JP6738285B2 - ヒト及びカニクイザルcd3イプシロンに結合する抗体 - Google Patents
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Description
本明細書では、ヒト カニクイザル交差反応性抗体を産生するための方法及びその使用を提供する。
発明の詳細な説明
a)本明細書に報告される方法を用いてヒト カニクイザル交差反応性抗体を産生する工程、
b)工程a)で産生された抗体をコードする核酸を含む細胞を提供する工程、
c)工程b)の細胞を培養する工程、
d)細胞又は培養上清から抗体を回収する工程、
及び、それによりヒト カニクイザル交差反応性抗体を組換え的に産生する工程。
a)本明細書に報告される方法を用いて抗体を産生する工程、
b)工程a)で産生された抗体をコードする核酸を単離する工程、
c)任意選択的に抗体をヒト化する工程、
d)工程b)で単離された、又は工程c)で得られた抗体をコードする核酸を発現ベクターにクローニングする工程、
e)工程d)で得られた発現ベクターで細胞をトランスフェクトする工程、
f)工程e)の細胞を培養する工程、
g)細胞又は培養上清から抗体を回収する工程、
及び、それによりヒト カニクイザル交差反応性抗体を組換え的に産生する工程。
定義
(a)アミノ酸残基26−32(L1)、50−52(L2)、91−96(L3)、26−32(H1)、53−55(H2)、及び96−101(H3)で生じる超可変ループ(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));
(b)アミノ酸残基24−34(L1)、50−56(L2)、89−97(L3)、31−35b(H1)、50−65(H2)、及び95−102(H3)で生じるCDR(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));
(c)アミノ酸残基27c−36(L1)、46−55(L2)、89−96(L3)、30−35b(H1)、47−58(H2)、及び93−101(H3)で生じる抗原接触(MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996));及び
(d)HVRのアミノ酸残基46−56(L2)、47−56(L2)、48−56(L2)、49−56(L2)、26−35(H1)、26−35b(H1)、49−65(H2)、93−102(H3)、及び94−102(H3)を含む、(a)、(b)、及び/又は(c)の組合せ。
分率X/Yの100倍
ここで、Xは、A及びBのプログラムアラインメントにおいて、配列アラインメントプログラムALIGN−2によって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、YはBの全アミノ酸残基の全数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと一致しない場合、AのBに対する%アミノ酸配列同一性は、BのAに対する%アミノ酸配列同一性とは一致しないと評価されるであろう。特に断らない限りは、ここで使用される全ての%アミノ酸配列同一性値は、直前のパラグラフに記載したように、ALIGN−2コンピュータプログラムを用いて得られる。
一態様において、本発明は、ヒト及びカニクイザルCD3イプシロンに結合する単離された抗体を提供する。ある実施態様において、抗CD3イプシロン抗体は
・配列番号01のポリペプチドに結合し、及び/又は
・ヒト(配列番号02)及びカニクイザル(配列番号28)のCD3イプシロンのECDに結合し、及び/又は
・ヒト及び/又はカニクイザルT細胞を活性化し、及び/又は
・CD3イプシロンのアゴニストであり、及び/又は
・その抗原に対して≦10μMの親和性で結合する。
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、≦100μM又は≦10μM(例えば、10−5M又はそれ未満)の解離定数(Kd)を有する。
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は抗体断片である。抗体断片は、限定されるものではないが、Fab、Fab’、Fab’−SH、F(ab’)2、Fv、及びscFv断片、並びに下記の他の断片を含む。所定の抗体断片の総説については、Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134を参照。scFv断片の総説については、例えば、Plueckthun, A., In; The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore (eds.), Springer-Verlag, New York (1994), pp. 269-315を参照;また、国際公開第93/16185号;及び米国特許第5571894号及び第5587458号も参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、かつインビボ半減期を増加させたFab及びF(ab’)2断片の議論については、米国特許第5869046号を参照のこと。
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体はキメラ抗体である。所定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第4816567号、及びMorrison, S.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855に記載されている。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域(例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又はサル等の非ヒト霊長類由来の可変領域)及びヒト定常領域を含む。更なる例において、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが親抗体のものから変更された「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体はヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で周知の様々な技術を用いて生産することができる。ヒト抗体は一般的に、van Dijk, M.A. and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374及びLonberg, N., Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 450-459に記載されている。
本発明の抗体は、一又は複数の所望の活性を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。例えば、様々な方法が、ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特性を有する抗体についてそのようなラリーをスクリーニングするために、当技術分野で知既知である。その方法は、例えば、Hoogenboom, H.R. et al., Methods in Molecular Biology 178 (2001) 1-37に概説され、更に、McCafferty, J. et al., Nature348 (1990) 552-554; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628; Marks, J.D. et al., J. Mol. Biol. 222 (1992) 581-597; Marks, J.D. and Bradbury, A., Methods in Molecular Biology 248 (2003) 161-175; Sidhu, S.S. et al., J. Mol. Biol. 338 (2004) 299-310; Lee, C.V. et al., J. Mol. Biol. 340 (2004) 1073-1093; Fellouse, F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 12467-12472;及びLee, C.V. et al., J. Immunol. Methods 284 (2004) 119-132に記載されている。
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある実施態様において、結合特異性の一つはCD3イプシロンに対してであり、他は、任意の他の抗原に対してである。特定の実施態様において、二重特異性抗体は、CD3イプシロンの2つの異なるエピトープに結合することができる。二重特異性抗体はまたCD3イプシロンを発現する細胞に細胞傷害性薬物を局所化するために用いることができる。二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片として調製することができる。
特定の実施態様では、本明細書に提供される抗体のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び/又は他の生物学的特性を改善することが望まれる。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することにより、又はペプチド合成により調製することができる。このような修飾は、例えば抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び/又はそれへの挿入、及び/又はそれの置換を含む。最終コンストラクトが所望の特性、例えば、抗原結合を有していることを条件として、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが、最終コンストラクトに到達させるために作成され得る。
ある実施態様において、一以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換突然変異の目的の部位は、HVR及びFRを含む。例示的な変更は、「例示的置換」と題して表1に示され、アミノ酸側鎖のクラスを参照して下記に更に説明される。保存的置換は、表1の「好ましい置換」の見出しの下に示されている。アミノ酸置換は、目的の抗体に導入することができ、その生成物は、所望の活性、例えば、抗原結合の保持/改善、免疫原性の減少、又はADCC又はCDCの改善についてスクリーニングされる。
(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
(2)中性の親水性Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(3)酸性:Asp、Glu;
(4)塩基性:His、Lys、Arg
(5)鎖配向に影響する残基:Gly、Pro
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe.
