エタノ−ル(用量が製品重量の5−20倍)を加え、700−1500rpmで15min−1h撹拌する。
(12)洗浄:無水エタノ−ル(製品と等量)を加え、10−100rpmで、0.5−2h撹拌する。700−1500rpmで、15−60min遠心分離する。
(13)乾燥:50−100℃、3−10h。純度:99.92%。総収率:84.6%。
(付記1)
微生物発酵によってN−アセチル−D−グルコサミン及び/又はD−グルコサミン塩を製造する方法であって、当該方法は次を含む:
A)発酵培地において微生物培養を行い、前記微生物は少なくとも1種のビトレオシラヘモグロビン(Vhb)を発現させることができる遺伝子改変を含む;及び
B)培養工程A)から産生されるN−アセチル−D−グルコサミンを収集する;
好ましくは、さらにC)N−アセチル−D−グルコサミンから脱アセチル化して得られるD−グルコサミン塩を含む;
より好ましくは、前記塩は塩酸塩、硫酸塩、ナトリウム塩、リン酸塩及び硫酸水素塩から選ばれる。
前記微生物は、少なくとも1種のビトレオシラヘモグロビン(Vhb)をコードする核酸配列の組換え核酸分子によって改変される;
好ましくは、ビトレオシラヘモグロビン(Vhb)をコードする核酸配列は少なくとも1種のビトレオシラヘモグロビン(Vhb)の活性を向上させる遺伝子改変を含む;より好ましくは、前記遺伝子改変はアミノ酸配列SEQ ID NO:61に対応する以下の位置での置換の1種または複数種を含む:45位のメチオニンからロイシンへの置換、86位のシステインからグリシンへの置換および95位のチロシンからセリンへの置換;さらに好ましくは、前記ビトレオシラヘモグロビン(Vhb)をコードする核酸配列はSEQ ID NO:64である;
好ましくは、前記ビトレオシラヘモグロビン(Vhb)はSEQ ID NO:61のアミノ酸配列の少なくとも約30%同じ、好ましくは少なくとも約50%同じ、より好ましくは少なくとも約70%同じ、より好ましくは少なくとも約80%同じ、さらに好ましくは少なくとも約90%同じ、最も好ましくは少なくとも約95%同じのアミノ酸配列を有し、そのうち前記ビトレオシラヘモグロビン(Vhb)は活性を有する;より好ましくは、前記ビトレオシラヘモグロビン(Vhb)はSEQ ID NO:61のアミノ酸配列を有する;
より好ましくは、組換え核酸分子中のビトレオシラヘモグロビン(Vhb)をコードする遺伝子のコピ−数は、1より大きいかまたはそれに等しい;
より好ましくは、組換え核酸分子は内在性天然プロモーターまたは内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターを含む;好ましくは、内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターはHCEプロモーター、gapプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーターから選ばれる;より好ましくは、内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターはtrcプロモーターである、付記1に記載の方法。
前記微生物はさらに次の遺伝子改変中の一種または複数種を含む、付記1または2に記載の方法:
(1)少なくとも1種の、微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミンキナーゼ(NanK)の働きを向上させることができる遺伝子改変;
(2)少なくとも1種の、微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミン−6−リン酸イソメラーゼの働きを向上させることができる遺伝子改変;
(3)少なくとも1種の、微生物の中のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼの働きを向上させることができる遺伝子改変、好ましくは同時に少なくとも1種のグルコサミン6−リン酸シンターゼの働きを低下させることができる遺伝子改変;
(4)少なくとも1種の微生物の中のグルコサミン6−リン酸シンターゼの働きを向上させることができる遺伝子改変、それと同時に少なくとも1種のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼの働きを低下させることができる遺伝子改変;
(5)少なくとも1種の微生物の中のUDP−N−アセチル−D−グルコサミン2−エピメラーゼ(WecB)の働きを向上させることができる遺伝子改変。
前記微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミンキナーゼの働きを向上させる遺伝子改変は、a)微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミンキナーゼの酵素活性の向上、及び/又は、b)微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミンキナーゼの過剰発現から選ばれる;
好ましくは、微生物は少なくとも1種の微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミンキナーゼの働きを向上させることができる遺伝子改変を含む少なくとも1種の組換え核酸分子によって改変される、付記3に記載の方法。
前記微生物は、少なくとも1種のN−アセチル−D−マンノサミンキナーゼをコードする核酸配列を含む組換え核酸分子によって改変される、付記4に記載の方法;
好ましくは、N−アセチル−D−マンノサミンキナーゼをコードする核酸配列は少なくとも1種のN−アセチル−D−マンノサミンキナーゼの酵素活性を向上させる遺伝子改変を含む;より好ましくは、前記遺伝子改変はアミノ酸配列SEQ ID NO:17に対応する次の位置での置換:36位のリジンからアルギニンへの置換、103位のリジンからメチオニンへの置換および223位のアルギニンからセリンへの置換の1種または複数種を含む;
さらに好ましくは、N−アセチル−D−マンノサミンキナーゼをコードする核酸配列はSEQ ID NO:26である;
好ましくは、前記N−アセチル−D−マンノサミンキナーゼは、SEQ ID NO: 17のアミノ酸配列の少なくとも約30%同じ、好ましくは少なくとも約50%同じ、より好ましくは少なくとも約70%同じ、より好ましくは少なくとも約80%同じ、さらに好ましくは少なくとも約90%同じ、最も好ましくは少なくとも約95%同じのアミノ酸配列を有し、そのうち前記N−アセチル−D−マンノサミンキナーゼは酵素活性を有する;より好ましくは、前記N−アセチル−D−マンノサミンキナーゼはSEQ ID NO: 17のアミノ酸配列を有する;
より好ましくは、組換え核酸分子中のN−アセチル−D−マンノサミンキナーゼをコードする遺伝子のコピ−数が増加されている;
より好ましくは、組換え核酸分子は内在性天然プロモーターまたは内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターを有する;
好ましくは、前記内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターは、HCEプロモーター、gapプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーターから選ばれる;
より好ましくは、前記内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターはtrcプロモーターである。
前記微生物は、少なくとも1種のN−アセチル−D−マンノサミンキナーゼをコードする遺伝子の内在性天然プロモーターに対する遺伝子改変を含む;
好ましくは、N−アセチル−D−マンノサミンキナーゼをコードする遺伝子の内在性天然プロモーターは、より高い発現レベルを有するプロモーターに置換される;より好ましくは、前記より高い発現レベルを有するプロモーターは、HCEプロモーター、gapプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーターから選ばれる;最も好ましくは、より高い発現レベルを有するプロモーターはtrcプロモーターである、付記4に記載の方法。
前記微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミン−6−リン酸イソメラーゼの働きを向上させる遺伝子改変は、a)微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミン−6−リン酸イソメラーゼの酵素活性の向上、及び/又は、b)微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミン−6−リン酸イソメラーゼの過剰発現から選ばれる;
好ましくは、前記微生物は、少なくとも1種の微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミン−6−リン酸イソメラーゼの働きを向上させることができる遺伝子改変を含む少なくとも1種の組換え核酸分子によって改変される、付記3に記載の方法。
微生物は少なくとも1種のN−アセチル−D−マンノサミン−6−リン酸イソメラーゼをコードする核酸配列を含む組換え核酸分子によって改変される;好ましくは、N−アセチル−D−マンノサミン−6−リン酸イソメラーゼをコードする核酸配列は、少なくとも1種のN−アセチル−D−マンノサミン−6−リン酸イソメラーゼの酵素活性を向上させる遺伝子改変を含む;
好ましくは、前記遺伝子改変は、アミノ酸配列SEQ ID NO:29に対応する次の位置での置換の1種または2種を含む:133のシステインからアルギニンへの置換および187位のチロシンからヒスチジンへの置換。より好ましくは、前記N−アセチル−D−マンノサミン−6−リン酸イソメラーゼ(NanE)をコードする核酸配列はSEQ ID NO:56である;
好ましくは、前記N−アセチル−D−マンノサミン−6−リン酸イソメラーゼはSEQ ID NO:29のアミノ酸配列の少なくとも約30%同じ、好ましくは少なくとも約50%同じ、より好ましくは少なくとも約70%同じ、より好ましくは少なくとも約80%同じ、さらに好ましくは少なくとも約90%同じ、最も好ましくは少なくとも約95%同じのアミノ酸配列を有し、前記N−アセチル−D−マンノサミン−6−リン酸イソメラーゼは酵素活性を有する;より好ましくは、前記N−アセチル−D−マンノサミン−6−リン酸イソメラーゼはSEQ ID NO:29のアミノ酸配列を有する;
