JP6728055B2 - Ｉｌ−１５部分とポリマーとのコンジュゲート - Google Patents

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関連出願の相互参照
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２０１４年４月３日に出願された米国仮特許出願第６１／９７４，９１４号明細書に対する優先権の利益を主張するものであり、その開示は参照により本明細書に援用される。

特に、本発明の１つ又は複数の実施形態は、概して、ＩＬ−１５部分（即ち、少なくとも何らかのヒトＩＬ−１５と同様の活性を有する部分）と水溶性非ペプチドポリマーとを含むコンジュゲートに関する。加えて、本発明は、（特に）コンジュゲートを含む組成物、コンジュゲートの合成方法、及び組成物の投与方法に関する。

インターロイキン−１５（「ＩＬ−１５」）は、Ｇｒａｂｓｔｅｉｎら［Ｇｒａｂｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４：９６５−９６８］によって初めて報告された多面的サイトカインである。１６２アミノ酸前駆体として分泌されるヒトＩＬ−１５は、２９アミノ酸リーダー配列と１９アミノ酸プロ配列とを含む；従って成熟タンパク質は１１４アミノ酸長である。４本のα−ヘリックス束のサイトカインファミリーに属するＩＬ−１５はヘテロ三量体受容体に結合し、ここでユニークなαサブユニット（ＩＬ−１５Ｒα）はＩＬ−１５に受容体特異性を付与し、及びこの受容体のβ及びγサブユニットは１つ以上の他のサイトカイン受容体と共通する特徴を有する。Ｇｉｒｉ ｅｔ ａｌ．（１９９５）ＥＭＢＯ Ｊ．１４：３６５４−３６６３。

サイトカインとしては、ＩＬ−１５は自然免疫系及び適応免疫系の両方に効果を及ぼす。ＤｉＳａｂｉｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ．２２：１９−３３。自然免疫系（これは外来性の侵入者から宿主を全般的に防御する）に関して、ＩＬ−１５は、他の特性の中でも特に、ナチュラルキラー細胞（「ＮＫ細胞」）及びナチュラルキラーＴ細胞（「ＮＫ−Ｔ細胞」）の発生を生じさせ、且つそれらの生存を維持する。自然免疫系におけるその役割と一致して、ＮＫ細胞は侵入病原体を特異的に攻撃することはない；むしろ、ＮＫ細胞は易感染性宿主細胞（腫瘍細胞又はウイルス感染細胞など）を破壊する。ＮＫ−Ｔ細胞は免疫調節性サイトカイン、特にインターフェロン−γを産生し、これにより免疫応答の全般的な活性化がもたらされる。

適応免疫系（これは特定の病原体と最初に遭遇した後、当該の特異的な外来性の侵入者から宿主を防御する）に関して、ＩＬ−１５は免疫調節性サイトカイン産生ヘルパーＴ細胞の維持に必要である。重要なことに、ＩＬ−１５は「抗原を経験した」メモリーＴ細胞の長期維持も支え、メモリーＴ細胞は急激に複製する能力を有するため、宿主に侵入する特定の外来性病原体に再曝露したときに一層迅速で強力な免疫応答を生じさせる。

最後に、自然免疫系及び適応免疫系内でのその特異的な役割にも関わらず、ＩＬ−１５は、免疫系の両カテゴリーにわたって重要で広範な効果を及ぼす。詳細には、ＩＬ−１５は、免疫系の両カテゴリーに関連する幾つもの細胞型（樹状細胞、好中球、好酸球、肥満細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、及びＢ細胞を含む）のアポトーシス（又は細胞死）を阻害し又は低減する。

ＩＬ−１５は、宿主にとって外来性（又は「非自己」）に見える細胞と闘うことのできる免疫系内の多くの細胞の増殖及び維持を刺激するため、癌罹患者の治療におけるＩＬ−１５の利用が提案されている。Ｓｔｅｅｌ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．３３（１）：３５−４１。例えば、ＩＬ−１５ベースの作動薬が骨髄腫の治療に提案されている。Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２（１１），ｅ２６４４２：１−３。加えて、ＩＬ−１５薬物療法がＨＩＶ感染症などのウイルス感染症罹患者の治療に提案されている。

幾つもの疾患の罹患者の治療に利用し得るその可能性にも関わらず、ＩＬ−１５ベースの治療法は幾つもの難題に直面している。例えば、ＩＬ−１５は急速に除去され、生理的条件下で比較的不安定である。幾つかの手法において、ＩＬ−１５をＩＬ−１５受容体αサブユニットと複合体化することによりこれらの制約を解消する試みがなされている。しかしながら、かかる手法は、複数の細胞型で発現するＩＬ−１５受容体αを介してユニークに起こる望ましいシグナル伝達を無効にし得る。比較的低分子量（５ｋＤａ）の炭酸スクシンイミジル末端ポリマーとの遊離不可能なペグ化が報告されているが、これはＩＬ−１５の生物学的活性が著しく改変される結果となった。Ｐｅｔｔｉｔ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（４）：２３１２−２３１８。

Ｇｒａｂｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４：９６５−９６８ Ｇｉｒｉ ｅｔ ａｌ．（１９９５）ＥＭＢＯ Ｊ．１４：３６５４−３６６３ ＤｉＳａｂｉｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ．２２：１９−３３ Ｓｔｅｅｌ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．３３（１）：３５−４１ Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２（１１），ｅ２６４４２：１−３ Ｐｅｔｔｉｔ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（４）：２３１２−２３１８

しかしながら、これらのコンジュゲートにも関わらず、改良された特性及びプロファイルを有するＩＬ−１５の新規コンジュゲートが依然として求められている。従って、特に、本発明の１つ又は複数の実施形態は、本明細書に記載するとおりのかかるコンジュゲート並びにコンジュゲートを含む組成物及び関連する方法に関し、これらは新規で、且つ当該技術分野では全く提案されたことのないものであると考えられる。

従って、本発明の１つ又は複数の実施形態では、コンジュゲートであって、水溶性ポリマーと共有結合したＩＬ−１５部分の残基を含むコンジュゲートが提供される。

本発明の１つ又は複数の実施形態では、コンジュゲートであって、水溶性ポリマーと共有結合したＩＬ−１５部分の残基を含むコンジュゲートが提供され、ＩＬ−１５部分の残基は遊離可能な連結を介して水溶性ポリマーと共有結合している。

本発明の１つ又は複数の実施形態では、コンジュゲートであって、水溶性ポリマーと共有結合したＩＬ−１５部分の残基を含むコンジュゲートが提供され、ＩＬ−１５部分の残基は遊離不可能な連結を介して水溶性ポリマーと共有結合しており、好ましくは水溶性ポリマーは５，０００ダルトンより高い重量平均分子量を有する。

本発明の１つ又は複数の実施形態では、コンジュゲートであって、水溶性ポリマーと共有結合したＩＬ−１５部分の残基を含むコンジュゲートが提供され、ＩＬ−１５部分は、ジスルフィド結合に関与しないシステイン残基を含まない。

本発明の１つ又は複数の実施形態では、コンジュゲートであって、水溶性ポリマーと共有結合したＩＬ−１５部分の残基を含むコンジュゲートが提供され、ＩＬ−１５部分はヒトＩＬ−１５と比較して追加のシステイン残基を有し、水溶性ポリマーがその追加のシステイン残基に共有結合している。

本発明の１つ又は複数の実施形態では、コンジュゲートであって、分枝鎖状水溶性ポリマーに共有結合したＩＬ−１５部分の残基を含むコンジュゲートが提供される。

本発明の１つ又は複数の実施形態では、コンジュゲートであって、水溶性ポリマーと共有結合したＩＬ−１５部分の残基を含むコンジュゲートが提供され、ＩＬ−１５部分のアミンがアミド連結以外の連結を介して水溶性ポリマーに共有結合している。

本発明の１つ又は複数の実施形態では、コンジュゲートであって、水溶性ポリマーと共有結合したＩＬ−１５部分の残基を含むコンジュゲートが提供され、ＩＬ−１５部分のアミンがアミン連結を介して水溶性ポリマーに共有結合している。

本発明の１つ又は複数の実施形態では、組成物であって、本明細書に記載されるとおりのコンジュゲートを薬学的に許容可能な賦形剤と共に含む組成物が提供される。

本発明の１つ又は複数の実施形態では、コンジュゲートの送達方法であって、ＩＬ−１５の残基と水溶性ポリマーとのコンジュゲートを含む組成物を患者に皮下投与するステップを含む方法が提供される。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
水溶性ポリマーに共有結合したＩＬ−１５部分の残基を含むコンジュゲート。
（項目２）
前記水溶性ポリマーに共有結合した前記ＩＬ−１５部分が、遊離可能な連結を介して共有結合している、項目１に記載のコンジュゲート。
（項目３）
前記水溶性ポリマーに共有結合した前記ＩＬ−１５部分が、安定な連結を介して共有結合している、項目１に記載のコンジュゲート。
（項目４）
前記水溶性ポリマーが分枝鎖状水溶性ポリマーである、項目１〜３のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
（項目５）
前記水溶性ポリマーが、ポリ（アルキレンオキシド）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリオキサゾリン、及びポリ（アクリロイルモルホリン）からなる群から選択されるポリマーである、項目１〜４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
（項目６）
前記水溶性ポリマーがポリ（アルキレンオキシド）である、項目５に記載のコンジュゲート。
（項目７）
前記ポリ（アルキレンオキシド）がポリ（エチレングリコール）である、項目６に記載のコンジュゲート。
（項目８）
前記ポリ（エチレングリコール）が、ヒドロキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、アルケノキシ、置換アルケノキシ、アルキノキシ、置換アルキノキシ、アリールオキシ及び置換アリールオキシからなる群から選択されるエンドキャップ部分で末端がキャップされている、項目７に記載のコンジュゲート。
（項目９）
前記水溶性ポリマーが、約５００ダルトン〜約１００，０００ダルトンの範囲の重量平均分子量を有する、項目１〜７のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
（項目１０）
前記コンジュゲートが、前記ＩＬ−１５部分の残基のアミン基に共有結合している、項目１〜１０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
（項目１１）
１個、２個、３個又は４個の水溶性ポリマーが前記ＩＬ−１５部分の残基に結合している、項目１〜１０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
（項目１２）
１個、２個又は３個の水溶性ポリマーが前記ＩＬ−１５部分の残基に結合している、項目１〜１０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
（項目１３）
１個又は２個の水溶性ポリマーが前記ＩＬ−１５部分の残基に結合している、項目１〜１０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
（項目１４）
１個の水溶性ポリマーが前記ＩＬ−１５部分の残基に結合している、項目１〜１０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
（項目１５）
水溶性ポリマーに共有結合したＩＬ−１５部分の残基を含むコンジュゲートであって、前記水溶性ポリマーが、共有結合する前には、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル基を有するポリマー試薬である、コンジュゲート。
（項目１６）
項目１〜１５のいずれか一項に記載のコンジュゲートと、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物。
（項目１７）
項目１６に記載の医薬組成物を個人に投与するステップを含む方法。
（項目１８）
コンジュゲート形成条件下で、ＩＬ−１５部分をポリマー試薬と接触させるステップを含むコンジュゲートの作製方法。

ＩＬ−１５と２０Ｋ ＰＥＧ２−ｒｕ−ＮＨＳとのコンジュゲーション反応混合物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。 ＩＬ−１５と４０Ｋ ＰＥＧ２−ｒｕ−ＮＨＳとのコンジュゲーション反応混合物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。 マウスに樹立したＢ１６Ｆ１０皮下腫瘍におけるＩＬ−１５（非コンジュゲート形態）、コンジュゲートｒＩＬ−１５、又はビヒクル対照の投与後のパーセント体重変化を示すプロットである。

本発明の１つ又は複数の実施形態を詳細に説明する前に、この発明は、特定のポリマー、合成方法、ＩＬ−１５部分などに限定されず、従って異なり得ることが理解されるべきである。

本明細書及び特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」が、文脈上特に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含むことは注記されるべきである。従って、例えば、「ポリマー（ａ ｐｏｌｙｍｅｒ）」と言うとき、それは単一のポリマー並びに２つ以上の同じ、又は異なるポリマーを含み、「任意選択の賦形剤（ａｎ ｏｐｔｉｏｎａｌ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）」と言うとき、それは単一の任意選択の賦形剤並びに２つ以上の同じ、又は異なる任意選択の賦形剤を指すなどする。

本発明の１つ又は複数の実施形態の説明及び特許請求においては、以下の専門用語を下記の定義に従い用いるものとする。

「ＰＥＧ」、「ポリエチレングリコール」、及び「ポリ（エチレングリコール）」は、本明細書で使用されるとき同義であり、任意の非ペプチド性水溶性ポリ（エチレンオキシド）を包含する。典型的には、本発明に従い使用されるＰＥＧは、以下の構造「−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎ−」（式中、（ｎ）は２〜４０００である）を含む。本明細書で使用されるとき、ＰＥＧはまた、末端酸素が例えば合成変換中に置換されたかどうかに応じて、「−ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｏ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−ＣＨ_２ＣＨ_２−」、及び「−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎＯ−」も含む。本明細書及び特許請求の範囲の全体を通じて、用語「ＰＥＧ」には、様々な末端基又は「エンドキャップ」基などを有する構造が含まれることに留意しなければならない。用語「ＰＥＧ」はまた、過半数の、すなわち５０％を超える−ＯＣＨ_２ＣＨ_２−の反復サブユニットを含むポリマーも意味する。具体的な形態に関して、ＰＥＧは、様々な分子量、並びに「分枝鎖状」、「直鎖状」、「フォーク型」、「多官能性」などの構造又は幾何形状のうちのいずれをとってもよく、これについては以下にさらに詳細に記載される。

用語「エンドキャップされた」及び「末端がキャップされた」は、本明細書では同義的に用いられ、ポリマーの末端又は終点がエンドキャップ部分を有することを指す。典型的には、必須ではないが、エンドキャップ部分はヒドロキシ基又はＣ_１〜２０アルコキシ基、より好ましくはＣ_１〜１０アルコキシ基、さらにより好ましくはＣ_１〜５アルコキシ基を含む。従って、エンドキャップ部分の例としては、アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ及びベンジルオキシ）、並びに、アリール、ヘテロアリール、シクロ、ヘテロシクロなどが挙げられる。エンドキャップ部分には、ポリマー中の末端単量体の１個又は複数の原子が含まれ得ることに留意しなければならない［例えば、ＣＨ_３Ｏ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−及びＣＨ_３（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎ−におけるエンドキャップ部分「メトキシ」］。加えて、前述の各々の飽和型、不飽和型、置換型、及び非置換型が想定される。さらに、エンドキャップ基はシランであってもよい。エンドキャップ基はまた、有利には検出可能標識も含み得る。ポリマーが検出可能標識を含むエンドキャップ基を有する場合、ポリマー及び／又はそのポリマーが結合している部分（例えば、活性薬剤）の量又は位置を、好適な検出器を用いて決定することができる。かかる標識としては、限定なしに、蛍光剤、化学発光剤、酵素標識に用いられる部分、比色（例えば、色素）、金属イオン、放射性部分などが挙げられる。好適な検出器としては、光度計、フィルム、分光計などが挙げられる。エンドキャップ基はまた、有利にはリン脂質も含み得る。ポリマーがリン脂質を含むエンドキャップ基を有する場合、ポリマー及び得られるコンジュゲートに固有の特性が付与される。例示的なリン脂質としては、限定なしに、ホスファチジルコリンと称されるクラスのリン脂質から選択されるものが挙げられる。具体的なリン脂質としては、限定なしに、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジオレイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステロイルホスファチジルコリン、ベヘノイルホスファチジルコリン、アラキドイルホスファチジルコリン、及びレシチンからなる群から選択されるものが挙げられる。エンドキャップ基はまた、ポリマー（並びにそれに結合するあらゆるもの、例えばＩＬ−１５部分）が目的の範囲に選択的に局在することができるように、標的部分も含み得る。

