JP6736816B2

JP6736816B2 - ピリジンカルボキサミド誘導体、それらの製造方法およびそれらの医薬用途

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Publication number: JP6736816B2
Application number: JP2017528783A
Authority: JP
Inventors: リ、シン; ドン、チン; スン、ピアオヤン
Original assignee: Jiangsu Hengrui Medicine Co Ltd; Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Hengrui Medicine Co Ltd; Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2014-12-08
Filing date: 2015-11-10
Publication date: 2020-08-05
Anticipated expiration: 2035-11-10
Also published as: RU2017121460A3; AU2015361614A1; US20190152959A1; KR20170090477A; US20170342059A1; RU2694899C9; RU2694899C2; US10442794B2; US10364234B2; CN105980379B; WO2016091042A1; TWI718113B; AU2015361614B2; EP3231802A1; MX2020011818A; EP3231802B1; MX2017006536A; CN105980379A; CA2966788A1; RU2017121460A

Description

本発明は、ピリジンカルボキサミド誘導体、それらの製造方法およびそれらを含有する医薬組成物、並びに治療剤として、特に腎髄質外部カリウムチャンネル（ROMK）の阻害剤としてのそれらの使用および高血圧症や心不全などの過剰の塩や水分の保持から生じる疾患の治療および/または予防のための薬物の製造におけるそれらの使用に関する。

腎臓の塩再吸収の増加は、高血圧のリスクを引き起こす可能性がある。逆に、腎臓の再吸収機能の阻害は、利尿や降圧効果をもたらす尿の***を促進することができる。一般的な利尿薬は、チアジド系利尿薬であり、米国において第一選択の降圧薬であって、それらは主にNa⁺-Cl^-輸送体に作用する。ループ利尿薬は、腎機能が障害された患者により効果的であり、Na⁺-K⁺-2Cl^-輸送タンパク質を介して役割を果たす。しかしながら、それら両者は、低カリウム血症（症状：脱力感、疲労、筋けいれん、便秘、および不整脈などの心臓のリズムの問題）の原因となり、病的状態のリスクや循環器疾患の死亡率を増大させ得る。

腎髄質外部カリウム（ROMK）チャンネルは、また内向き整流性カリウムチャンネル1.1(Kir1.1)としても知られている。ROMKカリウムチャンネルは、腎臓の太い上行脚（TAL）の頂端膜の透過性を通してNa+-K+-2Cl-共^-輸送タンパク質NKCC2（NaCl輸送に関与）と共働し、カリウムの再吸収を調整する。ROMKは、腎臓の分泌チャンネルと直接関連していることが見いだされた。ROMK遺伝子をノックアウトすると、マウスのTALおよびCCD 35-pSイオンチャンネルの欠失と他のK+チャンネルの欠失が生じる。バーター症候群は、腎臓における塩の大量欠失、低カリウム血症、および低血圧を特徴とする常染色体劣性遺伝疾患である。バーター症候群は、主としてROMKまたはNa+-K+-2Cl-共^-輸送タンパク質の変異によって起こる。違いは、バーター症候群の低カリウム血症はNa+-K+-2Cl-共^-輸送タンパク質の変異による場合と比べてROMKの変異ではより軽度に起こるということである。要約すると、ROMK機能の阻害は、Na+-K+-2Cl-共^-輸送タンパク質の塩再吸収機能を効果的に阻害し、尿の***を促進して、これにより低カリウム血症を起こすことなく、利尿や降圧効果をもたらすことができる。

WO2010129379 WO2012058134 WO2012058116 WO2012058134 WO2013066714 WO2013028474 WO2014085210 WO2014018764 WO2014015495 WO2014085210 WO2013039802 WO2013062892 WO2012058116

現在、特許文献１〜１３などの多くのROMK阻害剤が開示されているが、より良いhERG選択性を有する多くの化合物を開発する必要がある。本発明は、極性基を付加した一般式（I）で表される一連の新規化合物を提供し、これらはClogPを減少させ、hERG選択性を高めて、より安全であり、ROMK阻害活性を維持している。

本発明は、式（I）の化合物、またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩に関する：

式中
R¹は、アルキルであり、該アルキルはハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、カルボキシルおよびカルボン酸エステルから成る群から選択される１以上の基で任意にさらに置換されていてもよく；
R²は、水素、アルキル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、アルコキシ、シクロアルキルおよびヘテロシクリルから成る群から選択され、該アルキル、アルコキシ、シクロアルキルまたはヘテロシクリルはアルキル、ハロゲン、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、カルボキシルおよびカルボン酸エステルから成る群から選択される１以上の基で任意にさらに置換されていてもよく；
R^３は、次の基：

から選択され；
R^４およびR^５は、それぞれ独立して水素、アルキル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、アルコキシ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールおよびヘテロアリールから成る群から選択され：
R^６は、水素、アルキルおよびハロゲンから選択され；
ｎは、０、１または２である。

本発明の好ましい実施態様において、式（I）の化合物、またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩で、R¹はアルキルであり、該アルキルはハロゲン、ヒドロキシルおよびアルコキシから成る群から選択される１以上の基で任意にさらに置換されていてもよく；R¹は、好ましくはC_1-6アルキルであり、より好ましくはメチル、エチルおよびプロピルから成る群から選択される。

本発明の好ましい実施態様において、式（I）の化合物、またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩で、R^４はアルキルであり、R^５は水素である。

本発明の他の好ましい実施態様において、式（I）の化合物、またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩は、式（II）の化合物、またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩である：

式中、R¹, R², R⁴およびｎは、式（I）で定義したとおりである。

本発明の他の好ましい実施態様において、式（I）の化合物、またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩は、式（III）の化合物、またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩である：

式中、R¹, R², R⁴およびｎは、式（I）で定義したとおりである。

本発明の他の好ましい実施態様において、式（I）の化合物、またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩は、式（IV）の化合物、またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩である：

式中、R¹, R², R⁴およびｎは、式（I）で定義したとおりである。

本発明の他の好ましい実施態様において、式（I）の化合物、またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩は、式（V）の化合物、またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩である：

式中、R¹, R², R⁴およびｎは、式（I）で定義したとおりである。

本発明の他の好ましい実施態様において、式（I）の化合物、またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩は、式（VI）の化合物、またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩である：

式中、R¹, R², R⁴およびｎは、式（I）で定義したとおりである。

本発明の代表的化合物としては、これらに限定されないが、
またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩が挙げられる。

本発明は、さらに式（I）の化合物の合成中間体として式（IA）の化合物、またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩を提供する：

式中、
R¹は、アルキルであり、該アルキルはハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、カルボキシルおよびカルボン酸エステルから成る群から選択される１以上の基で任意にさらに置換されていてもよく；
R²は、水素、アルキル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、アルコキシ、シクロアルキルおよびヘテロシクリルから成る群から選択され、該アルキル、アルコキシ、シクロアルキルまたはヘテロシクリルはアルキル、ハロゲン、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、カルボキシルおよびカルボン酸エステルから成る群から選択される１以上の基で任意にさらに置換されていてもよく；
ｎは、０、１または２であり；
該化合物は式（I）の化合物、またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩の製造において中間体として使用することができる。

本発明の他の好ましい実施態様において、式（IA）の化合物、またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩は、式（IVA）の化合物、

またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩であり；式（IV）の化合物、またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩の製造において中間体として使用することができ；式中、R¹, R²およびｎは、式（IA）で定義したとおりである。

代表的な式（IA）の化合物としては、これらに限定されないが、
またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩が挙げられる。

他の態様において、本発明は、

（式中、R¹~R³およびｎは一般式（I）で定義したとおりである。）
式（IA）の化合物を式（IB）の置換ベンゾフラン誘導体と、好ましくは(R)-4-メチル-5-(オキシラン-2-イル)イソベンゾフラン-1(3H)-オンと加熱して、式（I）の化合物を得る：
というステップを含む、式（I）の化合物、またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩を製造する方法を提供する。

本発明の他の態様は、式（I）の化合物、またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩の治療上の有効量、および薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含有する医薬組成物に関する。

本発明の他の態様は、ROMK阻害剤の製造における、式（I）の化合物、またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩、またはそれらを含有する医薬組成物の使用に関する。

本発明の他の態様は、高血圧症および/または心不全の治療または予防のための薬剤の製造における、式（I）の化合物、またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩、またはそれらを含有する医薬組成物の使用に関する。

本発明の他の態様は、ROMK介在性疾患の治療または予防のための薬剤の製造における、式（I）の化合物、またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩、またはそれらを含有する医薬組成物の使用に関し、該疾患は、好ましくは肝硬変、急性および慢性腎不全、ネフローゼ症候群、肺高血圧症、循環器疾患、心筋梗塞、脳卒中、心不全、肺筋緊張亢進、アテローム性動脈硬化症および腎臓結石から成る群から選択される。

本発明の他の態様は、ROMK阻害剤として使用するための、式（I）の化合物、またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩、またはそれらを含有する医薬組成物に関する。

本発明の他の態様は、高血圧症および/または心不全の治療または予防における使用のための、式（I）の化合物、またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩、またはそれらを含有する医薬組成物に関する。

本発明の他の態様は、ROMK介在性疾患の治療または予防における使用のための、式（I）の化合物、またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩、またはそれらを含有する医薬組成物に関し、該疾患は、好ましくは肝硬変、急性および慢性腎不全、ネフローゼ症候群、肺高血圧症、循環器疾患、心筋梗塞、脳卒中、心不全、肺筋緊張亢進、アテローム性動脈硬化症および腎臓結石から成る群から選択される。

本発明の他の態様は、式（I）の化合物、またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩、またはそれらを含有する医薬組成物の治療上の有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む、ROMKを阻害する方法に関する。

本発明の他の態様は、式（I）の化合物、またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩、またはそれらを含有する医薬組成物の治療上の有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む、高血圧症および/または心不全の治療または予防の方法に関する。

本発明の他の態様は、式（I）の化合物、またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩、またはそれらを含有する医薬組成物の治療上の有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む、ROMK介在性疾患または障害の治療または予防の方法に関し、該疾患または障害は、好ましくは肝硬変、急性および慢性腎不全、ネフローゼ症候群、肺高血圧症、循環器疾患、心筋梗塞、脳卒中、心不全、肺筋緊張亢進、アテローム性動脈硬化症および腎臓結石から成る群から選択される。

