JP6749599B2

JP6749599B2 - Lignan compounds

Info

Publication number: JP6749599B2
Application number: JP2016106503A
Authority: JP
Inventors: 義人鈴木; 明秀梁; 智慧子安間
Original assignee: HEKIZANEN Co., Ltd.; Ibaraki University NUC; Yokohama City University
Current assignee: HEKIZANEN Co., Ltd.; Ibaraki University NUC; Yokohama City University
Priority date: 2015-05-27
Filing date: 2016-05-27
Publication date: 2020-09-02
Anticipated expiration: 2036-05-27
Also published as: JP2017074047A; JP2017002031A; JP6828883B2

Description

本発明はリグナン系化合物に関し、より詳しくはガン幹細胞の生育阻害活性を有するリグナン系化合物に関する。 The present invention relates to a lignan compound, and more particularly to a lignan compound having a cancer stem cell growth inhibitory activity.

ガン幹細胞は腫瘍組織に少量含まれる幹細胞の性質を持った細胞種である。ガン幹細胞は通常のガン細胞のように細胞***が盛んでなくほとんど休眠しているような状態であるため、盛んな細胞活性を標的とする既存の抗ガン剤は有効でない。ガン幹細胞は自己複製能と造腫瘍能があり、正常組織内に移入されると元の腫瘍組織と同様の腫瘍を形成するため、ガンの転移や再発の主要な原因となっている。しかしガン幹細胞の生育を阻害する有効な薬剤は開発されておらず、その開発はガン研究における重要な研究対象となっている。 Cancer stem cells are a cell type having the properties of stem cells contained in a small amount in tumor tissue. Since cancer stem cells are in a state of almost dormant and do not proliferate like normal cancer cells, existing anti-cancer agents targeting vigorous cell activity are not effective. Cancer stem cells have the ability of self-renewal and tumorigenicity, and when transferred into normal tissues, they form tumors similar to the original tumor tissue, which is a major cause of cancer metastasis and recurrence. However, an effective drug that inhibits the growth of cancer stem cells has not been developed, and its development has become an important research target in cancer research.

従来、ガン幹細胞は腫瘍組織から取り出されて研究に用いられてきた。しかしガン幹細胞は腫瘍組織に微量しか含まれていないため、抗ガン細胞物質のスクリーニングなど大量のガン幹細胞を必要とする研究には不向きであった。このため共同発明者の横浜市立大学医学部梁明秀教授は、iPS技術を用いてガン幹細胞の性質を持つ培養細胞系（iCSCL-10A）を確立することに成功した。本培養細胞を用いることによって、ガン幹細胞の生育阻害活性の検定が可能となった。 Traditionally, cancer stem cells have been extracted from tumor tissue and used for research. However, since cancer stem cells contain only a small amount in tumor tissue, they were not suitable for studies that required large amounts of cancer stem cells, such as screening for anti-cancer cell substances. Therefore, co-inventor Professor Akihide Liang of Yokohama City University School of Medicine succeeded in establishing a cultured cell line (iCSCL-10A) having cancer stem cell properties using iPS technology. By using the main culture cells, it became possible to assay the growth inhibitory activity of cancer stem cells.

トチュウ（杜仲、Eucommia ulmoides）は主に中国の四川・湖南省等に分布している自然の樹木である。杜仲葉は、現在では「杜仲茶」などの健康食品として多く食されているが、中国西部の民族学的調査によると「羌族」などの少数民族で古くから茶や粥として食されてきたことが明らかになっている。その最大摂取量に関して杜仲葉エキスで２０ｇ／日（葉重量に換算して約１００ｇ）との記述があり、この範囲での摂取量と安全性については問題のないことが示唆されている。また、現存種が一科一属一種（トチュウ科トチュウ属トチュウ種）であため、種内変異の幅が小さく含有成分の質的量的偏りが少ないことから、遺伝学的観点からも安定した素材である。 Eucommia ulmoides is a natural tree mainly distributed in Sichuan and Hunan provinces of China. Tochu leaf is now often eaten as a health food such as "Tochu tea", but according to an ethnographic survey in western China, it has been eaten as tea or porridge for a long time by ethnic minorities such as "Kan tribe". Has been revealed. Regarding the maximum intake, there is a description that the Tochu leaf extract is 20 g/day (about 100 g in terms of leaf weight), and it is suggested that there is no problem in the intake and safety in this range. In addition, since the existing species is one family and one genus (Euthus, Eucommia eucommia species), the range of intraspecific variation is small and the qualitative and quantitative distribution of the components is small, which is stable from a genetic perspective. It is a material.

杜仲葉はイリドイドやポリフェノールを含むことが知られており（例えば特許文献１〜３）、さらに杜仲葉から分離されたイリドイド、フェニルプロパノイド、フラボノイドを含むいくつかのタイプの二次代謝産物が特定の対生物作用を示すことが現在までの研究で明らかとなっている（例えば非特許文献１〜４等）。pinoresinol di-O-β-d-glucopyranosideやgeniposidic acidは杜仲葉特有の化合物である。イリドイド類のgeniposidic acidは杜仲葉中の含有量も高く、これが体内に吸収されると副交感神経に働きかけ末梢血管の周りの筋肉を弛緩することで降圧作用をもたらすことが知られている。また、geniposidic acidは内臓脂肪の減少や体重増加の抑制に働きかけるアディポネクチンを増加させてコレステロール値の上昇を抑制するということも知られている。その他、杜仲葉由来の化学物質として、genipinとgeniposideは消炎剤、血栓阻害および抗腫瘍活性を示し、chlorogenic acidは抗菌性、抗酸化性および抗突然変異性を示し、baicalein、wogoninおよびoroxylin Aを含むフラボノイドは抗酸化力、抗炎症性、抗ウイルス性を示すことなどが報告されている。 Tochu leaf is known to contain iridoids and polyphenols (for example, Patent Documents 1 to 3), and several types of secondary metabolites including iridoid, phenylpropanoids, and flavonoids isolated from the Tochu leaf are identified. It has been clarified in the studies up to now that it exhibits the anti-biological action of the above (for example, Non-Patent Documents 1 to 4). Pinoresinol di-O-β-d-glucopyranoside and geniposidic acid are compounds peculiar to Morinaka leaves. It is known that giriposidic acid, which is an iridoid, has a high content in Tochu leaf, and when it is absorbed in the body, it acts on the parasympathetic nerve and relaxes the muscle around the peripheral blood vessels to bring about a hypotensive effect. It is also known that geniposidic acid increases adiponectin, which works to reduce visceral fat and suppresses weight gain, thereby suppressing an increase in cholesterol level. In addition, as chemicals derived from Tochu leaf, genipin and geniposide show anti-inflammatory, antithrombotic and antitumor activity, chlorogenic acid shows antibacterial, antioxidant and antimutagenic properties, baicalein, wogonin and oroxylin A. It has been reported that the flavonoids contained therein exhibit antioxidant power, anti-inflammatory property, antiviral property, and the like.

この他、特許文献４にはリグナン類似構造を有する化合物としてフェノール性二量体化合物が開示されている。当該化合物はリパーゼ阻害作用を有するとされる。 In addition to this, Patent Document 4 discloses a phenolic dimer compound as a compound having a lignan-like structure. The compound is said to have a lipase inhibitory action.