本明細書に記載されるとおりのポリマーに関して「天然に存在しない」とは、そのままの状態としては自然界に見ることのできないポリマーを意味する。しかしながら、天然に存在しないポリマーは、全体としてのポリマー構造が自然界に見られない限りにおいて、１つ又は複数の天然に存在する単量体又は単量体セグメントを含み得る。

「水溶性ポリマー」にあるような用語「水溶性の」ポリマーは、室温で水に対して可溶性の任意のポリマーである。典型的には、水溶性ポリマーは、ろ過後の同じ溶液により伝達される光（例えば波長６００ｎｍのもの）の少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約９５％を伝達する。水溶性ポリマーは、重量基準で、好ましくは水に対して少なくとも約３５％（重量）溶解することができ、より好ましくは水に対して少なくとも約５０％（重量）溶解することができ、さらにより好ましくは水に対して約７０％（重量）溶解することができ、さらにより好ましくは水に対して約８５％（重量）溶解することができる。しかしながら、最も好ましくは、水溶性ポリマーは水に対して約９５％（重量）溶解することができ、又は水に対して完全に溶解することができる。

水溶性ポリマー、例えばＰＥＧに関連した分子量は、数平均分子量又は重量平均分子量のいずれとしても表すことができる。特に指示されない限り、本明細書で分子量と言うときは全て、重量平均分子量を指す。数平均及び重量平均のいずれの分子量の測定も、ゲル浸透クロマトグラフィー法又は他の液体クロマトグラフィー法を用いて計測することができる。また、分子量の値を計測するための他の方法を用いて、例えば、末端基分析を用いるか、若しくは束一的性質（例えば、凝固点降下、沸点上昇、若しくは浸透圧）を計測することにより数平均分子量を決定してもよく、又は、光散乱法、超遠心法若しくは粘度測定法を用いることにより重量平均分子量を決定してもよい。本発明のポリマーは、典型的には多分散系であり（すなわち、ポリマーの数平均分子量と重量平均分子量とが等しくない）、好ましくは約１．２未満、より好ましくは約１．１５未満、さらにより好ましくは約１．１０未満、なおさらにより好ましくは約１．０５未満、及び最も好ましくは約１．０３未満の低い多分散性値を有する。

用語「活性の」、「反応性の」、又は「活性化された」は、特定の官能基と併せて使用されるとき、別の分子上の求電子剤又は求核剤と容易に反応する反応性官能基を指す。これは、反応させるために強力な触媒又は極めて非現実的な反応条件が必要な基（すなわち、「非反応性の」、又は「不活性の」基）と対比される。

本明細書で使用されるとき、用語「官能基」又はその任意の同義語は、その保護型並びに無保護型を包含することが意図される。

用語「スペーサー部分」、「連結」、及び「リンカー」は、本明細書では、例えば高分子剤の末端とＩＬ−１５部分又はＩＬ−１５部分の求電子剤若しくは求核剤との相互接続部分を場合により連結するために用いられる結合又は原子若しくは原子集合を指して用いられる。スペーサー部分は、加水分解に対して安定であってもよく、又は生理的に加水分解可能か、若しくは酵素分解可能な連結を含んでもよい。文脈上特に明確に指示されない限り、スペーサー部分は化合物の任意の２つの要素間に場合により存在する（例えば、ＩＬ−２部分の残基と水溶性ポリマーとを含む提供のコンジュゲートは、直接的にも、又はスペーサー部分を介して間接的にも結合することができる）。

「アルキル」は炭化水素鎖を指し、典型的には約１〜１５個の範囲の原子長さである。かかる炭化水素鎖は、必須ではないが好ましくは飽和しており、分枝鎖状であっても、又は直鎖状であってもよく、但し典型的には直鎖状が好ましい。例示的なアルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、３−メチルペンチルなどが挙げられる。

「低級アルキル」は、１〜６個の炭素原子を含むアルキル基を指し、直鎖状であっても、又は分枝鎖状であってもよく、メチル、エチル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、及びｔ−ブチルにより例示されるとおりである。

「シクロアルキル」は、飽和又は不飽和の環状炭化水素鎖を指し、架橋、縮合、又はスピロ環化された化合物を含み、好ましくは３〜約１２個の炭素原子、より好ましくは３〜約８個の炭素原子で構成される。「シクロアルキレン」は、環式環系における任意の２個の炭素で鎖を結合させることによりアルキル鎖に挿入されたシクロアルキル基を指す。

「アルコキシ」は、−ＯＲ基であって、式中、Ｒがアルキルか、又は置換アルキル、好ましくはＣ_１〜６アルキル（例えば、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシなど）である−ＯＲ基を指す。

例えば「置換アルキル」にあるような用語「置換された」は、限定はされないが、アルキル、Ｃ_３〜８シクロアルキル、例えば、シクロプロピル、シクロブチルなど；ハロ、例えば、フルオロ、クロロ、ブロモ、及びヨード；シアノ；アルコキシ、低級フェニル；置換フェニル；などの１つ又は複数の干渉しない置換基で置換された部分（例えば、アルキル基）を指す。「置換アリール」は、１つ又は複数の干渉しない基を置換基として有するアリールである。フェニル環に対する置換について、置換基はいかなる配向（すなわち、オルト、メタ、又はパラ）であってもよい。

「干渉しない置換基」は、分子中に存在するとき、典型的にはその分子中に含まれる他の官能基との反応性を有しない基である。

「アリール」とは、１つ又は複数の芳香環であって、各々が５個又は６個の中心炭素原子であるものを意味する。アリールは、ナフチルにおけるように縮合していることも、又はビフェニルにおけるように縮合していないこともある複数のアリール環を含む。アリール環はまた、１つ又は複数の環状炭化水素、ヘテロアリール、又は複素環式環と縮合していても、又は縮合していなくともよい。本明細書で使用されるとき、「アリール」にはヘテロアリールが含まれる。

「ヘテロアリール」は、１〜４個のヘテロ原子、好ましくは硫黄、酸素、若しくは窒素、又はそれらの組み合わせを含むアリール基である。ヘテロアリール環はまた、１つ又は複数の環状炭化水素、複素環式環、アリール環、又はヘテロアリール環と縮合していてもよい。

「複素環」又は「複素環式」とは、５〜１２個の原子、好ましくは５〜７個の原子の１つ又は複数の環であって、不飽和特性又は芳香族特性を伴うことも、又は伴わないこともあり、且つ炭素以外の少なくとも１個の環原子を有する環を意味する。好ましいヘテロ原子としては、硫黄、酸素、及び窒素が挙げられる。

「置換ヘテロアリール」は、１つ又は複数の干渉しない基を置換基として有するヘテロアリールである。

「置換複素環」は、干渉しない置換基から形成された１つ又は複数の側鎖を有する複素環である。

「有機ラジカル」は、本明細書で使用されるとき、アキル（ａｋｙｌ）、置換アルキル、アリール、及び置換アリールを含む。

「求電子剤」及び「求電子基」は、求電子中心、すなわち電子を求引する中心を有し、求核剤と反応することが可能なイオン又はイオン化し得る原子若しくは原子集合を指す。

「求核剤」及び「求核基」は、求核中心、すなわち求電子中心を求引する中心を有するか、又は求電子剤を伴う、イオン又はイオン化し得る原子若しくは原子集合を指す。

「酵素分解性連結」は、１つ以上の酵素によって分解を受ける連結を意味する。

「加水分解性」結合は、生理的条件下で水と反応する（即ち加水分解される）結合である。結合が水中で加水分解し易いかどうかは、２つの中心原子をつなぐ連結の一般的なタイプのみならず、それらの中心原子に結合する置換基にも依存し得る。加水分解に対して不安定な、又は加水分解を受け易い適切な連結としては、限定はされないが、カルボン酸エステル、リン酸エステル、無水物、アセタール、ケタール、アシルオキシアルキルエーテル、イミン、オルトエステル、ペプチド及びオリゴヌクレオチドが挙げられる。「遊離可能な結合」は、生理的条件下において臨床的に有用な速度で開裂する共有結合性の連結であり、例えば及び限定なしに、加水分解性結合及び酵素分解性連結が含まれる。

「加水分解に対して安定な」連結又は結合とは、水中で実質的に安定な、すなわち生理学的条件下で長期間にわたってもいかなる認め得る程度の加水分解も受けない化学結合、典型的には共有結合を指す。加水分解に対して安定な連結の例としては、限定はされないが、以下のもの：炭素−炭素結合（例えば、脂肪族鎖中）、エーテル、アミド、ウレタンなどが挙げられる。概して、加水分解に対して安定な連結とは、生理学的条件下で１日約１〜２％未満の加水分解率を呈するものである。代表的な化学結合の加水分解率については、多くの標準的な化学テキストを参照することができる。

「薬学的に許容可能な賦形剤又は担体」とは、場合により本発明の組成物中に含めることができ、患者に対して何ら有意な毒性の有害作用を引き起こすことのない賦形剤を指す。

「薬理学的な有効量」、「生理学的な有効量」、及び「治療上の有効量」は、本明細書では同義的に用いられ、血流中又は標的組織中に所望のレベルのコンジュゲート（又はそれに対応する非コンジュゲート化ＩＬ−１５部分）をもたらすのに必要なポリマー−（ＩＬ−１５）部分コンジュゲートの量を意味する。正確な量は、例えば、特定のＩＬ−１５部分、治療組成物の成分及び物理的特性、目的とする患者集団、個々の患者の考慮事項など数多くの要因に依存し、当業者は、本明細書に提供される情報に基づきそれを容易に決定することができる。

「多官能性」は、３個以上の官能基がそこに含まれるポリマーを意味し、ここでそれらの官能基は同じであっても又は異なってもよい。本発明の多官能性ポリマー試薬は、典型的には約３〜１００個の官能基を含むことになり、例えば、以下の範囲の１つ以上を満たす個数を含有し得る：３〜５０個の官能基；３〜２５個の官能基；３〜１５個の官能基；３〜１０個の官能基。例えば、官能基の個数は、ポリマー骨格内の３、４、５、６、７、８、９及び１０個の官能基からなる群から選択することができる。

用語「ＩＬ−１５部分」は、本明細書で使用されるとき、ヒトＩＬ−１５活性を有するペプチド又はタンパク質部分を指す。ＩＬ−１５部分はまた、ポリマー試薬との反応に好適な少なくとも１つの求電子基又は求核基も有し得る。加えて、用語「ＩＬ−１５部分」は、コンジュゲート形成前のＩＬ−１５部分並びにコンジュゲート形成後のＩＬ−１５部分残基の双方を包含する。以下にさらに詳細に説明するとおり、当業者は、任意の所与の部分がＩＬ−１５活性を有するかどうかを決定することができる。配列番号１〜３のいずれか１つに対応するアミノ酸配列を含むタンパク質、並びにそれと実質的に相同な任意のタンパク質又はポリペプチドが、ＩＬ−１５部分である。本明細書で使用されるとき、用語「ＩＬ−１５部分」には、例えば部位特異的突然変異誘発によって意図的に修飾されたか、又は突然変異によって偶発的に修飾されたかかるペプチド及びタンパク質が含まれる。これらの用語にはまた、１〜６個のさらなるグリコシル化部位を有する類似体、ペプチド又はタンパク質のカルボキシ末端側の終端部に、少なくとも１個のさらなるアミノ酸であって、少なくとも１つのグリコシル化部位を含む１個又は複数のさらなるアミノ酸を有する類似体、及び少なくとも１つのグリコシル化部位を含むアミノ酸配列を有する類似体も含まれる。この用語には、天然の部分及び組換え及び合成的に産生された部分の双方が含まれる。

用語「実質的に相同な」とは、特定の対象配列、例えば突然変異配列が、１つ又は複数の置換、欠失、又は付加だけ基準配列と異なるが、その正味の効果としては、基準配列と対象配列との間に機能上の有害な相違は生じないことを意味する。本発明の目的上、９５パーセントより高い相同性、等価な生物活性（必須ではないが等価な生物活性強度）、及び等価な発現特性を有する配列が、実質的に相同であると見なされる。相同性を決定する目的では、成熟配列のトランケーションは無視するものとする。本明細書で用いられる例示的なＩＬ−１５部分には、実質的に相同な配列番号１である配列が含まれる。

用語「断片」とは、ＩＬ−１５部分の一部又は断片のアミノ酸配列を有する任意のタンパク質又はポリペプチドであって、ＩＬ−１５の生物活性を有するものを意味する。断片には、ＩＬ−１５部分のタンパク質分解によって産生されたタンパク質又はポリペプチド、並びに当該技術分野においてルーチンの方法による化学合成によって産生されたタンパク質又はポリペプチドが含まれる。

用語「患者」とは、活性薬剤（例えば、コンジュゲート）を投与することにより予防又は治療することのできる病態を患っている、又はそうした病態に罹りやすい生物体を指し、ヒト及び動物の双方を含む。

「任意選択の」、又は「場合により」とは、続いて記載される状況が起こることも、又は起こらないこともあり、従ってその記載は、その状況が起こる場合と、それが起こらない場合とを含むことを意味する。

「実質的に」とは、ほぼ全面的又は完全に、という意味であり、例えば、以下のうちの１つ又は複数を満足する：条件の５０％超、５１％以上、７５％以上、８０％以上、９０％以上、及び９５％以上。

ペプチド中のアミノ酸残基は、以下のとおり略記される：フェニルアラニンはＰｈｅ又はＦであり；ロイシンはＬｅｕ又はＬであり；イソロイシンはＩｌｅ又はＩであり；メチオニンはＭｅｔ又はＭであり；バリンはＶａｌ又はＶであり；セリンはＳｅｒ又はＳであり；プロリンはＰｒｏ又はＰであり；スレオニンはＴｈｒ又はＴであり；アラニンはＡｌａ又はＡであり；チロシンはＴｙｒ又はＹであり；ヒスチジンはＨｉｓ又はＨであり；グルタミンはＧｌｎ又はＱであり；アスパラギンはＡｓｎ又はＮであり；リジンはＬｙｓ又はＫであり；アスパラギン酸はＡｓｐ又はＤであり；グルタミン酸はＧｌｕ又はＥであり；システインはＣｙｓ又はＣであり；トリプトファンはＴｒｐ又はＷであり；アルギニンはＡｒｇ又はＲであり；及びグリシンはＧｌｙ又はＧである。

本発明の１つ又は複数の実施形態について見ると、コンジュゲートであって、水溶性ポリマーと（直接、又はスペーサー部分を介して）共有結合したＩＬ−１５部分の残基を含むコンジュゲートが提供される。本発明のコンジュゲートは、以下の特徴のうちの１つ又は複数を有する。

ＩＬ−１５部分
先述のとおり、このコンジュゲートは、水溶性ポリマーと直接、又はスペーサー部分を介して共有結合したＩＬ−１５部分の残基を含む。本明細書で使用されるとき、用語「ＩＬ−１５部分」は、コンジュゲート形成前のＩＬ−１５部分、並びに非ペプチド性水溶性ポリマーと結合した後のＩＬ−１５部分を指すものとする。しかしながら、本来のＩＬ−１５部分が非ペプチド性水溶性ポリマーと結合すると、ポリマーとの連結に伴い１つ又は複数の共有結合が存在するため、ＩＬ−１５部分は僅かに変化することが理解されるであろう。多くの場合に、この別の分子と結合して僅かに変化した形態のＩＬ−１５部分は、ＩＬ−１５部分の「残基」と称される。

ＩＬ−１５部分は、非組換え方法からも、及び組換え方法からも得ることができ、本発明はこの点について限定されない。加えて、ＩＬ−１５部分は、ヒト供給源にも、動物供給源（昆虫を含む）にも、菌類供給源（イーストを含む）にも及び植物供給源にも由来し得る。

ＩＬ−１５部分は、Ｇｒａｂｓｔｅｉｎらによって記載される手順に従い得ることができる。Ｇｒａｂｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４：９６５−９６８を参照のこと。

ＩＬ−１５部分は、組換え方法によって誘導することができる。例えば、欧州特許第０７７２６２４Ｂ２号明細書を参照のこと。

ＩＬ−１５部分は、例えば、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ ＵＳＡ Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ）及びＰｅｐｒｏｔｅｃｈ（Ｒｏｃｋｙｈｉｌｌ，ＮＪ）から市販品を購入することができる。