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加又は減少するように改変される。グリコシル化部位の抗体への付加又は欠失は、一又は複数のグリコシル化部位が創出又は削除されるようにアミノ酸配列を改変することにより、簡便に達成することができる。
ある実施態様において、一又は複数のアミノ酸修飾を、本明細書で提供される抗体のFc領域に導入し、それによりFc領域変異体を生成することができる。Fc領域変異体は、一又は複数のアミノ酸位置でアミノ酸修飾(例えば置換)を含むヒトFc領域配列(例えばヒトIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4のFc領域)を含みうる。
ある実施態様において、抗体の一以上の残基がシステイン残基で置換されている、システイン操作抗体、例えば、「thioMAbs」を作成することが望まれ得る。特定の実施態様において、置換された残基は、抗体のアクセス可能な部位で存在する。それらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基は、それにより抗体のアクセス可能な部位に配置され、本明細書中で更に記載されるように、イムノコンジュゲーを作成するために、例えば薬物部分又はリンカー−薬物部分などの他の部分に抗体をコンジュゲートするために使用することができる。ある実施態様において、以下の残基の任意の一以上がシステインで置換され得る:軽鎖のV205(Kabatの番号づけ);重鎖のA118(EUの番号づけ);及び重鎖Fc領域のS400(EUの番号づけ)。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第7521541号に記載のように生成され得る。
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、当技術分野で知られ、容易に入手可能な付加的な非タンパク質部分を含むように更に改変することができる。抗体の誘導体化に適した部分としては、限定されないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例は、限定されないが、ポリエチレングリコール(PEG)、エチレングリコール/プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−1,3−ジオキソラン、ポリ−1,3,6−トリオキサン、エチレン/無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸(ホモポリマー又はランダムコポリマーの何れか)及びデキストラン又はポリ(n−ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキシド/エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール(例えばグリセロール)、ポリビニルアルコール並びにこれらの混合物を含む。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のために製造上の利点を有しうる。ポリマーは、任意の分子量であってよく、分枝状でも非分枝状でもよい。抗体に結合するポリマーの数は変動してよく、そして、一以上の重合体が結合する場合は、それらは同じか又は異なる分子であることができる。一般的に、誘導体化に使用するポリマーの数及び/又は種類は、限定されないが、向上させるべき抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が限定された条件下で治療に使用されるのか等を含む考慮に基づいて決定することができる。
抗体は、例えば米国特許第4816567号で説明したように、組換えの方法及び組成物を用いて製造することができる。一実施態様では、本明細書に記載される抗CD3イプシロン抗体をコードする単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗体のVLを含むアミノ酸配列、及び/又は抗体のVHを含むアミノ酸配列(例えば、抗体の軽鎖及び/又は重鎖)をコードしうる。更なる実施態様では、そのような核酸を含む一又は複数のベクター(例えば、発現ベクター)が提供される。更なる実施態様では、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。一実施態様では、宿主細胞は以下を含む(例えば、以下で形質転換されている):(1)抗体のVLを含むアミノ酸配列、及び抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は(2)抗体のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一ベクターと、抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第ニベクター。一実施態様において、宿主細胞は、真核生物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、又はリンパ系細胞(例えば、Y0、NS0、Sp20細胞)である。一実施態様において、抗CD3イプシロン抗体を作製する方法が提供され、その方法は、上記のように、抗体の発現に適した条件下で、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することを含み、及び必要に応じて、宿主細胞(又は宿主細胞培養培地)から抗体を回収することを含む。