特許第４８４６８３８号Patent No. 4846838 特許第５０１４３２０号Patent No. 5014320 特許第５３２３００３号Patent No. 5232003 特開２０１２−１１６７５６号公報JP 2012-116756 A

Isoguro et al., Studies on iridoid-related compounds. IV. Antitumor activity of iridoid aglycones. Chem. Pharm. Bull. 34: 2375-2379, 1986;Isoguro et al., Studies on iridoid-related compounds. IV. Antitumor activity of iridoid aglycones. Chem. Pharm. Bull. 34: 2375-2379, 1986; Ikemoto et al., Antitumor effects of Scutellariae radix and its components baicalein, baicalin, and wogonin on bladder cancer cell lines. Urology 55, 951-955, 2000;Ikemoto et al., Antitumor effects of Scutellariae radix and its components baicalein, baicalin, and wogonin on bladder cancer cell lines. Urology 55, 951-955, 2000; Zhang et al., Studies on bioactivities of chlorogenic acid and its analogues. Chin. Tradit. Herbal Drags 32: 173-176, 2001Zhang et al., Studies on bioactivities of chlorogenic acid and its analogues. Chin. Tradit. Herbal Drags 32: 173-176, 2001 Tang et al., Simultaneous determination of ten bioactive constituents in Eucommia ulmoides leaves and Tochu tea products by high-performance liquid chromatography-diode array detector-mass spectrometry (HPLC-DAD-MS). J. Trad. Med., 25, 112-118, 2008Tang et al., Simultaneous determination of ten bioactive constituents in Eucommia ulmoides leaves and Tochu tea products by high-performance liquid chromatography-diode array detector-mass spectrometry (HPLC-DAD-MS). J. Trad. Med., 25, 112 -118, 2008

前述のとおり、ガン幹細胞の生育を阻害する有効な薬剤は未だ開発されておらず、その開発が必要とされている。かかる事情を鑑み、本発明はガン幹細胞の生育を阻害する活性を有する化合物を提供することを課題とする。 As described above, an effective drug that inhibits the growth of cancer stem cells has not yet been developed, and its development is needed. In view of such circumstances, an object of the present invention is to provide a compound having an activity of inhibiting the growth of cancer stem cells.

発明者らは後述の式（１）で表される化合物がガン幹細胞の生育を阻害する活性を有することを見出し、本発明を完成させた。前記課題は、以下の本発明により解決される。
［１］後述する一般式（１）で表される化合物。
［２］前記ＲおよびＲ^３が水素原子であり、ｍおよびｎが０である、［１］に記載の化合物。
［３］（Ａ）杜仲葉を水または水／アルコール混合溶媒で抽出して抽出液を得る工程、
（Ｂ）当該抽出液をアルコールで抽出して、水相とアルコール相を得る工程、ならびに
（Ｃ）前記水相を、順相クロマトグラフィー、次いで逆相クロマトグラフィーにより分離精製する工程、を含む、［２］に記載の化合物の製造方法。
［４］前記工程（Ｃ）が、
（Ｃ１）水／アセトニトリル混合溶媒を展開溶媒として用いた親水性相互作用クロマトグラフィーにより前記水相の分離を行い、水／アセトニトリル分画溶液を得る工程、
（Ｃ２）メタノール／水／酢酸混合溶媒を展開溶媒として用いた逆相分配クロマトグラフィーにより前工程で得た溶液の分離を行い、メタノール／水／酢酸分画溶液を得る工程、
（Ｃ３）アセトニトリル／水／酢酸混合溶媒を展開溶媒として用いた極性基内包型逆相分配クロマトグラフィーにより前工程で得た溶液の分離を行い、アセトニトリル／水／酢酸分画溶液を得る工程、を含む、［３］に記載の製造方法。
［５］前記工程（Ｃ２）が、アセトニトリル／水／酢酸混合溶媒を展開溶媒として用いた逆相分配クロマトグラフィーにより前記メタノール／水／酢酸分画溶液の分離を行い、アセトニトリル／水／酢酸分画溶液を得る工程をさらに含み、かつ
前記（Ｃ３）工程が、当該アセトニトリル／水／酢酸分画溶液を分離する工程である、［４］に記載の製造方法。
［６］前記杜仲葉が、生葉を乾燥しかつ粉末にして得た乾燥粉末または生葉を粉砕して得たスムージーである、［３］〜［５］のいずれかに記載の製造方法。
［７］前記工程（Ｂ）におけるアルコールが、炭素数４〜１０のアルコールである、［３］〜［６］のいずれかに記載の製造方法。
［８］前記［１］または［２］に記載の化合物を含む、医薬組成物。
［９］杜仲生葉を凍結乾燥によって乾燥粉末にする工程をさらに含み、前記工程（Ａ）において当該乾燥粉末を抽出に供する［３］に記載の製造方法。 The inventors have found that the compound represented by the formula (1) described later has an activity of inhibiting the growth of cancer stem cells, and completed the present invention. The above-mentioned problems can be solved by the present invention described below.
[1] A compound represented by the general formula (1) described below.
[2] The compound according to [1], wherein R and R ³ are hydrogen atoms, and m and n are 0.
[3] (A) a step of extracting Tochu leaf with water or a water/alcohol mixed solvent to obtain an extract
(B) extracting the extract with alcohol to obtain an aqueous phase and an alcohol phase, and (C) separating and purifying the aqueous phase by normal phase chromatography and then reverse phase chromatography. A method for producing the compound according to [2].
[4] In the step (C),
(C1) a step of obtaining a water/acetonitrile fractionated solution by separating the aqueous phase by hydrophilic interaction chromatography using a water/acetonitrile mixed solvent as a developing solvent,
(C2) a step of separating the solution obtained in the previous step by reverse phase partition chromatography using a mixed solvent of methanol/water/acetic acid as a developing solvent to obtain a methanol/water/acetic acid fractionated solution,
(C3) a step of obtaining the acetonitrile/water/acetic acid fractionated solution by separating the solution obtained in the previous step by polar group-encapsulating reverse phase partition chromatography using an acetonitrile/water/acetic acid mixed solvent as a developing solvent. The production method according to [3], which comprises:
[5] In the step (C2), the methanol/water/acetic acid fractionation solution is separated by reverse phase partition chromatography using an acetonitrile/water/acetic acid mixed solvent as a developing solvent, and the acetonitrile/water/acetic acid fractionation is performed. The production method according to [4], further including a step of obtaining a solution, and the step (C3) is a step of separating the acetonitrile/water/acetic acid fractionated solution.
[6] The production method according to any one of [3] to [5], wherein the Tochu leaf is a dry powder obtained by drying and pulverizing fresh leaves or a smoothie obtained by crushing fresh leaves.
[7] The production method according to any one of [3] to [6], wherein the alcohol in the step (B) is an alcohol having 4 to 10 carbon atoms.
[8] A pharmaceutical composition comprising the compound according to the above [1] or [2].
[ 9 ] The production method according to [3], further comprising a step of freeze-drying the Tochu green leaf to give a dry powder, and subjecting the dry powder to extraction in the step (A).

本発明によりガン幹細胞の生育を阻害する活性を有する化合物を提供できる。 The present invention can provide a compound having an activity of inhibiting the growth of cancer stem cells.

本発明の一態様の概要を示す概要図である。It is an outline figure showing an outline of one mode of the present invention. 図２Ａは実施例４の抗ガン活性試験結果（２Ｄ培養）を示す図であり、図２Ｂは比較例１の同試験結果を示す図である。FIG. 2A is a diagram showing an anticancer activity test result (2D culture) of Example 4, and FIG. 2B is a diagram showing the same test result of Comparative Example 1. 図３Ａは実施例５の抗ガン活性試験結果（３Ｄ培養）を示す図である。FIG. 3A is a diagram showing the results of the anticancer activity test of Example 5 (3D culture). 図３Ｂは比較例２の同試験結果を示す図である。FIG. 3B is a diagram showing the same test result of Comparative Example 2. 実施例５および比較例２における培地の写真である。5 is a photograph of the medium in Example 5 and Comparative Example 2.