ＩＬ−１５部分は、細菌［例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、例えば、Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１（３）：２９５−３１１を参照］、哺乳動物［例えば、Ｋｒｏｎｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｇｅｎｅ １２１：２９５−３０４を参照］、酵母［例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、例えば、Ｍｏｒｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３２８（１）：１２１−１２９を参照］、及び植物［例えば、Ｍｏｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．７５（３）：２５９−２６６を参照］の発現系で発現させることができる。発現は、外因性発現によっても（宿主細胞が天然で所望の遺伝コードを含む場合）又は内因性発現によっても起こり得る。

組換えに基づくタンパク質の調製方法には違いがあり得るが、典型的には、組換え方法には、所望のポリペプチド又は断片をコードする核酸の構築、核酸の発現ベクターへのクローニング、宿主細胞（例えば、植物、細菌、酵母、トランスジェニック動物細胞、又はチャイニーズハムスター卵巣細胞若しくはベビーハムスター腎臓細胞などの哺乳動物細胞）の形質転換、及び核酸の発現による所望のポリペプチド又は断片の産生が関わる。組換えポリペプチドをインビトロで原核生物及び真核生物の宿主細胞において産生し、発現させる方法は、当業者に公知である。

組換えポリペプチドの同定及び精製を促進するため、エピトープタグ又は他の親和性結合配列をコードする核酸配列を、コード配列とインフレームで挿入又は付加し、それにより所望のポリペプチドと、結合に適したポリペプチドとを含む融合タンパク質を産生することができる。融合タンパク質の同定及び精製は、初めに融合タンパク質を含む混合物を、融合タンパク質中のエピトープタグ又は他の結合配列に対する結合部分（例えば、抗体）を有するアフィニティーカラムに通過させ、それによって融合タンパク質をカラム内に結合させることにより行うことができる。その後、カラムを適切な溶液（例えば、酸）で洗浄して結合した融合タンパク質を遊離させることにより、融合タンパク質を回収することができる。組換えポリペプチドはまた、宿主細胞の溶解、ポリペプチドの、例えばイオン交換クロマトグラフィーによる分離、親和性結合手法、疎水性相互作用手法により精製し、その後、ＭＡＬＤＩ又はウエスタンブロットにより同定し、及びポリペプチドを回収することもできる。組換えポリペプチドを同定及び精製するためのこれらの及び他の方法は、当業者に公知である。しかしながら、本発明の１つ又は複数の実施形態では、ＩＬ−１５部分は融合タンパク質の形態ではない。

ＩＬ−１５活性を有するタンパク質の発現に用いられる系に応じて、ＩＬ−１５部分はグリコシル化されていなくても、又はグリコシル化されていてもよく、いずれも使用することができる。すなわち、ＩＬ−１５部分はグリコシル化されていなくてもよく、又はＩＬ−１５部分はグリコシル化されていてもよい。本発明の１つ又は複数の実施形態では、ＩＬ−１５部分はグリコシル化されていない。

ＩＬ−１５部分は、有利には、１つ又は複数のアミノ酸残基、例えば、リジン、システイン及び／又はアルギニンを含む及び／又は置換するように修飾することができ、それによりポリマーがそのアミノ酸の側鎖内の原子と結合し易くなる。ＩＬ−１５部分の置換の例は、米国特許第６，１７７，０７９号明細書に記載される。加えて、ＩＬ−１５部分は、天然に存在しないアミノ酸残基を含むように修飾することができる。アミノ酸残基及び天然に存在しないアミノ酸残基を付加する方法は、当業者に公知である。Ｊ．Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，４ｔｈ Ｅｄ．（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９９２）を参照されたい。

加えて、ＩＬ−１５部分は、有利には、官能基の結合（官能基を含むアミノ酸残基の付加によるものは除く）を含むように修飾することができる。例えば、ＩＬ−１５部分は、チオール基を含むように修飾することができる。加えて、ＩＬ−１５部分は、Ｎ末端のα炭素を含むように修飾することができる。加えて、ＩＬ−１５部分は、１つ又は複数の炭水化物部分を含むように修飾することができる。加えて、ＩＬ−１５部分は、アルデヒド基を含むように修飾することができる。加えて、ＩＬ−１５部分は、ケトン基を含むように修飾することができる。本発明の一部の実施形態では、ＩＬ−１５部分は、チオール基、Ｎ末端のα炭素、炭水化物、アルデヒド基（ａｄｅｈｙｄｅ ｇｒｏｕｐ）及びケトン基のうちの１つ又は複数を含むようには修飾されないことが好ましい。

例示的ＩＬ−１５部分は、本明細書、文献、並びに例えば米国特許出願公開第２００６／０１０４９４５号明細書、Ｐｅｔｔｉｔ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（４）：２３１２−２３１８、及びＷｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２（１１），ｅ２６４４２：１−３に記載される。好ましいＩＬ−１５部分には、配列番号１〜３からなる群から選択される配列、及びそれと実質的に相同の配列を含むアミノ酸配列を有するものが含まれる（ここで、配列番号２及び３、及びそれらと実質的に相同の配列が本明細書に提供されるＩＬ−１５部分のインビトロ活性基準を満たさない場合であっても、本発明の目的上、それらの配列もまた「ＩＬ−１５部分」であると理解されることは理解されるであろう）。好ましいＩＬ−１５部分は、配列番号１に対応するアミノ酸配列を有する。

場合によっては、ＩＬ−１５部分は、対応するペプチドの単一の発現が個別の単位として体系付けられる「単量体」形態であり得る。他の場合には、ＩＬ−１５部分は、２つの単量体形態のタンパク質が互いに会合している「二量体」の形態（例えば、組換えＩＬ−１５の二量体）であり得る。

加えて、前駆体形態ＩＬ−１５をＩＬ−１５部分として使用することができる。例示的な前駆体形態のＩＬ−１５は配列番号３の配列を有する。

前述の配列のいずれかのトランケート型、ハイブリッド変異体、及びペプチド模倣物もまた、ＩＬ−１５部分として働き得る。少なくともある程度のＩＬ−１５活性を維持する前述のいずれかの生物学的に活性な断片、欠失変異体、置換変異体又は付加変異体もまた、ＩＬ−１５部分として働き得る。

所与のペプチド、タンパク質部分又はコンジュゲートについて、当該のペプチド、タンパク質部分又はコンジュゲートがＩＬ−１５活性を有するかどうかを決定することが可能である。インビトロＩＬ−１５活性を決定するための様々な方法が当該技術分野において記載されている。例示的手法はｐＳＴＡＴアッセイに基づく。簡潔に言えば、ＩＬ−１５依存性ＣＴＬＬ−２細胞がＩＬ−１５活性を有する被験物質に曝露された場合、結果として、定量的に計測することのできるチロシン残基６９４（Ｔｙｒ６９４）におけるＳＴＡＴ５のリン酸化を含むシグナル伝達カスケードが惹起される。アッセイプロトコル及びキットは公知であり、例えば、ＭＳＤ Ｐｈｏｓｐｈｏ（Ｔｙｒ６９４）／Ｔｏｔａｌ ＳＴＡＴａ，ｂ全細胞ライセートキット（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）（実施例１に関連して使用した）が含まれる；この手法を用いて、５分又は１０分の少なくとも一方の時点で少なくとも３００ｎｇ／ｍＬ（より好ましくは少なくとも１５０ｎｇ／ｍＬ）のｐＳＴＡＴ５ ＥＣ_５０値を呈する候補ＩＬ−１５部分が、本発明に関連した「ＩＬ−１５部分」であると見なされる。しかしながら、本発明で使用されるＩＬ−１５部分はより強力である（例えば、５分又は１０分の少なくとも一方の時点で１５０ｎｇ／ｍＬ未満、例えば５分又は１０分の少なくとも一方の時点で１ｎｇ／ｍＬ未満、さらにより好ましくは０．５ｎｇ／ｍＬ未満のｐＳＴＡＴ５ ＥＣ_５０値を有する）ことが好ましい。安定した連結を含むコンジュゲートは、１０分の時点で少なくとも３００ｎｇ／ｍＬ（より好ましくは少なくとも１５０ｎｇ／ｍＬ）のｐＳＴＡＴ５ ＥＣ_５０値を呈することが好ましく、安定した連結を含むコンジュゲートは１０分の時点で１５０ｎｇ／ｍＬ未満のｐＳＴＡＴ５ ＥＣ_５０値を呈することがより好ましい。

電位測定法、分光測定法、クロマトグラフィー法、及び放射測定法を含めた当該技術分野において公知の他の方法もまた、ＩＬ−１５機能の評価に用いることができる。一つのかかる別のタイプのアッセイについては、例えば、Ｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３（１２）：１１８７−１１９５を参照のこと。

ＩＬ−１５部分の活性の計測に関連して用いられるアッセイはまた、本明細書に記載されるコンジュゲートの活性の計測にも用いることができる。しかしながら、所与のコンジュゲートの特性（例えば、遊離可能な連結の取り込み、代謝耐性能力、高い半減期、選択的結合特性など）に起因して、必ずしもコンジュゲートが本明細書で定義されるＩＬ−１５部分と同じ活性を呈しなければならないわけではない。

水溶性ポリマー
先に考察したとおり、各コンジュゲートは水溶性ポリマーと結合したＩＬ−１５部分を含む。水溶性ポリマーに関して、水溶性ポリマーは非ペプチド性で、非毒性であり、天然には存在せず、且つ生体適合性である。生体適合性に関して、物質は、生体組織に関連して物質を単独で、又は別の物質（例えば、ＩＬ−１５部分などの活性薬剤）と共に使用すること（例えば、患者への投与）に伴う有益な作用が、臨床医、例えば医師が評価するとき、いかなる有害な作用にも勝る場合に、生体適合性であると見なされる。非免疫原性に関して、物質は、生体内での物質の意図される使用によって望ましくない免疫反応（例えば、抗体の形成）が生じることがない場合か、又は、免疫反応が生じる場合にも、かかる反応が、臨床医の評価で臨床的に有意、又は重要とは見なされない場合に、非免疫原性であると見なされる。非ペプチド性水溶性ポリマーは、生体適合性且つ非免疫原性であることが特に好ましい。

さらに、このポリマーは、典型的には２〜約３００個の末端を有するものとして特徴付けられる。かかるポリマーの例としては、限定はされないが、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、ポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ」）、エチレングリコールとプロピレングリコールとの共重合体などのポリ（アルキレングリコール）、ポリ（オキシエチレン化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（メタクリル酸ヒドロキシアルキル）、ポリ（サッカライド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン（「ＰＯＺ」）（これについては、国際公開第２００８／１０６１８６号パンフレットに記載されている）、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）、及び前述のいずれかの組み合わせが挙げられる。

水溶性ポリマーは特定の構造に限定されず、直鎖状（例えば、エンドキャップされた、例えばアルコキシＰＥＧ又は二官能性ＰＥＧ）、分枝鎖状又は多腕状（例えば、フォーク型ＰＥＧ又はポリオール核と結合したＰＥＧ）、樹木状（又は星型）の構造であってもよく、各々は、１つ又は複数の分解可能な連結を有することも、又は有しないこともある。さらに、水溶性ポリマーの内部構造は、種々の反復パターンのいずれとして体系付けられてもよく、ホモポリマー、交互共重合体、ランダム共重合体、ブロック共重合体、交互トリコポリマー、ランダムトリコポリマー、及びブロックトリコポリマーからなる群から選択することができる。

典型的には、活性化ＰＥＧ及び他の活性化水溶性ポリマー（すなわち、ポリマー試薬）は、ＩＬ−１５部分上の所望の部位とのカップリングに適した好適な活性化基により活性化される。従って、ポリマー試薬は、ＩＬ−１５部分と反応するための反応基を有する。代表的なポリマー試薬及びこうしたポリマーを活性部分とコンジュゲート化するための方法は、当該技術分野において公知であり、Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．ら、“Ｕｓｅ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ Ｐｏｌｙ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌｓ）ｆｏｒ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ”、「Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」所収、Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ、Ｐｌｅｎｕｓ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２年）、及びＺａｌｉｐｓｋｙ（１９９５年）Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｒｅｖｉｅｗｓ １６：１５７−１８２頁にさらに記載されている。ＩＬ−１５部分のカップリングに好適な例示的活性化基としては、特に、ヒドロキシル、マレイミド、エステル、アセタール、ケタール、アミン、カルボキシル、アルデヒド、アルデヒド水和物、ケトン、ビニルケトン、チオン、チオール、ビニルスルホン、ヒドラジンが挙げられる。

典型的には、コンジュゲート中の水溶性ポリマーの重量平均分子量は、約１００ダルトン〜約１５０，０００ダルトンである。しかしながら、例示的範囲としては、５，０００ダルトン超〜約１００，０００ダルトンの範囲、約６，０００ダルトン〜約９０，０００ダルトンの範囲、約１０，０００ダルトン〜約８５，０００ダルトンの範囲、１０，０００ダルトン超〜約８５，０００ダルトンの範囲、約２０，０００ダルトン〜約８５，０００ダルトンの範囲、約５３，０００ダルトン〜約８５，０００ダルトンの範囲、約２５，０００ダルトン〜約１２０，０００ダルトンの範囲、約２９，０００ダルトン〜約１２０，０００ダルトンの範囲、約３５，０００ダルトン〜約１２０，０００ダルトンの範囲、及び約４０，０００ダルトン〜約１２０，０００ダルトンの範囲の重量平均分子量が挙げられる。任意の所与の水溶性ポリマーについて、これらの範囲のうちの１つ又は複数の分子量を有するＰＥＧが好ましい。

水溶性ポリマーについての例示的な重量平均分子量としては、約１００ダルトン、約２００ダルトン、約３００ダルトン、約４００ダルトン、約５００ダルトン、約６００ダルトン、約７００ダルトン、約７５０ダルトン、約８００ダルトン、約９００ダルトン、約１，０００ダルトン、約１，５００ダルトン、約２，０００ダルトン、約２，２００ダルトン、約２，５００ダルトン、約３，０００ダルトン、約４，０００ダルトン、約４，４００ダルトン、約４，５００ダルトン、約５，０００ダルトン、約５，５００ダルトン、約６，０００ダルトン、約７，０００ダルトン、約７，５００ダルトン、約８，０００ダルトン、約９，０００ダルトン、約１０，０００ダルトン、約１１，０００ダルトン、約１２，０００ダルトン、約１３，０００ダルトン、約１４，０００ダルトン、約１５，０００ダルトン、約２０，０００ダルトン、約２２，５００ダルトン、約２５，０００ダルトン、約３０，０００ダルトン、約３５，０００ダルトン、約４０，０００ダルトン、約４５，０００ダルトン、約５０，０００ダルトン、約５５，０００ダルトン、約６０，０００ダルトン、約６５，０００ダルトン、約７０，０００ダルトン、及び約７５，０００ダルトンが挙げられる。前述のいずれかの総分子量を有する分枝鎖型の水溶性ポリマー（例えば、２つの２０，０００ダルトンのポリマーを含む４０，０００ダルトンの分枝鎖状水溶性ポリマー）もまた、使用することができる。１つ又は複数の実施形態において、コンジュゲートは、直接的にも、又は間接的にも、約６，０００ダルトン未満の重量平均分子量を有するＰＥＧと結合したＰＥＧ部分は有しない。

ポリマーとして用いられるとき、ＰＥＧは、典型的には複数の（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）単量体［又は（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）単量体、ＰＥＧがどのように定義されるかによる］を含む。この説明全体を通じた使用について、反復単位の数は、「（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎ」の添え字「ｎ」によって特定される。従って、（ｎ）の値は、典型的には以下の範囲の１つ又は複数のなかに含まれる：２〜約３４００、約１００〜約２３００、約１００〜約２２７０、約１３６〜約２０５０、約２２５〜約１９３０、約４５０〜約１９３０、約１２００〜約１９３０、約５６８〜約２７２７、約６６０〜約２７３０、約７９５〜約２７３０、約７９５〜約２７３０、約９０９〜約２７３０、及び約１，２００〜約１，９００。分子量が既知の任意の所与のポリマーについては、ポリマーの総重量平均分子量を反復単量体の分子量で除算することにより、反復単位の数（すなわち、「ｎ」）を決定することが可能である。

