JP6770616B2 - Image acquisition device, image acquisition method, and spatial optical modulation unit - Google Patents
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Description
本発明は、励起光の照射に伴って試料から発せられる検出光を撮像して画像を取得する画像取得装置、画像取得方法、及び空間光変調ユニットに関する。 The present invention relates to an image acquisition device, an image acquisition method, and a spatial light modulation unit that acquire an image by capturing the detection light emitted from a sample when irradiated with excitation light.
そのような画像取得装置として、シート状の励起光を試料に照射し、励起光の照射に伴って試料から発せられる検出光を撮像するライトシート顕微鏡がある(例えば、下記非特許文献1参照)。非特許文献1に記載されたライトシート顕微鏡では、空間光変調器(SLM:Spatial Light Modulator)によりベッセルビームを生成し、生成したベッセルビームの集光点をその光軸に沿って走査することで、擬似的にシート状の励起光を作り出している。 As such an image acquisition device, there is a light sheet microscope that irradiates a sample with a sheet-shaped excitation light and images the detection light emitted from the sample by the irradiation of the excitation light (see, for example, Non-Patent Document 1 below). .. In the light sheet microscope described in Non-Patent Document 1, a Bessel beam is generated by a spatial light modulator (SLM), and the focused point of the generated Bessel beam is scanned along the optical axis. , Creates a pseudo sheet-like excitation light.
上記非特許文献1に記載されたライトシート顕微鏡では、ベッセルビームの集光点を光軸に沿って走査することで擬似的にシート状の励起光を生成していることから、当該走査のための光学素子等が必要となる。そのため、装置構成が複雑化するおそれがある。 In the light sheet microscope described in Non-Patent Document 1, a pseudo sheet-like excitation light is generated by scanning the focusing point of the Bessel beam along the optical axis. Optical elements and the like are required. Therefore, the device configuration may be complicated.
そこで、本発明は、簡易な構成でシート状の励起光を生成できる画像取得装置、画像取得方法、及び空間光変調ユニットを提供することを目的とする。 Therefore, an object of the present invention is to provide an image acquisition device, an image acquisition method, and a spatial light modulation unit capable of generating sheet-shaped excitation light with a simple configuration.
本発明の一側面に係る画像取得装置は、試料を励起させる波長を含む励起光を出力する光源と、二次元に配列された複数の画素を有し、光源から出力された励起光の位相を複数の画素毎に変調する空間光変調器と、空間光変調器で変調された励起光を試料に照射する第1の対物レンズと、第1の対物レンズからの励起光の照射に伴って試料から発せられる検出光を導光する第2の対物レンズと、第2の対物レンズにより導光された検出光を撮像する光検出器と、複数の画素それぞれに対応する位相値が二次元に分布する位相パターンに従って複数の画素毎の位相変調量を制御する制御部と、を備え、位相パターンは、所定の基本位相パターンに基づいて生成された位相パターンであり、基本位相パターンは、所定の方向に沿って連続的に位相値が増加する第1の領域と、所定の方向において第1の領域と対向し、所定の方向に沿って連続的に位相値が減少する第2の領域と、を有する。 The image acquisition device according to one aspect of the present invention has a light source that outputs excitation light including a wavelength that excites a sample, and a plurality of pixels arranged in two dimensions, and determines the phase of the excitation light output from the light source. A spatial light modulator that modulates each of a plurality of pixels, a first objective lens that irradiates the sample with excitation light modulated by the spatial light modulator, and a sample that accompanies irradiation of excitation light from the first objective lens. A second objective lens that guides the detection light emitted from the second objective lens, an optical detector that captures the detection light guided by the second objective lens, and a phase value corresponding to each of a plurality of pixels are distributed in two dimensions. A control unit that controls the amount of phase modulation for each of a plurality of pixels according to the phase pattern to be performed is provided, the phase pattern is a phase pattern generated based on a predetermined basic phase pattern, and the basic phase pattern is a predetermined direction. A first region in which the phase value continuously increases along the predetermined direction and a second region facing the first region in a predetermined direction and in which the phase value continuously decreases along the predetermined direction. Have.
この画像取得装置では、所定の方向に沿って連続的に位相値が増加する第1の領域と、所定の方向に沿って連続的に位相値が減少する第2の領域と、を有する基本位相パターンに基づいて位相パターンが算出される。この位相パターンに従って空間光変調器で励起光を変調することで、第1の対物レンズから試料に対してシート状の励起光を照射することが可能となる。したがって、従来技術のようにシート状の励起光を生成するためにベッセルビームの集光点を走査する必要がなく、当該走査のための光学素子等を省略することができる。よって、この画像取得装置によれば、簡易な構成でシート状の励起光を生成することができる。 In this image acquisition device, a basic phase having a first region in which the phase value continuously increases along a predetermined direction and a second region in which the phase value continuously decreases along a predetermined direction. The phase pattern is calculated based on the pattern. By modulating the excitation light with the spatial light modulator according to this phase pattern, it is possible to irradiate the sample with the excitation light in the form of a sheet from the first objective lens. Therefore, it is not necessary to scan the focusing point of the Bessel beam in order to generate the sheet-shaped excitation light as in the prior art, and the optical element or the like for the scanning can be omitted. Therefore, according to this image acquisition device, it is possible to generate sheet-shaped excitation light with a simple configuration.
本発明の一側面に係る画像取得装置においては、第1の領域では、位相値は所定の方向に沿って直線的に増加し、第2の領域では、位相値は所定の方向に沿って直線的に減少していてもよい。これによれば、基本位相パターンが単純化されるため、複雑な光学素子等を用いることなく、一層簡易な構成でシート状の励起光を生成することができる。 In the image acquisition device according to one aspect of the present invention, in the first region, the phase value increases linearly along a predetermined direction, and in the second region, the phase value linearly increases along a predetermined direction. May decrease. According to this, since the basic phase pattern is simplified, it is possible to generate sheet-shaped excitation light with a simpler configuration without using a complicated optical element or the like.
本発明の一側面に係る画像取得装置では、基本位相パターンは、所定の方向における中心を通り且つ所定の方向と直交する直線に関して線対称となっていてもよい。これによれば、シート状の励起光を第1の対物レンズの光軸上に生成することができる。したがって、第1の対物レンズ及び第2の対物レンズの光軸調整が容易になる。 In the image acquisition device according to one aspect of the present invention, the basic phase pattern may be axisymmetric with respect to a straight line passing through the center in a predetermined direction and orthogonal to the predetermined direction. According to this, the sheet-shaped excitation light can be generated on the optical axis of the first objective lens. Therefore, the optical axis adjustment of the first objective lens and the second objective lens becomes easy.
本発明の一側面に係る画像取得装置では、基本位相パターンは、所定の方向における中心を通り且つ所定の方向と直交する直線に関して非線対称となっていてもよい。これによれば、シート状の励起光を第1の対物レンズの光軸上とは異なる位置に生成することができる。 In the image acquisition apparatus according to one aspect of the present invention, the basic phase pattern may be non-axisymmetric with respect to a straight line passing through the center in a predetermined direction and orthogonal to the predetermined direction. According to this, the sheet-shaped excitation light can be generated at a position different from the optical axis of the first objective lens.
本発明の一側面に係る画像取得装置では、第1の領域と第2の領域とは、互いに隣接し、その境界において位相値が連続していてもよい。これによれば、基本位相パターンが単純化されるため、複雑な光学素子等を用いることなく、より一層簡易な構成でシート状の励起光を生成することができる。 In the image acquisition apparatus according to one aspect of the present invention, the first region and the second region may be adjacent to each other and the phase values may be continuous at the boundary thereof. According to this, since the basic phase pattern is simplified, it is possible to generate sheet-shaped excitation light with a simpler configuration without using a complicated optical element or the like.
本発明の一側面に係る画像取得装置では、位相パターンは、回折格子状の回折格子パターンと基本位相パターンとが重畳された位相パターンであってもよい。これによれば、回折格子を設けることなく、励起光の位相を回折格子状とすることができる。そのため、より一層簡易な構成でシート状の励起光を生成することができる。 In the image acquisition apparatus according to one aspect of the present invention, the phase pattern may be a phase pattern in which a diffraction grating-like diffraction grating pattern and a basic phase pattern are superimposed. According to this, the phase of the excitation light can be made into a diffraction grating shape without providing a diffraction grating. Therefore, a sheet-shaped excitation light can be generated with a simpler configuration.