以下、本発明を詳細に説明する。本発明において「〜」はその両端の値を含む。すなわち「Ｘ〜Ｙ」との記載はＸおよびＹを含むことを意味する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail. In the present invention, “to” includes values at both ends thereof. That is, the description “X to Y” means to include X and Y.

１．化合物
本発明の化合物は式（１）で表される。当該化合物はクロロゲン酸が二重結合部位で二量化してシクロブタン環構造を形成しているリグナン系化合物である。 1. Compound The compound of the present invention is represented by formula (1). The compound is a lignan compound in which chlorogenic acid dimerizes at the double bond site to form a cyclobutane ring structure.

式中、Ｒは独立に水素原子、炭素数１〜５のアルキル基、または炭素数２〜６のアシル基である。独立にとは、各Ｒが同一であってもよいし異なっていてもよいことを意味する。他の基についても同様である。本発明においてアルキル基は直鎖状および分岐状のアルキル基を含む。製造し易さの観点から、Ｒは水素原子、炭素数１〜３のアルキル基、または炭素数２〜４のアシル基であることが好ましい。 In the formula, R is independently a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, or an acyl group having 2 to 6 carbon atoms. Independently means that each R may be the same or different. The same applies to other groups. In the present invention, the alkyl group includes linear and branched alkyl groups. From the viewpoint of ease of production, R is preferably a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, or an acyl group having 2 to 4 carbon atoms.

Ｒ^１およびＲ^２はベンゼン環上の置換基であり、独立にハロゲン原子、炭素数１〜５のアルキル基、または炭素数２〜５のアルキレン基である。本発明においてアルキレン基は直鎖状および分岐状のアルキレン基を含む。ハロゲン原子としてはフッ素原子または塩素原子が、前記アルキル基としては炭素数１〜３のアルキル基が、前記アルキレン基としては炭素数２〜３のアルキレン基が好ましい。ｍおよびｎはそれぞれＲ^１およびＲ^２の数を表し、０〜３である。製造し易さの観点から、ｍおよびｎは０〜２が好ましく、０がより好ましい。 R ¹ and R ² are substituents on the benzene ring and are independently a halogen atom, an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, or an alkylene group having 2 to 5 carbon atoms. In the present invention, the alkylene group includes linear and branched alkylene groups. The halogen atom is preferably a fluorine atom or a chlorine atom, the alkyl group is preferably an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, and the alkylene group is preferably an alkylene group having 2 to 3 carbon atoms. m and n represent the numbers of R ¹ and R ² , respectively, and are 0 to 3. From the viewpoint of ease of production, m and n are preferably 0 to 2 and more preferably 0.

Ｒ^３は独立に水素原子または炭素数１〜５のアルキル基である。製造し易さの観点から、Ｒ^３は水素原子または炭素数１〜３のアルキル基であることが好ましい。 R ³ is independently a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms. From the viewpoint of ease of production, R ³ is preferably a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms.

２．化合物の製造方法
本発明の化合物は、（Ａ）杜仲葉を水または水／アルコール混合溶媒で抽出して抽出液を得る工程、
（Ｂ）当該抽出液をアルコールで抽出して、水相とアルコール相を得る工程、ならびに
（Ｃ）前記水相を、順相クロマトグラフィー、次いで逆相クロマトグラフィーにより分離精製する工程、を含む方法で製造されることが好ましい。以下、各工程について説明する。 2. Method for producing compound The compound of the present invention comprises: (A) a step of extracting Tochu leaf with water or a water/alcohol mixed solvent to obtain an extract.
(B) a step of extracting the extract with alcohol to obtain an aqueous phase and an alcohol phase, and (C) a step of separating and purifying the aqueous phase by normal phase chromatography and then by reverse phase chromatography. Is preferably manufactured by Each step will be described below.

（１）工程Ａ
本工程では、杜仲葉を水または水／アルコール混合溶媒で抽出する。杜仲葉とは前述のとおりトチュウ科トチュウ属トチュウ種の植物の葉である。ここで使用するアルコールは、水に溶解して混合溶媒となるものであれば限定されないが、メタノールやエタノールが好ましい。アルコールの濃度は混合溶媒中５０〜８０重量％が好ましい。杜仲葉と水、または水／アルコール混合溶媒の重量比は１：２〜１：５程度が好ましい。水を用いる場合はその温度を７０〜１００℃程度とすることが好ましい。本工程では、水／アルコール混合溶媒で抽出した後の杜仲葉を、さらに前記温度の熱水で抽出してもよい。 (1) Process A
In this step, Tochu leaf is extracted with water or a water/alcohol mixed solvent. As mentioned above, the Tochu leaf is a leaf of the Eucommia genus Eucommia species plant. The alcohol used here is not limited as long as it dissolves in water to form a mixed solvent, but methanol or ethanol is preferable. The alcohol concentration is preferably 50 to 80% by weight in the mixed solvent. The weight ratio of Tochu leaf and water, or a water/alcohol mixed solvent is preferably about 1:2 to 1:5. When water is used, its temperature is preferably about 70-100°C. In this step, the Tochu leaf after extraction with the water/alcohol mixed solvent may be further extracted with hot water at the above temperature.

杜仲葉としては加工を施していない生葉、生葉を乾燥した乾燥葉、または乾燥葉を粉末にした乾燥粉末を使用できる。乾燥粉末（以下「杜仲茶」ともいう）を使用すると、抽出効率を高めることができ、さらには自己消化による経時劣化を抑制できるので好ましい。乾燥葉とは、水分量が５重量％以下である葉をいう。乾燥葉の製造方法は、例えば特許第４３４０８１２号に開示されている。粉末とは、通常、杜仲茶として市販されている程度の大きさの粉をいう。 As the Tochu leaf, raw leaves that have not been processed, dried leaves obtained by drying the raw leaves, or dried powder obtained by making the dried leaves into powder can be used. It is preferable to use a dry powder (hereinafter also referred to as “Tochucha”) because the extraction efficiency can be increased and further deterioration with time due to self-digestion can be suppressed. The dry leaf refers to a leaf having a water content of 5% by weight or less. A method for producing dried leaves is disclosed in, for example, Japanese Patent No. 4340812. The powder usually refers to a powder having a size that is commercially available as Tochu tea.

杜仲生葉は２０〜２６℃で発酵して有効成分を消失するので、杜仲生葉を２０℃未満の環境下で乾燥させることが好ましい。乾燥温度は、より好ましくは１０℃以下、さらに好ましくは３℃以下、よりさらに好ましくは０℃以下である。乾燥時の雰囲気の湿度は好ましくは６０％以下、より好ましくは２０％以下、さらに好ましくは１５％以下である。あるいは、２６℃を超える温度で杜仲生葉を乾燥させてもよい。この場合の温度は、好ましくは５０℃以上、より好ましくは６０℃以上、よりさらに好ましくは７０℃以上である。乾燥時の雰囲気の湿度は好ましくは６０％以下、より好ましくは２０％以下、よりさらに好ましくは１５％以下である。乾燥雰囲気を窒素存在下あるいは減圧下としてもよい。 Since the Morinaka leaf is fermented at 20 to 26°C to lose the active ingredient, it is preferable to dry the Morinaka leaf in an environment of less than 20°C. The drying temperature is more preferably 10° C. or lower, further preferably 3° C. or lower, still more preferably 0° C. or lower. The humidity of the atmosphere during drying is preferably 60% or less, more preferably 20% or less, still more preferably 15% or less. Alternatively, the Tochu green leaf may be dried at a temperature above 26°C. In this case, the temperature is preferably 50° C. or higher, more preferably 60° C. or higher, even more preferably 70° C. or higher. The humidity of the atmosphere during drying is preferably 60% or less, more preferably 20% or less, still more preferably 15% or less. The dry atmosphere may be in the presence of nitrogen or under reduced pressure.