本発明での使用に特に好ましいポリマーの一つは、エンドキャップされたポリマー、すなわち、少なくとも１つの末端が下級Ｃ_１〜６アルコキシ基などの比較的不活性な基で（但し、ヒドロキシル基も用いることができる）キャッピングされたポリマーである。例えば、ポリマーがＰＥＧであるとき、メトキシＰＥＧ（一般にｍＰＥＧと称される）を使用することが好ましく、このメトキシＰＥＧは、ポリマーの一方の末端がメトキシ（−ＯＣＨ_３）基で、それに対し他の末端が、場合により化学修飾されていてもよいヒドロキシル又は他の官能基である直鎖型のＰＥＧである。

本発明の１つ又は複数の実施形態で有用な一形態において、遊離ＰＥＧ又は非結合ＰＥＧは、各末端がヒドロキシル基で終端している直鎖状ポリマー：
ＨＯ−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−ＣＨ_２ＣＨ_２−ＯＨ
であり、式中、（ｎ）は典型的には０〜約４，０００の範囲である。

上記のポリマー、α−、ω−ジヒドロキシルポリ（エチレングリコール）は、簡略な形ではＨＯ−ＰＥＧ−ＯＨと表すことができ、ここでは−ＰＥＧ−記号が、以下の構造単位を表し得ることが理解される：
−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−ＣＨ_２ＣＨ_２−
式中、（ｎ）は上記に定義されるとおりである。

本発明の１つ又は複数の実施形態で有用な別のタイプのＰＥＧは、メトキシＰＥＧ−ＯＨ、又は簡略にはｍＰＥＧであり、これは一方の末端が比較的不活性なメトキシ基で、それに対し他方の末端がヒドロキシル基である。ｍＰＥＧの構造は、以下に示すとおりである。
ＣＨ_３Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−ＣＨ_２ＣＨ_２−ＯＨ
式中、（ｎ）は上記のとおりである。

米国特許第５，９３２，４６２号明細書に記載されるような多腕状又は分枝鎖状ＰＥＧ分子もまた、ＰＥＧポリマーとして使用することができる。例えば、ＰＥＧは以下の構造を有し得る：

式中：
ｐｏｌｙ_ａ及びｐｏｌｙ_ｂは、メトキシポリ（エチレングリコール）などのＰＥＧ骨格であり（いずれも同じか、又は異なる）；
Ｒ”は、Ｈ、メチル又はＰＥＧ骨格などの非反応性部分であり；及び
Ｐ及びＱは、非反応性の連結である。好ましい実施形態において、分枝鎖状ＰＥＧポリマーはメトキシポリ（エチレングリコール）二置換リジンである。使用される具体的なＩＬ−１５部分によっては、二置換リジンの反応性エステル官能基がさらに修飾され、ＩＬ−１５部分内の標的基との反応に好適な官能基を形成してもよい。

加えて、ＰＥＧはフォーク型ＰＥＧを含むことができる。フォーク型ＰＥＧの例は、以下の構造によって表される：

式中：Ｘは、１個又は複数の原子のスペーサー部分であり、各Ｚは、一定長の原子鎖によってＣＨと連結された活性化末端基である。国際公開第９９／４５９６４号パンフレットは、本発明の１つ又は複数の実施形態に用いることが可能な様々なフォーク型ＰＥＧ構造を開示している。Ｚ官能基を分枝鎖状炭素原子と連結する原子鎖はテザー基として働き、例えば、アルキル鎖、エーテル鎖、エステル鎖、アミド鎖及びそれらの組み合わせを含み得る。

ＰＥＧポリマーは、カルボキシルなどの反応基が、ＰＥＧ鎖の末端ではなく、ＰＥＧの長さに沿って共有結合するペンダント型ＰＥＧ分子を含み得る。ペンダント型の反応基はＰＥＧと直接、又はアルキレン基などのスペーサー部分を介して結合することができる。

上述した形態のＰＥＧに加え、ポリマーはまた、上述のポリマーのいずれかを含め、ポリマー中に１つ又は複数の弱い、又は分解可能な連結を含むように調製することもできる。例えば、ＰＥＧは、加水分解を受けやすいエステル連結をポリマー中に含むように調製することができる。以下に示されるとおり、この加水分解の結果として、ポリマーがより低い分子量の断片に切断される：
−ＰＥＧ−ＣＯ_２−ＰＥＧ−＋Ｈ_２Ｏ→−ＰＥＧ−ＣＯ_２Ｈ＋ＨＯ−ＰＥＧ−

ポリマー骨格内の分解可能な連結として、及び／又はＩＬ−１５部分との分解可能な連結として有用な、加水分解により分解可能な他の連結としては、カーボネート連結；例えばアミンとアルデヒドとの反応から得られるイミン連結（例えば、Ｏｕｃｈｉら（１９９７年）Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｐｒｅｐｒｉｎｔｓ ３８（１）：５８２−３頁を参照）；例えばアルコールをリン酸基と反応させることによって形成されるリン酸エステル連結；典型的にはヒドラジドとアルデヒドとの反応によって形成されるヒドラゾン連結；典型的にはアルデヒドとアルコールとの間の反応によって形成されるアセタール連結；例えばギ酸塩とアルコールとの間の反応によって形成されるオルトエステル連結；例えばＰＥＧなどのポリマーの末端にあるアミン基と別のＰＥＧ鎖のカルボキシル基とによって形成されるアミド連結；例えば末端イソシアネート基を有するＰＥＧとＰＥＧアルコールとの反応から形成されるウレタン連結；ＰＥＧなどのポリマーの末端にあるアミン基とペプチドのカルボキシル基とによって形成されるペプチド連結；及び、例えば、例えばポリマーの末端にあるホスホラミダイト基とオリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシル基とによって形成されるオリゴヌクレオチド連結が挙げられる。

コンジュゲートのかかる任意選択の特徴、すなわち、１つ又は複数の分解可能な連結を高分子鎖の中に、又はＩＬ−１５部分に対して導入することは、コンジュゲートを投与したときの、その最終的な所望の薬理学的特性に対してさらなる制御をもたらし得る。例えば、大型で比較的不活性なコンジュゲート（すなわち、１つ又は複数の高分子量のＰＥＧ鎖、例えば約１０，０００より大きい分子量を有する１つ又は複数のＰＥＧ鎖がそこに結合しているもの、この場合、コンジュゲートは本質的に生物活性を有しない）が投与されてもよく、これは加水分解されて、元のＰＥＧ鎖の一部を有する生物活性コンジュゲートを生じる。このようにして、時間の経過に伴うコンジュゲートの生物活性が平衡するように、コンジュゲートの特性をより効果的に調整することができる。

コンジュゲートに関連する水溶性ポリマーはまた、「遊離可能」であってもよい。すなわち、水溶性ポリマーは放出され（加水分解、酵素過程、触媒過程又は他の方法のいずれかにより）、それによりコンジュゲート化されていないＩＬ−１５部分がもたらされる。ある場合には、遊離可能ポリマーは、インビボで、水溶性ポリマーのいかなる断片も残さずＩＬ−１５部分から離れる。別の場合には、遊離可能ポリマーは、インビボで、水溶性ポリマーからの比較的小さい断片（例えば、コハク酸タグ）を残してＩＬ−１５部分から離れる。例示的な開裂可能ポリマーには、カーボネート連結を介してＩＬ−１５部分に結合するものが含まれる。

当業者は、前述の非ペプチド性水溶性ポリマーに関する考察が、何ら網羅的なものではなく、単に例示に過ぎず、上記の質を有するあらゆるポリマー材料が企図されることを認識するであろう。本明細書で使用されるとき、用語「ポリマー試薬」は、概して、水溶性ポリマーセグメントと官能基とを含み得る分子全体を指す。

上記のとおり、本発明のコンジュゲートは、ＩＬ−１５部分と共有結合した水溶性ポリマーを含む。典型的には、任意の所与のコンジュゲートについて、１〜３個の水溶性ポリマーが、ＩＬ−１５活性を有する１つ又は複数の部分と共有結合している。しかしながら、ある場合には、コンジュゲートは、ＩＬ−１５部分と個々に結合した１、２、３、４、５、６、７、８個又はそれ以上の水溶性ポリマーを有し得る。任意の所与の水溶性ポリマーは、ＩＬ−１５部分のアミノ酸か、又はＩＬ−１５部分が（例えば）糖タンパク質である場合には、ＩＬ−１５部分の炭水化物と共有結合し得る。炭水化物との結合は、例えば、シアル酸−アジド化学反応を用いる代謝的官能化（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）［Ｌｕｃｈａｎｓｋｙら（２００４年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３（３８）：１２３５８−１２３６６頁］、又はグリシドールの使用によりアルデヒド基の導入を促進する［Ｈｅｌｄｔら（２００７年）Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２：５４２９−５４３３頁］などの他の好適な手法を利用して行ってもよい。

ＩＬ−１５活性を有する部分とポリマーとの内部の特定の連結は、様々な要因に依存する。かかる要因としては、例えば、用いられる特定の連結の化学的特性、特定のＩＬ−１５部分、ＩＬ−１５部分内の利用可能な官能基（ポリマーと結合するためのものか、又は好適な結合部位に変換されるためのもの）、ＩＬ−１５部分内における別の反応性官能基の存在などが挙げられる。

本発明のコンジュゲートは、必須ではないが、プロドラッグであってもよく、すなわちこれは、ポリマーとＩＬ−１５部分との間の連結が加水分解的に遊離可能で、それにより親部分を放出できることを意味する。例示的な遊離可能な連結としては、カルボン酸エステル、リン酸エステル、チオールエステル、無水物、アセタール、ケタール、アシルオキシアルキルエーテル、イミン、オルトエステル、ペプチド及びオリゴヌクレオチドが挙げられる。かかる連結は、ＩＬ−１５部分（例えば、タンパク質のカルボキシル基Ｃ末端、又はタンパク質中に含まれるセリン又はスレオニンなどのアミノ酸の側鎖ヒドロキシル基、又は炭水化物中の同様の官能基）及び／又はポリマー試薬のいずれかを、当該技術分野で一般的に用いられるカップリング方法を用いて適切に修飾することにより、容易に調製することができる。しかしながら、最も好ましくは、好適に活性化されたポリマーを、ＩＬ−１５活性を有する部分中に含まれる修飾されていない官能基と反応させることにより容易に形成される加水分解性の連結である。

或いは、加水分解に対して安定な連結、例えば、アミド、ウレタン（カルバメートとしても知られる）、アミン、チオエーテル（スルフィドとしても知られる）、又は尿素（カルバミドとしても知られる）連結もまた、ＩＬ−１５部分のカップリング用連結として用いることができる。さらに、加水分解に対して安定な連結としては、アミドが好ましい。一手法では、活性化エステルを有する水溶性ポリマーを、ＩＬ−１５部分のアミン基と反応させて、それによりアミド連結を生じさせることができる。

コンジュゲートは（コンジュゲートされていないＩＬ−１５部分と対比されるものとして）、測定可能な程度のＩＬ−１５活性を有することも、又は有しないこともある。すなわち、本発明に係るポリマー−ＩＬ−１５部分コンジュゲートは、修飾されていない親ＩＬ−１５部分の約０．１％〜約１００％の範囲の生物活性を有し得る。ある場合には、ポリマー−ＩＬ−１５部分コンジュゲートは、修飾されていない親ＩＬ−１５部分の１００％より大きい生物活性を有し得る。好ましくは、ＩＬ−１５活性をほとんど又は全く有しないコンジュゲートは、ポリマーを部分とつなぐ加水分解可能な連結を含み、そのためコンジュゲート中に活性が欠如している（又は比較的欠如している）こととは関係なしに、加水分解可能な連結が水により誘発されて切断されると、活性な親分子（又はその誘導体）が放出される。かかる活性は、用いられるＩＬ−１５活性を有する特定の部分についての既知の活性に応じて、好適なインビボ又はインビトロモデルを用いて測定し得る。

加水分解に対して安定な連結を有し、それがＩＬ−１５活性を有する部分をポリマーとカップリングするコンジュゲートについて、このコンジュゲートは、典型的には測定可能な程度の生物活性を有する。例えば、かかるコンジュゲートは、典型的には、コンジュゲートされないＩＬ−１５部分の生物活性と比べた以下の割合のうちの１つ又は複数を満足する生物活性を有するものとして特徴付けられる：少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約１００％、及び１０５％超（当該技術分野において周知のものなど、好適なモデルでの測定時）。好ましくは、加水分解に対して安定な連結（例えば、アミド連結）を有するコンジュゲートは、修飾されていない親のＩＬ−１５活性を有する部分の生物活性の少なくともある程度を有する。

ここで、本発明に係る例示的なコンジュゲートを説明する。典型的には、かかるＩＬ−１５部分は、配列番号１〜３の少なくとも１つに提供される配列と同様のアミノ酸配列を（少なくとも一部において）共有するものと予想される。従って、配列番号１〜３内の特定の位置又は原子が参照されるものの、そうした参照は便宜上に過ぎず、当業者は、ＩＬ−１５活性を有する他の部分における対応する位置又は原子を容易に決定し得る。特に、天然ヒトＩＬ−１５に関して本明細書に提供される説明は、多くの場合に、前述のいずれかの断片、欠失変異体、置換変異体又は付加変異体に適用することができる。

ＩＬ−１５部分のアミノ基は、ＩＬ−１５部分と水溶性ポリマーとの間の結合点を提供する。配列番号１〜３に提供されるアミノ酸配列を使用すると、コンジュゲートに利用し得るε−アミノ酸を有する数個のリジン残基が各々にあることは明らかである。さらに、いずれのタンパク質のＮ末端アミンもまた、結合点として機能することができる。

ＩＬ−１５部分の利用可能なアミンとの共有結合性の連結を形成するのに有用な好適なポリマー試薬の例は、数多くある。具体例について、対応するコンジュゲートと共に以下の表１に提供する。表中、変数（ｎ）は反復単量体単位の数を表し、「−ＮＨ−（ＩＬ−１５）」は、ポリマー試薬とのコンジュゲート形成後のＩＬ−１５部分の残基を表す。表１に示される各ポリマー部分［例えば、（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎ又は（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ］は末端が「ＣＨ_３」基であるが、これは他の基（Ｈ及びベンジルなど）に置換されてもよい。

ＩＬ−１５部分のアミノ基とのポリマー試薬のコンジュゲート形成は、様々な方法で達成することができる。一手法では、ＩＬ−１５部分が、スクシンイミジル誘導体（又は他の活性化エステル基、この場合、そうした代替的な活性化エステル基を含有するポリマー試薬について記載されるものと同様の手法を用いることができる）により官能化されたポリマー試薬とコンジュゲート化され得る。この手法では、スクシンイミジル誘導体を有するポリマーは、ｐＨ７〜９．０の水性媒体中でＩＬ−１５部分と結合し得るが、異なる反応条件を用いると（例えば、６〜７などのより低いｐＨ、又は異なる温度及び／又は１５℃未満）、結果としてポリマーは、ＩＬ−１５部分の異なる位置に結合し得る。加えて、アミン末端を有する非ペプチド性水溶性ポリマーを、活性なカルボン酸基を有するＩＬ−１５部分と反応させることにより、アミド連結を形成することができる。

例示的コンジュゲートは、以下の構造に包含される

式中：
（ｎ）は、２〜４０００の値を有する整数であり；
Ｘは、スペーサー部分であり；
Ｒ^１は、有機ラジカルであり；及び
ＩＬ−１５は、ＩＬ−１５部分の残基である。