より好ましくは、組換え核酸分子中のN−アセチル−D−マンノサミン−6−リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子のコピ−数が増加されている;
より好ましくは、前記組換え核酸分子は内在性天然プロモーターまたは内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターを含む;
好ましくは、前記内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターは、HCEプロモーター、gapプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーターから選ばれる;
より好ましくは、内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターはtrcプロモーターである、付記7に記載の方法。
微生物は少なくとも1種のN−アセチル−D−マンノサミン−6−リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子の内在性天然プロモーターに対する遺伝子改変を含む;好ましくは、N−アセチル−D−マンノサミン−6−リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子の内在性天然プロモーターはより高い発現レベルを有するプロモーターに置換される;より好ましくは、より高い発現レベルを有するプロモーターはHCEプロモーター、gapプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーターから選ばれる;最も好ましくは、より高い発現レベルを有するプロモーターはtrcプロモーターである、付記7に記載の方法。
微生物の中のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼの働きを向上させる遺伝子改変は、a)微生物の中のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼの酵素活性の向上;及び/又はb)微生物の中のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼの過剰発現から選ばれる;
好ましくは、微生物は少なくとも1種の微生物の中のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼの働きを向上させることができる遺伝子改変を含む少なくとも1種の組換え核酸分子によって改変される、付記3に記載の方法。
微生物は、少なくとも1種のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼをコードする核酸配列を含む組換え核酸分子によって改変される;
好ましくは、エンコードD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼをコードする核酸配列は少なくとも1種のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼの酵素活性を向上させる遺伝子改変を含む;
より好ましくは、組換え核酸分子中のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼをコードする遺伝子のコピ−数が増加されている;
より好ましくは、組換え核酸分子は内在性天然プロモーターまたは内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターを含む;好ましくは、内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターはHCEプロモーター、gapプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーターから選ばれる;より好ましくは、内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターはtrcプロモーターである、付記10に記載の方法。
前記微生物は、少なくとも1種のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼをコードする遺伝子の内在性天然プロモーターに対する遺伝子改変を含む;好ましくは、D−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼをコードする遺伝子の内在性天然プロモーターはより高い発現レベルを有するプロモーターに置換される;
より好ましくは、より高い発現レベルを有するプロモーターはHCEプロモーター、gapプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーターから選ばれる;最も好ましくは、より高い発現レベルを有するプロモーターはtrcプロモーターである、付記10に記載の方法。
前記微生物の中のグルコサミン6−リン酸シンターゼの働きを低下させる遺伝子改変は、a)微生物の中のグルコサミン6−リン酸シンターゼの酵素活性の低下、及び/又はb)微生物の中のグルコサミン6−リン酸シンターゼの発現低下から選ばれる;
好ましくは、前記微生物は、少なくとも1種の微生物の中のグルコサミン6−リン酸シンターゼの働きを低下させることができる遺伝子改変を含む少なくとも1種組換え核酸分子によって改変される;
より好ましくは、前記微生物の中のグルコサミン6−リン酸シンターゼの働きを低下させる遺伝子改変は微生物の中のグルコサミン6−リン酸シンターゼコードする内因性遺伝子の一部または全部の欠失、または一部または全部の不活性化、及び/又は微生物の中のグルコサミン6−リン酸シンターゼをコードする遺伝子の内在性天然プロモーターの一部または全部の欠失、または一部または全部の不活性化から選ばれる;
さらに好ましくは、微生物の中のグルコサミン6−リン酸シンターゼの働きを低下させる遺伝子改変は微生物の中のグルコサミン6−リン酸シンターゼをコードする遺伝子の内在性天然プロモーターを完全に欠失させ、即ち削除する、付記3に記載の方法。
前記微生物の中のグルコサミン6−リン酸シンターゼの働きを向上させる遺伝子改変は、a)微生物の中のグルコサミン6−リン酸シンターゼの酵素活性の向上、及び/又はb)微生物の中のグルコサミン6−リン酸シンターゼの過剰発現から選ばれる;
好ましくは、微生物は少なくとも1種の微生物の中のグルコサミン6−リン酸シンターゼの働きを向上させることができる遺伝子改変を含む少なくとも1種の組換え核酸分子によって改変される、付記3に記載の方法。
前記微生物は、少なくとも1種のグルコサミン6−リン酸シンターゼをコードする核酸配列を含む組換え核酸分子によって改変される;
好ましくは、グルコサミン6−リン酸シンターゼをコードする核酸配列は少なくとも1種のグルコサミン6−リン酸シンターゼの酵素活性を向上させる遺伝子改変を含む;
より好ましくは、組換え核酸分子中のグルコサミン6−リン酸シンターゼをコードする遺伝子のコピ−数が増加されている;
より好ましくは、組換え核酸分子は内在性天然プロモーターまたは内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターを含む;
好ましくは、前記内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターはHCEプロモーター、gapプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーターから選ばれる;より好ましくは、内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターはtrcプロモーターである、付記14に記載の方法。
前記微生物は、少なくとも1種のグルコサミン6−リン酸シンターゼをコードする遺伝子の内在性天然プロモーターに対する遺伝子改変を含む。好ましくは、グルコサミン6−リン酸シンターゼをコードする遺伝子の内在性天然プロモーターはより高い発現レベルを有するプロモーターに置換される;より好ましくは、より高い発現レベルを有するプロモーターはHCEプロモーター、gapプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーターから選ばれる;最も好ましくは、より高い発現レベルを有するプロモーターはtrcプロモーターである、付記14に記載の方法。
.微生物の中のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼの働きを低下させる遺伝子改変は、a)微生物の中のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼの酵素活性の低下、及び/又はb)微生物の中のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼの発現低下から選ばれる;
好ましくは、前記微生物は、少なくとも1種の微生物の中のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼの働きを低下させることができる遺伝子改変を含む少なくとも1種の組換え核酸分子によって改変される;
より好ましくは、前記微生物の中のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼの働きを低下させる遺伝子改変は,前記微生物の中のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼをコードする内因性遺伝子の一部または全部の欠失、または、一部または全部の不活性化、及び/又は、前記微生物の中のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼをコードする遺伝子の内在性天然プロモーターの一部または全部の欠失、または、一部または全部の不活性化から選ばれる;さらに好ましくは、微生物の中のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼの働きを低下させる遺伝子改変は、微生物の中のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼをコードする遺伝子の内在性天然プロモーターを完全に欠失させ、即ち削除する、付記3に記載の方法。
前記微生物の中のUDP−N−アセチル−D−グルコサミン2−エピメラーゼの働きを向上させる遺伝子改変は、a)微生物の中のUDP−N−アセチル−D−グルコサミン2−エピメラーゼの酵素活性の向上;及び/又はb)微生物の中のUDP−N−アセチル−D−グルコサミン2−エピメラーゼの過剰発現から選ばれる;