この他、杜仲生葉を粉砕してスムージーにしてこれを凍結乾燥させる、あるいは杜仲生葉を凍結した後、粉砕し凍結乾燥してもよい。スムージーとは杜仲生葉を粉砕して得られるスラリー状物である。杜仲葉はグッタベルカで覆われた屈強の葉脈を持っており、葉の部分と葉脈では、乾燥の時間を大きく異にする。このグッタベルカのため、気流式の粉砕機を使用しても１５〜２０μｍの粉体しか得られない。このサイズは抹茶の粒径（１０〜２０μｍ）よりも大きい。しかし、杜仲生葉を凍結すると葉脈部分に多くの穴が生じて繊維を切断しやすくなる。よって、杜仲生葉を凍結乾燥することでより小さな粒径である６〜１０μｍの粉末を得ることができる。このような微粉末杜仲葉は、前記リグナン系化合物を効率よく抽出できるという点で有用である。 In addition, the Tochu green leaves may be crushed into a smoothie and freeze-dried, or the Tochu green leaves may be frozen and then crushed and freeze-dried. A smoothie is a slurry-like material obtained by pulverizing Tochu green leaves. Morinaka leaves have strong veins covered with gutta belka, and the drying time differs greatly between the leaf parts and the veins. Due to this gutta belka, only powder of 15 to 20 μm can be obtained even if an air flow type pulverizer is used. This size is larger than the particle size of matcha (10 to 20 μm). However, when the Tochu leaf is frozen, many holes are created in the veins of the leaves and the fibers are easily cut. Therefore, by freeze-drying the Tochu green leaf, a powder having a smaller particle size of 6 to 10 μm can be obtained. Such fine powder Eucommia leaf is Ru useful der in that the lignan compound can be efficiently extracted.

さらに、杜仲葉は前記リグナン系化合物の他に、抗癌作用に有効とされるフラボノイドなどのポリフェノール、ゲニポシドサンやアスペルロシドのイリドイド類、ポリフェノールの吸収に必要とされるビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＣ、ビタミンＥ、葉酸、食物繊維を含んでいる。前述のように杜仲生葉を乾燥すると、これらの成分の消失を低減することができる。 In addition to the above-mentioned lignan-based compounds, Tochu-leaf has polyphenols such as flavonoids which are effective for anti-cancer action, iridoids of geniposide sun and asperuloside, vitamin A, vitamin B1 and vitamin B2 required for absorption of polyphenols. , Vitamin C, Vitamin E, folic acid, dietary fiber. As mentioned above, drying the Tochu green leaves can reduce the loss of these components.

（２）工程Ｂ
本工程では、当該抽出液をアルコールで抽出して水相とアルコール相を得る。本工程で使用するアルコールは水相と分離するものであれば限定されない。すなわち、工程Ｂにおけるアルコールは工程Ａにおけるアルコールとは異なる。作業容易性等の観点から、炭素数が４〜１０のアルコールが好ましく、中でもブタノール、ペンタノール、またはヘキサノールが好ましい。これらのアルコールは直鎖状および分岐状のものも含む。抽出は、前記抽出液の量の２０〜５０体積％のアルコールを用いて複数回行ってもよい。本工程で得られる水相に目的化合物が存在する。 (2) Process B
In this step, the extract is extracted with alcohol to obtain an aqueous phase and an alcohol phase. The alcohol used in this step is not limited as long as it can be separated from the aqueous phase. That is, the alcohol in step B is different than the alcohol in step A. From the viewpoint of workability and the like, alcohols having 4 to 10 carbon atoms are preferable, and among them, butanol, pentanol, or hexanol is preferable. These alcohols include linear and branched ones. The extraction may be carried out multiple times using 20 to 50% by volume of alcohol of the extract. The target compound is present in the aqueous phase obtained in this step.

（３）工程Ｃ
本工程では、前工程で得た水相を順相クロマトグラフィー、次いで逆相クロマトグラフィーで分離精製する。順相クロマトグラフィーとは固定相の極性が移動相の極性より高いクロマトグラフィーである。逆相クロマトグラフィーとは移動相の極性が固定相の極性より高いクロマトグラフィーである。これらの分離精製は公知のカラムを使用して実施できる。以下に好ましい態様を説明する。 (3) Process C
In this step, the aqueous phase obtained in the previous step is separated and purified by normal phase chromatography and then reverse phase chromatography. Normal phase chromatography is chromatography in which the polarity of the stationary phase is higher than that of the mobile phase. Reversed phase chromatography is chromatography in which the polarity of the mobile phase is higher than that of the stationary phase. These separation and purification can be carried out using a known column. The preferred embodiments will be described below.

順相クロマトグラフィーによる分離精製として親水性相互作用クロマトグラフィーにより前記水相の分離を行う（工程Ｃ１）。水／アセトニトリル混合溶媒を展開溶媒として用いることが好ましい。本工程では固定担体としてシリカゲルを充填したカラム等の公知のカラムを使用できる。後述する実施例に示す方法等で各画分の活性を調べることでいずれの画分に目的化合物が含まれているかを特定できる。例えば固定担体としてシリカゲルを充填したカラムを用いた場合、アセトニトリル濃度が７０〜９０体積％の水／アセトニトリル混合溶媒での分画溶液を得ることが好ましい。 The aqueous phase is separated by hydrophilic interaction chromatography as separation and purification by normal phase chromatography (step C1). It is preferable to use a water/acetonitrile mixed solvent as a developing solvent. In this step, a known column such as a column packed with silica gel can be used as a fixed carrier. It is possible to identify which fraction contains the target compound by examining the activity of each fraction by the method shown in Examples described later. For example, when a column packed with silica gel is used as a fixed carrier, it is preferable to obtain a fractionated solution in a water/acetonitrile mixed solvent having an acetonitrile concentration of 70 to 90% by volume.

次いで、逆相クロマトグラフィーによる分離精製として、前工程Ｃ１で得た目的化合物を含む分画溶液を逆相分配クロマトグラフィーにより分離する（工程Ｃ２）。メタノール／水／酢酸混合溶媒を展開溶媒として用いることが好ましい。本工程においては固定担体としてオクタデシルシリル基（ＯＤＳ）で表面が修飾されたシリカゲルを充填したカラム等の公知のカラムを使用できる。当該カラムを用いる場合、メタノール濃度が５〜２０体積％かつ酢酸濃度が０．０５〜０．２体積％のメタノール／水／酢酸混合溶媒での分画溶液を得ることが好ましい。 Next, as separation and purification by reverse phase chromatography, the fractionated solution containing the target compound obtained in the previous step C1 is separated by reverse phase partition chromatography (step C2). It is preferable to use a mixed solvent of methanol/water/acetic acid as a developing solvent. In this step, a known column such as a column packed with silica gel whose surface is modified with octadecylsilyl group (ODS) can be used as a fixed carrier. When using the column, it is preferable to obtain a fractionated solution in a methanol/water/acetic acid mixed solvent having a methanol concentration of 5 to 20% by volume and an acetic acid concentration of 0.05 to 0.2% by volume.

工程Ｃ２において、メタノール／水／酢酸混合溶媒での分画溶液をアセトニトリル／水／酢酸混合溶媒を展開溶媒として用い、前記逆相分配クロマトグラフィーにより再度分離する工程を設けてもよい。再分離により、より高程度で目的化合物を単離することができる。この場合、アセトニトリル濃度が５〜２０体積％かつ酢酸濃度が０．０５〜０．２体積％の混合溶媒での分画溶液を得ることが好ましい。 In the step C2, a step of separating again the fractionated solution in the methanol/water/acetic acid mixed solvent using the acetonitrile/water/acetic acid mixed solvent as a developing solvent by the reverse phase partition chromatography may be provided. The re-separation allows the desired compound to be isolated to a higher degree. In this case, it is preferable to obtain a fractionated solution in a mixed solvent having an acetonitrile concentration of 5 to 20% by volume and an acetic acid concentration of 0.05 to 0.2% by volume.

