JP2012194068A - レクチンと抗レクチン抗体との結合阻害剤 - Google Patents

レクチンと抗レクチン抗体との結合阻害剤 Download PDF

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Abstract

【課題】レクチンを用いる免疫測定における偽陽性反応の低減のための手段を提供すること。
【解決手段】本発明は、レクチンと糖残基含有キャリアとを含む、レクチンと抗レクチン抗体の結合阻害剤を提供する。本発明者は、さらに研究を重ねたところ、レクチンと糖残基含有キャリアとを予め混合し、得られた混合物の存在下で、レクチンにより固相化された抗原と、その抗原に対するサンプル中の抗体との免疫反応の検出を行うと、レクチンとサンプル中の抗レクチン抗体との結合が効果的に阻害されることを見出した。
【選択図】なし

Description

本発明は、レクチンを用いる免疫測定に関し、より具体的には、レクチンと抗レクチン抗体との結合阻害剤、そのような結合阻害剤を用いる免疫学的反応検出法、およびそのような結合阻害剤を含む免疫学的反応検出用キットに関する。本発明の結合阻害剤は、レクチンと糖残基含有キャリアとを含む。
免疫測定においては、種々の非特異的反応が生じることが知られている。例えば、マウスモノクローナル抗体を用いる免疫測定においては、検出対象の抗原ではなくヒト検体中に存在するヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）が試薬中のマウスモノクローナル抗体と結合してしまい、偽陽性反応を呈する。このような偽陽性反応を低減する手段として、試薬中にマウス抗体を添加することによって、ＨＡＭＡの結合を吸収する方法が周知である。
同様にレクチンに対する抗体を保有する検体が存在する。このような検体は赤血球に対する抗体が存在しないにも係わらず、レクチンをバインダーとして赤血球を固相化した場合に、陽性反応を呈し、本来の赤血球抗体による陽性なのか判別が出来にくく、試験の特異性を低下させるものである。
特許文献１は、小麦胚芽レクチンにより固相化した赤血球を用いる免疫学的検査における卵白または卵白関連物質の使用を開示している。特許文献１に記載の方法では、小麦胚芽レクチンをバインダーとして赤血球を固相化したマイクロプレートのウェルに、卵白または卵白関連物質を含む低イオン強度溶液（ＬＩＳＳ溶液）、および血漿等の検体が添加され、インキュベートした後に、免疫学的反応の検出が行われる。
特開平８−２４０５９２号明細書
本発明者は、レクチンと糖残基含有キャリアとを含む混合物が、抗レクチン抗体のレクチンへの結合を効果的に阻害し、レクチンを用いる免疫学的検査における偽陽性反応を低減させることを予想外に見出して、本発明を完成させた。
本発明者は、さらに研究を重ねたところ、レクチンと糖残基含有キャリアとを予め混合し、得られた混合物の存在下で、レクチンにより固相化された抗原と、その抗原に対する検体中の抗体との免疫反応の検出を行うと、レクチンと検体中の抗レクチン抗体との結合がより効果的に阻害されることを見出した。本発明では、糖残基含有キャリアは、レクチンの赤血球凝集活性をブロックするような量でレクチンと混合される。
本発明者は、レクチンとして小麦胚芽レクチンを用いる免疫測定法においては、糖残基含有キャリアとして、アルブミン、ムチン、またはムコイドが効果を有していることを見出し、特にオボムコイドが優れた効果を有するものであることを見出した。
したがって、本発明は、以下を提供する。
１つの局面において、本発明は、レクチンと糖残基含有キャリアとを含む、レクチンと抗レクチン抗体の結合阻害剤を提供する。
ある実施形態において、上記キャリアはタンパク質、合成ポリマーまたは糖である。
ある実施形態において、上記糖残基含有キャリアは、レクチンと抗レクチン抗体の結合を阻害するのに十分な分子量を有する高分子である。
ある実施形態において、上記レクチンは小麦胚芽レクチン（ＷＧＡ；ｗｈｅａｔ ｇｅｒｍ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ；小麦胚芽凝集素ともいう）であり、上記糖はＮ−アセチルグルコサミンである。
ある実施形態において、上記糖残基含有キャリアは、アルブミン、ムチン、およびムコイドからなる群より選択される。
ある実施形態において、上記糖残基含有キャリアは、オボアルブミン、ブタ胃由来ムチン、およびオボムコイドからなる群より選択される。
ある実施形態において、上記糖残基含有キャリアはオボムコイドである。
別の局面において、本発明は、免疫学的反応検出法であって、表面にレクチンが吸着された支持体を提供する工程、該支持体上にレクチン結合性抗原を固相化する工程、レクチンと糖残基含有キャリアとが混合された混合物を提供する工程、該混合物の存在下で検体と該支持体上の該抗原とを接触させる工程、および該抗原における該免疫学的反応を検出する工程を包含する方法を提供する。
ある実施形態において、上記抗原は生物体の一部である。
ある実施形態において、上記生物体の一部は赤血球または血小板である。
ある実施形態において、上記検体は、上記抗原に結合性の抗体またはその抗原結合性フラグメント、および上記レクチンに結合性の抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む検体である。
ある実施形態において、上記検体は、血液、血清、および血漿からなる群より選択される。
ある実施形態において、上記キャリアはタンパク質、合成ポリマーまたは糖である。
ある実施形態において、上記糖残基含有キャリアは、レクチンと抗レクチン抗体の結合を阻害するのに十分な分子量を有する高分子である。
ある実施形態において、上記レクチンは小麦胚芽レクチンであり、上記糖はＮ−アセチルグルコサミンである。
ある実施形態において、上記糖残基含有キャリアは、アルブミン、ムチン、およびムコイドからなる群より選択される。
ある実施形態において、上記糖残基含有キャリアは、オボアルブミン、ブタ胃由来ムチン、およびオボムコイドからなる群より選択される。
ある実施形態において、上記糖残基含有キャリアはオボムコイドである。
別の局面において、本発明は、免疫学的反応検出用キットであって、表面にレクチンが吸着された支持体と、レクチンと、糖残基含有キャリアとを含むキットを提供する。
ある実施形態において、本発明のキットは、レクチン結合性抗原をさらに含む。
ある実施形態において、上記キャリアはタンパク質、合成ポリマーまたは糖である。
ある実施形態において、上記糖残基含有キャリアは、レクチンと抗レクチン抗体の結合を阻害するのに十分な分子量を有する高分子である。
ある実施形態において、上記レクチンは小麦胚芽レクチンであり、上記糖はＮ−アセチルグルコサミンである。
ある実施形態において、上記糖残基含有キャリアは、アルブミン、ムチン、およびムコイドからなる群より選択される。
ある実施形態において、上記糖残基含有キャリアは、オボアルブミン、ブタ胃由来ムチン、およびオボムコイドからなる群より選択される。
ある実施形態において、上記糖残基含有キャリアはオボムコイドである。
本発明により、レクチンにより抗原を固相化して実施される免疫測定において、偽陽性反応を低減する手段が提供され、より特異的な免疫測定が可能になる。