活性成分を含有する医薬組成物は経口投与に適した形態、例えば、錠剤、トローチ剤、口内錠、水性または油性懸濁剤、分散性粉末または顆粒剤、乳剤、ハードまたはソフトカプセル剤、またはシロップ剤またはエリキシル剤であってもよい。経口用の組成物は、技術分野で公知の医薬組成物の製造方法に従って製造することができる。そのような組成物は、気持ちがよくて美味な医薬製剤を提供するために、甘味剤、芳香剤、着色剤および保存剤から成る群から選択される１以上の添加剤を含んでいてもよい。錠剤は、活性成分と錠剤の製造に適した非毒性の薬剤的に許容される賦形剤を含有する。これらの賦形剤は、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、乳糖、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウムなどの不活性な賦形剤；結晶セルロース、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム、コーンスターチまたはアルギン酸などの造粒剤および崩壊剤；デンプン、ゼラチン、ポリビニルピロリドンまたはアラビアゴムなどの結合剤；およびステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクなどの滑沢剤であってもよい。錠剤はコーティングしなくても、または公知の技術でコーティングして薬物の味をマスクし、または消化管での崩壊と活性成分の吸収を遅らせ、それにより長時間にわたる持続放出を提供してもよい。例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはヒドロキシプロピルセルロースなどの水溶性の味をマスクする物質が用いられ、またはエチルセルロースまたは酢酸酪酸セルロースなどの時間を延長させる物質が用いられる。

経口製剤は、また活性成分が炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリンなどの不活性な固形希釈剤と混合されたハードゼラチンカプセル、または活性成分がポリエチレングリコールなどの水溶性担体や例えばピーナッツオイル、流動パラフィン、またはオリーブ油などのオイル媒体と混合されたソフトゼラチンカプセルとして提供してもよい。

水性懸濁剤は、水性懸濁剤の製造に適した賦形剤との混合物で活性成分を含んでいる。そのような賦形剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドンおよびアラビアゴムなどの懸濁剤；レシチンなどの天然起源のリン脂質、またはステアリン酸ポリオキシエチレンなどの脂肪酸とのアルキレンオキシドの縮合生成物、またはヘプタデカエチレンオキシセタノールなどの長鎖脂肪族アルコールとのエチレンオキシドの縮合生成物、またはポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートなどの脂肪酸とヘキシトールから誘導した部分エステルとエチレンオキシドの縮合生成物、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエートなどの脂肪酸とヘキシトールから誘導した部分エステルとのエチレンオキシドの縮合生成物、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートなどの脂肪酸とヘキシトール無水物から誘導した部分エステルとのエチレンオキシドの縮合生成物である分散剤または湿潤剤である。水性懸濁剤は、またエチルパラベンまたはｎ−プロピルパラベンなどの１以上の保存剤、１以上の着色剤、１以上の香味料、およびショ糖、サッカリンまたはアスパルテームなどの甘味料を含んでいてもよい。

油性懸濁剤は、活性成分をピーナッツオイル、オリーブオイル、ゴマ油またはヤシ油などの植物油に、または流動パラフィンなどの鉱物油に懸濁させて製造される。油性懸濁剤は、ミツロウ、固形パラフィンまたはセチルアルコールなどの増粘剤を含んでいてもよい。前述の甘味料や香味料は味の良い製剤を提供するために添加してもよい。これらの組成物は、ブチル化ヒドロキシアニソールやα-トコフェロールなどの抗酸化剤を添加して保存してもよい。

水溶性懸濁液の製造に適した分散性粉末または顆粒に水を加えて、活性成分および分散剤、湿潤剤、懸濁剤または１以上の保存剤を提供できる。適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤は、既に上述したもので例示される。甘味料、香味料および着色剤などの更なる賦形剤も添加してもよい。これらの組成物はアスコルビン酸などの抗酸化剤を添加して保存してもよい。

本発明の医薬組成物は、また水中油型乳剤の形態であってもよい。油相はオリーブオイルまたはピーナッツオイルなどの植物油、または流動パラフィンなどの鉱物油、またはそれらの混合物である。適切な乳化剤は、大豆レシチンなどの天然由来のリン脂質、ソルビタンモノオレエートなどの脂肪酸とヘキシトール無水物から誘導したエステルまたは部分エステル、およびポリオキシエチレンソルビトールモノオレエートなどの該部分エステルのエチレンオキシドとの縮合生成物である。乳剤は、甘味料、芳香剤、保存剤および抗酸化剤も含んでいてもよい。シロップ剤およびエリキシル剤は、グリセリン、プロピレングリコール、ソルビトールまたはショ糖などの甘味料と製剤化してもよい。そのような製剤は、また粘滑剤、保存剤、着色剤および抗酸化剤も含んでいてもよい。

医薬組成物は、無菌の注射用水溶液の形態でもよい。用いることができる許容される溶剤または溶媒は、水、リンゲル液および等張の塩化ナトリウム溶液である。無菌の注射用製剤は、また活性成分が油相に溶解した無菌の注射用水中油型マイクロエマルションであってもよい。例えば、活性成分が先ず大豆油とレシチンの混合物に溶解し、次いでオイル溶液を水とグリセリンの混合物に入れ、そしてマイクロエマルションを形成させる。注射用溶液またはマイクロエマルションは、局所迅速投与により個々の血流中に導入してもよい。または、本発明化合物の一定の循環濃度を維持するような方法で溶液またはマイクロエマルションを投与するのが有利である。そのような一定の濃度を維持するために、持続静脈輸送デバイスが用いられる。そのようなデバイスの例としては、Deltec CADD-PLUS. TM. 5400静脈ポンプがある。

医薬組成物は、筋肉内または皮下投与のための無菌の注射用水性または油性懸濁液の形態であってもよい。そのような懸濁液は、前述の適当な分散または湿潤剤および懸濁剤を用いて公知技術に従って製造できる。無菌の注射用製剤は、また非毒性で非経口的に許容される希釈剤または溶媒の無菌の注射用溶液または懸濁液、例えば、1,3-ブタンジオールで調製した溶液であってもよい。さらに、無菌の不揮発性オイルが溶媒または懸濁媒体として容易に用いられている。この目的のために、合成モノまたはジグリセリドなどのブレンドした不揮発性オイルを用いることができる。さらに、オレイン酸のような脂肪酸を注射剤の製造に用いることができる。

本発明の化合物は、直腸投与のための坐剤の形態で投与してもよい。それらの医薬組成物は、薬物を、常温では固体であるが直腸では液体であり、それ故直腸内で融解して薬物を放出する、適切な非刺激性賦形剤と混合することによって製造できる。そのような物質としては、カカオバター、グリセリンゼラチン、水添植物油、ポリエチレングリコールと種々の分子量を持つポリエチレングリコールの脂肪酸エステルとの混合物が挙げられる。

薬物の用量は、これらに限られないが、以下の因子：特定化合物の活性、患者の年齢、体重、一般的な健康、挙動および食事、投与時間、投与ルート、***速度、併用薬剤などの種々の因子に依存することが当業者に知られている。さらに、治療様式、式（Ｉ）の化合物の１日量またはその薬学的に許容される塩のタイプなどのベストの治療が、伝統的な治療計画によって証明できる。

定義
特に言及しない限り、ここで用いた用語は以下の意味を有する。

「アルキル」とは、１〜２０個の炭素原子を持つ直鎖または分岐鎖基を含む飽和脂肪族炭化水素基、好ましくはＣ_１〜Ｃ_１０のアルキル、より好ましくはＣ_１〜Ｃ_６のアルキルである。代表例としては、これらに限定されないが、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、tert-ブチル、sec-ブチル、n-ペンチル、1,1-ジメチルプロピル、1,2-ジメチルプロピル、2,2-ジメチルプロピル、1-エチルプロピル、2-メチルブチル、3-メチルブチル、n-ヘキシル、1-エチル-2-メチルプロピル、1,1,2-トリメチルプロピル、1,1-ジメチルブチル、1,2-ジメチルブチル、2,2-ジメチルブチル、1,3-ジメチルブチル、2-エチルブチル、2-メチルペンチル、3-メチルペンチル、4-メチルペンチル、2,3-ジメチルブチル、n-ヘプチル、2-メチルヘキシル、3-メチルヘキシル、4-メチルヘキシル、5-メチルヘキシル、2,3-ジメチルペンチル、2,4-ジメチルペンチル、2,2-ジメチルペンチル、3,3-ジメチルペンチル、2-エチルペンチル、3-エチルペンチル、n-オクチル、2,3-ジメチルヘキシル、2,4-ジメチルヘキシル、2,5-ジメチルヘキシル、2,2-ジメチルヘキシル、3,3-ジメチルヘキシル、4,4-ジメチルヘキシル、2-エチルヘキシル、3-エチルヘキシル、4-エチルヘキシル、2-メチル-2-エチルペンチル、2-メチル-3-エチルペンチル、n-ノニル、2-メチル-2-エチルヘキシル、2-メチル-3-エチルヘキシル、2,2-ジエチルペンチル、n-デシル、3,3-ジエチルヘキシル、2,2-ジエチルヘキシルおよびそれらの分岐鎖異性体が挙げられる。より好ましくは、アルキル基は１〜６個の炭素原子を持つ低級アルキルである。代表例としては、これらに限定されないが、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、tert-ブチル、sec-ブチル、n-ペンチル、1,1-ジメチルプロピル、1,2-ジメチルプロピル、2,2-ジメチルプロピル、1-エチルプロピル、2-メチルブチル、3-メチルブチル、n-ヘキシル、1-エチル-2-メチルプロピル、1,1,2-トリメチルプロピル、1,1-ジメチルブチル、1,2-ジメチルブチル、2,2-ジメチルブチル、1,3-ジメチルブチル、2-エチルブチル、2-メチルペンチル、3-メチルペンチル、4-メチルペンチルおよび2,3-ジメチルブチルなどが挙げられる。該アルキル基は置換されていても、無置換であってもよい。置換されている場合、置換基はどの置換可能な位置で置換していてもよく、置換基は、好ましくはアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルアミノ、ハロゲン、チオール、ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルコキシ、複素環式アルコキシ、シクロアルキルチオ、ヘテロシクリルチオ、オキソ、アミノ、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、カルボキシルおよびカルボン酸エステルから成る群から独立して選択される１つ以上の基である。

「シクロアルキル」とは、飽和および／または部分的に不飽和の単環式または多環式炭化水素基で、３〜２０個の炭素原子、好ましくは３〜１２個の炭素原子、より好ましくは３〜１０個の炭素原子、最も好ましくは３〜６個の炭素原子を持つものである。単環式シクロアルキルの代表例としては、これらに限定されないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘキサジエニル、シクロヘプチル、シクロヘプタトリエニル、シクロオクチルなど、好ましくはシクロプロピルおよびシクロヘキセニルが挙げられる。多環式シクロアルキルには、スピロ環、縮合環または架橋環を持つシクロアルキルが含まれる。