例示的コンジュゲートは、以下の構造に包含される：

式中、（ｎ）は２〜４０００の値を有する整数であり、及びＩＬ−１５は、ＩＬ−１５部分の残基である。

ＩＬ−１５部分のポリマー試薬とのコンジュゲート化に有用な別の手法としては、還元的アミノ化を用いることによるＩＬ−１５部分の第一級アミンの、ケトン、アルデヒド又はその水和物形態（例えば、ケトン水和物、アルデヒド水和物）で官能化されたポリマー試薬とのコンジュゲート化が典型的である。この手法では、ＩＬ−１５部分の第一級アミンがアルデヒド又はケトンのカルボニル基（又はそれに対応する水和アルデヒド又はケトンのヒドロキシル含有基）と反応し、それによりシッフ塩基が形成される。ひいては、次にシッフ塩基が、水素化ホウ素ナトリウムなどの還元剤を使用することにより安定なコンジュゲートに還元的に変換され得る。特に、ケトン又はα−メチル分枝鎖アルデヒドで官能化されたポリマーを用いると、及び／又は特定の反応条件下（例えば、低いｐＨ）では、選択的な反応（例えば、Ｎ末端における）が可能である。

水溶性ポリマーが分枝鎖型である本発明の例示的コンジュゲートには、水溶性ポリマーが以下の構造に包含されるものが含まれる：

式中、各（ｎ）は、独立して２〜４０００の値を有する整数である。

本発明の例示的コンジュゲートは、以下の構造に包含される：

式中：
各（ｎ）は、独立して２〜４０００の値を有する整数であり；
Ｘはスペーサー部分であり；
（ｂ）は、２〜６の値を有する整数であり；
（ｃ）は、２〜６の値を有する整数であり；
Ｒ^２は、存在するごとに、独立してＨ又は低級アルキルであり；及び
ＩＬ−１５は、ＩＬ−１５部分の残基である。

本発明の例示的コンジュゲートは、以下の構造に包含される：

式中：
各（ｎ）は、独立して２〜４０００の値を有する整数であり；及び
ＩＬ−１５は、ＩＬ−１５部分の残基である。

本発明の他の例示的コンジュゲートは、以下の構造に包含される：

式中：
各（ｎ）は、独立して２〜４０００の値を有する整数であり；
（ａ）は、０又は１のいずれかであり；
Ｘは、存在するとき、１つ又は複数の原子を含むスペーサー部分であり；
（ｂ’）は、０又は１〜１０の値を有する整数であり；
（ｃ）は、１〜１０の値を有する整数であり；
Ｒ^２は、存在するごとに、独立してＨ又は有機ラジカルであり；
Ｒ^３は、存在するごとに、独立してＨ又は有機ラジカルであり；及び
ＩＬ−１５は、ＩＬ−１５部分の残基である。

本発明のさらに別の例示的コンジュゲートは、以下の構造に包含される：

式中：
各（ｎ）は、独立して２〜４０００の値を有する整数であり；及び
ＩＬ−１５は、ＩＬ−１５部分の残基である。

遊離可能な連結を含む例示的コンジュゲートには、ＩＬ−１５部分が、以下の式に包含されるポリマー試薬とコンジュゲート化されるものが含まれる：

式中：
ＰＯＬＹ^１は、第１の水溶性ポリマーであり；
ＰＯＬＹ^２は、第２の水溶性ポリマーであり；
Ｘ^１は、第１のスペーサー部分であり；
Ｘ^２は、第２のスペーサー部分であり；
Ｈ_αは、イオン化水素原子であり；
Ｒ^１は、Ｈ又は有機ラジカルであり；
Ｒ^２は、Ｈ又は有機ラジカルであり；
（ａ）は、０又は１のいずれかであり；
（ｂ）は、０又は１のいずれかであり；
Ｒ^ｅ１は、存在するとき、第１の電子改変基であり；
Ｒ^ｅ２は、存在するとき、第２の電子改変基であり；及び
（ＦＧ）は、活性薬剤のアミノ基と反応してカルバメート連結などの遊離可能な連結を形成することが可能な官能基である。この式中、さらに確定的な構造を有するポリマー試薬が企図される：

式中、ＰＯＬＹ^１、ＰＯＬＹ^２、Ｘ^１、Ｘ^２、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｈ_α及び（ＦＧ）の各々は、先に定義したとおりであり、及びＲ^ｅ１は第１の電子改変基であり；及びＲ^ｅ２は第２の電子改変基である。

さらに別の例示的ポリマー試薬は、以下の式に含まれる：


式中、各構造について、かつ各例において、（ｎ）は、独立して４〜１５００の整数である。

これらの遊離可能な連結を提供するポリマー試薬は、米国特許出願公開第２００６／０２９３４９９号明細書に記載される手順に従い調製することができる。

遊離可能な連結を提供するポリマー試薬を使用して形成される例示的コンジュゲートには、以下の式のものが含まれる：

式中：
ＰＯＬＹ^１は、第１の水溶性ポリマーであり；
ＰＯＬＹ^２は、第２の水溶性ポリマーであり；
Ｘ^１は、第１のスペーサー部分であり；
Ｘ^２は、第２のスペーサー部分であり；
Ｈ_αは、イオン化水素原子であり；
Ｒ^１は、Ｈ又は有機ラジカルであり；
Ｒ^２は、Ｈ又は有機ラジカルであり；
（ａ）は、０又は１のいずれかであり；
（ｂ）は、０又は１のいずれかであり；
Ｒ^ｅ１は、存在するとき、第１の電子改変基であり；
Ｒ^ｅ２は、存在するとき、第２の電子改変基であり；
Ｙ^１は、Ｏ又はＳであり；
Ｙ^２は、Ｏ又はＳであり；及び
（ＩＬ−１５）は、ＩＬ−１５部分の残基である。

例示的コンジュゲートは、以下の構造を有する：


式中、各構造について、かつ各例において、（ｎ）は、独立して４〜１５００の整数であり、及びＩＬ−１５は、ＩＬ−１５部分の残基である。

カルボキシル基は、ＩＬ−１５部分における結合点として機能し得る別の官能基を表す。構造上、コンジュゲートは以下を含み得る：

式中、（ＩＬ−１５）及び隣接するカルボニル基は、カルボキシル含有ＩＬ−１５部分に対応し、Ｘは連結鎖、好ましくはＯ、Ｎ（Ｈ）、及びＳから選択されるヘテロ原子であり、ＰＯＬＹは、場合により末端にエンドキャップ部分を有する、ＰＥＧなどの水溶性ポリマーである。

Ｃ（Ｏ）−Ｘ連結は、末端官能基を有するポリマー誘導体とカルボキシル含有ＩＬ−１５部分との間の反応から得られる。上記に考察されるとおり、具体的な連結は、利用される官能基のタイプに依存し得る。ポリマーがヒドロキシル基で末端官能化又は「活性化」される場合、結果として得られる連結はカルボン酸エステルとなり、ＸはＯとなる。ポリマー骨格がチオール基で官能化される場合、結果として得られる連結はチオエステルとなり、ＸはＳとなる。特定の多腕状、分枝鎖状又はフォーク型ポリマーが用いられると、Ｃ（Ｏ）Ｘ部分、特にＸ部分は比較的複雑となり得るとともに、より長い連結構造を含み得る。

ヒドラジド部分を含む水溶性誘導体もまた、カルボニル及びカルボン酸におけるコンジュゲート形成に有用である。ＩＬ−１５部分がカルボニル部分又はカルボン酸を含まない限りでは、当業者に公知の手法を用いて付加することができる。例えば、カルボニル部分は、カルボン酸（例えば、Ｃ末端カルボン酸）を還元することにより、及び／又はグリコシル化若しくは糖化された（この場合、付加される糖がカルボニル部分を有する）形のＩＬ−１５部分を提供することにより、導入することができる。カルボン酸を含有するＩＬ−１５部分に関して、ＰＥＧ−ヒドラジン試薬は、カップリング剤（例えば、ＤＣＣ）の存在下に、ＩＬ−１５部分と共有結合させることができる［例えば、ｍＰＥＧ−ＯＣＨ_２Ｃ（Ｏ）ＮＨＮＨ_２＋ＨＯＣ（Ｏ）−（ＩＬ−１５）の結果、ｍＰＥＧ−ＯＣＨ_２Ｃ（Ｏ）ＮＨＮＨＣ（Ｏ）−ＩＬ−１５が得られる］。ヒドラジド部分を含有する水溶性誘導体の具体例について、対応するコンジュゲートと共に以下の表２に提供する。加えて、活性化エステルを含有する水溶性ポリマー誘導体をヒドラジン（ＮＨ_２−ＮＨ_２）又はｔｅｒｔ−カルバジン酸ブチル［ＮＨ_２ＮＨＣＯ_２Ｃ（ＣＨ_３）_３］と反応させることにより、活性化エステル（例えば、スクシンイミジル基）を含有する任意の水溶性誘導体を、ヒドラジド部分を含むように変換することができる。表中、変数（ｎ）は反復単量体単位の数を表し、「−Ｃ（Ｏ）−（ＩＬ−１５）」は、ポリマー試薬とのコンジュゲート形成後のＩＬ−１５部分の残基を表す。場合により、ヒドラゾン連結は、好適な還元剤を用いて還元してもよい。表２に示される各ポリマー部分［例えば、（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎ又は（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ］は末端が「ＣＨ_３」基であるが、これは他の基（Ｈ及びベンジルなど）に置換されてもよい。

ＩＬ−１５部分中に含まれるチオール基は、水溶性ポリマーが結合する有効な部位として機能することができる。特に、システイン残基は、ＩＬ−１５部分がタンパク質であるとき、チオール基を提供する。次に、かかるシステイン残基のチオール基が、チオール基との反応に特異的な活性化ＰＥＧ、例えば、Ｎ−マレイミジルポリマー又は米国特許第５，７３９，２０８号明細書及び国際公開第０１／６２８２７号パンフレットに記載されるとおりの他の誘導体と反応し得る。加えて、保護基を有するチオールを活性化糖タンパク質のオリゴ糖側鎖に導入し、続いてチオール反応性水溶性ポリマーで脱保護してもよい。

試薬の具体例について、対応するコンジュゲートと共に以下の表３に提供する。表中、変数（ｎ）は反復単量体単位の数を表し、「−Ｓ−（ＩＬ−１５）」は、水溶性ポリマーとのコンジュゲート形成後のＩＬ−１５部分残基を表す。表３に示される各ポリマー部分［例えば、（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎ又は（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ］は末端が「ＣＨ_３」基であるが、これは他の基（Ｈ及びベンジルなど）に置換されてもよい。

例示的ＩＬ−１５部分に対応する配列番号１及び２に関して、１２５位にシステイン残基があることが分かる。従って、例示的チオール結合部位は、１２５位に位置するシステインである。所与のＩＬ−１５部分に関連するいかなるジスルフィド結合も分断しないことが好ましいが、これらのシステイン残基の１つ又は複数の側鎖中のポリマーを結合して、ある程度の活性を維持することが可能であり得る。加えて、従来の合成技法を用いてシステイン残基をＩＬ−１５部分に付加することが可能である。例えば、システイン残基の付加については、国際公開第９０／１２８７４号パンフレットに記載される手順を参照されたく、かかる手順をＩＬ−１５部分に適合させ得る。加えて、従来の遺伝子工学方法を用いてシステイン残基をＩＬ−１５部分に導入することもできる。しかしながら一部の実施形態では、追加のシステイン残基及び／又はチオール基を導入しないことが好ましい。

１つ又は複数のマレイミド官能基を有する水溶性ポリマーから形成されたコンジュゲートに関して（マレイミドがＩＬ−１５部分のアミン基と反応するか、又はチオール基と反応するかにかかわらず）、対応する１つ又は複数のマレアミド酸型の水溶性ポリマーもまたＩＬ−１５部分と反応することができる。一定の条件下（例えば、ｐＨ約７〜９且つ水の存在下）では、マレイミド環が「開環」することにより対応するマレアミド酸が形成される。ひいては、マレアミド酸が、ＩＬ−１５部分のアミン基又はチオール基と反応し得る。例示的なマレアミド酸ベースの反応が、以下に概略的に示される。ＰＯＬＹは水溶性ポリマーを表し、（ＩＬ−１５）はＩＬ−１５部分を表す。

本発明に係る代表的なコンジュゲートは、以下の構造を有し得る：
ＰＯＬＹ−Ｌ_０，１−Ｃ（Ｏ）Ｚ−Ｙ−Ｓ−Ｓ−（ＩＬ−１５）
式中、ＰＯＬＹは水溶性ポリマーであり、Ｌは任意選択のリンカーであり、Ｚは、Ｏ、ＮＨ、及びＳからなる群から選択されるヘテロ原子であり、Ｙは、Ｃ_２〜１０アルキル、Ｃ_２〜１０置換アルキル、アリール、及び置換アリールからなる群から選択され、（ＩＬ−１５）はＩＬ−１５部分である。ＩＬ−１５部分と反応することができ、結果としてこのタイプのコンジュゲートをもたらすポリマー試薬は、米国特許出願公開第２００５／００１４９０３号明細書に記載されている。

先に指摘したとおり、水溶性ポリマーが分枝鎖型である本発明の例示的コンジュゲートは、以下の構造を含む分枝鎖型の水溶性ポリマーを有し得る：

式中、各（ｎ）は、独立して２〜４０００の値を有する整数である。

分枝鎖型の水溶性ポリマーを有する例示的コンジュゲートは、以下の試薬を用いて調製することができ：

これにより、以下の構造を有するコンジュゲートが形成される：

式中：
（各構造について）各（ｎ）は、独立して２〜４０００の値を有する整数であり；及び
ＩＬ−１５は、ＩＬ−１５部分の残基である。

さらなる例示的コンジュゲートは、以下の試薬を用いて形成することができ：

これにより、以下の構造を有するコンジュゲートが形成される：

式中：
（各構造について）（ｎ）は、独立して２〜４０００の値を有する整数であり；及び
ＩＬ−１５は、ＩＬ−１５部分の残基である。

コンジュゲートは、チオール選択的ポリマー試薬を使用して様々な方法で形成することができ、本発明はこの点について限定されない。例えば、ＩＬ−１５部分−場合により好適な緩衝液（必要であれば、アミンを含有する緩衝液を含む）中にあるもの−がｐＨ約７〜８の水性媒体に入れられ、チオール選択的ポリマー試薬がモル過剰で添加される。そのまま反応を約０．５〜２時間にわたり進め、但し、ペグ化の収率が比較的低いと判断される場合、２時間より長い（例えば、５時間、１０時間、１２時間、及び２４時間の）反応時間が有用であり得る。この手法で使用することのできる例示的なポリマー試薬は、マレイミド、スルホン（例えば、ビニルスルホン）、及びチオール（例えば、オルトピリジニル又は「ＯＰＳＳ」などの官能性チオール）からなる群から選択される反応基を有するポリマー試薬である。

ポリマー試薬に関して、本明細書及びその他に記載されるものは、商業的な供給業者から購入するか、又は市販の出発物質から調製することができる。加えて、ポリマー試薬の調製方法は、文献中に記載がある。

ＩＬ−１５部分と非ペプチド性水溶性ポリマーとの結合は直接であってもよく、この場合、ＩＬ−１５部分とポリマーとの間に介在する原子は存在せず、又は結合は間接的であってもよく、この場合、ＩＬ−１５部分とポリマーとの間に１個又は複数の原子が位置する。間接的な結合に関して、「スペーサー部分」が、ＩＬ−１５部分の残基と水溶性ポリマーとの間のリンカーとして機能する。スペーサー部分を構成する１個又は複数の原子としては、炭素原子、窒素原子、硫黄原子、酸素原子、及びそれらの組み合わせのうちの１つ又は複数を挙げることができる。スペーサー部分は、アミド、第二級アミン、カルバメート、チオエーテル、及び／又はジスルフィド基を含むことができる。具体的なスペーサー部分の非限定的な例としては、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｓ）−、−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−、−Ｏ−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ_２−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ＣＨ_２−、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ_２−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ_２−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ_２−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ_２−ＣＨ_２−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ_２−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ_２−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−、−ＮＨ−ＣＨ_２−、−ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＨ_２−、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ_２−、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ_２−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ_２−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ_２−ＣＨ_２−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−［ＣＨ_２］_ｈ−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｊ−、二価シクロアルキル基、−Ｏ−、−Ｓ−、アミノ酸、−Ｎ（Ｒ^６）−、及び前述のいずれかの２つ以上の組み合わせからなる群から選択されるものが挙げられ、式中、Ｒ^６は、Ｈか、又は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール及び置換アリールからなる群から選択される有機ラジカルであり、（ｈ）は０〜６であり、（ｊ）は０〜２０である。他の具体的なスペーサー部分は以下の構造を有する：−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_１〜６−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_１〜６−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、及び−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_１〜６−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、式中、各メチレンの後ろの添え字の値は構造中に含まれるメチレンの数を示し、例えば、（ＣＨ_２）_１〜６は、その構造が、１、２、３、４、５又は６個のメチレンを含み得ることを意味する。加えて、上記のスペーサー部分のいずれも、１〜２０個のエチレンオキシド単量体単位［すなわち、−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_１〜２０］を含むエチレンオキシドオリゴマー鎖をさらに含み得る。すなわち、エチレンオキシドオリゴマー鎖は、スペーサー部分の前にも、又は後ろにも、及び場合によっては２個以上の原子を含むスペーサー部分の任意の２個の原子間に、存在することができる。また、オリゴマー鎖は、オリゴマーがポリマーセグメントに隣接し、単にポリマーセグメントの延長部に相当するに過ぎないならば、スペーサー部分の一部とは見なされない。

