JP6732283B2 - 対象の抗原に対する特異的抗体の製造方法 - Google Patents
対象の抗原に対する特異的抗体の製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6732283B2 JP6732283B2 JP2016120039A JP2016120039A JP6732283B2 JP 6732283 B2 JP6732283 B2 JP 6732283B2 JP 2016120039 A JP2016120039 A JP 2016120039A JP 2016120039 A JP2016120039 A JP 2016120039A JP 6732283 B2 JP6732283 B2 JP 6732283B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antigen
- binding
- protein
- carrier
- binding carrier
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims description 228
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims description 228
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims description 220
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 26
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 152
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 58
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 55
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 44
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 33
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 33
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 33
- 239000007771 core particle Substances 0.000 claims description 28
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 21
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 18
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 18
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 16
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 16
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000000539 dimer Substances 0.000 claims description 5
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims description 5
- 102000002278 Ribosomal Proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 108010000605 Ribosomal Proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 4
- 108700021638 Neuro-Oncological Ventral Antigen Proteins 0.000 claims description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 46
- -1 etc.) Substances 0.000 description 39
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 34
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 23
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 22
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 12
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 12
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 8
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 8
- 108010014460 mouse ribosomal protein S6 Proteins 0.000 description 8
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 7
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 7
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 7
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 6
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 6
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 6
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 101001131829 Homo sapiens P protein Proteins 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 5
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 5
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 5
- 102000047119 human OCA2 Human genes 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 4
- 101710181008 P protein Proteins 0.000 description 4
- 102100034574 P protein Human genes 0.000 description 4
- 101710177166 Phosphoprotein Proteins 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 3
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 3
