JP6731241B2 - ハーブのスプラウトを用いた皮膚外用剤や内用剤 - Google Patents
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Landscapes
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Description
水分を含んだ不織布にレモンバーム種子及びタイム種子を別々に同一量ずつ播種し、温度21℃で48時間、蛍光灯下で栽培し、芽を出させた。この不織布を、十分に酸素を含む水耕液上に設置して、室温21℃で24時間、植物の真上30cmの位置から、青色LED(ピーク波長450nm)及び赤色LED(ピーク波長660nm)を同時に照射し、赤色と青色LEDの合計光合成有効光量子束密度100μmol・m−2s−1となるように、赤色と青色の光量比を1:0(赤色のみ)、8:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、0:1(青色のみ)にして、栽培を行った。なお、栽培中は光量比を変えなかった。4週間栽培した後、収穫し、乾燥させることで、各植物のスプラウト乾燥物を得た。栽培例の中で、生育速度と各種効果に優れた4:1、3:1、2:1、1:1を選択し、それぞれ栽培例1〜4とし、また同光量の白色蛍光灯下(FL)で栽培した例を栽培例5とし、同条件の白色蛍光灯下で、任意の栽培方法にて約2カ月栽培したレモンバーム又はタイムを比較栽培例1とした(表1)。なお、各植物のスプラウト(製造例1〜5)は、子葉が2枚、本葉が1〜4枚程度付いており、地上部の長さが、レモンバームは2〜5cm、タイムは2〜8cmの植物体の地上部を用いた。一方、比較栽培例1は、地上部の長さが、20〜30cmである各植物の成体の地上部を用いた。
製造例1A レモンバーム・スプラウトの熱水抽出物
栽培例1のレモンバームのスプラウト乾燥物の10gに精製水400mLを加え、95〜100℃で1時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥してレモンバーム・スプラウトの熱水抽出物を2.1g得た。
栽培例1のタイムのスプラウト乾燥物の10gに精製水400mLを加え、95〜100℃で1時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥してタイム・スプラウトの熱水抽出物を2.0g得た。
栽培例1のレモンバームのスプラウト乾燥物10gに50%エタノール水溶液200mLを加え、常温で7日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、レモンバーム・スプラウトの50%エタノール抽出物を1.8g得た。
栽培例1のタイムのスプラウト乾燥物10gに50%エタノール水溶液200mLを加え、常温で7日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、タイム・スプラウトの50%エタノール抽出物を1.6g得た。
栽培例1のレモンバームのスプラウトの乾燥物20gに50%1,3−ブチレングリコール水溶液400mLを加え、常温で7日間抽出した後、濾過し、レモンバーム・スプラウトの50%1,3−ブチレングリコール抽出物を370g得た。
栽培例1のタイムのスプラウトの乾燥物20gに50%1,3−ブチレングリコール水溶液400mLを加え、常温で7日間抽出した後、濾過し、タイム・スプラウトの50%1,3−ブチレングリコール抽出物を370g得た。
対数増殖期にあるB16マウスメラノーマ細胞を60mm dishに3×104個播種し、各試料(最終濃度10μg/mL)を含むEagles’MEM(10%牛胎児血清含有)培地にて、37℃、5%CO2条件下で5日間培養した。次に、細胞をdishから剥離し、超音波破砕した後、4N NaOHを加え60℃で2時間の処理を行い、分光光度計でO.D.475nmを測定した。尚、超音波処理後の細胞破砕液についてLowryの方法(J.Biol.Chem.,193,265−275,1951)にてタンパク定量し、タンパク量当りのメラニン量を算出、試料未添加のメラニン生成量をコントロールとし、コントロールに対する試料添加時のメラニン生成量の値からメラニン生成抑制率を算出した。