「スピロシクロアルキル」とは、１個の共通の炭素原子（スピロ原子と呼ばれる。）を通じてつながっている環を持つ５〜２０員の多環式基であって、１つ以上の環は１つ以上の二重結合を含んでいてもよいが、環のどれも完全に共役したπ電子系を持たないものをいう。スピロシクロアルキルは、好ましくは６〜１４員、より好ましくは７〜１０員である。共通のスピロ原子の数によって、スピロシクロアルキルはモノスピロ、ジスピロまたはポリスピロのシクロアルキルに分けられる。好ましくはモノスピロまたはジスピロのシクロアルキルで、より好ましくは４員／４員、４員／５員、４員／６員、５員／５員または５員／６員のモノスピロのシクロアルキルである。スピロシクロアルキルの代表例としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる。

「縮合シクロアルキル」とは、５〜２０員の全て炭素の多環式基であって、系内の各環が隣接した一対の炭素原子を他の環と共有していて、１つ以上の環が１つ以上の二重結合を含んでいてもよいが、環のどれも完全に共役したπ電子系を持たないものをいう。縮合シクロアルキル基は、好ましくは６〜１４員、より好ましくは７〜１０員である。構成する環の数によって、縮合シクロアルキルは二環式、三環式、四環式または多環式の縮合シクロアルキルに分けられるが、好ましくは二環式または三環式の縮合シクロアルキルであり、より好ましくは５員／５員または５員／６員の二環式の縮合シクロアルキルである。縮合シクロアルキルの代表例としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる。

「架橋シクロアルキル」とは、５〜２０員の全て炭素の多環式基であって、系内のそれぞれ二つの環が２個の連結していない原子を共有しているものをいう。この環は１つ以上の二重結合を持っていてもよいが、完全に共役したπ電子系を持たない。架橋シクロアルキルは、好ましくは６〜１４員、より好ましくは７〜１０員である。構成する環の数によって、架橋シクロアルキルは架橋二環式、三環式、四環式または多環式に分けられるが、好ましくは二環式、三環式または四環式の架橋シクロアルキル、より好ましくは二環式または三環式の架橋シクロアルキルである。架橋シクロアルキルの代表例としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる。

該シクロアルキルはアリール、ヘテロアリールまたはヘテロシクリルに縮合していてもよく、ここでは親構造と結合する環はシクロアルキルである。代表例としては、これらに限定されないが、インダニル、テトラヒドロナフチルおよびベンゾシクロヘプチルなどが挙げられる。該シクロアルキルは任意に置換されていても、無置換であってもよい。置換されている場合、置換基は、好ましくはアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルアミノ、ハロゲン、チオール、ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルコキシ、複素環式アルコキシ、シクロアルキルチオ、ヘテロシクリルチオ、オキソ、アミノ、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、カルボキシルおよびカルボン酸エステルから成る群から独立して選択される１つ以上の基である。

「ヘテロシクリル」とは、３〜２０員の飽和および／または部分的に不飽和の単環式または多環式炭化水素基であって、環原子としてＮ、ＯおよびＳ（Ｏ）_ｍ（式中、ｍは０〜２の間から選択される整数である。）から成る群から選ばれる１個以上のヘテロ原子を有するが、環内に−Ｏ−Ｏ−、−Ｏ−Ｓ−または−Ｓ−Ｓ−はなく、残りの環原子が炭素原子であるものをいう。ヘテロシクリルは、好ましくは１〜４個のヘテロ原子を含み、３〜１２個の原子を有し；より好ましくは、１〜３個のヘテロ原子を含み、３〜１０個の原子を有し；最も好ましくは、１〜２個のヘテロ原子を含み、５〜６個の原子を有する。単環式ヘテロシクリルの代表例としては、これらに限定されないが、ピロリジニル、ピペリジル、ピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ホモピペラジニル、ピラニルおよびテトラヒドロフラニルなどが挙げられる。多環式ヘテロシクリルには、スピロ環、縮合環または架橋環を持つヘテロシクリルが含まれる。

「スピロヘテロシクリル」とは、１個の共通の原子（スピロ原子と呼ばれる。)を通じて結合している環を持つ５〜２０員の多環式ヘテロシクリルであって、該環は環原子としてＮ、ＯおよびＳ（Ｏ）_ｍ（式中、ｍは０〜２の間から選択される整数である。）から成る群から選ばれる１個以上のヘテロ原子を有し、残りの環原子は炭素原子であって、１つ以上の環は１つ以上の二重結合を含んでいてもよいが、環のどれも完全に共役したπ電子系を持たないものをいう。スピロヘテロシクリルは、好ましくは６〜１４員、より好ましくは７〜１０員である。共通のスピロ原子の数によって、スピロヘテロシクリルはモノ−スピロヘテロシクリル、ジ−スピロヘテロシクリルまたはポリ−スピロヘテロシクリルに分けられるが、好ましくはモノ−スピロヘテロシクリルまたはジ−スピロヘテロシクリルであり、より好ましくは４員／４員、４員／５員、４員／６員、５員／５員または５員／６員のモノ−スピロヘテロシクリルである。スピロヘテロシクリルの代表例としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる。

「縮合ヘテロシクリル」とは、５〜２０員の多環式ヘテロシクリル基であって、系内の各環が隣接した一対の原子を他の環と共有していて、１つ以上の環が１つ以上の二重結合を含んでいてもよいが、環のどれも完全に共役したπ電子系を持たず、そして該環は環原子としてＮ、ＯおよびＳ（Ｏ）_ｍ（式中、ｍは０〜２の間から選択される整数である。）から成る群から選ばれる１個以上のヘテロ原子を有し、残りの環原子は炭素原子であるものをいう。縮合ヘテロシクリルは、好ましくは６〜１４員、より好ましくは７〜１０員である。構成する環の数によって、縮合ヘテロシクリルは二環式、三環式、四環式または多環式の縮合ヘテロシクリルに分けられるが、好ましくは二環式または三環式の縮合ヘテロシクリルであり、より好ましくは５員／５員または５員／６員の二環式の縮合ヘテロシクリルである。縮合ヘテロシクリルの代表例としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる。

「架橋ヘテロシクリル」とは、５〜１４員の多環式ヘテロシクリル基であって、系内のそれぞれ二つの環が２つの連結していない原子を共有していて、該環は１つ以上の二重結合を持っていてもよいが、環のどれも完全に共役したπ電子系は持たず、そして該環は環原子としてＮ、ＯおよびＳ（Ｏ）_ｍ（式中、ｍは０〜２の間から選択される整数である。）から成る群から選ばれる１個以上のヘテロ原子を有し、残りの環原子は炭素原子であるものをいう。架橋ヘテロシクリルは、好ましくは６〜１４員、より好ましくは７〜１０員である。構成する環の数によって、架橋ヘテロシクリルは二環式、三環式、四環式または多環式の架橋ヘテロシクリルに分けられるが、好ましくは二環式、三環式または四環式の架橋ヘテロシクリル、より好ましくは二環式または三環式の架橋ヘテロシクリルである。架橋ヘテロシクリルの代表例としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる。

該ヘテロシクリルはアリール、ヘテロアリールまたはシクロアルキルに縮合していてもよく、ここでは親構造と結合する環はヘテロシクリルである。代表例としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる。

該ヘテロシクリルは任意に置換されていても、無置換であってもよい。置換されている場合、置換基は、好ましくはアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルアミノ、ハロゲン、チオール、ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルコキシ、複素環式アルコキシ、シクロアルキルチオ、ヘテロシクリルチオ、オキソ、アミノ、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、カルボキシルおよびカルボン酸エステルから成る群から独立して選択される１つ以上の基である。

「アリール」とは、６〜１４員の全て炭素の単環式環または多環式縮合環（即ち、系内の各環が隣り合った炭素原子対を系内の他の環と共有している。）であって、完全に共役したπ電子系を持っているものをいう。アリールは、好ましくは６〜１０員であり、より好ましくはフェニルおよびナフチル、最も好ましくはフェニルである。該アリールは、ヘテロアリール、ヘテロシクリルまたはシクロアルキルに縮合していてもよく、ここでは親構造と結合する環はアリールである。代表例としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる。

該アリールは任意に置換されていても、無置換であってもよい。置換されている場合、置換基は、好ましくはアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルアミノ、ハロゲン、チオール、ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルコキシ、複素環式アルコキシ、シクロアルキルチオ、ヘテロシクリルチオ、アミノ、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、カルボキシルおよびカルボン酸エステルから成る群から独立して選択される１つ以上の基である。

「ヘテロアリール」とは、５〜１４員のアリールであって、Ｏ、ＳおよびＮから成る群から選択される１〜４個のヘテロ原子を環原子とし、残りの環原子は炭素原子であるものをいう。ヘテロアリールは、好ましくは５〜１０員、より好ましくはフリル、チエニル、ピリジル、ピロリル、Ｎ−アルキルピロリル、ピリミジニル、ピラジニル、イミダゾリルおよびテトラゾリルなどの５員または６員のヘテロアリールである。該ヘテロアリールは、アリール、ヘテロシクリルまたはシクロアルキルと縮合してもよく、ここでは親構造と結合する環はヘテロアリールである。代表例としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる。

該ヘテロアリールは、任意に置換されていても、無置換であってもよい。置換されている場合、置換基は、好ましくはアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルアミノ、ハロゲン、チオール、ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルコキシ、複素環式アルコキシ、シクロアルキルチオ、ヘテロシクリルチオ、アミノ、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、カルボキシルおよびカルボン酸エステルから成る群から独立して選択される１つ以上の基である。

「アルコキシ」とは、−Ｏ−（アルキル）または−Ｏ−（無置換シクロアルキル）基をいい、ここで該アルキルは上記で定義した通りである。代表例としては、これらに限定されないが、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、シクロプロピルオキシ、シクロブチルオキシ、シクロペンチルオキシおよびシクロヘキシルオキシなどが挙げられる。該アルコキシルは任意に置換されていても、無置換であってもよい。置換されている場合、置換基は、好ましくはアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルアミノ、ハロゲン、チオール、ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルコキシ、複素環式アルコキシ、シクロアルキルチオ、ヘテロシクリルチオ、アミノ、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、カルボキシルおよびカルボン酸エステルから成る群から独立して選択される１つ以上の基である。

「ハロアルキル」とは、１つ以上のハロゲンで置換されたアルキルをいい、ここでアルキルは上記で定義した通りである。
「ヒドロキシ」とは、−ＯＨ基をいう。
「ヒドロキシアルキル」とは、ヒドロキシで置換されたアルキル基をいい、ここでアルキルは上記で定義した通りである。
「ハロゲン」とは、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素をいう。
「シアノ」とは、−ＣＮ基をいう。
「カルボキシル」とは、−Ｃ(Ｏ)ＯＨ基をいう。
「カルボン酸エステル」とは、−Ｃ(Ｏ)Ｏ(アルキル)または(シクロアルキル)基をいい、ここで該アルキルおよびシクロアルキルは上記で定義した通りである。

