JP2013160893A - Microscope and aberration correction method for the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、顕微鏡とその収差補正方法に関するものである。 The present invention relates to a microscope and an aberration correction method thereof.
従来、波面補正装置による補正量を変化させながら複数枚の画像を取得し、取得された画像を比較して最も良好に収差を補正できる補正量を決定する技術が知られている(例えば、非特許文献1参照。)。 Conventionally, a technique for acquiring a plurality of images while changing a correction amount by a wavefront correction apparatus and comparing the acquired images to determine a correction amount that can correct aberrations best is known (for example, (See Patent Document 1).
しかしながら、この非特許文献1の技術では、波面補正装置による補正量が決定されるまでの間に、標本を何度も撮影する必要があり、照射する光が励起光である場合には、標本にフォトブリーチングのようなダメージが与えられてしまうという不都合がある。
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、標本に与えるダメージを抑えつつ、標本の位置における収差を補正して精度よく観察を行うことができる顕微鏡とその収差補正方法を提供することを目的としている。
However, in the technique of this non-patent document 1, it is necessary to photograph the sample many times before the correction amount by the wavefront correction device is determined. There is a disadvantage that damage such as photo bleaching is given.
The present invention has been made in view of the above-described circumstances, and provides a microscope and an aberration correction method capable of correcting an aberration at the position of the sample and accurately observing while suppressing damage to the sample. The purpose is that.
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の一態様は、光源からの励起光の波面を変調する空間光変調素子と、標本上において励起光を2次元的に走査するスキャナと、該スキャナによる励起光の標本上の走査位置から発生した蛍光を撮影して蛍光画像を取得する撮像部と、前記スキャナによって前記標本上の少なくとも1箇所の位置に対するスポット状の前記励起光を照射させ、励起光の照射により前記標本において発生した蛍光を前記撮像部により撮影させ、取得された蛍光スポット像に基づいて前記標本の位置における収差をソフトウェアにより決定し、決定された収差に基づいて前記空間光変調素子を制御する制御部とを備える顕微鏡を提供する。
In order to achieve the above object, the present invention provides the following means.
One embodiment of the present invention includes a spatial light modulation element that modulates the wavefront of excitation light from a light source, a scanner that two-dimensionally scans excitation light on a sample, and a scanning position of the excitation light on the sample by the scanner. An imaging unit that captures the generated fluorescence and obtains a fluorescence image, and the scanner emits the spot-like excitation light to at least one position on the sample, and the fluorescence generated in the sample by irradiation of the excitation light A microscope including: a control unit that controls the spatial light modulation element based on the determined aberration based on the acquired fluorescence spot image. I will provide a.
本態様によれば、光源から発せられた励起光がスキャナによって標本上で走査されると、標本内に含まれる蛍光物質が励起されて蛍光が発生する。そして、発生した蛍光は撮像部により撮影されることにより、蛍光画像が取得される。 According to this aspect, when the excitation light emitted from the light source is scanned on the specimen by the scanner, the fluorescent substance contained in the specimen is excited to generate fluorescence. Then, the generated fluorescence is photographed by the imaging unit, whereby a fluorescence image is acquired.
制御部が、スキャナを制御して標本上の少なくとも1箇所にスポット状の励起光を照射させ、そのときに発生した蛍光を撮像部により撮影させることで、蛍光スポット像が取得される。この蛍光スポット像は、標本までの光路に存在する光学部材の屈折率不均一性に基づく収差が含まれている場合には変形するので、制御部はその光学スポット像の形状に基づいて収差をソフトウェア的に決定することができる。 The control unit controls the scanner to irradiate at least one spot on the specimen with spot-like excitation light, and the fluorescence generated at that time is captured by the imaging unit, whereby a fluorescent spot image is acquired. Since this fluorescent spot image is deformed when aberrations based on the refractive index non-uniformity of the optical member existing in the optical path to the specimen are included, the control unit corrects the aberration based on the shape of the optical spot image. It can be determined by software.