好ましくは、前記微生物は、少なくとも1種の微生物の中のUDP−N−アセチル−D−グルコサミン2−エピメラーゼの働きを向上させることができる遺伝子改変を含む少なくとも1種の組換え核酸分子によって改変される、付記3に記載の方法。
前記微生物は、少なくとも1種のUDP−N−アセチル−D−グルコサミン2−エピメラーゼをコードする核酸配列を含む組換え核酸分子によって改変される;
好ましくは、UDP−N−アセチル−D−グルコサミン2−エピメラーゼをコードする核酸配列は少なくとも1種のUDP−N−アセチル−D−グルコサミン2−エピメラーゼの酵素活性を向上させる遺伝子改変を含む;
好ましくは、前記遺伝子改変は、アミノ酸配列SEQ ID NO:50に対応する次の位置での置換:34位のシステインからセリンへの置換、145位のヒスチジンからアスパラギン酸への置換、226位のシステインからフェニルアラニンへの置換および245位のバリンからグリシンへの置換の1種または複数種を含む;
さらに好ましくは、UDP−N−アセチル−D−グルコサミン2−エピメラーゼ(WecB)をコードする核酸配列は、SEQ ID NO:58である;
好ましくは、前記UDP−N−アセチル−D−グルコサミン2−エピメラーゼはSEQ ID NO:50のアミノ酸配列の少なくとも約30%同じ、好ましくは少なくとも約50%同じ、より好ましくは少なくとも約70%同じ、より好ましくは少なくとも約80%同じ、さらに好ましくは少なくとも約90%同じ、最も好ましくは少なくとも約95%同じのアミノ酸配列を有し、そのうち前記UDP−N−アセチル−D−グルコサミン2−エピメラーゼ(WecB)は酵素活性を有する;より好ましくは、前記UDP−N−アセチル−D−グルコサミン2−エピメラーゼはSEQ ID NO:50のアミノ酸配列を有する;
より好ましくは、組換え核酸分子中のUDP−N−アセチル−D−グルコサミン2−エピメラーゼをコードする遺伝子のコピ−数が増加されている;
より好ましくは、組換え核酸分子は内在性天然プロモーターまたは内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターを含む;
好ましくは、内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターは、HCEプロモーター、gapプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーターから選ばれる;より好ましくは、内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターはtrcプロモーターである、付記18に記載の方法。
前記微生物は、少なくとも1種のUDP−N−アセチル−D−グルコサミン2−エピメラーゼをコードする遺伝子の内在性天然プロモーターに対する遺伝子改変を含む;
好ましくは、前記UDP−N−アセチル−D−グルコサミン2−エピメラーゼをコードする遺伝子の内在性天然プロモーターは、より高い発現レベルを有するプロモーターに置換される;
より好ましくは、前記より高い発現レベルを有するプロモーターは、HCEプロモーター、gapプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーターから選ばれる;
最も好ましくは、前記より高い発現レベルを有するプロモーターはtrcプロモーターである、付記18に記載の方法。
前記微生物は、さらに次の遺伝子改変の1種または複数種を含む、付記1−20のいずれか1つに記載の方法;
(1)少なくとも1種の微生物の中のマンノーストランスポーターEIIM、P/IIIman(ManXYZ)の働きを低下させることができる遺伝子改変;
(2)少なくとも1種の微生物の中のN−アセチルノイラミン酸リア−ゼ(NanA)の働きを低下させることができる遺伝子改変;
(3)少なくとも1種の微生物の中のN−アセチル−D−グルコサミン6−リン酸デアセチラ−ゼ(NagA)の働きを低下させることができる遺伝子改変を;
(4)少なくとも1種の微生物の中のN−アセチル−D−グルコサミン特異的酵素IINag(NagE)の働きを低下させることができる遺伝子改変;
(5)少なくとも1種の微生物の中のホスホグルコサミンムタ−ゼ(GlmM)の働きを向上させることができる遺伝子改変;
(6)包含少なくとも1種の微生物の中の二機能性酵素N−アセチル−D−グルコサミン1−リン酸ウリジルトランスファラーゼ(GlmU)の働きを向上させることができる遺伝子改変。
前記微生物は、少なくとも1種の微生物の中のマンノーストランスポーターEIIM、P/IIIman(ManXYZ)の働きを低下させることができる遺伝子改変を含む少なくとも1種の組換え核酸分子によって改変される;
好ましくは、前記微生物の中のマンノーストランスポーターEIIM、P/IIIman(ManXYZ)の働きを低下させる遺伝子改変は、前記微生物の中のマンノーストランスポーターEIIM、P/IIIman(ManXYZ)をコードする内因性遺伝子の一部または全部の欠失、または一部または全部の不活性化、及び/又は微生物の中のマンノーストランスポーターEIIM、P/IIIman(ManXYZ)をコードする遺伝子の内在性天然プロモーターの一部または全部の欠失、または一部または全部の不活性化から選ばれる;
さらに好ましくは、前記微生物の中のマンノーストランスポーターEIIM、P/IIIman(ManXYZ)の働きを低下させる遺伝子改変が微生物の中のマンノーストランスポーターEIIM、P/IIIman(ManXYZ)をコードする内因性遺伝子を完全に欠失させ、即ち削除する、付記21に記載の方法。
前記微生物は少なくとも1種の微生物の中のN−アセチルノイラミン酸リア−ゼ(NanA)の働きを低下させることができる遺伝子改変を含む少なくとも1種の組換え核酸分子によって改変される;
好ましくは、微生物の中のN−アセチルノイラミン酸リア−ゼ(NanA)の働きを低下させる遺伝子改変は、微生物の中のN−アセチルノイラミン酸リア−ゼ(NanA)をコードする内因性遺伝子の一部または全部の欠失、または一部または全部の不活性化、及び/又は微生物の中のN−アセチルノイラミン酸リア−ゼ(NanA)をコードする遺伝子の内在性天然プロモーターの一部または全部の欠失、または一部または全部の不活性化から選ばれる;
さらに好ましくは、微生物の中のN−アセチルノイラミン酸リア−ゼ(NanA)の働きを低下させる遺伝子改変は、微生物の中のN−アセチルノイラミン酸リア−ゼ(NanA)をコードする内因性遺伝子を完全に欠失させ、即ち削除する、付記21に記載の方法。
前記微生物は、少なくとも1種の微生物の中のN−アセチル−D−グルコサミン6−リン酸デアセチラ−ゼ(NagA)の働きを低下させることができる遺伝子改変を含む少なくとも1種の組換え核酸分子によって改変される;
好ましくは、前記微生物の中のN−アセチル−D−グルコサミン6−リン酸デアセチラ−ゼ(NagA)の働きを低下させる遺伝子改変は、微生物の中のN−アセチル−D−グルコサミン6−リン酸デアセチラ−ゼ(NagA)をコードする内因性遺伝子の一部または全部の欠失、または一部または全部の不活性化、及び/又は、エンコード微生物の中のN−アセチル−D−グルコサミン6−リン酸デアセチラ−ゼ(NagA)をコードする遺伝子の内在性天然プロモーターの一部または全部の欠失、または一部または全部の不活性化から選ばれる;
さらに好ましくは、前記微生物の中のN−アセチル−D−グルコサミン6−リン酸デアセチラ−ゼ(NagA)の働きを低下させる遺伝子改変は微生物の中のN−アセチル−D−グルコサミン6−リン酸デアセチラ−ゼ(NagA)をコードする内因性遺伝子を完全に欠失させ、即ち削除する、付記21に記載の方法。
前記微生物は、少なくとも1種の微生物の中のN−アセチル−D−グルコサミン特異的酵素IINag(NagE)の働きを低下させる遺伝子改変を含む少なくとも1種の組換え核酸分子によって改変される;
好ましくは、前記微生物の中のN−アセチル−D−グルコサミン特異的酵素IINag(NagE)の働きを低下させる遺伝子改変は、前記微生物の中のN−アセチル−D−グルコサミン特異的酵素IINag(NagE)をコードする内因性遺伝子の一部または全部の欠失、または、一部または全部の不活性化、及び/又は、エンコード微生物の中のN−アセチル−D−グルコサミン特異的酵素IINag(NagE)をコードする遺伝子の内在性天然プロモーターの一部または全部の欠失、または、一部または全部の不活性化から選ばれる;
さらに好ましくは、微生物の中のN−アセチル−D−グルコサミン特異的酵素IINag(NagE)の働きを低下させる遺伝子改変は、前記微生物の中のN−アセチル−D−グルコサミン特異的酵素IINag(NagE)をコードする内因性遺伝子を完全に欠失させ、即ち削除する、付記21に記載の方法。
前記微生物の中のホスホグルコサミンムタ−ゼ(GlmM)の働きを向上させる遺伝子改変は、a)微生物の中のホスホグルコサミンムタ−ゼ(GlmM)の酵素活性の向上;及び/又はb)微生物の中のホスホグルコサミンムタ−ゼ(GlmM)の過剰発現から選ばれる;
好ましくは、前記微生物は、少なくとも1種の微生物の中のホスホグルコサミンムタ−ゼ(GlmM)の働きを向上させる遺伝子改変を含む少なくとも1種の組換え核酸分子によって改変される、付記21に記載の方法。
前記微生物は、少なくとも1種のホスホグルコサミンムタ−ゼ(GlmM)をコードする核酸配列を含む組換え核酸分子によって改変される;
好ましくは、前記ホスホグルコサミンムタ−ゼ(GlmM)をコードする核酸配列は、少なくとも1種のホスホグルコサミンムタ−ゼ(GlmM)の酵素活性を向上させる遺伝子改変を含む;
より好ましくは、前記組換え核酸分子中のホスホグルコサミンムタ−ゼ(GlmM)をコードする遺伝子のコピ−数が増加されている;
より好ましくは、組換え核酸分子は内在性天然プロモーターまたは内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターを含む;
好ましくは、前記内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターは、HCEプロモーター、gapプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーターから選ばれる;
より好ましくは、前記内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターはtrcプロモーターである、付記26に記載の方法。