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- FTOAOBMCPZCFFF-UHFFFAOYSA-N 5,5-diethylbarbituric acid Chemical compound CCC1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O FTOAOBMCPZCFFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 2
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 2
- 239000007810 chemical reaction solvent Substances 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 230000001603 reducing effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 2
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 2
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 2
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N (2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dimethoxy-2-(methoxymethyl)-3-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trimethoxy-6-(methoxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4,5,6-trimethoxy-2-(methoxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxane Chemical compound CO[C@@H]1[C@@H](OC)[C@H](OC)[C@@H](COC)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](OC)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OC)[C@H](OC)O[C@@H]2COC)OC)O[C@@H]1COC LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- RPZANUYHRMRTTE-UHFFFAOYSA-N 2,3,4-trimethoxy-6-(methoxymethyl)-5-[3,4,5-trimethoxy-6-(methoxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxane;1-[[3,4,5-tris(2-hydroxybutoxy)-6-[4,5,6-tris(2-hydroxybutoxy)-2-(2-hydroxybutoxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-2-yl]methoxy]butan-2-ol Chemical compound COC1C(OC)C(OC)C(COC)OC1OC1C(OC)C(OC)C(OC)OC1COC.CCC(O)COC1C(OCC(O)CC)C(OCC(O)CC)C(COCC(O)CC)OC1OC1C(OCC(O)CC)C(OCC(O)CC)C(OCC(O)CC)OC1COCC(O)CC RPZANUYHRMRTTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 229920000623 Cellulose acetate phthalate Polymers 0.000 description 1
- DQEFEBPAPFSJLV-UHFFFAOYSA-N Cellulose propionate Chemical compound CCC(=O)OCC1OC(OC(=O)CC)C(OC(=O)CC)C(OC(=O)CC)C1OC1C(OC(=O)CC)C(OC(=O)CC)C(OC(=O)CC)C(COC(=O)CC)O1 DQEFEBPAPFSJLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002284 Cellulose triacetate Polymers 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 239000001856 Ethyl cellulose Substances 0.000 description 1
- ZZSNKZQZMQGXPY-UHFFFAOYSA-N Ethyl cellulose Chemical compound CCOCC1OC(OC)C(OCC)C(OCC)C1OC1C(O)C(O)C(OC)C(CO)O1 ZZSNKZQZMQGXPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108010068370 Glutens Proteins 0.000 description 1
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Polymers OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 239000006173 Good's buffer Substances 0.000 description 1
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 229920002153 Hydroxypropyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 1
- 102000006404 Mitochondrial Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010058682 Mitochondrial Proteins Proteins 0.000 description 1
- HSHXDCVZWHOWCS-UHFFFAOYSA-N N'-hexadecylthiophene-2-carbohydrazide Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCNNC(=O)c1cccs1 HSHXDCVZWHOWCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 102000019040 Nuclear Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010051791 Nuclear Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000002508 Peptide Elongation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 229920002319 Poly(methyl acrylate) Polymers 0.000 description 1
- 229920001283 Polyalkylene terephthalate Polymers 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- 229920002732 Polyanhydride Polymers 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 description 1