ヒト皮膚線維芽細胞(NB1RGB)を60mm dishに1×105個播種し、10%FBSを含むDMEM培地にて、37℃、5%CO2条件下で培養した。コンフルエントな状態になったところで、各試料(最終濃度10μg/mL)を添加したDMEM培地にて、24時間培養した後、総RNAの抽出を行った。細胞からの総RNAの抽出はTRIZOL Reagent(Invitrogen)を用いて行い、総RNA量は分光光度計(NanoDrop)を用いて260nmにおける吸光度により求めた。mRNA発現量の測定は、細胞から抽出した総RNAを基にしてリアルタイムRT−PCR法により行った。リアルタイムRT−PCR法には、SuperScriptIII Platinum Two−Step qRT−PCR Kit with SYBR Green(Invitrogen)を用いた。すなわち、500ngの総RNAを逆転写反応後、PCR反応(95℃:15秒間、60℃:30秒間、40cycles)を行った。その他の操作は定められた方法に従い、MMP−1 mRNAの発現量を、内部標準であるβ―actin mRNAの発現量に対する割合として求めた。発現量は、コントロールのmRNAの発現量に対する試料添加群のmRNAの発現量の比率として算出した。尚、各遺伝子の発現量の測定に使用したプライマーは次の通りである。
GGGAGATCATCGGGACAACTC(配列番号1)
TGAGCATCCCCTCCAATACC(配列番号2)
β―actin用のプライマーセット
CACTCTTCCAGCCTTCCTTCC(配列番号3)
GTGTTGGCGTACAGGTCTTTG(配列番号4)
界面活性剤であるsodium dodecyl sulfate(SDS)曝露によるケラチノサイトにおける炎症性サイトカイン、IL−1α発現亢進に対する抑制作用を指標に抗炎症効果を評価した。すなわち、ケラチノサイト由来HaCaT細胞を、60mm dishに1×105個播種し、10%FBSを含むDMEM培地にて、37℃、5%CO2条件下で培養した。コンフルエントな状態になったところで、20μg/mlのSDS及び10μg/mlの試料を添加した2%FBSを含むDMEM培地にてさらに6時間培養した後、総RNAの抽出を行った。細胞からの総RNAの抽出はTRIZOL Reagent(Invitrogen)を用いて行い、総RNA量は分光光度計(NanoDrop)を用いて260nmにおける吸光度により求めた。mRNA発現量の測定は、細胞から抽出した総RNAを基にしてリアルタイムRT−PCR法により行った。リアルタイムRT−PCR法には、SuperScriptIII Platinum Two−Step qRT−PCR Kit with SYBR Green(Invitrogen)を用いた。すなわち、500ngの総RNAを逆転写反応後、PCR反応(95℃:15秒間、60℃:30秒間、40cycles)を行った。その他の操作は定められた方法に従い、IL−1α mRNAの発現量を、内部標準であるGAPDH mRNAの発現量に対する割合として求めた。尚、各遺伝子の発現量の測定に使用したプライマーは、次の通りである。
ATTGTATGTGACTGCCCAAGATGA(配列番号5)
AGTTTCCCAGAAGAAGAGGAGGTT(配列番号6)
GAPDH用のプライマーセット
TGCACCACCAACTGCTTAGC(配列番号7)
TCTTCTGGGTGGCAGTGATG(配列番号8)
IL−1α産生抑制率(%)=(試料未添加SDS添加のIL−1α mRNA発現量−試料・SDS添加のIL−1α mRNA発現量)/(試料未添加SDS添加のIL−1α mRNA発現量−試料・SDS未添加のIL−1α mRNA発現量)×100
ケラチノサイト由来HaCaT細胞を96wellプレートに1wellあたり5×103個播種し、各試料(最終濃度1μg/mL)を添加した0.1%FBSを含むDMEM培地にて、37℃、5%CO2条件下で3日間培養した。細胞数の測定は、MTT法により行った。すなわち、培養終了後、培地を除き、500μg/mLの濃度にて、MTT(3−[4,5−dimethylthiazol−2−yl]−2,5−diphenyl tetrazolium bromide)を溶解させたDMEMに培地を入れ替え、2時間培養した後、150μLのisopropanolに細胞を溶解させ、マイクロプレートリーダーを用いて570及び630nmにおける吸光度を測定した。細胞数は、570nmの吸光度値から、630nmの吸光度値を引いた値にて算出し、試料未添加の細胞数をコントロールとし、コントロールに対する試料添加時の細胞数から試料の細胞増殖促進効果を評価した。
各種照明条件で栽培したレモンバーム・スプラウト又はタイム・スプラウトの熱水抽出物を試料として用い、フリーラジカルの一種であるDPPHラジカルの消去作用を測定した。
各濃度の試料の試験濃度になるように調整した試料水溶液0.3mLに0.1mLの酢酸緩衝液(pH5.5)と0.4mLのエタノールと0.2mLの0.5mMのDPPH(diphenylpycrylhydrazyl)エタノール溶液を加え、37℃で30分間反応させた後、水を対照として波長517nmにおける吸光度を測定した。また、ブランクとして試料の代わりに精製水を加えた反応液を用いて吸光度を測定した。各試料の消去率は、次の式で算出した。
DPPHラジカル消去率(%)=(1−試料の吸光度/ブランクの吸光度)×100
処方 含有量(重量%)
1.製造例2Aの抽出物 1.0
2.1,3−ブチレングリコール 8.0