前記微生物は、少なくとも1種のホスホグルコサミンムタ−ゼ(GlmM)をコードする遺伝子の内在性天然プロモーターに対する遺伝子改変を含む;
好ましくは、ホスホグルコサミンムタ−ゼ(GlmM)をコードする遺伝子の内在性天然プロモーターは、より高い発現レベルを有するプロモーターに置換される;
より好ましくは、前記より高い発現レベルを有するプロモーターは、HCEプロモーター、gapプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーターから選ばれる;
最も好ましくは、前記より高い発現レベルを有するプロモーターはtrcプロモーターである、付記26に記載の方法。
前記微生物の中の二機能性酵素N−アセチル−D−グルコサミン1−リン酸ウリジルトランスファラーゼ(GlmU)の働きを向上させる遺伝子改変は、a)前記微生物の中の二機能性酵素N−アセチル−D−グルコサミン1−リン酸ウリジルトランスファラーゼ(GlmU)の酵素活性の向上、及び/又は、b)前記微生物の中の二機能性酵素N−アセチル−D−グルコサミン1−リン酸ウリジルトランスファラーゼ(GlmU)の過剰発現から選ばれる;
好ましくは、前記微生物は、少なくとも1種の微生物の中の二機能性酵素N−アセチル−D−グルコサミン1−リン酸ウリジルトランスファラーゼ(GlmU)の働きを向上させることができる遺伝子改変を含む、少なくとも1種の組換え核酸分子によって改変される、付記21に記載の方法。
前記微生物は、少なくとも1種の二機能性酵素N−アセチル−D−グルコサミン1−リン酸ウリジルトランスファラーゼ(GlmU)をコードする核酸配列を含む組換え核酸分子によって改変される;
好ましくは、二機能性酵素N−アセチル−D−グルコサミン1−リン酸ウリジルトランスファラーゼ(GlmU)をコードする核酸配列は、少なくとも1種の二機能性酵素N−アセチル−D−グルコサミン1−リン酸ウリジルトランスファラーゼ(GlmU)の酵素活性を向上させる遺伝子改変を含む;
より好ましくは、前記組換え核酸分子中の二機能性酵素N−アセチル−D−グルコサミン1−リン酸ウリジルトランスファラーゼ(GlmU)をコードする遺伝子のコピ−数が増加されている;
より好ましくは、前記組換え核酸分子は、内在性天然プロモーターまたは内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターを含む;
好ましくは、前記内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターは、HCEプロモーター、gapプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーターから選ばれる;
より好ましくは、内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターはtrcプロモーターである、付記29に記載の方法。
前記微生物は、少なくとも1種の二機能性酵素N−アセチル−D−グルコサミン1−リン酸ウリジルトランスファラーゼ(GlmU)をコードする遺伝子の内在性天然プロモーターに対する遺伝子改変を含む;
好ましくは、前記二機能性酵素N−アセチル−D−グルコサミン1−リン酸ウリジルトランスファラーゼ(GlmU)をコードする遺伝子の内在性天然プロモーターは、より高い発現レベルを有するプロモーターに置換される;
より好ましくは、前記より高い発現レベルを有するプロモーターは、HCEプロモーター、gapプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーターから選ばれる;
最も好ましくは、より高い発現レベルを有するプロモーターはtrcプロモーターである、付記29に記載の方法。
組換え核酸分子がプラスミドにロ−ドされまたは組換え核酸分子が微生物のゲノムに組込まれる、付記1−31のいずれか1つに記載の方法。
前記組換え核酸分子の発現は誘導されることができる;好ましくは、前記組換え核酸分子の発現は乳糖によって誘導される、付記1−32のいずれか1つに記載の方法。
前記培養工程A)は、約20℃−約45℃で行われる;好ましくは、約33℃−約37℃で行われる;
好ましくは、前記培養工程A)は、約pH4.5−約pH8.5で行われる;好ましくは約pH6.7−約pH7.2で行われる;
好ましくは、前記培養工程A)は、材料補充発酵法を採用する;
より好ましくは、糖分補充液は、グルコ−スとリボ−スを含み、好ましくは、グルコ−スの濃度は10%−85%(w/v)、リボ−スの濃度は0.5%−15%(w/v)、より好ましくは、グルコ−スの濃度は55%−75%(w/v)、リボ−スの濃度は5%−7%(w/v)である;
より好ましくは、糖分補充液はグルコ−スとグルコン酸塩を含み、好ましくは、グルコ−スの濃度は10%−85%(w/v)、グルコン酸塩の濃度は0.5%−15%(w/v)、より好ましくは、グルコ−スの濃度は55%−75%(w/v)、グルコン酸塩の濃度は2%−3%(w/v)である;
より好ましくは、糖分補充液はグルコ−ス、リボ−スおよびグルコン酸塩を含み、好ましくは、グルコ−スの濃度は10%−85%(w/v)、リボ−スの濃度は0.5%−15%(w/v)、グルコン酸塩の濃度は0.5%−15%(w/v)、より好ましくは、グルコ−スの濃度は55%−75%(w/v)、リボ−スの濃度は5%−7%(w/v)、グルコン酸塩の濃度は2%−3%(w/v)である;
さらに好ましくは、グルコン酸塩はグルコン酸ナトリウムである、付記1−33のいずれか1つに記載の方法。
前記收集ステップB)は、(a)微生物が除去される発酵液からN−アセチル−D−グルコサミンを沈殿させる、及び/又は、(b)微生物が除去される発酵液からN−アセチル−D−グルコサミンを結晶化させることを含む;
好ましくは、前記收集ステップB)は、さらに発酵液を脱色するステップを含む;
より好ましくは、前記脱色ステップは、発酵液を沈殿・結晶化させる前に、発酵液を1回または複数回沈殿・結晶化させる後に行われる;
さらに好ましくは、前記脱色ステップは活性炭処理及び/又はクロマトグラフィ−脱色を含む、付記1−34のいずれか1つに記載の方法。
前記ステップC)は、酸性と加熱条件下または酵素触媒下で行われる;
好ましくは、30%−37%の塩酸溶液から、60℃−90℃で脱アセチル化してN−アセチル−D−グルコサミンを加水分解してD−グルコサミン塩酸塩が得られる;
好ましくは、UDP−3−O−N−アセチルグルコサミンの脱アセチル化酵素作用下でN−アセチル−D−グルコサミンを加水分解してD−グルコサミンが得られ、さらに塩になる、付記1−35のいずれか1つに記載の方法。
少なくとも1種のビトレオシラヘモグロビン(Vhb)を発現させることができる遺伝子改変を含む微生物。
少なくとも1種のビトレオシラヘモグロビン(Vhb)をコードする核酸配列を含む組換え核酸分子によって改変されている、付記37に記載の微生物;
好ましくは、前記ビトレオシラヘモグロビン(Vhb)をコードする核酸配列は、少なくとも1種のビトレオシラヘモグロビン(Vhb)の活性を向上させる遺伝子改変を含む;
より好ましくは、前記遺伝子改変は、アミノ酸配列SEQ ID NO:61に対応する以下の位置での置換:45位のメチオニンからロイシンへの置換、86位のシステインからグリシンへの置換および95位のチロシンからセリンへの置換の1種または複数種を含む;
さらに好ましくは、前記ビトレオシラヘモグロビン(Vhb)をコードする核酸配列はSEQ ID NO:64である;
好ましくは、前記ビトレオシラヘモグロビン(Vhb)は、SEQ ID NO:61のアミノ酸配列の少なくとも約30%同じ、好ましくは少なくとも約50%同じ、より好ましくは少なくとも約70%同じ、より好ましくは少なくとも約80%同じ、さらに好ましくは少なくとも約90%同じ、最も好ましくは少なくとも約95%同じのアミノ酸配列を有し、そのうち前記ビトレオシラヘモグロビン(Vhb)は活性を有する;
より好ましくは、前記ビトレオシラヘモグロビン(Vhb)はSEQ ID NO:61のアミノ酸配列を有する;
より好ましくは、組換え核酸分子中のビトレオシラヘモグロビン(Vhb)コードする遺伝子のコピ−数は1より大きいかまたはそれに等しい;
より好ましくは、前記組換え核酸分子は、内在性天然プロモーターまたは内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターを含む;
好ましくは、前記内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターは、HCEプロモーター、gapプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーターから選ばれる;
より好ましくは、内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターはtrcプロモーターである微生物。
さらに、次の遺伝子改変の1種または複数種を含む、付記37または38に記載の微生物;
(1)少なくとも1種の微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミンキナーゼ(NanK)の働きを向上させることができる遺伝子改変;
(2)少なくとも1種の微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミン−6−リン酸イソメラーゼの働きを向上させることができる遺伝子改変;
(3)少なくとも1種の微生物の中のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼの働きを向上させることができる遺伝子改変をみ、好ましくは同時に少なくとも1種のグルコサミン6−リン酸シンターゼの働きを低下させることができる遺伝子改変;
(4)少なくとも1種の微生物の中のグルコサミン6−リン酸シンターゼの働きを向上させることができる遺伝子改変を含み、それと同時に少なくとも1種のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼの働きを低下させることができる遺伝子改変;
(5)少なくとも1種の微生物の中のUDP−N−アセチル−D−グルコサミン2−エピメラーゼ(WecB)の働きを向上させることができる遺伝子改変。
前記微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミンキナーゼの働きを向上させる遺伝子改変は、a)微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミンキナーゼの酵素活性の向上、及び/又は、b)微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミンキナーゼの過剰発現から選ばれる、;