- 229920001273 Polyhydroxy acid Polymers 0.000 description 1
- 229920001710 Polyorthoester Polymers 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108091028733 RNTP Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000004598 Small Nuclear Ribonucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010003165 Small Nuclear Ribonucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 229920002494 Zein Polymers 0.000 description 1
- 108010055615 Zein Proteins 0.000 description 1
- NNLVGZFZQQXQNW-ADJNRHBOSA-N [(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-diacetyloxy-3-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-triacetyloxy-6-(acetyloxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5,6-triacetyloxy-2-(acetyloxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-2-yl]methyl acetate Chemical compound O([C@@H]1O[C@@H]([C@H]([C@H](OC(C)=O)[C@H]1OC(C)=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](OC(C)=O)[C@@H](COC(C)=O)O1)OC(C)=O)COC(=O)C)[C@@H]1[C@@H](COC(C)=O)O[C@@H](OC(C)=O)[C@H](OC(C)=O)[C@H]1OC(C)=O NNLVGZFZQQXQNW-ADJNRHBOSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 229920013820 alkyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 241000617156 archaeon Species 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 229960002319 barbital Drugs 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 229920006217 cellulose acetate butyrate Polymers 0.000 description 1
- 229940081734 cellulose acetate phthalate Drugs 0.000 description 1
- 229920003086 cellulose ether Polymers 0.000 description 1
- 229920006218 cellulose propionate Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000002230 centromere Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N dihydromaleimide Natural products O=C1CCC(=O)N1 KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical group 0.000 description 1
- 229920001249 ethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 235000019325 ethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 235000021312 gluten Nutrition 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 229920013821 hydroxy alkyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001863 hydroxypropyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010977 hydroxypropyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000001866 hydroxypropyl methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920003088 hydroxypropyl methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 235000010979 hydroxypropyl methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000012966 insertion method Methods 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 238000003771 laboratory diagnosis Methods 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 241001515942 marmosets Species 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- XNGIFLGASWRNHJ-UHFFFAOYSA-N o-dicarboxybenzene Natural products OC(=O)C1=CC=CC=C1C(O)=O XNGIFLGASWRNHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000636 p-nitrophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1*)[N+]([O-])=O 0.000 description 1
- NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N phloretic acid Chemical group OC(=O)CCC1=CC=C(O)C=C1 NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 108091005981 phosphorylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920000739 poly(3-hydroxycarboxylic acid) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000233 poly(alkylene oxides) Polymers 0.000 description 1