図１は、ＷＧＡを介して赤血球が結合されたプレートに検体を添加した場合の免疫反応像を示す。左の２ウェルの広がった像が、ＷＧＡ非特異検体２１６Ｄ７、１０２Ｄ３による陽性像である。右の２ウェルは、抗赤血球抗体も抗レクチン抗体も含まない陰性検体を添加した場合に観察される陰性像を示す。 図２は、ＮＡｃＧｌｃまたはオボアルブミンとＷＧＡとの混合物の、ＷＧＡ非特異検体の反応性への効果を示す。上段から、１．ＮＡｃＧｌｃ５％、２．ＮＡｃＧｌｃ２．５％、３．ＮＡｃＧｌｃ１．２５％、４．オボアルブミン２．５％、５．オボアルブミン１．２５％、６．オボアルブミン０．６３％に、ＷＧＡを、左列から１００μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、１２μｇ／ｍＬ、６．３μｇ／ｍＬ、３．１μｇ／ｍＬ、１．５μｇ／ｍＬ、０．８μｇ／ｍＬ、０．４μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、および０μｇ／ｍＬを添加した混合物に、ＷＧＡ非特異検体を添加したものである。 図３は、熱変性ＷＧＡのＷＧＡ非特異検体の反応性への効果を示す。上段は、右から熱変性ＷＧＡ５０μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、１２．５μｇ／ｍＬ、６．３μｇ／ｍＬ、３．１μｇ／ｍＬ、および１．５μｇ／ｍＬの結果である。下段は、右端は熱変性ＷＧＡを添加していない（０μｇ／ｍＬ）検体希釈液に検体としてＷＧＡ非特異検体を用いた結果であり、その他は、何も添加していない検体希釈液で不規則性抗体陰性を反応させた反応像である。 図４は、ムチンまたはトリプシンインヒビターと、ＷＧＡとの混合物の、ＷＧＡ非特異検体の反応性への効果を示す。上段から、１．ムチン１．２５％、２．ムチン０．６３％、３．ムチン０．３２％、４．ムチン０．１５％、５．トリプシンインヒビター１．２５％、６．トリプシンインヒビター０．６３％、７．トリプシンインヒビター０．３２％、８．トリプシンインヒビター０．１５％に、ＷＧＡを、左列から１０μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、２．５μｇ／ｍＬ、１．２５μｇ／ｍＬ、０．６３μｇ／ｍＬ、０．３１μｇ／ｍＬ、０．１５μｇ／ｍＬ、０．０７μｇ／ｍＬ、０．０３５μｇ／ｍＬおよび０μｇ／ｍＬ（右列）添加した混合物に、ＷＧＡ非特異検体を添加したものである。 図５は、オボアルブミン−ＷＧＡ、ムチン−ＷＧＡ、ＴＩ−ＷＧＡ混合物添加検体希釈液のＷＧＡ非特異検体反応像を示す。上段からＬＩＳＳ； グリシン低イオン強度メディウム（対照）、オボアルブミン−ＷＧＡ，ＴＩ−ＷＧＡ、ムチン−ＷＧＡ添加検体希釈液による反応像（右２例は、陰性検体の反応像、左２列はＷＧＡ非特異検体反応像）を示している。
以下に本発明の好ましい形態を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の表記（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など、他の言語における対応する冠詞、形容詞など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
（定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
本明細書における「レクチン」とは、糖鎖を特異的に認識して、結合または架橋するタンパク質をいう。本発明において、レクチンは、本発明の結合阻害剤の一部として使用されるほか、抗原における糖鎖を認識して結合することにより、支持体（例えばマイクロプレート等）と抗原とをつなぐバインダーとしても使用される。
本明細書における「糖残基含有キャリア」とは、任意の糖残基と、任意のキャリアの結合体または複合体を意味する。キャリアは、糖残基を含有する限りいかなる物質をも含み得、例えばタンパク質、ポリマーまたは糖などであり得るがこれらに限定されない。キャリアがタンパク質である場合、「糖残基含有キャリア」はいわゆる糖タンパク質であり、キャリアが糖である場合、「糖残基含有キャリア」はいわゆる多糖類である。
本明細書における「混合」とは、任意の２以上の成分の物理的混合を意味し、「混合」された対象を「混合物」という。混合物に含まれる２以上の成分は、結合されていてもよいし、結合されていなくてもよい。
本明細書における「複合体」とは、２以上の部分を含む任意の構成体を意味する。本明細書において複合体を構成する２以上の部分は、共有結合で結合されていてもよくそれ以外の結合（例えば、水素結合、イオン結合、疎水性相互作用、ファンデルワールス力等）で結合されていてもよい。
本明細書において、ある物質によるレクチンと抗レクチン抗体との「結合阻害」とは、その物質の非存在下でのレクチンと抗レクチン抗体の結合の程度に対して、その物質の存在下でのレクチンと抗レクチン抗体の結合の程度が低減することをいう。本発明において、レクチンと抗レクチン抗体の結合の程度は、例えば磁性混合受身血球凝集法（ｍａｇｎｅｔｉｃ−ｍｉｘｅｄ ｐａｓｓｉｖｅ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ法；Ｍ−ＭＰＨＡ法）におけるウェル中の凝集パターンに基づいて判断し得る。本明細書においては、凝集パターンは、以下のようにスコアに割り当てられる。
スコア０ 陰性像
スコア１ リング状やや滲みの陰性像
スコア２ 弱い陽性像
スコア３ 広がっているがやや崩れのある陽性像
スコア４ 強く広がった陽性像
本明細書における「高分子」とは、レクチンと抗レクチン抗体の結合を阻害するのに十分な分子量を有する分子をいう。本発明において、「レクチンと抗レクチン抗体の結合を阻害するのに十分な分子量」とは、その分子量の物質の存在下にて、Ｍ−ＭＰＨＡ法によってレクチンと抗レクチン抗体との結合の程度を測定した場合に、凝集スコアが１以上低下するような分子量をいう。本明細書における「レクチンと抗レクチン抗体の結合を阻害するのに十分な分子量」とは、代表的に１，０００以上の分子量をいう。
本明細書における「レクチン結合性抗原」とは、表面にレクチンによって認識される糖鎖を有し、かついずれかの抗体によって結合され得る任意の物質をいう。
本明細書における「支持体」とは、レクチンを吸着させ得る任意の固相をいう。本発明における支持体は、任意の材料、任意の材質から構成され得る。そのような材料としては、金属、プラスチック、ガラス、天然ポリマーなどが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明における支持体としては、マイクロプレートのウェル、試験管、キュベット等の凹状容器の内壁、スライドガラス、シリコンチップ等の平板上のような、種々の公知の形状の支持体を用いることができる。
本明細書における「生物体の一部」とは、任意の生物体の任意の構成単位である。本明細書中における「生物体の一部」としては、ある生物体の臓器、組織、細胞、細胞成分などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明において、この生物体の一部は、代表的には、赤血球または白血球のような血球や、血小板のような無核の細胞であるが、これらに限定されない。