逆相クロマトグラフィーによる分離精製として、前工程Ｃ２で得た目的化合物を含む分画溶液を極性基内包型逆相分配クロマトグラフィーにより分離する（工程Ｃ３）。アセトニトリル／水／酢酸混合溶媒を展開溶媒として用いることが好ましい。本工程においては固定担体として極性基を介してオクタデシル基を化学結合させた極性基内包型のシリカゲルを充填したカラム等の公知のカラムを使用できる。当該カラムを用いる場合、アセトニトリル濃度および酢酸濃度が５〜２０体積％および０．０５〜０．２体積％のアセトニトリル／水／酢酸混合溶媒での分画溶液を得ることが好ましい。 As separation and purification by reverse phase chromatography, the fractionated solution containing the target compound obtained in the previous step C2 is separated by polar group-encapsulating reverse phase partition chromatography (step C3). It is preferable to use a mixed solvent of acetonitrile/water/acetic acid as a developing solvent. In this step, a known column such as a column packed with a polar group-encapsulating silica gel in which an octadecyl group is chemically bonded via a polar group can be used as a fixed carrier. When the column is used, it is preferable to obtain a fractionated solution in an acetonitrile/water/acetic acid mixed solvent having an acetonitrile concentration and an acetic acid concentration of 5 to 20% by volume and 0.05 to 0.2% by volume.

前記工程で得た分画溶液中には精製された目的化合物が含まれており、この溶液から溶媒を除去することで目的化合物を単離できる。この場合に得られるのは式（１）において、ＲおよびＲ^３が水素原子であり、ｍおよびｎが０である化合物（式（１ａ））である。Ｒ等を水素原子以外とする化合物は、式（１ａ）の化合物を公知の方法で修飾することで得ることができる。例えばＲがアセチル基である化合物は、式（１ａ）の化合物を無水酢酸でアセチル化すること等により得ることができる。 The purified target compound is contained in the fractionated solution obtained in the above step, and the target compound can be isolated by removing the solvent from this solution. In this case, the compound (formula (1a)) in which R and R ³ are hydrogen atoms and m and n are 0 in the formula (1) is obtained. The compound having R and the like other than a hydrogen atom can be obtained by modifying the compound of the formula (1a) by a known method. For example, a compound in which R is an acetyl group can be obtained by acetylating the compound of formula (1a) with acetic anhydride.

３．用途
本発明の化合物はガン幹細胞の生育を阻害する活性を有する。よって当該化合物は抗ガン活性を有する治療薬および医薬組成物として有用である。 3. Use The compound of the present invention has an activity of inhibiting the growth of cancer stem cells. Therefore, the compound is useful as a therapeutic agent or pharmaceutical composition having anticancer activity.

以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。使用した分析機器は以下のとおりである。
（１）ＮＭＲ
¹H-NMR (400 MHz)、¹³C-NMR (100 MHz)、²D-NMR：5mmのBBFOプローブを配置したAVANCE III FT-NMR spectrometer (Bruker BioSpin製)で記録した。
ケミカルシフト（δ）は溶媒シグナルを基準とした。結合定数（H-7、H-7’、H-8、H-8’）はiNMR version 5.4.4 (nucleomatica, Molfetta, Italy; http:// www.inmr.net)に基づくスピンシミュレーションにより決定した。
（２）比旋光度
ハロゲンランプおよび589nmフィルターを備えたP-2100ポーラメータ（日本分光株式会社製）を用いた。
（３）高分解能質量分析
JMS-BU25 (GCmate II) 質量分析計（日本電子株式会社製）を用いた。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. The analytical instruments used are as follows.
(1) NMR
¹ H-NMR (400 MHz), ¹³ C-NMR (100 MHz), ² D-NMR: recorded with an AVANCE III FT-NMR spectrometer (manufactured by Bruker BioSpin) in which a 5 mm BBFO probe was arranged.
The chemical shift (δ) was based on the solvent signal. Coupling constants (H-7, H-7', H-8, H-8') are determined by spin simulation based on iNMR version 5.4.4 (nucleomatica, Molfetta, Italy; http://www.inmr.net). did.
(2) Specific Optical Rotation A P-2100 polarimeter (manufactured by JASCO Corporation) equipped with a halogen lamp and a 589 nm filter was used.
(3) High resolution mass spectrometry
A JMS-BU25 (GCmate II) mass spectrometer (made by JEOL Ltd.) was used.

［実施例１］式（１ａ）の化合物の製造
工程Ａ
杜仲葉の乾燥粉末（杜仲茶、有限会社碧山園製）を準備した。１２６ｇの杜仲茶を５００ｍＬの７０体積％メタノール水溶液で抽出して第一抽出液を得た。次いで、当該抽出操作を行った後の杜仲茶を５００ｍＬの熱水（１０５℃）で再度抽出して第二抽出液を得た。第一抽出液と第二抽出液を合わせて抽出液とした。当該抽出液を減圧下で濃縮した。 Example 1 Production of Compound of Formula (1a) Step A
A dry powder of Tochu leaf (Tochu tea, manufactured by Hekiyamaen Co., Ltd.) was prepared. 126 g of Tochu tea was extracted with 500 mL of 70% by volume aqueous methanol solution to obtain a first extract. Then, the Tochu tea after the extraction operation was extracted again with 500 mL of hot water (105° C.) to obtain a second extract. The first extract and the second extract were combined to obtain an extract. The extract was concentrated under reduced pressure.

工程Ｂ
当該濃縮液に対して１／３の体積の１−ブタノールを用いて、当該濃縮液を３回抽出し、水相と１−ブタノール相を得た。水相の一部を取出し、適量のセライト（セライト５４５、純正化学株式会社製）を加えた後、乾燥濃縮した。取出した水相の量は、杜仲茶（乾燥粉末）にして１８．５ｇ相当量であり、全水相の量をＷ（ｇ）とするとき、Ｗ×１８．５／１２６である。 Process B
The concentrated liquid was extracted three times with 1/3 volume of 1-butanol to the concentrated liquid to obtain an aqueous phase and a 1-butanol phase. A part of the aqueous phase was taken out, an appropriate amount of Celite (Celite 545, manufactured by Junsei Kagaku Co., Ltd.) was added, and the mixture was dried and concentrated. The amount of the aqueous phase taken out was equivalent to 18.5 g of Tochu-cha (dry powder), and when the total amount of the aqueous phase was W (g), it was W×18.5/126.

工程Ｃ１
親水性相互作用クロマトグラフィーを用いて濃縮した水相を分離した。カラムとして、アセトニトリル濃度が９０体積％の水／アセトニトリル混合溶媒で平衡させたＤＩＯＬＭＢ１００−７５／２００（５００ｇ、富士シリシア化学株式会社製）を用いた。当該カラムに、アセトニトリル濃度が９０体積％の混合溶媒２，５００ｍＬおよびアセトニトリル濃度が８０体積％の混合溶媒２，５００ｍＬを通液し、それぞれ６２５ｍＬの溶出液を得た。同じ操作をもう一度繰返し（合計で２回行い）、それぞれの混合溶媒に関して杜仲茶（乾燥粉末）にして３７ｇ相当量の溶出液を得た。当該溶液の画分について活性をスクリーニングし、活性成分を含む第６画分および第７画分を得た。これはアセトニトリル濃度が８０体積％の混合溶媒の第２および第３分画溶液に該当する。 Process C1
The concentrated aqueous phase was separated using hydrophilic interaction chromatography. As the column, DIOL MB100-75/200 (500 g, manufactured by Fuji Silysia Chemical Ltd.) equilibrated with a water/acetonitrile mixed solvent having an acetonitrile concentration of 90% by volume was used. 2,500 mL of a mixed solvent having an acetonitrile concentration of 90% by volume and 2,500 mL of a mixed solvent having an acetonitrile concentration of 80% by volume were passed through the column to obtain 625 mL of an eluate. The same operation was repeated once again (twice in total), and each mixed solvent was made into Tochu tea (dry powder) to obtain 37 g of an eluate. The fractions of the solution were screened for activity to obtain the sixth and seventh fractions containing the active ingredient. This corresponds to the second and third fractionation solutions of the mixed solvent having an acetonitrile concentration of 80% by volume.