- 229920001308 poly(aminoacid) Polymers 0.000 description 1
- 229920001490 poly(butyl methacrylate) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001483 poly(ethyl methacrylate) polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000005014 poly(hydroxyalkanoate) Substances 0.000 description 1
- 229920000212 poly(isobutyl acrylate) Polymers 0.000 description 1
- 229920000205 poly(isobutyl methacrylate) Polymers 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 229920000196 poly(lauryl methacrylate) Polymers 0.000 description 1
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 1
- 229920000184 poly(octadecyl acrylate) Polymers 0.000 description 1
- 239000002745 poly(ortho ester) Substances 0.000 description 1
- 229920002627 poly(phosphazenes) Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001281 polyalkylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001515 polyalkylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- 229920006149 polyester-amide block copolymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000139 polyethylene terephthalate Polymers 0.000 description 1
- 239000005020 polyethylene terephthalate Substances 0.000 description 1
- 229920000129 polyhexylmethacrylate Polymers 0.000 description 1
- 229920000903 polyhydroxyalkanoate Polymers 0.000 description 1
- 229920000197 polyisopropyl acrylate Polymers 0.000 description 1
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920000182 polyphenyl methacrylate Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 1
- 229920002635 polyurethane Polymers 0.000 description 1
- 239000004814 polyurethane Substances 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 229920001290 polyvinyl ester Polymers 0.000 description 1
- 229920001289 polyvinyl ether Polymers 0.000 description 1
- 229920001291 polyvinyl halide Polymers 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 239000012798 spherical particle Substances 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 229960002317 succinimide Drugs 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000005019 zein Substances 0.000 description 1
- 229940093612 zein Drugs 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
部位特異的な抗体の作製を目的として、タンパク質の特定部位の合成ペプチド等を各種キャリアに結合し、免疫化する方法(例えば、特許文献1参照。)が開発されているが、有効な抗体が得られない場合が多く、タンパク質の特定部位に対する抗体を自在に作製する新たな技術が求められている。
本発明者らは、自己免疫疾患において、しばしば自己抗体の標的となるリボソーム中の酸性リン酸化タンパク質であるPタンパク質の大サブユニットP0、P1、及びP2において、共通して保存されたC末端部位の強力な抗原性が、Pタンパク質の高次構造や動的性質に起因するものであると考え、各種解析を行ってきた。その結果、Pタンパク質はユニークな複合体を形成し、抗原部位となる共通C末端部位(以下、「C末端抗原部位」と称することがある。)は柔軟に運動すること、及びヒトPタンパク質複合体をマウスに投与することで、共通C末端抗原部位に対する特異的な抗体(以下、「抗P抗体」と称することがある。)が優先的に生じることを明らかにした(例えば、非特許文献1、及び特許文献2参照。)。
また、ヒトPタンパク質複合体を抗原として用いた抗体の作製方法では、抗P抗体の産生のみが可能であり、任意のタンパク質に対する特異的な抗体を作製することはできない。
[1]対象の抗原に対する特異的抗体の製造方法であって、
対象の抗原を、抗原結合用キャリアに結合させ、抗原結合キャリアを作製する結合工程と、
前記抗原結合キャリアを非ヒト哺乳動物に投与する免疫工程と、
前記免疫工程後に、前記非ヒト哺乳動物から血清、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血白血球、又はB細胞を採取する採取工程と、
を備え、
前記抗原結合用キャリアが、
コア粒子と、
前記コア粒子に連結され、可動性を有する少なくとも2つのリンカーと、
を備え、
前記リンカーにおいて、コア粒子との連結部とは反対側の先端が抗原結合部位であり、
前記コア粒子及び前記リンカーが以下の(a)〜(c)のいずれかのタンパク質であり、
(a)配列番号1に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、
(b)配列番号1に示すアミノ酸配列において、1個以上5個以下のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、多量体形成能及び可動性領域を有するタンパク質、
(c)配列番号1に示すアミノ酸配列と同一性が90%以上であるアミノ酸配列からなり、かつ、多量体形成能及び可動性領域を有するタンパク質、
前記抗原が高度に保存された部位を有し、リボソームタンパク質以外のタンパク質である、製造方法。