本発明の一側面に係る画像取得装置では、位相パターンは、レンズ状のレンズパターンと基本位相パターンとが重畳された位相パターンであってもよい。これによれば、レンズ素子を設けることなく、励起光の位相をレンズ状とすることができる。そのため、より一層簡易な構成でシート状の励起光を生成することができる。 In the image acquisition device according to one aspect of the present invention, the phase pattern may be a phase pattern in which a lens-shaped lens pattern and a basic phase pattern are superimposed. According to this, the phase of the excitation light can be made into a lens shape without providing a lens element. Therefore, a sheet-shaped excitation light can be generated with a simpler configuration.
本発明の一側面に係る画像取得装置は、励起光を試料に対して走査する光走査部を更に備えていてもよい。 The image acquisition device according to one aspect of the present invention may further include an optical scanning unit that scans the excitation light with respect to the sample.
本発明の一側面に係る画像取得装置では、光検出器は、複数の画素列を有し、ローリング読み出しが可能な二次元撮像素子であってもよい。これによれば、これによれば、グローバル読み出しが可能な二次元撮像素子を用いる場合に比べて、S/Nを向上させることができる。 In the image acquisition device according to one aspect of the present invention, the photodetector may be a two-dimensional image sensor having a plurality of pixel sequences and capable of rolling readout. According to this, the S / N can be improved as compared with the case of using a two-dimensional image sensor capable of global readout.
本発明の一側面に係る画像取得方法は、二次元に配列された複数の画素を有する空間光変調器により、試料を励起させる波長を含む励起光の位相を複数の画素毎に変調する第1のステップと、空間光変調器で変調された励起光を試料に照射する第2のステップと、励起光の照射に伴って試料から発せられる検出光を導光し、導光された検出光を撮像する第3のステップと、を含み、第1のステップでは、所定の基本位相パターンに基づいて生成され、複数の画素それぞれに対応する位相値が二次元に分布する位相パターンに従って複数の画素毎の位相変調量を制御し、基本位相パターンは、所定の方向に沿って連続的に位相値が増加する第1の領域と、所定の方向において第1の領域と対向し、所定の方向に沿って連続的に位相値が減少する第2の領域と、を有する。 The image acquisition method according to one aspect of the present invention is a first method in which the phase of the excitation light including the wavelength for exciting the sample is modulated for each plurality of pixels by a spatial light modulator having a plurality of pixels arranged in two dimensions. Steps, the second step of irradiating the sample with the excitation light modulated by the spatial light modulator, and the detection light emitted from the sample due to the irradiation of the excitation light are guided, and the guided detection light is used. Including the third step of imaging, in the first step, each of a plurality of pixels is generated based on a predetermined basic phase pattern, and the phase values corresponding to each of the plurality of pixels are distributed in two dimensions according to the phase pattern. The phase modulation amount of the above is controlled, and the basic phase pattern faces the first region in which the phase value continuously increases along the predetermined direction and the first region in the predetermined direction, and follows the predetermined direction. It has a second region in which the phase value continuously decreases.
この画像取得方法では、所定の方向に沿って連続的に位相値が増加する第1の領域と、所定の方向に沿って連続的に位相値が減少する第2の領域と、を有する基本位相パターンに基づいて位相パターンを算出する。この位相パターンに従って空間光変調器で励起光を変調することで、試料に対してシート状の励起光を照射することが可能となる。したがって、従来技術のようにシート状の励起光を生成するためにベッセルビームの集光点を走査する必要がなく、当該走査のための光学素子等を省略することができる。よって、この画像取得方法によれば、簡易な構成でシート状の励起光を生成することができる。 In this image acquisition method, a basic phase having a first region in which the phase value continuously increases along a predetermined direction and a second region in which the phase value continuously decreases along a predetermined direction. The phase pattern is calculated based on the pattern. By modulating the excitation light with a spatial light modulator according to this phase pattern, it is possible to irradiate the sample with sheet-shaped excitation light. Therefore, it is not necessary to scan the focusing point of the Bessel beam in order to generate the sheet-shaped excitation light as in the prior art, and the optical element or the like for the scanning can be omitted. Therefore, according to this image acquisition method, it is possible to generate sheet-shaped excitation light with a simple configuration.
本発明の一側面に係る空間光変調ユニットは、ライトシート顕微鏡に用いられる空間光変調ユニットであって、二次元に配列された複数の画素を有し、入力された光の位相を複数の画素毎に変調して変調後の光を出力する空間光変調器と、複数の画素それぞれに対応する位相値が二次元に分布する位相パターンに従って複数の画素毎の位相変調量を制御する制御部と、を備え、位相パターンは、所定の基本位相パターンに基づいて生成された位相パターンであり、基本位相パターンは、所定の方向に沿って連続的に位相値が増加する第1の領域と、所定の方向において第1の領域と対向し、所定の方向に沿って連続的に位相値が減少する第2の領域と、を有する。 The spatial light modulation unit according to one aspect of the present invention is a spatial light modulation unit used in a light sheet microscope, has a plurality of pixels arranged in two dimensions, and has a plurality of pixels in the phase of input light. A spatial optical modulator that modulates each unit and outputs the modulated light, and a control unit that controls the amount of phase modulation for each of a plurality of pixels according to a phase pattern in which the phase values corresponding to each of the plurality of pixels are distributed in two dimensions. The phase pattern is a phase pattern generated based on a predetermined basic phase pattern, and the basic phase pattern includes a first region in which the phase value continuously increases along a predetermined direction and a predetermined region. It has a second region which faces the first region in the direction of the above and whose phase value continuously decreases along a predetermined direction.
この空間光変調ユニットでは、所定の方向に沿って連続的に位相値が増加する第1の領域と、所定の方向に沿って連続的に位相値が減少する第2の領域と、を有する基本位相パターンに基づいて位相パターンを算出する。この位相パターンに従って空間光変調器で励起光を変調することで、試料に対してシート状の励起光を照射することが可能となる。したがって、従来技術のようにシート状の励起光を生成するためにベッセルビームの集光点を走査する必要がなく、当該走査のための光学素子等を省略することができる。よって、この空間光変調ユニットによれば、簡易な構成でシート状の励起光を生成することができる。 In this spatial light modulation unit, a basic region having a first region in which the phase value continuously increases along a predetermined direction and a second region in which the phase value continuously decreases along a predetermined direction. The phase pattern is calculated based on the phase pattern. By modulating the excitation light with a spatial light modulator according to this phase pattern, it is possible to irradiate the sample with the excitation light in the form of a sheet. Therefore, it is not necessary to scan the focusing point of the Bessel beam in order to generate the sheet-shaped excitation light as in the prior art, and the optical element or the like for the scanning can be omitted. Therefore, according to this spatial light modulation unit, it is possible to generate sheet-shaped excitation light with a simple configuration.
本発明によれば、簡易な構成でシート状の励起光を生成することができる。 According to the present invention, a sheet-shaped excitation light can be generated with a simple configuration.
以下、本発明の画像取得装置及び画像取得方法に係る実施形態について、図面を参照しつつ詳細に説明する。なお、以下の説明において、同一又は相当要素には同一符号を用い、重複する説明は省略する。 Hereinafter, embodiments relating to the image acquisition device and the image acquisition method of the present invention will be described in detail with reference to the drawings. In the following description, the same reference numerals will be used for the same or equivalent elements, and duplicate description will be omitted.
図1に示されるライトシート顕微鏡(画像取得装置)1は、シート状の励起光L1を試料Sに照射し、励起光L1の照射に伴って試料Sから発せられる検出光L2を撮像することで、試料Sの画像を取得する装置である。ライトシート顕微鏡1では、励起光L1の光軸と直交する方向に沿って励起光L1の集光位置が試料Sに対して走査され、各集光位置において試料Sの画像が取得される。ライトシート顕微鏡1では、励起光L1が試料Sに照射される領域が狭いため、例えば光退色又は光毒性等の試料Sの劣化を抑制することができると共に、画像取得を高速化することができる。 The light sheet microscope (image acquisition device) 1 shown in FIG. 1 irradiates the sample S with the sheet-shaped excitation light L1 and images the detection light L2 emitted from the sample S with the irradiation of the excitation light L1. , A device for acquiring an image of sample S. In the light sheet microscope 1, the focused position of the excitation light L1 is scanned with respect to the sample S along the direction orthogonal to the optical axis of the excitation light L1, and an image of the sample S is acquired at each focused position. In the light sheet microscope 1, since the region where the excitation light L1 is irradiated to the sample S is narrow, deterioration of the sample S such as photofading or phototoxicity can be suppressed, and image acquisition can be speeded up. ..