工程Ｃ２
前記の第６画分および第７画分を合わせて、逆相分配クロマトグラフィーを用いた分離工程に供した。カラムとしてＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎＣ１８ＨＰＬＣ（φ１４×１５０ｍｍ、５μｍ、ジーエルサイエンス株式会社製）を用いた。展開溶媒としてメタノール／水／酢酸混合溶媒を用い、０．１体積％酢酸水溶液からメタノールへの直線勾配溶出法を採用した（３ｍＬ／分で２０分）。溶出液は１分毎に採取した。４〜５分の分画溶液に活性が認められたので、前記カラムを用いて当該分画溶液を再度分離した。この際、展開溶媒としてアセトニトリル（１０体積％）／水／酢酸（０．１体積％）混合溶媒（３ｍＬ／分）を用いた。ＵＶ検出器で２５４ｎｍの吸収をモニタした。１５．５分付近の画分に活性が認められた。 Process C2
The 6th and 7th fractions were combined and subjected to a separation step using reverse phase partition chromatography. As a column, InertSustain C18 HPLC (φ14×150 mm, 5 μm, manufactured by GL Science Co., Ltd.) was used. A methanol/water/acetic acid mixed solvent was used as a developing solvent, and a linear gradient elution method from a 0.1 vol% acetic acid aqueous solution to methanol was adopted (3 mL/min for 20 minutes). The eluate was collected every minute. Since activity was observed in the fractionated solution for 4 to 5 minutes, the fractionated solution was separated again using the column. At this time, a mixed solvent (3 mL/min) of acetonitrile (10% by volume)/water/acetic acid (0.1% by volume) was used as a developing solvent. Absorption was monitored at 254 nm with a UV detector. The activity was recognized in the fraction around 15.5 minutes.

工程Ｃ３
前記活性が認められた画分をさらに極性基内包型逆相分配クロマトグラフィーを用いた分離工程に供し精製した。カラムとしてＩｎｅｒｔｓｉｌＯＤＳ−ＥＰ（φ６×２５０ｍｍ、５μｍ、ジーエルサイエンス株式会社製）を用いた。展開溶媒としてアセトニトリル（１０体積％）／水／酢酸（０．１体積％）混合溶媒（１ｍＬ／分）を用いた。本発明の化合物が１３．３分の画分に認められた。 Process C3
The fraction in which the activity was recognized was further subjected to a separation step using polar group-encapsulating reverse phase partition chromatography for purification. As a column, Inertsil ODS-EP (φ6×250 mm, 5 μm, manufactured by GL Sciences Inc.) was used. A mixed solvent of acetonitrile (10% by volume)/water/acetic acid (0.1% by volume) (1 mL/min) was used as a developing solvent. The compound of the present invention was found in the fraction of 13.3 minutes.

前記画分から溶媒を除去することにより、精製された式（１ａ）で表される本発明の化合物を得た。当該化合物は無色でアモルファスであった。 By removing the solvent from the fraction, a purified compound of the present invention represented by the formula (1a) was obtained. The compound was colorless and amorphous.

分析結果は以下のとおりである。
ESI-MS m/z (rel. int.): 191 (88), 243 (21), 353 (13), 4 (2.5), 707 ([M-H]⁻, 100);
FAB-HRMS (negative) m/z ([M-H]⁻ ): calcd. for C 32 H 35 O 18, 707.1824; found, 707.1781
NMR：表１
[α] ²⁰ _D : -30.2 (c 0.136, MeOH) The analysis results are as follows.
ESI-MS m/z (rel. int.): 191 (88), 243 (21), 353 (13), 4 (2.5), 707 ([MH] ⁻ ,100);
FAB-HRMS (negative) m/z ([MH] ⁻ ): calcd. for C 32 H 35 O 18, 707.1824; found, 707.1781
NMR: Table 1
[α] ²⁰ _D : -30.2 (c 0.136, MeOH)

［実施例２］式（１ａ）の化合物のアセチル化
３ｍｇの式（１ａ）で表される化合物、２００μＬのピリジン、および１００μＬの無水酢酸を混合して、室温で２晩反応させた。反応生成物を減圧下で濃縮し、ＩｎｅｒｔｓｉｌＯＤＳ−ＥＰ（φ６×２５０ｍｍ、５μｍ、ジーエルサイエンス株式会社製）を用いた液体クロマトグラフィーにて精製した。０．１体積％酢酸水溶液からアセトニトリルへの直線勾配溶出法（２０分）を採用し、その後はアセトニトリルを通液した（１ｍＬ／分）。その結果、２０．０分に単一ピークが認められ、これが完全にアセチル化された式（１ｂ）で表される化合物であることを確認した。 [Example 2] Acetylation of compound of formula (1a) 3 mg of the compound represented by formula (1a), 200 µL of pyridine, and 100 µL of acetic anhydride were mixed and reacted at room temperature for 2 nights. The reaction product was concentrated under reduced pressure and purified by liquid chromatography using Inertsil ODS-EP (φ6×250 mm, 5 μm, manufactured by GL Science Co., Ltd.). A linear gradient elution method (20 minutes) from a 0.1 vol% acetic acid aqueous solution to acetonitrile was adopted, and then acetonitrile was passed through (1 mL/min). As a result, a single peak was observed at 20.0 minutes, and it was confirmed that this was a completely acetylated compound represented by the formula (1b).

分析結果は以下のとおりである。
¹H-NMR： The analysis results are as follows.
¹ H-NMR:

［実施例３］式（１ａ）の化合物の製造
杜仲茶のかわりに杜仲葉の生葉５０ｇを用いた以外は同様にして実施例１を実施した。その結果、式（１ａ）の化合物を製造できたことを確認した。発明者らは最初に杜仲茶（乾燥粉末）から本願発明の化合物を製造することを見出したが、本例で示すように生葉からも本願発明の化合物を製造できることを確認した。 [Example 3] Production of compound of formula (1a) Example 1 was carried out in the same manner except that 50 g of fresh leaves of Tochu leaf were used instead of Tochu tea. As a result, it was confirmed that the compound of formula (1a) could be produced. The inventors first found that the compound of the present invention was produced from Tochu tea (dry powder), but as shown in this Example, it was confirmed that the compound of the present invention can be produced from fresh leaves.