好ましくは、少なくとも1種の微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミンキナーゼの働きを向上させることができる遺伝子改変を含む少なくとも1種の組換え核酸分子によって改変されている、付記39に記載の微生物。
少なくとも1種のN−アセチル−D−マンノサミンキナーゼをコードする核酸配列を含む組換え核酸分子によって改変されている;
好ましくは、前記N−アセチル−D−マンノサミンキナーゼをコードする核酸配列は、少なくとも1種のN−アセチル−D−マンノサミンキナーゼの酵素活性を向上させる遺伝子改変を含む;
より好ましくは、前記遺伝子改変は、アミノ酸配列SEQ ID NO:17に対応する次の位置での置換:36位のリジンからアルギニンへの置換、103位のリジンからメチオニンへの置換および223位のアルギニンからセリンへの置換の1種または複数種を含む;
さらに好ましくは、前記N−アセチル−D−マンノサミンキナーゼをコードする核酸配列はSEQ ID NO:26である;
好ましくは、前記N−アセチル−D−マンノサミンキナーゼは、SEQ ID NO: 17のアミノ酸配列の少なくとも約30%同じ、好ましくは少なくとも約50%同じ、より好ましくは少なくとも約70%同じ、より好ましくは少なくとも約80%同じ、さらに好ましくは少なくとも約90%同じ、最も好ましくは少なくとも約95%同じのアミノ酸配列を有し、そのうち前記N−アセチル−D−マンノサミンキナーゼは酵素活性を有する;
より好ましくは、前記N−アセチル−D−マンノサミンキナーゼは、SEQ ID NO: 17のアミノ酸配列を有する;
より好ましくは、前記組換え核酸分子中のN−アセチル−D−マンノサミンキナーゼをコードする遺伝子のコピ−数が増加されている;
より好ましくは、前記組換え核酸分子は、内在性天然プロモーターまたは内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターを有する;
好ましくは、前記内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターは、HCEプロモーター、gapプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーターから選ばれる;
より好ましくは、前記内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターはtrcプロモーターである、付記40に記載の微生物。
少なくとも1種のN−アセチル−D−マンノサミンキナーゼをコードする遺伝子の内在性天然プロモーターに対する遺伝子改変を含む;
好ましくは、前記N−アセチル−D−マンノサミンキナーゼをコードする遺伝子の内在性天然プロモーターは、より高い発現レベルを有するプロモーターに置換されている;
より好ましくは、前記より高い発現レベルを有するプロモーターは、HCEプロモーター、gapプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーターから選ばれる;
最も好ましくは、より高い発現レベルを有するプロモーターはtrcプロモーターである、付記40に記載の微生物。
前記微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミン−6−リン酸イソメラーゼの働きを向上させる遺伝子改変は、a)微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミン−6−リン酸イソメラーゼの酵素活性の向上、及び/又は、b)微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミン−6−リン酸イソメラーゼの過剰発現から選ばれる;
好ましくは、少なくとも1種の微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミン−6−リン酸イソメラーゼの働きを向上させる遺伝子改変を含む少なくとも1種の組換え核酸分子によって改変されている、付記39に記載の微生物。
少なくとも1種のN−アセチル−D−マンノサミン−6−リン酸イソメラーゼをコードする核酸配列を含む組換え核酸分子によって改変されている;
好ましくは、前記N−アセチル−D−マンノサミン−6−リン酸イソメラーゼをコードする核酸配列は、少なくとも1種のN−アセチル−D−マンノサミン−6−リン酸イソメラーゼの酵素活性を向上させる遺伝子改変を含む;
好ましくは、前記遺伝子改変は、アミノ酸配列SEQ ID NO:29に対応する次の位置での置換:133位のシステインからアルギニンへの置換および187位のチロシンからヒスチジンへの置換の1種または2種を含む;
より好ましくは、前記N−アセチル−D−マンノサミン−6−リン酸イソメラーゼをコードする核酸配列は、SEQ ID NO:56である;
好ましくは、前記N−アセチル−D−マンノサミン−6−リン酸イソメラーゼは、SEQ ID NO:29のアミノ酸配列の少なくとも約30%同じ、好ましくは少なくとも約50%同じ、より好ましくは少なくとも約70%同じ、より好ましくは少なくとも約80%同じ、さらに好ましくは少なくとも約90%同じ、最も好ましくは少なくとも約95%同じのアミノ酸配列を有し、前記N−アセチル−D−マンノサミン−6−リン酸イソメラーゼは酵素活性を有する;
より好ましくは、前記N−アセチル−D−マンノサミン−6−リン酸イソメラーゼは、SEQ ID NO:29のアミノ酸配列を有する;
より好ましくは、組換え核酸分子中のN−アセチル−D−マンノサミン−6−リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子のコピ−数が増加されている;
より好ましくは、前記組換え核酸分子は、内在性天然プロモーターまたは内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターを含む;
好ましくは、前記内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターは、HCEプロモーター、gapプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーターから選ばれる;
より好ましくは、前記内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターはtrcプロモーターである、付記43に記載の微生物。
少なくとも1種のN−アセチル−D−マンノサミン−6−リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子の内在性天然プロモーターに対する遺伝子改変を含む;
好ましくは、前記N−アセチル−D−マンノサミン−6−リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子の内在性天然プロモーターは、より高い発現レベルを有するプロモーターに置換されている;
より好ましくは、前記より高い発現レベルを有するプロモーターは、HCEプロモーター、gapプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーターから選ばれる;
最も好ましくは、前記より高い発現レベルを有するプロモーターはtrcプロモーターである、付記43に記載の微生物。
前記微生物の中のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼの働きを向上させる遺伝子改変は、a)微生物の中のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼの酵素活性の向上、及び/又は、b)微生物の中のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼの過剰発現から選ばれる;
好ましくは、微生物は少なくとも1種の微生物の中のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼの働きを向上させることができる遺伝子改変を含む少なくとも1種の組換え核酸分子によって改変されている、付記39に記載の微生物。
少なくとも1種のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼをコードする核酸配列を含む組換え核酸分子によって改変されている;
好ましくは、前記エンコードD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼをコードする核酸配列は、少なくとも1種のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼの酵素活性を向上させる遺伝子改変を含む;
より好ましくは、前記組換え核酸分子中のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼをコードする遺伝子のコピ−数が増加されている;
より好ましくは、前記組換え核酸分子は内在性天然プロモーターまたは内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターを含む;好ましくは、前記内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターは、HCEプロモーター、gapプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーターから選ばれる;
より好ましくは、前記内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターはtrcプロモーターである、付記46に記載の微生物。
微生物は少なくとも1種のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼをコードする遺伝子の内在性天然プロモーターに対する遺伝子改変を含む;好ましくは、前記D−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼをコードする遺伝子の内在性天然プロモーターは、より高い発現レベルを有するプロモーターに置換されている;
より好ましくは、前記より高い発現レベルを有するプロモーターは、HCEプロモーター、gapプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーターから選ばれる;最も好ましくは、より高い発現レベルを有するプロモーターはtrcプロモーターである、付記46に記載の微生物。