3.グリセリン 2.0
4.キサンタンガム 0.02
5.クエン酸 0.01
6.クエン酸ナトリウム 0.1
7.エタノール 5.0
8.パラオキシ安息香酸メチル 0.1
9.ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油(40E.O.) 0.1
10.香料 適量
11.精製水にて全量を100とする
[製造方法]成分1〜6及び11と、成分7〜10をそれぞれ均一に溶解し、両者を混合し濾過して製品とする。
処方 含有量(重量%)
1.製造例4Aの抽出物 0.5
2.製造例4Bの抽出物 0.5
3.スクワラン 5.5
4.オリーブ油 3.0
5.ステアリン酸 2.0
6.ミツロウ 2.0
7.ミリスチン酸オクチルドデシル 3.5
8.ベヘニルアルコール 1.5
9.モノステアリン酸グリセリン 2.5
10.香料 0.1
11.パラオキシ安息香酸メチル 0.2
12.1,3−ブチレングリコール 8.5
13.精製水にて全量を100とする
[製造方法]成分3〜9を加熱溶解して混合し、70℃に保ち油相とする。成分1、2及び11〜13を加熱溶解して混合し、75℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、45℃で成分10を加え、更に30℃まで冷却して製品とする。
処方 含有量(重量%)
1.製造例3Eの抽出物 1.0
2.スクワラン 5.0
3.オリーブ油 5.0
4.ホホバ油 5.0
5.セタノール 1.5
6.モノステアリン酸グリセリン 2.0
7.ポリオキシエチレンセチルエーテル(20E.O.) 3.0
8.ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート(20E.O.) 2.0
9.香料 0.1
10.プロピレングリコール 1.0
11.グリセリン 2.0
12.パラオキシ安息香酸メチル 0.2
13.精製水にて全量を100とする
[製造方法]成分2〜8を加熱溶解して混合し、70℃に保ち油相とする。成分1及び10〜13を加熱溶解して混合し、75℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、45℃で成分9を加え、更に30℃まで冷却して製品とする。
処方 含有量(重量%)
1.製造例2Cの抽出物 0.01
2.エタノール 5.0
3.パラオキシ安息香酸メチル 0.1
4.ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油(60E.O.) 0.1
5.香料 適量
6.1,3−ブチレングリコール 5.0
7.グリセリン 5.0
8.キサンタンガム 0.1
9.カルボキシビニルポリマー 0.2
10.水酸化カリウム 0.2
11.精製水にて全量を100とする
[製造方法]成分2〜5と、成分1及び6〜11をそれぞれ均一に溶解し、両者を混合して製品とする。
処方 含有量(重量%)
1.製造例4Bの抽出物 0.5
2.製造例4Fの抽出物 1.0
3.ポリビニルアルコール 12.0
4.エタノール 5.0
5.1,3−ブチレングリコール 8.0
6.パラオキシ安息香酸メチル 0.2
7.ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油(20E.O.) 0.5
8.クエン酸 0.1
9.クエン酸ナトリウム 0.3
10.香料 適量
11.精製水にて全量を100とする
[製造方法]成分1〜11を均一に溶解し製品とする。
処方 含有量(重量%)
1.製造例3Fの抽出物 1.0
2.ステアリン酸 2.4
3.ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート(20E.O.) 1.0
4.ポリオキシエチレンセチルエーテル(20E.O.) 2.0
5.セタノール 1.0
6.液状ラノリン 2.0
7.流動パラフィン 3.0
8.ミリスチン酸イソプロピル 6.5
9.カルボキシメチルセルロースナトリウム 0.1
10.ベントナイト 0.5
11.プロピレングリコール 4.0
12.トリエタノールアミン 1.1
13.パラオキシ安息香酸メチル 0.2
14.二酸化チタン 8.0
15.タルク 4.0
16.ベンガラ 1.0
17.黄酸化鉄 2.0
18.香料 適量
19.精製水にて全量を100とする
[製造方法]成分2〜8を加熱溶解し、80℃に保ち油相とする。成分19に成分9をよく膨潤させ、続いて、成分1及び10〜13を加えて均一に混合する。これに粉砕機で粉砕混合した成分14〜17を加え、ホモミキサーで撹拌し75℃に保ち水相とする。この油相に水相をかき混ぜながら加え、冷却し、45℃で成分18を加え、かき混ぜながら30℃まで冷却して製品とする。
処方 含有量(重量%)
1.製造例2Aの抽出物 0.1
2.炭酸水素ナトリウム 50.0
3.黄色202号(1) 適量
