JP6745559B1 - イメージングフローサイトメーター、ソート方法、及びキャリブレーション方法 - Google Patents
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Abstract
Description
これに対し、検出部からソート部までの距離を短くすることにより、対象物の速度ばらつきの影響を抑制できる。そのため、従来のフローサイトメーターでは、対象物の速度ばらつきを考慮せず、対象物が検出部を通過してから、一定の遅延時間が経過したタイミングでソート部を動作させるのが一般的であった。
また、個々の対象物の速度を計測できたとしても、特許文献1では速度信号と細胞分類の計算を各々独立して行い、それらの結果を遅延処理回路に入力してソート部を制御するものである。そのため、カメラで撮像された個々の画像と速度計測部で計測された個々の対象物の速度とが、正確に1対1対応で紐付けされる確証がない。異なる対象物に由来する画像の処理結果と速度情報とが誤って紐付けられてしまうと、正確にソートできないため問題となる。具体的には、高いスループットで対象物を流路に流す場合には、個々の対象物の信号間隔が狭まり、場合によっては信号が重複して埋没し、紐付けにエラーを引き起こすことがある。あるいは、計測対象物が小さい場合など、カメラでは識別されたが速度検出部では検出できなかった場合も、信号の1対1対応にエラーを来たすことがある。
粒子が流れる流路上の第1スポット及び第2スポットに、それぞれ第1レーザ光及び第2レーザ光を照射するレーザユニットと、
前記第1スポットを撮像する第1撮像部と、
前記第2スポットを撮像する第2撮像部と、
前記第1スポットを通過する前記粒子を検出する第1検出器と、
前記第2スポットを通過する前記粒子を検出する第2検出器と、
前記第1検出器及び前記第2検出器が取得した信号に基づいて、前記粒子を検出する第1粒子検出部であって、前記第1撮像部及び前記第2撮像部に対して撮像タイミングを指示する撮像タイミング指示信号を発する第1粒子検出部と、
前記第1粒子検出部に対してシステム時間を発するシステム時間管理部と、
前記第1撮像部及び前記第2撮像部が撮像した画像を受信する画像記憶部と、
前記粒子が対象粒子であるか否かを判断するソート判断部と、
を有し、
前記第1撮像部及び前記第2撮像部は、前記撮像タイミング指示信号に基づいて、撮像した前記粒子の画像を切り出す、
イメージングフローサイトメーターである。
粒子が流れる流路上の第1スポット及び第2スポットに、それぞれ第1レーザ光及び第2レーザ光をレーザユニットが照射し、
前記第1スポットを通過する前記粒子を第1検出器が検出し、
前記第2スポットを通過する前記粒子を第2検出器が検出し、
前記第1検出器及び前記第2検出器が信号を取得する撮像タイミングに基づいて、前記第1スポットを第1撮像部が撮像するとともに前記第2スポットを第2撮像部が撮像し、撮像した前記粒子の画像を切り出し、
前記粒子が対象粒子であるか否かをソート判断部が判断し、
前記第1検出器及び前記第2検出器が信号を取得したタイミングに基づいて、前記粒子がソート部に到達するまでの遅延時間を計算し、
前記ソート判断部の判断結果に応じて、前記粒子の遅延時間に基づいて前記ソート部が前記対象粒子をソートする、
ソート方法である。
粒子が流れる流路上の第1スポット及び第2スポットに、それぞれ第1レーザ光及び第2レーザ光をレーザユニットが照射し、
前記第1スポットを通過する前記粒子を第1検出器が検出し、
前記第2スポットを通過する前記粒子を第2検出器が検出し、
前記第1検出器及び前記第2検出器が信号を取得したタイミングに基づいて、前記粒子が前記流路上において前記第1スポット及び前記第2スポットよりも下流に位置する検出位置を通過するまでの到達予想時間を計算し、
前記検出位置を通過する前記粒子を検出して、前記粒子が前記検出位置に到達する到達時間を検出し、
前記到達時間に基づいて、前記到達予想時間を調整する、
キャリブレーション方法である。
以下、図面を参照して、第1実施形態のイメージングフローサイトメーター1について説明する。図1は、本実施形態のイメージングフローサイトメーター1の構成図である。本実施形態のイメージングフローサイトメーター1は、流路10を流れる粒子Pがソート対象となる対象粒子であるか否かを判断し、対象粒子をソートする。粒子Pは、例えば、ビーズ、細胞および細胞塊(血球細胞、骨髄細胞、リンパ球、循環がん細胞、血管内皮細胞、血小板、血小板凝集塊、卵子、***、受精卵、スフェロイド、オルガノイドなど)、オルガネラ(染色体、葉緑体、ミトコンドリアなど)、微生物、寄生虫、花粉、藻(クラミドモナス、ユーグレナなど)である。多数の粒子Pは、流路10を一定の方向(軸方向)に流れる。
ここで、流路10の内径W1は、約200μmである。各スポット25a〜25cは、流路10の軸に直交する方向に延びる。流路10の軸に直交する方向のスポット25a〜25cの幅は、例えば、80μm〜100μmである。粒子Pの直径は、例えば、20μmである。
図2(b)は、レーザ光の強度プロファイルの一例を示す。レーザ光は、流路10の軸に直交する方向に一定の強度を有することが好ましい。
ここで、第1スポット25aと第2スポット25bの間の距離L1は、第1撮像部52a上のラインセンサ100と第2撮像部52b上のラインセンサ100の間の距離、および後述する結像光学系の光学倍率により決定されることから、これらの設計値から計算することができる。そのため、第1スポット25aと第2スポット25bを粒子Pが通過するタイミング情報から、粒子Pの速度を粒子毎に計算できる。
第1粒子検出部70は、撮像ユニット50に対し、各粒子Pの識別番号とともに撮像タイミング指示信号SG1を送信する。
例えば、第1〜第3の各レーザ光に対して角度調整が可能なミラーをレーザユニット22と流路10との間に各々設置する。ミラーの角度を調整することにより、各スポット25a〜25cの位置を調整できる。
AD変換器104がアナログフロントエンド回路102の全画素の出力に対して並列に接続される場合、AD変換器104のサンプリングレートは、例えば、流路を粒子Pが通過する速度をVm/s、粒子の流れ方向における画像の1ピクセルの大きさをXμmとすると、V/X×106 samples/s以上とする。
ソート判断部84は、対象となる粒子の種類に応じて様々な画像解析方法を用いることが出来る。例えば、画像から1つ以上の特徴量を計算し、その分布から粒子Pを分類する方法、特徴量の分布に対してSVM(Support Vector Machine)などの機械学習により分類する方法、画像に対して深層学習を適用することで分類する方法などが用いられる。
このほか、ソート判断部84は、米国特許第6,211,955号公報に記載されるように、細胞核内部の蛍光画像から輝点の有無により分類する方法を用いてもよい。
第4検出器34が画像を取得する場合、第2粒子検出部72は、カメラからの画像とシステム時間の入力を有し、画像バッファとなる内部メモリを搭載したFPGAや、FPGAとDRAMなどの外部メモリを組み合わせた構成や、FPGAを専用もしくは汎用の論理回路に置き換えた構成、マイクロプロセッサとメモリを組み合わせたコンピュータシステムでもよい。例えば、画像を解析して画像内に粒子Pが含まれることが分かる場合、その画像が取得された時間に入力されたシステム時間を粒子Pの通過時間として粒子を検出することができる。第4検出器34がディテクタのように時間方向に連続な信号を取得する場合、第2粒子検出部72は、検出信号をデジタル信号に変換するADC(Analog Digital Converter)と、検出信号バッファとなる内部メモリおよび処理回路を搭載したFPGAで構成できる。検出信号バッファと処理回路については、FPGAとDRAMなどの外部メモリを組み合わせた構成や、FPGAを専用もしくは汎用の論理回路に置き換えた構成、マイクロプロセッサとメモリを組み合わせたコンピュータシステムでもよい。例えば、信号の変化が一定の閾値以上であった時間を粒子Pの通過時間として粒子Pを検出するなどの方法により、粒子を検出することができる。
なお、上記の遅延時間ΔTは、粒子Pが第1スポット25aを通過してから粒子Pがソート部90に到達するまでの時間であるが、これに限られない。遅延時間ΔTは、粒子Pが第2スポット25bを通過してからソート部90に到達するまでの時間でもよい。
ソート信号制御部86には、システム時間管理部60からシステム時間が送信されているため、粒子Pがソート部90に到達するタイミングに合わせて、ソート信号制御部86はソート部90に適切なソート信号を発する。
ソート信号を発する際に遅延時間に基づいて計算されたタイミングがシステム時間より後であれば、計算されたタイミングでのソートは成功であり、ソート信号が出力される。遅延時間に基づいて計算されたタイミングがシステム時間より前の場合は、ソートは不成功であり、ソート信号は出力されなくてもよい。このソート成否は、ソート信号制御部86から記憶部88に向けて出力される。
また、ソート部90が対象粒子を2種類以上に分けてソートする場合がある。例えば、2種類に分けてソートする場合(2−way sorting)、4種類に分けてソートする場合(4−way sorting)がある。そのような場合には、ソート判断部84が対象粒子をさらに複数の異なる種類に分類し、その分類結果がソート信号に含まれる。その場合、例えば、パルス信号の振幅や符号などを用いて、分類結果をパルス信号に含ませることができる。
または、パルス信号と合わせて別途準備した信号線を用いて、分類結果をデジタル信号などとしてソート部90に伝達してもよい。
さらに、ソート信号はソートのタイミングを開始時間としてソートを持続する時間幅を伝達してもよい。その場合、ソートを持続する時間幅を、パルス信号のパルス幅として伝達してもよいし、ソートを持続する時間幅を符号化した信号を別途準備した信号線を用いて伝達してもよい。
ソート判断部84の判断結果により、粒子Pが対象粒子である場合のみに、ソート信号制御部86がソート信号を発してもよい。また、ソート判断部84の判断結果により、粒子Pが対象粒子である場合と対象粒子ではない場合に、ソート信号制御部86が異なるソート信号を発してもよい。
遅延時間計算部80は、検出ユニット30が信号を取得したタイミングのシステム時間に基づいて、粒子Pがソート部90に到達するまでの遅延時間を計算する。
以下、第2実施形態のイメージングフローサイトメーター1について説明する。本実施形態のイメージングフローサイトメーター1は、第4検出器34、第2粒子検出部72、および遅延時間計算部80の構成が第1実施形態とは異なる。それ以外の構成は1実施形態と同一である。本実施形態では、検出位置Xがソート部90の下流に位置しており、粒子Pがソート部90でソートされた際に起こる位置の変化を検出することができる。
以下、第3実施形態のイメージングフローサイトメーター1について説明する。本実施形態のイメージングフローサイトメーター1は、第1実施形態のイメージングフローサイトメーター1において、更に遅延時間のキャリブレーション機能を有する。具体的には、イメージングフローサイトメーター1では、キャリブレーション用のビーズ(粒子P)を流路10に流し、第1スポット25a、第2スポット25bを通過する粒子Pが、検出位置Xで検出される到達時間を測定する。これにより、第1スポット25a、第2スポット25bを通過する粒子Pから計算される粒子Pの到達予想時間のキャリブレーションを行う。
本実施形態の遅延時間計算部80は、第1粒子検出部70で検出された、粒子Pが第1スポット25a、第2スポット25bを通過したシステム時間t1及びt2に基づき、粒子Pが検出位置Xに到達する時間(到達予想時間)を計算する。なお、検出位置Xとソート部90との距離は既知である。
遅延時間計算部80は、紐付けられた粒子Pの識別番号、到達予想時間、到達時間をセットで出力する。
第1スポット25aと第2スポット25bの間の距離をL1、第1スポット25aと検出位置Xの間の距離をL2とすると、粒子Pが等速運動をしている場合には、到達予想時間は(L2/L1)×(t2−t1)として求められる。ここでは係数A=L2/L1の値をキャリブレーションにより求めることで、t1およびt2が与えられた際に到達予想時間を求めることができる。
まず、多数の粒子Pが流路10を流れる。レーザユニット20は、第1〜第3スポット25a〜25cに、それぞれ第1〜第3レーザ光を照射する。検出ユニット30は、第1〜第3スポット25a〜25cを通過する粒子Pを検出する。第1粒子検出部70は、検出ユニット30が取得した信号に基づいて、粒子Pを検出する。また、第1粒子検出部70は、撮像ユニット50に対して、撮像タイミングを指示する撮像タイミング指示信号SG1を発する。この間、システム時間管理部60は、第1粒子検出部70に対して、システム時間を発する。
遅延時間計算部80は、粒子Pが第1スポット25a及び第2スポット25bを通過した時間(システム時間)に基づき、粒子Pが検出位置Xに到達する到達予想時間を計算する。
第2粒子検出部72は、粒子Pの通過に対応する検出信号を検出し、粒子Pが検出位置Xに到達した到達時間を遅延時間計算部80に出力する。
遅延時間計算部80は、到達時間に基づいて、到達予想時間の計算式をキャリブレーションし調整する。そして、ソート信号制御部86とソート部90は、調整された到達予想時間に基づき、粒子Pをソートするタイミングを調整する。
以下、第4実施形態のイメージングフローサイトメーター1について説明する。本実施形態のイメージングフローサイトメーター1は、第2実施形態のイメージングフローサイトメーター1において、更に遅延時間のキャリブレーション機能を有する。具体的には、イメージングフローサイトメーター1では、キャリブレーション用のビーズ(粒子P)を流路10に流し、第1スポット25a、第2スポット25bを通過する粒子Pが、検出位置Xで検出される到達時間を測定する。これにより、第1スポット25a、第2スポット25bを通過する粒子Pから計算される粒子Pの到達予想時間のキャリブレーションを行う。
10 流路
20 レーザユニット
22a 第1レーザ光源
22b 第2レーザ光源
22c 第3レーザ光源
25a 第1スポット
25b 第2スポット
25c 第3スポット
25d 第4スポット
26 レーザ制御部
30 検出ユニット
32a 第1検出器
32b 第2検出器
32c 第3検出器
34 第4検出器
40 照明光源
50 撮像ユニット
52a 第1撮像部
52b 第2撮像部
52c 第3撮像部
52d 第4撮像部
60 システム時間管理部
70 第1粒子検出部
72 第2粒子検出部
80 遅延時間計算部
81 画像解析部
82 画像記憶部
84 ソート判断部
86 ソート信号制御部
88 記憶部
90 ソート部
100 APD
102 AFE
104 ADC
106 FPGA
108 GbE
110 APD制御高圧電源
P 粒子
SG1 撮像タイミング指示信号
D1 画像
Claims (10)
- 粒子が流れる流路上の第1スポット及び第2スポットに、それぞれ第1レーザ光及び第2レーザ光を照射するレーザユニットと、
前記第1スポットを撮像する第1撮像部と、
前記第2スポットを撮像する第2撮像部と、
前記第1スポットを通過する前記粒子を検出する第1検出器と、
前記第2スポットを通過する前記粒子を検出する第2検出器と、
前記第1検出器及び前記第2検出器が取得した信号に基づいて、前記粒子を検出する第1粒子検出部であって、前記第1撮像部及び前記第2撮像部に対して撮像タイミングを指示する撮像タイミング指示信号を発する第1粒子検出部と、
前記第1粒子検出部に対してシステム時間を発するシステム時間管理部と、
前記第1撮像部及び前記第2撮像部が撮像した画像を受信する画像記憶部と、
前記粒子が対象粒子であるか否かを判断するソート判断部と、
を有し、
前記第1撮像部及び前記第2撮像部は、前記撮像タイミング指示信号に基づいて、撮像した前記粒子の画像を切り出し、
前記第1粒子検出部は、前記第1撮像部及び前記第2撮像部に対して、前記粒子単位で付与した識別番号を送信し、
前記第1撮像部及び前記第2撮像部の各々は、切り出された前記粒子の画像と、前記粒子の前記識別番号と、を前記画像記憶部へ送信する、
イメージングフローサイトメーター。 - 前記レーザユニットは、互いに異なる波長を有する前記第1レーザ光と前記第2レーザ光を照射する、
請求項1に記載のイメージングフローサイトメーター。 - 前記第1撮像部及び前記第2撮像部の各々は、ラインセンサを有する、
請求項1又は2に記載のイメージングフローサイトメーター。 - 前記第1撮像部及び前記第2撮像部は、前記流路の軸方向に沿って配置される、
請求項1〜3のいずれかに記載のイメージングフローサイトメーター。 - 前記粒子の遅延時間を計算する遅延時間計算部と、
前記ソート判断部の判断結果に応じて、前記遅延時間計算部によって計算されたタイミングに合わせて前記粒子をソートするために、ソート信号を発するソート信号制御部と、
前記ソート信号に基づいて、前記対象粒子をソートするソート部と、
を更に有し、
前記遅延時間計算部は、前記第1検出器及び前記第2検出器が信号を取得したタイミングの前記システム時間に基づいて、前記粒子が前記ソート部に到達するまでの前記遅延時間を計算する、
請求項1〜4のいずれかに記載のイメージングフローサイトメーター。 - 前記流路上において前記第1スポット及び前記第2スポットよりも下流に位置する検出位置を通過する前記粒子を検出する第2粒子検出部を更に有し、
前記遅延時間計算部は、前記粒子が前記第1スポット及び前記第2スポットを通過したシステム時間に基づいて計算される前記粒子の前記検出位置への到達予想時間と、前記第2粒子検出部によって検出された前記粒子の前記検出位置への到達時間とを比較し、
前記ソート信号制御部は、前記到達予想時間と前記到達時間との比較結果に基づき、前記ソート部が前記対象粒子をソートするタイミングを調整する、
請求項5に記載のイメージングフローサイトメーター。 - 前記検出位置は、前記ソート部よりも下流に位置し、
前記第2粒子検出部は、粒子のソート成功率を算出し、
前記遅延時間計算部は、前記到達予想時間と前記ソート成功率に基づいて、前記ソート部が前記対象粒子をソートするタイミングを調整する、
請求項6に記載のイメージングフローサイトメーター。 - 粒子が流れる流路上の第1スポット及び第2スポットに、それぞれ第1レーザ光及び第2レーザ光をレーザユニットが照射し、
前記第1スポットを通過する前記粒子を第1検出器が検出し、
前記第2スポットを通過する前記粒子を第2検出器が検出し、
前記第1検出器及び前記第2検出器が信号を取得する撮像タイミングに基づいて、前記第1スポットを第1撮像部が撮像するとともに前記第2スポットを第2撮像部が撮像し、撮像した前記粒子の画像を切り出し、
第1粒子検出部が、前記第1撮像部及び前記第2撮像部に対して、前記粒子単位で付与した識別番号を送信し、
前記第1撮像部及び前記第2撮像部の各々が、切り出された前記粒子の画像と、前記粒子の前記識別番号とを送信し、
前記粒子が対象粒子であるか否かをソート判断部が判断し、
前記第1検出器及び前記第2検出器が信号を取得したタイミングに基づいて、前記粒子がソート部に到達するまでの遅延時間を計算し、
前記ソート判断部の判断結果に応じて、前記粒子の遅延時間に基づいて前記ソート部が前記対象粒子をソートする、
ソート方法。 - 粒子が流れる流路上の第1スポット及び第2スポットに、それぞれ第1レーザ光及び第2レーザ光をレーザユニットが照射し、
前記第1スポットを通過する前記粒子を第1検出器が検出し、
前記第2スポットを通過する前記粒子を第2検出器が検出し、
前記第1検出器及び前記第2検出器が信号を取得する撮像タイミングに基づいて、前記第1スポットを第1撮像部が撮像するとともに前記第2スポットを第2撮像部が撮像し、撮像した前記粒子の画像を切り出し、
第1粒子検出部が、前記第1撮像部及び前記第2撮像部に対して、前記粒子単位で付与した識別番号を送信し、
前記第1撮像部及び前記第2撮像部の各々が、切り出された前記粒子の画像と、前記粒子の前記識別番号とを送信し、
前記第1検出器及び前記第2検出器が信号を取得したタイミングに基づいて、前記粒子が前記流路上において前記第1スポット及び前記第2スポットよりも下流に位置する検出位置を通過するまでの到達予想時間を計算し、
前記検出位置を通過する前記粒子を検出して、前記粒子が前記検出位置に到達する到達時間を検出し、
前記到達時間に基づいて、前記到達予想時間を調整する、
キャリブレーション方法。 - 調整された前記到達予想時間に基づき、ソート部が前記粒子をソートするタイミングを調整する、
請求項9に記載のキャリブレーション方法。
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