制御部は、決定された収差に基づいて空間光変調素子を制御することにより、収差をなくすように、励起光の波面を変調することができる。すなわち、上記により変調された波面を有する励起光をスキャナによって標本上で走査することにより、精密な蛍光画像を取得して、精度よく観察することができる。この場合において、収差を取り除くために空間光変調素子により発生する位相パターンを、蛍光スポット像を1回撮影するだけで決定することができ、標本に与えるダメージを抑えつつ、標本の位置における収差を補正して精度よく観察を行うことができる。 The control unit can modulate the wavefront of the excitation light so as to eliminate the aberration by controlling the spatial light modulation element based on the determined aberration. That is, by scanning excitation light having a wavefront modulated as described above on a specimen with a scanner, a precise fluorescent image can be acquired and observed with high accuracy. In this case, the phase pattern generated by the spatial light modulation element in order to remove the aberration can be determined only by photographing the fluorescent spot image once, and the aberration at the position of the specimen can be reduced while suppressing damage to the specimen. Correction can be performed with high accuracy.
上記態様においては、前記制御部が、前記標本の位置における種々の収差を含むスポット像をソフトウェア的に生成した複数の参照スポット像と前記撮像部において取得された蛍光スポット像とを比較して、類似性の高い参照スポット像に含まれる収差を、前記標本の位置における収差として決定してもよい。
このようにすることで、種々の収差を含む複数の参照スポット像は、ソフトウェア的に簡易に生成することができ、各参照スポット像の形状と、撮影した蛍光スポット像の形状とを比較して、最も類似する参照スポット像に含まれる収差を、標本の位置における収差として決定することができる。
In the above aspect, the control unit compares a plurality of reference spot images generated by software with a spot image including various aberrations at the position of the sample and the fluorescent spot image acquired in the imaging unit, The aberration included in the reference spot image having high similarity may be determined as the aberration at the position of the sample.
In this way, a plurality of reference spot images including various aberrations can be easily generated by software, and the shape of each reference spot image is compared with the shape of the captured fluorescent spot image. The aberration included in the most similar reference spot image can be determined as the aberration at the sample position.
また、上記態様においては、前記参照スポット像が、Zernike係数を用いてソフトウェア的に生成されていてもよい。
このようにすることで、種々の収差を含む参照スポット像を、ソフトウェア的に簡易に生成することができる。
In the above aspect, the reference spot image may be generated by software using a Zernike coefficient.
By doing in this way, the reference spot image containing various aberrations can be easily generated by software.
また、上記態様においては、前記制御部が、前記参照スポット像と前記蛍光スポット像との類似性を相互相関によって判定してもよい。
このようにすることで、2つのスポット像の類似性を簡易に判定し、取得された蛍光スポット像に最も類似している参照スポット像を簡易に決定することができる。
Moreover, in the said aspect, the said control part may determine the similarity of the said reference spot image and the said fluorescence spot image by a cross correlation.
By doing in this way, the similarity of two spot images can be determined easily and the reference spot image most similar to the acquired fluorescent spot image can be easily determined.
また、上記態様においては、前記撮像部が、前記標本上の2以上の位置に対するスポット状の励起光の照射により前記標本において発生した蛍光を撮影して複数の蛍光スポット像を取得してもよい。
このようにすることで、複数の蛍光スポット像の各々について参照スポット像との類似性を判定することができ、決定される収差の精度を向上することができる。
In the above aspect, the imaging unit may acquire a plurality of fluorescent spot images by photographing fluorescence generated in the specimen by irradiation with spot-like excitation light at two or more positions on the specimen. .
By doing in this way, the similarity with a reference spot image can be determined about each of several fluorescent spot images, and the precision of the determined aberration can be improved.
また、上記態様においては、前記標本上の2以上の位置に対するスポット状の励起光の照射パターンが、前記空間光変調素子により生成されてもよい。
このようにすることで、空間光変調素子の制御により励起光の波面を変調して、複数の位置にスポット状の励起光を同時に照射することができる。
Moreover, in the said aspect, the irradiation pattern of the spot-like excitation light with respect to two or more positions on the said sample may be produced | generated by the said spatial light modulation element.
By doing so, the wavefront of the excitation light can be modulated by controlling the spatial light modulation element, and a plurality of positions can be irradiated with spot-like excitation light simultaneously.