前記微生物の中のグルコサミン6−リン酸シンターゼの働きを低下させることが遺伝子改変は、a)微生物の中のグルコサミン6−リン酸シンターゼの酵素活性の低下、及び/又は、b)微生物の中のグルコサミン6−リン酸シンターゼの発現低下から選ばれる;
好ましくは、少なくとも1種の微生物の中のグルコサミン6−リン酸シンターゼの働きを低下させることができる遺伝子改変を含む少なくとも1種組換え核酸分子によって改変されている;
より好ましくは、前記微生物の中のグルコサミン6−リン酸シンターゼの働きを低下させる遺伝子改変は、前記微生物の中のグルコサミン6−リン酸シンターゼコードする内因性遺伝子の一部または全部の欠失、または一部または全部の不活性化、及び/又は、微生物の中のグルコサミン6−リン酸シンターゼをコードする遺伝子の内在性天然プロモーターの一部または全部の欠失、または、一部または全部の不活性化から選ばれる;
さらに好ましくは、前記微生物の中のグルコサミン6−リン酸シンターゼの働きを低下させる遺伝子改変は、微生物の中のグルコサミン6−リン酸シンターゼをコードする遺伝子の内在性天然プロモーターを完全に欠失させ、即ち削除する、付記39に記載の微生物。
前記微生物の中のグルコサミン6−リン酸シンターゼの働きを向上させる遺伝子改変は、a)微生物の中のグルコサミン6−リン酸シンターゼの酵素活性の向上、及び/又は、b)微生物の中のグルコサミン6−リン酸シンターゼの過剰発現から選ばれる;
好ましくは、少なくとも1種の微生物の中のグルコサミン6−リン酸シンターゼの働きを向上させることができる遺伝子改変を含む少なくとも1種の組換え核酸分子によって改変されている、付記39に記載の微生物。
少なくとも1種のグルコサミン6−リン酸シンターゼをコードする核酸配列を含む組換え核酸分子によって改変されている;
好ましくは、グルコサミン6−リン酸シンターゼをコードする核酸配列は少なくとも1種のグルコサミン6−リン酸シンターゼの酵素活性を向上させる遺伝子改変を含む;
より好ましくは、組換え核酸分子中のグルコサミン6−リン酸シンターゼをコードする遺伝子のコピ−数が増加されている;
より好ましくは、前記組換え核酸分子は、内在性天然プロモーターまたは内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターを含む;
好ましくは、前記内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターは、HCEプロモーター、gapプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーターから選ばれる;
より好ましくは、前記内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターはtrcプロモーターである、付記50に記載の微生物。
少なくとも1種のグルコサミン6−リン酸シンターゼをコードする遺伝子の内在性天然プロモーターに対する遺伝子改変を含む;好ましくは、グルコサミン6−リン酸シンターゼをコードする遺伝子の内在性天然プロモーターは、より高い発現レベルを有するプロモーターに置換されている;より好ましくは、前記より高い発現レベルを有するプロモーターは、HCEプロモーター、gapプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーターから選ばれる;
最も好ましくは、より高い発現レベルを有するプロモーターはtrcプロモーターである、付記50に記載の微生物。
前記微生物の中のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼの働きを低下させる遺伝子改変は、a)微生物の中のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼの酵素活性の低下、及び/又は、b)微生物の中のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼの発現低下から選ばれる;
好ましくは、微生物は少なくとも1種の微生物の中のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼの働きを低下させることができる遺伝子改変を含む、少なくとも1種の組換え核酸分子によって改変されている;
より好ましくは、前記微生物の中のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼの働きを低下させる遺伝子改変は、前記微生物の中のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼをコードする内因性遺伝子の一部または全部の欠失、または、一部または全部の不活性化、及び/又は、微生物の中のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼをコードする遺伝子の内在性天然プロモーターの一部または全部の欠失、または、一部または全部の不活性化から選ばれる;
さらに好ましくは、前記微生物の中のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼの働きを低下させる遺伝子改変は、微生物の中のD−グルコサミン6−リン酸デアミナ−ゼをコードする遺伝子の内在性天然プロモーターを完全に欠失させ、即ち削除する、付記39に記載の微生物。
前記微生物の中のUDP−N−アセチル−D−グルコサミン2−エピメラーゼの働きを向上させる遺伝子改変は、a)微生物の中のUDP−N−アセチル−D−グルコサミン2−エピメラーゼの酵素活性の向上、及び/又は、b)微生物の中のUDP−N−アセチル−D−グルコサミン2−エピメラーゼの過剰発現から選ばれる;
好ましくは、少なくとも1種の微生物の中のUDP−N−アセチル−D−グルコサミン2−エピメラーゼの働きを向上させることができる遺伝子改変を含む少なくとも1種の組換え核酸分子によって改変されている、付記39に記載の微生物。
少なくとも1種のUDP−N−アセチル−D−グルコサミン2−エピメラーゼをコードする核酸配列を含む組換え核酸分子によって改変されている;
好ましくは、UDP−N−アセチル−D−グルコサミン2−エピメラーゼをコードする核酸配列は少なくとも1種のUDP−N−アセチル−D−グルコサミン2−エピメラーゼの酵素活性を向上させる遺伝子改変を含む;
好ましくは、前記遺伝子改変はアミノ酸配列SEQ ID NO:50に対応する次の位置での置換:34位のシステインからセリンへの置換、145位のヒスチジンからアスパラギン酸への置換、226位のシステインからフェニルアラニンへの置換および245位のバリンからグリシンへの置換の1種または複数種を含む;
さらに好ましくは、UDP−N−アセチル−D−グルコサミン2−エピメラーゼ(WecB)をコードする核酸配列はSEQ ID NO:58である;
好ましくは、前記UDP−N−アセチル−D−グルコサミン2−エピメラーゼはSEQ ID NO:50のアミノ酸配列の少なくとも約30%同じ、好ましくは少なくとも約50%同じ、より好ましくは少なくとも約70%同じ、より好ましくは少なくとも約80%同じ、さらに好ましくは少なくとも約90%同じ、最も好ましくは少なくとも約95%同じのアミノ酸配列を有し、そのうち前記UDP−N−アセチル−D−グルコサミン2−エピメラーゼ(WecB)は酵素活性を有する;
より好ましくは、前記UDP−N−アセチル−D−グルコサミン2−エピメラーゼはSEQ ID NO:50のアミノ酸配列を有する;
より好ましくは、組換え核酸分子中のUDP−N−アセチル−D−グルコサミン2−エピメラーゼをコードする遺伝子のコピ−数が増加されている;
より好ましくは、前記組換え核酸分子は内在性天然プロモーターまたは内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターを含む;
好ましくは、前記内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターは、HCEプロモーター、gapプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーターから選ばれる;
より好ましくは、前記内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターはtrcプロモーターである、付記54に記載の微生物。
少なくとも1種のUDP−N−アセチル−D−グルコサミン2−エピメラーゼをコードする遺伝子の内在性天然プロモーターに対する遺伝子改変を含む;
好ましくは、UDP−N−アセチル−D−グルコサミン2−エピメラーゼをコードする遺伝子の内在性天然プロモーターは、より高い発現レベルを有するプロモーターに置換されている;
より好ましくは、前記より高い発現レベルを有するプロモーターは、HCEプロモーター、gapプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーターから選ばれる;
最も好ましくは、前記より高い発現レベルを有するプロモーターはtrcプロモーターである、付記54に記載の微生物。
さらに次の遺伝子改変の1種または複数種を含む、付記37−56のいずれか1つに記載の微生物:
(1)少なくとも1種の微生物の中のマンノーストランスポーターEIIM、P/IIIman(ManXYZ)の働きを低下させることができる遺伝子改変;
(2)少なくとも1種の微生物の中のN−アセチルノイラミン酸リア−ゼ(NanA)の働きを低下させることができる遺伝子改変;
(3)少なくとも1種の微生物の中のN−アセチル−D−グルコサミン6−リン酸デアセチラ−ゼ(NagA)の働きを低下させることができる遺伝子改変;
(4)少なくとも1種の微生物の中のN−アセチル−D−グルコサミン特異的酵素IINag(NagE)の働きを低下させることができる遺伝子改変;
(5)少なくとも1種の微生物の中のホスホグルコサミンムタ−ゼ(GlmM)の働きを向上させることができる遺伝子改変;
(6)包含少なくとも1種の微生物の中の二機能性酵素N−アセチル−D−グルコサミン1−リン酸ウリジルトランスファラーゼ(GlmU)の働きを向上させることができる遺伝子改変。
少なくとも1種の微生物の中のマンノーストランスポーターEIIM、P/IIIman(ManXYZ)の働きを低下させることができる遺伝子改変を含む少なくとも1種の組換え核酸分子によって改変されている;