本明細書における「検体」とは、抗レクチン抗体を含み得る、被験体等から得られた任意の物質をいい、例えば、体液（血液、唾液、尿、涙液、血清、および血漿等）が含まれる。本発明で使用される検体としては、代表的に、血液、血清、または血漿が挙げられる。
本明細書における「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。抗体は通常、タンパク質の一種である。
本明細書における「抗体」とは、免疫反応において、抗原の刺激によって生体内でつくられ、抗原と特異的に結合したり反応したりするタンパク質またはそれらと同じ配列を有するものを化学合成等で生産したものを総称していう。実体は免疫グロブリンであり、Ａｂとも称する。特に言及しない限り、本発明における抗体は、その抗原結合性フラグメントも含む。
本明細書における抗体（全長）の「抗原結合性フラグメント」とは、ある抗体（全長）について、その抗体（全長）の抗原と同じ抗原に対して結合性を有するフラグメントをいう。そのような「抗原結合性フラグメント」の範囲に入るかどうかは、親和性のアッセイによって評価することができる。本明細書中においては、そのような親和性は、抗体に対する標識抗原の結合量を５０％阻害する濃度（ＩＣ５０値）を指標として示すことができ、ＩＣ５０値は、例えばｌｏｇｉｓｔｉｃ曲線による回帰モデル（Ｒｏｄｂａｒｄら、Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ ＲＩＡ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｉｎ ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｐ１６５，Ｉｎｔ．Ａｔｏｍｉｃ Ｅｎｅｒｇｙ Ａｇｅｎｃｙ，１９７４）で算出することができる。
抗原結合性フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ二重特異性抗体、およびＦｄフラグメントを含むが、これらに限定されない。
本明細書において、「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長を有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここで具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。
本明細書における「免疫学的反応検出法」とは、任意の抗原−抗体相互作用に基づく任意の免疫学的反応を検出する方法をいう。
本明細書における「接触（させる）」とは、ある成分を、直接的または間接的のいずれかで、所望の反応（例えば、免疫学的反応）が生じる様式で別の成分に対して物理的に近接させることを意味する。本発明における接触は、いかなる形態をとってもよく、代表的には検体を抗原に対して物理的に近接させることである。接触は、抗原を含むウェル等の支持体に、検体を置くことが挙げられる。
本明細書における「小麦胚芽レクチン」とは、小麦胚芽（Ｗｈｅａｔ ｇｅｒｍ）（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｖｕｌｇａｒｉｓ）より調製した糖鎖を持たないタンパク質であり、本明細書中では「ＷＧＡ」ともいう。中性下ではサブユニットが２量体を形成している。分子量は約４３，２００である。
（好ましい実施形態の説明）
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。当業者はまた、以下のような好ましい実施例を参考にして、本発明の範囲内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解されるべきである。
卵白または卵白関連物質の添加による偽陽性反応の低減が公知であった（特許文献１を参照のこと）が、それだけでは不十分であり（以下の実施例５を参照のこと）、本発明者は、さらに効果的な方法を探索した。本発明者は、マウス抗体の添加によるＨＡＭＡブロッキングを応用して、レクチンを添加することによる抗レクチン抗体ブロッキングによる偽陽性反応の低減を試みたが、その結果、むしろ免疫測定における抗レクチン抗体の結合による偽陽性反応は顕著に増加した（以下の実施例３を参照のこと）。
本発明は、レクチンと糖残基含有キャリアとを含む、レクチンと抗レクチン抗体との結合阻害剤を提供する。レクチンを用いて抗原を固相化して行う免疫測定において、本発明の結合阻害剤を使用することによって、検体中に存在し得る抗レクチン抗体が、固相化に用いられるレクチンよりも本発明の結合阻害剤に優先的に結合する。このことによって、免疫測定における偽陽性反応である、抗レクチン抗体の固相化用レクチンへの結合を吸収し、免疫測定における偽陽性が低減される。本発明において、固相化用レクチンと、結合阻害剤の成分であるレクチンとは、検体中の抗レクチン抗体による固相化用レクチンへの結合を阻害し、偽陽性反応を低減させることができる限り、同一のレクチンであってもよいし、異なるレクチンであってもよい。好ましい実施形態においては、固相化用レクチンと、結合阻害剤の成分であるレクチンとは、同一のレクチンである。
また、本発明においては、レクチンと糖残基含有キャリアとを予め混合することが重要であり得る。理論に束縛されることを望まないが、レクチンを用いて抗原を固相化して行う免疫測定において、レクチン単独を結合阻害剤として添加することによって、むしろ添加したレクチンが抗原に結合し、それによって検体中の抗レクチン抗体のレクチンへの結合によって生じる偽陽性反応が増大されるからである。しかしながら、レクチンと糖残基含有キャリアとを予め混合し、本発明の結合阻害剤とすることによって、結合阻害剤の一部であるレクチンが免疫測定における抗原に結合することを防ぐことができ、レクチンの添加によって生じる偽陽性反応をなくし、かつ効果的な偽陽性の低減をも達成する。したがって、本発明の免疫反応検出法においては、表面にレクチンが吸着された支持体にレクチン結合性抗原を固相化し、別途、レクチンと糖残基含有キャリアとが混合された混合物を提供し、その混合物の存在下で検体とその支持体上のその抗原とを接触させ、その後、抗原における該免疫学的反応を検出する。
（レクチンと糖残基の組み合わせ）
本発明で用いられるレクチンと糖残基の組み合わせは、検体中の抗レクチン抗体による固相化用レクチンへの結合を阻害し、偽陽性反応を低減させることができる限り、どのような量、種類、比率の組み合わせ、混合方法を用いてもよい。
レクチンのみを結合阻害剤として用いた場合には、レクチンを用いて抗原を固相化する免疫測定における偽陽性反応は大きく増加するが、他方、本発明の結合阻害剤を用いることによって、偽陽性反応は顕著に低減されることを、本発明者は見出した。何ら理論に拘束されることを望まないが、レクチンのみを結合阻害剤として添加すると、添加したレクチンが抗原に結合して偽陽性反応を増加させているものと考えられる。本発明の結合阻害剤においては、レクチンに糖残基含有キャリアが作用し、偽陽性反応を誘発する結合阻害剤中に含まれるレクチンの抗原への結合がブロックされ得る。何ら理論に拘束されることを望まないが、本発明の結合阻害剤においては、レクチンと糖残基含有キャリアとが、糖残基によるレクチンの特異的認識によって複合体を形成しているものと考えられる。なお、この複合体が具体的にどのような形態のものであるかは本発明の本質とは何ら関係がないことに留意すべきである。したがって、糖残基含有キャリアにおける糖残基は、使用するレクチン種に対して特異性を示すものであることが好ましい。