観察対象物となる試料Sは、例えば、蛍光色素又は蛍光遺伝子等の蛍光物質を含む細胞や生体等のサンプルである。試料Sは、所定の波長域の光が照射された場合に、例えば蛍光等の検出光L2を発する。試料Sは、例えば、少なくとも励起光L1及び検出光L2に対する透過性を有するホルダ内に収容されている。このホルダは、例えばステージ上に保持されている。 The sample S to be observed is, for example, a sample of a cell, a living body, or the like containing a fluorescent substance such as a fluorescent dye or a fluorescent gene. The sample S emits detection light L2 such as fluorescence when it is irradiated with light in a predetermined wavelength range. The sample S is housed in, for example, a holder having at least transparency to the excitation light L1 and the detection light L2. This holder is held, for example, on a stage.
図1に示されるように、ライトシート顕微鏡1は、光源11と、コリメータレンズ12と、光走査部13と、SLM14と、第1の光学系15と、第1の対物レンズ16と、第2の対物レンズ17と、フィルタ18と、第2の光学系19と、光検出器20と、制御部21と、を備えている。 As shown in FIG. 1, the light sheet microscope 1 includes a light source 11, a collimator lens 12, an optical scanning unit 13, an SLM 14, a first optical system 15, a first objective lens 16, and a second objective lens 16. The objective lens 17, the filter 18, the second optical system 19, the light detector 20, and the control unit 21 are provided.
光源11は、試料Sを励起させる波長を含む励起光L1を出力する。光源11は、例えば、コヒーレント光又はインコヒーレント光を出射する。コヒーレント光源としては、例えば、レーザダイオード(LD)といったレーザ光源等が挙げられる。インコヒーレント光源としては、例えば発光ダイオード(LED)、スーパールミネッセントダイオード(SLD)、ランプ系光源等が挙げられる。レーザ光源としては、連続波(Continuous Wave)を発振する光源が好ましく、超短パルス光等のパルス光を発振する光源が用いられてもよい。パルス光を発振する光源としては、パルス光を出力する光源と、光シャッタ又はパルス変調用のAOM(Acousto-Optic Modulator)とを組み合わせたユニットが用いられてもよい。光源11は、複数の波長域を含む励起光L1を出力するように構成されてもよい。この場合、音響光学可変フィルタ(Acousto-Optic Tunable Filter)等の光学フィルタにより励起光L1の波長の一部を選択的に透過させてもよい。 The light source 11 outputs the excitation light L1 including the wavelength that excites the sample S. The light source 11 emits, for example, coherent light or incoherent light. Examples of the coherent light source include a laser light source such as a laser diode (LD). Examples of the incoherent light source include a light emitting diode (LED), a superluminescent diode (SLD), and a lamp-based light source. As the laser light source, a light source that oscillates a continuous wave is preferable, and a light source that oscillates a pulsed light such as an ultrashort pulsed light may be used. As the light source that oscillates the pulsed light, a unit that combines a light source that outputs the pulsed light and an optical shutter or an AOM (Acousto-Optic Modulator) for pulse modulation may be used. The light source 11 may be configured to output excitation light L1 including a plurality of wavelength regions. In this case, a part of the wavelength of the excitation light L1 may be selectively transmitted by an optical filter such as an acoustic-optical variable filter (Acousto-Optic Tunable Filter).
コリメータレンズ12は、光源11から出力された励起光L1を平行化し、平行化された励起光L1を出力する。光走査部13は、コリメータレンズ12から出力された励起光L1の進行方向を変更することで、励起光L1を試料Sに対して走査する光スキャナである。これにより、第1の光学系15及び第1の対物レンズ16を介して試料Sに照射される励起光L1の照射位置が、第1の対物レンズ16の光軸(励起光L1の光軸)と直交する方向に沿って試料Sの表面上で走査される。光走査部13は、例えば、ガルバノミラー、レゾナントスキャナ、ポリゴンミラー、MEMS(Micro Electro Mechanical System)ミラー、又はAOM,AOD(Acousto-Optic Deflector)等の音響光学素子等である。 The collimator lens 12 parallelizes the excitation light L1 output from the light source 11 and outputs the parallelized excitation light L1. The optical scanning unit 13 is an optical scanner that scans the excitation light L1 with respect to the sample S by changing the traveling direction of the excitation light L1 output from the collimator lens 12. As a result, the irradiation position of the excitation light L1 irradiated to the sample S via the first optical system 15 and the first objective lens 16 is the optical axis of the first objective lens 16 (the optical axis of the excitation light L1). It is scanned on the surface of sample S along a direction orthogonal to. The optical scanning unit 13 is, for example, a galvano mirror, a resonant scanner, a polygon mirror, a MEMS (Micro Electro Mechanical System) mirror, or an acoustic optical element such as an AOM or AOD (Acousto-Optic Deflector).
SLM14は、二次元に配列された複数の画素を有し、光源11から出力された励起光L1の位相を当該複数の画素毎に変調する位相変調型の空間光変調器である。SLM14は、光走査部13から入射された励起光L1を変調し、変調された励起光L1を第1の光学系15に向けて出力する(第1のステップ)。SLM14は、例えば透過型又は反射型に構成されている。図1では、透過型のSLM14が示されている。SLM14は、例えば、屈折率変化材料型SLM(例えば、LCOS(Liquid Crystal on Silicon)型SLM、LCD(LiquidCrystalDisplay))、可変鏡型SLM(例えば、Segment Mirror型SLM、Continuous Deformable Mirror型SLM)、又は電気アドレス型液晶素子若しくは光アドレス型液晶素子を用いたSLM等である。SLM14は、制御部21のコントローラ23に電気的に接続されており、空間光変調ユニットを構成している。SLM14は、コントローラ23によりその駆動が制御される。制御部21によるSLM14の制御の詳細については後述する。 The SLM 14 is a phase modulation type spatial light modulator having a plurality of pixels arranged in two dimensions and modulating the phase of the excitation light L1 output from the light source 11 for each of the plurality of pixels. The SLM 14 modulates the excitation light L1 incident from the optical scanning unit 13 and outputs the modulated excitation light L1 toward the first optical system 15 (first step). The SLM 14 is configured, for example, as a transmissive type or a reflective type. In FIG. 1, a transmissive SLM 14 is shown. The SLM14 is, for example, a refractive index changing material type SLM (for example, LCOS (Liquid Crystal on Silicon) type SLM, LCD (LiquidCrystalDisplay)), a variable mirror type SLM (for example, a Segment Mirror type SLM, a Continuous Deformable Mirror type SLM), or An electric address type liquid crystal element or an SLM using an optical address type liquid crystal element. The SLM 14 is electrically connected to the controller 23 of the control unit 21 and constitutes a spatial optical modulation unit. The drive of the SLM 14 is controlled by the controller 23. Details of the control of the SLM 14 by the control unit 21 will be described later.
第1の光学系15は、SLM14から出力された励起光L1が第1の対物レンズ16に導光されるように、SLM14と第1の対物レンズ16とを光学的に結合している。ここでの第1の光学系15は、SLM14からの励起光L1を第1の対物レンズ16の瞳で集光させるレンズ15aを有し、両側テレセントリック光学系を構成している。 The first optical system 15 optically couples the SLM 14 and the first objective lens 16 so that the excitation light L1 output from the SLM 14 is guided to the first objective lens 16. The first optical system 15 here has a lens 15a that focuses the excitation light L1 from the SLM 14 with the pupil of the first objective lens 16 and constitutes a bilateral telecentric optical system.
第1の対物レンズ16は、照明用の対物レンズであり、SLM14で変調された励起光L1を試料Sに照射する(第2のステップ)。第1の対物レンズ16は、ピエゾアクチュエータ又はステッピングモータ等の駆動素子により、その光軸に沿って移動可能となっている。これにより、励起光L1の集光位置が調整可能となっている。 The first objective lens 16 is an objective lens for illumination, and irradiates the sample S with the excitation light L1 modulated by the SLM 14 (second step). The first objective lens 16 is movable along its optical axis by a driving element such as a piezo actuator or a stepping motor. As a result, the focusing position of the excitation light L1 can be adjusted.
第2の対物レンズ17は、検出用の対物レンズであり、第1の対物レンズ16からの励起光L1の照射に伴って試料Sから発せられる検出光L2を光検出器20側に導光する。この例では、第2の対物レンズ17は、その光軸(検出光L2の光軸)と第1の対物レンズ16の光軸とが直交(交差)するように、配置されている。第2の対物レンズ17は、ピエゾアクチュエータ又はステッピングモータ等の駆動素子により、その光軸に沿って移動可能となっている。これにより、第2の対物レンズ17の焦点位置が調整可能となっている。 The second objective lens 17 is an objective lens for detection, and guides the detection light L2 emitted from the sample S to the photodetector 20 side in association with the irradiation of the excitation light L1 from the first objective lens 16. .. In this example, the second objective lens 17 is arranged so that its optical axis (optical axis of the detection light L2) and the optical axis of the first objective lens 16 intersect (cross). The second objective lens 17 can be moved along its optical axis by a driving element such as a piezo actuator or a stepping motor. As a result, the focal position of the second objective lens 17 can be adjusted.
フィルタ18は、第2の対物レンズ17により導光された光から励起光L1と検出光L2とを分離し、抽出された検出光L2を光検出器20側に出力するための光学フィルタである。フィルタ18は、第2の対物レンズ17と光検出器20との間の光路上に配置されている。第2の光学系19は、第2の対物レンズ17から出力された検出光L2が光検出器20に導光されるように、第2の対物レンズ17と光検出器20とを光学的に結合している。第2の光学系19は、第2の対物レンズ17からの検出光L2を光検出器20の受光面20a(図2)で結像させるレンズ19aを有している。 The filter 18 is an optical filter for separating the excitation light L1 and the detection light L2 from the light guided by the second objective lens 17 and outputting the extracted detection light L2 to the photodetector 20 side. .. The filter 18 is arranged on the optical path between the second objective lens 17 and the photodetector 20. The second optical system 19 optically connects the second objective lens 17 and the photodetector 20 so that the detection light L2 output from the second objective lens 17 is guided to the photodetector 20. It is combined. The second optical system 19 has a lens 19a that forms an image of the detection light L2 from the second objective lens 17 on the light receiving surface 20a (FIG. 2) of the photodetector 20.
光検出器20は、第2の対物レンズ17により導光されて受光面20aで結像された検出光L2を撮像する(第3のステップ)。光検出器20は、複数の画素列を有し、複数の画素列毎のローリング読み出しが可能な二次元撮像素子である。そのような光検出器20としては、例えば、CMOSイメージセンサ等が挙げられる。図2(a)に示されるように、光検出器20の受光面20aには、読み出し方向に垂直な方向に複数の画素が配列されてなる画素列Rが、読み出し方向に複数配列されている。 The photodetector 20 captures the detection light L2 imaged on the light receiving surface 20a by being guided by the second objective lens 17 (third step). The photodetector 20 is a two-dimensional image sensor that has a plurality of pixel sequences and is capable of rolling readout for each of the plurality of pixel sequences. Examples of such a photodetector 20 include a CMOS image sensor and the like. As shown in FIG. 2A, a plurality of pixel sequences R in which a plurality of pixels are arranged in a direction perpendicular to the reading direction are arranged on the light receiving surface 20a of the photodetector 20 in a plurality of reading directions. ..
光検出器20では、図2(b)に示すように、駆動クロックの駆動周期に基づいて、リセット信号、読み出し開始信号が入力されることで、画素列R毎に露光及び読み出しが制御される。ローリング読み出しでは、画素列R毎に読み出し開始信号が所定の時間差で順次入力される。このため、全ての画素列の読み出しを同時に行うグローバル読み出しとは異なり、画素列R毎の読み出しが所定の時間差をもって順次行われる。 In the photodetector 20, as shown in FIG. 2B, exposure and readout are controlled for each pixel string R by inputting a reset signal and a readout start signal based on the drive cycle of the drive clock. .. In the rolling read, the read start signal is sequentially input for each pixel string R with a predetermined time difference. Therefore, unlike the global read-out in which all the pixel trains are read out at the same time, the read-out for each pixel row R is sequentially performed with a predetermined time difference.
制御部21は、プロセッサ及びメモリ等を含むコンピュータ22及びプロセッサ及びメモリ等を含むコントローラ23により構成されている。コンピュータ22は、例えば、パーソナルコンピュータあるいはスマートデバイスであり、プロセッサにより、光走査部13、第1の対物レンズ16、第2の対物レンズ17、光検出器20、及びコントローラ23等の動作を制御し、各種の制御を実行する。例えば、コンピュータ22は、光走査部13による励起光L1の走査と、光検出器20による検出光L2の撮像とのタイミングとを同期させるための制御を行う。具体的には、光走査部13による励起光L1の走査に応じて光検出器20で検出される検出光L2も移動する。そのため、コンピュータ22は、光検出器20における検出光L2の移動に合わせて、ローリング読み出しによる信号読み出しが行われるように光検出器20あるいは光走査部13を制御する。 The control unit 21 is composed of a computer 22 including a processor, a memory, and the like, and a controller 23 including the processor, the memory, and the like. The computer 22 is, for example, a personal computer or a smart device, and the processor controls the operations of the optical scanning unit 13, the first objective lens 16, the second objective lens 17, the photodetector 20, the controller 23, and the like. , Perform various controls. For example, the computer 22 controls to synchronize the scanning of the excitation light L1 by the optical scanning unit 13 with the imaging of the detection light L2 by the photodetector 20. Specifically, the detection light L2 detected by the photodetector 20 also moves according to the scanning of the excitation light L1 by the optical scanning unit 13. Therefore, the computer 22 controls the photodetector 20 or the optical scanning unit 13 so that the signal is read by rolling reading in accordance with the movement of the detection light L2 in the photodetector 20.
コントローラ23は、コンピュータ22と電気的に接続され、図3に示されるような二次元の位相パターンPに従ってSLM14における複数の画素毎の位相変調量を制御する。位相パターンPは、二次元平面上の位置に関する位相値のパターンであり、位相パターンPにおける各位置は、SLM14の複数の画素に対応している。位相パターンPの位相値は、0〜2πラジアンの間で規定されている。図3では、色の濃さによって位相パターンPの各部における位相値が表されている。なお、位相パターンPの位相値の上限は、2πラジアンよりも大きくてもよい。 The controller 23 is electrically connected to the computer 22 and controls the phase modulation amount for each of a plurality of pixels in the SLM 14 according to the two-dimensional phase pattern P as shown in FIG. The phase pattern P is a pattern of phase values relating to positions on a two-dimensional plane, and each position in the phase pattern P corresponds to a plurality of pixels of the SLM 14. The phase value of the phase pattern P is defined between 0 and 2π radians. In FIG. 3, the phase value in each part of the phase pattern P is represented by the color density. The upper limit of the phase value of the phase pattern P may be larger than 2π radians.
コントローラ23は、SLM14の各画素について、位相パターンPにおける当該画素に対応する位置の位相値に従って当該画素の位相変調量を制御する。具体的には、例えば、コントローラ23内には、DVI(Digital Video Interface)等のデジタルデータとして入力される位相パターンPの位相値を各画素に印加される駆動電圧値に変換するD/A変換部(デジタル/アナログ変換器)が設けられている。コンピュータ22からコントローラ23に位相パターンPが入力されると、コントローラ23は、D/A変換部により位相パターンPの位相値を駆動電圧値に変換し、SLM14に駆動電圧値を入力する。SLM14は、入力された駆動電圧値に応じて各画素に電圧を印加する。なお、例えば、SLM14がD/A変換部を有し、コントローラ23が位相パターンPに応じたデジタルデータをSLM14に入力してもよい。この場合、SLM14のD/A変換部で位相パターンPの位相値を駆動電圧値に変換する。また、D/A変換を行わず、SLM14がコントローラ23から出力されたデジタル信号に基づいて各画素に印加される電圧値を制御してもよい。 The controller 23 controls the phase modulation amount of each pixel of the SLM 14 according to the phase value of the position corresponding to the pixel in the phase pattern P. Specifically, for example, in the controller 23, a D / A conversion that converts the phase value of the phase pattern P input as digital data such as DVI (Digital Video Interface) into a drive voltage value applied to each pixel. A unit (digital / analog converter) is provided. When the phase pattern P is input from the computer 22 to the controller 23, the controller 23 converts the phase value of the phase pattern P into a drive voltage value by the D / A conversion unit, and inputs the drive voltage value to the SLM 14. The SLM 14 applies a voltage to each pixel according to the input drive voltage value. For example, the SLM 14 may have a D / A conversion unit, and the controller 23 may input digital data corresponding to the phase pattern P into the SLM 14. In this case, the D / A conversion unit of the SLM 14 converts the phase value of the phase pattern P into a drive voltage value. Further, the SLM 14 may control the voltage value applied to each pixel based on the digital signal output from the controller 23 without performing the D / A conversion.
位相パターンPは、制御部21のコンピュータ22により、所定の基本位相パターン31に基づいて算出される。基本位相パターン31は、例えば、コンピュータ22のメモリに予め記憶されている。基本位相パターン31に基づいて算出された位相パターンPに従ってSLM14で励起光L1を変調することで、第1の対物レンズ16からシート状の励起光L1を照射することが可能となる。後述するように、位相パターンPは、基本位相パターン31に他のパターンを更に重畳することで算出される場合もあるが、以下では、基本位相パターン31がそのまま位相パターンPとして用いられる場合について説明する。 The phase pattern P is calculated by the computer 22 of the control unit 21 based on a predetermined basic phase pattern 31. The basic phase pattern 31 is stored in advance in the memory of the computer 22, for example. By modulating the excitation light L1 with the SLM 14 according to the phase pattern P calculated based on the basic phase pattern 31, it is possible to irradiate the sheet-shaped excitation light L1 from the first objective lens 16. As will be described later, the phase pattern P may be calculated by further superimposing another pattern on the basic phase pattern 31, but the case where the basic phase pattern 31 is used as it is as the phase pattern P will be described below. To do.
図3に示されるように、基本位相パターン31は、矩形状の範囲内に設定されている。基本位相パターン31は、所定の方向D1に沿って連続的に位相値が増加する矩形状の第1の領域32と、方向D1において第1の領域32と対向し、方向D1に沿って連続的に位相値が減少する矩形状の第2の領域33と、を有している。すなわち、第1の領域32と第2の領域33とでは、位相値が増減する方向が互いに反対になっている。なお、ある領域において「連続的に位相値が増加する」とは、当該領域の全体に亘って位相値が途切れることなく連続していることを意味する。また、位相値が0ラジアンである場合と位相値が2πラジアンである場合とは同じ状態を意味しており、位相値が0ラジアンと2πラジアンとの間を跨いで変化したとしても位相値は連続している。 As shown in FIG. 3, the basic phase pattern 31 is set within a rectangular range. The basic phase pattern 31 faces a rectangular first region 32 whose phase value continuously increases along a predetermined direction D1 and a first region 32 in the direction D1 and is continuous along the direction D1. It has a rectangular second region 33 whose phase value decreases. That is, in the first region 32 and the second region 33, the directions in which the phase values increase or decrease are opposite to each other. In addition, "the phase value continuously increases" in a certain region means that the phase value is continuous without interruption over the entire region. Further, the case where the phase value is 0 radians and the case where the phase value is 2π radians mean the same state, and even if the phase value changes across between 0 radians and 2π radians, the phase value remains. It is continuous.
第1の領域32では、位相値は方向D1に沿って直線的に増加している。第2の領域33では、位相値は方向D1に沿って直線的に減少している。第1の領域32及び第2の領域33のいずれにおいても、位相値は2πラジアンだけ変化している。すなわち、第1の領域32における位相値の傾き(増加の割合)の絶対値と第2の領域33における位相値の傾き(減少の割合)の絶対値とは、等しくなっている。第1の領域32及び第2の領域33のいずれにおいても、方向D1と直交する方向D2に沿っては、位相値が一定となっている。第1の領域32と第2の領域33とは、互いに隣接し、その境界において位相値が連続している。この例では、境界における位相値は0ラジアンとなっている。基本位相パターン31は、方向D1における中心を通り且つ方向D1と直交する直線(中心線)Cに関して線対称となっている。この例では、第1の領域32と第2の領域33の境界は中心線C上に位置している。 In the first region 32, the phase value increases linearly along the direction D1. In the second region 33, the phase value decreases linearly along the direction D1. In both the first region 32 and the second region 33, the phase value changes by 2π radians. That is, the absolute value of the slope of the phase value (rate of increase) in the first region 32 and the absolute value of the slope of the phase value (rate of decrease) in the second region 33 are equal. In both the first region 32 and the second region 33, the phase value is constant along the direction D2 orthogonal to the direction D1. The first region 32 and the second region 33 are adjacent to each other, and the phase values are continuous at the boundary thereof. In this example, the phase value at the boundary is 0 radians. The basic phase pattern 31 is axisymmetric with respect to a straight line (center line) C that passes through the center in the direction D1 and is orthogonal to the direction D1. In this example, the boundary between the first region 32 and the second region 33 is located on the center line C.
図4は、基本位相パターン31に従ってSLM14で励起光L1が変調されることでシート状の励起光L1が生成される様子を説明する概念図である。図4(a)は、方向D2に対応する方向d2から見た場合の励起光L1の光路を示す図であり、図4(b)は、方向D1に対応する方向d1から見た場合の励起光L1の光路を示す図である。図4(a)では、第1の領域32に入射する励起光L1の光路の例として、第1の対物レンズ16の光軸Xからの距離が小さい順に3つの励起光A1,B1,C1が示されている。また、第2の領域33に入射する励起光L1の光路の例として、光軸Xからの距離が小さい順に3つの励起光A2,B2,C2が示されている。 FIG. 4 is a conceptual diagram illustrating how the sheet-shaped excitation light L1 is generated by modulating the excitation light L1 with the SLM 14 according to the basic phase pattern 31. FIG. 4A is a diagram showing an optical path of the excitation light L1 when viewed from the direction d2 corresponding to the direction D2, and FIG. 4B is a diagram showing the excitation light when viewed from the direction d1 corresponding to the direction D1. It is a figure which shows the optical path of light L1. In FIG. 4A, as an example of the optical path of the excitation light L1 incident on the first region 32, the three excitation lights A1, B1, and C1 are arranged in ascending order from the optical axis X of the first objective lens 16. It is shown. Further, as an example of the optical path of the excitation light L1 incident on the second region 33, three excitation lights A2, B2, and C2 are shown in ascending order of distance from the optical axis X.
図4(a)に示されるように、励起光A1,A2は、SLM14でその位相が所定量だけ遅らせられ、光軸X上で結像される。励起光B1,B2では、SLM14での位相の遅れ量が励起光A1,A2よりも大きくなる。そのため、励起光B1,B2は、励起光A1,A2よりも第1の対物レンズ16から遠い位置の光軸X上で結像される。励起光C1,C2では、SLM14での位相の遅れ量が励起光A1,A2よりも小さくなり、位相はSLM14でほぼ変化しない。そのため、励起光C1,C2は、励起光A1,A2よりも第1の対物レンズ16に近い位置の光軸X上で結像される。 As shown in FIG. 4A, the excitation lights A1 and A2 are imaged on the optical axis X with their phases delayed by a predetermined amount at SLM14. In the excitation lights B1 and B2, the amount of phase delay in the SLM 14 is larger than that in the excitation lights A1 and A2. Therefore, the excitation lights B1 and B2 are imaged on the optical axis X at a position farther from the first objective lens 16 than the excitation lights A1 and A2. In the excitation lights C1 and C2, the phase delay amount in the SLM 14 is smaller than that in the excitation lights A1 and A2, and the phase is almost unchanged in the SLM 14. Therefore, the excitation lights C1 and C2 are imaged on the optical axis X at a position closer to the first objective lens 16 than the excitation lights A1 and A2.
図4(b)に示されるように、方向d1から見た場合には、励起光L1の位相はSLM14で変化しない。以上より、所定の結像位置Y1にシート状の励起光L1が生成される。この例では、このシート状の励起光L1は、その幅方向が方向d2に沿うように、光軸X上に生成される。 As shown in FIG. 4B, the phase of the excitation light L1 does not change with the SLM 14 when viewed from the direction d1. From the above, the sheet-shaped excitation light L1 is generated at the predetermined imaging position Y1. In this example, the sheet-shaped excitation light L1 is generated on the optical axis X so that its width direction is along the direction d2.
以上説明したように、ライトシート顕微鏡1では、方向D1に沿って連続的に位相値が増加する第1の領域32と、方向D1に沿って連続的に位相値が減少する第2の領域33と、を有する基本位相パターン31に基づいて位相パターンPが算出される。この位相パターンPに従ってSLM14で励起光を変調することで、第1の対物レンズ16から試料Sに対してシート状の励起光L1を照射することが可能となる。したがって、従来技術のようにシート状の励起光L1を生成するためにベッセルビームの集光点を走査する必要がなく、当該走査のための光学素子等を省略することができる。よって、このライトシート顕微鏡1によれば、簡易な構成でシート状の励起光L1を生成することができる。さらに、従来技術のようにシート状の励起光L1を生成するためにベッセルビームの集光点を走査する必要がないため、制御を容易化することができる共に、画像取得に要する時間を短縮することができる。 As described above, in the light sheet microscope 1, the first region 32 in which the phase value continuously increases along the direction D1 and the second region 33 in which the phase value continuously decreases along the direction D1. The phase pattern P is calculated based on the basic phase pattern 31 having the above. By modulating the excitation light with the SLM 14 according to this phase pattern P, it is possible to irradiate the sample S with the sheet-shaped excitation light L1 from the first objective lens 16. Therefore, it is not necessary to scan the focusing point of the Bessel beam in order to generate the sheet-shaped excitation light L1 as in the prior art, and the optical element or the like for the scanning can be omitted. Therefore, according to this light sheet microscope 1, a sheet-shaped excitation light L1 can be generated with a simple configuration. Further, unlike the conventional technique, it is not necessary to scan the focusing point of the Bessel beam in order to generate the sheet-shaped excitation light L1, so that the control can be facilitated and the time required for image acquisition can be shortened. be able to.
ライトシート顕微鏡1においては、第1の領域32では、位相値は方向D1に沿って直線的に増加し、第2の領域33では、位相値は方向D1に沿って直線的に減少している。これにより、基本位相パターン31が単純化されるため、複雑な光学素子等を用いることなく、一層簡易な構成でシート状の励起光L1を生成することができる。すなわち、第1の領域32及び第2の領域33の少なくとも一方において位相値が方向D1に沿って直線的に増加していない場合、シート状の励起光L1を生成するための第1の光学系15又は第1の対物レンズ16等の光学系の構成が複雑化してしまうおそれがある。対して、ライトシート顕微鏡1においては、第1の領域32及び第2の領域33のいずれにおいても位相値が方向D1に沿って直線的に増加しているため、シート状の励起光L1を生成するための光学系の構成を簡易化することができる。 In the light sheet microscope 1, in the first region 32, the phase value increases linearly along the direction D1, and in the second region 33, the phase value decreases linearly along the direction D1. .. As a result, the basic phase pattern 31 is simplified, so that the sheet-shaped excitation light L1 can be generated with a simpler configuration without using a complicated optical element or the like. That is, when the phase value does not increase linearly along the direction D1 in at least one of the first region 32 and the second region 33, the first optical system for generating the sheet-shaped excitation light L1. The configuration of the optical system such as the 15 or the first objective lens 16 may be complicated. On the other hand, in the light sheet microscope 1, since the phase value increases linearly along the direction D1 in both the first region 32 and the second region 33, the sheet-shaped excitation light L1 is generated. The configuration of the optical system for this purpose can be simplified.
ライトシート顕微鏡1では、基本位相パターン31が直線Cに関して線対称となっている。これにより、シート状の励起光L1を第1の対物レンズ16の光軸X上に生成することができる。よって、第1の対物レンズ16及び第2の対物レンズ17の光軸調整が容易になる。 In the light sheet microscope 1, the basic phase pattern 31 is axisymmetric with respect to the straight line C. As a result, the sheet-shaped excitation light L1 can be generated on the optical axis X of the first objective lens 16. Therefore, the optical axis adjustment of the first objective lens 16 and the second objective lens 17 becomes easy.
ライトシート顕微鏡1では、第1の領域32と第2の領域33とが互いに隣接し、その境界において位相値が連続している。これにより、基本位相パターン31が単純化されるため、複雑な光学素子等を用いることなく、一層簡易な構成でシート状の励起光L1を生成することができる。 In the light sheet microscope 1, the first region 32 and the second region 33 are adjacent to each other, and the phase values are continuous at the boundary thereof. As a result, the basic phase pattern 31 is simplified, so that the sheet-shaped excitation light L1 can be generated with a simpler configuration without using a complicated optical element or the like.
ライトシート顕微鏡1では、励起光L1を試料Sに対して走査する光走査部13を備えているため、第1の対物レンズ16から照射される励起光L1の照射位置を試料Sに対して走査することができる。 Since the light sheet microscope 1 includes an optical scanning unit 13 that scans the excitation light L1 with respect to the sample S, the irradiation position of the excitation light L1 emitted from the first objective lens 16 is scanned with respect to the sample S. can do.
ライトシート顕微鏡1では、光検出器20が、複数の画素列Rを有し、ローリング読み出しが可能な二次元撮像素子である。これにより、グローバル読み出しが可能な二次元撮像素子を用いる場合に比べて、S/Nを向上させることができる。 In the light sheet microscope 1, the photodetector 20 is a two-dimensional image sensor having a plurality of pixel rows R and capable of rolling readout. As a result, the S / N can be improved as compared with the case of using a two-dimensional image sensor capable of global readout.
以上、本発明の好適な実施形態について説明したが、本発明は上記実施形態に限られない。例えば、図5に示される第1の変形例の基本位相パターン31Aが用いられてもよい。基本位相パターン31Aの第2の領域33Aでは、位相値が方向D1に沿って直線的に4πラジアンだけ減少している。すなわち、第1の領域32における位相値の傾きの絶対値と第2の領域33Aにおける傾きの絶対値とが異なっている。基本位相パターン31Aは、中心線Cに関して非線対称となっている。この例でも、第1の領域32と第2の領域33Aの境界は中心線C上に位置している。 Although the preferred embodiment of the present invention has been described above, the present invention is not limited to the above embodiment. For example, the basic phase pattern 31A of the first modification shown in FIG. 5 may be used. In the second region 33A of the basic phase pattern 31A, the phase value is linearly reduced by 4π radians along the direction D1. That is, the absolute value of the slope of the phase value in the first region 32 and the absolute value of the slope of the second region 33A are different. The basic phase pattern 31A is non-axisymmetric with respect to the center line C. In this example as well, the boundary between the first region 32 and the second region 33A is located on the center line C.
このような基本位相パターン31Aが用いられた場合でも、図6に示されるように、基本位相パターン31Aに従ってSLM14で励起光L1が変調されることでシート状の励起光L1が生成される。この場合、図6(a)に示されるように、第2の領域33Aに入射する励起光A2では、SLM14での位相の遅れ量が第1の領域32に入射する励起光A1よりも大きくなる。同様に、励起光B2では、SLM14での位相の遅れ量が励起光B1よりも大きくなり、励起光C2では、SLM14での位相の遅れ量が励起光C1よりも大きくなる。これにより、上記実施形態の場合の結像位置Y1よりも第1の対物レンズ16から遠い結像位置Y2にシート状の励起光L1が生成される。このシート状の励起光L1は、光軸X上とは異なる位置に生成される。 Even when such a basic phase pattern 31A is used, as shown in FIG. 6, the excitation light L1 is modulated by the SLM 14 according to the basic phase pattern 31A, so that the sheet-shaped excitation light L1 is generated. In this case, as shown in FIG. 6A, in the excitation light A2 incident on the second region 33A, the phase delay amount in the SLM 14 is larger than the excitation light A1 incident on the first region 32. .. Similarly, in the excitation light B2, the phase delay amount in the SLM 14 is larger than that in the excitation light B1, and in the excitation light C2, the phase delay amount in the SLM 14 is larger than that in the excitation light C1. As a result, the sheet-shaped excitation light L1 is generated at the imaging position Y2 farther from the first objective lens 16 than the imaging position Y1 in the case of the above embodiment. The sheet-shaped excitation light L1 is generated at a position different from that on the optical axis X.
このように、第1の変形例によっても、上記実施形態の場合と同様に、第1の対物レンズ16から試料Sに対してシート状の励起光L1を照射することが可能となり、簡易な構成でシート状の励起光L1を生成することができる。また、第1の変形例では、基本位相パターン31が直線Cに関して非線対称となっているため、シート状の励起光L1を第1の対物レンズ16の光軸X上とは異なる位置に生成することができる。 As described above, even in the first modification, it is possible to irradiate the sample S with the sheet-shaped excitation light L1 from the first objective lens 16 as in the case of the above embodiment, which is a simple configuration. Can generate a sheet-shaped excitation light L1. Further, in the first modification, since the basic phase pattern 31 is non-axisymmetric with respect to the straight line C, the sheet-shaped excitation light L1 is generated at a position different from that on the optical axis X of the first objective lens 16. can do.
また、図7に示される第2の変形例の基本位相パターン31B、第3の変形例の基本位相パターン31C、又は第4の変形例の基本位相パターン31Dが用いられてもよい。基本位相パターン31Bの第1の領域33Bでは、位相値が方向D1に沿って直線的に4πラジアンだけ増加している。すなわち、第1の領域32Bにおける位相値の傾きの絶対値と第2の領域33Aにおける位相値の傾きの絶対値とが等しくなっている。 Further, the basic phase pattern 31B of the second modification, the basic phase pattern 31C of the third modification, or the basic phase pattern 31D of the fourth modification shown in FIG. 7 may be used. In the first region 33B of the basic phase pattern 31B, the phase value increases linearly along the direction D1 by 4π radians. That is, the absolute value of the slope of the phase value in the first region 32B and the absolute value of the slope of the phase value in the second region 33A are equal.
基本位相パターン31Cでは、第1の領域32と第2の領域33との方向D1における位置関係が上記実施形態の場合とは逆になっている。すなわち、上述した基本位相パターン31においては、第1の領域32では、境界(中心線C)からの距離が大きくなるほど位相値が増加し、第2の領域33では、境界からの距離が小さくなるほど位相値が減少していたのに対し、基本位相パターン31Cにおいては、第1の領域32では、境界からの距離が小さくなるほど位相値が増加し、第2の領域33では、境界からの距離が大きくなるほど位相値が減少している。 In the basic phase pattern 31C, the positional relationship between the first region 32 and the second region 33 in the direction D1 is opposite to that in the above embodiment. That is, in the above-mentioned basic phase pattern 31, in the first region 32, the phase value increases as the distance from the boundary (center line C) increases, and in the second region 33, the distance from the boundary decreases. Whereas the phase value decreased, in the basic phase pattern 31C, in the first region 32, the phase value increased as the distance from the boundary decreased, and in the second region 33, the distance from the boundary increased. The larger the value, the smaller the phase value.
基本位相パターン31Dでは、上記第3の変形例と同様に、第1の領域32Dと第2の領域33Dとの方向D1における位置関係が上記実施形態の場合と逆になっている。さらに、基本位相パターン31Dにおいては、第1の領域32Dでは、位相値が方向D1に沿って直線的に4πラジアンだけ増加し、第2の領域33Dでは、位相値が方向D1に沿って直線的に4πラジアンだけ減少している。基本位相パターン31B〜31Dは、中心線Cに関して線対称となっている。基本位相パターン31B〜31Dでも、第1の領域32と第2の領域33Aの境界は中心線C上に位置している。 In the basic phase pattern 31D, the positional relationship between the first region 32D and the second region 33D in the direction D1 is opposite to that in the case of the above embodiment, as in the third modification. Further, in the basic phase pattern 31D, in the first region 32D, the phase value increases linearly by 4π radians along the direction D1, and in the second region 33D, the phase value linearly increases along the direction D1. It is reduced by 4π radians. The basic phase patterns 31B to 31D are line symmetric with respect to the center line C. Even in the basic phase patterns 31B to 31D, the boundary between the first region 32 and the second region 33A is located on the center line C.
これらの基本位相パターン31B〜31Dが用いられた場合でも、上記実施形態の場合と同様に、第1の対物レンズ16から試料Sに対してシート状の励起光L1を照射することが可能となり、簡易な構成でシート状の励起光L1を生成することができる。 Even when these basic phase patterns 31B to 31D are used, it is possible to irradiate the sample S with the sheet-shaped excitation light L1 from the first objective lens 16 as in the case of the above embodiment. A sheet-shaped excitation light L1 can be generated with a simple configuration.
また、図8に示されるように、回折格子状の回折格子パターン41を基本位相パターン31に重畳することで位相パターンPが算出されてもよい。回折格子パターン41は、方向D2において回折格子状をなしている。また、図9に示されるように、例えばフレネルレンズ等のレンズ状のレンズパターン42を基本位相パターン31に重畳することで位相パターンPが算出されてもよい。なお、回折格子パターン41又はレンズパターン42を基本位相パターン31A〜31Cに重畳することで位相パターンPが算出されてもよい。 Further, as shown in FIG. 8, the phase pattern P may be calculated by superimposing the diffraction grating pattern 41 on the basic phase pattern 31. The diffraction grating pattern 41 has a diffraction grating shape in the direction D2. Further, as shown in FIG. 9, the phase pattern P may be calculated by superimposing a lens-shaped lens pattern 42 such as a Fresnel lens on the basic phase pattern 31. The phase pattern P may be calculated by superimposing the diffraction grating pattern 41 or the lens pattern 42 on the basic phase patterns 31A to 31C.
これらの場合でも、上記実施形態の場合と同様に、第1の対物レンズ16から試料Sに対してシート状の励起光L1を照射することが可能となり、簡易な構成でシート状の励起光L1を生成することができる。また、回折格子又はレンズ素子を設けることなく、励起光の位相を回折格子状又はレンズ状とすることができる。そのため、より一層簡易な構成でシート状の励起光L1を生成することができる。 Even in these cases, it is possible to irradiate the sample S with the sheet-shaped excitation light L1 from the first objective lens 16 as in the case of the above embodiment, and the sheet-shaped excitation light L1 can be irradiated with a simple configuration. Can be generated. Further, the phase of the excitation light can be made into a diffraction grating or a lens without providing a diffraction grating or a lens element. Therefore, the sheet-shaped excitation light L1 can be generated with a simpler configuration.
また、図10に示される第5の変形例のライトシート顕微鏡1Dのように構成されてもよい。ライトシート顕微鏡1Dは、テレスコープ光学系を構成する第1の光学系15Dを備える点で上記実施形態のライトシート顕微鏡1と相違する。この第1の光学系15Dは、SLM14からの励起光L1を第1の対物レンズ16の瞳で集光させる2つのレンズ15Da,15Dbを有し、テレスコープ光学系を構成している。このようなテレスコープ光学系としては、4f光学系、ケプラー型光学系、又はガリレオ型光学系等が挙げられる。 Further, it may be configured like the light sheet microscope 1D of the fifth modification shown in FIG. The light sheet microscope 1D is different from the light sheet microscope 1 of the above embodiment in that it includes a first optical system 15D constituting a telescope optical system. The first optical system 15D has two lenses 15Da and 15Db that focus the excitation light L1 from the SLM 14 with the pupil of the first objective lens 16, and constitutes a telescope optical system. Examples of such a telescope optical system include a 4f optical system, a Kepler type optical system, a Galileo type optical system, and the like.
このようなライトシート顕微鏡1Dによっても、図11に示されるように、基本位相パターン31に従ってSLM14で励起光L1が変調されることでシート状の励起光L1が生成される。このように、第5の変形例によっても、上記実施形態の場合と同様に、第1の対物レンズ16から試料Sに対してシート状の励起光L1を照射することが可能となり、簡易な構成でシート状の励起光L1を生成することができる。 Even with such a light sheet microscope 1D, as shown in FIG. 11, the excitation light L1 is modulated by the SLM 14 according to the basic phase pattern 31, so that the sheet-shaped excitation light L1 is generated. As described above, even in the fifth modification, it is possible to irradiate the sample S with the sheet-shaped excitation light L1 from the first objective lens 16 as in the case of the above embodiment, which is a simple configuration. Can generate a sheet-shaped excitation light L1.
また、上記実施形態の基本位相パターン31において、方向D1において位相値が一定である第3の領域が更に設けられていてもよい。このような第3の領域は、例えば第1の領域32と第2の領域33との間に設けられる。この場合、第1の領域32と第2の領域33とは互いに隣接しない。 Further, in the basic phase pattern 31 of the above embodiment, a third region in which the phase value is constant in the direction D1 may be further provided. Such a third region is provided, for example, between the first region 32 and the second region 33. In this case, the first region 32 and the second region 33 are not adjacent to each other.
また、上記実施形態において、光検出器20は、グローバル読み出し可能なエリアイメージセンサであってもよい。第1の光学系15は省略されてもよく、SLM14から出力された励起光L1が第1の対物レンズ16に直接入力されてもよい。光走査部13は、SLM14から出力された励起光L1を受けるように配置されてもよい。第1の対物レンズ16の光軸と第2の対物レンズ17の光軸とは直交していなくてもよく、互いに交わっていなくてもよい。 Further, in the above embodiment, the photodetector 20 may be a globally readable area image sensor. The first optical system 15 may be omitted, and the excitation light L1 output from the SLM 14 may be directly input to the first objective lens 16. The optical scanning unit 13 may be arranged so as to receive the excitation light L1 output from the SLM 14. The optical axis of the first objective lens 16 and the optical axis of the second objective lens 17 may not be orthogonal to each other, or may not intersect with each other.
また、制御部21は、位相パターンPを適宜変更することで、生成するシート状の励起光L1の波長、シートの厚さ、集光位置、又は形状等を制御してもよい。制御部21は、収差補正のためのパターンを基本位相パターン31に重畳して位相パターンPを算出してもよい。また、例えばレンズ15aと第1の対物レンズ16との間には、励起光L1の0次光又は高次光をカットするためのスリットを有する光学素子が設けられていてもよい。これにより、不要光(ノイズになりうる光)を遮光できる。 Further, the control unit 21 may control the wavelength, the thickness, the condensing position, the shape, and the like of the sheet-shaped excitation light L1 to be generated by appropriately changing the phase pattern P. The control unit 21 may calculate the phase pattern P by superimposing the pattern for aberration correction on the basic phase pattern 31. Further, for example, an optical element having a slit for cutting the 0th-order light or the higher-order light of the excitation light L1 may be provided between the lens 15a and the first objective lens 16. As a result, unnecessary light (light that can become noise) can be blocked.
また、制御部21は、位相パターンPに応じて、ローリング読み出し可能な光検出器20において同時に露光される画素列数Nを設定してもよい。このとき、制御部21は、設定された画素列数N及び各画素列の露光期間T1に基づいてローリング読み出しの読み出し期間T2を設定する。この場合、各画素列の露光期間T1は、ユーザー等により設定される。また、制御部21は、設定された画素列数N及びローリング読み出しの読み出し期間T2に基づいて、各画素列の露光期間T1を設定してもよい。この場合、ローリング読み出しの読み出し期間T2は、ユーザー等により設定される。いずれの場合でも、制御部21は、光走査部13による励起光L1の走査とローリング読み出しが可能な光検出器20による各画素列Rの信号読み出しとが同期するように、光走査部13あるいは光検出器20を制御する。 Further, the control unit 21 may set the number of pixel rows N to be simultaneously exposed by the photodetector 20 capable of rolling and reading out according to the phase pattern P. At this time, the control unit 21 sets the reading period T2 for rolling reading based on the set number of pixel rows N and the exposure period T1 for each pixel row. In this case, the exposure period T1 of each pixel string is set by the user or the like. Further, the control unit 21 may set the exposure period T1 of each pixel sequence based on the set number of pixel sequences N and the reading period T2 of the rolling readout. In this case, the read period T2 for rolling read is set by the user or the like. In either case, the control unit 21 may use the optical scanning unit 13 or the optical scanning unit 13 or the control unit 21 so that the scanning of the excitation light L1 by the optical scanning unit 13 and the signal readout of each pixel sequence R by the photodetector 20 capable of rolling readout are synchronized. Controls the photodetector 20.
1…ライトシート顕微鏡(画像取得装置)、11…光源、13…光走査部、14…空間光変調器、16…第1の対物レンズ、17…第2の対物レンズ、20…光検出器、21…制御部、22…コンピュータ、23…コントローラ、31…基本位相パターン、32…第1の領域、33…第2の領域、41…回折格子パターン、42…レンズパターン、C…直線(中心線)、D1…所定の方向、L1…励起光、L2…検出光、P…位相パターン、R…画素列、S…試料。 1 ... Light sheet microscope (image acquisition device), 11 ... Light source, 13 ... Optical scanning unit, 14 ... Spatial light modulator, 16 ... First objective lens, 17 ... Second objective lens, 20 ... Photodetector, 21 ... Control unit, 22 ... Computer, 23 ... Controller, 31 ... Basic phase pattern, 32 ... First region, 33 ... Second region, 41 ... Diffraction grating pattern, 42 ... Lens pattern, C ... Straight line (center line) ), D1 ... predetermined direction, L1 ... excitation light, L2 ... detection light, P ... phase pattern, R ... pixel series, S ... sample.
Claims (10)
二次元に配列された複数の画素を有し、前記光源から出力された前記励起光の位相を前記複数の画素毎に変調する空間光変調器と、
前記空間光変調器で変調された前記励起光を試料に照射する第1の対物レンズと、
前記第1の対物レンズからの前記励起光の照射に伴って前記試料から発せられる検出光を導光する第2の対物レンズと、
前記第2の対物レンズにより導光された前記検出光を撮像する光検出器と、
前記複数の画素それぞれに対応する位相値が二次元に分布する位相パターンに従って前記複数の画素毎の位相変調量を制御する制御部と、を備え、
前記位相パターンは、所定の基本位相パターンに基づいて生成された位相パターンであり、
前記基本位相パターンは、所定の方向に沿って連続的かつ直線的に前記位相値が増加すると共に前記所定の方向に直交する方向については前記位相値が一定である第1の領域と、前記所定の方向において前記第1の領域と対向し、前記所定の方向に沿って連続的かつ直線的に前記位相値が減少すると共に前記所定の方向に直交する方向については前記位相値が一定である第2の領域と、を有する、画像取得装置。 A light source that outputs excitation light containing a wavelength that excites the sample,
A spatial light modulator having a plurality of pixels arranged in two dimensions and modulating the phase of the excitation light output from the light source for each of the plurality of pixels.
A first objective lens that irradiates the sample with the excitation light modulated by the spatial light modulator, and
A second objective lens that guides the detection light emitted from the sample in association with the irradiation of the excitation light from the first objective lens.
A photodetector that captures the detection light guided by the second objective lens, and
A control unit that controls the phase modulation amount for each of the plurality of pixels according to a phase pattern in which the phase values corresponding to the plurality of pixels are distributed in two dimensions is provided.
The phase pattern is a phase pattern generated based on a predetermined basic phase pattern.
The basic phase pattern includes a first region in which the phase value increases continuously and linearly along a predetermined direction and the phase value is constant in a direction orthogonal to the predetermined direction, and the predetermined region. The phase value faces the first region in the direction of the above, and the phase value decreases continuously and linearly along the predetermined direction, and the phase value is constant in the direction orthogonal to the predetermined direction . An image acquisition device having two regions.
前記空間光変調器で変調された前記励起光を前記試料に照射する第2のステップと、
前記励起光の照射に伴って前記試料から発せられる検出光を導光し、導光された前記検出光を撮像する第3のステップと、を含み、
前記第1のステップでは、所定の基本位相パターンに基づいて生成され、前記複数の画素それぞれに対応する位相値が二次元に分布する位相パターンに従って前記複数の画素毎の位相変調量を制御し、
前記基本位相パターンは、所定の方向に沿って連続的かつ直線的に前記位相値が増加すると共に前記所定の方向に直交する方向については前記位相値が一定である第1の領域と、前記所定の方向において前記第1の領域と対向し、前記所定の方向に沿って連続的かつ直線的に前記位相値が減少すると共に前記所定の方向に直交する方向については前記位相値が一定である第2の領域と、を有する、画像取得方法。 The first step of modulating the phase of the excitation light including the wavelength for exciting the sample for each of the plurality of pixels by a spatial light modulator having a plurality of pixels arranged in two dimensions.
A second step of irradiating the sample with the excitation light modulated by the spatial light modulator,
A third step of guiding the detection light emitted from the sample with the irradiation of the excitation light and imaging the guided detection light is included.
In the first step, the phase modulation amount for each of the plurality of pixels is controlled according to the phase pattern generated based on a predetermined basic phase pattern and the phase values corresponding to the plurality of pixels are distributed in two dimensions.
The basic phase pattern includes a first region in which the phase value increases continuously and linearly along a predetermined direction and the phase value is constant in a direction orthogonal to the predetermined direction, and the predetermined region. The phase value faces the first region in the direction of the above, and the phase value decreases continuously and linearly along the predetermined direction, and the phase value is constant in the direction orthogonal to the predetermined direction . An image acquisition method having two regions.
二次元に配列された複数の画素を有し、入力された光の位相を前記複数の画素毎に変調して変調後の光を出力する空間光変調器と、
前記複数の画素それぞれに対応する位相値が二次元に分布する位相パターンに従って前記複数の画素毎の位相変調量を制御する制御部と、を備え、
前記位相パターンは、所定の基本位相パターンに基づいて生成された位相パターンであり、
前記基本位相パターンは、所定の方向に沿って連続的かつ直線的に前記位相値が増加すると共に前記所定の方向に直交する方向については前記位相値が一定である第1の領域と、前記所定の方向において前記第1の領域と対向し、前記所定の方向に沿って連続的かつ直線的に前記位相値が減少すると共に前記所定の方向に直交する方向については前記位相値が一定である第2の領域と、を有する、空間光変調ユニット。 A spatial light modulation unit used in light sheet microscopes.
A spatial light modulator that has a plurality of pixels arranged in two dimensions, modulates the phase of the input light for each of the plurality of pixels, and outputs the modulated light.
A control unit that controls the phase modulation amount for each of the plurality of pixels according to a phase pattern in which the phase values corresponding to the plurality of pixels are distributed in two dimensions is provided.
The phase pattern is a phase pattern generated based on a predetermined basic phase pattern.
The basic phase pattern includes a first region in which the phase value increases continuously and linearly along a predetermined direction and the phase value is constant in a direction orthogonal to the predetermined direction, and the predetermined region. The phase value faces the first region in the direction of the above, and the phase value decreases continuously and linearly along the predetermined direction, and the phase value is constant in the direction orthogonal to the predetermined direction . A spatial light modulation unit having two regions.
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