［実施例４］抗ガン特性（２Ｄ培養における評価）
本発明の化合物の抗ガン特性を、横浜市立大学梁明秀教授により作製された癌幹細胞モデルであるiCSCL-10A細胞の２つのクローンおよび乳癌細胞株であるMCF-7およびMDA-MB-231細胞を用いて、以下のように評価した。これらの細胞の詳細は、国際公開第２０１２／１６５２８７号、”Induction of cells with cancer stem cell properties from nontumorigenic human mammary epithelial cells by defined reprogramming factors.” Nishi M, Sakai Y, Akutsu H, Nagashima Y, Quinn G, Masui S, Kimura H, Perrem K, Umezawa A, Yamamoto N, Lee SW, Ryo A.Oncogene. 33(5):643-52, 2014、および”Induced cancer stem-like cells as a model for biological screening and discovery of agents targeting phenotypic traits of cancer stem cell”. Nishi M, Akutsu H , Kudoh A , Kimura H , Yamamoto N, Umezawa A , Lee SW, Ryo A. Oncotarget 5(18):8665-80, 2014に記載されている。 [Example 4] Anti-cancer property (evaluation in 2D culture)
The anti-cancer property of the compound of the present invention was evaluated using two clones of iCSCL-10A cell, which is a cancer stem cell model, and MCF-7 and MDA-MB-231 cells, which are breast cancer cell lines, produced by Professor Akihide Liang of Yokohama City University. It was used and evaluated as follows. For details of these cells, see WO 2012/165287, “Induction of cells with cancer stem cell properties from nontumorigenic human mammary epithelial cells by defined reprogramming factors.” Nishi M, Sakai Y, Akutsu H, Nagashima Y, Quinn G , Masui S, Kimura H, Perrem K, Umezawa A, Yamamoto N, Lee SW, Ryo A. Oncogene. 33(5):643-52, 2014, and “Induced cancer stem-like cells as a model for biological screening and discovery of agents targeting phenotypic traits of cancer stem cell”. Nishi M, Akutsu H ,Kudoh A ,Kimura H ,Yamamoto N, Umezawa A ,Lee SW, Ryo A. Oncotarget 5(18):8665-80, 2014. ing.

１）実施例１で得た化合物をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に溶解して、０．５μＭ、１．０μＭ、５．０μＭ、１０μＭ、５０μＭ、１００μＭの溶液を調製した。
２）iCSCL-10A細胞の２つのクローンについて、それぞれ４×１０^４ｃｅｌｌ／ｍＬの濃度の溶液を調製した。またMCF-7およびMDA-MB-231細胞についてそれぞれ２×１０^４ｃｅｌｌ／ｍＬの濃度の溶液を調製した。
３）前記細胞を含む溶液を９６ウェルプレートに１００μＬずつ播種した。ウェル中の細胞濃度は、iCSCL-10Aでは４×１０^３ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ、MCF-7およびMDA-MB-231では２×１０^３ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌであった。
４）３７℃で２４時間インキュベートした後、１）で調製した実施例１で得た化合物を含む溶液を各ウェルに１０μＬずつ添加した。
５）その後、３７℃で２４時間インキュベートし、顕微鏡および細胞増殖アッセイキット（Cell Counting kit-8、株式会社同仁化学研究所製）を用いて細胞の増殖度合いを評価した。
６）コントロールとして実施例１で得た化合物の代わりに同量のＰＢＳを用いて同試験を行った。
７）結果を図２Ａに示す（コントロールの結果を１．０とし、これに対する比を縦軸にプロットした）。 1) The compound obtained in Example 1 was dissolved in PBS (phosphate buffered saline) to prepare 0.5 μM, 1.0 μM, 5.0 μM, 10 μM, 50 μM, and 100 μM solutions.
2) A solution having a concentration of 4×10 ⁴ cells/mL was prepared for each of the two clones of iCSCL-10A cells. A solution having a concentration of 2×10 ⁴ cells/mL was prepared for each of MCF-7 and MDA-MB-231 cells.
3) The solution containing the cells was seeded in a 96-well plate at 100 μL each. Cell concentration in the well was iCSCL-10A in ^{4 × 10 3 cell / well,} MCF-7 and in ^{MDA-MB-231 2 × 10} 3 cell / well.
4) After incubating at 37° C. for 24 hours, 10 μL of the solution containing the compound obtained in Example 1 prepared in 1) was added to each well.
5) After that, the cells were incubated at 37° C. for 24 hours, and the degree of cell proliferation was evaluated using a microscope and a cell proliferation assay kit (Cell Counting kit-8, manufactured by Dojindo Laboratories).
6) As a control, the same test was conducted using the same amount of PBS instead of the compound obtained in Example 1.
7) The results are shown in Fig. 2A (the control result was set to 1.0, and the ratio to this was plotted on the vertical axis).

［比較例１］
実施例１で得た化合物の代わりにクロロゲン酸を用いて実施例４と同じ試験を行った結果を示す。 [Comparative Example 1]
The results of the same test as in Example 4 using chlorogenic acid instead of the compound obtained in Example 1 are shown.

図２に結果を示す。図２Ａから本発明の化合物は比較的低濃度においてもガン幹細胞に対して高い育成阻害活性を示すことが明らかである。また、本発明の化合物は比較的高濃度においては乳ガン細胞に対しても育成阻害活性を示すことも明らかである。一方、図２Ｂに示すとおり、クロロゲン酸ではこのような活性は認められなかった。 The results are shown in FIG. From FIG. 2A, it is clear that the compound of the present invention exhibits high growth inhibitory activity against cancer stem cells even at a relatively low concentration. It is also clear that the compound of the present invention exhibits a growth inhibitory activity also on breast cancer cells at a relatively high concentration. On the other hand, as shown in FIG. 2B, such activity was not observed with chlorogenic acid.

［実施例５］抗ガン特性（３Ｄスフェロイド培養における評価）
本発明の化合物の抗ガン特性を、癌幹細胞モデルであるiCSCL-10A細胞を用いて以下のように評価した。
１）実施例１で得た化合物をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に溶解して、０．５μＭ、１．０μＭ、５．０μＭ、１０μＭ、５０μＭ、１００μＭの溶液を調製した。
２）９６ウェルプレート（Ultra-Low Attachment Plat、コーニング社製）の各ウェルに、１００μＬのスフェロイド培地（DMEM/F12 (1:1)（ロンザ社製）、インシュリン（sigma aldrich社製）５μｇ／ｍＬ、ヒドロコルチゾン（sigma aldrich社製）０．５μＭ、ＥＧＦ（sigma aldrich社製）２０ｎｇ／ｍＬ、Ｂ−２７（登録商標、ライフテクノロジー社製）２％、ｐ／ｓ（ペニシリン／ストレプトマイシン、ライフテクノロジー社製）１％）を入れた。
３）１６０００ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの濃度となるように各ウェルに前記細胞を播種した。
４）３７℃で４日間インキュベートした後、１）で調製した実施例１で得た化合物を含む溶液を各ウェルに１０μＬずつ添加した。
５）その後、３７℃で７２時間インキュベートし、細胞増殖アッセイキット（CellTiter-Glo ^TM、プロメガ株式会社製）を用いて細胞の増殖度合いを評価した。
６）コントロールとして実施例１で得た化合物の代わりに同量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて同試験を行った。
７）結果を図３Ａに示す（コントロールの結果を１．０とし、これに対する比を縦軸にプロットした）。 [Example 5] Anti-cancer property (evaluation in 3D spheroid culture)
The anti-cancer property of the compound of the present invention was evaluated as follows using iCSCL-10A cells, which is a cancer stem cell model.
1) The compound obtained in Example 1 was dissolved in PBS (phosphate buffered saline) to prepare 0.5 μM, 1.0 μM, 5.0 μM, 10 μM, 50 μM, and 100 μM solutions.
2) In each well of a 96-well plate (Ultra-Low Attachment Plat, Corning), 100 μL of spheroid medium (DMEM/F12 (1:1) (Lonza), insulin (sigma aldrich) 5 μg/mL) , Hydrocortisone (manufactured by sigma aldrich) 0.5 μM, EGF (manufactured by sigma aldrich) 20 ng/mL, B-27 (registered trademark, manufactured by Life Technology Inc.) 2%, p/s (penicillin/streptomycin, manufactured by Life Technology Inc.) ) 1%) was added.
3) The cells were seeded in each well so that the concentration was 16000 cells/well.
4) After incubating at 37° C. for 4 days, 10 μL of the solution containing the compound obtained in Example 1 prepared in 1) was added to each well.
5) After that, the cells were incubated at 37° C. for 72 hours, and the cell proliferation rate was evaluated using a cell proliferation assay kit (CellTiter-Glo ^™ , manufactured by Promega Corporation).
6) As a control, the same test was conducted using the same amount of phosphate buffered saline (PBS) instead of the compound obtained in Example 1.
7) The results are shown in FIG. 3A (the control result was 1.0, and the ratio to this was plotted on the vertical axis).