例えば、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＮＡｃＧｌｃ）特異的レクチンとしては、小麦胚芽レクチン（ＷＧＡ）、チョウセンアサガオレクチン（ＤＳＡ）、またはアメリカヤマゴボウレクチン（ＰＷＭ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
例えば、ガラクトース（Ｇａｌ）またはＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）に特異的なレクチンとしては、マッシュルームレクチン（ＡＢＡ）、ドリコスマメレクチン（ＤＢＡ）、デイゴマメレクチン（ＥＣＡ）、インゲンマメレクチン（ＰＨＡ−Ｅ４、ＰＨＡ−Ｌ４、ＰＨＡ−Ｐ）、ピーナッツレクチン（ＰＮＡ）、またはダイズレクチン（ＳＢＡ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
例えば、マンノース（Ｍａｎ）特異的レクチンとしては、タチナタマメレクチン（Ｃｏｎ Ａ）、レンズマメレクチン（ＬＣＡ、ＬＣＡ−Ａ）、またはエンドウマメレクチン（ＰＳＡ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
例えば、フコース（Ｆｕｃ）特異的レクチンとしては、ヒイロチャワンタケレクチン（ＡＡＬ）、ロータスレクチン（Ｌｏｔｕｓ）、ハリエニシダレクチン（ＵＥＡ−Ｉ）、レンズマメレクチン（ＬＣＡ）、レンズマメレクチン（ＬＣＡ−Ａ）、またはエンドウマメレクチン（ＰＳＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。
例えば、シアル酸（Ｓｉａ）特異的レクチンとしては、イヌエンジュレクチン（ＭＡＭ）、ニホンニワトコレクチン（ＳＳＡ）または小麦胚芽レクチン（ＷＧＡ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
レクチンと、それが特異的に認識する糖については、Ｌｅｃｔｉｎ Ｆｒｏｎｔｉｅｒ ＤａｔａＢａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｒｉｏｄｂ．ｉｂａｓｅ．ａｉｓｔ．ｇｏ．ｊｐ／ｒｃｍｇ／ｇｌｙｃｏｄｂ／ＬｅｃｔｉｎＳｅａｒｃｈ）等により公知であり、それらの情報に基づいて、当業者は本発明において使用する適切なレクチンと糖残基の組み合わせを選択することができ、当業者の技術常識の範囲内である。
本発明において使用されるレクチンは好ましくは小麦胚芽レクチン（ＷＧＡ）である。したがって、使用される糖残基はＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）またはシアル酸（Ｓｉａ）などが好ましく、本発明においては、特に小麦胚芽レクチン（ＷＧＡ）とＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）との組み合わせが好ましい。
（好ましい糖残基含有キャリア）
本発明者は、レクチンとしてＷＧＡを用いて抗原を固相化した免疫測定において、ＷＧＡへの非特異的抗体の結合阻害のために、ＷＧＡとＧｌｃＮＡｃ単糖との混合物を添加しても、結合阻害剤として機能しないことを実証した（以下の実施例５を参照のこと）。しかしながら、アルブミン、ムチンまたはムテインのような、ＧｌｃＮＡｃを含有する高分子とＷＧＡとの混合物を添加したところ、ＷＧＡへの非特異的抗体の結合が顕著に低減された。決して理論に拘束されることを望まないが、この事実から、高分子の糖残基含有キャリアが本発明において好ましいものであり得る。
したがって、本発明の糖残基含有キャリアは「高分子」であり得る。上記の通り、本発明における「高分子」とは、レクチンと抗レクチン抗体の結合を阻害するのに十分な分子量を有する分子をいい、「レクチンと抗レクチン抗体の結合を阻害するのに十分な分子量」とは、その分子量の物質の存在下にて、Ｍ−ＭＰＨＡ法によってレクチンと抗レクチン抗体との結合の程度を測定した場合に、凝集スコアが１以上低下するような分子量をいう。１つの実施形態において、本発明の糖残基含有キャリアは、１，０００以上の分子量を有する分子である。
ある実施形態において、本発明の糖残基含有キャリアとしては、オボムコイド（例えば、トリプシンインヒビター）（分子量約２８，０００）が好ましい。よって、本発明の糖残基含有キャリアは、２８，０００以上の分子量を有する高分子であり得る。
別の実施形態において、本発明の糖残基含有キャリアとしてはオボアルブミン（分子量約４５，０００）が好ましい。よって、本発明の糖残基含有キャリアは、４５，０００以上の分子量を有する高分子であり得る。
別の実施形態において、本発明の糖残基含有キャリアとしては、ムチン（分子量約１０６〜１０７）が好ましい。よって、本発明の糖残基含有キャリアは、１０６以上の分子量を有する高分子であり得る。
ある実施形態においては、本発明において好ましい糖残基含有キャリアは糖タンパク質である。特定の実施形態において、本発明において好ましい糖残基含有キャリアはアルブミンであり、より好ましくはオボアルブミンである。別の実施形態においては、本発明において好ましい糖残基含有キャリアはムチンであり、より好ましくはブタ胃由来ムチンまたはオボムチンであり、特に好ましくはブタ胃由来ムチンである。別の実施形態においては、本発明において好ましい糖残基含有キャリアはオボムコイド（トリプシンインヒビター）であり、オボムアルブミン、ムチンもまた好ましい。
（免疫学的反応検出法）
ある局面において、本発明は、免疫学的反応検出法であって、表面にレクチンが固相化された支持体を提供する工程、その支持体上にレクチン結合性抗原を固相化する工程、レクチンと糖残基含有キャリアとが混合された混合物を提供する工程、その混合物の存在下で検体とその支持体上のその抗原とを接触させる工程、および、その抗原におけるその免疫学的反応を検出する工程を包含する方法を提供する。
本発明においては、表面にレクチンが固相化された支持体は、市販されているものを購入してもよいし、公知の方法によって調製してもよい。支持体表面へのレクチンの固相化は、例えば、支持体とレクチンとを液体中で接触させ、支持体へのレクチンの吸着が達成されるのに十分な条件にて放置し、その後その支持体を洗浄することによって調製され得る。
支持体へのレクチンの固相化が達成されるのに十分な条件とは均一な固相化が可能である任意の条件をいい、例えば、温度は冷蔵温度から室温の範囲、時間は３０分以上である。
本発明の１つの実施形態においては、表面にレクチンが固相化された支持体は、特開平２−１２４４６４号に開示される方法によって調製され得る。具体的には、Ｕ字型マイクロプレート（例えば、ＮＵＮＣ社製）のような支持体に、例えばｐＨ７．０の０．０１Ｍリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を用いて、例えば濃度１０μｇ／ｍｌに調製した小麦胚芽レクチン（ＷＧＡ；生化学工業社製）を各ウェルに例えば１００μｌずつ添加し、例えば室温で例えば３０分間処理する。次に、例えばｐＨ７．０の０．０１Ｍ ＰＢＳを３００μｌずつ用いて５回洗浄し、例えば室温で乾燥させることによって、ＷＧＡが固相化された支持体を得ることができる。表面にレクチンが吸着された支持体の調製および入手は、当業者の技術常識の範囲内である。