本明細書に記載の抗CD3イプシロン抗体の薬学的製剤は、所望の程度の純度を有するその抗体と任意の薬学的に許容可能な一以上の担体(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980))とを、凍結乾燥製剤又は水性溶液の形態で混合することによって調製される。薬学的に許容可能な担体は、使用される投薬量及び濃度でレシピエントに毒性でなく、そしてこれには、限定しないが、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸のような緩衝液;アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤;防腐剤(例えば、オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロライド;ヘキサメトニウムクロライド;塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール;アルキルパラベン、例えば、メチル又はプロピルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3−ペンタノール;及びm−クレゾール);低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えば、ポリ(ビニルピロリドン);アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン;マンノサッカライド、ジサッカライド、及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物;キレート剤、例えば、EDTA;糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール;塩形成対イオン、例えば、ナトリウム、金属錯体(例えば、Zn−タンパク質錯体);及び/又はポリエチレングリコール(PEG)等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。本明細書における典型的な薬学的に許容可能な担体は、介在性薬物分散剤、例えば、水溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質(sHASEGP)、例えば、rhuPH20(HYLENEX(登録商標))、Baxter International、Inc.)などのヒト可溶性PH−20ヒアルロニダーゼ糖タンパク質を更に含む。所定の典型的なsHASEGP及び使用法は、rhuPH20を含み、米国特許出願公開第2005/0260186号及び第2006/0104968号に開示されている。一態様において、sHASEGPは、コンドロイチナーゼなどの1つ又は複数の追加のグルコサミノグリカンと組み合わされる。
本明細書で提供される抗CD3イプシロン抗体は、当技術分野で周知の種々のアッセイによって同定され、その物理的/化学的性質及び/又は生物学的活性についてスクリーニングされ又は特徴付けされうる。
一態様において、本発明の抗体は、例えばELISA、ウエスタンブロット法など公知の方法により、その抗原結合活性について試験される。
一態様において、アッセイは、生物学的活性を有するそれらの抗CD3イプシロン抗体を同定するために与えられる。生物学的活性は、例えば、T細胞の活性化を含み得る。インビボ及び/又はインビトロでこのような生物学的活性を有する抗体もまた提供される。
本発明はまた、化学療法剤又は薬物、成長抑制剤、毒素(例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、又は動物起源の酵素活性毒素、又はそれらの断片)、又は放射性同位元素など、1つ以上の細胞傷害性薬物にコンジュゲートした本明細書中の抗CD3イプシロン抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。
特定の実施態様では、本明細書において提供される抗CD3イプシロン抗体のいずれもが、生物学的試料中の抗CD3イプシロンの存在を検出するために有用である。本明細書で使用する「検出(する)」という用語は、定量的又は定性的検出を包含する。ある実施態様において、生物学的試料は、細胞又は組織、例えば血液などを含む。
本明細書に記載の抗CD3イプシロン抗体の薬学的製剤は、所望の程度の純度を有するその抗体と任意の薬学的に許容可能な一以上の担体(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980))とを、凍結乾燥製剤又は水性溶液の形態で混合することによって調製される。薬学的に許容可能な担体は、使用される投薬量及び濃度でレシピエントに毒性でなく、そしてこれには、限定しないが、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸のような緩衝液;アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤;防腐剤(例えば、オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロライド;ヘキサメトニウムクロライド;塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール;アルキルパラベン、例えば、メチル又はプロピルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3−ペンタノール;及びm−クレゾール);低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えば、ポリ(ビニルピロリドン);アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン;マンノサッカライド、ジサッカライド、及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物;キレート剤、例えば、EDTA;糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール;塩形成対イオン、例えば、ナトリウム、金属錯体(例えば、Zn−タンパク質錯体);及び/又はポリエチレングリコール(PEG)等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。本明細書における典型的な薬学的に許容可能な担体は、介在性薬物分散剤、例えば、水溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質(sHASEGP)、例えば、rhuPH20(HYLENEX(登録商標))、Baxter International、Inc.)などのヒト可溶性PH−20ヒアルロニダーゼ糖タンパク質を更に含む。所定の典型的なsHASEGP及び使用法は、rhuPH20を含み、米国特許出願公開第2005/0260186号及び第2006/0104968号に開示されている。一態様において、sHASEGPは、コンドロイチナーゼなどの1つ又は複数の追加のグルコサミノグリカンと組み合わされる。
本明細書で提供される抗CD3イプシロン抗体の何れかを、治療方法で使用することができる。