好ましくは、微生物の中のマンノーストランスポーターEIIM、P/IIIman(ManXYZ)の働きを低下させる遺伝子改変は、微生物の中のマンノーストランスポーターEIIM、P/IIIman(ManXYZ)をコードする内因性遺伝子の一部または全部の欠失、または、一部または全部の不活性化、及び/又は、微生物の中のマンノーストランスポーターEIIM、P/IIIman(ManXYZ)をコードする遺伝子の内在性天然プロモーターの一部または全部の欠失、または、一部または全部の不活性化から選ばれる;
さらに好ましくは、前記微生物の中のマンノーストランスポーターEIIM、P/IIIman(ManXYZ)の働きを低下させる遺伝子改変が微生物の中のマンノーストランスポーターEIIM、P/IIIman(ManXYZ)をコードする内因性遺伝子を完全に欠失させ、即ち削除する、付記57に記載の微生物。
少なくとも1種の微生物の中のN−アセチルノイラミン酸リア−ゼ(NanA)の働きを低下させることができる遺伝子改変を含む少なくとも1種の組換え核酸分子によって改変されている;
好ましくは、前記微生物の中のN−アセチルノイラミン酸リア−ゼ(NanA)の働きを低下させる遺伝子改変は、微生物の中のN−アセチルノイラミン酸リア−ゼ(NanA)をコードする内因性遺伝子の一部または全部の欠失、または、一部または全部の不活性化、及び/又は、前記微生物の中のN−アセチルノイラミン酸リア−ゼ(NanA)をコードする遺伝子の内在性天然プロモーターの一部または全部の欠失、または、一部または全部の不活性化から選ばれる;
さらに好ましくは、前記微生物の中のN−アセチルノイラミン酸リア−ゼ(NanA)の働きを低下させる遺伝子改変は微生物の中のN−アセチルノイラミン酸リア−ゼ(NanA)をコードする内因性遺伝子を完全に欠失させ、即ち削除する、付記57に記載の微生物。
少なくとも1種の微生物の中のN−アセチル−D−グルコサミン6−リン酸デアセチラ−ゼ(NagA)の働きを低下させることができる遺伝子改変を含む少なくとも1種の組換え核酸分子によって改変されている;
好ましくは、微生物の中のN−アセチル−D−グルコサミン6−リン酸デアセチラ−ゼ(NagA)の働きを低下させる遺伝子改変は、微生物の中のN−アセチル−D−グルコサミン6−リン酸デアセチラ−ゼ(NagA)をコードする内因性遺伝子の一部または全部の欠失、または一部または全部の不活性化、及び/又はエンコード微生物の中のN−アセチル−D−グルコサミン6−リン酸デアセチラ−ゼ(NagA)をコードする遺伝子の内在性天然プロモーターの一部または全部の欠失、または、一部または全部の不活性化から選ばれる;
さらに好ましくは、微生物の中のN−アセチル−D−グルコサミン6−リン酸デアセチラ−ゼ(NagA)の働きを低下させる遺伝子改変は微生物の中のN−アセチル−D−グルコサミン6−リン酸デアセチラ−ゼ(NagA)をコードする内因性遺伝子を完全に欠失させ、即ち削除する、付記57に記載の微生物。
少なくとも1種の前記微生物の中のN−アセチル−D−グルコサミン特異的酵素IINag(NagE)の働きを低下させることができる遺伝子改変を含む少なくとも1種の組換え核酸分子によって改変されている:
好ましくは、微生物の中のN−アセチル−D−グルコサミン特異的酵素IINag(NagE)の働きを低下させる遺伝子改変は、微生物の中のN−アセチル−D−グルコサミン特異的酵素IINag(NagE)をコードする内因性遺伝子の一部または全部の欠失、または、一部または全部の不活性化、及び/又は、エンコード微生物の中のN−アセチル−D−グルコサミン特異的酵素IINag(NagE)をコードする遺伝子の内在性天然プロモーターの一部または全部の欠失、または、一部または全部の不活性化から選ばれる;
さらに好ましくは、微生物の中のN−アセチル−D−グルコサミン特異的酵素IINag(NagE)の働きを低下させる遺伝子改変は、微生物の中のN−アセチル−D−グルコサミン特異的酵素IINag(NagE)をコードする内因性遺伝子を完全に欠失させ、即ち削除する、付記57に記載の微生物。
前記微生物の中のホスホグルコサミンムタ−ゼ(GlmM)の働きを向上させる遺伝子改変は、a)微生物の中のホスホグルコサミンムタ−ゼ(GlmM)の酵素活性の向上及び/又は、b)微生物の中のホスホグルコサミンムタ−ゼ(GlmM)の過剰発現から選ばれる;
好ましくは、少なくとも1種の微生物の中のホスホグルコサミンムタ−ゼ(GlmM)の働きを向上させることができる遺伝子改変を含む少なくとも1種の組換え核酸分子によって改変されている、付記57に記載の微生物。
少なくとも1種ホスホグルコサミンムタ−ゼ(GlmM)をコードする核酸配列を含む組換え核酸分子によって改変されている;
好ましくは、前記ホスホグルコサミンムタ−ゼ(GlmM)をコードする核酸配列は、少なくとも1種のホスホグルコサミンムタ−ゼ(GlmM)の酵素活性を向上させる遺伝子改変を含む;
より好ましくは、前記組換え核酸分子中のホスホグルコサミンムタ−ゼ(GlmM)をコードする遺伝子のコピ−数が増加されている;
より好ましくは、組換え核酸分子は内在性天然プロモーターまたは内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターを含む;
好ましくは、前記内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターは、HCEプロモーター、gapプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーターから選ばれる;
より好ましくは、前記内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターはtrcプロモーターである、付記62に記載の微生物。
少なくとも1種のホスホグルコサミンムタ−ゼ(GlmM)をコードする遺伝子の内在性天然プロモーターに対する遺伝子改変を含む;
好ましくは、前記ホスホグルコサミンムタ−ゼ(GlmM)をコードする遺伝子の内在性天然プロモーターは、より高い発現レベルを有するプロモーターに置換されている;
より好ましくは、前記より高い発現レベルを有するプロモーターは、HCEプロモーター、gapプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーターから選ばれる;最も好ましくは、より高い発現レベルを有するプロモーターはtrcプロモーターである、付記62に記載の微生物。
前記微生物の中の二機能性酵素N−アセチル−D−グルコサミン1−リン酸ウリジルトランスファラーゼ(GlmU)の働きを向上させる遺伝子改変は、a)微生物の中の二機能性酵素N−アセチル−D−グルコサミン1−リン酸ウリジルトランスファラーゼ(GlmU)の酵素活性の向上、及び/又は、b)微生物の中の二機能性酵素N−アセチル−D−グルコサミン1−リン酸ウリジルトランスファラーゼ(GlmU)の過剰発現から選ばれる;
好ましくは、少なくとも1種の、前記微生物の中の二機能性酵素N−アセチル−D−グルコサミン1−リン酸ウリジルトランスファラーゼ(GlmU)の働きを向上させることができる遺伝子改変を含む、少なくとも1種の組換え核酸分子によって改変されている、付記57に記載の微生物。
少なくとも1種の二機能性酵素N−アセチル−D−グルコサミン1−リン酸ウリジルトランスファラーゼ(GlmU)をコードする核酸配列を含む組換え核酸分子によって改変されている。
好ましくは、前記二機能性酵素N−アセチル−D−グルコサミン1−リン酸ウリジルトランスファラーゼ(GlmU)をコードする核酸配列は、少なくとも1種の二機能性酵素N−アセチル−D−グルコサミン1−リン酸ウリジルトランスファラーゼ(GlmU)の酵素活性を向上させる遺伝子改変を含む;
より好ましくは、前記組換え核酸分子中の二機能性酵素N−アセチル−D−グルコサミン1−リン酸ウリジルトランスファラーゼ(GlmU)をコードする遺伝子のコピ−数が増加されている。
より好ましくは、前記組換え核酸分子は、内在性天然プロモーターまたは内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターを含む;
好ましくは、前記内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターは、HCEプロモーター、gapプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーターから選ばれる;
より好ましくは、前記内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターはtrcプロモーターである、付記65に記載の微生物。
少なくとも1種の、二機能性酵素N−アセチル−D−グルコサミン1−リン酸ウリジルトランスファラーゼ(GlmU)をコードする遺伝子の内在性天然プロモーターに対する遺伝子改変を含む;
好ましくは、前記二機能性酵素N−アセチル−D−グルコサミン1−リン酸ウリジルトランスファラーゼ(GlmU)をコードする遺伝子の内在性天然プロモーターは、より高い発現レベルを有するプロモーターに置換されている;
より好ましくは、前記より高い発現レベルを有するプロモーターは、HCEプロモーター、gapプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーターから選ばれる;
最も好ましくは、前記より高い発現レベルを有するプロモーターはtrcプロモーターである、付記65に記載の微生物。
組換え核酸分子はプラスミドにロ−ドされている、または、組換え核酸分子は微生物のゲノムに組込まれている、付記37−67のいずれか1つに記載の微生物。
前記組換え核酸分子の発現は誘導されることができる;好ましくは、前記組換え核酸分子の発現は乳糖によって誘導される、付記37−68のいずれか1つに記載の微生物。
前記微生物は細菌、酵母または真菌である、付記1−36のいずれか1つに記載の方法、または、付記37−69のいずれか1つに記載の微生物;
好ましくは、前記微生物は細菌または酵母から選ばれる;
より好ましくは、前記細菌は、エシェリヒア属(Escherichia)、バシラス属 (Bacillus)、ラクトバチルス属(Lactobacillus)、シュ−ドモナス属(Pseudomonas)またはストレプトミセス属(Streptomyces)の属に属する細菌から選ばれる;
より好ましくは、前記細菌は、大腸菌(Escherichia coli)、枯草菌(Bacillus subtilis)、バチルスリケニホルミス(Bacillus licheniformis)、ラクトバチルスブレビス(Lactobacillus brevis)、シュ−ドモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)またはストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)の種に属する細菌から選ばれる;