表面にレクチンが吸着された支持体への赤血球等の細胞の固相化は、支持体上のレクチンへのレクチン結合性抗原の結合を達成できる任意の手法によって達成され得、当業者の技術常識の範囲内である。例えば、表面にレクチンが吸着された支持体への赤血球等の細胞の固相化は、例えば、支持体上のレクチンと固相化された赤血球等の細胞とを液体中で接触させ、レクチンへの赤血球等の細胞の固相化が達成されるのに十分な条件にて放置し、その後その支持体を洗浄することによって調製され得る。レクチンへの赤血球等の細胞の固相化が達成されるのに十分な条件とは、例えば、冷蔵温度から室温で１０分間以上放置すれば達成され得る。また、血小板等更に小さな細胞の場合は、遠心分離（５００ｒｐｍ ５分程度）を実施すれば効果が大きい。具体的には、表面にレクチンが固相化された支持体への赤血球の固相化は、レクチンが固相化された支持体に赤血球を含有する溶液を添加し、室温で１０分間以上放置すれば達成され得る。
レクチンと糖残基含有キャリアとの混合は、レクチンと糖残基含有キャリアとの物理的接触を達成する任意の手法によって達成され得、当業者の技術常識の範囲内である。例えば、レクチンと糖残基含有キャリアとの混合は、レクチンを含む溶液または懸濁液と、糖残基含有キャリアを含む溶液または懸濁液とを合わせることによって達成され得る。必要に応じて、合わせた混合物を、ローター、振盪機、ミキサーのような機械的手段によって、または手でウェルを揺らすことのような人的手段によって、さらに混合させてもよい。
本発明において、レクチンと糖残基含有キャリアとが混合された混合物を提供する工程は、レクチンと糖残基含有キャリアとを混合した後に、レクチンと糖残基含有キャリアの複合体化を達成するのに十分な条件にてインキュベートすることを包含する。レクチンと糖残基含有キャリアの複合体化を達成するのに十分な条件とは、例えば、冷蔵温度から室温で３０分以上の混合攪拌をいう。具体的には、レクチンを含む溶液と、糖残基含有キャリアを含む溶液または懸濁液とを合わせて、例えば室温で、例えば約３０分間インキュベートすることによって、レクチンと糖残基含有キャリアとが混合された混合物を提供することができる。
本発明の結合阻害剤において、レクチンと糖残基含有キャリアとは、該糖残基含有キャリアがレクチンの赤血球凝集活性を阻害するような比率で混合される。レクチンの赤血球凝集活性が消失する比率でレクチンと糖残基含有キャリアとを混合することによって達成される。
本発明におけるレクチンと糖残基含有キャリアの好ましい比率および量はまた、レクチン種、糖残基キャリア種、レクチンの赤血球凝集活性の消失、検体希釈液の成分、検体希釈液のｐＨ、イオン強度、検体の種類等に応じて、当業者が容易に決定することができる。レクチンと糖残基含有キャリアとの比率または量の具体的な数値は、レクチンと抗レクチン抗体の結合阻害を効果的に達成することができる限り必ずしも限定されるものではなく、レクチンと糖残基含有キャリアとを組み合わせことによる効果を達成しうる任意の比率および量が本発明の範囲内に包含されることが理解される。
本発明の免疫学的反応検出法による検査対象は、抗赤血球抗体のような細胞表面上の抗原と結合反応し得る任意の抗体であり、本発明が適用され得る検査方法は、特に限定されない。
本発明の方法において、検体と抗原との接触は、検体中に存在する抗体とその抗原との抗原抗体反応が生じる条件であれば、いかなる手段を用いてもよく、例えば、抗原を含む支持体に検体を置くことによって行われ得る。
本発明の方法において、免疫学的反応の検出は、血球の凝集、抗原抗体複合体の沈降、蛍光抗体法、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、ウェスタンブロット法等の当該分野で周知の技術によって行われ得る。本発明の好ましい実施形態では、抗原として血球が使用され、免疫学的反応の検出は、目視による血球の凝集パターンの確認によって達成され得る。また、反応像を光学的に数値に置き換えて判定する方法でも実施可能である。
（キット）
ある局面において、本発明はさらに、免疫学的反応検出用キットであって、表面にレクチンが固相化された支持体と、レクチンと、糖残基含有キャリアとを含むキットを提供する。支持体表面上のレクチンと、キット中の成分として提供されるレクチンとは同一のものである。
１つの実施形態では、本発明のキットは、さらに赤血球などのレクチン結合性抗原を含んでもよい。
好ましい実施形態では、本発明のキットは、レクチンと糖残基含有キャリアとを、該糖残基含有キャリアがレクチンの赤血球凝集活性を阻害するような比率で含む。レクチンの赤血球凝集活性を阻害するとは、レクチンによる赤血球の凝集が消失することをいう。
１つの実施形態では、本発明のキットは、さらに指示書を備えていてもよい。この指示書は、本発明の免疫反応検出法などを実施者に対して記載したものである。この指示書は、本発明の免疫反応検出手順を指示する文言が記載されている。この指示書は、必要であれば本発明が実施される国の監督官庁が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、瓶に貼り付けられたフィルム、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ（ウェブサイト）、電子メール）のような形態でも提供され得る。
１つの実施形態において、本発明のキットは、まずレクチンと糖残基含有キャリアとを混合し、そのようにして得られた混合物を、次いで、表面にレクチンが固相化された支持体に添加することによって使用され得る。
本発明は、例えば、Ｊ Ｏｈｇａｍａ，Ｒ Ｙａｂｅ，Ｔ Ｔａｍａｉ ｅｔ．ａｌ，Ａ ｎｅｗ ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ ｕｓｉｎｇ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｆｏｒｃｅ ｏｎ ｂｌｏｏｄ ｇｒｏｕｐ ｓｅｒｏｌｏｇｙ．Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｍｅｄ．１９９６，６：３５１−３５９、Ｔ Ｔａｍａｉ，Ｙ Ｉｓｈｉｉ，Ｔ Ｍａｚｄａ，ＩｇＭ ａｌｌｏａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｍ−ＭＰＨＡ，ａ ｎｅｗ ｓｏｉｌｄ−ｐｈａｓｅ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０００，２３：４７−５４、または斉藤 敏、玉井豊広、太田正穂 他、ＩｇＭ型ＨＬＡクラスＩ抗体の血小板輸血不応答状態への関与−ＰＴＲ患者における免疫グロブリンクラス別ＨＬＡ抗体陽性率、日輸学会誌 ２００６．５２，４０５−４１３などの当該分野で周知の文献に基づいて実施され得る。
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
まず、以下の実施例において使用する試薬、材料および方法について説明する。
（試薬および材料）
１．赤血球結合用マイクロプレート
マイクロプレートは、Ｎａｌｇｅ−Ｎｕｎｃ社のＵ底Ｍａｘｉｓｏｒｐを使用した。小麦胚芽レクチン（ＷＧＡ）は、生化学工業（株）から入手した。
２．抗ヒトＩｇＧ抗体感作顔料添加磁性粒子（以下ＩｇＧ感作粒子）
ＩｇＧ感作粒子は、国際公開第２０１０／０８４６２６号に記載される方法に従って調製した。具体的には、ゼラチンとアラビアゴムの混合物のｐＨを下げてコアセルベートを作成する過程で、磁性体と赤色顔料（株式会社呉竹）を添加し、取り込ませたものに抗ヒトＩｇＧ抗体を感作した。
３．赤血球及び検体
赤血球はオーソクリニカルダイアグノスティックスのセレクトジェンを使用した。陽性検体は、抗Ｄ抗体コントロール（抗Ｄ抗体保有の患者血清を陰性血清で適宜希釈したもの）、ＤｉａＭｅｄ社のＩＱＣのコントロール血清等を使用した。陰性検体は不規則性抗体陰性検体を使用した。ＷＧＡ非特異検体（抗赤血球非含有かつ抗ＷＧＡ抗体含有検体）として、２種類のＷＧＡ非特異検体２１６Ｄ７および２１０２Ｄ３（いずれも不規則性抗体陰性検体をスクリーニングして得た）を使用した。検体希釈液としては、一般的なグリシンＬＩＳＳ液 ｐＨ６．４を使用した。
４．糖残基含有キャリア
糖残基含有キャリアとして、オボアルブミン（＃９８８２）、オボアルブミン（＃１７０７１）、Ｎアセチルグルコサミン（ＮＡｃＧｌｃ）、ムチン（＃１３２−０９１６２）、トリプシンインヒビター（ＴＩ）＃５９５−１２３５５を和光純薬より入手した。トリプシンインヒビター（ＴＩ）＃Ｔ２０１１、＃Ｔ９２５３はＳｉｇｍａ Ａｌｄｏｒｉｃｈより入手した。
５．マイクロタイピングシステム
マイクロタイピングシステムＩｇＧカード（ＤｉａＭｅｄ ＡＧ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用した。血球は、オーソセレクトジェンを専用浮遊液ＣｅｌｌＳｔａｂ（ＤｉａＭｅｄ ＡＧ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）にて浮遊調製して使用した。使用方法はマイクロタイピングシステムＩｇＧカードの添付文書に従った。
（方法）
１．赤血球結合用プレートの作製
特開平２−１２４４６４号に開示される方法に従った。具体的には、Ｕ字型マイクロプレートに、ｐＨ７．０の０．０１Ｍリン酸等張緩衝液（ＰＢＳ）を用いて、濃度１０μｇ／ｍｌに調製したＷＧＡを各ウェルに１００μｌずつ添加し、室温で３０分間処理した。次に、ｐＨ７．０の０．０１Ｍ ＰＢＳを３００μｌずつ用いて５回洗浄し、室温で乾燥させることによって、赤血球結合用プレートを得た。
２．磁性混合受身血球凝集法（ｍａｇｎｅｔｉｃ−ｍｉｘｅｄ ｐａｓｓｉｖｅ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ法；Ｍ−ＭＰＨＡ法）
赤血球を０．０１Ｍ ＰＢＳで０．９％に希釈したものを２５μＬ／ｗｅｌｌずつ、赤血球結合用マイクロプレートに分注し、１０分間静置した。これを１．３％ＮａＣｌで３回洗浄し、余分な赤血球を除去した。検体希釈液７５μＬ／ｗｅｌｌ分注して、さらに検体を２５μＬ分注した。３７℃１５分間インキュベート後、洗浄液（生理食塩液）で６回洗浄し粒子希釈懸濁液（０．２％ＢＳＡ添加０．０１Ｍリン酸クエン酸等張バッファーｐＨ６．８）で浮遊調製したＩｇＧ感作粒子を２５μＬ／ウェルで分注して磁石上で３分間パターン形成した。
３．マイクロタイピングシステムアッセイ
使用方法はマイクロタイピングシステムＩｇＧカードの添付文書に従った。
（実施例１ ＷＧＡ非特異検体の反応性の確認）
赤血球結合用プレートにセレクトジェンを固相化して、ＷＧＡ非特異検体２１６Ｄ７、１０２Ｄ３及び陰性検体をアッセイした。その結果を図１に示す。左の２ウェルの広がった像が、赤血球と反応する抗体は含まないがＷＧＡに結合する抗体を含む検体による陽性像である。右の２ウェルは、抗赤血球抗体も抗レクチン抗体も含まない陰性検体を添加した場合に観察される陰性像を示す。
（実施例２ マイクロタイピングシステムによるＷＧＡ非特異検体の反応性）
ＷＧＡ非特異検体２１６Ｄ７および１０２Ｄ３について、マイクロタイピングシステムアッセイでの反応性を観察した。その結果、ＷＧＡ非特異検体２１６Ｄ７および１０２Ｄ３は、マイクロタイピングシステムアッセイでは、陰性を呈した（図示せず）。また、このＷＧＡ非特異検体はＷＧＡを固相化したマイクロプレートとアルカリフォスファターゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体を使用したＥＩＡの結果からでも陽性であること、自己血球を使用した場合も陽性を呈したことも含めて、実施例１の結果と合わせて、ＷＧＡ非特異検体が、プレートへの固相化のために使用されたＷＧＡに結合していることが実証された。
（実施例３ レクチン添加による非特異反応吸収）
本実施例では、マウス抗体の添加によるＨＡＭＡブロッキングを応用して、レクチンを添加することによる抗レクチン抗体ブロッキングによる偽陽性反応の低減を試みた。
赤血球結合用プレートにセレクトジェンを固相化し、血球プレートを作製した。検体希釈液に５μｇ／ｍＬのＷＧＡを添加したものを７５μｌ／ｗｅｌｌ分注し、ＷＧＡ非特異検体２１６Ｄ７を倍々希釈したものを検体として２５μＬ／ｗｅｌｌ加えて、３７℃で１５分間インキュベートして、洗浄後、抗ヒトＩｇＧ抗体感作粒子で、アッセイした。また、ＷＧＡを添加しない検体希釈液でも同様に試験した。結果を表１−１および表１−２に示した。
上記表１−１および１−２に示すように、ＷＧＡを検体希釈液に添加すると、２１６Ｄ７との反応性は、ＷＧＡ非添加のものに比べて著しく増加した。これは、検体希釈液中のＷＧＡが赤血球表面に結合することで更に非特異反応が増強したためであると考えられる。
以上から、レクチンを添加することによる抗レクチン抗体ブロッキングによる偽陽性反応の低減を試みたが、その結果、むしろ免疫測定における抗レクチン抗体の結合による偽陽性反応は逆に増加することが明らかになった。
（実施例４ 中和ＷＧＡおよび変性ＷＧＡによる赤血球凝集能の変化）
実施例３の結果から、ＷＧＡが赤血球に結合することなく非特異検体を中和出来るようにすることを試みた。そこでＷＧＡの活性部位が認識するＮ−アセチルグルコサミン（ＮＡｃＧｌｃ）残基を多く持つ物質による中和能を検討した。Ｎ−アセチルグルコサミン（ＮＡｃＧｌｃ）基を多く持つ物質として糖タンパク質であるオボアルブミン、オボムコイド（トリプシンインヒビター）およびムチンと、Ｎ−アセチルグルコサミン単糖を選択した。
ＮＡｃＧｌｃ単糖、オボアルブミン、トリプシンインヒビターおよびムチンは赤血球凝集を濃度依存的に阻害することが明らかになった。ＷＧＡと各種凝集阻害物質を等量混合したときの具体的な結果は、以下の通りである。
ＮＡｃＧｌｃ単糖は、５％のＮＡｃＧｌｃは５０μｇ／ｍＬ以下のＷＧＡの赤血球凝集活性を消失させ、２．５％のＮＡｃＧｌｃは１２．５％以下のＷＧＡの赤血球凝集活性を消失させ、そして１．２５％のＮＡｃＧｌｃは６．２５μｇ／ｍＬ以下のＷＧＡの赤血球凝集活性を消失させた。
２．５％の＃１７０７１オボアルブミンは２５μｇ／ｍＬ以下のＷＧＡの赤血球凝集活性を消失させ、１．２５％の＃１７０７１オボアルブミンは１２．５μｇ／ｍＬ以下のＷＧＡの赤血球凝集活性を消失させ、そして０．６２％の＃１７０７１オボアルブミンは１．２５μｇ／ｍＬ以下のＷＧＡの赤血球凝集活性を消失させた。
２．５％、１．２５％および０．６３％ムチンはいずれも１００μｇ／ｍＬ以下の赤血球凝集活性を消失させた。
１．２５％のＴ９２５３トリプシンインヒビターは１００μｇ／ｍＬ以下のＷＧＡの赤血球凝集活性を消失させ、０．６３％のＴ９２５３トリプシンインヒビターは５０μｇ／ｍＬ以下のＷＧＡの赤血球凝集活性を消失させ、０．３２％のＴ９２５３トリプシンインヒビターは２５μｇ／ｍＬ以下のＷＧＡの赤血球凝集活性を消失させた。
また、熱変性ＷＧＡでは赤血球凝集能が消失することが明らかになった。
（実施例５ 熱変性ＷＧＡ、ＮＡｃＧｌｃ−ＷＧＡ、オボアルブミン−ＷＧＡ、ムチン−ＷＧＡ、またはトリプシンインヒビター−ＷＧＡによるＷＧＡ非特異検体の吸収）
実施例４で赤血球凝集能がないことが明らかになった熱変性ＷＧＡや、実施例４で赤血球凝集能が阻害されることが明らかになった濃度のオボアルブミン、ムチン、またはトリプシンインヒビターとＷＧＡとの混合物によって、ＷＧＡ非特異検体が吸収出来るかどうかを検討した。
ＷＧＡを検体希釈液で、下記表２−１および２−２に示す濃度に調製したもの３５μＬと、検体希釈液で調製した等量の＃１７０７１オボアルブミン（２．５％、１．２５％、０．６３％）、ＮＡｃＧｌｃ（５％、２．５％、１．２５％）、ムチン（１．２５％、０．６３％、０．３２％、０．１５％）、Ｔ９２５３トリプシンインヒビター（１．２５％、０．６３％、０．３２％、０．１５％）を３０分間インキュベートした。なお、本明細書中、ＮＡｃＧｌｃ、オボアルブミン、ムチンおよびトリプシンインヒビターの濃度は、全てｗ／ｗ％で示されていることに留意されたい。ＷＧＡ非特異検体１０２Ｄ３を２５μＬ加え、更に３０分間インキュベートし、その全量を赤血球を固相化したプレートに移してアッセイした。
熱変性ＷＧＡもまた、検体希釈液で５０μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、１２μｇ／ｍＬ、６．３μｇ／ｍＬ、３．１μｇ／ｍＬ、および１．５μｇ／ｍＬ濃度に調製した。その３５μＬと、等量の検体希釈液とを加えたものを３０分間インキュベートした。２倍希釈したＷＧＡ非特異検体１０２Ｄ３を２５μＬ加え、更に３０分間インキュベートし、その全量を赤血球を固相化したプレートに移してアッセイした。
結果を図２、図３および図４と、表２−１および２−２に示した。図２は、上段から、１．ＮＡｃＧｌｃ５％、２．ＮＡｃＧｌｃ２．５％、３．ＮＡｃＧｌｃ１．２５％、４．オボアルブミン２．５％、５．オボアルブミン１．２５％、６．オボアルブミン０．６３％に、ＷＧＡを、左列から１００μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、１２μｇ／ｍＬ、６．３μｇ／ｍＬ、３．１μｇ／ｍＬ、１．５μｇ／ｍＬ、０．８μｇ／ｍＬ、０．４μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、および０μｇ／ｍＬを添加した混合物に、ＷＧＡ非特異検体を添加した結果を示す。
図３は、熱変性ＷＧＡのＷＧＡ非特異検体の反応性への効果を示す。上段は、右から熱変性ＷＧＡ５０μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、１２．５μｇ／ｍＬ、６．３μｇ／ｍＬ、３．１μｇ／ｍＬ、および１．５μｇ／ｍＬの結果である。下段は、右端は熱変性ＷＧＡを添加していない（０μｇ／ｍＬ）検体希釈液に検体としてＷＧＡ非特異検体を用いた結果であり、その他は、何も添加していない検体希釈液で不規則性抗体陰性を反応させた反応像である。
図４は、上段から、１．ムチン１．２５％、２．ムチン０．６３％、３．ムチン０．３２％、４．ムチン０．１５％、５．トリプシンインヒビター１．２５％、６．トリプシンインヒビター０．６３％、７．トリプシンインヒビター０．３２％、８．トリプシンインヒビター０．１５％に、ＷＧＡを、左列から１０μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、２．５μｇ／ｍＬ、１．２５μｇ／ｍＬ、０．６３μｇ／ｍＬ、０．３１μｇ／ｍＬ、０．１５μｇ／ｍＬ、０．０７μｇ／ｍＬ、０．０３５μｇ／ｍＬおよび０μｇ／ｍＬ（右列）添加した混合物に、ＷＧＡ非特異検体を添加した結果を示す。
以上から明らかなように、熱変性ＷＧＡでは、赤血球の凝集活性が消失しており、赤血球表面に結合しないため、実施例３の結果のようにＷＧＡ非特異を強めることはないと予想したが、ＷＧＡ非特異検体の反応は低下しなかった。また、同様にＮＡｃＧｌｃにＷＧＡを添加したものは、赤血球の凝集は見られなかったが、ＷＧＡ非特異検体の反応は低下しなかった。
＃１７０７１オボアルブミン＋ＷＧＡは、２．５％オボアルブミン＋ＷＧＡ（６．３〜０．２μｇ／ｍＬ）の範囲、および１．２５％オボアルブミン＋ＷＧＡ（１．５μｇ／ｍＬ〜０．２μｇ／ｍＬ）の範囲でＷＧＡ非特異反応が陰性化（スコア０または１）した。本実施例の条件下においては、ＷＧＡ１モルに対してオボアルブミン４モル以上を含むことが好ましいことが明らかになった。
ムチンは、本実施例の条件下においては、０．３１％以上で使用するとＷＧＡ非特異反応は消失するが、赤血球の固相化に影響（血球膜にダメージがあり、ケズレを生じた）を及ぼし、その結果赤血球が剥がれ易くなるため、欠けのある陰性像となった。洗浄やピペッティングを穏やかに実施する必要があった。以下の実施例６および表３の結果から、異なる検体希釈液および０．０３７５％〜０．００４７％というより低い濃度でムチンをキャリアとして使用した場合には、赤血球の固相化に影響はなく、かつＷＧＡ非特異検体は陰性を示したことから、ムチンも本発明の非特異反応低減効果を奏することは明らかである。
本実施例の条件下においては、トリプシンインヒビター＋ＷＧＡは、０．６２％トリプシンインヒビター＋ＷＧＡ（１０μｇ／ｍＬ〜０．０３５μｇ／ｍＬ）、０．３１％トリプシンインヒビター＋ＷＧＡ（５μｇ／ｍＬ〜０．０３５μｇ／ｍＬ）、および０．１５％トリプシンインヒビター＋ＷＧＡ（２．５μｇ／ｍＬ〜０．０７μｇ／ｍＬ）の範囲でＷＧＡ非特異反応が陰性化（スコア０または１）した。トリプシンインヒビターは、本実施例の条件下においては、１．２５％以上では血球膜にダメージがあり、ケズレを生じた。本実施例の条件下においては、ＷＧＡ１モルに対してトリプシンインヒビター１モル以上を含むことが好ましいことが明らかになった。
また、ＷＧＡを添加していなくてもムチン、オボアルブミン、トリプシンインヒビターだけでもＷＧＡ非特異反応は低減されたが、ＷＧＡと混合することによって顕著に、より効果的にＷＧＡ非特異反応が低減された。
本実施例においては、レクチンとしてＷＧＡを用いて抗原を固相化した免疫測定において、ＷＧＡへの非特異的抗体の結合阻害のために、ＷＧＡとＧｌｃＮＡｃ単糖との混合物を添加しても、結合阻害剤として機能しないことを実証した。しかしながら、アルブミン、ムチンまたはムテイン（トリプシンインヒビター）のような、ＧｌｃＮＡｃを含有する高分子とＷＧＡとの混合物を添加したところ、ＷＧＡへの非特異的抗体の結合が顕著に低減された。決して理論に拘束されることを望まないが、この事実から、高分子の糖残基含有キャリアが本発明において好ましいものであり得る。また、ＷＧＡを添加せずに、アルブミン、ムチンまたはムテインのような糖残基含有キャリアのみを添加することによる偽陽性反応の低減は十分ではなく、レクチンと糖残基含有キャリアとを組み合わせることが結合阻害に重要であることが示された。