組成物
コンジュゲートは、典型的には組成物の一部である。概して、組成物は複数のコンジュゲートを含み、必須ではないが、好ましくは各コンジュゲートは同じＩＬ−１５部分を含む（すなわち、組成物全体のなかに、ただ１つのタイプのＩＬ−１５部分が存在する）。加えて、組成物は、任意の所与のコンジュゲートが２つ以上の異なるＩＬ−１５部分からなる群から選択されるある部分を含む複数のコンジュゲートを含み得る（すなわち、組成物全体のなかに、２つ以上の異なるＩＬ−１５部分が存在する）。しかしながら、最適には、組成物中の実質的に全てのコンジュゲート（例えば、組成物中の複数のコンジュゲートのうちの８５％以上）が、各々、同じＩＬ−１５部分を含む。

組成物は、単一のコンジュゲート種（例えば、単一のポリマーが、組成物中の実質的に全てのコンジュゲートについて同じ位置で結合するモノペグ化コンジュゲート）か、又はコンジュゲート種の混合物（例えば、ポリマーの結合が異なる部位で起こるモノペグ化コンジュゲートの混合物、及び／又は、モノペグ化、ジペグ化及びトリペグ化コンジュゲートの混合物）を含み得る。組成物はまた、４、５、６、７、８個又はそれ以上のポリマーが、ＩＬ−１５活性を有する任意の所与の部分と結合している他のコンジュゲートも含み得る。加えて、本発明は、組成物が複数のコンジュゲートを含み、各コンジュゲートが、１個のＩＬ−１５部分と共有結合した１個の水溶性ポリマーを含む場合、並びに１個のＩＬ−１５部分と共有結合した２、３、４、５、６、７、８個、又はそれ以上の水溶性ポリマーを含む組成物も含む。

組成物中のコンジュゲートに関して、組成物は、以下の特性のうちの１つ又は複数を満足し、すなわち、組成物中のコンジュゲートの少なくとも約８５％が、ＩＬ−１５部分と結合した１〜４個のポリマーを有する；組成物中のコンジュゲートの少なくとも約８５％が、ＩＬ−１５部分と結合した１〜３個のポリマーを有する；組成物中のコンジュゲートの少なくとも約８５％が、ＩＬ−１５部分と結合した１〜２個のポリマーを有する；組成物中のコンジュゲートの少なくとも約８５％が、ＩＬ−１５部分と結合した１個のポリマーを有する；組成物中のコンジュゲートの少なくとも約９５％が、ＩＬ−１５部分と結合した１〜５個のポリマーを有する；組成物中のコンジュゲートの少なくとも約９５％が、ＩＬ−１５部分と結合した１〜４個のポリマーを有する；組成物中のコンジュゲートの少なくとも約９５％が、ＩＬ−１５部分と結合した１〜３個のポリマーを有する；組成物中のコンジュゲートの少なくとも約９５％が、ＩＬ−１５部分と結合した１〜２個のポリマーを有する；組成物中のコンジュゲートの少なくとも約９５％が、ＩＬ−１５部分と結合した１個のポリマーを有する；組成物中のコンジュゲートの少なくとも約９９％が、ＩＬ−１５部分と結合した１〜５個のポリマーを有する；組成物中のコンジュゲートの少なくとも約９９％が、ＩＬ−１５部分と結合した１〜４個のポリマーを有する；組成物中のコンジュゲートの少なくとも約９９％が、ＩＬ−１５部分と結合した１〜３個のポリマーを有する；組成物中のコンジュゲートの少なくとも約９９％が、ＩＬ−１５部分と結合した１〜２個のポリマーを有する；及び組成物中のコンジュゲートの少なくとも約９９％が、ＩＬ−１５部分と結合した１個のポリマーを有する。例えば「ｘ〜ｙ個のポリマー」としてポリマーの範囲を参照するときは、ポリマーの数が、端点を含めてｘ〜ｙであることを意図している（すなわち、例えば「１〜３個のポリマー」は、１個のポリマー、２個のポリマー及び３個のポリマーを意図し、「１〜２個のポリマー」は１個のポリマー及び２個のポリマーを意図する等）ことが理解される。加えて、ＩＬ−１５部分に結合した２つ以上のポリマーを有する所与のコンジュゲートが安定的に結合したポリマーと遊離可能に結合したポリマーとの混合物を有することも企図される（ここでは少なくともポリマーがＩＬ−１５部分に安定的に結合しており、且つ少なくとも１つのポリマーがＩＬ−１５部分に遊離可能に結合している）。

１つ又は複数の実施形態において、コンジュゲート含有組成物はアルブミンを含まないか又は実質的に含まないことが好ましい。また、組成物が、ＩＬ−１５活性を有しないタンパク質を含まないか又は実質的に含まないことも好ましい。従って、組成物は８５％、より好ましくは９５％、及び最も好ましくは９９％アルブミン不含であることが好ましい。加えて、組成物は、ＩＬ−１５活性を有しないタンパク質を８５％、より好ましくは９５％、及び最も好ましくは９９％不含であることが好ましい。組成物中にアルブミンが存在する限りにおいて、本発明の例示的組成物は、ＩＬ−１５部分の残基をアルブミンに連結するポリ（エチレングリコール）ポリマーを含むコンジュゲートを実質的に含まない。

任意の所与の部分に対するポリマーの所望の数の制御は、適切なポリマー試薬、ポリマー試薬のＩＬ−１５部分に対する比、温度、ｐＨ条件、及びコンジュゲート形成反応の他の側面を選択することにより実現することができる。加えて、精製手段により、望ましくないコンジュゲート（例えば、４個以上のポリマーが結合したコンジュゲート）の低減又は除去を実現することができる。

例えば、ポリマー−ＩＬ−１５部分コンジュゲートを精製して、異なるコンジュゲート化種を得る／単離することができる。具体的には、生成混合物を精製して、各ＩＬ−１５部分につき平均１、２、３、４、５個又はそれ以上の範囲のＰＥＧ、典型的には、各ＩＬ−１５部分につき１、２又は３個のＰＥＧを得ることができる。最終的なコンジュゲート反応混合物の精製方針は、例えば、用いられるポリマー試薬の分子量、特定のＩＬ−１５部分、所望の投薬レジメン、１つ又は複数のコンジュゲートの個々の残基活性及びインビボ特性を含め、様々な要因に依存し得る。

必要であれば、ゲルろ過クロマトグラフィー及び／又はイオン交換クロマトグラフィーを用いて分子量が異なるコンジュゲートを単離することができる。すなわち、ゲルろ過クロマトグラフィーを用いると、その分子量の違いに基づき（この違いは、本質的に水溶性ポリマー分の平均分子量に対応する）、ポリマー−対−ＩＬ−１５部分の比の大きさが異なるもの（例えば、１ｍｅｒ、２ｍｅｒ、３ｍｅｒなど、ここで「１ｍｅｒ」は、１ポリマー対ＩＬ−１５部分を示し、「２ｍｅｒ」は、２ポリマー対ＩＬ−１５部分を示す等）が分画される。例えば、３５，０００ダルトンのタンパク質が、約２０，０００ダルトンの分子量のポリマー試薬に対してランダムにコンジュゲート化される例示的反応では、結果として得られる反応混合物は、非修飾タンパク質（分子量約３５，０００ダルトン）、モノペグ化タンパク質（分子量約５５，０００ダルトン）、ジペグ化タンパク質（分子量約７５，０００ダルトン）などを含み得る。

この手法を用いることで、異なる分子量を有するＰＥＧと他のポリマー−ＩＬ−１５部分コンジュゲートとを分離することはできるが、概してこの手法は、ＩＬ−１５部分中のポリマー結合部位が異なる位置アイソフォームの分離には役立たない。例えば、ゲルろ過クロマトグラフィーを用いると、ＰＥＧ １ｍｅｒ、２ｍｅｒ、３ｍｅｒなどの混合物を互いに分離することはできるが、回収したコンジュゲート組成物の各々は、ＩＬ−１５部分中の異なる反応基（例えば、リジン残基）に結合した１つ又は複数のＰＥＧを含み得る。

このタイプの分離を行うのに好適なゲルろ過カラムとしては、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）から入手可能なＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）カラム及びＳｅｐｈａｄｅｘ（商標）カラムが挙げられる。特定のカラムの選択は、望ましい所望の分画範囲に依存し得る。溶出は、概して、リン酸、酢酸などの好適な緩衝液を使用して行われる。収集された画分は、例えば、（ｉ）タンパク質含量についての２８０ｎｍの吸光度、（ｉｉ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準として使用する色素ベースのタンパク質分析、（ｉｉｉ）ＰＥＧ含量についてのヨウ素試験（Ｓｉｍｓら（１９８０年）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ、１０７：６０−６３頁）、（ｉｖ）ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ ＰＡＧＥ）と、続くヨウ化バリウムによる染色、及び（ｖ）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）など、様々な異なる方法により分析され得る。

位置アイソフォームの分離は、好適なカラム（例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ又はＶｙｄａｃなどの企業から市販されているＣ１８カラム又はＣ３カラム）を使用した逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を用いる逆相クロマトグラフィーによるか、又はイオン交換カラム、例えば、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手可能なＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）イオン交換カラムを用いるイオン交換クロマトグラフィーにより行われる。いずれの手法を用いても、同じ分子量を有するポリマー−活性薬剤の異性体（すなわち、位置アイソフォーム）を分離することができる。

組成物は、好ましくはＩＬ−１５活性を有しないタンパク質を実質的に含まない。加えて、組成物は、好ましくは他のいかなる非共有結合性の水溶性ポリマーも実質的に含まない。しかしながら、ある状況下では、組成物は、ポリマー−ＩＬ−１５部分コンジュゲートと非コンジュゲート化ＩＬ−１５部分との混合物を含み得る。

場合により、本発明の組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含む。必要であれば、薬学的に許容可能な賦形剤はコンジュゲートに添加され、組成物を形成することができる。

例示的な賦形剤としては、限定なしに、炭水化物、無機塩類、抗菌剤、抗酸化剤、界面活性剤、緩衝剤、酸、塩基、アミノ酸、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるものが挙げられる。

糖、誘導体化された糖、例えば、アルジトール、アルドン酸、エステル化された糖、及び／又は糖ポリマーなどの炭水化物が、賦形剤として存在し得る。具体的な炭水化物賦形剤としては、例えば：フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ−マンノース、ソルボースなどの単糖類；ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオースなどの二糖類；ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプンなどの多糖類；及びマンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトール、ソルビトール（グルシトール）、ピラノシルソルビトール、ミオイノシトール、シクロデキストリンなどのアルジトールが挙げられる。

賦形剤としてはまた、クエン酸、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硝酸カリウム、一塩基性リン酸ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム、及びそれらの組み合わせなどの無機塩又は緩衝剤も挙げることができる。

組成物はまた、微生物の繁殖を防止又は抑止するための抗菌剤も含むことができる。本発明の１つ又は複数の実施形態に好適な抗菌剤の非限定的な例としては、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、塩化セチルピリジニウム、クロロブタノール、フェノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、チメルソール（ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ）、及びそれらの組み合わせが挙げられる。

抗酸化剤も同様に組成物中に存在し得る。抗酸化剤を使用すると酸化が防止され、それによりコンジュゲート又は調製物の他の構成成分の劣化が防止される。本発明の１つ又は複数の実施形態での使用に好適な抗酸化剤としては、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、次亜リン酸、モノチオグリセロール、没食子酸プロピル、亜硫酸水素ナトリウム、スルホキシル酸ナトリウムホルムアルデヒド、メタ重亜硫酸ナトリウム、及びそれらの組み合わせが挙げられる。

賦形剤として界面活性剤が存在してもよい。例示的な界面活性剤としては、「Ｔｗｅｅｎ ２０」及び「Ｔｗｅｅｎ ８０」などのポリソルベート、並びにＦ６８及びＦ８８（双方とも、ＢＡＳＦ、Ｆｌｏｒｈａｍ Ｐａｒｋ，ＮＪから入手可能）などのプルロニック；ソルビタンエステル；レシチン及び他のホスファチジルコリンなどのリン脂質、ホスファチジルエタノールアミン（但し、リポソーム形態ではないことが好ましい）、脂肪酸、並びに脂肪酸エステルなどの脂質；コレステロールなどのステロイド；並びにＥＤＴＡ、亜鉛及び他のかかる好適な陽イオンなどのＩＬ−１５レーティング（ＩＬ−１５ｌａｔｉｎｇ）剤が挙げられる。

酸又は塩基が組成物中に賦形剤として存在してもよい。使用することのできる酸の非限定的な例としては、塩酸、酢酸、リン酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、ギ酸、トリクロロ酢酸、硝酸、過塩素酸、リン酸、硫酸、フマル酸、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される酸が挙げられる。好適な塩基の例としては、限定なしに、水酸化ナトリウム、酢酸ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、酢酸アンモニウム、酢酸カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、ギ酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、フマル酸カリウム、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される塩基が挙げられる。

１つ又は複数のアミノ酸は、本明細書に記載される組成物中に賦形剤として存在することができる。この関連における例示的なアミノ酸としては、アルギニン、リジン及びグリシンが挙げられる。

組成物中のコンジュゲート（すなわち、活性薬剤とポリマー試薬との間で形成されるコンジュゲート）の量は、様々な要因によって異なり得るが、最適には、組成物が単位用量容器（例えば、バイアル）に保存されるとき、治療上有効な用量であり得る。加えて、医薬調製物はシリンジに収容されてもよい。治療上有効な用量は、どの量が臨床的に望ましいエンドポイントを生じるかを判断するために、コンジュゲートの量を漸増させながら反復投与することにより実験的に決定することができる。

組成物中の任意の個別の賦形剤の量は、賦形剤の活性及び組成物の特定の必要性によって異なり得る。典型的には、任意の個別の賦形剤についての最適量の決定は、ルーチンの実験を通じて、すなわち、様々な量の賦形剤（低量から高量までの範囲にわたる）を含む組成物を調製して安定性及び他のパラメータを調べ、次にどの時点で有意な副作用なしに最適な効果が得られるかを決定することにより行われる。

しかしながら、概して賦形剤は組成物中に約１％〜約９９重量％、好ましくは約５％〜約９８重量％、より好ましくは約１５〜約９５重量％の賦形剤の量で存在し、濃度は３０重量％未満が最も好ましい。

これらの前述の医薬賦形剤は、他の賦形剤と共に、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ」、第１９版、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｌｉａｍｓ、（１９９５年）、「Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ」、第５２版、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ、Ｍｏｎｔｖａｌｅ，ＮＪ（１９９８年）、及びＫｉｂｂｅ，Ａ．Ｈ．、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ」、第３版、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、２０００年に記載されている。

組成物は、あらゆるタイプの製剤、特に注射に適したもの、例えば、再構成することのできる粉末又は親液体並びに液体を包含する。固形組成物の注射前の再構成に好適な希釈剤の例としては、注射用静菌水、水中のデキストロース５％、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、生理食塩水、滅菌水、脱イオン水、及びそれらの組み合わせが挙げられる。液状の医薬組成物に関しては、溶液及び懸濁液が想定される。

本発明の１つ又は複数の実施形態の組成物は、必須ではないが、典型的には注射により投与され、従って投与直前には概して液状の溶液又は懸濁液である。医薬調製物はまた、シロップ、クリーム、軟膏、錠剤、粉末などの他の形態をとることもできる。他の投与方法には、肺内、直腸、経皮、経粘膜、経口、髄腔内、腫瘍内、腫瘍周囲、腹腔内、皮下、動脈内なども含まれる。

本発明はまた、本明細書に提供されるとおりのコンジュゲートを、コンジュゲートによる治療に反応性を有する病態を患う患者に対して投与する方法も提供する。この方法は、患者に対し、概して注射により、治療上有効量のコンジュゲート（好ましくは医薬組成物の一部として提供されるもの）を投与することを含む。先述のとおり、コンジュゲートは、注射（例えば、筋肉内、皮下及び非経口）することができる。非経口投与に好適な製剤タイプとしては、特に、即時注射用溶液、使用前に溶媒と混和する乾燥粉末、即時注射用懸濁液、使用前に媒剤と混和する不溶性の乾燥組成物、並びに投与前に希釈する乳剤及び液状濃縮物が挙げられる。

コンジュゲートを投与する方法は（好ましくは医薬組成物の一部として提供する）、場合により、コンジュゲートを特定の範囲に局在させるように実施することができる。例えば、コンジュゲートを含む液体、ゲル及び固形製剤を、罹患範囲（腫瘍内、腫瘍の近傍、炎症範囲内、及び炎症範囲の近傍など）に外科的に植え込んでもよい。好都合には、臓器及び組織はまた、所望の位置がコンジュゲートに対してより良好に曝露されることを確実にするため、画像化され得る。

この投与方法は、本コンジュゲートの投与によって治療又は予防し得る任意の病態の治療に用いることができる。当業者は、具体的なコンジュゲートがどの病態を有効に治療し得るかを理解する。例えば、コンジュゲートは、ある病態に罹患している患者を治療するため単独で使用しても、又は他の薬物療法との併用で使用してもよい。例示的病態としては、限定なしに：メラノーマ、腎癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、前立腺癌、乳癌、血液癌（ｈｅｍａｔｏｌｉｇｃａｌ ｃａｎｃｅｒ）、頭頸部癌、卵巣癌、及び結腸癌が挙げられる。有利には、コンジュゲートは別の活性薬剤の投与前に、それと同時に、又はその後に患者に投与され得る。

実際の投与用量は、対象の年齢、体重、及び全身状態並びに治療下の病態の重症度、医療専門家の判断、及び投与されるコンジュゲートに応じて異なり得る。治療有効量は当業者に公知であり、及び／又は関連する参考書及び文献に記載されている。概して、治療有効量は、約０．００１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは０．０１ｍｇ／日〜７５ｍｇ／日の用量、及びより好ましくは０．１０ｍｇ／日〜５０ｍｇ／日の用量の範囲であり得る。所与の用量が、例えば臨床医が適切なエンドポイント（例えば、治癒、退縮、部分退縮など）に達したことを決定するまで、定期的に投与されてもよい。

単位投薬量の任意の所与のコンジュゲート（ここでも、好ましくは医薬調製物の一部として提供されるもの）は、臨床医の判断、患者の必要性などに応じて様々な投薬スケジュールで投与することができる。具体的な投薬スケジュールは、当業者には周知であるか、又はルーチンの方法を用いて実験的に決定することができる。例示的な投薬スケジュールとしては、限定なしに、１日１回、週３回、週２回、週１回、月２回、月１回、及びそれらの任意の組み合わせの投与が挙げられる。臨床的なエンドポイントが達成されると、組成物の投薬は中止される。

本発明は、その好ましい具体的な実施形態に関連して説明されているが、前述の説明並びに以下の実施例は例示を目的としており、本発明の範囲を限定する意図はないことが理解されるべきである。本発明の範囲内における他の態様、利点及び変更は、本発明の係る当該技術分野の当業者には明らかであろう。

本明細書で参照される論文、著作、特許及び他の刊行物は全て、全体として参照により本明細書に援用される。

本発明の実施には、特に指示されない限り、有機合成、生化学、タンパク質精製などの従来技術が用いられ、それらは当該技術分野の範囲内である。かかる方法は文献中に詳しく説明されている。例えば、Ｊ．Ｍａｒｃｈ、「Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」、第４版（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、１９９２年）、上記を参照のこと。

以下の実施例では、使用される数（例えば、量、温度等）に関する正確性を確保するように努めたが、いくらかの実験誤差及び偏差は考慮しなければならない。特に指示がない限り、温度は摂氏温度であり、圧力は海上気圧又はその近傍におけるものである。以下の例の各々は、当業者が本明細書に記載される実施形態の１つ又は複数を実行するための教示と見なされる。

本実施例で使用される配列番号１のアミノ酸配列に対応する組換えＩＬ−１５（「ｒｈＩＬ−１５」）を含む水溶液（「ストック溶液」）。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析 試料はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎゲル電気泳動システム（ＸＣｅｌｌ ＳｕｒｅＬｏｃｋ Ｍｉｎｉ−Ｃｅｌｌ）を使用してドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分析した。試料を試料緩衝液と混合した。次に、調製した試料をＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘプレキャストゲルにロードし、約３０分間泳動した。

ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析 コンジュゲート組成物の特徴付けに関しては、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）分析を用いることが企図される。実行時、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析はＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ）で行われ得る。試料はＳｈｏｄｅｘタンパク質ＫＷ−８０４カラム（３００×８ｍｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）、及びリン酸ナトリウムと硫酸ナトリウムとからなる移動相、ｐＨ７を使用して分析することができる。カラムの流量は０．５ｍｌ／分とし得る。溶出タンパク質及びＰＥＧ−タンパク質コンジュゲートは、２８０ｎｍ及び２２０ｎｍのＵＶを使用して検出することができる。

関連する特徴付けの技法、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）もまたＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ）で行うことができる。試料はＺｏｒｂａｘ ３００ＳＢ−Ｃ３カラム（３．５μｍ粒度、１５０ｍｍ×３．０ｍｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ）、並びに水中０．１％トリフルオロ酢酸（緩衝液Ａ）及びアセトニトリル中０．１％トリフルオロ酢酸（緩衝液Ｂ）からなる移動相を使用して分析することができる。カラムの流量は０．３ｍｌ／分とし得る。タンパク質及びＰＥＧ−タンパク質コンジュゲートは直線勾配で２０分かけて溶出することができ、２８０ｎｍのＵＶを使用して検出した。

概して、精製は１０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ２．７）を使用したＳＰ−ＨＰカラムで行うことができる。カラムに対するコンジュゲートの結合を最適化するため、ｐＨは低下させる。コンジュゲートはこの緩衝液中で結合させ、０＝５００ｍＭ ＮａＣｌ勾配を用いて溶出する。

実施例１
ＣＴＬＬ−２細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化に基づくｒＩＬ−１５のＩＬ−１５活性の計測
アッセイの前日に、ＣＴＬＬ−２細胞を新鮮成長培地（ＲＰＭＩ １６４０＋１０％ＦＢＳ＋１０％Ｔ−ＳＴＩＭ＋２ｍＭ Ｌ−グルタミン酸塩＋１ｍＭ ピルビン酸Ｎａ）に分けた。アッセイ当日、細胞をアッセイ培地（ＲＰＭＩ １６４０＋１％ＦＢＳ＋２ｍＭ Ｌ−グルタミン酸塩＋１ｍＭ ピルビン酸Ｎａ）で少なくとも４時間プレインキュベートし、次にアッセイ培地中５０，０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートに入れた。

アッセイ直前に適切な緩衝液中に被験物質の希釈物を調製し、被験物質の各希釈物をＣＴＬＬ−２細胞の別個のウェルでインキュベートした。次にＭＳＤ Ｐｈｏｓｐｈｏ（Ｔｙｒ６９４）／Ｔｏｔａｌ ＳＴＡＴａ，ｂ全細胞ライセートキット（カタログ番号Ｋ１５１６３Ｄ、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用してＳＴＡＴ５のリン酸化を決定した。

ＰｅｐｒｏＴｅｃｈから入手したｒＩＬ−１５（カタログ番号２００−１５）は、５分で０．２０７０５ｎｇ／ｍＬ（２回のランの平均）及び１０分で０．０８１８７ｎｇ／ｍＬの平均ｐＳＴＡＴ５ ＥＣ_５０を呈することによりＩＬ−１５活性を実証した。

実施例２
分枝鎖状ｍＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル誘導体、２０ｋＤａによるｒＩＬ−１５のペグ化

ｍＰＥＧ２−ｒｕ−２０Ｋ−Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミジル（Ｈｙｄｒｏｘｙｌｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）誘導体、２０ｋＤａ（「ｍＰＥＧ２−ｒｕ−２０Ｋ−ＮＨＳ」）
アルゴン下に−８０℃で保存したｍＰＥＧ２−ｒｕ−２０Ｋ−ＮＨＳを、窒素パージ下で周囲温度に加温した。ｍＰＥＧ２−ｒｕ−２０Ｋ−ＮＨＳのストック溶液（２００ｍｇ／ｍＬ）を２ｍＭ ＨＣｌ中に調製し、約（ａｂｏｕｎｄ）５：１〜１００：１の範囲のｍＰＥＧ２−ｒｕ−２０Ｋ−ＮＨＳ対ｒＩＬ−１５のモル比でｍＰＥＧ２−ｒｕ−２０Ｋ−ＮＨＳをｒＩＬ−１５に添加した。混合物中のｒＩＬ−１５の最終濃度は０．５ｍＧ／ｍＬ（０．０３１ｍＭ）であった。最終濃度が１００ｍＭに達するように混合物に重炭酸ナトリウム緩衝液（１Ｍ、ｐＨ８．０）を添加して、コンジュゲート形成を３０分間進行させると、［ｍＰＥＧ２−ｒｕ−２０Ｋ］−［ｒＩＬ−１５］コンジュゲートが得られた。３０分後、最終濃度が１００ｍＭとなるように反応混合物に１Ｍ グリシン（ｐＨ６．０）を添加してクエンチを達成した。

［ｍＰＥＧ２−ｒｕ−２０Ｋ］−［ｒＩＬ−１５］の典型的なコンジュゲーション生成物プロファイルを図１に提供する。図１に示されるとおり、ｍＰＥＧ２−ｒｕ−２０Ｋ−ＮＨＳ対ｒＩＬ−１５のモル比が約５：１（レーン３）から、約１０：１（レーン４）、約２５：１（レーン５）、約５０：１（レーン６）、及び約１００：１（レーン７）に増加すると、主要生成物（レーン３）としてモノ−ＰＥＧ−ＩＬ−１５からジ−、トリ−ＰＥＧ−ＩＬ−１５及び高級種へのシフトが生じる。個別的なモノ−、ジ−、トリ−及び高級ＰＥＧ−ＩＬ−１５コンジュゲートは、精製して特徴付けることになる。

概して、精製は１０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ２．７）を使用したＳＰ−ＨＰカラムで行うことができる。カラムに対するコンジュゲートの結合を最適化するため、ｐＨは低下させる。コンジュゲートはこの緩衝液中で結合させ、０＝５００ｍＭ ＮａＣｌ勾配を用いて溶出する。

実施例３
ｍＰＥＧ２−Ｃ２−ｆｍｏｃ−２０Ｋ−ＮＨＳによるｒＩＬ−１５のペグ化

ｍＰＥＧ_２−Ｃ２−ｆｏｍｃ−２０Ｋ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド誘導体、２０ｋＤａ（「ｍＰＥＧ２−Ｃ２−ｆｍｏｃ−２０Ｋ−ＮＨＳ」）
アルゴン下に−８０℃で保存したｍＰＥＧ２−Ｃ２−ｆｍｏｃ−２０Ｋ−ＮＨＳを、窒素パージ下で周囲温度に加温した。ｍＰＥＧ２−Ｃ２−ｆｍｏｃ−２０Ｋ−ＮＨＳのストック溶液（２００ｍｇ／ｍＬ）を２ｍＭ ＨＣｌ中に調製し、５：１〜１００：１の範囲のｍＰＥＧ２−Ｃ２−ｆｍｏｃ−２０Ｋ−ＮＨＳ対ｒＩＬ−１５のモル比でｍＰＥＧ２−Ｃ２−ｆｍｏｃ−２０Ｋ−ＮＨＳをｒＩＬ−１５に添加した。混合物中のｒＩＬ−１５の最終濃度は０．５ｍｇ／ｍＬ（０．０３１ｍＭ）であった。最終濃度が１００ｍＭに達するように混合物に重炭酸ナトリウム緩衝液（１Ｍ、ｐＨ８．０）を添加して、コンジュゲート形成を３０分間進行させると、［ｍＰＥＧ２−Ｃ２−ｆｍｏｃ−２０Ｋ］−［ｒＩＬ−１５］コンジュゲートが得られた。３０分後、最終濃度が１００ｍＭとなるように反応混合物に１Ｍ グリシン（ｐＨ６．０）を添加してクエンチを達成した。次にクエンチした反応混合物のｐＨを氷酢酸を使用して４．０に調整した後、カラムクロマトグラフィー精製及び特徴付けを行った。

実施例４
ｍＰＥＧ２−ＣＡＣ−ｆｍｏｃ−２０Ｋ−ＮＨＳによるｒＩＬ−１５のペグ化

ｍＰＥＧ２−ＣＡＣ−ｆｍｏｃ−２０Ｋ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド誘導体、２０ｋＤａ（「ｍＰＥＧ２−ＣＡＣ−ｆｍｏｃ−２０Ｋ−ＮＨＳ」）
アルゴン下に−８０℃で保存したｍＰＥＧ２−ＣＡＣ−ｆｍｏｃ−２０Ｋ−ＮＨＳを、窒素パージ下で周囲温度に加温した。ｍＰＥＧ２−ＣＡＣ−ｆｍｏｃ−２０Ｋ−ＮＨＳのストック溶液（２００ｍｇ／ｍＬ）を２ｍＭ ＨＣｌ中に調製し、５：１〜１００：１の範囲のｍＰＥＧ_２−ＣＡＣ−ｆｍｏｃ−２０Ｋ−ＮＨＳ対ｒＩＬ−１５のモル比でｍＰＥＧ２−ＣＡＣ−ｆｍｏｃ−２０Ｋ−ＮＨＳをｒＩＬ−１５に添加した。混合物中のｒＩＬ−１５の最終濃度は０．５ｍｇ／ｍＬ（０．０３１ｍＭ）であった。最終濃度が１００ｍＭに達するように混合物に重炭酸ナトリウム緩衝液（１Ｍ、ｐＨ８．０）を添加して、コンジュゲート形成を３０分間進行させると、［ｍＰＥＧ２−ＣＡＣ−ｆｍｏｃ−２０Ｋ］−［ｒＩＬ−１５］コンジュゲートが得られた。３０分後、最終濃度が１００ｍＭとなるように反応混合物に１Ｍ グリシン（ｐＨ６．０）を添加してクエンチを達成した。次にクエンチした反応混合物のｐＨを氷酢酸を使用して４．０に調整した後、カラムクロマトグラフィー精製及び特徴付けを行った。

実施例５
分枝鎖状ｍＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル誘導体、４０ｋＤａによるｒＩＬ−１５のペグ化