また、本発明の他の態様は、光源からの励起光を標本に照射し、標本において発生した蛍光を撮影して蛍光画像を取得する顕微鏡の収差補正方法であって、前記標本に対してスポット状の励起光を照射して取得した蛍光スポット像に基づいて、前記標本の位置における収差をソフトウェア的に決定するステップと、決定された収差を低下させるように前記励起光の波面を変調するステップとを含む顕微鏡の収差補正方法を提供する。 Another aspect of the present invention is a microscope aberration correction method for irradiating a specimen with excitation light from a light source, photographing fluorescence generated in the specimen, and acquiring a fluorescent image, and spotting the specimen with respect to the spot And determining the aberration at the position of the sample by software based on the fluorescent spot image obtained by irradiating the excitation light in the shape, and modulating the wavefront of the excitation light so as to reduce the determined aberration And a microscope aberration correction method.
本態様によれば、収差を取り除くために励起光の波面に与える変調を、蛍光スポット像を1回撮影するだけで決定することができ、標本に与えるダメージを抑えつつ、標本の位置における収差を補正して精度よく観察を行うことができる。 According to this aspect, the modulation to be given to the wavefront of the excitation light in order to remove the aberration can be determined only by photographing the fluorescent spot image once, and the aberration at the position of the specimen can be reduced while suppressing damage to the specimen. Correction can be performed with high accuracy.
上記態様においては、収差を決定するステップが、前記標本の位置における種々の収差を含むスポット像からなる複数の参照スポット像をソフトウェア的に生成するステップと、生成された参照スポット像と前記蛍光スポット像とを比較するステップとを含み、類似性の高い参照スポット像に含まれる収差を、前記標本の位置における収差として決定してもよい。 In the above aspect, the step of determining the aberration includes a step of generating a plurality of reference spot images composed of spot images including various aberrations at the position of the specimen in software, the generated reference spot image and the fluorescent spot. An aberration included in a reference spot image having high similarity may be determined as an aberration at the position of the sample.
また、上記態様においては、前記参照スポット像が、Zernike係数を用いてソフトウェア的に生成されてもよい。
また、上記態様においては、収差を決定するステップが、前記参照スポット像と前記蛍光スポット像との類似性を相互相関によって判定してもよい。
また、上記態様においては、収差を決定するステップが、前記標本上の2以上の位置に対するスポット状の励起光の照射により前記標本において発生した蛍光を撮影して取得した複数の蛍光スポット像に基づいて決定してもよい。
In the above aspect, the reference spot image may be generated by software using a Zernike coefficient.
Moreover, in the said aspect, the step which determines an aberration may determine the similarity of the said reference spot image and the said fluorescence spot image by a cross correlation.
Further, in the above aspect, the step of determining aberration is based on a plurality of fluorescent spot images acquired by photographing fluorescence generated in the specimen by irradiation of spot-like excitation light at two or more positions on the specimen. May be determined.
本発明によれば、標本に与えるダメージを抑えつつ、標本の位置における収差を補正して精度よく観察を行うことができるという効果を奏する。 According to the present invention, it is possible to perform observation with high accuracy by correcting aberrations at the position of the specimen while suppressing damage to the specimen.
本発明の一実施形態に係る顕微鏡1について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡1は、図1に示されるように、光源2からの励起光を標本Aに照射する照明光学系3と、標本Aにおいて発生した蛍光を撮影する撮影光学系4と、これらを制御する制御部5とを備えている。
A microscope 1 according to an embodiment of the present invention will be described below with reference to the drawings.