なお、本実施例の条件において効果を奏する数値を上記したが、レクチンと糖残基含有キャリアとの比率または量の具体的な数値は、レクチンと抗レクチン抗体の結合阻害を効果的に達成することができる限り必ずしも限定されるものではなく、レクチンと糖残基含有キャリアとを組み合わせことによる効果を達成しうる任意の比率および量が本発明の範囲内に包含されることが理解される。本発明におけるレクチンと糖残基含有キャリアの比率および量は、レクチン種、糖残基キャリア種、レクチンの赤血球凝集活性の消失、検体希釈液の成分、検体の種類等に応じて、当業者は容易に決定することができる。
（実施例６ ＷＧＡ−各種糖残基含有キャリアによるＷＧＡ非特異結合の低減効果の確認）
以下のＷＧＡ−各種糖残基含有キャリア添加検体希釈液を使用して、血球固相膜へのダメージ及び、抗Ｄコントロール検体の反応性、陰性像、ＷＧＡ非特異検体の反応像を検討した。対象としてＷＧＡ−各種糖残基含有キャリア非添加の検体希釈液も使用した。結果を表３に示した。
表３ ＷＧＡ−各種糖残基含有キャリアによるＷＧＡ非特異結合の比較
ややリングとは、粒子の沈降が少し悪い場合をいう。陽性ではないが何かしらの弱い非特異反応が起きている可能性がある。
表３に示したように、０．０３７５％〜０．００４７％ムチン＋０．４μｇ／ｍＬ ＷＧＡ添加検体希釈液、１％〜０．５％オボアルブミン＋０．４μｇ／ｍＬ ＷＧＡ添加検体希釈液、０．２〜０．１％トリプシンインヒビター＃Ｔ９２５３＋０．４μｇ／ｍＬ ＷＧＡ添加検体希釈液で陰性となった。陽性の反応の感度は、非添加は６４倍までの希釈感度であり、トリプシンインヒビターやオボアルブミンを添加した検体希釈液でも６４倍以上であり、抗Ｄ抗体の反応に反応低下等の悪影響はなかった。
（実施例７ 本発明の結合阻害剤による抗赤血球抗体の反応性への影響）
本実施例では、オボアルブミン−ＷＧＡ、ムチン−ＷＧＡ、ＴＩ−ＷＧＡ混合物添加検体希釈液による抗赤血球抗体の反応性への影響を検証した。
抗Ｄ抗体、抗Ｃ抗体、抗Ｅ抗体、抗Ｆｙａ抗体、抗Ｆｙｂ抗体、抗Ｊｋａ抗体、抗Ｊｋｂ抗体、抗Ｋ抗体、抗Ｓ抗体、抗ｓ抗体、抗Ｍ抗体、抗Ｌｅａ抗体を陰性血漿を用いて希釈系列を作製し、従来の検体希釈液と、本発明の結合阻害剤添加検体希釈液の反応性を比較した。その結果を表４に示した。オボアルブミン−ＷＧＡ、ムチン−ＷＧＡ、ＴＩ−ＷＧＡ混合物添加検体希釈液のいずれの検体希釈液でも、非添加の従来の検体希釈液と比較して希釈感度の低下は認められなかった。
表４ オボアルブミン−ＷＧＡ、ムチン−ＷＧＡ、ＴＩ−ＷＧＡ混合物添加検体希釈液による抗赤血球抗体の反応性への影響
Ｉ−１％ ＃１７０７１オボアルブミン＋０．８μｇ／ｍＬ ＷＧＡ
ＩＩ−０．２％ ＃９２５３ＴＩ＋０．４μｇ／ｍＬ ＷＧＡ
ＩＩＩ−０．０１％ムチン＋０．４μｇ／ｍＬ ＷＧＡ
＊同じ希釈でも反応像の広がり方が強い
以上の結果から、本発明の結合阻害剤を使用しても、そのような結合阻害剤を添加していない従来の検体希釈液と比較して、希釈感度は低下しないことが明らかになり、目的とする抗赤血球抗体の検出の妨害になることはなかった。また、図５に示すように本発明の結合阻害剤を使用した検体希釈液はＷＧＡ非特異検体を陰性と正確に判定することが実証された。この事は、本発明の結合阻害剤が、免疫測定における偽陽性低減剤として有用であることを示している。
（実施例８ 本発明のキットの製造）
本実施例では、本発明のキットの製造について記載する。
上記「方法」において記載するように、赤血球結合用プレートを作製した。具体的には、Ｕ字型マイクロプレートに、ｐＨ７．０の０．０１Ｍリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を用いて、濃度１０μｇ／ｍｌに調製したＷＧＡを各ウェルに１００μｌずつ添加し、室温で３０分間処理した。次に、ｐＨ７．０の０．０１Ｍ ＰＢＳを３００μｌずつ用いて５回洗浄し、室温で乾燥させることによって、赤血球結合用プレートを得た。
この赤血球結合用プレートと、ＷＧＡと、上記実施例５において使用したようなオボアルブミン、ムチンまたはトリプシンインヒビターとを同一の容器に、または別個の容器に包装することによって、本発明のキットを製造することができる。
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
本発明により、レクチンにより抗原を固相化して実施される免疫測定において、偽陽性反応を低減する手段が提供され、より特異的な免疫測定が可能になる。

Claims (14)

  1. レクチンと糖残基含有キャリアとを含む、レクチンと抗レクチン抗体の結合阻害剤。
  2. 前記キャリアがタンパク質、合成ポリマーまたは糖である、請求項１に記載の結合阻害剤。
  3. 前記糖残基含有キャリアが、レクチンと抗レクチン抗体の結合を阻害するのに十分な分子量を有する高分子である、請求項１に記載の結合阻害剤。
  4. 前記レクチンが小麦胚芽レクチンであり、前記糖がＮ−アセチルグルコサミンである、請求項２に記載の結合阻害剤。
  5. 前記糖残基含有キャリアが、アルブミン、ムチン、およびムコイドからなる群より選択される、請求項４に記載の結合阻害剤。
  6. 前記糖残基含有キャリアが、オボアルブミン、ブタ胃由来ムチン、およびオボムコイドからなる群より選択される、請求項４に記載の結合阻害剤。
  7. 前記糖残基含有キャリアがオボムコイドである、請求項６に記載の結合阻害剤。
  8. 免疫学的反応検出法であって、
    表面にレクチンが吸着された支持体を提供する工程、
    該支持体上にレクチン結合性抗原を固相化する工程、
    レクチンと糖残基含有キャリアとが混合された混合物を提供する工程、
    該混合物の存在下で検体と該支持体上の該抗原とを接触させる工程、および
    該抗原における該免疫学的反応を検出する工程
    を包含する、方法。
  9. 前記抗原が生物体の一部である、請求項８に記載の方法。
  10. 前記生物体の一部が赤血球または血小板である、請求項９に記載の方法。
  11. 前記検体は、前記抗原に結合性の抗体またはその抗原結合性フラグメント、および前記レクチンに結合性の抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む検体である、請求項８に記載の方法。
  12. 前記検体は、血液、血清、および血漿からなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
  13. 免疫学的反応検出用キットであって、
    表面にレクチンが固相化された支持体と、
    レクチンと、
    糖残基含有キャリアと
    を含む、キット。
  14. レクチン結合性抗原をさらに含む、請求項１３に記載のキット。
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