「任意の」または「任意に」は、続いて記載した出来事や状況が必ずしも生じなくてもよいことを意味する。その記載は出来事や状況の事例が生じても、生じなくてもよいことを含んでいる。例えば、「アルキルで任意に置換された複素環式基」は、アルキル基が存在しても、必ずしも存在しなくてもよいことを意味し、そのような記載は複素環式基がアルキルで置換されている場合と複素環式基がアルキルで置換されていない場合を含んでいる。

「置換された」とは、基内の１個以上の水素原子、好ましくは５個まで、より好ましくは１〜３個の水素原子が、対応する数の置換基でそれぞれ独立して置換されていることをいう。置換基はそれらの化学的に可能な位置にのみ存在することは言うまでもない。当業者は過剰な努力を払うことなく経験や理論により置換が可能かどうかについて判断することができる。例えば、フリーの水素を持つアミノまたはヒドロキシルが不飽和結合を持つ炭素原子（例えば、オレフィン）と結合している場合は不安定であろう。

「医薬組成物」とは、本発明に係る１つ以上の化合物またはそれらの生理学的／薬学的に許容される塩またはプロドラッグおよび生理学的／薬学的に許容される担体や賦形剤などの他の化学成分の混合物をいう。医薬組成物の目的は、生体への化合物投与および活性成分の吸収を容易にすることであり、これにより、生物活性を実現できる。

本発明の合成方法
発明の対象物を得るために、本発明は以下の合成の技術的解決法を適用する：
スキーム１
以下：

（式中、R¹~R³およびｎは一般式（I）で定義したとおりである。）
式（IA）の化合物を置換ベンゾフラン誘導体（IB）の化合物、好ましくは(R)-4-メチル-5-(オキシラン-2-イル)イソベンゾフラン-1(3H)-オンと有機溶媒中で加熱して、式（I）の化合物を得る：
のステップを含む、本発明の式（I）の化合物、またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩の製造方法。

スキーム２
以下：

（式中、R¹, R², R⁴およびｎは、一般式（II）で定義したとおりである。）
式（IA）の化合物を置換ベンゾフラン誘導体（IB）の化合物、好ましくは(R)-4-メチル-5-(オキシラン-2-イル)イソベンゾフラン-1(3H)-オンと有機溶媒中で加熱して、式（II）の化合物を得る：
というステップを含む、式（II）の化合物、またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩を製造する方法。

スキーム３
以下：

（式中、R¹, R², R⁴およびｎは、一般式（III）で定義したとおりである。）
式（IA）の化合物を置換ベンゾフラン誘導体（IB）の化合物、好ましくは(R)-4-メチル-5-(オキシラン-2-イル)イソベンゾフラン-1(3H)-オンと有機溶媒中で加熱して、式（III）の化合物を得る：
というステップを含む、式（III）の化合物、またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩を製造する方法。

スキーム４
以下：

（式中、R¹~R³およびｎは一般式（I）で定義したとおりである。）
式（IVA）の化合物を置換ベンゾフラン誘導体（IB）の化合物、好ましくは(R)-4-メチル-5-(オキシラン-2-イル)イソベンゾフラン-1(3H)-オンと有機溶媒中で加熱して、式（IV）の化合物を得る：
というステップを含む、式（IV）の化合物、またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩を製造する方法。

スキーム５
以下：

（式中、R¹, R², R⁴およびｎは、一般式（I）で定義したとおりである。）
式（IVA）の化合物を置換ベンゾフラン誘導体（IB）の化合物、好ましくは(R)-4-メチル-5-(オキシラン-2-イル)イソベンゾフラン-1(3H)-オンと有機溶媒中で加熱して、式（V）の化合物を得る：
というステップを含む、式（V）の化合物、またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩を製造する方法。

スキーム６
以下：

（式中、R¹, R², R⁴およびｎは、一般式（I）で定義したとおりである。）
式（IVA）の化合物を置換ベンゾフラン誘導体（IB）の化合物、好ましくは(R)-4-メチル-5-(オキシラン-2-イル)イソベンゾフラン-1(3H)-オンと有機溶媒中で加熱して、式（VI）の化合物を得る：
というステップを含む、式（VI）の化合物、またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩を製造する方法。

溶媒としては、これらに限定されないが、酢酸、メタノール、エタノール、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、ジメチルスルホキシド、1,4-ジオキサン、水、N,N-ジメチルホルムアミド、またはN,N-ジメチルアセトアミド、好ましくは非極性溶媒、より好ましくはアセトニトリルが挙げられる。

SDラットの尿量に関するROMK阻害剤の効果を示す図である。 SDラットの尿中ナトリウム***量に関するROMK阻害剤の効果を示す図である。 SDラットの尿中カリウム***量に関するROMK阻害剤の効果を示す図である。 SDラットの血清ナトリウムに関するROMK阻害剤の効果を示す図である。 SDラットの血清カリウムに関するROMK阻害剤の効果を示す図である。

本発明に関する詳細な説明

以下の実施例に基づいて本発明をさらに説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
以下の実施例で具体的に示されていない条件は、当業における一般的な条件または製造者が推奨する原料の条件である。起源が示されていない試薬は市場から一般に購入できる公知の試薬である。

化合物の構造は、核磁気共鳴(NMR)および／または質量分析(MS)で同定した。NMRはBruker AVANCE-400で測定した。溶媒として重水素化ジメチルスルホキシド（DMSO-d₆）、重水素化クロロホルム（CDC1₃）および重水素化メタノール（CD₃OD）を使用し、内部標準としてテトラメチルシラン(TMS)を使用した。NMRケミカルシフト(δ)は10^-6(ppm)で示した。
MSはFINNIGAN LCQAd (ESI) 質量分析計(メーカー：Thermo、型式：Finnigan LCQ advantage MAX)で測定した。
薄層シリカゲルクロマトグラフィー(TLC)には、Yantai Huanghai HSGF254 または Qingdao GF254シリカゲルプレートを使用した。TLCで使用したシリカゲルプレートの寸法は0.15 mm〜0.2 mmで、生成物の精製に使用したシリカゲルプレートの寸法は0.4 mm〜0.5 mmであった。
カラムクロマトグラフィーの担体として、Yantai Huanghai 200〜300メッシュのシリカゲルを使用した。
本発明の公知の原料は、当業における公知の合成法により調製できるか、ABCR GmbH & Co.KG、Acros Organics、Aldrich Chemical Company、Accela ChemBio Inc.またはDari Chemical Companyなどから購入できる。
特に明記しない限り、反応は窒素またはアルゴン雰囲気下で行った。
「窒素雰囲気」または「アルゴン雰囲気」は、反応フラスコが１Ｌの窒素またはアルゴンの風船を備えていることを意味する。
「水素雰囲気」は、反応フラスコが１Ｌの水素の風船を備えていることを意味する。
マイクロ波反応には、型式CEM Discover-S 908860のマイクロ波反応器を使用した。
特に明記しない限り、反応に用いた溶液は水溶液をいう。
特に明記しない限り、反応における反応温度は室温をいう。
室温は最適な反応温度であり、20℃〜30℃の範囲内にある。
反応の進行は薄層クロマトグラフィー(TLC)でモニターし、溶出系は、Ａ：ジクロロメタンとメタノール系、Ｂ：ｎ−ヘキサンと酢酸エチル系、Ｃ：石油エーテルと酢酸エチル系およびＤ：アセトンを含む。溶媒の容積比は化合物の極性に応じて調節できる。
化合物の精製に使用したカラムクロマトグラフィーおよび薄層クロマトグラフィーの溶出系は、Ａ：ジクロロメタンとメタノール系、Ｂ：ｎ−ヘキサンと酢酸エチル系、Ｃ：ｎ−ヘキサンとアセトン系、Ｄ：ｎ−ヘキサンおよびＥ：酢酸エチルを含む。溶媒の容積比は化合物の極性に応じて調節でき、また時には、トリエチルアミンのようなアルカリ性試薬または酸性試薬を少量に添加することもできる。

（R)-5-シアノ-N-(1-(2-ヒドロキシ-2-(4-メチル-1-オキソ-1,3-ジヒドロイソベンゾフラン-5-イル)エチル)ピペリジン-4-イル)-4-メトキシピコリンアミド

工程１
5-ブロモ-4-メトキシピコリン酸
5-ブロモ-4-メトキシピコリン酸メチル1a(250 mg, 1.01 mmol)を10 mLのメタノール、テトラヒドロフランおよび水の混合物(V:V:V=3:3:1)に溶解した後、水酸化ナトリウム(100 mg, 2.5 mmol)を加え、２時間攪拌した。反応溶液を減圧下で濃縮し、残渣に10 mLの水を加えた。得られた混合物を2M塩酸でpH 2に調整し、酢酸エチル(20 mL×3)で抽出した。有機層を飽和NaCl溶液(15 mL×2)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過した。ろ液を減圧下で濃縮し、白色固体の標記化合物5-ブロモ-4-メトキシピコリン酸1bの粗製品(200 mg)を得た。これをさらに精製せず、次の工程に用いた。
MS m/z (ESI): 229.9 [M-1].

工程２
tert-ブチル4-（5-ブロモ-4-メトキシピコリンアミド）ピペリジン-1-カルボキシラート
5-ブロモ-4-メトキシピコリン酸1b(150 mg, 0.65 mmol)、4-アミノ-1-tert-ブトキシカルボニルピペリジン(130 mg, 0.65 mmol)、1-エチル-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(190 mg, 1 mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(20 mg, 0.13 mmol)およびトリエチルアミン(0.15 mL, 1 mmol)を20 mLのN,N-ジメチルホルムアミドに溶解した。反応混合物を50℃に加熱し、50℃で６時間攪拌した。反応溶液を減圧下で濃縮し、溶出系Ｂを用いた薄層クロマトグラフィー(TLC)で残渣を精製し、淡黄色油の標記化合物tert-ブチル4-(5-ブロモ-4-メトキシピコリンアミド)ピペリジン-1-カルボキシラート1c(60 mg, 22.4%)を得た。
MS m/z (ESI): 414.1 [M+1].

工程３
tert-ブチル4-(5-シアノ-4-メトキシピコリンアミド)ピペリジン-1-カルボキシラート
tert-ブチル4-(5-ブロモ-4-メトキシピコリンアミド)ピペリジン-1-カルボキシラート1c(60 mg, 0.15 mmol)、シアン化亜鉛(26 mg, 0.22 mmol)およびテトラ(トリフェニルホスフィン)パラジウム(18 mg, 0.015 mmol)を1.5 mLのN,N-ジメチルアセトアミドに溶解した。135℃で混合物をマイクロ波で40分間攪拌した後、反応溶液を減圧下で濃縮した。溶出系Ｂを用いた薄層クロマトグラフィー(TLC)で残渣を精製し、無色油の標記化合物tert-ブチル4-(5-シアノ-4-メトキシピコリンアミド)ピペリジン-1-カルボキシラート1d(32 mg, 61.5%)を得た。
MS m/z (ESI): 361.2 [M+1].

工程４
5-シアノ-4-メトキシ-N-(ピペリジン-4-イル)ピコリンアミド
tert-ブチル4-(5-シアノ-4-メトキシピコリンアミド)ピペリジン-1-カルボキシラート1d(32 mg, 0.09 mmol)を5 mLのジクロロメタンに溶解し、1 mLのトリフルオロ酢酸を加えた。反応混合物を1.5時間攪拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、残渣に15 mLのメタノールに加え、飽和重炭酸ナトリウム溶液でpH 8に調整した。混合物を減圧下で濃縮した。溶出系Ａを用いた薄層クロマトグラフィー(TLC)で残渣を精製し、白色ペーストの標記化合物5-シアノ-4-メトキシ-N-(ピペリジン-4-イル)ピコリンアミド1e(23 mg, 100%)を得た。
MS m/z (ESI): 261.1 [M+1].

工程５
(R)-5-シアノ-N-(1-(2-ヒドロキシ-2-(4-メチル-1-オキソ-1,3-ジヒドロイソベンゾフラン-5-イル)エチル)ピペリジン-4-イル)-4-メトキシピコリンアミド
(R)-4-メチル-5-(オキシラン-2-イル)イソベンゾフラン-1(3H)-オン(25 mg, 0.09 mmol、特許出願“ WO2010129379 ”に開示された方法に従って調製したもの)および5-シアノ-4-メトキシ-N-(ピペリジン-4-イル)ピコリンアミド1e(23 mg, 0.09 mmol)を5 mLのアセトニトリルに溶解した。反応混合物を還流下で15時間攪拌した後、減圧下で濃縮した。溶出系Ａを用いた薄層クロマトグラフィー(TLC)で残渣を精製し、淡黄色固体の標記化合物(R)-5-シアノ-N-(1-(2-ヒドロキシ-2-(4-メチル-1-オキソ-1,3-ジヒドロイソベンゾフラン-5-イル)エチル)ピペリジン-4-イル)-4-メトキシピコリンアミド1(4.5 mg, 11.3%)を得た。
MS m/z (ESI): 450.2 [M+1].
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ 8.88 (s, 1H), 8.75 (d, 1H), 7.77 (s, 1H), 7.71-7.69 (m, 2H), 5.43-5.40 (m, 2H), 5.35 (s,1H), 5.08 (s , 1H), 4.09 (s, 3H), 3.78 (s, 1H), 2.95 (s, 3H), 2.38 (s, 1H), 2.27 (s, 3H), 2.25 (s, 2H), 1.72 (s, 4H).

(R)-5-シアノ-4-エトキシ-N-(1-(2-ヒドロキシ-2-(4-メチル-1-オキソ-1,3-ジヒドロイソベンゾフラン-5-イル)エチル)ピペリジン-4-イル)ピコリンアミド

工程１
6-クロロ-4-エトキシニコチノニトリル
4,6-ジクロロニコチノニトリル2a(500 mg, 2.89 mmol)を20 mLのテトラヒドロフランに溶解し、0℃以下で10 mLのナトリウムエトキシド(197 mg, 2.89 mmol)のエタノール溶液を滴下した。反応混合物を室温まで加熱し、さらに１時間攪拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、溶出系Ｂを用いた薄層クロマトグラフィー(TLC)で残渣を精製し、白色固体の標記化合物6-クロロ-4-エトキシニコチノニトリル2b(375 mg, 71%)を得た。
MS m/z (ESI): 183.1 [M+1].

工程２
tert-ブチル4-(5-シアノ-4-エトキシピコリンアミド)ピペリジン-1-カルボキシラート
オートクレーブに6-クロロ-4-エトキシニコチノニトリル2b(375 mg, 2.05 mmol)、4-アミノ-1-tert-ブトキシカルボニルピペリジン(422 mg, 2.05 mmol)、酢酸パラジウム(23 mg, 0.1 mmol)、1,3-ビス(ジフェニルフォスフィノ)プロパン(42 mg, 0.1 mmol)、トリエチルアミン(0.57 mL, 4.1 mmol)および20 mLのアセトニトリルをチャージした。得られた混合物を80℃および10バールの一酸化炭素の条件下で16時間反応させた。反応混合物をろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Ａを用いた薄層クロマトグラフィー(TLC)で残渣を精製し、白色固体の標記化合物tert-ブチル4-(5-シアノ-4-エトキシピコリンアミド)ピペリジン-1-カルボキシラート2c(645 mg, 84%)を得た。
MS m/z (ESI): 373.2 [M-1].

工程３
5-シアノ-4-エトキシ-N-(ピペリジン-4-イル)ピコリンアミド2,2,2-トリフルオロアセテート
tert-ブチル4-(5-シアノ-4-エトキシピコリンアミド)ピペリジン-1-カルボキシラート2c(100 mg, 0.27 mmol)を5 mLのジクロロメタンに溶解し、1 mLのトリフルオロ酢酸を加えた。反応混合物を1時間攪拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、黄色油の標記化合物5-シアノ-4-エトキシ-N-(ピペリジン-4-イル)ピコリンアミド2,2,2-トリフルオロアセテート2dの粗製品(110 mg)を得た。これを精製せずに、次の工程に用いた。

工程４
(R)-5-シアノ-4-エトキシ-N-(1-(2-ヒドロキシ-2-(4-メチル-1-オキソ-1,3-ジヒドロイソベンゾフラン-5-イル)エチル)ピペリジン-4-イル)ピコリンアミド
(R)-4-メチル-5-(オキシラン-2-イル)イソベンゾフラン-1(3H)-オン(50.7 mg, 0.27 mmol)および5-シアノ-4-エトキシ-N-(ピペリジン-4-イル)ピコリンアミド2,2,2-トリフルオロアセテート2dの粗製品(110 mg, 0.27 mmol)を15 mLのアセトニトリルに溶解し、炭酸ナトリウム(56.6 mg, 0.53 mmol)を加えた。反応混合物を80℃に加熱し、48時間攪拌した。反応混合物をろ過し、減圧下で濃縮した。溶出系Ａを用いた薄層クロマトグラフィー(TLC)で残渣を精製し、淡黄色固体の標記化合物(R)-5-シアノ-4-エトキシ-N-(1-(2-ヒドロキシ-2-(4-メチル-1-オキソ-1,3-ジヒドロイソベンゾフラン-5-イル)エチル)ピペリジン-4-イル)ピコリンアミド2(50 mg, 40%)を得た。
MS m/z (ESI): 465.2 [M+1].
¹H NMR (400 MHz, CD₃OD): δ 8.89 (s, 1H), 8.74 (d, 1H), 7.73 (s, 1H), 7.65 (s, 2H), 5.41 (d, 2H), 5.09 (br, 1H), 4.41 (d, 2H), 3.71-3.85 (m, 2H), 2.95 (br, 2H), 2.41-2.55 (m, 2H), 2.31 (s, 3H), 2.12-2.27 (m, 2H), 1.57-1.81 (m, 4H), 1.40 (t, 3H).

(R)-5-シアノ-4-(2-フルオロエトキシ)-N-(1-(2-ヒドロキシ-2-(4-メチル-1-オキソ-1,3-ジヒドロイソベンゾフラン-5-イル)エチル)ピペリジン-4-イル)ピコリンアミド

工程１
6-クロロ-4-(2-フルオロエトキシ)ニコチノニトリル
2-フルオロエタノール(150 mg, 2.34 mmol)を10 mLのテトラヒドロフランに溶解し、水素化ナトリウム(281 mg, 7.02 mmol)を加えた。得られた混合物1時間攪拌した。4,6-ジクロロニコチノニトリル2a(405 mg, 2.34 mmol)を25 mLのテトラヒドロフランに溶解し、0℃以下で反応混合物に滴下した。反応混合物を室温まで加熱し、１時間攪拌した。1 mLの水で反応混合物を急冷させ、減圧下で濃縮した。溶出系Ｂを用いた薄層クロマトグラフィー(TLC)で残渣を精製し、白色固体の標記化合物6-クロロ-4-(2-フルオロエトキシ)ニコチノニトリル3a(210 mg, 45%)を得た。
MS m/z (ESI): 201.1 [M+1].

工程２
tert-ブチル4-(5-シアノ-4-(2-フルオロエトキシ)ピコリンアミド）ピペリジン-1-カルボキシレート
オートクレーブに6-クロロ-4-(2-フルオロエトキシ)ニコチノニトリル3a(210 mg, 1.05 mmol)、4-アミノ-1-tert-ブトキシカルボニルピペリジン(216 mg, 1.05 mmol)、酢酸パラジウム(12 mg, 0.05 mmol)、1,3-ビス(ジフェニルフォスフィノ)プロパン(22 mg, 0.05 mmol)、トリエチルアミン(0.29 mL, 2.1 mmol)および20 mLのセトニトリルをチャージした。得られた混合物を80℃および10バールの一酸化炭素の条件下で16時間反応させた。反応混合物をろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。溶出系Ｂを用いた薄層クロマトグラフィー(TLC)で残渣を精製し、白色固体の標記化合物tert-ブチル4-(5-シアノ-4-(2-フルオロエトキシ)ピコリンアミド）ピペリジン-1-カルボキシレート3b(140 mg, 34%)を得た。
MS m/z (ESI): 391.1 [M-1].

工程３
5-シアノ-4-(2-フルオロエトキシ)-N-(ピペリジン-4-イル)ピコリンアミド2,2,2-トリフルオロアセテート
tert-ブチル4-(5-シアノ-4-(2-フルオロエトキシ)ピコリンアミド)ピペリジン-1-カルボキシレート3b(70 mg, 0.18 mmol)を5 mLのジクロロメタンに溶解し、1 mLのトリフルオロ酢酸を加えた。反応混合物を１時間攪拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、黄色油の標記化合物5-シアノ-4-(2-フルオロエトキシ)-N-(ピペリジン-4-イル)ピコリンアミド2,2,2-トリフルオロアセテート3cの粗製品(80 mg)を得た。これを精製せずに、次の工程に用いた。

工程４
(R)-5-シアノ-4-(2-フルオロエトキシ)-N-(1-(2-ヒドロキシ-2-(4-メチル-1-オキソ-1,3-ジヒドロイソベンゾフラン-5-イル)エチル)ピペリジン-4-イル)ピコリンアミド
(R)-4-メチル-5-(オキシラン-2-イル）イソベンゾフラン-1(3H)-オン(34 mg, 0.18 mmol)および5-シアノ-4-(2-フルオロエトキシ)-N-(ピペリジン-4-イル)ピコリンアミド2,2,2-トリフルオロアセテート3cの粗製品(80 mg, 0.18 mmol)を20 mLのアセトニトリルに溶解し、炭酸ナトリウム(38 mg, 0.36 mmol)を加えた。反応混合物を80℃に加熱し、48時間攪拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、溶出系Ａを用いた薄層クロマトグラフィー(TLC)で残渣を精製し、白色固体の標記化合物(R)-5-シアノ-4-(2-フルオロエトキシ)-N-(1-(2-ヒドロキシ-2-(4-メチル-1-オキソ-1,3-ジヒドロイソベンゾフラン-5-イル)エチル)ピペリジン-4-イル)ピコリンアミド3(10 mg, 12%)を得た。
MS m/z (ESI): 481.2 [M-1]
¹H NMR (400 MHz, CD₃OD): δ 8.93 (s, 1H), 8.79 (d, 1H), 7.82 (s, 1H), 7.71 (d, 2H), 5.41 (d, 2H), 5.14 (br, 1H), 4.89 (t, 1H), 4.77 (t, 1H), 4.72 (t, 1H), 4.65 (t, 1H), 3.71-3.82 (m, 2H), 2.85-3.15 (m, 2H), 2.40-2.54 (m, 2H), 2.31 (s, 3H), 2.12-2.26 (m, 2H), 1.61-1.90 (m, 4H).

(R)-5-シアノ-4-(ジフルオロメトキシ)-N-(1-(2-ヒドロキシ-2-(4-メチル-1-オキソ-1,3-ジヒドロイソベンゾフラン-5-イル)エチル)ピペリジン-4-イル)ピコリンアミド

工程１
(2-ブロモ-5-クロロピリジン-4-イル)ボロン酸
2-ブロモ-5-クロロピリジン4a(2 g, 10.4 mmol)を40 mLのテトラヒドロフランに溶解した後、-78℃以下で7.8 mLの2Mリチウムジイソプロピルアミドを滴下した。得られた混合物を１時間攪拌した。ホウ酸トリイソプロピル(2.94 mg, 15.6 mmol)を加え、-78℃以下で反応混合物を30分間攪拌した。そして、反応混合物を室温まで加熱し、さらに16時間攪拌した。50 mLの4%水酸化ナトリウム溶液を加えた。混合物を30分間攪拌した。水層を分離し、氷-水浴の中で6M水酸化ナトリウム溶液を用いてpH 3〜4に調整した。その後、酢酸エチル(50 mL×2)で水層を抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過した。ろ液を減圧下で濃縮し、白色固体の標記化合物(2-ブロモ-5-クロロピリジン-4-イル)ボロン酸4bの粗製品(1.3 g, 53%)を得た。

工程２
2-ブロモ-5-クロロピリジン-4-オール
(2-ブロモ-5-クロロピリジン-4-イル)ボロン酸4b(1.3 g, 5.51 mmol)を40 mLのジクロロメタンに溶解し、過酸化水素(1.87 mL, 16.5 mmol)を加えた。得られた混合物を16時間攪拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、白色固体の標記化合物2-ブロモ-5-クロロピリジン-4-オール4cの粗製品(1 g, 88%)を得た。
MS m/z (ESI): 205.9/207.9 [M+1].

工程３
2-ブロモ-5-クロロ-4-(ジフルオロメトキシ)ピリジン
2-ブロモ-5-クロロピリジン-4-オール4cの粗製品(320 mg, 1.54 mmol)、2-クロロ-2,2-ジフルオロ酢酸ナトリウム(470 mg, 3.08 mmol)および炭酸カリウム(470 mg, 3.39 mmol)を5 mLのN,N-ジメチルアセトアミドに溶解した。反応混合物を120℃に加熱し、マイクロ波で1時間攪拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、溶出系Ｂを用いた薄層クロマトグラフィー(TLC)で残渣を精製し、無色油の標記化合物 2-ブロモ-5-クロロ-4-(ジフルオロメトキシ)ピリジン4d(950 mg, 60%)を得た。

工程４
tert-ブチル4-(5-クロロ-4-(ジフルオロメトキシ)ピコリンアミド)ピペリジン-1-カルボキシラート
オートクレーブに2-ブロモ-5-クロロ-4-(ジフルオロメトキシ)ピリジン4d(1.03 g, 3.99 mmol)、4-アミノ-1-tert-ブトキシカルボニルピペリジン(800 mg, 3.99 mmol)、酢酸パラジウム(45 mg, 0.2 mmol)、1,3-ビス(ジフェニルフォスフィノ)プロパン(82 mg, 0.2 mmol)、トリエチルアミン(1.1 mL, 7.98 mmol)および30 mLのアセトニトリルをチャージした。得られた混合物を80℃および10バールの一酸化炭素の条件下で16時間反応させた。反応混合物をろ過し、ろ液を減圧下で濃縮し、溶出系Ｂを用いた薄層クロマトグラフィー(TLC)で残渣を精製し、白色固体の標記化合物tert-ブチル4-(5-クロロ-4-(ジフルオロメトキシ)ピコリンアミド)ピペリジン-1-カルボキシラート4e(809 mg, 50%)を得た。
MS m/z (ESI): 404.1 [M-1].

工程５
tert-ブチル4-(5-シアノ-4-(ジフルオロメトキシ)ピコリンアミド）ピペリジン-1-カルボキシラート
tert-ブチル4-(5-クロロ-4-(ジフルオロメトキシ)ピコリンアミド）ピペリジン-1-カルボキシラート4e(100 mg, 0.25 mmol)、シアン化亜鉛(57.6 mg, 0.49 mmol)およびテトラ(トリフェニルホスフィン)パラジウム(88 mg, 0.07 mmol)を5 mLのN,N-ジメチルアセトアミドに溶解した。170℃で混合物をマイクロ波で30分間攪拌した。反応溶液を減圧下で濃縮し、溶出系Ｂを用いた薄層クロマトグラフィー(TLC)で残渣を精製し、白色固体の標記化合物tert-ブチル4-(5-シアノ-4-(ジフルオロメトキシ)ピコリンアミド)ピペリジン-1-カルボキシラート4f(83 mg, 85%)を得た。
MS m/z (ESI): 395.0 [M-1].

工程６
5-シアノ-4-(ジフルオロメトキシ)-N-(ピペリジン-4-イル)ピコリンアミド2,2,2-トリフルオロアセテート
tert-ブチル4-(5-シアノ-4-(ジフルオロメトキシ)ピコリンアミド)ピペリジン-1-カルボキシラート4f(250 mg, 0.63 mmol)を5 mLのジクロロメタンに溶解し、2 mLのトリフルオロ酢酸を加えた。反応混合物を１時間攪拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、黄色油の標記化合物5-シアノ-4-(ジフルオロメトキシ)-N-(ピペリジン-4-イル)ピコリンアミド2,2,2-トリフルオロアセテート4gの粗製品(540 mg)を得た。これを精製せずに、次の工程に用いた。
MS m/z (ESI): 297.2 [M+1]

工程７
(R)-5-シアノ-4-(ジフルオロメトキシ)-N-(1-(2-ヒドロキシ-2-(4-メチル-1-オキソ-1,3-ジヒドロイソベンゾフラン-5-イル)エチル)ピペリジン-4-イル)ピコリンアミド
(R)-4-メチル-5-(オキシラン-2-イル)イソベンゾフラン-1(3H)-オン(57.7 mg,0.3 mmol)、5-シアノ-4-(ジフルオロメトキシ)-N-(ピペリジン-4-イル)ピコリンアミド2,2,2-トリフルオロアセテート4gの粗製品(260 mg, 0.3 mmol)およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン(78.4 mg, 0.61 mmol)を3 mLのエタノールに溶解した。反応混合物を135℃に加熱し、マイクロ波で１時間攪拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、溶出系Ａを用いた薄層クロマトグラフィー(TLC)で残渣を精製し、白色固体の標記化合物(R)-5-シアノ-4-(ジフルオロメトキシ)-N-(1-(2-ヒドロキシ-2-(4-メチル-1-オキソ-1,3-ジヒドロイソベンゾフラン-5-イル)エチル)ピペリジン-4-イル)ピコリンアミド4(30 mg, 20%)を得た。
MS m/z (ESI): 487.2 [M+1]
¹H NMR (400 MHz, CD₃OD): δ 9.13 (s, 1H), 8.87 (d, 1H), 7.98 (t, 1H), 7.83 (s, 1H), 7.63-7.78 (m, 2H), 5.40 (d, 2H), 5.08 (br, 1H), 3.70-3.81 (m, 2H), 2.96 (br, 2H), 2.40-2.54 (m, 2H), 2.28 (s, 3H), 2.11-2.26 (m, 2H), 1.61-1.75 (m, 4H).
試験例
生物学的試験

試験例１

ヒトROMKおよびラットROMKチャンネルについての本発明化合物の阻害活性
後述の方法をヒトROMKおよびラットROMKチャンネルに対する本発明化合物の阻害活性を測定するために用いた。
１．物質と装置
（１）FluxOR^TMカリウムチャンネルアッセイ (F10016, Invitrogen)
（２）ウアバイン (O3125-1G，sigma)
（３）FlexStation3マイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス）
（４）ヒトROMK/HEK293細胞：ヒトROMK cDNA (NCBI SEQ ID NO. NM-000220.4)で遺伝子導入したROMKチャンネルを安定に発現するHEK293細胞株
（５）ラットROMK/HEK293細胞：安定にROMKチャンネルを発現する、ラットROMK cDNA (NCBI SEQ ID NO. NM-017023.1)で遺伝子導入したHEK293細胞株
（６）HEK293細胞株：Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, GNHu43
２．試験方法
ddH₂Oとウアバインを除き、全ての試験試薬は、FluxOR^TMカリウムイオンチャンネルアッセイキットからのものであり、処方もキットの説明書を参照した。
（１）ヒトROMK/HEK293細胞をPDL（ポリ-D-リジン）コーティングしたプレートに、20000細胞/ウェルで前日に播種した；
（２）終夜培養後、プレートの培地は廃棄した；次いでFluxor^tmカリウムイオンチャンネルアッセイキットの指示に従って、染料を100μL/holeで添加し、次いで室温で90分間インキュベートした；
（３）次いで、染料をデカントし、ウアバイン(300μM)とプロベネシドを含有するアッセイバッファー100μLを各ウェルに添加した；
（４）1μLの化合物またはDMSOを対応するウェルに添加し、30秒間振とうして、室温で30分間インキュベートした；
（５）プレートをFlexStation3マイクロプレートリーダーに配置し、次いで刺激バッファー（K₂SO₄: Tl₂SO₄: 1XFluxOR Chloride-free Buffer: ddH₂O = 3: 12: 40: 125）を25 μL/ウェルで添加し、次いで値を、直ちに490/525 nmのEX/EMで5分間連続して読み取った；
（６）ヒトROMKチャンネルについての本発明化合物のIC₅₀は、データ処理ソフトウェアGraphpadにより得た。