本発明の他の実施態様において、上述した障害の治療、予防、及び/又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。製造品は、容器とラベル又は容器上にある又は容器に付属する添付文書を含む。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、IV輸液バッグ等を含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な物質から形成されうる。容器は、疾患の治療、予防、及び/又は診断に有効である、それ自体か、又はその他の組成物と併用される化合物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る(例えば、容器は皮下注射針による穴あきストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい)。組成物中の少なくとも一の活性剤は本発明の抗体である。ラベル又は添付文書は、組成物が特定の症状の治療のために使用されることを示している。更に、製造品は、(a)組成物が本発明の抗体を包含する組成物を含む第一の容器;及び(b)組成物が更なる細胞障害性又はその他の治療的薬剤を包含する組成物を含む第2の容器を含み得る。本発明の本実施態様における製造品は、組成物が特定の疾患を治療することに用いることができることを示す添付文書を更に含んでいてもよい。別法として、又は加えて、製造品は、薬学的に許容される緩衝液、例えば注射用静菌水(BWFI)、リン酸緩衝化塩水、リンガー溶液及びデキストロース溶液を含む第二(又は第三)の容器を更に含んでもよい。これは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的及びユーザーの立場から望まれる他の物質を更に含んでもよい。
1.ヒト カニクイザル交差反応性抗体を産生するための唯一の抗原として、天然型カニクイザル抗原で実験動物を免疫する工程を含む方法の使用。
a)実施態様30から58の何れか一に記載の方法を用いてヒト カニクイザル交差反応性抗体を産生する工程、
b)工程a)で産生された抗体をコードする核酸を含む細胞を提供する工程、
c)工程b)の細胞を培養する工程、
d)細胞又は培養上清から抗体を回収する工程、
及び、それによりヒト カニクイザル交差反応性抗体を組換え的に産生する工程
を含む、ヒト カニクイザル交差反応性抗体を組換え的に産生するための方法。
a)実施態様30から58の何れか一に記載の方法を用いて抗体を産生する工程、
b)工程a)で産生された抗体をコードする核酸を単離する工程、
c)任意選択的に抗体をヒト化する工程、
d)工程b)で単離された、又は工程c)で得られた抗体をコードする核酸を発現ベクターにクローニングする工程、
e)工程d)で得られた発現ベクターで細胞をトランスフェクトする工程、
f)工程e)の細胞を培養する工程、
g)細胞又は培養上清から抗体を回収する工程、
それによりヒト カニクイザル交差反応性抗体を組換え的に産生する工程
を含む、ヒト カニクイザル交差反応性抗体を組換え的に産生するための方法。
配列番号01 ヒトCD3イプシロン細胞外ドメインの残基77−96のアミノ酸配列。
配列番号02 ヒトCD3イプシロンの細胞外ドメインのアミノ酸配列。
配列番号03 全長ヒトCD3イプシロンのアミノ酸配列。
配列番号04 抗体クローン645のHVR−H1変異体1のアミノ酸配列。
配列番号05 抗体クローン645のHVR−H1変異体2のアミノ酸配列。
配列番号06 抗体クローン645のHVR−H2変異体1のアミノ酸配列。
配列番号07 抗体クローン645のHVR−H2変異体2のアミノ酸配列。
配列番号08 抗体クローン645のHVR−H2変異体3のアミノ酸配列。
配列番号09 抗体クローン645のHVR−H3のアミノ酸配列。
配列番号10 抗体クローン645のHVR−L1変異体1のアミノ酸配列。
配列番号11 抗体クローン645のHVR−L1変異体2のアミノ酸配列。
配列番号12 抗体クローン645のHVR−L2のアミノ酸配列。
配列番号13 抗体クローン645のHVR−L3のアミノ酸配列。
配列番号14 抗体クローン645の重鎖可変領域(VH)のアミノ酸配列。
配列番号15 抗体クローン645の軽鎖可変領域(VL)のアミノ酸配列。
配列番号16 ヒトCD3g(G4S)5CD3e−AcTev−Fc(ノブ)−Avi融合ポリペプチドのアミノ酸配列。
配列番号17 Fc(ホール)のアミノ酸配列。
配列番号18 カニクイザルCD3g(G4S)5CD3e−AcTev−Fc(ノブ)−Avi融合ポリペプチドのアミノ酸配列。
配列番号19 ヒトCD3e−ストーク−Fc(ノブ)−Avi融合ポリペプチドのアミノ酸配列。
配列番号20 ヒトCD3d−ストーク−Fc(ホール)−Avi融合ポリペプチドのアミノ酸配列。
配列番号21 ヒトCD3gC85−ストーク−Fc(ホール)−Avi融合ポリペプチドのアミノ酸配列。
配列番号22 カニクイザルCD3e ストーク−Fc(ノブ)−Avi融合ポリペプチドのアミノ酸配列。
配列番号23 カニクイザルCD3d ストーク−Fc(ホール)−Avi融合ポリペプチドのアミノ酸配列。
配列番号24 ヒトCD3e −1−26−Fc(ノブ)Avi融合ポリペプチドのアミノ酸配列。
配列番号25 カニクイザルCD3e 5−26−Fc(ノブ)−Avi融合ポリペプチドのアミノ酸配列。
配列番号26 ヒトCD3e 5−26−Fc(ノブ)−Avi融合ポリペプチドのアミノ酸配列。
配列番号27 全長カニクイザルCD3イプシロンのアミノ酸配列。
配列番号28 カニクイザルCD3イプシロン細胞外ドメインのアミノ酸配列。
配列番号29 カニクイザルCD3イプシロンの残基69−88のアミノ酸配列。
配列番号30 プライマーrbHCfinal.upのヌクレオチド配列。
配列番号31 プライマーrbHCfinal.doのヌクレオチド配列。
配列番号32 プライマーrbLCfinal.upのヌクレオチド配列。
配列番号33 プライマーrbLCfinal.doのヌクレオチド配列。
実施例1
A)第一の免疫化キャンペーンのための組換えヒトCD3g(G4S)5CD3e−AcTev−Fc(ノブ)−Avi/Fc(ホール)及びカニクイザルCD3g(G4S)5CD3e−AcTev−Fc(ノブ)−Avi/Fc(ホール)の調製
第一の免疫化キャンペーンのために、CD3g鎖と融合したCD3eを含むヒト及びカニクイザル組換えタンパク質が産生された。ヒトCD3g(G4S)5CD3e−AcTev−Fc(ノブ)−Avi(配列番号16)及びカニクイザルCD3g(G4S)5CD3e−AcTev−Fc(ノブ)−Avi(配列番号18)は、グリシン−セリンリンカー((G4S)5)によって連結されているCD3e及びCD3gの外部ドメインがFc(ホール)と同時発現されたC末端Aviタグを有するFc(ノブ)に融合した組換えタンパク質である(配列番号17)(図1)。