さらに好ましくは、細菌は大腸菌である;
さらに好ましくは、前記大腸菌は、K−12、BおよびWの菌株から選ばれる;
最も好ましくは大腸菌はK−12菌株である;
より好ましくは、酵母はサッカロマイセス属(Saccharomyces)、シゾサッカロマイセス属(Schizosaccharomyces)、カンジダ属(Candida)、ハンゼヌラ属(Hansenula)、ピキア属(Pichia)、クルベルミセス属(Kluveromyces)およびファフィア属(PHaffia)の酵母から選ばれる;
さらに好ましくは、前記酵母は、サッカロマイセスセレビシエ(Saccharomyce scerevisiae)、シゾサッカロミセスポンベ(Schizosaccharo mycespombe)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、ハンゼヌラポリモルファ(HansenulapolymorpHa)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、ピキア・カナデンシス((Pichia canadensis)、クルイベロマイセス・マルシアヌス(Kluyveromyces marxianus)またはファフィア・ロドチ−マ(PHaffia rohodozyma)から選ばれる;
好ましくは、前記微生物は真菌であり;
より好ましくは、真菌はアスペルギルス属(Aspergillus)、アブシディア属(Absidia)、リゾプス属(Rhizopus)、クリソスポリウム属(Chrysosporium)、ニュ−ロスポラ属(Neurospora)またはトリコデルマ属(Trichoderma)の属に属する真菌から選ばれる;
さらに好ましくは、真菌はアスペルギルス・ニガ−(Aspergillus niger)、アスペルギルス・ニドランス(Aspergillus nidulans)、アブシディア・コエルレア(Absidia coerulea)、リゾプス・オリザエ(Rhizopus oryzae)、クリソスポリウム・ロックンオウンズ(Chrysosporium lucknowense)、ニュ−ロスポラ・クラッサ(Neurospora crassa)、ニュ−ロスポラ・インタ−メディア(Neurosporaintermedia)またはトリコデルマ・リ−セイ(Trichoderma reesei) から選ばれる。
前記蛋白質はSEQ ID NO:65で表されるアミノ酸配列を有する、より高い活性を有するビトレオシラヘモグロビン(Vhb)。
付記71に記載のビトレオシラヘモグロビン(Vhb)をコードする核酸分子であって、前記核酸分子はSEQ ID NO:64で表される核酸配列を有する核酸分子。
付記72に記載の核酸分子を含むベクタ−。
付記73に記載のベクタ−を含む微生物。
ゲノムが付記72に記載の核酸分子を含む微生物。
Claims (20)
- 微生物発酵によってN−アセチル−D−グルコサミン及び/又はD−グルコサミン塩を製造する方法であって、次を含む方法;
A)発酵培地において微生物培養を行い、前記微生物は少なくとも1種のビトレオシラヘモグロビン(Vhb)を発現させることができる遺伝子改変を含む;及び
B)培養工程A)から産生されるN−アセチル−D−グルコサミンを収集する。 - 前記微生物は、少なくとも1種のビトレオシラヘモグロビン(Vhb)をコードする核酸配列の組換え核酸分子によって改変され、ビトレオシラヘモグロビン(Vhb)をコードする核酸配列は少なくとも1種のビトレオシラヘモグロビン(Vhb)の活性を向上させる遺伝子改変を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記遺伝子改変は、アミノ酸配列SEQ ID NO:61に対応する、45位のメチオニンからロイシンへの置換、86位のシステインからグリシンへの置換および95位のチロシンからセリンへの置換の1種または複数種を含む、請求項2に記載の方法。
- 前記ビトレオシラヘモグロビン(Vhb)をコードする核酸配列はSEQ ID NO:64である、請求項2に記載の方法。
- 前記ビトレオシラヘモグロビン(Vhb)は、SEQ ID NO:61のアミノ酸配列の、少なくとも90%同じアミノ酸配列を有し、そのうち前記ビトレオシラヘモグロビン(Vhb)は活性を有する、請求項2に記載の方法。
- 組換え核酸分子中のビトレオシラヘモグロビン(Vhb)をコードする遺伝子のコピー数は、1より大きいかまたはそれに等しい;
組換え核酸分子は内在性天然プロモーターまたは内在性天然プロモーターより高い発現レベルを有するプロモーターを含む、請求項2に記載の方法。 - 前記微生物はさらに次の遺伝子改変中の一種または複数種を含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法:
(1)少なくとも1種の、微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミンキナーゼ(NanK)の働きを向上させることができる遺伝子改変;
(2)少なくとも1種の、微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミン−6−リン酸イソメラーゼの働きを向上させることができる遺伝子改変;
(3)少なくとも1種の、微生物の中のD−グルコサミン−6−リン酸デアミナーゼの働きを向上させることができる遺伝子改変;
(4)少なくとも1種の微生物の中のグルコサミン−6−リン酸シンターゼの働きを向上させることができる遺伝子改変、それと同時に少なくとも1種のD−グルコサミン−6−リン酸デアミナーゼの働きを低下させることができる遺伝子改変;
(5)少なくとも1種の微生物の中のUDP−N−アセチル−D−グルコサミン−2−エピメラーゼ(WecB)の働きを向上させることができる遺伝子改変。 - 前記微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミンキナーゼの働きを向上させる遺伝子改変は、a)微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミンキナーゼの酵素活性の向上、及び/又は、b)微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミンキナーゼの過剰発現から選ばれる、請求項7に記載の方法。
- 前記微生物は、少なくとも1種のN−アセチル−D−マンノサミンキナーゼをコードする核酸配列を含む組換え核酸分子によって改変され、N−アセチル−D−マンノサミンキナーゼをコードする核酸配列はSEQ ID NO:26である、請求項8に記載の方法。
- 前記微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミン−6−リン酸イソメラーゼの働きを向上させる遺伝子改変は、a)微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミン−6−リン酸イソメラーゼの酵素活性の向上、及び/又は、b)微生物の中のN−アセチル−D−マンノサミン−6−リン酸イソメラーゼの過剰発現から選ばれる、請求項7に記載の方法。
- 微生物は少なくとも1種のN−アセチル−D−マンノサミン−6−リン酸イソメラーゼをコードする核酸配列を含む組換え核酸分子によって改変され、前記N−アセチル−D−マンノサミン−6−リン酸イソメラーゼ(NanE)をコ−ドする核酸配列はSEQ ID NO:56である、請求項10に記載の方法。
- 前記微生物の中のUDP−N−アセチル−D−グルコサミン−2−エピメラーゼの働きを向上させる遺伝子改変は、a)微生物の中のUDP−N−アセチル−D−グルコサミン−2−エピメラーゼの酵素活性の向上;及び/又はb)微生物の中のUDP−N−アセチル−D−グルコサミン−2−エピメラーゼの過剰発現から選ばれる、請求項7に記載の方法。
- 前記微生物は、少なくとも1種のUDP−N−アセチル−D−グルコサミン−2−エピメラーゼをコードする核酸配列を含む組換え核酸分子によって改変され、前記UDP−N−アセチル−D−グルコサミン−2−エピメラーゼ(WecB)をコードする核酸配列は、SEQ ID NO:58である、請求項12に記載の方法。
- 前記微生物は、さらに次の遺伝子改変の1種または複数種を含む、請求項1−13のいずれか1項に記載の方法;
(1)少なくとも1種の微生物の中のマンノーストランスポーターEIIM、P/IIIman(ManXYZ)の働きを低下させることができる遺伝子改変;
(2)少なくとも1種の微生物の中のN−アセチルノイラミン酸リアーゼ(NanA)の働きを低下させることができる遺伝子改変;
(3)少なくとも1種の微生物の中のN−アセチル−D−グルコサミン−6−リン酸デアセチラーゼ(NagA)の働きを低下させることができる遺伝子改変;
(4)少なくとも1種の微生物の中のN−アセチル−D−グルコサミン特異的酵素IINag(NagE)の働きを低下させることができる遺伝子改変;
(5)少なくとも1種の微生物の中のホスホグルコサミンムターゼ(GlmM)の働きを向上させることができる遺伝子改変;
(6)包含少なくとも1種の微生物の中の二機能性酵素N−アセチル−D−グルコサミン−1−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ(GlmU)の働きを向上させることができる遺伝子改変。 - 少なくとも1種のビトレオシラヘモグロビン(Vhb)を発現させることができる遺伝子改変を含む微生物。
- 少なくとも1種のビトレオシラヘモグロビン(Vhb)をコードする核酸配列を含む組換え核酸分子によって改変されており、前記ビトレオシラヘモグロビン(Vhb)をコードする核酸配列はSEQ ID NO:64である、請求項15に記載の微生物。
- 蛋白質はSEQ ID NO:65で表されるアミノ酸配列を有する、より高い活性を有するビトレオシラヘモグロビン(Vhb)。
- 請求項17に記載のビトレオシラヘモグロビン(Vhb)をコードする核酸分子であって、前記核酸分子はSEQ ID NO:64で表される核酸配列を有する核酸分子。
- 請求項18に記載の核酸分子を含むベクター。
- ゲノムが請求項18に記載の核酸分子を含む微生物。
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