[2]前記タンパク質が2量体以上7量体以下の多量体を形成している[1]に記載の製造方法。
[3]前記結合工程において、前記抗原結合用キャリアをコードする核酸を含む発現ベクターに、前記抗原をコードする核酸を挿入し、抗原結合キャリアをコードする核酸を含む発現ベクターを作製し、前記抗原結合キャリアをコードする核酸を含む発現ベクターを用いて、宿主を形質転換した後、前記宿主を培養して抗原結合キャリアを発現させる、[1]又は[2]に記載の製造方法。
[4]前記抗原がHbs1である、[1]〜[3]のいずれか一つに記載の製造方法。
一実施形態において、本発明は、コア粒子と、前記コア粒子に連結され、可動性を有する少なくとも2つのリンカーと、を備え、前記リンカーにおいて、コア粒子との連結部とは反対側の先端が抗原結合部位である抗原結合用キャリアを提供する。
図1は、本発明の抗原結合用キャリアの一実施形態を模式的に示す図である。
本実施形態におけるコア粒子(11)は、リンカー(12)を支持するためのものである。
また、本実施形態におけるリンカー(12)は、抗原を結合するためのものである。
本実施形態の抗原結合用キャリア(1A)は、コア粒子(11)に可動性を有するリンカー(12)が複数連結されている。リンカー(12)は、コア粒子(11)との連結部とは反対側の先端に抗原結合部位(13)を有する。
図1において、リンカー(12)が4つ連結されているものを例示しているが、これに限定されない。また、図1において、コア粒子(11)は球状のものを例示しているが、これに限定されない。
リンカー(12)の長さは、100Å以上200Å以下であることが好ましく、100Å以上180Å以下であることがより好ましく、100Å以上150Å以下であることがさらに好ましい。リンカー(12)の長さが上記範囲内であることにより、隣り合うリンカー同士で構造障害を引き起こしにくく、また、抗体産生細胞の表面の受容体を効率的に活性化することを可能とする。
コア粒子(11)には、リンカー(12)が少なくとも2つ、好ましくは2以上10以下、より好ましくは4以上9以下、さらに好ましくは4以上8以下連結されている。リンカー(12)を複数備えることにより、効率的に抗体産生細胞(B細胞)の表面に存在する受容体を活性化することができ、優先的に抗原に対する抗体を産生させることができる。
また、本実施形態の抗原結合用キャリアは、耐熱性を有するものであることが好ましい。耐熱性を有することにより、例えば、本実施形態の抗原結合用キャリアがタンパク質により構成されており、大腸菌発現系を用いて製造する場合に、大腸菌由来のタンパク質等の不純物を加熱により変性させることで取り除き、効率的に本実施形態の抗原結合用キャリアを精製することができる。
適用可能な抗原としては、例えば、ヒストン、酵素、リボソームタンパク質、ミトコンドリアタンパク質、増殖細胞核抗原(PCNA)等のタンパク質;snRNP等のRNA−タンパク質複合体;セントロメア、糖鎖、糖タンパク質;DNA、RNA、miRNA、siRNA等の核酸(前記核酸は、一本鎖でもよく、二本鎖でもよい。また、LNA等の合成核酸も含む。)等が挙げられ、これらに限定されない。
より好適な抗原としては、例えば10以上30以下のアミノ酸残基からなるペプチドが挙げられる。
次いで、本実施形態の抗原結合用キャリアの材料について、詳細に説明する。
コア粒子及びリンカーを構成する材料としては、生体適合性を有するものであれば、特別な限定はない。コア粒子及びリンカーを構成する材料としては、例えば、タンパク質(例えば、ゼイン、カゼイン、ゼラチン、グルテン、血清アルブミン、コラーゲン、C末端抗原部位を欠損したaP1(配列番号1にアミノ酸配列を示す。)、及びそれらと実質的に同等の活性を有するタンパク質改変体等)、多糖類(例えば、アルギネート、セルロース、デキストラン、プルラン(pullulane)、ポリヒアルロン酸、及びそれらの誘導体等)、キチン、ポリ(3−ヒドロキシアルカノエート)(特に、ポリ(β−ヒドロキブチレート)、ポリ(3−ヒドロキシオクタノエート))、ポリ(3−ヒドロキシ脂肪酸)等の天然由来の高分子化合物;ポリホスファゼン、ポリ(ビニルアルコール)、ポリアミド、ポリエステルアミド、ポリ(アミノ酸)、ポリ無水物、ポリカーボネート、ポリアクリレート、ポリアルキレン(例えば、ポリエチレン等)、ポリアクリルアミド、ポリアルキレングリコール(例えば、ポリエチレングリコール等)、ポリアルキレンオキシド(例えば、ポリエチレンオキシド等)、ポリアルキレンテレフタレート(例えば、ポリエチレンテレフタレート等)、ポリオルトエステル、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリビニルハライド、ポリビニルピロリドン、ポリエステル、ポリシロキサン、ポリウレタン、ポリヒドロキシ酸(例えば、ポリラクチド、ポリグリコリド等)、ポリ(ヒドロキシ酪酸)、ポリ(ヒドロキシ吉草酸)、ポリ[ラクチド−co−(ε−カプロラクトン)]、ポリ[グリコリド−co−(ε−カプロラクトン)]等)、ポリ(ヒドロキシアルカノエート)、及びこれらのコポリマー等の合成高分子化合物等が挙げられる。コア粒子は上述の材料のうち1種類から構成されていてもよく、2種類以上から構成されていてもよい。
C末端抗原部位を欠損した古細菌由来のaP1、又は該aP1と実質的に同等の活性を有するタンパク質改変体は、耐熱性を有する。そのため、本実施形態の抗原結合用キャリアを、大腸菌発現系を用いて製造する場合に、大腸菌由来のタンパク質等の不純物を加熱により変性させることで取り除き、効率的に抗原結合用キャリアを精製することができる。
C末端抗原部位を欠損した古細菌aP1の4量体(1B)は、aP0結合部位(21)と、抗原結合部位(23)と、aP0結合部位(21)と抗原結合部位(23)とに挟まれた可動性領域(22)とからなるC末端抗原部位を欠損したaP1(100)を含む。さらに、C末端抗原部位を欠損したaP1(100)中のaP0結合部位(21)同士が結合してコア粒子様構造を形成することで、多量体を形成している。
図2において、C末端抗原部位を欠損したaP1(100)が4量体を形成しているものを例示しているが、これに限定されない。
C末端抗原部位を欠損したaP1(100)は、土台となるaP0を含まずとも、それ単体を混合することにより、P0結合部位(21)同士が結合することにより、多量体を形成することができる。また、aP0を含むことで、最大で7量体の多量体を形成することができる。本実施形態の抗原結合用キャリアに用いられるC末端抗原部位を欠損したaP1は、好ましくは2量体以上7量体以下、より好ましくは4量体以上7量体以下の多量体を形成している。
また、C末端抗原部位を欠損したaP1と実質的に同等の活性を有するタンパク質改変体とは、例えば、配列番号1に示すアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質等が挙げられる。
ここで、欠失、置換、若しくは付加されてもよいアミノ酸の数としては、1個以上15個以下が好ましく、1個以上10個以下がより好ましく、1個以上5個以下がさらに好ましい。
前記官能基としては、例えば、活性エステル構造(例えば、p−ニトロフェニルエステル基、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、コハク酸イミドエステル基、フタル酸イミドエステル基、5−ノルボルネン−2、3−ジカルボキシイミドエステル基等)、カルボキシ基、アミノ基、チオール基等が挙げられ、これらに限定されない。
本実施形態の抗原結合用キャリアの製造方法としては、例えば、市販の生体適合性を有する高分子化合物をコア粒子及びリンカーとして用いて、公知の方法を適宜選択して、コア粒子とリンカーとを結合させて作製すればよい。コア粒子とリンカーとの結合様式は、特別な限定はなく、例えば、共有結合(例えば、アミド結合、ジスルフィド結合、エステル結合等)、静電的相互作用、水素結合、ファンデルワールス結合、疎水効果による結合等が挙げられる。