4.香料 適量
5.硫酸ナトリウムにて全量を100とする
[製造方法]成分1〜5を均一に混合し製品とする。
処方 含有量(重量%)
1.製造例2Bの抽出物 0.01
2.製造例2Eの抽出物 0.05
3.ポリオキシエチレンセチルエーテル(30E.O.) 2.0
4.モノステアリン酸グリセリン 10.0
5.流動パラフィン 5.0
6.セタノール 6.0
7.パラオキシ安息香酸メチル 0.1
8.プロピレングリコール 10.0
9.精製水にて全量を100とする
[製造方法]成分3〜6を加熱溶解して混合し、70℃に保ち油相とする。成分1、2及び7〜9を加熱溶解して混合し、75℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら30℃まで冷却して製品とする。
処方 含有量(重量%)
1.製造例4Aの抽出物 20.0
2.乾燥コーンスターチ 30.0
3.微結晶セルロース 50.0
[製造方法]成分1〜3を混合し、散剤とする。
処方 含有量(重量%)
1.製造例4Aの抽出物 3.0
2.乾燥コーンスターチ 27.0
3.カルボキシメチルセルロースカルシウム 20.0
4.微結晶セルロース 40.0
5.ポリビニルピロリドン 7.0
6.タルク 3.0
[製造方法]成分1〜4を混合し、次いで成分5の水溶液を結合剤として加えて顆粒成形する。成形した顆粒に成分6を加えて打錠する。1錠0.52gとする。
処方 含有量(重量%)
1.製造例4Bの抽出物 1.0
2.乾燥コーンスターチ 50.0
3.エリスリトール 40.0
4.クエン酸 5.0
5.ショ糖脂肪酸エステル 3.0
6.香料 適量
7.精製水にて全量を100とする
[製造方法]成分1〜4及び7を混合し、顆粒成形する。成形した顆粒に成分5及び6を加えて打錠する。1粒1.0gとする。
処方 含有量(重量%)
1.製造例4Aの抽出物 0.1
2.果糖ブドウ糖液糖 12.5
3.クエン酸 0.1
4.香料 0.05
5.精製水にて全量を100とする
[製造方法]成分1〜5を混合し、飲料とする。
処方 含有量(重量%)
1.製造例4Bの抽出物 1.0
2.粉糖 65.0
3.粉末ピーチ果汁 24.0
4.L−アスコルビン酸 8.0
5.結晶クエン酸 1.2
6.クエン酸ナトリウム 0.75
7.アスパルテーム 0.02
8.粉末ピーチ香料 0.03
[製造方法]成分1〜8を混合し、粉末飲料とする。
処方 含有量(重量%)
1.レモンバーム乾燥物(表1の栽培例2) 50.0
2.ペパーミント乾燥物 25.0
3.ローズヒップ乾燥物 25.0
[製造方法]成分1〜3を混合し、ティーバッグに2gを封入してハーブティーとする。
Claims (10)
- レモンバーム及び/又はタイムのスプラウトの水による抽出物を含有することを特徴とするMMP抑制剤。
- スプラウトが、地上部の長さが10cm以下であることを特徴とする請求項1記載のMMP抑制剤。
- 波長域570〜730nm及び400〜515nmの人工光を、光合成光量子束密度(PPFD)比が、4:1〜1:1で照射して栽培したレモンバーム及び/又はタイムのスプラウトの水による抽出物を含有することを特徴とする皮膚の美白剤。
- 波長域570〜730nm及び400〜515nmの光を、光合成光量子束密度(PPFD)比が、4:1〜1:1で照射して栽培したレモンバーム及び/又はタイムのスプラウトの水による抽出物を含有することを特徴とするMMP抑制剤。
- 波長域570〜730nm及び400〜515nmの人工光を、光合成光量子束密度(PPFD)比が、4:1〜1:1で照射して栽培したレモンバームのスプラウトの水による抽出物を含有することを特徴とする皮膚の抗炎症剤。
- 波長域570〜730nm及び400〜515nmの人工光を、光合成光量子束密度(PPFD)比が、4:1で照射して栽培したタイムのスプラウトの水による抽出物を含有することを特徴とする表皮細胞増殖促進剤。
- 波長域570〜730nm及び400〜515nmの人工光を、光合成光量子束密度(PPFD)比が、4:1〜1:1で照射して栽培したレモンバーム及び/又はタイムのスプラウトの水による抽出物を含有することを特徴とする抗酸化剤。
- 波長域570〜730nm及び400〜515nmの人工光であって、光合成光量子束密度(PPFD)比が4:1〜1:1である光を20〜40日間照射して栽培したことによって、成体のレモンバーム及び/又はタイムと比較して、熱水抽出物の美白効果、MMP抑制効果、抗炎症効果、細胞増殖促進効果及び/又は抗酸化効果を高めたことを特徴とするレモンバーム及び/又はタイムのスプラウト。
- 請求項8記載のスプラウト及び/又はその抽出物を含有することを特徴とする医薬品。
- 請求項8記載のスプラウト及び/又はその抽出物を含有することを特徴とする食品。
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