As shown in FIG. 1, the microscope 1 according to the present embodiment includes an illumination optical system 3 that irradiates the specimen A with excitation light from the
照明光学系3は、光源2からの励起光をコリメートするコリメートレンズ6と、励起光の波面を変調する波面変調部7と、波面変調部7において変調された波面をリレーするリレー光学系8,9と、励起光を2次元的に走査する第1スキャナ10と、励起光を反射し蛍光を透過するダイクロイックミラー11と、励起光を標本Aに照射する対物レンズ12とを備えている。
The illumination optical system 3 includes a
波面変調部7は、反射型の波面変調素子(空間光変調素子)13と、該波面変調素子13への励起光の入射角度を波面変調素子13の法線方向に近づけるための折り返しミラー14とを備えている。波面変調素子13は、制御部5からの指令に従う照射パターンを達成可能なホログラムの位相パターンを反射面に発生し、反射面において反射される励起光の波面を位相パターンに従う形態に変調するようになっている。また、波面変調素子13は、その反射面を鏡面状にすることで、入射された励起光を変調することなく反射することができるようになっている。
第1スキャナ10は、非平行な軸線回りに揺動させられる2枚のガルバノミラー10a,10bを近接して配置した、いわゆる近接ガルバノミラーにより構成されている。
The
The
撮影光学系4は、対物レンズ12によって集光され、ダイクロイックミラー11を透過した標本Aからの蛍光をリレーするリレー光学系15と、標本A上における蛍光の検出位置を2次元的に走査させる第2スキャナ16と、集光レンズ17,18と、共焦点ピンホール19と、光電子増倍管20とを備えている。
第2スキャナ16も、非平行な軸線回りに揺動させられる2枚のガルバノミラー16a,16bを近接して配置した、いわゆる近接ガルバノミラーにより構成されている。
The photographing optical system 4 has a relay
The
制御部5は、光電子増倍管20により取得された蛍光の強度情報と第1スキャナ10および第2スキャナ16の走査位置情報とに基づいて蛍光画像を生成するようになっている。
また、制御部5は、第2スキャナ16を停止して、第1スキャナ10を作動させることにより、取得された蛍光画像に基づいて、スポット状の励起光を照射する位置を設定するとともに、設定された位置にスポット状の励起光が照射されるように第1スキャナ10を停止した状態で、第2スキャナ16を作動させて蛍光スポット像を取得させるようになっている。
The
Further, the
また、制御部5は、種々の収差を含むスポット像をソフトウェア的に生成した複数の参照スポット像を収差と対応づけて記憶する記憶部5aを備えている。
参照スポット像は、例えば、Zernike係数を用いて生成する。
In addition, the
The reference spot image is generated using, for example, a Zernike coefficient.
すなわち、収差は、対物レンズ12の瞳位置かつZernikeZ(ρ,θ)ベースで与えることとし、収差ベクトルをΔW=(Z1,Z2,…,Zn)とする。無収差の場合にはΔW=(0,0,…,0)である。
That is, the aberration is given based on the pupil position of the
例えば、Z5に0.1λの収差を含む場合には、図4(a)に示されるように、収差ベクトルΔW=(0,0,0,0,0.1,0,…,0)の参照スポット像を生成する。
次に、図4(b)に示されるように、Z8に0.1λの収差を含む収差ベクトルΔW=(0,0,0,0,0,0,0,0.1,0,…,0)の参照スポット像を生成する。
次に、図4(c)に示されるように、Z5に0.1λ、Z8に0.1λの収差を含む収差ベクトルΔW=(0,0,0,0,0.1,0,0,0.1,0,…,0)の参照スポット像を生成する。
For example, when Z 5 includes an aberration of 0.1λ, the aberration vector ΔW = (0, 0, 0, 0, 0.1, 0,..., 0) as shown in FIG. A reference spot image is generated.
Next, as shown in FIG. 4 (b), the aberration vector ΔW = (0,0,0,0,0,0,0,0.1,0 containing aberration of 0.1λ to Z 8, ... , 0) is generated.
Next, as shown in FIG. 4 (c), the aberration vector ΔW = (0,0,0,0,0.1,0 containing the Z 5 0.1 [lambda], the aberrations of 0.1 [lambda] to Z 8, 0, 0.1, 0,..., 0) reference spot images are generated.
このようにして、この工程を所定数のZernike係数について、所定の収差範囲にわたって、所定の収差間隔で、(収差範囲/収差間隔)^(Zernike係数の数)回繰り返す。
例えば、5個のZernike係数Z5,Z6,Z7,Z8,Z9に対して、±5λの収差範囲を0.1λ間隔で行う場合、1005回繰り返すことになる。
In this manner, this process is repeated (aberration range / aberration interval) ^ (number of Zernike coefficients) times at a predetermined aberration interval over a predetermined aberration range for a predetermined number of Zernike coefficients.
For example, when an aberration range of ± 5λ is performed at intervals of 0.1λ for five Zernike coefficients Z 5 , Z 6 , Z 7 , Z 8 , Z 9 , 100 5 times are repeated.