a)ビオチン−リンカー−ヒトCD3eアミノ酸1−22
b)ヒトCD3eアミノ酸1−22−リンカー−ビオチン
c)ビオチン−リンカー−カニクイザルCD3eアミノ酸1−22
d)カニクイザルCD3eアミノ酸1−22−リンカー−ビオチン
e)ビオチン−リンカー−ヒトCD3eアミノ酸77−96(配列番号01)
f)ヒトCD3eアミノ酸77−96(配列番号01)−リンカー−ビオチン
g)ビオチン−リンカー−カニクイザルCD3eアミノ酸69−88(配列番号29)
h)カニクイザルCD3eアミノ酸69−88(配列番号29)−リンカー−ビオチン
ウサギの免疫化
第一の免疫化キャンペーン
Charles River Laboratories International、Inc.のNZWウサギを免疫化に使用した。
免疫化に対する抗体応答は、Maxisorb 96ウェルマイクロタイタープレート(Nunc)上で1ウェルあたり2.5μgの組換えヒト/カニクイザルCD3g(G4S)5CD3e−AcTev−Fc(ノブ)−Aviを4℃で一晩4℃でインキュベートしたELISAを用いた血清の連続希釈によって決定した。検出のために、西洋ワサビペルオキシダーゼ(The Jackson laboratory)に連結したヤギ抗ウサギIgGを1:16000希釈で使用した。BM Blue POD基質、沈殿性テトラメチルベンジジン(TMB)、すぐに使用できる溶液(Roche)を可視化するために使用した。1NのHClで反応を停止させ、Tecan Infiniteで450/690nmで測定した。
初代ヒトT細胞を、RosetteSepヒトT細胞エンリッチメントカクテル(StemCell Technologies)により、6人の健常ヒトドナーの全血200mlから製造業者の指示に従って単離した。得られたT細胞の品質及び細胞数を、細胞計数装置XT−1800 iVET(Sysmex)によって確認した(表4)。CD3、CD4及びCD8陽性T細胞を検出するBDからのTriTestを用いたFACS分析を、得られたT細胞の質及び純度の分析に用いた(表5)。更に、これらのT細胞の生存率をPI(ヨウ化プロピジウム)FACS染色によって評価し、全試料において99.6%超の生存細胞であった。免疫化までの保存のために、T細胞を、シスメックス(Sysmex)装置によって測定された細胞数を用いて4.6×107及び1.15×107の細胞として液体窒素中で個別に各ドナーについて凍結させた。
リコール細胞をFicoll−Paque(GE Healthcare)を用いた密度勾配遠心分離によってカニクイザル血液(Covance)から単離した。簡潔に述べると、10mlのヘパリン添加血液を同量のRPMI−1640培地(Invitrogen)で希釈し、希釈血液の5mlのアリコートを15mlのファルコンチューブ中の5mlのFicoll−Paqueの上に重層した。室温で800×gで45分間遠心分離した後(連続的に)、リンパ球含有画分を回収し、プールし、リンパ球集団の純度を高めるために第2の勾配遠心分離に供した。このために、プールされた画分約6mlを18mlのRPMI−1640培地で希釈し、希釈した細胞懸濁液の6mlアリコートを15mlファルコンチューブ中のFicoll−Paque3mlの上に重層した。室温で800×gで30分間遠心分離した後(連続的に)、リンパ球を採取し、プールした。PBSで洗浄した後、リンパ球を、10%ウシ胎児血清、10mMのHEPES、2mMのL−グルタミン、1×NEAA、1mMのピルビン酸ナトリウム及び1×抗生物質−抗真菌剤を補充したRPMI−1640培地に6.0E+05細胞/mlで再懸濁した(培地及びサプリメントはInvitrogenから購入した)。細胞を、20μg/mlのコンカナバリンA(Sigma−Aldrich)の存在下、加湿雰囲気中37℃、5%CO2で3日間培養した。その後、培地を交換し、細胞を10%ウシ胎児血清、10mMのHEPES、2mMのL−グルタミン、1×NEAA、1mMのピルビン酸ナトリウム及び1×抗生物質−抗真菌剤及び20U/mLのヒトIL−2(Roche)を補充したRPMI−1640培地中で9日間培養した。この培養期間中、2−3日ごとにIL−2含有培地を交換した。細胞生存率及び細胞数を培養期間を通してモニターし、インビトロで拡大したカニクイザルTリンパ球のCD3発現を、抗CD3 mAb(クローンSP34;BD Pharmingen)を用いたフローサイトメトリーによって確認した。インビトロで増殖したTリンパ球(生存率>80%)を採取し、PBSで洗浄し、1.0E+07細胞/mlで凍結培地(10%DMSO、90%FCS)に再懸濁した。細胞のアリコートを液体窒素中に貯蔵した。
カニクイザルTリンパ球の調製及びインビトロでの増殖
リコール細胞をFicoll−Paque(GE Healthcare)を用いた密度勾配遠心分離によってカニクイザル血液(Covance)から単離した。簡潔に述べると、10mlのヘパリン添加血液を同量のRPMI−1640培地(Invitrogen)で希釈し、希釈血液の9−10mlのアリコートを15mlのファルコンチューブ中の5mlのFicoll−Paqueの上に重層した。室温で800×gで45分間遠心分離した後(連続的に)、リンパ球含有画分を回収し、プールし、リンパ球集団の純度を高めるために第2の勾配遠心分離に供した。このために、おおよそプールされた画分をRPMI−1640培地で希釈された初期体積まで希釈し、希釈した細胞懸濁液の9−10mlアリコートを15mlファルコンチューブ中のFicoll−Paque 5mlの上に重層した。室温で800×gで30分間遠心分離した後(連続的に)、リンパ球を採取し、プールした。PBSで洗浄した後、リンパ球を、10%ウシ胎児血清、10mMのHEPES、2mMのL−グルタミン、1×NEAA、1mMのピルビン酸ナトリウム及び1×抗生物質−抗真菌剤を補充したRPMI−1640培地に6.0E+05細胞/mlで再懸濁した(培地及びサプリメントはInvitrogenから購入した)。細胞を、20μg/mlのコンカナバリンA(Sigma−Aldrich)及び20U/mlのヒトIL−2(Roche)の存在下、加湿雰囲気中37℃、5%CO2で3日間培養した。その後、培地を交換し、細胞を10%ウシ胎児血清、10mMのHEPES、2mMのL−グルタミン、1×NEAA、1mMのピルビン酸ナトリウム及び1×抗生物質−抗真菌剤及び20U/mLのヒトIL−2(Roche)を補充したRPMI−1640培地中で9日間培養した。この培養期間中、2−3日ごとにIL−2含有培地を交換した。細胞生存率及び細胞数を培養期間を通してモニターし、インビトロで拡大したカニクイザルTリンパ球のCD3発現を、抗CD3 mAb(クローンSP34;BD Pharmingen)を用いたフローサイトメトリーによって確認した。インビトロで増殖したTリンパ球(生存率>90%)を採取し、PBSで洗浄し、1.0E+07細胞/mlで凍結培地(10%DMSO、90%FCS)に再懸濁した。細胞のアリコートを液体窒素中に貯蔵した。
リンパ球をLeukosep(Greiner Bio One、227 288)を用いた密度勾配遠心分離によって健常なドナーの末梢血から単離した。簡潔に述べると、ヘパリン添加血液を3倍容量のPBSで希釈し、希釈した血液の25mlアリコートを50mlのLeukosepチューブに重層した。室温で800×gで15分間遠心分離した後(連続的に)、リンパ球含有画分を回収し、PBSで洗浄し、10%ウシ胎児血清、10mMのHEPES、2mMのL−グルタミン、1×NEAA、1mMのピルビン酸ナトリウム及び1×抗生物質−抗真菌剤を補充したRPMI−1640培地に1.0E+06細胞/mlで再懸濁した(培地及びサプリメントはInvitrogenから購入した)。細胞を、T175フラスコ中に10μg/mlのコンカナバリンA(Sigma−Aldrich)の存在下、加湿雰囲気中37℃、5%CO2で2日間培養した。その後、培地を交換し、細胞を10%ウシ胎児血清、10mMのHEPES、2mMのL−グルタミン、1×NEAA、1mMのピルビン酸ナトリウム及び1×抗生物質−抗真菌剤及び20U/mLのヒトIL−2(Roche)を補充したRPMI−1640培地中で更に7日間培養した。この培養期間中、細胞を2−3日ごとに1.0E+06細胞/mlに分割され、IL−2含有培地を交換した。細胞生存率及び細胞数を培養期間を通してモニターし(図5)、インビトロで拡大したヒトTリンパ球のCD3発現を、抗CD3 mAb(クローンV9)を用いたフローサイトメトリーによって確認した。インビトロで増殖したTリンパ球(生存率>90%)を採取し、PBSで洗浄し、1.0E+07細胞/mlで凍結培地(10%DMSO、90%FCS)に再懸濁した。細胞のアリコートを液体窒素中に貯蔵した。
3匹のウサギを、T細胞について濃縮されたカニクイザル及びヒトPBLで免疫した(上述されるように)。各免疫化のために、凍結した細胞を解凍し、計数し、遠心分離によって凍結培地から分離し、注射用の適切な容量のPBSに再懸濁した。各ウサギは、0日目にPBSに再懸濁した6×107個のカニクイザルPBLの1回の皮内適用を受けた;その後7日目及び14日目にそれぞれ4×107個のカニクイザルPBLの1回の筋肉内投与及び1回の皮下投与を行い、21日目に最初の出血を行った。
B細胞クローニング
ウサギ末梢血単核細胞(PBMC)の単離は
3匹のウサギ(実施例「ウサギの免疫化」に記載)を血液源として使用した。哺乳動物lympholyte(Cedarlane Laboratories、Burlington、Ontario、Canada)を用いて、製造者の仕様に従って密度遠心分離前に、全血を含むEDTAを1×PBS(PAA、Pasching、Austria)で2倍に希釈した。PBMCを1×PBSで2回洗浄した。
10%FCS(Hyclone、Logan、UT、USA)、2mMのグルタミン、1%ペニシリン/ストレプトマイシン溶液(PAA、Pasching、Austria)、2mMのピルビン酸ナトリウム、10mMのHEPES(PAN(登録商標))を補充したRPMI 1640(Pan Biotech、Aidenbach、Biotech、Aidenbach、Germany)及び0.05mMのβ−メルカプトエタノール(Gibco、Paisley、Scotland)
滅菌6ウェルプレート(細胞培養グレード)を使用して、非特異的接着によってマクロファージ及び単球を枯渇させた。各ウェルは、最大で4mlの培地で、免疫化されたウサギからの6×106個のPBMCになるまで充填され、インキュベーター内で37℃で1時間結合させた。上清中の細胞(末梢血リンパ球(PBL))を抗原パニング工程に使用した。
タンパク質パンニングのために、滅菌ストレプトアビジン被覆6−ウェルプレート(Microcoat、Bernried、Germany)をPBS中の2μg/mlのビオチン化ヒトCD3eタンパク質変異体(表6参照)を用いて室温で3時間コーティングした。各タンパク質変異体を別々にコーティングした。ヒト表面CD3細胞上でのパンニングを可能にするために、CD3陽性Jurkat T細胞をウシ胎仔血清(FCS)を含まない滅菌細胞培養6ウェルプレートに播種し、直ちに遠心分離した。培養の1−4時間後、コンフルエントな細胞単層が生成された。パンニングの前に、これらの6ウェルプレートを滅菌PBSで3回慎重に洗浄した。
抗原特異的末梢B細胞の濃縮のために、ヒトCD3eタンパク質変異体でコーティングされた、又はヒトCD3陽性Jurkat T細胞で覆われた6ウェル組織培養プレートに、培地4ml当たり最大で6×106個のPBLを播種し、5%CO2下で37℃で1時間結合させた。その後、1×PBSでウェルを慎重に1−2回洗浄することによって、非接着細胞を除去した。残りの粘着性細胞を、5%CO2下37℃で10分間、トリプシンにより脱離した。トリプシン処理をEL−4 B5培地で停止させた。免疫蛍光染色まで細胞を氷上に保った。
抗IgG FITC(AbD Serotec、Duesseldorf、Germany)を単細胞選別に使用した。表面染色のために、枯渇及び濃縮工程からの細胞をPBS中で抗IgG FITC抗体と共にインキュベートし、暗所で4℃で45分間インキュベートした。染色後、PBMCを氷冷PBSで2回洗浄した。最後に、PBMCを氷冷PBS中に再懸濁し、直ちにFACS分析に供した。FACS分析の前に、5μg/mlの濃度のヨウ化プロピジウム(BD Pharmingen、San Diego、CA、USA)を添加して、死細胞と生存細胞とを区別した。
ウサギB細胞の培養は、Zubler et al. (1985)により記載されたものと類似の方法により調製された。簡潔には、単一選別されたウサギB細胞を、Pansorbin細胞(1:100000)(Calbiochem(Merck)、Darmstadt、Deutschland)、5%ウサギ胸腺細胞上清(charge TSN−M13(10242)、MicroCoat、Bernried、Germany)及びγ線照射マウスEL−4−B5胸腺腫細胞(2.5×104/ウェル)を含有するEL−4 B5培地を200μl/ウェル含む96ウェルプレート中で、インキュベーター内で37℃、5%CO2の雰囲気下で7日間培養した。B細胞培養の上清をスクリーニングのために除去し、残りの細胞を直ちに回収し、100μlのRLT緩衝液(Qiagen、Hilden、Germany)中で−80℃で凍結した。
全RNAは、NucleoSpin 8/96 RNAキット(Macherey&Nagel;740709.4、740698)を製造者のプロトコールに従って用いて調製した。全ての工程は、epMotion 5075液体ハンドリングシステム(Eppendorf)で行った。RNAを60μlのRNaseを含まない水を用いて溶出した。6μlのRNAを使用して、Superscript III First−Strand Synthesis SuperMix(Invitrogen 18080−400)及びオリゴdTプライマーを製造業者の指示に従って使用して逆転写反応によってcDNAを生成した。4μlのcDNAを用いてAccuPrime Supermix(Invitrogen 12344−040)により免疫グロブリン重鎖及び軽鎖可変領域(VH及びVL)を、重鎖についてはプライマーrbHCfinal.up及びrbHCfinal.doを使用し、軽鎖についてはプライマーrbLCfinal.up及びrbLCfinal.doを使用して(配列番号30から33)最終体積50μl中で増幅した。PCRの条件は以下の通りであった:94℃で5分間ホットスタート;94℃で20秒、70℃で20秒、68℃で45秒、及び68℃で7分間最終延長の35サイクル。
ウサギモノクローナル抗体の組換え発現のために、VH又はVLをコードするPCR産物を、オーバーハングクローニング法によりcDNAとして発現ベクターにクローニングした(RS Haun et al., Biotechniques (1992) 13, 515-518; MZ Li et al., Nature Methods (2007) 4, 251-256)。
ヒト及びカニクイザルT細胞を用いた機能活性アッセイ(Ca Flux)
CD3媒介カルシウムフラックスアッセイの確立
抗CD3 mAbの機能活性をスクリーニングするために、CD3陽性(Jurkat E6−1)及びCD3陰性(Jurkat RT3−T3.5)ヒトT細胞株を用いてカルシウムフラックスアッセイを確立した。アッセイは、96ウェルフォーマット(二次スクリーニング)又は384ウェルフォーマット(一次ハイスループットスクリーニング)において行った。
CD3陽性Jurkat E6−1細胞又はCD3陰性Jurkat RT3−T3.5を、ウェルあたり50μlの無血清培地(RPMI 1640/2mMのグルタミン/1mMのピルビン酸ナトリウム/10mMのHepes/0.1mMのNEAA中200,000細胞で黒壁透明底96ウェルプレート(BD Falcon)中に播種した。細胞にカルシウム感受性色素(FLIPR(登録商標)Calcium 5 Assay Kit、Molecular Devices)をロードした。色素の貯蔵溶液を製造業者の指示に従って調製した。使用直前にプロペネシドを添加し、50μl/ウェルの希釈色素を細胞に添加した(プロベネシドの最終濃度は2.5mM/ウェルであろう)。効率的なローディングのために、細胞を暗所で室温で2時間色素と共にインキュベートした。続いて、20μlのウサギ抗CD3mAb(ウサギB細胞上清)又はキメラV9mAb、ウサギ免疫グロブリン定常領域及びヒト化抗CD3 mAb V9の可変領域からなるキメラ抗CD3抗体の連続希釈物を添加することによって細胞を刺激した。非特異的ポリクローナルウサギIgGは陰性対照として役割を果たした。抗CD3誘導カルシウムフラックスの動力学を、30秒の時間間隔で7.5−10分間、蛍光(485nm ex./530nm em.)を測定することによってモニターした。キメラV9 mAbによって誘導されたカルシウムフラックスを図6Aに示す。このデータは、このアッセイが、最小濃度約37ng/mlでアゴニスト抗CD3 mAbの検出を可能にすることを示している(アッセイ中の最終mAb濃度:6.2ng/ml;シグナル−ノイズ比>2)。キメラV9 mAbは、CD3陰性Jurkat RT3−T3.5細胞においてではなく、CD3陽性Jurkat E6−1細胞においてのみカルシウム動員を誘導し、その作用のCD3依存性を実証した。同様に、細胞を非特異的ウサギIgGで処理した場合、カルシウムフラックスは観察されなかった。
CD3陽性Jurkat E6−1細胞又はCD3陰性Jurkat RT3−T3.5を、ウェルあたり25μlの無血清培地(RPMI 1640/2mMのグルタミン/1mMのピルビン酸ナトリウム/10mMのHepes/0.1mMのNEAA中100,000細胞で黒壁透明底384ウェルプレート(Corning)中に播種した。細胞にカルシウム感受性色素(FLIPR(登録商標)Calcium 5 Assay Kit、Molecular Devices)をロードした。色素の貯蔵溶液を製造業者の指示に従って調製した。使用直前にプロペネシドを添加し、25μl/ウェルの希釈色素を細胞に添加した(プロベネシドの最終濃度は2.5mM/ウェルであろう)。効率的なローディングのために、細胞を暗所で室温で2時間色素と共にインキュベートした。続いて、10μlのウサギ抗CD3mAb(ウサギB細胞上清)又はキメラV9mAb、ウサギ免疫グロブリン定常領域及びヒト化抗CD3 mAb V9の可変領域からなるキメラ抗CD3抗体の連続希釈物を添加することによって細胞を刺激した。非特異的ポリクローナルウサギIgGは陰性対照として役割を果たした。抗CD3誘導カルシウムフラックスの動力学を、30秒の時間間隔で7.5−10分間、蛍光(485nm ex./530nm em.)を測定することによってモニターした。キメラV9 mAbによって誘導されたカルシウムフラックスを図7Aに示す。これらのデータは、このアッセイが、最小濃度約25ng/mlでアゴニスト抗CD3 mAbの検出を可能にすることを示している(アッセイ中の最終mAb濃度:4.2ng/ml;シグナル−ノイズ比>2)。キメラV9 mAbは、CD3陰性Jurkat RT3−T3.5細胞においてではなく、CD3陽性Jurkat E6−1細胞においてのみカルシウム動員を誘導しており、CD3依存性を実証した。同様に、細胞を非特異的ウサギIgG(アイソタイプ対照)で処理した場合、カルシウムフラックスは観察されなかった。
ヒト及びカニクイザルCD3タンパク質並びにペプチドへの結合
抗CD3抗体のヒト及びカニクイザルCD3タンパク質並びにペプチドへの結合をELISAによって決定した。ビオチン化標的タンパク質及びペプチドを、384ウェルのストレプトアビジン被覆マイクロプレート(MaxiSorb;MicroCoat、DE、Cat.No.11974998/MC1099)上、DPBS(PAN Biotech GmbH、DE、Cat.No.P0436500)中25μl/ウェルで4℃で一晩インキュベートすることにより固定化した。標的濃度は、1000ng/mlの濃度で固定化されたカニクイザルCD3ペプチド−1−22及びヒトCD3ペプチド77−96を除いて、表8に記載の全てのタンパク質及びペプチドについて250ng/mlであった。使用したペプチドは、リンカーを介してペプチドのN末端又はC末端の何れかに結合したビオチンとともに生成された。標的結合ELISAのために、N及びC末端ビオチン化ペプチドをマイクロプレート上での固定化のために1:1の比で混合し(表8)、別々に使用した(表8)。1X PBS(Roche、Cat.No.1666789)中の0.1%Tween20(USB、Cat.No.20605)を用いた3回の洗浄工程の後、組換え抗CD3抗体(25μl/ウェル、1X PBS中の0.5%BSA(ウシ血清アルブミン画分V、脂肪酸フリー、Roche、#10735078001)、0.05%Tween20)が添加され、オービタルシェーカーを室温で1時間インキュベートした後、洗浄緩衝液(90μl/ウェル)による3回の洗浄工程が続いた。抗体は、室温で1時間、1X PBS(w/0.5%BSA、0.05%Tween20)中で1:5000に希釈した、ペルオキシダーゼ結合型、種特異的抗ウサギIgG、ロバ由来のF(ab’)2断片、GE、Cat.No.NA 9340)により検出された。検出抗体を洗浄緩衝液で4回の洗浄工程により除去し、TMB基質(TMB溶液、Roche)の添加によってシグナルを発色させた。吸光度を、一定時間間隔後にEX370nm/EM492nmで読み取った。
生成した抗CD3抗体の細胞結合を評価するために、ヒト及びカニクイザルの増殖型T細胞を用いたFACSに基づく結合アッセイを実施した。簡潔には、凍結したT細胞(実施例2)を解凍し、遠心分離によって凍結培地から分離し、Jurkat細胞培地に2×106細胞/mlで懸濁した。50μlの細胞アリコートを抗CD3抗体の連続希釈物(BD FACS緩衝液中10μg/ml−0.01μg/ml)と共に4℃で1時間インキュベートした。BD FACS緩衝液で洗浄した後、細胞はその起源に応じて、4℃で1時間、BD FACS緩衝液中に10μg/mlのAlexa488標識抗ウサギIgG H+L(Invitrogen 34732A)又は抗マウスIgG H+L(Invitrogen 65E1−1)又は抗ヒトIgG H+L(Invitrogen A11013)により染色された。洗浄及び遠心分離後、染色された細胞のMFIシグナルを、BD Biosciences FACSCantoフローサイトメーターによって分析した。
結合エピトープの特徴付け
N及びC末端ビオチン化ヒト及びカニクイザルCD3ペプチドへの抗CD3抗体クローン645の結合を、上記のようにELISAによって決定した(実施例5)。
抗CD3e抗体の結合親和性KD値
ヒト及びカニクイザルCD3eに対するクローン645抗体の結合を、BIACORE T100装置(GE Healthcare)を用いた表面プラズモン共鳴によって調べた。捕捉系(10μg/mlヤギ抗ウサギIgG Fc断片特異的;注文コード:111−005−046;Jackson Immuno Research)の約2000共鳴単位(RU)をGE Healthcareによって供給されるアミンカップリングキットを用いてpH5.0でCM4チップ(GE Healthcare、BR−1005−34)に結合させた。固定化のためのランニング緩衝液は、HBS−N pH7.4(10mMのHEPES、150mMのNaCl、pH7.4、GE Healthcare、BR−1006−70)であった。追跡される動力学アッセイのために、ランニング及び希釈緩衝液はHBS−P pH7.4(10mMのHEPES、150mMのNaCl、0.05%界面活性剤P20、pH7.4、GE Healthcare、BR−1006−71)とした。フローセルを25℃に設定し、試料ブロックを12℃に設定し、ランニング緩衝液で2回刺激した。クローン645抗体は、1μg/mlの溶液を10μl/分の流速で60秒間注入することによって捕捉した。会合は、溶液中の様々な濃度のヒトCD3e(ストーク)Fc−Knob−CD3d(ストーク)FcHole又はカニクイザルCD3e(ストーク)Fc−Knob−CD3d(ストーク)FcHoleの注入を、1350nMで開始し、続いて1回1:1.5希釈し、更に1:3希釈して、30μl/分の流速で180秒間の注入によって測定された。解離相を最高300秒間モニターし、試料溶液からランニング緩衝液に切り替えることによってトリガーした。表面を、10μl/分の流速で60秒間、グリシンpH1.7溶液の2回の連続注入で洗浄することによって再生した。バルク屈折率の差は、ヤギ抗ウサギIgG Fc表面から得られた応答を差し引くことによって補正した。ブランク注入もまた減算される(=ダブルリファレンス)。KD及び他の動力学パラメーターの計算のために、ラングミュアの1:1モデルを使用した。
Claims (1)
- 配列番号02のヒトCD3イプシロンに特異的に結合し、かつ配列番号01のポリペプチドに特異的に結合するヒト カニクイザル交差反応性抗体であり、ここで、ヒト カニクイザル交差反応性抗体がヒト及びカニクイザルT細胞に特異的に結合し、かつヒトT細胞を活性化し、
抗体は、
(a)配列番号04又は配列番号05のアミノ酸配列を含むHVR−H1、
(b)配列番号06から配列番号08のいずれか1つのアミノ酸配列を含むHVR−H2、
(c)配列番号09のアミノ酸配列を含むHVR−H3、
(d)配列番号10又は配列番号11のアミノ酸配列を含むHVR−L1、
(e)配列番号12のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び
(f)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L3
を含む、ヒト カニクイザル交差反応性抗体。
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