上記のリンカーの溶液濃度について、特別な限定はなく、例えば、0.05重量%以上であってよく、例えば、0.1重量%以上30重量%以下であってよく、例えば0.1重量%以上20重量%以下であってよく、例えば0.3重量%以上10重量%以下であってよい。リンカー溶液中のリンカー濃度が上記範囲内にあることにより、リンカーの、コア粒子へ化学結合させる数を一定数にすることができ、効率的にリンカーを固定化することができる。
一実施形態において、本発明は、上述のC末端抗原部位を欠損した古細菌由来のaP1、又は該aP1と実質的に同等の活性を有するタンパク質改変体をコードする核酸を含むベクターを提供する。
一実施形態において、本発明は、対象の抗原に対する特異的抗体を作製するためのキットであって、上述の抗原結合用キャリア、又は上述のベクターを備えることを特徴とするキットを提供する。
ヌクレオチド三リン酸は、核酸合成酵素に応じた基質(dNTP、rNTP等)である。核酸合成酵素は、使用する核酸増幅方法に応じた酵素であり、例えば、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、逆転写酵素等が挙げられる。増幅反応用緩衝液としては、例えば、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液等が挙げられ、pHは特に限定されない。
また、本実施形態のキットは、上述のベクターを備える場合には、上述のベクターを宿主細胞に導入するためのトランスフェクション試薬をさらに備えていてもよい。
前記トランスフェクション試薬は、カチオン性高分子、カチオン性脂質、ポリアミン系試薬、ポリイミン系試薬及びリン酸カルシウムからなる群より選択される。このようなトランスフェクション試薬としては、例えば、Effectene Transfection Reagent(cat.no.301425,Qiagen,CA)、TransFastTM Transfection Reagent(E2431,Promega,WI)、TfxTM−20 Reagent(E2391,Promega,WI)、SuperFect Transfection Reagent(301305,Qiagen,CA)、PolyFect Transfection Reagent(301105,Qiagen,CA)、LipofectAMINE 2000 Reagent(11668−019,Invitrogen corporation,CA)、JetPEI(×4)conc.(101−30,Polyplus−transfection,France)、ExGen 500(R0511,Fermentas Inc.,MD)等が挙げられ、それらに限定されない。
一実施形態において、本発明は、対象の抗原に対する特異的抗体の製造方法であって、対象の抗原を、上述の抗原結合用キャリアに結合させ、抗原結合キャリアを作製する結合工程と、前記抗原結合キャリアを非ヒト哺乳動物に投与する免疫工程と、前記免疫工程後に、前記非ヒト哺乳動物から血清、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血白血球、又はB細胞を採取する採取工程と、を備える製造方法を提供する。
また、本明細書において、「ポリクローナル抗体」とは、異なるエピトープに対する異なる抗体を含む抗体調製物を意味する。
また、本明細書において、「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な特異性を持つ抗体を意味する。
本明細書において、「抗原結合フラグメント」とは、抗体の一部分(部分断片)であって、標的タンパク質を特異的に認識するものを意味する。具体的には、Fab、Fab’、F(ab’)2、可変領域断片(Fv)、ジスルフィド結合Fv、一本鎖Fv(scFv)、sc(Fv)2、ダイアボディー、多特異性抗体、およびこれらの重合体等が挙げられる。
本実施形態の製造方法における各工程について、以下に詳細に説明する。
まず、対象の抗原を、上述の抗原結合用キャリアに結合させて、抗原結合キャリアを作製する。
対象の抗原としては、上述の<<抗原結合用キャリア>>において例示されたものと同様のものが挙げられる。
上述の抗原結合用キャリアと抗原との結合様式は、特別な限定はなく、例えば、上述の<<抗原結合用キャリア>>におけるリンカーの抗原結合部位として例示された官能基を用いた共有結合(例えば、アミド結合、ジスルフィド結合、エステル結合等)、静電的相互作用、水素結合、ファンデルワールス結合、疎水効果による結合等が挙げられる。
抗原結合部位のカルボキシ基と抗原のアミノ基との縮合反応により結合する方法等が挙げられる。
まず、抗原結合用キャリアをコードする核酸を含む発現ベクターに、抗原タンパク質をコードする核酸を挿入し、抗原結合キャリアをコードする核酸を含む発現ベクターを作製する。挿入方法としては、例えば、制限酵素を用いて、前記発現ベクターの抗原結合用キャリアをコードする核酸の塩基配列の3’末端に抗原タンパク質をコードする核酸の塩基配列を挿入し、ライゲーションする方法、又は抗原タンパク質をコードする核酸の塩基配列を付加したプライマーを用いたPCRによるクローニング法等が挙げられる。
次いで、当該宿主を培養して抗原結合キャリアを発現させる。培地の組成、培養の温度、時間、誘導物質の添加等の条件は、形質転換体が生育し、抗原結合キャリアが効率よく産生されるよう、公知の方法に従って当業者が決定できる。また、例えば、選択マーカーとして抗生物質抵抗性遺伝子を発現ベクターに組み込んだ場合、培地に抗生物質を加えることにより、形質転換体を選択することができる。
次いで、宿主が発現した抗原結合キャリアを適宜の方法により精製することにより、抗原結合キャリアが得られる。
例えば、抗原結合用キャリアがaP1、又は該aP1と実質的に同等の活性を有するタンパク質改変体である場合、耐熱性を有するため、加熱により不純物を取り除き精製することができる。
次いで、前記結合工程で得られた抗原結合キャリアを非ヒト哺乳動物に投与する。
前記非ヒト哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、マーモセット、サル等が挙げられ、これらに限定されない。また、前記非ヒト哺乳動物は、健常体でもよく、自己免疫疾患モデル動物でもよい。中でも、効率的に抗体を産生できることから、前記非ヒト哺乳動物は、自己免疫疾患モデル動物であることが好ましい。
次いで、前記免疫工程後の非ヒト哺乳動物から血清、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血白血球、又はB細胞を採取する。
ハイブリドーマを得る方法としてより具体的は、例えば、前記免疫工程後のマウスから得られた脾臓細胞と、マウスミエローマ細胞との間の細胞融合により産生され、その後のスクリーニングにより、標的蛋白質に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る方法等が挙げられる。
また、ハイブリドーマにより産生されたモノクローナル抗体を得る方法としては、例えば標的蛋白質に対するモノクローナル抗体は、ハイブリドーマを培養することにより、また、ハイブリドーマを投与した非ヒト哺乳動物の腹水から、取得する方法等が挙げられる。
抗体をコードするDNAの発現においては、重鎖又は軽鎖をコードするDNAを別々に発現ベクターに組み込んで宿主を形質転換してもよく、重鎖及び軽鎖をコードするDNAを単一の発現ベクターに組み込んで宿主を形質転換してもよい(例えば、国際特許出願第94/11523号参照)。