そして、制御部5は、このようにして生成された複数の参照スポット像と、撮影により取得した蛍光スポット像との相互相関をとり、その評価関数値が最も大きくなった場合の収差ベクトルΔW=(0,0,0,0,X1,X2,X3,X4,X5,…,Xn)を標本Aの位置における収差として決定する。
さらに、制御部5は、得られた収差ベクトルΔWを補正し得る位相パターンを波面変調素子13の反射面に発生させるように、波面変調素子13に指令するようになっている。これにより、標本Aに無収差のスポットを形成することができ、強度の高い蛍光像を得ることができることになる。
Then, the
Further, the
このように構成された本実施形態に係る顕微鏡1の収差補正方法について、以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡1の収差補正方法は、図2に示されるように、まず、波面変調素子13による波面の補正を行わない状態、すなわち、波面変調素子13の反射面を鏡面に設定する(ステップS1)。
The aberration correction method of the microscope 1 according to this embodiment configured as described above will be described below.
In the aberration correction method of the microscope 1 according to the present embodiment, as shown in FIG. 2, first, the wavefront is not corrected by the
次いで、第2スキャナ16を停止して(ステップS2)、第1スキャナ10を作動させる(ステップS3)。これにより、光源2からの励起光を波面変調素子13において無変調のまま反射させ、リレー光学系8によってリレーし、第1スキャナ10によって2次元的に走査する。第1スキャナ10によって2次元的に走査された励起光は、リレー光学系9によってリレーされ、ダイクロイックミラー11によって反射され、対物レンズ12によって標本A上に集光され、標本A内に存在している蛍光物質を励起する。
Next, the
標本A内で蛍光物質が励起されることにより発生した蛍光は、対物レンズ12によって集光され、ダイクロイックミラー11を透過し、リレー光学系15によってリレーされた後、停止している第2スキャナ16を通過して、集光レンズ17により集光され、対物レンズ12の焦点面において発生した蛍光のみが、共焦点ピンホール19を通過し、集光レンズ18によって集光されて、光電子増倍管20により検出される。光電子増倍管20により検出された蛍光強度と、各蛍光強度を検出した時点での第1スキャナ10の走査位置とを対応づけて記憶することにより、図3(a)に示される蛍光画像が取得される(ステップS4)。
The fluorescence generated by exciting the fluorescent substance in the specimen A is collected by the
次に、制御部5は、取得された蛍光画像内において、所定の面積で蛍光強度の高い領域を検出し、図3(b)に示されるように、その位置をスポット位置として設定し(ステップS5)、第1スキャナ10に送る。図3(b)は、図3(a)の枠で囲んだ領域の拡大図であり、破線は、図3(a)の蛍光画像において蛍光を発生する蛍光物質の存在する部分の境界を示しており、スポット像がある領域の方が蛍光物質が存在する領域である。
そして、設定されたスポット位置に励起光が照射されるように第1スキャナ10を停止させ(ステップS6)、第2スキャナ16を作動させる(ステップS7)。
Next, the
Then, the
これにより、設定された標本A上のスポット位置に、スポット状の励起光が照射されるので、第2スキャナ16の作動によって、図3(c)に示されるように、スポット位置周辺の蛍光画像である蛍光スポット像を取得する(ステップS8)。
Thereby, since the spot-like excitation light is irradiated to the set spot position on the specimen A, the fluorescence image around the spot position is obtained by the operation of the
次に、制御部5は、記憶部5aに記憶されている参照スポット像を読み出し(ステップS9)、取得された蛍光スポット像と読み出された参照スポット像との類似性を読み出した全ての参照スポット像に対して算出する(ステップS10)。類似性の算出は、上述したように、異なる収差ベクトルΔWを有するように生成された各参照スポット像と、撮影により取得された蛍光スポット像との相互相関の評価関数値を算出することにより行われる。
Next, the
そして、評価関数値の最も大きくなる参照スポット像を決定することにより、蛍光スポット像に最も類似する参照スポット像の収差ベクトルΔWを決定する(ステップS11)。
制御部5は、上述のようにして決定された収差ベクトルΔWを補正し得る位相パターンを波面変調素子13の反射面に発生させるように、波面変調素子13に指令する(ステップS12)。
Then, by determining the reference spot image having the largest evaluation function value, the aberration vector ΔW of the reference spot image most similar to the fluorescent spot image is determined (step S11).