ｍＰＥＧ２−ｒｕ−４０Ｋ−Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミジル（Ｈｙｄｒｏｘｙｌｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）誘導体、４０ｋＤａ（「ｍＰＥＧ２−ｒｕ−４０Ｋ−ＮＨＳ」）
アルゴン下に−８０℃で保存したｍＰＥＧ２−ｒｕ−４０Ｋ−ＮＨＳを、窒素パージ下で周囲温度に加温した。ｍＰＥＧ２−ｒｕ−４０Ｋ−ＮＨＳのストック溶液（２００ｍｇ／ｍＬ）を２ｍＭ ＨＣｌ中に調製し、５：１〜１００：１の範囲のモル比でｍＰＥＧ２−ｒｕ−４０Ｋ−ＮＨＳをｒＩＬ−１５に添加した。混合物中のｒＩＬ−１５の最終濃度は０．５ｍｇ／ｍＬ（０．０３１ｍＭ）であった。最終濃度が１００ｍＭに達するように混合物に重炭酸ナトリウム緩衝液（１Ｍ、ｐＨ８．０）を添加して、コンジュゲート形成を３０分間進行させると、［ｍＰＥＧ２−ｒｕ−４０Ｋ−］−［ｒＩＬ−１５］コンジュゲートが得られた。３０分後、最終濃度が１００ｍＭとなるように反応混合物に１Ｍ グリシン（ｐＨ６．０）を添加してクエンチを達成した。次にクエンチした反応混合物のｐＨを氷酢酸を使用して４．０に調整した後、カラムクロマトグラフィー精製及び特徴付けを行った。

［ｍＰＥＧ２−ｒｕ−４０Ｋ］−［ｒＩＬ−１５］のコンジュゲーション生成物プロファイルを図２に提供する。図２に示されるとおり、ｍＰＥＧ２−ｒｕ−４０Ｋ−ＮＨＳ対ｒＩＬ−１５のモル比が約５：１（レーン２）から、約１０：１（レーン３）、約２５：１（レーン４）、約５０：１（レーン５）、及び約１００：１（レーン６）に増加すると、低級ペグ化生成物から高級ペグ化生成物へのシフトが生じる。個別的なコンジュゲートを精製して特徴付けることができる。

実施例６
ｍＰＥＧ２−Ｃ２−ｆｍｏｃ−４０Ｋ−ＮＨＳによるｒＩＬ−１５のペグ化

ｍＰＥＧ_２−Ｃ２−ｆｏｍｃ−４０Ｋ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド誘導体、４０ｋＤａ（「ｍＰＥＧ２−Ｃ２−ｆｍｏｃ−４０Ｋ−ＮＨＳ」）
アルゴン下に−８０℃で保存したｍＰＥＧ２−Ｃ２−ｆｍｏｃ−４０Ｋ−ＮＨＳを、窒素パージ下で周囲温度に加温した。ｍＰＥＧ２−Ｃ２−ｆｍｏｃ−４０Ｋ−ＮＨＳのストック溶液（２００ｍｇ／ｍＬ）を２ｍＭ ＨＣｌ中に調製し、５：１〜１００：１の範囲のｍＰＥＧ_２−Ｃ２−ｆｍｏｃ−４０Ｋ−ＮＨＳ対ｒＩＬ−１５のモル比でｍＰＥＧ２−Ｃ２−ｆｍｏｃ−４０Ｋ−ＮＨＳをｒＩＬ−１５に添加した。混合物中のｒＩＬ−１５の最終濃度は０．５ｍｇ／ｍＬ（０．０３１ｍＭ）であった。最終濃度が１００ｍＭに達するように混合物に重炭酸ナトリウム緩衝液（１Ｍ、ｐＨ８．０）を添加して、コンジュゲート形成を３０分間進行させると、［ｍＰＥＧ２−Ｃ２−ｆｍｏｃ−４０Ｋ］−［ｒＩＬ−１５］コンジュゲートが得られた。３０分後、最終濃度が１００ｍＭとなるように反応混合物に１Ｍ グリシン（ｐＨ６．０）を添加してクエンチを達成した。次にクエンチした反応混合物のｐＨを氷酢酸を使用して４．０に調整した後、カラムクロマトグラフィー精製及び特徴付けを行った。

この同じ一般的手法に従い、１０ｋＤａ及び２０ｋＤａバージョンのｍＰＥＧ２−Ｃ２−ｆｍｏｃ−４０Ｋ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド誘導体を使用してコンジュゲートを調製した。

実施例７
ｍＰＥＧ２−ＣＡＣ−ｆｍｏｃ−４０Ｋ−ＮＨＳによるｒＩＬ−１５のペグ化

ｍＰＥＧ２−ＣＡＣ−ｆｍｏｃ−４０Ｋ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド誘導体、４０ｋＤａ（「ｍＰＥＧ２−ＣＡＣ−ｆｍｏｃ−４０Ｋ−ＮＨＳ」）
アルゴン下に−８０℃で保存したｍＰＥＧ２−ＣＡＣ−ｆｍｏｃ−４０Ｋ−ＮＨＳを、窒素パージ下で周囲温度に加温した。ｍＰＥＧ２−ＣＡＣ−ｆｍｏｃ−４０Ｋ−ＮＨＳのストック溶液（２００ｍｇ／ｍＬ）を２ｍＭ ＨＣｌ中に調製し、５：１〜１００：１の範囲のｍＰＥＧ_２−ＣＡＣ−ｆｍｏｃ−４０Ｋ−ＮＨＳ対ｒＩＬ−１５のモル比でｍＰＥＧ２−ＣＡＣ−ｆｍｏｃ−４０Ｋ−ＮＨＳをｒＩＬ−１５に添加した。混合物中のｒＩＬ−１５の最終濃度は０．５ｍｇ／ｍＬ（０．０３１ｍＭ）であった。最終濃度が１００ｍＭに達するように混合物に重炭酸ナトリウム緩衝液（１Ｍ、ｐＨ８．０）を添加して、コンジュゲート形成を３０分間進行させると、［ｍＰＥＧ２−ＣＡＣ−ｆｍｏｃ−４０Ｋ］−［ｒＩＬ−１５］コンジュゲートが得られた。３０分後、最終濃度が１００ｍＭとなるように反応混合物に１Ｍ グリシン（ｐＨ６．０）を添加してクエンチを達成した。次にクエンチした反応混合物のｐＨを氷酢酸を使用して４．０に調整した後、カラムクロマトグラフィー精製及び特徴付けを行った。

この同じ一般的手法に従い、１０ｋＤａ及び２０ｋＤａバージョンのｍＰＥＧ２−ＣＡＣ−ｆｍｏｃ−４０Ｋ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド誘導体を使用してコンジュゲートを調製した。これらのさらなる調製では、１００：１の試薬：ｒＩＬ−１５モル比を使用し、及び２．７へのｐＨ調整を塩酸で行った後（氷酢酸を使用してｐＨ４．０に調整するのでなく）、精製及び特徴付けを行った。

実施例８
ＣＴＬＬ−２細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化に基づくｒＩＬ−１５コンジュゲートのＩＬ−１５活性の計測
アッセイの前日に、ＣＴＬＬ−２細胞を新鮮な成長培地［１０％ＦＢＳ、１０％Ｔ細胞培養添加物（カタログ番号３５４１１５、Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ，ＭＡ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン酸塩、及び１ｍＭピルビン酸ナトリウムを補足したＲＰＭＩ １６４０］に分けた。アッセイ当日、細胞をアッセイ培地（１％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン酸塩、及び１ｍＭピルビン酸ナトリウムを補足したＲＰＭＩ １６４０）で少なくとも４時間プレインキュベートし、次に９６ウェルプレート中のアッセイ培地に５０，０００細胞／ウェルでプレーティングした。アッセイ直前に適切な緩衝液中に被験物質の希釈物を調製した。ＣＴＬＬ−２細胞が入ったトリプリケートウェルに２５倍被験物質溶液を移すことにより、ＣＴＬＬ−２細胞の刺激を開始した。プレートを３７℃、５％ＣＯ_２で１０分間インキュベートし、細胞溶解によって反応は停止した。ＭＳＤ Ｐｈｏｓｐｈｏ（Ｔｙｒ６９４）／Ｔｏｔａｌ ＳＴＡＴａ，ｂ全細胞ライセートキット（カタログ番号Ｋ１５１６３Ｄ、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用して細胞溶解物中のホスホ−ＳＴＡＴ５及び総ＳＴＡＴ５タンパク質レベルの検出を実施した。１０分間の処理後、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈから入手した組換えヒトＩＬ−１５（カタログ番号２００−１５）は、０．０６３±０．０２８ｎｇ／ｍＬの平均ＥＣ_５０でＣＴＬＬ−２細胞においてＳＴＡＴ５リン酸化（ｐｈｏｓｐｏｒｙｌａｔｉｏｎ）を誘導することによりＩＬ−１５活性を実証し、これを対照として供した。実施例２、３及び５において調製したコンジュゲートを試験し、１０分間の処理後の結果を表４に提供した。

実施例９
Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ腫瘍におけるｒＩＬ−１５コンジュゲートの抗腫瘍活性の評価
インビボモデルにおけるｒＩＬ−１５コンジュゲートの有効性を試験して比較するため、６〜８週齢雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、１００μＬ容積の血清不含細胞培養培地中１×１０６細胞ｍＬ−１の密度のマウス転移性Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞を腹部腹後側に皮下注射することによって同系腫瘍を誘導した。マウスにおいては、６〜８日目の終わりまでに約１００ｍｍ^３の腫瘍が発達した。マウスを６群に分け、各群が１０匹の動物からなった。各群には、表５に示すとおり異なる被験物質を割り当てた。

群Ａ〜群Ｄは、マウスに０．６ｍｇ／ｋｇ体重で静脈内注射によって１回のみ投与したｒＩＬ−１５コンジュゲートに対応し、一方、群Ｅは、腹腔内注射によって隔日投与した非コンジュゲートＩＬ−１５に相当する。群Ｆはビヒクル対照に相当し、ここではリン酸緩衝生理食塩水を静脈内注射によって投与した。

用量投与後、体重変化及びデジタルノギスによる皮下転移性メラノーマ腫瘍の成長に関してマウスの計測を週３回行った。毎日の臨床徴候もまたモニタした。腫瘍の平均容積が１５００ｍｍ^３（即ち、１５００ｍｍ^３の平均腫瘍容積）に達したとき、試験エンドポイントに達した。

１５００ｍｍ^３の平均腫瘍容積に最初に達した群は群Ｆ（ビヒクル対照群）であり、これは試験１３日目に起こった。他の全ての群（即ち、群Ａ〜群Ｅ）は約２４日目に試験エンドポイントに達し、従って腫瘍成長の阻害におけるＩＬ−１５及びｒＩＬ−１５コンジュゲートの両方の有効性が示される。

さらに、非コンジュゲートＩＬ−１５及びｒＩＬ−１５コンジュゲートについて１０００ｍｍ^３に達するまでの観察された腫瘍増殖遅延は１．５〜４．５日の範囲であったが、非コンジュゲートＩＬ−１５（６用量について毎日０．３ｍｇ／ｋｇの投与）の総用量はコンジュゲートｒＩＬ−１５の単回用量（０．６ｍｇ／ｋｇの単回用量の投与）の３倍であったため、少なくともｒＩＬ−１５コンジュゲートは非コンジュゲートＩＬ−１５の約３倍強力であることが示された。表６を参照のこと。

ｒＩＬ−１５コンジュゲートの効力増加に加えて、パーセント体重の低下などの顕著な臨床徴候はなかった。図３として提供されるプロットに、群Ａ〜群Ｆの各々の投与後のパーセント体重変化を示す。

実施例１０
ＩＬ−１５Ｒαに対するｒＩＬ−１５コンジュゲートの受容体親和性
表面プラズモン共鳴（「ＳＰＲ」）を用いてＩＬ−１５及びｒＩＬ−１５コンジュゲートの親和性を測定した。簡潔に言えば、１：１のＮＨＳ：ＥＤＣ混合物を使用して活性ＮＨＳエステルを生じさせることにより、Ｂｉａｃｏｒｅ ＣＭ５センサーチップの表面を活性化した。ヤギ抗ヒトＦｃ抗体を１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４）中において５分間注入することにより、それを表面に共有結合させた。約８０００ＲＵの抗体が表面に結合した。次に残りのＮＨＳエステルをエタノールアミンでクエンチした。

各注入サイクルの開始時に、ＰＢＳＰ中における５分間の注入ステップによってセンサーチップチャネル上にＩＬ−１５−Ｒα−Ｆｃを捕捉した。典型的には、１５０〜２００ＲＵの受容体が表面に結合した。

ｒＩＬ−１５コンジュゲートをＰＢＳ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０及び０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ含有）中１０μＭに希釈した。３倍段階希釈物を作製し、ＩＬ−１５Ｒαで被覆したセンサーチップに注入した。ｋ_ａ速度及びｋ_ｄ速度を別々に決定することにより親和性を計測し、ｋ_ｄとｋ_ａとの比を用いてＫ_ｄ値を計算した。

表７に示されるとおり、ＩＬ−１５は、３．８ｐＭのＩＬ−Ｒａに対する親和性を有する。この親和性はモノ−ＰＥＧ種で４３ｐＭに低下し、ジ−及びトリ−ＰＥＧ種で１８３ｐＭに低下する（種は全て実施例２において調製）。この効果は４０ｋＤａ ＰＥＧでより大きくなる；親和性はモノ−並びにジ−及びトリ−種で２〜４ｎＭに低下し、トリ−ＰＥＧ種で９．４ｎＭに低下する（種は全て実施例５において調製）。

配列表
配列番号１

配列番号２

配列番号３

Claims (14)

1. ２０，０００ダルトン、３０，０００ダルトンおよび４０，０００ダルトンからなる群から選択される総重量平均分子量を有する分枝鎖状水溶性ポリマーに遊離可能に共有結合したインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）部分を含むコンジュゲートであって、以下の構造
   
   を含む、コンジュゲート。
2. 前記ＩＬ−１５部分が、配列番号１〜３、および配列番号１〜３のいずれか１つと９５％より高い相同性を有するアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のコンジュゲート。
3. １個、２個、３個又は４個の分枝鎖状水溶性ポリマーが前記ＩＬ−１５部分に結合しており、ここで、各結合は、前記分枝鎖状水溶性ポリマーと前記ＩＬ−１５部分との間の結合である、請求項１または２に記載のコンジュゲート。
4. １個、２個又は３個の分枝鎖状水溶性ポリマーが前記ＩＬ−１５部分に結合しており、ここで、各結合は、前記分枝鎖状水溶性ポリマーと前記ＩＬ−１５部分との間の結合である、請求項１または２に記載のコンジュゲート。
5. １個又は２個の分枝鎖状水溶性ポリマーが前記ＩＬ−１５部分に結合しており、ここで、各結合は、前記分枝鎖状水溶性ポリマーと前記ＩＬ−１５部分との間の結合である、請求項１または２に記載のコンジュゲート。
6. 前記分枝鎖状水溶性ポリマーが、インビボで、前記水溶性ポリマーの断片を残さず前記ＩＬ−１５部分から離れる、請求項１に記載のコンジュゲート。
7. 前記ＩＬ−１５部分が、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のコンジュゲート。
8. 修飾されていないＩＬ−１５部分の測定可能な程度のＩＬ−１５活性を有する、請求項１に記載のコンジュゲート。
9. インビボ腫瘍動物モデルにおいて評価した場合に腫瘍増殖の阻害に有効である、請求項１に記載のコンジュゲート。
10. 表面プラズモン共鳴によって測定した場合に、ＩＬ−１５Ｒαに対するインターロイキン−１５の親和性と比較して低下したＩＬ−１５Ｒαに対する親和性を有する、請求項１に記載のコンジュゲート。
11. 請求項１〜８のいずれか一項に記載のコンジュゲートと、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物。
12. 療法における使用のために個人に投与されることを特徴とする、請求項１１に記載の医薬組成物。
13. メラノーマ、腎癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、前立腺癌、乳癌、血液癌、頭頸部癌、卵巣癌、及び結腸癌から選択される病態の治療に使用するための、請求項１２に記載の医薬組成物。
14. 請求項１〜１０のいずれかに記載のＩＬ−１５水溶性ポリマーコンジュゲートの作製方法であって、コンジュゲート形成条件下で、ｐＨ７〜９．０の水性媒体中でＩＬ−１５部分を、スクシンイミジル基または他の活性化エステル基で官能化したモル過剰の分枝鎖状ポリマー試薬と接触させるステップを含み、前記分枝鎖状ポリマー試薬は、
    
    の構造を有し、前記分枝鎖状ポリマー試薬は、２０，０００ダルトン、３０，０００ダルトンおよび４０，０００ダルトンから選択される分子量を有する、方法。