抗体は、上記宿主を培養し、宿主内又は培養液から分離及び精製し、実質的に純粋で均一な形態で取得することができる。抗体の分離及び精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている方法を使用することができる。
トランスジェニック動物作製技術を用いた方法では、例えば、抗体遺伝子が組み込まれたトランスジェニック動物(例えば、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ等)を作製し、そのトランスジェニック動物のミルクから、抗体遺伝子に由来するモノクローナル抗体を大量に取得する方法等が挙げられる。
(1)抗原結合キャリア発現用ベクターの作製
(1−1)古細菌P.horikoshiiのaP1の全長DNA挿入大腸菌発現用プラスミドベクターの作製
まず、古細菌P.horikoshiiのaP1の全長DNAを、NdeI及びBamHIの配列を付加したプライマーを用いて、PCRにより増幅した。次いで、大腸菌発現用プラスミドベクターpET−3a(アジレント・テクノロジー社製)をNdeI及びBamHIで処理し、PCR産物を挿入した。得られた古細菌P. horikoshiiのaP1の全長DNAが挿入された大腸菌発現用プラスミドベクターの塩基配列を配列番号3に示す。
次いで、(1−1)で得られた古細菌P.horikoshiiのaP1の全長DNAが挿入された大腸菌発現用プラスミドベクターを用いて、前記aP1のC末端抗原部位にあたる18アミノ酸残基をコードする核酸を、抗原タンパク質をコードする塩基配列に置換した。
抗原タンパク質として、マウスリボソームタンパク質S6のC末端部位(18アミノ酸残基)を用いた。マウスリボソームタンパク質S6のC末端部位をコードする核酸の塩基配列を配列番号4に示す。
具体的には、前記マウスリボソームタンパク質S6のC末端部位をコードする塩基配列の一部と、大腸菌発現用プラスミドベクターpET−3aの塩基配列の一部とを含むプライマー(配列番号5及び6)を用いて、(1−1)で得られた古細菌P.horikoshiiのaP1の全長DNAが挿入された大腸菌発現用プラスミドベクターを環状のまま鋳型としてPCRを行い、得られた増幅産物を大腸菌形質転換に使用した。クローン化したプラスミドを大腸菌から調製し、抗原結合キャリア発現用ベクターを得た。
次いで、得られた抗原結合キャリア発現ベクターを大腸菌に形質転換し、37℃で12時間培養し、抗原結合キャリアを発現させた。次いで、培養後の大腸菌を回収し、超音波処理により破砕し、90℃に加熱して、大腸菌由来等の不要なタンパク質を変性させた。次いで、加熱処理後の溶液を、カラムクロマトグラフィーを用いて精製し、抗原結合キャリアを得た。
次いで、(2)で得られた抗原結合キャリアをアジュバンドと混合し、ウサギ(ニュージーランドホワイト種)の足蹠に注射し、免疫化した。次いで、免疫化から63日後のウサギから血清を採取し、HiTrap Protein G(GEヘルスケア・ジャパン社製)を充填したアフィニティークロマトグラフを用いて精製し、ウサギポリクローナル抗体(IgG)を得た。
次いで、(3)で得られたポリクローナル抗体の抗原特異性を検証するために、(2)で作製した抗原結合キャリア、ネガティブコントロールとして、古細菌P.horikoshiiのaP1の4量体、及びポジティブコントロールとして、マウスリボソームタンパク質S6の全長タンパク質をそれぞれSDS−PAGEで分離後、各タンパク質をタンパク質吸着性メンブランにブロットさせた。次いで、メンブランと(3)で得られたポリクローナル抗体とを室温で、60分間反応させた。その後、抗ウサギIgG抗体を用いた免疫染色を行った。結果を図3に示す。
図3において、レーン1は、前記ポリクローナル抗体と、前記抗原結合キャリアを反応させたもの、レーン2は、前記ポリクローナル抗体と、古細菌P.horikoshiiのaP1の4量体とを反応させたもの、及びレーン3は、前記ポリクローナル抗体と、マウスリボソームタンパク質S6の全長タンパク質とを反応させたものである。
また、図3において、上の矢印は、マウスリボソームタンパク質S6の全長タンパク質の分子量にあたる位置を示し、下の矢印は、抗原結合キャリアの分子量にあたる位置を示す。
また、リボソームタンパク質は、高度に保存された部位を有するタンパク質であり、従来の方法では、優れた特異性を有する抗体を作製しにくいが、本発明の抗原結合用キャリアを用いることで、容易に優れた特異性を有する抗体を作製できることが示された。
(1)抗原結合キャリア発現用ベクターの作製
抗原タンパク質として、マウスリボソームタンパク質S6のC末端部位(18アミノ酸残基)をコードする核酸の代わりに、酵母Hbs1の140番目〜15番目の20アミノ酸残基をコードする核酸(配列番号7)を用いて、前記Hbs1の140番目〜15番目の20アミノ酸残基をコードする塩基配列の一部と、大腸菌発現用プラスミドベクターpET−3aの塩基配列の一部とを含むプライマー(配列番号8及び9)を用いた以外は、実施例1の(1)と同様の方法を用いて、抗原結合キャリア発現用ベクターを作製した。
次いで、実施例1の(2)と同様の方法を用いて、抗原結合キャリア発現ベクターを大腸菌に形質転換し、抗原結合キャリアを発現させて、精製し、抗原結合キャリアを得た。
次いで、実施例1の(3)と同様の方法を用いて、(2)で得られた抗原結合キャリアをウサギ(ニュージーランドホワイト種)に投与し、ウサギポリクローナル抗体(IgG)を精製した。
次いで、(3)で得られたポリクローナル抗体の抗原特異性を検証するために、(2)で作製した抗原結合キャリア、ネガティブコントロールとして、古細菌P.horikoshiiのaP1の4量体、及びポジティブコントロールとして、酵母Hbs1の全長タンパク質をそれぞれSDS−PAGEで分離後、各タンパク質をタンパク質吸着性メンブランにブロットさせた。次いで、メンブランと(3)で得られたポリクローナル抗体とを室温で、60分間反応させた。その後、抗ウサギIgG抗体を用いた免疫染色を行った。結果を図4に示す。
図4において、レーン1は、前記ポリクローナル抗体と、古細菌P.horikoshiiのaP1の4量体とを反応させてもの、レーン2は、前記ポリクローナル抗体と、前記抗原結合キャリアを反応させてもの、及びレーン3は、前記ポリクローナル抗体と、酵母Hbs1の全長タンパク質とを反応させたものである。
また、図4において、上の矢印は、酵母Hbs1の全長タンパク質の分子量にあたる位置を示し、下の矢印は、抗原結合キャリアの分子量にあたる位置を示す。
また、Hbs1は、高度に保存された部位を有するタンパク質であり、従来の方法では、優れた特異性を有する抗体を作製しにくいが、本発明の抗原結合用キャリアを用いることで、容易に優れた特異性を有する抗体を作製できることが示された。
Claims (4)
- 対象の抗原に対する特異的抗体の製造方法であって、
対象の抗原を、抗原結合用キャリアに結合させ、抗原結合キャリアを作製する結合工程と、
前記抗原結合キャリアを非ヒト哺乳動物に投与する免疫工程と、
前記免疫工程後に、前記非ヒト哺乳動物から血清、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血白血球、又はB細胞を採取する採取工程と、
を備え、
前記抗原結合用キャリアが、
コア粒子と、
前記コア粒子に連結され、可動性を有する少なくとも2つのリンカーと、
を備え、
前記リンカーにおいて、コア粒子との連結部とは反対側の先端が抗原結合部位であり、
前記コア粒子及び前記リンカーが以下の(a)〜(c)のいずれかのタンパク質であり、
(a)配列番号1に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、
(b)配列番号1に示すアミノ酸配列において、1個以上5個以下のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、多量体形成能及び可動性領域を有するタンパク質、