The
このようにして波面変調素子が設定された状態で、第2スキャナ16を停止し(ステップS13)、第1スキャナ10を作動させることにより(ステップS14)、標本Aに無収差のスポットを形成し、該スポットを第1スキャナ10によって2次元的に走査させる。これにより、各走査位置において強度の高い蛍光を発生させることができる。
そして、各走査位置において発生した強度の高い蛍光を光電子増倍管20において検出することにより、標本の鮮明な蛍光画像を取得することができる(ステップS15)。
With the wavefront modulation element set in this manner, the
Then, by detecting the high-intensity fluorescence generated at each scanning position in the
すなわち、本実施形態に係る顕微鏡1およびその位相補正方法によれば、波面変調素子13において発生する位相パターンを決定するための情報の取得を、標本Aに励起光を複数回照射することにより試行錯誤的に行うのではなく、1回の撮影により取得した蛍光スポット像と、ソフトウェア的に発生させた複数の参照スポット像との比較により行う。このため、標本Aに過度の励起光を照射せずに済み、標本Aに与えるダメージを抑えつつ、標本Aの位置における収差を補正して精度よく観察を行うことができるという利点がある。
That is, according to the microscope 1 and the phase correction method thereof according to the present embodiment, acquisition of information for determining the phase pattern generated in the
なお、本実施形態においては、参照スポット像の生成を全ての組み合わせについて計算することとしたが、全ての組み合わせについて計算すると計算量が多いので、これに代えて、以下の通りに計算してもよい。
すなわち、まず、Z5に0.1λの収差を含む収差ベクトルΔW=(0,0,0,0,0.1,0,…,0)の場合の参照スポット像を生成する。
そして、撮影した蛍光スポット像と生成された参照スポット像の相互相関をとり、その値をM1とする。
In this embodiment, the generation of the reference spot image is calculated for all the combinations. However, since the calculation amount is large when calculating for all the combinations, the calculation may be performed as follows instead. Good.
That is, first, a reference spot image in the case of an aberration vector ΔW = (0, 0, 0, 0, 0.1, 0,..., 0) including an aberration of 0.1λ in Z 5 is generated.
Then, the cross-correlation between the photographed fluorescent spot image and the generated reference spot image is taken, and the value is set to M1.
次に、Zernike係数Z5に0.2λの収差を含む収差ベクトルΔW=(0,0,0,0,0.2,0,…,0)の場合の参照スポット像を生成し、蛍光スポット像との相互相関をとり、その値をM2とする。この工程を所定の収差範囲にわたって、所定の収差間隔で繰り返し、相互相関が最も大きな値となった収差ベクトルΔW=(0,0,0,0,X1,0,…,0)をZernike係数Z5の値として決定する。この工程をZ6,Z7,…と繰り返し、順次Zernike係数の値を決定していく。 Next, a reference spot image in the case of an aberration vector ΔW = (0, 0, 0, 0, 0.2, 0,..., 0) including an aberration of 0.2λ in the Zernike coefficient Z 5 is generated, and the fluorescent spot The cross-correlation with the image is taken and the value is M2. This process is repeated over a predetermined aberration range at a predetermined aberration interval, and the aberration vector ΔW = (0, 0, 0, 0, X 1 , 0,..., 0) having the largest cross-correlation is expressed as a Zernike coefficient. It is determined as the value of Z 5. This process is repeated with Z 6 , Z 7 ,... To sequentially determine the value of the Zernike coefficient.
この方法によれば、繰り返し回数は100×5回となり、大幅に計算量を減らすことができる。
あるいは、相互相関の値が所定の値を超えた時点で計算を終了することにしてもよい。これによっても、大幅に計算量を減らすことができる。
According to this method, the number of repetitions is 100 × 5, and the amount of calculation can be greatly reduced.
Alternatively, the calculation may be terminated when the cross-correlation value exceeds a predetermined value. This also can greatly reduce the amount of calculation.
また、本実施形態においては、蛍光を検出する撮影光学系4に、光電子増倍管20を用いたため、蛍光スポット像を取得するために、第2スキャナ16を作動させることとしたが、これに代えて、図5に示されるように、CCDあるいはCMOSイメージセンサのような撮像素子を採用し、第2スキャナ16をなくしてもよい。
In the present embodiment, since the
また、本実施形態においては、標本Aにおける1つの蛍光スポット像を取得して、参照スポット像との類似性を判定することとしたが、これに代えて、複数の蛍光スポット像を取得して、参照スポット像との類似性を計算し、それらの平均によって、類似性を判定することにしてもよい。このようにすることで、精度よく収差ベクトルΔWを決定することができる。 In the present embodiment, one fluorescence spot image in the specimen A is acquired and the similarity to the reference spot image is determined. Instead, a plurality of fluorescence spot images are acquired. The similarity with the reference spot image may be calculated, and the similarity may be determined based on the average of these. In this way, the aberration vector ΔW can be determined with high accuracy.
また、この場合に、標本A上に形成する複数のスポットは、第1スキャナ10の動作により、その位置を逐次変化させることにしてもよいし、波面変調素子13によって、複数のスポットを同時に標本Aに生成するような位相パターンを励起光に与えてもよい。位相パターンを励起光に与えることにより複数のスポットを同時に標本Aに生成する場合、撮影光学系4にCCDやCMOSイメージセンサのような撮像素子を配置することにより、同時に複数地点の蛍光スポット像を取得することができる。
In this case, the positions of the plurality of spots formed on the specimen A may be sequentially changed by the operation of the
また、本実施形態においては、反射型の波面変調素子を例示したが、これに代えて、透過型の波面変調素子を採用することにしてもよい。
また、本実施形態においては、図1において共焦点ピンホール19を用いた顕微鏡を例示したが、これに代えて、光源2に超短パルスレーザを用いて多光子励起による蛍光観察を行うこととして、共焦点ピンホールを省略してもよい。
Further, in the present embodiment, the reflection type wavefront modulation element is illustrated, but instead of this, a transmission type wavefront modulation element may be adopted.
In the present embodiment, the microscope using the
1 顕微鏡
2 光源
5 制御部
10 第1スキャナ(スキャナ)
13 波面変調素子(空間光変調素子)
20 光電子増倍管(撮像部)
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1
13 Wavefront modulator (spatial light modulator)
20 Photomultiplier tube (imaging part)
Claims (11)
標本上において励起光を2次元的に走査するスキャナと、
該スキャナによる励起光の標本上の走査位置から発生した蛍光を撮影して蛍光画像を取得する撮像部と、
前記スキャナによって前記標本上の少なくとも1箇所の位置に対するスポット状の前記励起光を照射させ、励起光の照射により前記標本において発生した蛍光を前記撮像部により撮影させ、取得された蛍光スポット像に基づいて前記標本の位置における収差をソフトウェア的に決定し、決定された収差に基づいて前記空間光変調素子を制御する制御部とを備える顕微鏡。 A spatial light modulator that modulates the wavefront of the excitation light from the light source;
A scanner for two-dimensionally scanning excitation light on the specimen;
An imaging unit that captures fluorescence generated from a scanning position on the sample of excitation light by the scanner and acquires a fluorescence image;
Based on the acquired fluorescent spot image by irradiating the spot-shaped excitation light to at least one position on the specimen by the scanner, causing the imaging unit to photograph fluorescence generated in the specimen by the irradiation of excitation light And a control unit that determines the aberration at the position of the sample by software and controls the spatial light modulator based on the determined aberration.
前記標本に対してスポット状の励起光を照射して取得した蛍光スポット像に基づいて、前記標本の位置における収差をソフトウェア的に決定するステップと、
決定された収差を低下させるように前記励起光の波面を変調するステップとを含む顕微鏡の収差補正方法。 A microscope aberration correction method for irradiating a sample with excitation light from a light source and photographing fluorescence generated in the sample to obtain a fluorescence image,
Based on a fluorescent spot image obtained by irradiating the specimen with spot-like excitation light, determining the aberration at the specimen position by software;
A method for correcting aberrations of the microscope, comprising: modulating a wavefront of the excitation light so as to reduce the determined aberration.
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