ヒトROMK/HEK293細胞をラットROMK/HEK293細胞と置き換えたのを除いて、上記手順を繰り返して、ラットROMKチャンネルに関する本発明化合物の阻害IC₅₀を測定した。

ヒトROMKまたはラットROMKチャンネルについての本発明化合物の阻害活性について、上記アッセイにより試験を行った。IC₅₀値を下記の表１に示す。
（表１）
結論：本発明化合物は、ヒトROMKおよびラットROMKチャンネルについて顕著な阻害活性を有する。

試験例２

hERGに関する本発明化合物の阻害活性
後述の方法をhERGに対する本発明化合物の阻害活性を測定するために用いた。
１．物質と装置
（１）FluxOR^TMカリウムチャンネルアッセイ (F10016, Invitrogen)
（２）FlexStation3マイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス）
（３）hERG/HEK293細胞：hERG cDNA (NCBI SEQ ID NO. NM-000238(RC215928, origene))で遺伝子導入したhERGチャンネルを安定に発現するHEK293細胞株
２．試験方法
ddH₂Oを除き、全ての試験試薬は、FluxOR^TMカリウムイオンチャンネルアッセイキットからのものであり、処方もキットの説明書を参照した。
（１）ヒトhERG/HEK293細胞をPDL（ポリ-D-リジン）コーティングしたプレートに、25000細胞/ウェルで前日に播種した；
（２）終夜培養後、プレートの培地は廃棄した；次いでFluxOR^TMカリウムイオンチャンネル検出要件操作に従って、染料を100μL/holeで添加し、次いで室温で90分間インキュベートした；
（３）次いで、染料をデカントし、100μLのプロベネシドを含有するアッセイバッファー100μLを各ウェルに添加した；
（４）1μLの化合物またはDMSOを対応するウェルに添加し、30秒間振とうして、室温で30分間インキュベートした；
（５）プレートをFlexStation3マイクロプレートリーダーに配置し、次いで刺激バッファー（K₂SO₄: Tl₂SO₄: 1XFluxOR Chloride-free Buffer: ddH₂O = 2: 1: 2: 5）を25 μL/ウェルで添加し、次いで値を、直ちに490/525 nmのEX/EMで5分間連続して読み取った；
（６）ヒトhERGイオンチャンネルについての本発明化合物のIC₅₀は、データ処理ソフトウェアGraphpadにより得た。

hERGに関する本発明化合物の阻害活性について、上記アッセイにより試験を行った。IC₅₀値を下記の表２に示す。
（表２）
hERGについての本発明化合物の阻害IC₅₀
結論：本発明化合物は、hERGに対して弱い阻害効果を有し、本発明化合物が低い心臓毒性を有することを示している。

試験例３

ROMKカリウムチャンネルに対する電気生理学的マニュアルパッチクランプの効果
１．プロトコール
試験は、in vitroでHEK293のROMKカリウムチャンネルに対する化合物の効果を調べるためにデザインした。ROMKカリウムチャンネルは、本願のHEK293細胞で安定して発現する。カリウムイオン電流が安定した後、カリウムチャンネルに対する本発明化合物の効果は、異なる濃度での本発明化合物の使用前と後で得られたカリウム電流を比較することによって得られた。
２．物質と装置
（１）HEK293細胞株：Chinese academy of sciencesの細胞バンク、GNHu43；
（２）ヒトROMK/HEK293細胞：ヒトROMK cDNA (NCBI SEQ ID NO. NM-000220.4)で遺伝子導入したROMKチャンネルを安定に発現するHEK293細胞株；
（３）細胞外液（mM）：NaCl, 137；KCl, 4；CaCl₂, 1.8；MgCl₂, 1；HEPES, 10；グルコース, 10；pH 7.4（NaOH滴定）；
（４）細胞内液（mM）：K Aspartate, 130；MgCl₂, 5；EGTA 5；HEPES, 10；Tris-ATP, 4；pH 7.2（KOH滴定）；
酸塩基滴定用NaOHおよびKOHに加え、化合物はSigma（St. Louis, MO）から購入した。
細胞培養培地：Ham’s F12培地(Invitrogen), 10% (v/v)不活性化ウシ胎児血清, 100 μg/mLハイグロマイシンB, 100μg/mLジェネテシン；
マニュアルパッチクランプシステム：HEKA EPC-10シグナル増幅器およびデジタル変換システム、ドイツHEKA Electronicsより購入；
マイクロコントロール機器：MP-225；
作図電極装置：PC-10（Narishige、日本）。
３．試験方法
試験化合物はジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解し、室温で保存した。試験日に、試験化合物は細胞外液を用いて次の最終濃度（3, 10, 30, 100, 300 nM）に希釈した。DMSO中の試験化合物の最終濃度は、0.3％であった。
ヒトROMK/HEK293細胞は、上記の細胞培養培地を有する培養皿で成長させ、37℃で5%CO²を含むインキュベーター中で培養した。ヒトROMK/HEK293細胞は、試験の24〜48時間前に培養皿中に配置した円形ガラスプレートに移し、上記と同じ培養培地および条件下に成長させた。各円形ガラスプレートのヒトROMK/HEK293細胞の密集状態は、大多数の細胞が独立していて個別になっている状態に達する必要がある。
この試験では、マニュアルパッチクランプシステムを全細胞電流記録に用いた。表面で成長したヒトROMK/HEK293細胞を有する円形ガラスプレートを倒立顕微鏡下の電気生理記録バス中に配置した。記録バスは、細胞外液を用いて連続して潅流を続けた（約1mL/分）。全細胞パッチクランプ電流記録法を本試験に用いた。特に言及しない限り、試験は室温（〜25℃）で行った。細胞は-80 mVに固定した。細胞の固定電圧を5秒間+20 mVに脱分極させ、ROMKカリウムチャンネルを活性化し、次いで-50 mVに固定して不活性化を除いて、テール電流を発生させた。テール電流のピーク値は、ROMK電流の値として用いた。上記ステップで記録したROMKカリウム電流が記録バス中での細胞外液の連続潅流下で安定した後、試験薬物を、ROMK電流に対する薬物の阻害が定常状態に達するまで潅流する。通常、３つの連続した電流記録線のリクローズを、安定状態を決定するための基準として使用した。安定化後、細胞は、ROMK電流が薬物添加前の値に戻るまで細胞外液で潅流した。一つの細胞を、１以上の薬物に対して、または複数の濃度の同じ薬物に対して試験を行ってもよいが、異なる薬物間では細胞外液ですすぐ必要がある。
４．データ解析
データは、HEKA Patchmaster、XLFitおよびGraphpad Prismデータ解析ソフトウェアにより解析した。IC₅₀値を下記の表３に示す。
（表３）ROMKカリウムチャンネルに対する本発明化合物の阻害IC₅₀
結論：本発明化合物は、ROMKカリウムチャンネルに対し強い阻害効果を有する。

試験例４

電気生理学的マニュアルパッチクランプにより測定したhERGカリウムチャンネルに対する効果
１．目的
この試験の目的は、in vitroでCHO細胞のhERGカリウムチャンネルに対する化合物の効果を試験することである。本発明において、hERGカリウムチャンネルは、CHO細胞で安定に発現する。カリウムイオン電流が安定した後、カリウムチャンネルに対する化合物の効果を、異なる化合物濃度の適用前と後のカリウム電流の大きさを比較することによって得た。
１．物質と装置
（１）CHO細胞株：Sophion Biosciense Company Denmark；
（２）hERG/CHO293細胞：ヒトROMK cDNA (NCBI SEQ ID NO. NM-000238 (RC215928, origene))で遺伝子導入したhERGチャンネルを安定に発現するCHO細胞株；
（３）細胞外液（mM）：EC 0.0.0 NaCl-リンゲル液, NaCl, 145; KCl, 4; CaCl₂, 2; MgCl₂, 1; HEPES, 10; グルコース, 10; pH 7.4 (NaOH滴定), 浸透圧~305 mOsm；
（４）細胞内液（mM）：IC 0.0.0 KCl-リンゲル液, KCl, 120; CaCl₂, 5.374; MgCl₂, 1.75; EGTA 5; HEPES, 10; Na-ATP 4; pH 7.25 (KOH 滴定), 浸透圧~305 mOsm；
酸塩基滴定用NaOHおよびKOHに加え、化合物はSigma（St. Louis, MO）から購入した。
細胞培養培地：Ham’s F12培地(Invitrogen), 10% (v/v)不活性化ウシ胎児血清, 100 μg/mLハイグロマイシン B, 100μg/mLジェネテシン；
マニュアルパッチクランプシステム：HEKA EPC-10シグナル増幅器およびデジタル変換システム、ドイツHEKA Electronicsより購入；
マイクロコントロール機器：MP-225；
作図電極装置：PC-10（Narishige、日本）。
２．試験方法
試験化合物は、ジメチルスルホキシド（DMSO）で30, 10, 3, 1, 0.3および0.1 mMに傾斜をつけて希釈し、前もって室温で保存した。次いで、保存溶液は、細胞外液を用いて次の最終濃度（30, 10, 3, 1, 0.3および0.1 μM）に希釈した。DMSO中の試験化合物の最終濃度は、0.1％であった。全ての保存溶液と試験溶液は、5-10分間超音波で振とうし、化合物の完全な溶液にした。
CHO hERG細胞は、上記の細胞培養培地を含有する培養皿で成長させ、37℃で5%CO²を含んでいるインキュベーター中で培養した。CHO hERG細胞は、試験の24〜48時間前に培養皿中に配置した円形ガラスプレートに移し、上記と同じ培養培地および条件下で成長させた。各円形ガラスプレート上のCHO hERG細胞の密集状態は、大多数の細胞が独立していて個別になっている状態になるようにした。
この試験では、マニュアルパッチクランプシステムを全細胞電流記録に用いた。表面で成長したCHO hERG細胞を有する円形ガラスプレートを倒立顕微鏡下の電気生理記録バス中に配置した。記録バスは、細胞外液を用いて連続して潅流を続けた（約1mL/分）。全細胞パッチクランプ電流記録法を本試験に用いた。特に言及しない限り、試験は室温（〜25℃）で行った。細胞は-80 mVに固定した。細胞の固定電圧を5秒間+20 mVに脱分極させ、hERGカリウムチャンネルを活性化し、次いで-50 mVに固定して不活性化を除いて、テール電流を発生させた。テール電流のピーク値は、hERG電流の値として用いた。上記ステップで記録したhERGカリウム電流が記録バス中で細胞外液の連続潅流下で安定した後、試験薬物を、hERG電流に対する薬物の阻害が定常状態に達するまで潅流しなければならない。通常、３つの連続した電流記録線のリクローズを、安定状態を決定するための基準として使用した。安定化後、細胞は、hERG電流が薬物添加前の値に戻るまで細胞外液で潅流した。一つの細胞を、１以上の薬物に対して、または複数の濃度の同じ薬物に対して試験を行ってもよいが、異なる薬物間では細胞外液ですすぐ必要がある。
４．データ解析
データは、HEKA Patchmaster、XLFitおよびGraphpad Prismデータ解析ソフトウェアにより解析した。IC₅₀値を下記の表４に示す。
（表４）hERGカリウムチャンネルに対する本発明化合物の阻害IC₅₀
結論：本発明化合物は、hERGカリウムチャンネルに対し弱い阻害効果を有し、本発明化合物が低い心臓毒性を有することを示している。

試験例５

本発明化合物の薬物動態試験
１．要約
ラットを試験動物として用いた。異なる時点での血漿中の薬物濃度は、化合物をラットに投与後にＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより測定した。本発明化合物の薬物動態挙動をラットで研究し、評価した。
２．プロトコール
２．１サンプル
実施例１の化合物
２．２試験動物
４匹の健康な成体Sprague-Dawley（SD）ラット、雄と雌半々、これらはSINO-BRITSH SIPPR/BK LAB. ANIMAL LTD., CO, with Certificate No.: SCXK (Shanghai) 2008-0016から購入した。
２．３試験化合物の調製
試験化合物の適切な量を秤量し、最終容量まで0.5%CMC-Naを加え、超音波処理により0.5mg/mL懸濁液を調製した。
２．４投与
一晩絶食後、４匹のSDラット、雄と雌半々に、5.0mg/kgの投与量および10mL/kgの投与容量で胃内に投与した。
３．方法
血液（0.1mL）を投与前および投与後0.5h、1.0h、2.0h、4.0h、6.0h、8.0h、11.0hおよび24.0hに眼窩静脈叢からサンプリングした。サンプルはEDTA抗凝血管に貯蔵し、3,500rpmで10分間、遠心分離を行って血漿を分離した。血漿サンプルは-20℃で保存した。ラットは投与後２時間で餌を与えた。
胃内投与後のラットにおける試験化合物の血漿濃度はLC-MS/MSにより測定した。血漿サンプルはタンパク沈降により前処理した後に分析した。
４．薬物動態パラメータの結果
本発明化合物の薬物動態パラメータを下記の表５に示す。
（表５）

試験例６

SDラットにおけるROMK阻害剤の利尿活性
1．目的
SDラットに対する化合物1およびROMK阻害剤の陽性コントロール薬の利尿活性を調べた。
２．方法と物質
２．１試験動物と給餌条件
雄SDラットは、SINO-BRITSH SIPPR/BK LAB. ANIMAL LTD., CO (Shanghai, China, Certificate No. 2008001647752, License SCXK (Shanghai) 2013-0016)から購入した。ラットは120-130gであり、5/ケージ、12/12時間の明/暗周期制御、23 ± 1℃の一定温度、50~60%の湿度、および水と食物へのフリーアクセスで飼育した。雄SDラットは、利尿試験にそれらを使用する前の7日間、この条件に順化させた。
２．２試験薬物
化合物1；
陽性コントロール薬の構造は、次の通りである：

0.9% NaCl溶液 (500 ml: 4.5 g)。
CMC^.Na：Batch No. 20131022, Sinopharm Group Chemical Reagent Co.,Ltd。
ナトリウム検出キット：Batch No. 20150203, Nanjing Jiancheng Biotechnology Companyより。
カリウム検出キット：Batch No. 20141112, Nanjing Jiancheng Biotechnology Companyより。
薬物投与量は、フリー塩基に基づいて計算した。
２．３試験デザインと方法
２．３．１動物のグループ分け
順化飼育の後、動物は、次のようにグループ化した：
２．３．２試験方法
試験は特許文献1に開示の方法に従って行った。順化飼育の後、ラットは代謝ケージに入れて、終夜絶食した。ラットは体重を量って、ランダムに次の群に分けた：各群10ラットで、ブランクコントロール群、化合物1試験薬0.03mg/kg群および0.1mg/kg群、陽性コントロール0.03mg/kg群および0.1mg/kg群。各ラットは、各化合物（ig, 1ml/kg）を胃内に投与した。ブランクコントロール群のラットは、対応する溶媒を与えた。胃内投与後、ラットは通常のケージに入れた。30分後、25ml/kgの普通の食塩水を与えた。ラットを代謝ケージに移し、直ちに食物と水を絶食した。4時間の全尿容量を集めて測定した。4時間の尿中ナトリウムおよび尿中カリウム***量も測定した。そして尿の収集後、眼窩の血清を集め、血清のナトリウム濃度および血清のカリウム濃度を調べた。
２．４試験器具
室温遠心機：Model 5417C、Eppendorf製
２．５データ表示および統計処理
試験データは、平均±標準偏差（S.D.）として表した。データは、excelのt検定を用いて統計的に比較した。薬物群とコントロール群の間のデータを解析し、比較して、有意な統計的有意性があるかどうかを判断した。*P<0.05は、薬物群とコントロール群の間に有意な差があることを示し、**P <0.01は、薬物群とコントロール群の間に高い有意な差があることを示す。
３．結果
結果は、ブランクコントロール群と比較して、陽性コントロール薬0.03mg/kgおよび0.1mg/kg群の尿容量は明らかに増加し（P <0.05）、尿量は、それぞれ1.41倍および1.46倍増加し；化合物1試験薬0.03mg/kg群および0.1mg/kg群の尿容量は有意に増加し（P <0.01）、尿量は、2.76倍および3.22倍増加する（図１参照）。陽性薬物および化合物1群は、尿中ナトリウム***量を有意に増加し（P <0.01）、尿中ナトリウム***量は1.57倍、1.65倍、3.12倍および3.31倍増加した（図２参照）。正常のコントロール群と比較して、陽性薬物と試験薬物の尿中カリウムは、僅かに上昇したが、統計的には有意ではない（図３参照）。同時に、陽性薬物と各試験群の血清のナトリウムおよびカリウムは、少し変化した（P >0.05）（図４および５参照）。
４．考察
機能的特性により、K+チャンネルは、次の４つのタイプに分類することができる：遅い（遅延）K+チャンネル（Kチャンネル）、早い（早期）K+チャンネル（Aチャンネル）、Ca2+活性化K+チャンネル[K (Ca)チャンネル)]および内向き整流性K+チャンネル。内向き整流性K+チャンネル（Kir）は、さらに７つのタイプ：異なるKCNJ遺伝子コーディングをもつKir1~ Kir7に分類することができる。腎髄質外部カリウムチャンネル（ROMK）はKir1タイプに属する。ラットの腎臓には、少なくとも３つのサブタイプのROMK：ROMK1、ROMK2およびROMK3がある。ROMK2は、髄質係蹄の上行脚の太い区域にほとんど分布している。ROMK1およびROMK3は、主に集合尿細管に発現する。
髄質係蹄の上行脚の太い区域に発現したROMKは、Na/K/Clトランスポーターと共にカリウムの分泌と再吸収を調整する。皮質集合尿細管に発現に発現したROMKは、Na/Kトランスポーターと共にカリウムの分泌を調整する。ROMK部位をブロックすると、低カリウム血症に導く過剰な低カリウムになることなく管腔へのNaClの分泌を促進する。これは高血圧患者のための利尿薬のよい研究の方向となる。この試験は、ROMK阻害剤の利尿作用を探索するものである。
この試験において、試験化合物1の溶解性は非常に良い。葉裂現象はない。しかし、陽性コントロール薬を秤量するとき、静電気があり秤量するのは容易でない。初期粉砕では、塊があり溶解性も乏しい。十分に粉砕した後は、その溶解性は良くなる。結果もまた、ラットへの化合物1および陽性コントロール薬の単剤経口投与は、正常（Normal）群と比べて有意な利尿とナトリウム***の効果を達成することを示している。さらに、それは試験化合物1の各用量と陽性コントロール薬の間の用量依存性を示している。
５．結論
化合物1および陽性コントロール薬の両者は、有意な利尿とナトリウム***の効果を有するが、血清カリウムについての効果は有しない。しかしながら、化合物1の利尿効果は、陽性コントロール薬のものより優れている。各群の薬物の効力は、用量依存的である。

Claims

式（I）の化合物、またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩：
式中
R¹は、C _1-6アルキルであり、該アルキルは１以上のハロゲンで任意にさらに置換されていてもよく；
R²は、水素であり；
R^３は、次の基：
であり；
R^４およびR^５は、それぞれ独立して、水素およびアルキルから成る群から選択され；
ｎは、０、１または２である。
R¹は、メチル、エチルおよびプロピルから成る群から選択される、請求項１に記載の式（I）の化合物。
R^４がC _1-6アルキルであり、そしてR^５が水素である、請求項１に記載の式（I）の化合物。
式（II）の化合物、またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩：
（式中、R¹, R², R⁴およびｎは、請求項１で定義したとおりである）
である、請求項１に記載の式（I）の化合物。
式（III）の化合物、またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩：
（式中、R¹, R², R⁴およびｎは、請求項１で定義したとおりである）
である、請求項１に記載の式（I）の化合物。
化合物が、
から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の式（I）の化合物。
式（IA）の化合物、またはそれらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩：
式中、
R¹は、C _1-6アルキルであり、該C _1-6アルキルは１以上のハロゲンで任意にさらに置換されていてもよく；
R²は、水素であり；
ｎは、０、１または２である。
該化合物が：
である、請求項７に記載の式（IA）の化合物。
式（IA）の化合物を置換ベンゾフラン誘導体と加熱して、式（I）の化合物を得る：
（式中、R¹〜R³およびｎは、請求項１で定義したとおりである。）
というステップを含む、請求項１に記載の式（I）の化合物の製造方法。
前記置換ベンゾフラン誘導体は、(R)-4-メチル-5-(オキシラン-2-イル)イソベンゾフラン-1(3H)-オンである、請求項９に記載の方法。
請求項１〜６のいずれか１項に記載の式（I）の化合物の治療上の有効量、および薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含有する医薬組成物。
ROMK阻害剤の製造における、請求項１〜６のいずれか１項に記載の式（I）の化合物、または請求項１１に記載の医薬組成物の使用。
高血圧症および/または心不全の治療または予防のための薬剤の製造における、請求項１〜６のいずれか１項に記載の式（I）の化合物、または請求項１１に記載の医薬組成物の使用。
ROMK介在性疾患の治療または予防のための薬剤の製造における、請求項１〜６のいずれか１項に記載の式（I）の化合物、または請求項１１に記載の医薬組成物の使用。
ROMK介在性疾患が、肝硬変、急性および慢性腎不全、ネフローゼ症候群、肺高血圧症、循環器疾患、心筋梗塞、脳卒中、心不全、肺筋緊張亢進、アテローム性動脈硬化症および腎臓結石から成る群から選択される、請求項１４に記載の使用。