［比較例２］
本発明の化合物の代わりにクロロゲン酸を用いて実施例５と同じ試験を行った結果を示す。 [Comparative Example 2]
The result of having conducted the same test as Example 5 using chlorogenic acid instead of the compound of this invention is shown.

［参考例１］
杜仲生葉を凍結し、ミキサーを使用して葉の葉脈を切断し、スムージーを得た。このスムージーを−４０℃で予備乾燥し、−３０℃で４８時間乾燥し、乾燥粉末を得た。得られた粉末は粒径が６〜１０μｍであり、極めて粒子の細かい溶解性の良い杜仲葉粉末を得ることができた。 [Reference Example 1]
Morinaka leaves were frozen, and the veins of the leaves were cut using a mixer to obtain a smoothie. This smoothie was pre-dried at -40°C and dried at -30°C for 48 hours to obtain a dry powder. The obtained powder had a particle size of 6 to 10 μm, and it was possible to obtain a Tochu leaf powder having very fine particles and good solubility.

抗ガン特性試験の結果を図３に、７２時間インキュベート後の培地の写真を図４に示す。図３Ａから本発明の化合物は３Ｄスフェロイド培養においてもガン幹細胞に対して高い育成阻害活性を示すことが明らかである。一方、図３Ｂに示すとおり、クロロゲン酸ではこのような活性は認められなかった。３Ｄスフェロイド培養は単層の２Ｄ培養とは異なりその組織本来の機能を高く再現すると考えられる。よって、本発明の化合物はガン幹細胞の自己複製阻害効果を有することが明らかである。
The result of the anti-cancer property test is shown in FIG. 3, and the photograph of the medium after 72 hours of incubation is shown in FIG. From FIG. 3A, it is clear that the compound of the present invention exhibits high growth inhibitory activity against cancer stem cells even in 3D spheroid culture. On the other hand, as shown in FIG. 3B, such activity was not observed with chlorogenic acid. It is considered that the 3D spheroid culture highly reproduces the original function of the tissue unlike the monolayer 2D culture. Therefore, it is clear that the compound of the present invention has a self-renewal inhibitory effect on cancer stem cells.

Claims

下記一般式（１）：

（式中、Ｒは独立に水素原子、炭素数１〜５のアルキル基、または炭素数２〜６のアシル基であり、
Ｒ^１およびＲ^２はベンゼン環上の置換基であり、独立にハロゲン原子、または炭素数１〜５のアルキル基であり、
ｍおよびｎはそれぞれＲ^１およびＲ^２の数を表し、０〜３であり、
Ｒ^３は独立に水素原子または炭素数１〜５のアルキル基である）
で表される化合物。 The following general formula (1):

(In the formula, R is independently a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, or an acyl group having 2 to 6 carbon atoms,
R ¹ and R ² are substituents on the benzene ring, each independently a halogen atom or an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms,
m and n represent the numbers of R ¹ and R ² , respectively, and are 0 to 3,
R ³ is independently a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms)
The compound represented by.

前記ＲおよびＲ^３が水素原子であり、ｍおよびｎが０である、請求項１に記載の化合物。 The compound according to claim 1, wherein R and R ³ are hydrogen atoms, and m and n are 0.

（Ａ）杜仲葉を水または水／アルコール混合溶媒で抽出して抽出液を得る工程、
（Ｂ）当該抽出液をアルコールで抽出して、水相とアルコール相を得る工程、ならびに
（Ｃ）前記水相を、順相クロマトグラフィー、次いで逆相クロマトグラフィーにより分離精製する工程、
を含む、請求項２に記載の化合物の製造方法。 (A) a step of extracting Tochu leaf with water or a water/alcohol mixed solvent to obtain an extract,
(B) a step of extracting the extract with alcohol to obtain an aqueous phase and an alcohol phase, and (C) a step of separating and purifying the aqueous phase by normal phase chromatography and then reverse phase chromatography,
The method for producing the compound according to claim 2, which comprises:

前記工程（Ｃ）が、
（Ｃ１）水／アセトニトリル混合溶媒を展開溶媒として用いた親水性相互作用クロマトグラフィーにより前記水相の分離を行い、水／アセトニトリル分画溶液を得る工程、
（Ｃ２）メタノール／水／酢酸混合溶媒を展開溶媒として用いた逆相分配クロマトグラフィーにより前工程で得た溶液の分離を行い、メタノール／水／酢酸分画溶液を得る工程、
（Ｃ３）アセトニトリル／水／酢酸混合溶媒を展開溶媒として用いた極性基内包型逆相分配クロマトグラフィーにより前工程で得た溶液の分離を行い、アセトニトリル／水／酢酸分画溶液を得る工程、
を含む、請求項３に記載の製造方法。 In the step (C),
(C1) a step of obtaining a water/acetonitrile fractionated solution by separating the aqueous phase by hydrophilic interaction chromatography using a water/acetonitrile mixed solvent as a developing solvent,
(C2) a step of separating the solution obtained in the previous step by reverse phase partition chromatography using a mixed solvent of methanol/water/acetic acid as a developing solvent to obtain a methanol/water/acetic acid fractionated solution,
(C3) a step of separating the solution obtained in the previous step by polar group-encapsulating reverse phase partition chromatography using a mixed solvent of acetonitrile/water/acetic acid as a developing solvent to obtain an acetonitrile/water/acetic acid fractionated solution,
The manufacturing method according to claim 3, comprising:

前記工程（Ｃ２）が、アセトニトリル／水／酢酸混合溶媒を展開溶媒として用いた逆相分配クロマトグラフィーにより前記メタノール／水／酢酸分画溶液の分離を行い、アセトニトリル／水／酢酸分画溶液を得る工程をさらに含み、かつ
前記（Ｃ３）工程が、当該アセトニトリル／水／酢酸分画溶液を分離する工程である、
請求項４に記載の製造方法。 In the step (C2), the methanol/water/acetic acid fractionated solution is separated by reverse phase partition chromatography using a mixed solvent of acetonitrile/water/acetic acid as a developing solvent to obtain an acetonitrile/water/acetic acid fractionated solution. Further comprising a step, and the step (C3) is a step of separating the acetonitrile/water/acetic acid fractionated solution.
The manufacturing method according to claim 4.

前記杜仲葉が、生葉を乾燥しかつ粉末にして得た乾燥粉末または生葉を粉砕して得たスムージーである、請求項３〜５のいずれかに記載の製造方法。 The production method according to claim 3, wherein the Tochu leaf is a dry powder obtained by drying and pulverizing fresh leaves or a smoothie obtained by crushing fresh leaves.

前記工程（Ｂ）におけるアルコールが、炭素数４〜１０のアルコールである、請求項３〜６のいずれかに記載の製造方法。 The manufacturing method according to any one of claims 3 to 6, wherein the alcohol in the step (B) is an alcohol having 4 to 10 carbon atoms.

請求項１または２に記載の化合物を含む、医薬組成物。 A pharmaceutical composition comprising a compound according to claim 1 or 2.

杜仲生葉を凍結乾燥によって乾燥粉末にする工程をさらに含み、前記工程（Ａ）において当該乾燥粉末を抽出に供する、請求項３に記載の製造方法。 The production method according to claim 3, further comprising a step of freeze-drying the Tochu green leaf to give a dry powder, wherein the dry powder is subjected to extraction in the step (A).