(c)配列番号1に示すアミノ酸配列と同一性が90%以上であるアミノ酸配列からなり、かつ、多量体形成能及び可動性領域を有するタンパク質、
前記抗原が、高度に保存された部位を有し、リボソームタンパク質以外のタンパク質である、製造方法。 - 前記タンパク質が2量体以上7量体以下の多量体を形成している請求項1に記載の製造方法。
- 前記結合工程において、前記抗原結合用キャリアをコードする核酸を含む発現ベクターに、前記抗原をコードする核酸を挿入し、抗原結合キャリアをコードする核酸を含む発現ベクターを作製し、前記抗原結合キャリアをコードする核酸を含む発現ベクターを用いて、宿主を形質転換した後、前記宿主を培養して抗原結合キャリアを発現させる、請求項1又は2に記載の製造方法。
- 前記抗原がHbs1である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の製造方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2016120039A JP6732283B2 (ja) | 2016-06-16 | 2016-06-16 | 対象の抗原に対する特異的抗体の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2016120039A JP6732283B2 (ja) | 2016-06-16 | 2016-06-16 | 対象の抗原に対する特異的抗体の製造方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2017221153A JP2017221153A (ja) | 2017-12-21 |
JP6732283B2 true JP6732283B2 (ja) | 2020-07-29 |
Family
ID=60686583
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016120039A Active JP6732283B2 (ja) | 2016-06-16 | 2016-06-16 | 対象の抗原に対する特異的抗体の製造方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP6732283B2 (ja) |
-
2016
- 2016-06-16 JP JP2016120039A patent/JP6732283B2/ja active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2017221153A (ja) | 2017-12-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5913202B2 (ja) | 改善された特異性を有する新規免疫グロブリン結合タンパク質 | |
JP6591964B2 (ja) | Icoslへの治療上の標的特異的vnarドメインの単離 | |
US8394771B1 (en) | Multimeric proteins and methods of making and using same | |
JP7164598B2 (ja) | トランスジェニックマクロファージ、キメラ抗原受容体、及び関連する方法 | |
CA3015642A1 (en) | Transposon system and methods of use | |
CN112877387A (zh) | 一种生物磁性微球及其制备方法和应用 | |
US20220064691A1 (en) | Decorated inclusion body and uses thereof | |
CN111094333A (zh) | 异源二聚化的Ig结构域 | |
CN113811548A (zh) | 抗原结合蛋白 | |
CN105073977B (zh) | 重组酵母转化体和用其制备免疫球蛋白Fc片段的方法 | |
KR20220004115A (ko) | 항체로 장식된 자가-조립 단백질 나노케이지(sapna) 및 이의 일부 | |
CN108290928B (zh) | 卷曲螺旋连接体 | |
US10570197B2 (en) | Fd chain gene or L chain gene capable of increasing secretion amount of fab-type antibody | |
JP2023550191A (ja) | Dr4および/またはdr5を標的とするポリペプチドならびに関連する組成物および方法 | |
AU2004234282B2 (en) | Chaperonine-target protein complex, method of producing the same, method of stabilizing target protein, method of immobilizing target protein, method of analyzing the structure of target protein, sustained-release preparation and method of producing antibody against target protein | |
Ståhl et al. | Engineered bacterial receptors in immunology | |
JP6732283B2 (ja) | 対象の抗原に対する特異的抗体の製造方法 | |
US10550158B2 (en) | Antigen peptide complex for improved production of anti-peptide antibodies | |
McDonnell et al. | Development of a high yield expression and purification system for Domain I of Beta-2-glycoprotein I for the treatment of APS | |
JP4892717B2 (ja) | ニワトリキメラ抗体およびその利用 | |
WO2021241240A1 (ja) | 抗緑膿菌ワクチンに有用なタンパク質分子 | |
Rehm et al. | Applications of microbial biopolymers in display technology | |
JP2017070224A (ja) | 遺伝子発現用カセット及びその産生物 | |
TW202202514A (zh) | 多聚體IgA抗體之製造法及多重特異性多聚體IgA抗體 | |
CN113999306A (zh) | 一种获得识别空间构象表位抗体的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20190408 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20200220 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20200303 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200430 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20200623 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20200702 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6732283 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |