ES2876433T3 - Conjugados de IL-15 y polietilenglicol ramificado - Google Patents

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Peter Kirk
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Abstract

Un conjugado que comprende una fracción de interleucina-15 (IL-15) que está unida covalentemente, a través de uno o más de sus grupos amino, a un polímero de poli(etilenglicol) ramificado.

Description

DESCRIPCIÓN
Conjugados de IL-15 y polietilenglicol ramificado
Campo
Entre otras cosas, la presente divulgación se refiere generalmente a conjugados que comprenden una fracción de IL-15 (es decir, una fracción que tiene al menos alguna actividad similar a la IL-15 humana) y un polímero hidrosoluble, no peptídico. Además, la divulgación se refiere a (entre otras cosas) composiciones que comprenden conjugados, métodos para sintetizar conjugados y métodos para administrar una composición.
Antecedentes
La interleucina-15 ("IL-15") es una citocina pleiotrópica que se informó por primera vez por Grabstein et al. [Grabstein et al. (1994) Science 264:965-968]. Secretada como un precursor de 162 aminoácidos, la IL-15 humana contiene una secuencia líder de 29 aminoácidos y una pro secuencia de 19 aminoácidos; la proteína madura tiene, por lo tanto, 114 aminoácidos de longitud. Perteneciente a la familia de citocinas de cuatro haces a-hélice, la IL-15 se une a un receptor heterotrimérico, en donde una subunidad a única (IL-15Ra) confiere especificidad de receptor a IL-15, y las subunidades p y y de este receptor comparten similitudes con uno o más de otros receptores de citocinas. Giri et al. (1995) EMBO J. 14:3654-3663.
Como una citocina, la IL-15 tiene efectos tanto en el sistema inmunitario innato como en el sistema inmunitario adaptativo. DiSabitino et al. (2011) Cytokine Growth Factor Rev. 22:19-33. Con respecto al sistema inmunitario innato (que defiende al hospedador de invasores extraños de forma genérica), la IL-15 provoca el desarrollo de y mantiene la supervivencia de las células citolíticas naturales ("células NK") y las células T citolíticas naturales ("células T-NK"), entre otras propiedades. De acuerdo con su papel en el sistema inmunitario innato, las células NK no atacan específicamente al patógeno invasor; más bien, estas células destruyen las células hospedadoras comprometidas (tales como las células tumorales o las células infectadas por virus). Las células NK-T generan citocinas inmunomoduladoras, particularmente interferón-y, que resultan en una activación general de la respuesta inmunitaria.
Con respecto al sistema inmunitario adaptativo (que defiende al hospedador de un invasor extraño específico después de un encuentro inicial con ese patógeno en particular), la IL-15 es necesaria para el mantenimiento de las células T auxiliares generadoras de citocinas inmunomoduladoras. De manera importante, la IL-15 también apoya el mantenimiento a largo plazo de las células T de memoria "de experiencia por antígenos", que tienen la capacidad de reproducirse rápidamente, generando de esta manera una respuesta inmunitaria más rápida y más fuerte tras la reexposición al patógeno extraño particular que invade al hospedador.
Finalmente, a pesar de sus funciones específicas dentro de los sistemas inmunitarios innato y adaptativo, la IL-15 tiene efectos amplios y significativos en ambas categorías de sistemas inmunitarios. En particular, la IL-15 inhibe o reduce la apoptosis (o muerte celular) de varios tipos de células (incluyendo células dendríticas, neutrófilos, eosinófilos, mastocitos, células T CD4+ y células B) asociados a ambas categorías de sistemas inmunitarios.
Debido a que estimula la proliferación y el mantenimiento de muchas células dentro del sistema inmunitario que pueden luchar contra las células que al hospedador le parecen extrañas (o "no propias"), se ha propuesto la IL-15 para su uso en los tratamientos de individuos que padecen cáncer. Steel et al. (2012) Trends Pharmacol. Sci. 33(1):35-41. Por ejemplo, se ha propuesto un agonista basado en IL-15 para tratar mielomas. Wong et al. (2013) OncoImmunology 2(11), e26442:1-3. Además, se ha propuesto la farmacoterapia con IL-15 para el tratamiento de individuos que padecen infecciones víricas, tales como la infección por VIH.
A pesar de su potencial de uso en el tratamiento de personas que padecen una serie de enfermedades, las terapias basadas en IL-15 enfrentan una serie de desafíos. Por ejemplo, la IL-15 se elimina rápidamente y es relativamente inestable en condiciones fisiológicas. Determinados enfoques intentan superar estas limitaciones formando un complejo de IL-15 con la subunidad alfa del receptor de IL-15. Dicho enfoque, sin embargo, puede anular la señalización deseable que se produce únicamente a través del receptor alfa de IL-15, expresado en múltiples tipos de células. Se ha informado de una PEGilación no liberable con un polímero terminado en carbonato de succinimidilo de peso molecular relativamente pequeño (5 kDa), pero esto resultó en una alteración significativa de la actividad biológica de la IL-15. Pettit et al. (1997) J. Biol. Chem. 272(4):2312-2318.
A pesar de estos conjugados, sin embargo, sigue existiendo una necesidad de nuevos conjugados de IL-15 que tengan características y perfiles mejorados. Entre otras cosas, por lo tanto, una o más realizaciones de la presente invención están dirigidas a dichos conjugados, así como a composiciones que comprenden los conjugados y métodos relacionados como se describe en el presente documento, que se cree que son nuevos y completamente no sugeridos por la técnica.
Sumario
En un primer aspecto, la invención proporciona un conjugado que comprende una fracción de interleucina-15 (IL-15) que está unida covalentemente, a través de uno o más de sus grupos amino, a un polímero soluble en agua que es un polímero de poli(etilenglicol) ramificado.
En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un conjugado de la invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
En un aspecto adicional, las composiciones farmacéuticas de la invención son para su uso en terapia.
En una o más realizaciones de la invención, se proporciona un conjugado, comprendiendo el conjugado un resto de una fracción de IL-15 unido covalentemente a un polímero hidrosoluble de acuerdo con la invención, en donde el resto de la fracción de IL-15 está unido covalentemente al polímero hidrosoluble a través de un enlace liberable.
En una o más realizaciones de la invención, se proporciona un conjugado, comprendiendo el conjugado un resto de una fracción de IL-15 unido covalentemente a un polímero hidrosoluble de acuerdo con la invención, en donde el resto de la fracción de IL-15 está unido covalentemente al polímero hidrosoluble a través de un enlace no liberable, preferentemente en donde el polímero hidrosoluble tiene un peso molecular promedio en peso superior a 5.000 Dalton. En una o más realizaciones de la invención, se proporciona un conjugado, comprendiendo el conjugado un resto de una fracción de IL-15 unido covalentemente a un polímero hidrosoluble de acuerdo con la invención, en donde la fracción de IL-15 está libre de restos de cisteína no implicados en el enlace disulfuro.
En una o más realizaciones de la invención, se proporciona un conjugado, comprendiendo el conjugado un resto de una fracción de IL-15 unido covalentemente a un polímero hidrosoluble de acuerdo con la invención, en donde la fracción de IL-15 tiene un resto de cisteína adicional en comparación con la IL-15 humana, y el polímero hidrosoluble está unido covalentemente al resto de cisteína adicional.
En una o más realizaciones de la invención, se proporciona un conjugado, comprendiendo el conjugado un resto de una fracción de IL-15 unido covalentemente a un polímero hidrosoluble de acuerdo con la invención, en donde una amina de la fracción de IL-15 se une covalentemente al polímero hidrosoluble a través de un enlace distinto del enlace amida.
En una o más realizaciones de la invención, se proporciona un conjugado, comprendiendo el conjugado un resto de una fracción de IL-15 unido covalentemente a un polímero hidrosoluble de acuerdo con la invención, en donde una amina de la fracción de IL-15 está unida covalentemente al polímero hidrosoluble a través de un enlace amina. También se describe en el presente documento un método para suministrar un conjugado, comprendiendo el método la etapa de administrar subcutáneamente al paciente una composición compuesta por un conjugado de un resto de una iL-15 y un polímero hidrosoluble.
Breve descripción de los dibujos
La FIGURA 1 es un gel SDS-PAGE de mezclas de reacción de conjugación de IL-15 con PEG2-ru-NHS 20K.
La FIGURA 2 es un gel SDS-PAGE de mezclas de reacción de conjugación de IL-15 con PEG2-ru-NHS 40K.
La FIGURA 3 es un gráfico que muestra el porcentaje de cambio de peso corporal después de la administración de IL-15 (en forma no conjugada), rIL-15 conjugada o control de vehículo en tumores subcutáneos B16F10 establecidos en ratones.
Descripción detallada
Cabe señalar que, como se usa en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones previstas, las formas del singular "un", "uno/una", y "el/la" incluyen los referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "un polímero" incluye un solo polímero así como dos o más del mismo o diferentes polímeros, la referencia a "un excipiente opcional" se refiere a un único excipiente opcional así como a dos o más del mismo o diferentes excipientes opcionales y similares.
Al describir y reivindicar una o más realizaciones de la presente invención, se usará la siguiente terminología de acuerdo con las definiciones descritas a continuación.
"PEG", "polietilenglicol" y "poli(etilenglicol)" como se usan en el presente documento, son intercambiables y abarcan cualquier poli(óxido de etileno) no peptídico, hidrosoluble. Normalmente, los PEG para su uso de acuerdo con la invención comprenden la siguiente estructura "-(OCH2CH2)n-" donde (n) es de 2 a 4000. Como se usa en el presente documento, PEG también incluye "-CH2CH2-O(CH2CH2O)n-CH2CH2-" y "-(OCH2CH2)nO-", dependiendo de si los oxígenos terminales se han desplazado o no, por ejemplo, durante una transformación sintética. A lo largo de toda la memoria descriptiva y las reivindicaciones, debe recordarse que el término "PEG" incluye estructuras que tienen diversos grupos terminales o de "protección terminal" y así sucesivamente. El término "PEG" también significa un polímero que contiene una mayoría, es decir, más del 50 %, de subunidades de repetición -OCH2CH2-. Con respecto a formas específicas, el PEG puede tomar cualquier número de una diversidad de pesos moleculares, así como estructuras o geometrías tales como "ramificado", "lineal", "bifurcado", "multifuncional", y similares, que se describirán con más detalle a continuación.
Las expresiones "con protección terminal" y "protegido terminalmente" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a un terminal o punto final de un polímero que tiene una fracción de protección terminal. Normalmente, aunque no necesariamente, la fracción de protección terminal comprende un grupo hidroxi o alcoxi C1-20, más preferentemente un grupo alcoxi C1-10 y aún más preferentemente un grupo alcoxi C1-5. Por lo tanto, algunos ejemplos de fracciones de protección terminal incluyen alcoxi (por ejemplo, metoxi, etoxi y benciloxi), así como arilo, heteroarilo, ciclo, heterociclo y similares. Debe recordarse que el resto de protección terminal puede incluir uno o más átomos del monómero terminal en el polímero [por ejemplo, la fracción de protección terminal "metoxi" en CHaO(CH2CH2O)n- y CH3(OCH2CH2)n-]. Además, las formas saturadas, insaturadas, sustituidas y no sustituidas de cada uno de los anteriores están previstas. Por otra parte, el grupo de protección terminal también puede ser un silano. El grupo de protección terminal también puede comprender ventajosamente un marcador detectable. Cuando el polímero tiene un grupo de protección terminal que comprende un marcador detectable, la cantidad o ubicación del polímero y/o la fracción (por ejemplo, principio activo) al que está acoplado el polímero puede determinarse usando un detector adecuado. Tales marcadores incluyen, sin limitación, agentes fluorescentes, quimioluminiscentes, fracciones usadas en el marcaje enzimático, colorimétrico (por ejemplo, tintes), iones metálicos, restos radiactivos y similares. Los detectores adecuados incluyen fotómetros, películas, espectrómetros y similares. El grupo de protección terminal también puede comprender ventajosamente un fosfolípido. Cuando el polímero tiene un grupo de protección terminal que comprende un fosfolípido, se imparten propiedades únicas al polímero y al conjugado resultante. Los fosfolípidos ilustrativos incluyen, sin limitación, aquellos seleccionados de la clase de fosfolípidos llamada fosfatidilcolinas. Los fosfolípidos específicos incluyen, sin limitación, aquellos seleccionados del grupo que consiste en dilauroilfosfatidilcolina, dioleilfosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina, disteroilfosfatidilcolina, behenoilfosfatidilcolina, araquidoilfosfatidilcolina y lecitina. El grupo de protección terminal también puede incluir un resto de direccionamiento, de tal manera que el polímero, así como cualquier otra cosa, por ejemplo, una fracción de IL-15, unida al mismo, pueda localizarse preferencialmente en un área de interés.
"De origen no natural" con respecto a un polímero como se describe en el presente documento, significa un polímero que en su totalidad no se encuentra en la naturaleza. Un polímero de origen no natural puede, sin embargo, contener uno o más monómeros o segmentos de monómeros de origen natural, siempre que la estructura global del polímero no se encuentre en la naturaleza.
La expresión "soluble en agua" como en un "polímero hidrosoluble" es un resto que es soluble en agua a temperatura ambiente. Normalmente, un polímero hidrosoluble transmitirá al menos aproximadamente el 75 %, más preferentemente al menos aproximadamente el 95 %, de luz (por ejemplo, de una longitud de onda de 600 nm) transmitida por la misma solución después del filtrado. Sobre una base en peso, un polímero hidrosoluble será preferentemente al menos aproximadamente el 35 % (en peso) soluble en agua, más preferentemente al menos aproximadamente el 50 % (en peso) soluble en agua, aún más preferentemente de aproximadamente el 70 % (en peso) soluble en agua y aún más preferentemente de aproximadamente el 85 % (en peso) soluble en agua. Es lo más preferido, sin embargo, que el polímero hidrosoluble sea aproximadamente el 95 % (en peso) soluble en agua o completamente soluble en agua.
Peso molecular en el contexto de un polímero hidrosoluble, tal como PEG, puede expresarse como un peso molecular peso molecular promedio en número o un peso molecular promedio ponderado. A menos que se indique lo contrario, todas las referencias al peso molecular en el presente documento se refieren al peso molecular promedio en peso. Ambas determinaciones de peso molecular, promedio en número y promedio ponderado, pueden medirse usando cromatografía de permeación en gel u otras técnicas de cromatografía líquida. También pueden usarse otros métodos para medir los valores de peso molecular, tales como el uso de análisis de grupo final o la medición de propiedades coligativas (por ejemplo, depresión del punto de congelación, elevación del punto de ebullición o presión osmótica) para determinar el peso molecular promedio en número o el uso de técnicas de dispersión de luz, ultracentrifugación o viscosimetría para determinar el peso molecular promedio ponderado. Los polímeros de la invención son típicamente polidispersos (es decir, el peso molecular promedio en número y el peso molecular promedio ponderado de los polímeros no son iguales), poseyendo bajos valores de polidispersidad de preferentemente menos de aproximadamente 1,2, más preferentemente menos de aproximadamente 1,15, aún más preferentemente menos de aproximadamente 1,10, aún más preferentemente menos de aproximadamente 1,05 y lo más preferentemente menos de aproximadamente 1,03.
Los términos "activo", "reactivo" o "activado" cuando se usa junto con un grupo funcional particular, se refieren a un grupo funcional reactivo que reacciona fácilmente con un electrófilo o un nucleófilo en otra molécula. Esto contrasta con aquellos grupos que requieren catalizadores fuertes o condiciones de reacción muy poco prácticas para reaccionar (es decir, un grupo "no reactivo" o "inerte").
Como se usa en el presente documento, la expresión "grupo funcional" o cualquier sinónimo del mismo pretende abarcar formas protegidas del mismo así como formas no protegidas.
Las expresiones "fracción espadadora", "enlace" y "enlazador" se usan en el presente documento para referirse a un enlace o un átomo o una colección de átomos usados opcionalmente para enlazar fracciones de interconexión tales como un extremo de un reactivo polimérico y una fracción de IL-15 o un electrófilo o nucleófilo de una fracción de IL-15. El resto espaciador puede ser hidrolíticamente estable o puede incluir un enlace fisiológicamente hidrolizable o enzimáticamente degradable. A menos que el contexto dicte claramente lo contrario, opcionalmente existe un resto espaciador entre dos elementos cualesquiera de un compuesto (por ejemplo, los conjugados proporcionados que comprenden un resto de la fracción de IL-15 y polímero hidrosoluble pueden unirse directa o indirectamente a través de un resto espaciador).
"Alquilo" se refiere a una cadena de hidrocarburo, que varía típicamente de aproximadamente 1 a 15 átomos de longitud. Dichas cadenas de hidrocarburos están preferentemente, pero no necesariamente, saturadas y pueden ser de cadena lineal o ramificada, aunque normalmente se prefiere la cadena lineal. Algunos ejemplos de grupos alquilo incluyen metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, 3-metilpentilo y similares.
"Alquilo inferior" se refiere a un grupo alquilo que contiene de 1 a 6 átomos de carbono y puede ser de cadena lineal o ramificada, como se ejemplifican por metilo, etilo, n-butilo, /'-butilo y f-butilo.
"Cicloalquilo" se refiere a una cadena de hidrocarburo cíclico saturado o insaturado, incluyendo compuestos de puente, condensados o espirocíclicos, preferentemente compuestos por 3 a aproximadamente 12 átomos de carbono, más preferentemente de 3 a aproximadamente 8 átomos de carbono. "Cicloalquileno" se refiere a un grupo cicloalquilo que se inserta en una cadena de alquilo mediante la unión de la cadena en dos carbonos cualesquiera en el sistema de anillo cíclico.
"Alcoxi" se refiere a un grupo -OR, en donde R es alquilo o alquilo sustituido, preferentemente alquilo C1-6 (por ejemplo, metoxi, etoxi, propiloxi, etcétera).
El término "sustituido" como en, por ejemplo, "alquilo sustituido", se refiere a una fracción (por ejemplo, un grupo alquilo) sustituida con uno o más sustituyentes que no interfieren, tales como, pero no limitado a: alquilo, cicloalquilo C3-8, por ejemplo, ciclopropilo, ciclobutilo y similares; halo, por ejemplo, fluoro, cloro, bromo y yodo; ciano; alcoxi, fenilo inferior; fenilo sustituido; y similares. "Arilo sustituido" es arilo que tiene uno o más grupos que no interfieren como un sustituyente. Para sustituciones en un anillo de fenilo, los sustituyentes pueden estar en cualquier orientación (es decir, orto, meta o para).
Los "sustituyentes que no interfieren" son aquellos grupos que, cuando están presentes en una molécula, son típicamente no reactivos con otros grupos funcionales contenidos dentro de la molécula.
"Arilo" significa uno o más anillos aromáticos, cada uno de 5 o 6 átomos de carbono del núcleo. Arilo incluye múltiples anillos de arilo que pueden estar condensados, como en naftilo o sin condensar, como en bifenilo. Los anillos de arilo también pueden estar condensados o no condensados con uno o más anillos de hidrocarburo cíclicos, de heteroarilo o heterocíclicos. Como se usa en el presente documento, "arilo" incluye heteroarilo.
"Heteroarilo" es un grupo arilo que contiene de uno a cuatro heteroátomos, preferentemente azufre, oxígeno o nitrógeno, o una combinación de los mismos. Los anillos de heteroarilo también pueden condensarse con uno o más anillos de hidrocarburo cíclicos, heterocíclicos, de arilo o de heteroarilo.
"Heterociclo" o "heterocíclico" significa uno o más anillos de 5-12 átomos, preferentemente de 5-7 átomos, con o sin insaturación o carácter aromático y que tiene al menos un átomo de anillo que no es un carbono. Los heteroátomos preferidos incluyen azufre, oxígeno y nitrógeno.
"Heteroarilo sustituido" es heteroarilo que tiene uno o más grupos que no interfieren como sustituyentes.
"Heterociclo sustituido" es un heterociclo que tiene una o más cadenas laterales formadas a partir de sustituyentes que no interfieren.
Un "radical orgánico" como se usa en el presente documento incluirá alquilo, alquilo sustituido, arilo y arilo sustituido. "Electrófilo" y "grupo electrófilo" se refieren a un ion o átomo o colección de átomos, que puede ser iónicos, teniendo un centro electrófilo, es decir, un centro que busca electrones, capaz de reaccionar con un nucleófilo.
"Nucleófilo" y "grupo nucleófilo" se refieren a un ion o átomo o colección de átomos que pueden ser iónicos que tienen un centro nucleófilo, es decir, un centro que busca un centro electrófilo o con un electrófilo.
Un "enlace enzimáticamente degradable" significa un enlace que está sujeto a la degradación por una o más enzimas.
Un enlace "hidrolizable" es un enlace que reacciona con el agua (es decir, se hidroliza) en condiciones fisiológicas. La tendencia de un enlace a hidrolizarse en agua dependerá no sólo del tipo general de enlace que conecta dos átomos centrales, sino también de los sustituyentes unidos a estos átomos centrales. Los enlaces débiles o hidrolíticamente inestables apropiados incluyen, pero no se limitan a, éster de carboxilato, éster de fosfato, anhídridos, acetales, cetales, aciloxialquil éter, iminas, ortoésteres, péptidos y oligonucleótidos. Un "enlace liberable" es un enlace covalente que se escinde en condiciones fisiológicas a una velocidad que es clínicamente útil e incluye, por ejemplo y sin limitación, enlaces hidrolizables y enlaces enzimáticamente degradables.
Un enlace o enlace "hidrolíticamente estable" se refiere a un enlace químico, típicamente un enlace covalente, que es sustancialmente estable en agua, es decir, no sufre hidrólisis en condiciones fisiológicas en ningún grado apreciable durante un período de tiempo prolongado. Los ejemplos de enlaces hidrolíticamente estables incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: enlaces carbono-carbono (por ejemplo, en cadenas alifáticas), éteres, amidas, uretanos y similares. Generalmente, un enlace hidrolíticamente estable es uno que exhibe una tasa de hidrólisis de menos de aproximadamente el 1-2 % por día en condiciones fisiológicas. Las tasas de hidrólisis de enlaces químicos representativos pueden encontrarse en la mayoría de los libros de texto de química convencional.
"Excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un excipiente que puede incluirse opcionalmente en las composiciones de la invención y que no provoca efectos toxicológicos adversos significativos en el paciente.
"Cantidad farmacológicamente eficaz", "cantidad fisiológicamente eficaz", y "cantidad terapéuticamente eficaz" se usan indistintamente en el presente documento para significar la cantidad de un conjugado de polímero-fracción (IL-15) que se necesita para proporcionar un nivel deseado del conjugado (o fracción de IL-15 no conjugada correspondiente) en el torrente sanguíneo o en el tejido diana. La cantidad precisa dependerá de numerosos factores, por ejemplo, la fracción de IL-15 particular, los componentes y características físicas de la composición terapéutica, la población de pacientes prevista, las consideraciones del paciente individual y similares, y puede determinarse fácilmente por un experto en la materia, basándose en la información proporcionada en el presente documento.
"Multifuncional" significa un polímero que tiene tres o más grupos funcionales contenidos en el mismo, donde los grupos funcionales pueden ser iguales o diferentes. Los reactivos poliméricos multifuncionales de la invención contendrán típicamente de aproximadamente 3-100 grupos funcionales y pueden contener, por ejemplo, un número que satisfaga uno o más de los siguientes intervalos: de 3-50 grupos funcionales; de 3-25 grupos funcionales; de 3­ 15 grupos funcionales; de 3 a 10 grupos funcionales. Por ejemplo, el número de grupos funcionales puede seleccionarse del grupo que consiste en 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10 grupos funcionales dentro de la cadena principal del polímero.
La expresión "fracción de IL-15", como se usa en el presente documento, se refiere a una fracción peptídica o proteica que tiene actividad IL-15 humana. La fracción de IL-15 también tendrá al menos un grupo electrófilo o nucleófilo adecuado para la reacción con un reactivo polimérico. Además, la expresión "fracción de IL-15" abarca tanto la fracción IL-15 antes de la conjugación como el resto de la fracción de IL-15 después de la conjugación. Como se explicará con detalle adicional a continuación, un experto en la materia puede determinar si cualquier resto dado tiene actividad IL-15. Las proteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos correspondiente a una cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 3 es un resto de IL-15, así como cualquier proteína o polipéptido sustancialmente homólogo al mismo. Como se usa en el presente documento, la expresión "fracción de IL-15" incluye tales péptidos y proteínas modificados deliberadamente, como por ejemplo, por mutagénesis dirigida al sitio o accidentalmente a través de mutaciones. Estas expresiones también incluyen análogos que tienen de 1 a 6 sitios de glucosilación adicionales, análogos que tienen al menos un aminoácido adicional en el extremo carboxi terminal del péptido o proteína en donde el aminoácido o aminoácidos adicionales incluyen al menos un sitio de glucosilación y análogos que tienen una secuencia de aminoácidos que incluye al menos un sitio de glucosilación. La expresión incluye fracciones producidas natural, recombinante y sintéticamente.
La expresión "sustancialmente homólogo" significa que una secuencia objeto particular, por ejemplo, una secuencia mutante, varía de una secuencia de referencia en una o más sustituciones, deleciones o adiciones, cuyo efecto neto no da como resultado una disimilitud funcional adversa entre las secuencias de referencia y objeto. Para los fines de la presente invención, las secuencias que tienen más del 95 por ciento de homología, actividad biológica equivalente (aunque no necesariamente fuerza equivalente de actividad biológica) y características de expresión equivalentes se consideran sustancialmente homólogas. Para los fines de determinación de homología, el truncamiento de la secuencia madura debe descartarse. Las fracciones de IL-15 ilustrativas para su uso en el presente documento incluyen aquellas secuencias que son sustancialmente homólogas a SEQ ID NO: 1.
El término "fragmento" significa cualquier proteína o polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de una porción o fragmento de una fracción de IL-15 y que tiene la actividad biológica de IL-15. Los fragmentos incluyen proteínas o polipéptidos producidos por degradación proteolítica de un resto de IL-15 así como proteínas o polipéptidos producidos por síntesis química mediante métodos rutinarios en la técnica.
El término "paciente", se refiere a un organismo vivo que padece o es propenso a una afección que puede prevenirse o tratarse mediante la administración de un principio activo (por ejemplo, conjugado) e incluye tanto seres humanos como animales.
"Opcional" u "opcionalmente" significa que la circunstancia descrita posteriormente puede o puede no producirse, de tal manera que la descripción incluye casos donde tiene lugar la circunstancia y casos en los que no.
"Sustancialmente" significa casi total o completamente, por ejemplo, satisfaciendo uno o más de los siguientes: más del 50 %, el 51 % o mayor, el 75 % o mayor, el 80 % o mayor, el 90 % o mayor y el 95 % o mayor de la condición. Los restos de aminoácidos en los péptidos se abrevian como sigue: Fenilalanina es Phe o F; Leucina es Leu o L; Isoleucina es Ile o I; Metionina es Met o M; Valina es Val o V; Serina es Ser o S; Prolina es Pro o P; Treonina es Thr o T; Alanina es Ala o A; Tirosina es Tyr o Y; Histidina es His o H; Glutamina es Gln o Q; Asparagina es Asn o N; Lisina es Lys o K; Ácido aspártico es Asp o D; Ácido glutámico es Glu o E; Cisteína es Cys o C; Triptófano es Trp o W; Arginina es Arg o R; y Glicina es Gly o G.
Se describe en el presente documento un conjugado, en donde el conjugado comprende un resto de una fracción de IL-15 unido covalentemente (ya sea directamente o mediante un resto espaciador) a un polímero hidrosoluble. En un aspecto, la invención proporciona un conjugado que comprende una fracción de interleucina-15 (IL-15) que está unida covalentemente, a través de uno o más de sus grupos amino, a un polímero de poli(etilenglicol) ramificado. Los conjugados de la invención tendrán una o más de las siguientes características.
La fracción de IL-15
Como se ha indicado anteriormente, el conjugado de la invención comprende un resto de una fracción de IL-15 unido covalentemente, ya sea directamente o a través de una fracción espaciadora, a un polímero hidrosoluble que es un polímero de poli(etilenglicol) ramificado. Como se usa en el presente documento, la expresión "fracción de IL-15" se referirá a la fracción de IL-15 antes de la conjugación así como a la fracción de IL-15 después de la unión a un polímero no peptídico, hidrosoluble. Se entenderá, sin embargo, que cuando la fracción de IL-15 original se une a un polímero no peptídico, hidrosoluble, la fracción de IL-15 está ligeramente alterada debido a la presencia de uno o más enlaces covalentes asociados al enlace al polímero o polímeros. A menudo, esta forma ligeramente alterada de la fracción de IL-15 unida a otra molécula se denomina un "resto" de la fracción de IL-15.
La fracción de IL-15 puede derivar de métodos no recombinantes y de métodos recombinantes y la invención no está limitada a este respecto. Además, la fracción de IL-15 puede derivar de fuentes humanas, fuentes animales (incluyendo insectos), fuentes de hongos (incluyendo levaduras) y fuentes vegetales.
El resto de IL-15 puede obtenerse de acuerdo con los procedimientos descritos por Grabstein et al. Véase. Grabstein et al. (1994) Science 264:965-968.
El resto de IL-15 puede derivar de métodos recombinantes. Véase, por ejemplo, el documento EP 0772 624 B2. El resto de IL-15 puede obtenerse en el comercio de, por ejemplo, GenScript ilSA Inc. (Piscataway NJ) y Peprotech (Rockyhill, NJ).
La fracción de IL-15 puede expresarse en sistemas de expresión bacterianos [por ejemplo, E. coli, véase, por ejemplo, Fischer et al. (1995) Biotechnol. Appl. Biotechnol. 21(3):295-311], de mamíferos [véase, por ejemplo, Kronman et al. (1992) Gene 121:295-304], de levadura (por ejemplo, Pichia pastoris, véase, por ejemplo, Morel et al. (1997) Biochem. J. 328(1):121-129] y vegetales [véase, por ejemplo, Mor et al. (2001) Biotechnol. Bioeng. 75(3):259-266]. La expresión puede producirse mediante expresión exógena (cuando la célula hospedadora contiene de forma natural la codificación genética deseada) o mediante expresión endógena.
Aunque los métodos basados recombinantes para preparar proteínas pueden diferir, los métodos recombinantes típicamente implican la construcción del ácido nucleico que codifica el polipéptido o fragmento deseado, clonar el ácido nucleico en un vector de expresión, transformar una célula hospedadora (por ejemplo, célula vegetal, bacteriana, de levadura, célula animal transgénica o célula de mamífero tal como célula de ovario de hámster chino o célula de riñón de hámster bebé) y expresar el ácido nucleico para producir el polipéptido o fragmento deseado. Los métodos para producir y expresar polipéptidos recombinantes in vitro y en células hospedadoras procariotas y eucariotas son conocidos por los expertos en la materia.
Para facilitar la identificación y purificación del polipéptido recombinante, las secuencias de ácido nucleico que codifican una etiqueta de epítopo u otra secuencia de unión de afinidad pueden insertarse o añadirse en marco con la secuencia codificante, produciendo de esta manera una proteína de fusión compuesta por el polipéptido deseado y un polipéptido adecuado para la unión. Las proteínas de fusión pueden identificarse y purificarse pasando primero una mezcla que contiene la proteína de fusión a través de una columna de afinidad que lleva fracciones de unión (por ejemplo, anticuerpos) dirigidos contra la etiqueta de epítopo u otra secuencia de unión en las proteínas de fusión, uniendo de esta manera la proteína de fusión dentro de la columna. En lo sucesivo, la proteína de fusión puede recuperarse lavando la columna con la solución apropiada (por ejemplo, ácido) para liberar la proteína de fusión unida. El polipéptido recombinante también puede purificarse lisando las células hospedadoras, separando el polipéptido, por ejemplo, por cromatografía de intercambio iónico, enfoques de unión por afinidad, enfoques de interacción hidrófoba y en lo sucesivo identificar por MALDI o transferencia Western y recolectando el polipéptido. Estos y otros métodos para identificar y purificar polipéptidos recombinantes son conocidos por los expertos en la materia. En una o más realizaciones de la invención, sin embargo, la fracción de IL-15 no está en forma de una proteína de fusión.
Dependiendo del sistema usado para expresar proteínas que tienen actividad IL-15, la fracción de IL-15 puede estar no glucosilada o glucosilada y puede usarse cualquiera. Esto es, la fracción de IL-15 puede estar no glucosilada o la fracción de IL-15 puede estar glucosilado. En una o más realizaciones de la invención, la fracción de IL-15 no está glucosilada.
La fracción de IL-15 puede modificarse ventajosamente para incluir y/o sustituir uno o más restos de aminoácidos tales como, por ejemplo, lisina, cisteína y/o arginina, para proporcionar una unión fácil del polímero a un átomo dentro de la cadena lateral del aminoácido. Un ejemplo de sustitución de una fracción de IL-15 se describe en la Patente de EE.UU. N.° 6.177.079. Además, la fracción de IL-15 puede modificarse para incluir un residuo de aminoácido de origen no natural. Las técnicas para añadir restos de aminoácidos y restos de aminoácidos de origen no natural son bien conocidas por los expertos en la materia. Se hace referencia a J. March, Advanced Organic Chemistry: Reactions Mechanisms and Structure, 4a Ed. (Nueva York: Wiley-Interscience, 1992).
Además, la fracción de IL-15 puede modificarse ventajosamente para incluir la unión de un grupo funcional (distinto de a través de la adición de un resto de aminoácido que contiene un grupo funcional). Por ejemplo, la fracción de IL-15 puede modificarse para incluir un grupo tiol. Además, la fracción de IL-15 puede modificarse para incluir un carbono alfa N-terminal. Además, la fracción de IL-15 puede modificarse para incluir una o más fracciones carbohidrato. Además, la fracción de IL-15 puede modificarse para incluir un grupo aldehído. Además, la fracción de IL-15 puede modificarse para incluir un grupo cetona. En algunas realizaciones de la invención, se prefiere que la fracción de IL-15 no se modifique para incluir uno o más de un grupo tiol, un carbono alfa N-terminal, carbohidrato, grupo aldehído y grupo cetona.
En el presente documento se describen ejemplos de fracciones de IL-15, en la bibliografía y en, por ejemplo, la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. N.° 2006/0104945, Pettit et al. (1997) J. Biol. Chem. 272(4):2312-2318 y Wong et al. (2013) OncoImmunology 2(11), e26442:1-3. Las fracciones de IL-15 preferidas incluyen aquellas que tienen una secuencia de aminoácidos que comprende secuencias seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 a 3 y secuencias sustancialmente homólogas a las mismas (en donde incluso si SEQ ID NO 2 y 3 y las secuencias sustancialmente homólogas a las mismas no cumplen con el patrón de actividad in vitro de una fracción de IL-15 proporcionada en el presente documento, se entenderá para los fines de la presente invención que estas secuencias también se entienden como "fracciones de IL-15"). Una fracción de IL-15 preferida tiene la secuencia de aminoácidos correspondiente a SEQ ID NO: 1.
En algunos casos, la fracción de IL-15 estará en forma de "monómero", en donde una sola expresión del péptido correspondiente se organiza en una unidad discreta. En otros casos, la fracción de IL-15 estará en forma de un "dímero" (por ejemplo, un dímero de IL-15 recombinante) en donde dos formas monoméricas de la proteína están asociadas entre sí.
Además, las formas precursoras de IL-15 pueden usarse como la fracción de IL-15. Una forma precursora ilustrativa de IL-15 tiene la secuencia de SEQ ID NO: 3.
Las versiones truncadas, variantes híbridas y miméticos de péptidos de cualquiera de las secuencias anteriores también pueden servir como la fracción de IL-15. Los fragmentos biológicamente activos, variantes de deleción, variantes de sustitución o variantes de adición de cualquiera de los anteriores que mantienen al menos algún grado de actividad de IL-15 también pueden servir como una fracción de IL-15.
Para cualquier péptido, fracción de proteína o conjugado dados, es posible determinar si ese péptido, fracción de proteína o conjugado tiene actividad IL-15. Se describen en la técnica diversos métodos para determinar la actividad IL-15 in vitro. Un enfoque ilustrativo se basa en un ensayo pSTAT. Brevemente, si una célula CTLL-2 dependiente de IL-15 se expone a un artículo de prueba que tiene actividad IL-15, el inicio de una cascada de señalización da como resultado la fosforilación de STAT5 en el resto de tirosina 694 (Tyr694) que puede medirse cuantitativamente. Los kits y protocolos de ensayo son conocidos e incluyen, por ejemplo, el kit MSD Phospho(Tyr694)/Total STATa,b Whole Cell Lysate Kit (Meso Seal Diagnostics, LLC, Gaithersburg, MD), que se usó en relación con el Ejemplo 1; usando esta estrategia, una fracción de IL-15 propuesta que exhibe un valor de CE50 pSTAT5 de al menos 300 ng/ml (más preferentemente al menos 150 ng/ml) al menos uno de a 5 minutos o a 10 minutos se considera una "fracción de IL-15" en relación con la presente invención. Se prefiere, sin embargo, que el resto de IL-15 usado en la presente invención sea más potente (por ejemplo, que tenga un valor de CE50 pSTAT5 de menos de 150 ng/ml en uno de al menos 5 minutos o 10 minutos, tal como menos de 1 ng/ml e incluso más preferentemente menos de 0,5 ng/ml en uno de al menos uno de 5 minutos o en 10 minutos). Se prefiere que los conjugados que contienen un enlace estable exhiban un valor de CE50 pSTAT5 de al menos 300 ng/ml (más preferentemente al menos 150 ng/ml) a los 10 minutos y se prefiere más que los conjugados que contienen un enlace estable exhiban un valor de CE50 pSTAT5 de menos de 150 ng/ml a los 10 minutos.
También pueden usarse otras metodologías conocidas en la técnica para evaluar la función de IL-15, incluyendo electrometría, espectrofotometría, cromatografía y metodologías radiométricas. Véase, por ejemplo, Ring et al. (2012) Nat. Immunol. 13 (12):1187-1195 para un tipo adicional de ensayo de este tipo.
Los ensayos para su uso en relación con la medición de la actividad de una fracción de IL-15 también pueden usarse para medir la actividad de los conjugados descritos en el presente documento. Debido a las propiedades de un conjugado dado (por ejemplo, incorporación de un enlace liberable, capacidad para soportar el metabolismo, semivida aumentada, propiedades de unión selectiva, etcétera), sin embargo, el conjugado no necesita exhibir necesariamente la misma actividad que un resto de IL-15 definido en el presente documento.
El polímero hidrosoluble
Como se analiza anteriormente, cada conjugado comprende una fracción de IL-15 unida a un polímero hidrosoluble. Con respecto al polímero hidrosoluble, el polímero hidrosoluble es no peptídico, no tóxico, de origen no natural y biocompatible. Con respecto a la biocompatibilidad, una sustancia se considera biocompatible si los efectos beneficiosos asociados al uso de la sustancia sola o con otra sustancia (por ejemplo, un principio activo tal como una fracción de IL-15) en relación con tejidos vivos (por ejemplo, administración a un paciente) superan cualquier daño efectos evaluados por un médico, por ejemplo, un médico tratante. Con respecto a la no inmunogenicidad, una sustancia se considera no inmunogénica si el uso previsto de la sustancia in vivo no produce una respuesta inmunitaria no deseada (por ejemplo, la formación de anticuerpos) o, si se produce una respuesta inmunitaria, que una respuesta tal no se considera clínicamente significativa o importante de acuerdo con la evaluación de un médico. Se prefiere particularmente que el polímero hidrosoluble no peptídico sea biocompatible y no inmunogénico.
Además, el polímero se caracteriza típicamente por que tiene de 2 a aproximadamente 300 terminales. Los ejemplos de tales polímeros incluyen, pero no se limitan a, poli(alquilenglicoles) tales como polietilenglicol ("PEG"), poli(propilenglicol) ("PPG"), copolímeros de etilenglicol y propilenglicol y similares, poli(poliol oxietilado), poli(alcohol olefínico), poli(vinilpirrolidona), poli(hidroxialquilmetacrilamida), poli(hidroxialquilmetacrilato), poli(sacáridos), poli(ahidroxiácido), poli(alcohol vinílico), polifosfaceno, polioxazolinas ("POZ") (que se describen en el documento WO 2008/106186), poli(N-acriloilmorfolina) y combinaciones de cualquiera de los anteriores.
El polímero hidrosoluble no se limita a una estructura particular y puede ser lineal (por ejemplo, un extremo protegido, por ejemplo, alcoxi PEG o un PEG bifuncional), ramificado o de múltiples brazos (por ejemplo, PEG bifurcado o PEG unido a un núcleo de poliol), una arquitectura dendrítica (o en estrella), cada uno con o sin uno o más enlaces degradables. Por otra parte, la estructura interna del polímero hidrosoluble puede organizarse en cualquier número de patrones de repetición diferentes y puede seleccionarse del grupo que consiste en homopolímero, copolímero alterno, copolímero aleatorio, copolímero de bloques, tripolímero alterno, tripolímero aleatorio y tripolímero de bloques. De acuerdo con las reivindicaciones, la invención proporciona un conjugado que comprende una fracción de interleucina-15 (IL-15) que está unida covalentemente, a través de uno o más de sus grupos amino, a un polímero hidrosoluble que es un polímero de poli(etilenglicol) ramificado.
Normalmente, PEG activado y otros polímeros hidrosolubles (es decir, reactivos poliméricos) se activan con un grupo activador adecuado apropiado para acoplarse a un sitio deseado en la fracción de IL-15. Por lo tanto, un reactivo polimérico poseerá un grupo reactivo para reaccionar con la fracción de IL-15. Los reactivos poliméricos representativos y los métodos para conjugar estos polímeros con una fracción activa se conocen en la técnica y se describen con más detalle en Zalipsky, S., et al., "Use of Functionalized Poly(Ethylene Glycols) for Modification of Polypeptides" in Polyethylene Glycol Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, J. M. Harris, Plenus Press, Nueva York (1992) y en Zalipsky (1995) Advanced Drug Reviews 16:157-182. Los ejemplos de grupos activadores adecuados para acoplarse a una fracción de IL-15 incluyen hidroxilo, maleimida, éster, acetal, cetal, amina, carboxilo, aldehído, aldehído hidrato, cetona, vinil cetona, tiona, tiol, vinil sulfona, hidrazina, entre otros.
Normalmente, el peso molecular promedio ponderado del polímero hidrosoluble en el conjugado es de aproximadamente 100 Dalton a aproximadamente 150.000 Dalton. Los intervalos ilustrativos, sin embargo, incluyen pesos moleculares promedio en peso en el intervalo de más de 5.000 Dalton a aproximadamente 100.000 Dalton, en el intervalo de aproximadamente 6.000 Dalton a aproximadamente 90.000 Dalton, en el intervalo de aproximadamente 10.000 Dalton a aproximadamente 85.000 Dalton, en el intervalo de más de 10.000 Dalton a aproximadamente 85.000 Dalton, en el intervalo de aproximadamente 20.000 Dalton a aproximadamente 85.000 Dalton, en el intervalo de aproximadamente 53.000 Dalton a aproximadamente 85.000 Dalton, en el intervalo de aproximadamente 25.000 Dalton a aproximadamente 120.000 Dalton, en el intervalo de aproximadamente 29.000 Dalton a aproximadamente 120.000 Dalton, en el intervalo de aproximadamente 35.000 Dalton a aproximadamente 120.000 Dalton y en el intervalo de aproximadamente 40.000 Dalton a aproximadamente 120.000 Dalton. Para cualquier polímero hidrosoluble dado, se prefieren los PEG que tienen un peso molecular en uno o más de estos intervalos.
Los pesos moleculares promedio ponderados ilustrativos para el polímero hidrosoluble incluyen aproximadamente 100 Dalton, aproximadamente 200 Dalton, aproximadamente 300 Dalton, aproximadamente 400 Dalton, aproximadamente 500 Dalton, aproximadamente 600 Dalton, aproximadamente 700 Dalton, aproximadamente 750 Dalton, aproximadamente 800 Dalton, aproximadamente 900 Dalton, aproximadamente 1.000 Dalton, aproximadamente 1.500 Dalton, aproximadamente 2.000 Dalton, aproximadamente 2.200 Dalton, aproximadamente 2.500 Dalton, aproximadamente 3.000 Dalton, aproximadamente 4.000 Dalton, aproximadamente 4.400 Dalton, aproximadamente 4.500 Dalton, aproximadamente 5.000 Dalton, aproximadamente 5.500 Dalton, aproximadamente 6.000 Dalton, aproximadamente 7.000 Dalton, aproximadamente 7.500 Dalton, aproximadamente 8.000 Dalton, aproximadamente 9.000 Dalton, aproximadamente 10.000 Dalton, aproximadamente 11.000 Dalton, aproximadamente 12.000 Dalton, aproximadamente 13.000 Dalton, aproximadamente 14.000 Dalton, aproximadamente 15.000 Dalton, aproximadamente 20.000 Dalton, aproximadamente 22.500 Dalton, aproximadamente 25.000 Dalton, aproximadamente 30.000 Dalton, aproximadamente 35.000 Dalton, aproximadamente 40.000 Dalton, aproximadamente 45.000 Dalton, aproximadamente 50.000 Dalton, aproximadamente 55.000 Dalton, aproximadamente 60.000 Dalton, aproximadamente 65.000 Dalton, aproximadamente 70.000 Dalton y aproximadamente 75.000 Dalton. Las versiones ramificadas del polímero hidrosoluble (por ejemplo, un polímero hidrosoluble ramificado de 40.000 Dalton compuesto por dos polímeros de 20.000 Dalton) que tiene un peso molecular total de cualquiera de los anteriores también pueden usarse. En una o más realizaciones, el conjugado no tendrá restos de PEG unidos, ya sea directa o indirectamente, con un PEG que tiene un peso molecular promedio en peso de menos de aproximadamente 6.000 Dalton.
Cuando se usa como el polímero de acuerdo con la invención, los PEG normalmente comprenderán una serie de monómeros (OCH2CH2) [o monómeros (CH2CH2O), dependiendo de cómo se defina el PEG]. Como se usa a lo largo de toda la descripción, el número de unidades de repetición se identifica con el subíndice "n" en "(OCH2CH2)n". Por lo tanto, el valor de (n) normalmente se encuentra dentro de uno o más de los siguientes intervalos: de 2 a aproximadamente 3400, de aproximadamente 100 a aproximadamente 2300, de aproximadamente 100 a aproximadamente 2270, de aproximadamente 136 a aproximadamente 2050, de aproximadamente 225 a aproximadamente 1930, de aproximadamente 450 a aproximadamente 1930, de aproximadamente 1200 a aproximadamente 1930, de aproximadamente 568 a aproximadamente 2727, de aproximadamente 660 a aproximadamente 2730, de aproximadamente 795 a aproximadamente 2730, de aproximadamente 795 a aproximadamente 2730, de aproximadamente 909 a aproximadamente 2730 y de aproximadamente 1.200 a aproximadamente 1.900. Para cualquier polímero dado en el cual se conoce el peso molecular, es posible determinar el número de unidades de repetición (es decir, "n") dividiendo el peso molecular promedio en peso total del polímero por el peso molecular del monómero de repetición.
Un polímero particularmente preferido para su uso en la invención es un polímero con protección terminal, esto es, un polímero que tiene al menos un extremo protegido con un grupo relativamente inerte, tal como un grupo alcoxi C1-6 inferior, aunque también puede usarse un grupo hidroxilo. Cuando, de acuerdo con la invención, el polímero es PEG, se prefiere usar un metoxi-PEG (comúnmente conocido como mPEG), que es una forma lineal de PEG en donde un extremo del polímero es un grupo metoxi (-OCH3), mientras que el otro extremo es un hidroxilo u otro grupo funcional que opcionalmente puede estar químicamente modificado.
En una forma útil en una o más realizaciones de la presente invención, el PEG libre o no unido es un polímero lineal terminado en cada extremo con grupos hidroxilo:
HO-CH2CH2O-(CH2CH2O),-CH2CH2-OH,
en donde (n) típicamente varía de cero a aproximadamente 4.000.
El polímero anterior, alfa-, omega-dihidroxilpoli(etilenglicol), puede representarse brevemente como HO-PEG-OH donde se entiende que el símbolo -PEG- puede representar la siguiente unidad estructural:
-CH2CH2O-(CH2CH2O),-CH2CH2-,
en donde (n) es como se define anteriormente.
Otro tipo de PEG útil en una o más realizaciones de la presente invención es metoxi-PEG-OH o mPEG brevemente, en el cual un extremo es el grupo metoxi relativamente inerte, mientras que el otro extremo es un grupo hidroxilo. La estructura de mPEG se da a continuación.
CH3O-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH
en donde (n) es como se describió anteriormente.
Las moléculas de PEG ramificadas o de múltiples brazos, tales como los aquellas en la Patente de EE.UU. N.° 5.932.462, también pueden usarse como el polímero de PEG. Por ejemplo, el PEG puede tener la estructura:
Figure imgf000011_0001
en donde:
polia y poliB son estructuras principales de PEG (ya sean iguales o diferentes), tales como metoxi poli(etilenglicol); R" es una fracción no reactiva, tales como H, metilo o una estructura principal de PEG; y
P y Q son enlaces no reactivos. En una realización preferida, el polímero de PEG ramificado es lisina disustituida con metoxi poli(etilenglicol). Dependiendo del resto de IL-15 específico usado, el grupo funcional éster reactivo de la lisina disustituida puede modificarse adicionalmente para formar un grupo funcional adecuado para la reacción con el grupo diana dentro de la fracción IL-15.
Además, el PEG puede comprender un PEG bifurcado. Un ejemplo de un PEG bifurcado está representado por la siguiente estructura:
Figure imgf000011_0002
en donde: X es una fracción espaciadora de uno o más átomos y cada Z es un grupo terminal activado unido a CH por una cadena de átomos de longitud definida. La Publicación de Solicitud de Patente Internacional WO 99/45964 desvela diversas estructuras de PEG bifurcadas capaces de usarse en una o más realizaciones de la presente invención. La cadena de átomos que enlaza los grupos funcionales Z al átomo de carbono ramificado sirve como grupo de unión y puede comprender, por ejemplo, cadenas de alquilo, cadenas de éter, cadenas de éster, cadenas de amida y combinaciones de las mismas.
El polímero de PEG puede comprender una molécula de PEG colgante que tiene grupos reactivos, tales como carboxilo, unida covalentemente a lo largo de la longitud del PEG en lugar de al final de la cadena de PEG. Los grupos reactivos colgantes pueden unirse al PEG directamente o a través de una fracción espaciadora, tales como un grupo alquileno.
Además de las formas de PEG descritas anteriormente, el polímero también puede prepararse con uno o más enlaces débiles o degradables en el polímero, incluyendo cualquiera de los polímeros descritos anteriormente. Por ejemplo, el PEG puede prepararse con enlaces éster en el polímero que están sujetos a hidrólisis. Como se muestra a continuación, esta hidrólisis da como resultado la escisión del polímero en fragmentos de menor peso molecular: -PEG-CO2-PEG- H2O ^ -PEG-CO2H HO-PEG-Otros enlaces hidrolíticamente degradables, útiles como enlace degradable dentro de una estructura polimérica y/o como enlace degradable a una fracción de IL-15, incluyen: enlaces carbonato; enlaces de imina resultantes, por ejemplo, de la reacción de una amina y un aldehído (véase, por ejemplo, Ouchi et al. (1997) Polymer Preprints 38(1):582-3); enlaces de éster de fosfato formados, por ejemplo, haciendo reaccionar un alcohol con un grupo fosfato; enlaces hidrazona que se forman normalmente por reacción de una hidrazida y un aldehído; enlaces acetal que se forman típicamente por reacción entre un aldehído y un alcohol; enlaces de ortoéster que, por ejemplo, se forman por reacción entre un formiato y un alcohol; enlaces amida formados por un grupo amina, por ejemplo, en un extremo de un polímero tal como PEG y un grupo carboxilo de otra cadena de PEG; enlaces de uretano formados a partir de la reacción de, por ejemplo, un PEG con un grupo isocianato terminal y un alcohol PEG; enlaces peptídicos formados por un grupo amina, por ejemplo, en un extremo de un polímero tal como PEG y un grupo carboxilo de un péptido; y enlaces oligonucleotídicos formados por, por ejemplo, un grupo fosforamidita, por ejemplo, en el extremo de un polímero y un grupo hidroxilo 5' de un oligonucleótido.
Tales características opcionales del conjugado, es decir, la introducción de uno o más enlaces degradables en la cadena del polímero o en la fracción de IL-15, puede proporcionar un control adicional sobre las propiedades farmacológicas deseadas finales del conjugado tras la administración. Por ejemplo, un conjugado grande y relativamente inerte (es decir, que tiene una o más cadenas de PEG de alto peso molecular unidas al mismo, por ejemplo, una o más cadenas de PEG que tienen un peso molecular superior a aproximadamente 10.000, en donde el conjugado no posee esencialmente bioactividad) pueden administrarse, que se hidroliza para generar un conjugado bioactivo que posee una parte de la cadena de PEG original. De esta manera, las propiedades del conjugado pueden adaptarse de manera más eficaz para equilibrar la bioactividad del conjugado a lo largo del tiempo.
El polímero hidrosoluble asociado al conjugado también puede ser "liberable". Esto es, el polímero hidrosoluble se libera (ya sea a través de hidrólisis, procesos enzimáticos, procesos catalíticos o de otra manera), dando como resultado la fracción de IL-15 no conjugada. En algunos casos, los polímeros liberables se desprenden de la fracción de IL-15 in vivo sin dejar ningún fragmento del polímero hidrosoluble. En otros casos, los polímeros liberables se desprenden de la fracción de IL-15 in vivo dejando un fragmento relativamente pequeño (por ejemplo, una etiqueta succinato) del polímero hidrosoluble. Un polímero escindible ilustrativo incluye uno que se une a la fracción de IL-15 a través de un enlace carbonato.
Los expertos en la materia reconocerán que el análisis anterior sobre el polímero hidrosoluble y no peptídico no es de ningún modo exhaustiva y es meramente ilustrativa, y que se contemplan todos los materiales poliméricos que tienen las cualidades descritas anteriormente. Como se usa en el presente documento, la expresión "reactivo polimérico" generalmente se refiere a una molécula completa, que puede comprender un segmento de polímero hidrosoluble y un grupo funcional.
Como se ha descrito anteriormente, un conjugado de la invención comprende un polímero hidrosoluble unido covalentemente a una fracción de IL-15. Normalmente, para cualquier conjugado dado, habrá de uno a tres polímeros hidrosolubles unidos covalentemente a uno o más restos que tienen actividad IL-15. En algunos casos, sin embargo, el conjugado puede tener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más polímeros hidrosolubles unidos individualmente a una fracción de IL-15. De acuerdo con la invención, la fracción de IL-15 está unida a través de uno o más de sus grupos amino a un polímero de poli(etilenglicol) ramificado. Para los conjugados también descritos en el presente documento, cualquier polímero hidrosoluble dado puede estar unido covalentemente a un aminoácido de la fracción de IL-15 o, cuando la fracción de IL-15 es (por ejemplo) una glucoproteína, a un carbohidrato de la fracción de IL-15. La unión a un carbohidrato puede llevarse a cabo, por ejemplo, usando funcionalización metabólica empleando química ácido siálicoazida [Luchansky et al. (2004) Biochemistry 43(38): 12358-12366] u otros enfoques adecuados tales como el uso de glicidol para facilitar la introducción de grupos aldehído [Heldt et al. (2007) European Journal of Organic Chemistry 32:5429-5433].
El enlace particular dentro de la fracción que tiene actividad IL-15 y el polímero depende de varios factores. Tales factores incluyen, por ejemplo, la química de enlace particular empleada, la fracción de IL-15 particular, los grupos funcionales disponibles dentro de la fracción de IL-15 (ya sea para la unión a un polímero o conversión a un sitio de unión adecuado), la presencia de grupos funcionales reactivos adicionales dentro de la fracción de IL-15 y similares.
Los conjugados de la invención pueden ser, aunque no necesariamente, profármacos, lo que significa que el enlace entre el polímero y la fracción de IL-15 puede liberarse hidrolíticamente para permitir la liberación del resto de origen. Los enlaces liberables ilustrativos incluyen éster de carboxilato, éster de fosfato, éster de tiol, anhídridos, acetales, cetales, aciloxialquil éter, iminas, ortoésteres, péptidos y oligonucleótidos. Tales enlaces pueden prepararse fácilmente mediante la modificación apropiada de cualquiera de la fracción de IL-15 (por ejemplo, el C terminal grupo carboxilo de la proteína, o un grupo hidroxilo de cadena lateral de un aminoácido como serina o treonina contenida en la proteína, o un funcionalidad similar dentro del carbohidrato) y/o el reactivo polimérico usando métodos de acoplamiento comúnmente empleados en la técnica. Lo más preferido, sin embargo, son enlaces hidrolizables que se forman fácilmente por reacción de un polímero adecuadamente activado con un grupo funcional no modificado contenido dentro de la fracción que tiene actividad IL-15.
Alternativamente, un enlace hidrolíticamente estable, tales como un enlace amida, uretano (también conocido como carbamato), amina, tioéter (también conocido como sulfuro) o urea (también conocido como carbamida) puede emplearse también como enlace para acoplar el resto IL-15. De nuevo, un enlace hidrolíticamente estable preferido es una amida. En un enfoque, puede hacerse reaccionar un polímero hidrosoluble que lleva un éster activado con un grupo amina en el resto IL-15 para dar como resultado un enlace amida.
Los conjugados (en oposición a una fracción de IL-15 no conjugado) descritos en el presente documento pueden poseer o no un grado medible de actividad de IL-15. Es decir, un conjugado polímero-fracción de IL-15 poseerá de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 100 % de la bioactividad de la fracción de IL-15 parental no modificada. En algunos casos, los conjugados polímero-fracción de IL-15 pueden tener una bioactividad superior al 100 % de la fracción de IL-15 parental no modificada. Preferentemente, los conjugados que poseen poca o ninguna actividad de IL-15 contienen un enlace hidrolizable que conecta el polímero a la fracción, de tal manera que independientemente de la falta (o relativamente falta) de actividad en el conjugado, la molécula parental activa (o un derivado de la misma) se libera tras la escisión inducida por agua del enlace hidrolizable. Dicha actividad puede determinarse usando un modelo in vivo o in vitro, dependiendo de la actividad conocida de la fracción particular que tiene actividad IL-15 empleada.
Para conjugados que poseen un enlace hidrolíticamente estable que acopla la fracción que tiene actividad IL-15 al polímero, el conjugado típicamente poseerá un grado medible de bioactividad. Por ejemplo, tales conjugados se caracterizan típicamente por tener una bioactividad que satisface uno o más de los siguientes porcentajes en relación con la fracción de IL-15 no conjugada: al menos aproximadamente el 2 %, al menos aproximadamente el 5 %, al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 15 %, al menos aproximadamente el 25 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 100 % y más del 105 % (cuando se mide en un modelo adecuado, tal como aquellos bien conocidos en la técnica). Preferentemente, los conjugados que tienen un enlace hidrolíticamente estable (por ejemplo, un enlace amida) poseerán al menos algún grado de bioactividad de la fracción parental no modificada que tiene actividad IL-15.
Ahora se describirán conjugados ilustrativos de acuerdo con la invención. Normalmente, se espera que una fracción tal de IL-15 comparta (al menos en parte) una secuencia de aminoácidos similar a la secuencia proporcionada en al menos una de SEQ ID NO: 1 a 3. Por lo tanto, mientras que se hará referencia a ubicaciones o átomos específicos dentro de SEQ ID NO: 1 a 3, dicha referencia es sólo por conveniencia y un experto en la materia podrá determinar fácilmente la ubicación o el átomo correspondiente en otras fracciones que tienen actividad IL-15. En particular, la descripción proporcionada en el presente documento para la IL-15 humana nativa a menudo es aplicable a fragmentos, variantes de deleción, variantes de sustitución o variantes de adición de cualquiera de los anteriores.
Los grupos amino en las fracciones de IL-15 proporcionan un punto de unión entre la fracción de IL-15 y el polímero hidrosoluble. Usando la secuencia de aminoácidos proporcionada en SEQ ID NO: 1 a 3, es evidente que hay varios restos de lisina en cada uno de los cuales tiene un £-aminoácido que puede estar disponible para la conjugación. Además, la amina N-terminal de cualquier proteína también puede servir como punto de unión.
Hay varios ejemplos de reactivos poliméricos adecuados útiles para formar enlaces covalentes con aminas disponibles de una fracción de IL-15. Los ejemplos específicos, junto con el conjugado correspondiente, se proporcionan en la Tabla 1, a continuación. En la tabla, la variable (n) representa el número de unidades monoméricas de repetición y "-NH-(IL-15)" representa el resto de la fracción de IL-15 después de la conjugación con el reactivo polimérico. Mientras que cada porción polimérica [por ejemplo, (OCH2CH2)n o (CH2CH2O)n] presentada en la Tabla 1 termina en un grupo "CH3", otros grupos (tales como H y bencilo) pueden estar sustituidos por los mismos.
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La conjugación de un reactivo polimérico con un grupo amino de una fracción de IL-15 puede lograrse mediante una diversidad de técnicas. En un enfoque, puede conjugarse un resto IL-15 con un reactivo polimérico funcionalizado con un derivado de succinimidilo (u otro grupo éster activado, en el que pueden usarse enfoques similares a los descritos para estos reactivos poliméricos que contienen grupos éster activado alternativos). En este enfoque, el polímero que lleva un derivado de succinimidilo puede unirse a la fracción de IL-15 en un medio acuoso a un pH de 7 a 9,0, aunque el uso de diferentes condiciones de reacción (por ejemplo, un pH más bajo como de 6 a 7, o diferentes temperaturas y/o menos de 15 °C) puede resultar en la unión del polímero a una ubicación diferente en el resto IL-15. Además, puede formarse un enlace amida haciendo reaccionar un polímero no peptídico terminado en amina, hidrosoluble con una fracción de IL-15 que lleva un grupo de ácido carboxílico activador.
Los conjugados ilustrativos están englobados dentro de la siguiente estructura
Figure imgf000023_0001
en donde:
(n) es un número entero que tiene un valor de 2 a 4000;
X es una fracción espaciadora;
R1 es un radical orgánico; e
IL-15 es un resto de una fracción de IL-15.
Los conjugados ilustrativos están englobados por la siguiente estructura:
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en donde (n) es un número entero que tiene un valor de 2 a 4000 e IL-15 es un resto de una fracción de IL-15. Típico de otro enfoque útil para conjugar la fracción de IL-15 con un reactivo polimérico es el uso de aminación reductora para conjugar una amina primaria de una fracción de IL-15 con un reactivo polimérico funcionalizado con una cetona, aldehído o una forma hidratada del mismo (por ejemplo, cetona hidrato, aldehído hidrato). En este enfoque, la amina primaria de la fracción de IL-15 reacciona con el grupo carbonilo del aldehído o cetona (o el correspondiente grupo que contiene hidroxilo de un aldehído o cetona hidrato), formando de esta manera una base de Schiff. La base de Schiff, a su vez, puede convertirse después de forma reductora en un conjugado estable mediante el uso de un agente reductor tal como borohidruro de sodio. Son posibles reacciones selectivas (por ejemplo, en el extremo N), particularmente con un polímero funcionalizado con una cetona o un aldehído ramificado alfa-metilo y/o en condiciones de reacción específicas (por ejemplo, pH reducido).
Como se describe en otras partes en el presente documento, los conjugados de la invención comprenden un polímero de poli(etilenglicol) ramificado. Los conjugados ilustrativos de la invención incluyen aquellos que comprenden un polímero de poli(etilenglicol) ramificado englobado dentro de la siguiente estructura:
Figure imgf000023_0003
en donde cada (n) es independientemente un número entero que tiene un valor de 2 a 4000.
Los conjugados ilustrativos de la invención están englobados dentro de la siguiente estructura:
Figure imgf000024_0001
en donde:
cada (n) es independientemente un número entero que tiene un valor de 2 a 4000;
X es la fracción espadadora;
(b) es un número entero que tiene un valor de 2 a 6;
(c) es un número entero que tiene un valor de 2 a 6;
R2, en cada aparición, es independientemente H o alquilo inferior; e
IL-15 es un resto de una fracción de IL-15.
Los conjugados ilustrativos de la invención están englobados dentro de la siguiente estructura:
Figure imgf000024_0004
en donde:
cada (n) es independientemente un número entero que tiene un valor de 2 a 4000; e
IL-15 es un resto de una fracción de IL-15.
Otros conjugados ilustrativos de la invención están englobados en la siguiente estructura:
Figure imgf000024_0002
en donde:
cada (n) es independientemente un número entero que tiene un valor de 2 a 4000;
(a) es cero o bien uno;
X, cuando está presente, es un resto espaciador comprendido por uno o más átomos;
(b') es cero o un número entero que tiene un valor de uno a diez;
(c) es un número entero que tiene un valor de uno a diez;
R2, en cada aparición, es independientemente H o un radical orgánico;
R3, en cada aparición, es independientemente H o un radical orgánico; e
IL-15 es un resto de una fracción de IL-15.
Aún conjugados adicionales ilustrativos de la invención están englobados dentro de la siguiente estructura:
Figure imgf000024_0003
en donde:
cada (n) es independientemente un número entero que tiene un valor de 2 a 4000; e
IL-15 es un resto de fracción de IL-15.
Los conjugados ilustrativos que incluyen un enlace liberable incluyen aquellos en los cuales una fracción de IL-15 está conjugado con un reactivo polimérico abarcado en la siguiente fórmula:
Figure imgf000025_0001
en donde:
POLI1 es un primer polímero hidrosoluble;
POLI2 es un segundo polímero hidrosoluble;
X1 es una primera fracción espadadora;
X2 es una segunda fracción espaciadora;
Ha es un átomo de hidrógeno ionizable;
R1 es H o un radical orgánico;
R2 es H o un radical orgánico;
(a) es cero o bien uno;
(b) es cero o bien uno;
Re1, cuando está presente, es un primer grupo de alteración de electrones;
Re2, cuando está presente, es un segundo grupo de alteración de electrones; y
(FG) es un grupo funcional capaz de reaccionar con un grupo amino de un principio activo para formar un enlace liberable, tal como un enlace carbamato. Dentro de esta fórmula, se contemplan reactivos poliméricos que tienen la estructura más definida:
Figure imgf000025_0002
en donde cada uno de POLI1, POLI2, X1, X2, R1, R2, Ha y (FG) es como se definió anteriormente y Re1 es un primer grupo de alteración de electrones; y Re2 es un segundo grupo de alteración de electrones.
Reactivos poliméricos ilustrativos aún adicionales caen dentro de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000026_0001
en donde, para cada estructura y en cada caso, (n) es independientemente un número entero de 4 a 1500.
Estos reactivos poliméricos que proporcionan enlaces liberables pueden prepararse de acuerdo con los procedimientos establecidos en la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. N.° 2006/0293499.
Los conjugados ilustrativos formados usando reactivos poliméricos que proporcionan enlaces liberables incluyen los de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000027_0001
en donde:
POLI1 es un primer polímero hidrosoluble;
POLI2 es un segundo polímero hidrosoluble;
X1 es una primera fracción espadadora;
X2 es una segunda fracción espadadora;
Ha es un átomo de hidrógeno ionizable;
R1 es H o un radical orgánico;
R2 es H o un radical orgánico;
(a) es cero o bien uno;
(b) es cero o bien uno;
Re1, cuando está presente, es un primer grupo de alteración de electrones;
Re2, cuando está presente, es un segundo grupo de alteración de electrones;
Y1 es O o S;
Y2 es O o S; e
IL-15 es un resto de una fracción de IL-15.
Los conjugados ilustrativos tienen la siguiente estructura:
Figure imgf000028_0001
en donde, para cada estructura y en cada caso, (n) es independientemente un número entero de 4 a 1500 e IL-15 es un resto de una fracción de IL-15.
Los grupos carboxilo representan otro grupo funcional que puede servir como punto de unión en la fracción de IL-15. Estructuralmente, el conjugado comprenderá lo siguiente:
O
(IL-15)-C-X-POLI
donde IL-15 y el grupo carbonilo adyacente corresponden a la fracción de IL-15 que contiene carboxilo, X es un enlace, preferentemente un heteroátomo seleccionado de O, N(H) y S y POLI es un polímero hidrosoluble tales como PEG, terminando opcionalmente en una fracción de protección terminal.
El enlace C(O)-X resulta de la reacción entre un derivado polimérico que lleva un grupo terminal funcional y una fracción de IL-15 que contiene carboxilo. Como se ha analizado anteriormente, el enlace específico dependerá del tipo de grupo funcional utilizado. Si el polímero está funcionalizado en los extremos o "activado" con un grupo hidroxilo, el enlace resultante será un éster de ácido carboxílico y X será O. Si la cadena principal del polímero está funcionalizada con un grupo tiol, el enlace resultante será un tioéster y X será S. Cuando se emplean determinados polímeros de brazos múltiples, ramificados o bifurcados, la fracción C(O)X y, en particular, la fracción X, pueden ser relativamente más complejas y pueden incluir una estructura de enlace más larga.
Los derivados hidrosolubles que contienen una fracción hidrazida también son útiles para la conjugación en un carbonilo y ácido carboxílico. En la medida en que la fracción de IL-15 no contenga un resto carbonilo o un ácido carboxílico, uno puede añadirse usando técnicas conocidas por un experto en la materia. Por ejemplo, puede introducirse una fracción carbonilo reduciendo un ácido carboxílico (por ejemplo, el ácido carboxílico C-terminal) y/o proporcionando versiones glucosiladas o glicadas (en donde los azúcares añadidos tienen una fracción carbonilo) de la fracción de IL-15. Con respecto a las fracciones de IL-15 que contienen un ácido carboxílico, un reactivo de PEG-hidrazina puede, en presencia de un agente de acoplamiento (por ejemplo, DCC), unirse covalentemente a la fracción de IL-15 [por ejemplo, mPEG-OCH2C(O)NHNH2 + HOC(O)-(IL-15) da como resultado mPEG-OCH2C(O)NHNHC(O)-IL-15]. Algunos ejemplos específicos de derivados hidrosolubles que contienen una fracción hidrazida, junto con los conjugados correspondientes, se proporcionan en la Tabla 2, a continuación. Además, cualquier derivado hidrosoluble que contenga un éster activado (por ejemplo, un grupo succinimidilo) puede convertirse para que contenga un resto hidrazida haciendo reaccionar el derivado polimérico hidrosoluble que contiene el éster activado con hidrazina (NH2-NH2) o ferc-butil carbazato [NH2NHCO2C(CH3)3]. En la tabla, la variable (n) representa el número de unidades monoméricas de repetición y "-C(O)-(IL-15)" representa el resto de la fracción de IL-15 después de la conjugación con el reactivo polimérico. Opcionalmente, el enlace hidrazona puede reducirse usando un agente reductor adecuado. Mientras que cada porción polimérica [por ejemplo, (OCH2CH2)n o (CH2CH2O)n] presentada en la Tabla 2 termina en un grupo "CH3", otros grupos (tales como H y bencilo) pueden estar sustituidos por los mismos.
Tabla 2
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continuación
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Los grupos tiol contenidos en la fracción de IL-15 pueden servir como sitios eficaces de unión para el polímero hidrosoluble. En particular, los restos de cisteína proporcionan grupos tiol cuando la fracción de IL-15 es una proteína. Los grupos tiol en tales restos de cisteína pueden hacerse reaccionar con un PEG activado que es específico para la reacción con grupos tiol, por ejemplo, un polímero de N-maleimidilo u otro derivado como se describe en la Patente de EE.UU. N.° 5.739.208 y en el documento WO 01/62827. Además, puede incorporarse un tiol protegido en una cadena lateral de oligosacárido de una glucoproteína activada, seguido de desprotección con un polímero hidrosoluble reactivo con tiol.
Los ejemplos específicos de reactivos, junto con el conjugado correspondiente, se proporcionan en la Tabla 3, a continuación. En la tabla, la variable (n) representa el número de unidades monoméricas de repetición y "-S-(IL-15)" representa el resto de la fracción de IL-15 después de la conjugación con el polímero hidrosoluble. Mientras que cada porción polimérica [por ejemplo, (OCH2CH2)n o (CH2CH2O)n] presentada en la Tabla 3 termina en un grupo "CH3", otros grupos (tales como H y bencilo) pueden estar sustituidos por los mismos.
Con respecto a SEQ ID NO: 1 y 2 correspondientes a fracciones de IL-15 ilustrativas, puede verse que hay un resto de cisteína en la posición 125. Por lo tanto, un sitio de unión de tiol ilustrativo es la cisteína ubicada en la posición 125. Aunque se prefiere no romper ningún enlace disulfuro, asociado a una fracción de IL-15 dada, puede ser posible unir un polímero dentro de la cadena lateral de uno o más de estos restos de cisteína y retener un grado de actividad. Además, es posible añadir un resto de cisteína a la fracción de IL-15 usando técnicas sintéticas convencionales. Véase, por ejemplo, el procedimiento descrito en el documento WO 90/12874 para añadir restos de cisteína, en donde un procedimiento tal puede adaptarse para una fracción de IL-15. Además, también pueden usarse procesos de ingeniería genética convencionales para introducir un resto cisteína en la fracción de IL-15. En algunas realizaciones, sin embargo, se prefiere no introducir un resto de cisteína y/o un grupo tiol adicionales.
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Con respecto a los conjugados formados a partir de polímeros hidrosolubles que llevan uno o más grupos funcionales maleimida (independientemente de si la maleimida reacciona con una amina o un grupo tiol en la fracción de IL-15), la forma o formas de ácido maleámico correspondientes del polímero hidrosoluble también puede reaccionar con la fracción de IL-15. Bajo ciertas condiciones (por ejemplo, un pH de aproximadamente 7-9 y en presencia de agua), el anillo de maleimida se "abrirá" para formar el correspondiente ácido maleámico. El ácido maleámico, a su vez, puede reaccionar con un grupo amina o tiol de una fracción de IL-15. A continuación se muestran esquemáticamente reacciones ilustrativas basadas en ácido maleámico. POLI representa el polímero hidrosoluble e IL-15 representa la fracción de IL-15.
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Un conjugado representativo descrito en el presente documento puede tener la siguiente estructura:
POLI-Lq,1-C(O)Z-Y-S-S-(IL-15)
en donde POLI es un polímero hidrosoluble, L es un enlazador opcional, Z es un estereoisómero seleccionado del grupo que consiste en O, NH y S, e Y se selecciona del grupo que consiste en alquilo C2-10, alquilo C2-10 sustituido, arilo y arilo sustituido, e IL-15 es una fracción de IL-15. Los reactivos poliméricos que pueden hacerse reaccionar con una fracción de IL-15 y dar como resultado este tipo de conjugado se describen en la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. N.° 2005/0014903.
Como se ha indicado anteriormente, los conjugados de acuerdo con la invención comprenden un polímero soluble en agua que es un polímero de poli(etilenglicol) ramificado. En consecuencia, los conjugados ilustrativos de la invención pueden tener los polímeros de poli(etilenglicol) ramificados que comprenden la siguiente estructura:
Figure imgf000035_0002
en donde cada (n) es independientemente un número entero que tiene un valor de 2 a 4000.
Los conjugados ilustrativos que tienen un polímero hidrosoluble en forma ramificada se preparan usando el siguiente reactivo:
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formando de esta manera un conjugado que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000036_0002
en donde:
(para cada estructura) cada (n) es independientemente un número entero que tiene un valor de 2 a 4000; e
IL-15 es un resto de fracción de IL-15.
Puede formarse un conjugado ilustrativo adicional usando un reactivo:
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formando de esta manera un conjugado que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000036_0004
en donde:
(para cada estructura) (n) es independientemente un número entero que tiene un valor de 2 a 4000; e
IL-15 es un resto de fracción de iL-15.
Los conjugados pueden formarse usando reactivos poliméricos selectivos de tiol de varias formas y la divulgación no está limitada a este respecto. Por ejemplo, la fracción de IL-15, opcionalmente en un tampón adecuado (incluyendo tampones que contienen amina, si se desea), se coloca en un medio acuoso a un pH de aproximadamente 7-8 y el reactivo polimérico selectivo de tiol se añade en un exceso molar. Se deja que la reacción prosiga durante aproximadamente 0,5 a 2 horas, aunque los tiempos de reacción superiores a 2 horas (por ejemplo, 5 horas, 10 horas, 12 horas y 24 horas) pueden ser útiles si se determina que los rendimientos de PEGilación son relativamente bajos. Los ejemplos de reactivos poliméricos que pueden usarse en este enfoque son reactivos poliméricos que llevan un grupo reactivo seleccionado del grupo que consiste en maleimida, sulfona (por ejemplo, vinilsulfona) y tiol (por ejemplo, tioles funcionalizados tales como ortopiridinilo u "OPSS").
Con respecto a los reactivos poliméricos, aquellos descritos aquí y en otros lugares pueden adquirirse de fuentes comerciales o prepararse a partir de materiales de partida disponibles en el mercado. Además, los métodos para preparar los reactivos poliméricos se describen en la bibliografía.
La unión entre la fracción de IL-15 y el polímero hidrosoluble no peptídico puede ser directa, en donde no hay átomos intermedios ubicados entre la fracción IL-15 y el polímero, o indirecta, en donde uno o más átomos están ubicados entre la fracción de IL-15 y el polímero. Con respecto a la unión indirecta, una "fracción espadadora" sirve como un enlazador entre el resto de la fracción de IL-15 y el polímero hidrosoluble. El uno o más átomos que forman la fracción espaciadora pueden incluir uno o más átomos de carbono, átomos de nitrógeno, átomos de azufre, átomos de oxígeno y combinaciones de los mismos. La fracción espaciadora puede comprender un grupo amida, amina secundaria, carbamato, tioéter y/o disulfuro. Los ejemplos no limitantes de fracciones espaciadoras específicos incluyen los seleccionados del grupo que consiste en -O-, -S-, -S-S-, -C(O)-, -C(O)-NH-, -NH-C(O)-NH-, -O-C(O)-NH-, -C(S)-, -CH2-, -CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-, -O-CH2-, -CH2-O-, -O-CH2-CH2-, -CH2-O-CH2-, -CH2-CH2-O-, -O CH2-CH2-CH2-, -CH2-0 -C H2-CH2-, -CH2-CH2-0 -CH2-, -CH2-CH2-CH2-0 -, -0 -CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-0 -CH2-CH2-C H2-, -CH2-CH2-O-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-O-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-O-, -C(O)-NH-CH2-, -C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-C(O)-NH-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-NH-, -C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-, -CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-, -C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-, -C( O)-O-CH2-, -CH2-C(O)-O-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-O-CH2-, -C(O)-O-CH2-CH2-, -NH-C(O)-CH2-, -CH2-NH-C(O)-CH2-, -CH2-CH2-NH-C(O )-CH2-, -NH-C(O)-CH2-CH2-, -CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-, -CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-, -C(O )-NH-CH2-, -C(O)-NH-CH2-CH2-, -O-C(O)-NH-CH2-, -O-C(O)-NH-CH2-CH2-, -NH-CH2-, -NH-CH2-CH2-, -CH2-NH-CH2-, -CH2-CH2-NH-CH2-, -C(O)-CH2-, -C(O)-CH2-CH2-, -CH2-C(O)-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C (O)-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-, -O-C(O)-NH-[CH2]h-(OCH 2CH2V, grupo cicloalquilo bivalente, -O-, -S-, un aminoácido, -N(R6)- y combinaciones de dos o más de cualquiera de los anteriores, en donde de R6 es H o un radical orgánico seleccionado del grupo que consiste en alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido, (h) es de cero a seis y (j) es de cero a 20. Otros restos espaciadores específicos tienen las siguientes estructuras: -C(O)-NH-(CH2)1-6-NH-C(O)-, -NH-C(O)-NH-(CH2)1-6-NH-C(O)- y -O-C(O)-NH-(CH2)1-6-NH-C(O)-, en donde los valores del subíndice que siguen a cada metileno indican el número de metilenos contenidos en la estructura, por ejemplo, (CH2)1-6 significa que la estructura puede contener 1, 2, 3, 4, 5 o 6 metilenos. Adicionalmente, cualquiera de las fracciones espaciadoras anteriores puede incluir además una cadena de oligómero de óxido de etileno que comprende de 1 a 20 unidades de monómero de óxido de etileno [es decir, -(CH2CH2O)1-20]. Esto es, la cadena de oligómero de óxido de etileno puede producirse antes o después de la fracción espaciadora y, opcionalmente, entre dos átomos cualesquiera de un resto espaciador compuesto por dos o más átomos. También, la cadena de oligómero no se consideraría parte de la fracción espaciadora si el oligómero está adyacente a un segmento de polímero y simplemente representa una extensión del segmento de polímero.
Composiciones
Los conjugados son típicamente parte de una composición. Generalmente, la composición comprende una pluralidad de conjugados, preferentemente aunque no necesariamente, cada conjugado está compuesto por la misma fracción de IL-15 (es decir, dentro de toda la composición, sólo se encuentra un tipo de fracción de IL-15). Además, la composición puede comprender una pluralidad de conjugados en donde cualquier conjugado dado está compuesto por una fracción seleccionada del grupo que consta de dos o más fracciones de IL-15 diferentes (es decir, dentro de la composición completa, se encuentran dos o más fracciones de IL-15 diferentes). De manera óptima, sin embargo, sustancialmente todos los conjugados en la composición (por ejemplo, el 85 % o más de la pluralidad de conjugados en la composición) están compuestos cada uno por la misma fracción de IL-15.
La composición puede comprender una única especie conjugada (por ejemplo, un conjugado monoPEGilado en donde el polímero único está unido en el mismo lugar para sustancialmente todos los conjugados en la composición) o una mezcla de especies conjugadas (por ejemplo, una mezcla de conjugados monoPEGilados donde la unión del el polímero se produce en diferentes sitios y/o una mezcla monoPEGilada, conjugados diPEGilados y triPEGilados). Las composiciones también pueden comprender otros conjugados que tienen cuatro, cinco, seis, siete, ocho o más polímeros unidos a cualquier fracción dada que tenga actividad IL-15. Además, la invención incluye casos en donde la composición comprende una pluralidad de conjugados, comprendiendo cada conjugado un polímero hidrosoluble unido covalentemente a una fracción de IL-15, así como composiciones que comprenden dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o más polímeros hidrosolubles unidos covalentemente a una fracción de IL-15.
Con respecto a los conjugados en la composición, la composición satisfará una o más de las siguientes características: al menos aproximadamente el 85 % de los conjugados en la composición tendrá de uno a cuatro polímeros unidos a la fracción de IL-15; al menos aproximadamente el 85 % de los conjugados en la composición tendrá de uno a tres polímeros unidos a la fracción de IL-15; al menos aproximadamente el 85 % de los conjugados en la composición tendrá de uno a dos polímeros unidos a la fracción de IL-15; al menos aproximadamente el 85 % de los conjugados en la composición tendrá un polímero unido a la fracción de IL-15; al menos aproximadamente el 95 % de los conjugados en la composición tendrá de uno a cinco polímeros unidos a la fracción de IL-15; al menos aproximadamente el 95 % de los conjugados en la composición tendrá de uno a cuatro polímeros unidos a la fracción de IL-15; al menos aproximadamente el 95 % de los conjugados en la composición tendrá de uno a tres polímeros unidos a la fracción de IL-15; al menos aproximadamente el 95 % de los conjugados en la composición tendrá de uno a dos polímeros unidos a la fracción de IL-15; al menos aproximadamente el 95 % de los conjugados en la composición tendrá un polímero unido a la fracción de IL-15; al menos aproximadamente el 99 % de los conjugados en la composición tendrá de uno a cinco polímeros unidos a la fracción de IL-15; al menos aproximadamente el 99 % de los conjugados en la composición tendrá de uno a cuatro polímeros unidos a la fracción de IL-15; al menos aproximadamente el 99 % de los conjugados en la composición tendrá de uno a tres polímeros unidos a la fracción de iL-15; al menos aproximadamente el 99 % de los conjugados en la composición tendrá de uno a dos polímeros unidos a la fracción de lL-15; y al menos aproximadamente el 99 % de los conjugados en la composición tendrá un polímero unido a la fracción de IL-15. Se entiende que una referencia a un intervalo de polímeros, por ejemplo, "de x a y polímeros", contempla una serie de polímeros x a y inclusivo (esto es, por ejemplo, "de uno a tres polímeros" contempla un polímero, dos polímeros y tres polímeros, "de uno a dos polímeros" contempla un polímero y dos polímeros, y así sucesivamente). Además, también se contempla que un conjugado dado que tiene dos o más polímeros unidos a la fracción de IL-15 tendrá mezclas de polímeros unidos de forma liberable y estables (en donde al menos el polímero está unido de manera estable al resto de IL-15 y al menos un polímero está unido de manera liberable al resto IL-15).
En una o más realizaciones, se prefiere que la composición que contiene el conjugado esté libre o sustancialmente libre de albúmina. También se prefiere que la composición esté libre o sustancialmente libre de proteínas que no tengan actividad IL-15. Por lo tanto, se prefiere que la composición sea el 85 %, más preferentemente el 95 % y lo más preferentemente el 99 % libre de albúmina. Adicionalmente, se prefiere que la composición sea el 85 %, más preferentemente el 95 % y lo más preferentemente el 99 % libre de cualquier proteína que no tenga actividad IL-15. En la medida en que la albúmina esté presente en la composición, las composiciones ilustrativas de la invención están sustancialmente libres de conjugados que comprenden un polímero de poli(etilenglicol) que une un resto de una fracción de IL-15 a albúmina.
El control del número deseado de polímeros para cualquier resto dado puede lograrse seleccionando el reactivo polimérico adecuado, la proporción de reactivo polimérico a la fracción de IL-15, temperatura, condiciones de pH y otros aspectos de la reacción de conjugación. Además, la reducción o eliminación de los conjugados no deseados (por ejemplo, aquellos conjugados que tienen cuatro o más polímeros unidos) puede lograrse mediante medios de purificación.
Por ejemplo, los conjugados polímero-fracción de IL-15 pueden purificarse para obtener/aislar diferentes especies conjugadas. Específicamente, la mezcla de productos puede purificarse para obtener un promedio de cualquiera de uno, dos, tres, cuatro, cinco o más PEG por fracción de IL-15, normalmente uno, dos o tres PEG por fracción de IL-15. La estrategia para la purificación de la mezcla de reacción conjugada final dependerá de varios factores, incluyendo, por ejemplo, el peso molecular del reactivo polimérico empleado, la fracción de IL-15 particular, el régimen de dosificación deseado y la actividad residual y propiedades in vivo del conjugado o conjugados individuales.
Si se desea, los conjugados que tienen diferentes pesos moleculares pueden aislarse usando cromatografía de filtración en gel y/o cromatografía de intercambio iónico. Es decir, la cromatografía de filtración en gel se usa para fraccionar proporciones de polímero a fracción de IL-15 numeradas de manera diferente (por ejemplo, 1-mero, 2-meros, 3-meros y así sucesivamente, donde "1-mero" indica 1 polímero por fracción de IL-15, "2-mero" indica dos polímeros por fracción de IL-15 y así sucesivamente) sobre la base de sus diferentes pesos moleculares (donde la diferencia corresponde esencialmente al peso molecular promedio de la porción de polímero hidrosoluble). Por ejemplo, en una reacción ilustrativa donde una proteína de 35.000 Dalton se conjuga aleatoriamente con un reactivo polimérico que tiene un peso molecular de aproximadamente 20.000 Dalton, la mezcla de reacción resultante puede contener proteína no modificada (que tiene un peso molecular de aproximadamente 35.000 Dalton), proteína monoPEGilada (que tiene un peso molecular de aproximadamente 55.000 Dalton), proteína diPEGilada (que tiene un peso molecular de aproximadamente 75.000 Dalton), etc.
Aunque este enfoque puede usarse para separar PEG y otros conjugados de polímero-fracción de IL-15 que tienen diferentes pesos moleculares, este enfoque es generalmente ineficaz para separar isoformas posicionales que tienen diferentes sitios de unión de polímero dentro de la fracción de IL-15. Por ejemplo, la cromatografía de filtración en gel puede usarse para separar entre sí mezclas de PEG 1-meros, 2-meros, 3-meros y así sucesivamente, aunque cada una de las composiciones de conjugado recuperadas puede contener PEG unido a diferentes grupos reactivos (por ejemplo, restos de lisina) dentro de la fracción de IL-15.
Las columnas de filtración en gel adecuadas para llevar a cabo este tipo de separación incluyen las columnas Superdex™ y Sephadex™ disponibles en GE Healthcare (Buckinghamshire, RU). La selección de una columna en particular dependerá del intervalo de fraccionamiento deseado. La elución se lleva a cabo generalmente usando un tampón adecuado, tales como fosfato, acetato o similares. Las fracciones recolectadas pueden analizarse mediante diversos métodos diferentes, por ejemplo, (i) absorbancia a 280 nm para el contenido de proteínas, (ii) análisis de proteínas basadas en colorantes usando seroalbúmina bovina (BSA) como un patrón, (iii) prueba de yodo para el contenido de PEG (Sims et al. (1980) Anal. Biochem, 107:60-63), (iv) electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS PAGE), seguido de tinción con yoduro de bario y (v) cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).
La separación de las isoformas posicionales se lleva a cabo mediante cromatografía de fase inversa usando una cromatografía líquida de fase inversa de alta resolución (RP-HPLC) usando una columna adecuada (por ejemplo, una columna C18 o una columna C3, disponibles en el mercado de empresas tales como Amersham Biosciences o Vydac) o mediante cromatografía de intercambio iónico usando una columna de intercambio iónico, por ejemplo, una columna de intercambio iónico Sepharose™ disponible en GE Healthcare. Puede usarse cualquier enfoque para separar isómeros de principio activo de polímero que tienen el mismo peso molecular (es decir, isoformas posicionales).
Las composiciones preferentemente están sustancialmente libres de proteínas que no tienen actividad IL-15. Además, las composiciones preferentemente están sustancialmente libres de todos los demás polímeros hidrosolubles unidos de forma no covalente. En algunas circunstancias, sin embargo, la composición puede contener una mezcla de conjugados polímero-fracción de IL-15 y fracción de IL-15 no conjugada.
Opcionalmente, la composición de la invención comprende además un excipiente farmacéuticamente aceptable. Si se desea, el excipiente farmacéuticamente aceptable puede añadirse a un conjugado para formar una composición. Los excipientes ilustrativos incluyen, sin limitación, aquellos seleccionados del grupo que consiste en carbohidratos, sales inorgánicas, agentes antimicrobianos, antioxidantes, tensioactivos, tampones, ácidos, bases, aminoácidos y combinaciones de los mismos.
Un carbohidrato tales como un azúcar, un azúcar derivatizado tales como un alditol, ácido aldónico, un azúcar esterificado y/o un polímero de azúcar puede estar presente como un excipiente. Los excipientes de carbohidratos específicos incluyen, por ejemplo: monosacáridos, tales como fructosa, maltosa, galactosa, glucosa, D-manosa, sorbosa y similares; disacáridos, tales como lactosa, sacarosa, trehalosa, celobiosa y similares; polisacáridos, tales como rafinosa, melecitosa, maltodextrinas, dextranos, almidones y similares; y alditoles, tales como manitol, xilitol, maltitol, lactitol, xilitol, sorbitol (glucitol), piranosil sorbitol, mioinositol, ciclodextrinas y similares.
El excipiente también puede incluir una sal inorgánica o tampón tales como ácido cítrico, cloruro sódico, cloruro potásico, sulfato sódico, nitrato potásico, fosfato sódico monobásico, fosfato sódico dibásico y combinaciones de los mismos.
La composición también puede incluir un agente antimicrobiano para prevenir o disuadir el crecimiento microbiano. Los ejemplos no limitantes de agentes antimicrobianos adecuados para una o más realizaciones de la presente invención incluyen cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, alcohol bencílico, cloruro de cetilpiridinio, clorobutanol, fenol, alcohol feniletílico, nitrato fenilmercúrico, thimersol y combinaciones de los mismos.
También puede estar igualmente presente un antioxidante en la composición. Los antioxidantes se usan para prevenir la oxidación, evitando de esta manera el deterioro del conjugado u otros componentes de la preparación. Los antioxidantes adecuados para su uso en una o más realizaciones de la presente invención incluyen, por ejemplo, palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, ácido hipofosforoso, monotioglicerol, galato de propilo, bisulfito sódico, formaldehído sulfoxilato sódico, metabisulfito sódico y combinaciones de los mismos.
Puede estar presente un tensioactivo como excipiente. Los tensioactivos ilustrativos incluyen: polisorbatos, tale como "Tween 20" y "Tween 80", y pluronics tales como F68 y F88 (ambos disponibles en BASF, Florham Park, NJ); ésteres de sorbitán; lípidos, tales como fosfolípidos como lecitina y otras fosfatidilcolinas, fosfatidiletanolaminas (aunque preferentemente no en forma liposómica), ácidos grasos y ésteres grasos; esteroides, tales como colesterol; y agentes IL-15antes, tal como EDTA, cinc y otros cationes adecuados.
Pueden estar presentes ácidos o bases como un excipiente en la composición. Los ejemplos no limitantes de ácidos que pueden usarse incluyen aquellos ácidos seleccionados del grupo que consiste en ácido clorhídrico, ácido acético, ácido fosfórico, ácido cítrico, ácido málico, ácido láctico, ácido fórmico, ácido tricloroacético, ácido nítrico, ácido perclórico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido fumárico y combinaciones de los mismos. Los ejemplos de bases adecuadas incluyen, sin limitación, bases seleccionadas del grupo que consiste en hidróxido sódico, acetato sódico, hidróxido de amonio, hidróxido potásico, acetato de amonio, acetato potásico, fosfato sódico, fosfato potásico, citrato sódico, formiato sódico, sulfato sódico, sulfato potásico, fumarato potásico y combinaciones de los mismos.
Pueden estar presentes uno o más aminoácidos como excipiente en las composiciones descritas en el presente documento. Los aminoácidos ilustrativos a este respecto incluyen arginina, lisina y glicina.
La cantidad de conjugado (es decir, el conjugado formado entre el principio activo y el reactivo polimérico) en la composición variará dependiendo de varios factores, pero será óptimamente una dosis terapéuticamente eficaz cuando la composición se almacene en un recipiente de dosis unitaria (por ejemplo, un vial). Además, la preparación farmacéutica puede almacenarse en una jeringa. Puede determinarse experimentalmente una dosis terapéuticamente eficaz mediante la administración repetida de cantidades crecientes del conjugado para determinar qué cantidad produce un punto final clínicamente deseado.
La cantidad de cualquier excipiente individual en la composición variará dependiendo de la actividad del excipiente y las necesidades particulares de la composición. Normalmente, la cantidad óptima de cualquier excipiente individual se determina mediante experimentación de rutina, es decir, preparando composiciones que contienen cantidades variables del excipiente (que van de bajas a altas), examinando la estabilidad y otros parámetros, y luego determinar el intervalo en el que se alcanza el rendimiento óptimo sin efectos adversos significativos.
Generalmente, sin embargo, el excipiente estará presente en la composición en una cantidad de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 99 % en peso, preferentemente de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 98 % en peso, más preferentemente de aproximadamente el 15 a aproximadamente el 95 % en peso del excipiente, siendo las más preferidas las concentraciones inferiores al 30 % en peso.
Estos excipientes farmacéuticos anteriores junto con otros excipientes se describen en "Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19a ed., Williams & Williams, (1995), the "Physician's Desk Reference", 52a ed., Medical Economics, Montvale, NJ (1998) y Kibbe, A.H., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3a Edición, American Pharmaceutical Association, Washington, D.C., 2000.
Las composiciones abarcan todo tipo de formulaciones y en particular aquellas que son adecuadas para inyección, por ejemplo, polvos o liofilizados reconstituibles y líquidos. Los ejemplos de diluyentes adecuados para reconstituir composiciones sólidas antes de la inyección incluyen agua bacteriostática para inyección, dextrosa al 5 % en agua, solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer, solución salina, agua estéril, agua desionizada y combinaciones de las mismas. Con respecto a las composiciones farmacéuticas líquidas, se prevén soluciones y suspensiones.
Las composiciones de una o más realizaciones de la presente invención son típicamente, aunque no necesariamente, capaces de administrarse mediante inyección y, por lo tanto, generalmente son soluciones o suspensiones líquidas inmediatamente antes de la administración. La preparación farmacéutica también puede tomar otras formas tales como jarabes, cremas, ungüentos, comprimidos, polvos y similares. También se incluyen otros modos de administración, tales como pulmonar, rectal, transdérmico, transmucoso, oral, intratecal, intratumoral, peritumoral, intraperitoneal, subcutáneo, intraarterial, etcétera.
La invención también proporciona un conjugado, de la invención, para su uso en un método de tratamiento de un paciente que padece una afección que responde al tratamiento con conjugado. El método comprende administrar a un paciente, generalmente mediante inyección, una cantidad terapéuticamente eficaz del conjugado (preferentemente proporcionada como parte de una composición farmacéutica). Como se ha descrito anteriormente, los conjugados pueden inyectarse (por ejemplo, por vía intramuscular, por vía subcutánea y parenteral). Los tipos de formulación adecuados para la administración parenteral incluyen soluciones listas para inyección, polvos secos para combinar con un disolvente antes de su uso, suspensiones listas para inyección, composiciones secas insolubles para combinar con un vehículo antes de su uso, y emulsiones y concentrados líquidos para diluir antes de la administración, entre otros.
El método de administración del conjugado (preferentemente proporcionado como parte de una composición farmacéutica) puede realizarse opcionalmente para localizar el conjugado en un área específica. Por ejemplo, las formulaciones líquidas, en gel y sólidas que comprenden el conjugado podrían implantarse quirúrgicamente en un área enferma (tales como en un tumor, cerca de un tumor, en un área inflamada y cerca de un área inflamada). Convenientemente, también pueden obtenerse imágenes de órganos y tejidos para garantizar que la ubicación deseada esté mejor expuesta al conjugado.
El conjugado puede usarse en un método de tratamiento de cualquier afección que pueda remediarse o prevenirse mediante la administración del conjugado. Aquellos expertos en la materia apreciarán qué afecciones puede tratar eficazmente un conjugado específico. Por ejemplo, los conjugados pueden usarse solos o en combinación con otra farmacoterapia para tratar a pacientes que padecen una afección. Las condiciones ilustrativas incluyen, sin limitación: melanoma, cáncer renal, cáncer de pulmón de células no microcíticas, cáncer de pulmón de células microcíticas, cáncer de próstata, cáncer de mama, cánceres hematológicos, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de ovario y cáncer de colon. Ventajosamente, el conjugado puede administrarse al paciente antes de, simultáneamente con, o después de la administración de otro principio activo.
La dosis real a administrar variará dependiendo de la edad, peso y estado general del sujeto así como la gravedad de la afección que se está tratando, el juicio del profesional de la salud y el conjugado que se administra. Los expertos en la materia conocen las cantidades terapéuticamente eficaces y/o se describen en los textos de referencia y la bibliografía pertinentes. Generalmente, una cantidad terapéuticamente eficaz variará de aproximadamente 0,001 mg a 100 mg, preferentemente en dosis de 0,01 mg/día a 75 mg/día y más preferentemente en dosis de 0,10 mg/día a 50 mg/día. Una dosis determinada puede administrarse periódicamente hasta que, por ejemplo, el médico determina que se logra un criterio de valoración apropiado (por ejemplo, cura, regresión, regresión parcial, etc.).
La dosificación unitaria de cualquier conjugado dado (nuevamente, preferentemente proporcionado como parte de una preparación farmacéutica) puede administrarse en una diversidad de programas de dosificación dependiendo del criterio del médico, necesidades del paciente, etcétera. El programa de dosificación específico será conocido por los expertos en la materia o puede determinarse experimentalmente usando métodos rutinarios. Los programas de dosificación ilustrativos incluyen, sin limitación, administración una vez al día, tres veces a la semana, dos veces a la semana, una vez a la semana, dos veces al mes, una vez al mes y cualquier combinación de los mismos. Una vez que se ha alcanzado el criterio de valoración clínico, se detiene la dosificación de la composición.
Debe entenderse que aunque la invención se ha descrito junto con las realizaciones específicas preferidas de la misma, que la descripción anterior, así como los ejemplos que siguen, pretenden ilustrar y no limitar el alcance de la invención.
PARTE EXPERIMENTAL
La práctica de la invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de síntesis orgánica, bioquímica, purificación de proteínas y similares, que se encuentran entre las capacidades de la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, J. March, Advanced Organic Chemistry: Reactions Mechanisms and Structure, 4a Ed. (Nueva York: Wiley-Interscience, 1992), citado anteriormente. En los siguientes ejemplos, se han realizado esfuerzos para garantizar la exactitud con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperaturas, etc.) pero deben tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique lo contrario, la temperatura está en grados C y la presión está en o cerca de la presión atmosférica al nivel del mar. Se considera que cada uno de los siguientes ejemplos es instructivo para un experto en la materia para llevar a cabo una o más de las realizaciones descritas en el presente documento.
Una solución acuosa ("solución madre") que comprende IL-15 recombinante ("rhIL-15") correspondiente a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 para su uso en los ejemplos.
Análisis SDS-PAGE Las muestras se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) usando el sistema de electroforesis en gel Invitrogen (XCell SureLock Mini-Cell). Las muestras se mezclaron con tampón de muestra. Después, las muestras preparadas se cargaron en un gel prefabricado NuPAGE Novex y se procesaron durante aproximadamente treinta minutos.
Análisis SEC-HPLC Se contempla que el análisis de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC-HPLC) se usará en relación con la caracterización de la composición del conjugado. Cuando se realiza, el análisis SEC-HPLC puede llevarse a cabo en un sistema de HPLC Agilent 1100 (Agilent). Las muestras pueden analizarse usando una columna de proteína Shodex KW-804 (300 x 8 mm, Phenomenex) y una fase móvil que consiste en fosfato sódico y sulfato sódico, pH 7. El caudal de la columna puede ser de 0,5 ml/min. Los conjugados de proteína y PEG-proteína eluidos pueden detectarse usando UV a 280 nm y 220 nm.
Una técnica de caracterización relacionada, cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa (RP-HPLC), también puede realizarse en un sistema HPLC Agilent 1100 (Agilent). Las muestras pueden analizarse usando una columna Zorbax 300SB-C3 (tamaño de partícula de 3,5 pm, 150 mm x 3,0 mm, Agilent) y fases móviles que consisten en ácido trifluoroacético al 0,1 % en agua (tampón A) y ácido trifluoroacético al 0,1 % en acetonitrilo (tampón B). El caudal de la columna puede ser de 0,3 ml/min. Los conjugados de proteína y PEG-proteína pueden eluirse con un gradiente lineal durante 20 minutos y se detectaron usando UV a 280 nm.
Generalmente, la purificación puede llevarse a cabo en una columna SP-HP usando citrato sódico 10 mM (pH 2,7). El pH se reduce para optimizar la unión de los conjugados a la columna. Los conjugados se unen en este tampón y se eluyen usando un gradiente de NaCl 0=500 mM.
Ejemplo 1
Medición de la actividad de IL-15 de rIL-15 basada en la fosforilación de STATS en células CTLL-2
Un día antes del ensayo, las células CTLL-2 se dividieron en medio de crecimiento reciente (RPMI 1640 FBS al 10 % T-STIM al 10 % L-glut 2 mM piruvato sódico 1 mM). En el día del ensayo, las células se preincubaron en medio de ensayo (RPMI 1640 FBS al 1 % L-glut 2 mM Na-piruvato 1 mM) durante al menos 4 horas y luego se colocaron en una placa de 96 pocillos a 50.000 células/pocillo en el medio de ensayo.
Se prepararon diluciones del artículo de prueba en un tampón apropiado inmediatamente antes del ensayo y cada dilución del artículo de prueba se incubó en un pocillo separado de las células CTLL-2. A continuación, se determinó la fosforilación de STAT5 usando el kit MSD Phospho (Tyr694)/Total STATa, b Whole Cell Lysate (n.° de catálogo K15163D, Meso Scal Diagnostics, LLC, Gaithersburg, MD).
rIL-15 obtenido de PeproTech (catálogo n.° 200-15) demostró actividad de IL-15 al exhibir una CE50 pSTAT5 promedio a 0,20705 ng/ml a los 5 minutos (un promedio de dos ciclos) y 0,08187 ng/ml a los 10 minutos.
Ejemplo 2
PEGilación de rIL-15 con derivado de mPEG-N-hidroxisuccinimidilo ramificado, 20k Da
Figure imgf000041_0001
El derivado de mPEG2-ru-20K-N-hidroxilsuccinimidilo, 20 kDa, ("mPEG2-ru-20K-NHS")
mPEG2-ru-20K-NHS, almacenado a -80 °C en argón, se calentó a temperatura ambiente con purga de nitrógeno. Se preparó una solución madre (200 mg/ml) de mPEG2-ru-20K-NHS en HCl 2 mM, y se añadió mPEG2-ru-20K-NHS al rIL-15 con relaciones molares de mPEG2-ru-20K-NHS a rIL-15 que van desde aproximadamente 5:1 a 100:1. La concentración final de rIL-15 en la mezcla fue de 0,5 mg/ml (0,031 mM). Se añadió tampón bicarbonato sódico (1 M, pH 8,0) a la mezcla para alcanzar una concentración final de 100 mM y se dejó que prosiguiera la conjugación durante treinta minutos para proporcionar conjugados [mPEG2-ru-20K]-[rIL-15]. Después de treinta minutos, la inactivación se consiguió añadiendo glicina 1 M (pH 6,0) a la mezcla de reacción para conseguir una concentración final de 100 mM. En la Figura 1 se proporciona un perfil de producto de conjugación típico de [mPEG2-ru-20K]-[rIL-15]. Como se muestra en la FIGURA 1, relaciones molares crecientes de mPEG2-ru-20K-NHS a rIL-15 de aproximadamente 5:1 (carril 3), aproximadamente 10:1 (carril 4), aproximadamente 25:1 (carril 5), aproximadamente 50:1 (carril 6) y aproximadamente 100:1 (carril 7) dan como resultado un cambio de mono-PEG-IL-15 como producto principal (carril 3) a di-, tri-PEG-IL-15 y especies superiores. Los distintos mono-, di-, tri- y PEG-IL-15 superiores deben purificarse y caracterizarse.
Generalmente, la purificación puede llevarse a cabo en una columna SP-HP usando citrato sódico 10 mM (pH 2,7). El pH se reduce para optimizar la unión de los conjugados a la columna. Los conjugados se unen en este tampón y se eluyen usando un gradiente de NaCl 0=500 mM.
Ejemplo 3
PEGilación de rIL-15 con mPEG2-C2-fmoc-20K-NHS
Figure imgf000042_0001
El derivado de mPEG2-C2-fmoc-20K-N-Hidroxisuccinimida, 20 kDa, ("mPEG2-C2-fmoc-20K-NHS")
mPEG2-C2-fmoc-20K-NHS, almacenado a -80 °C en argón, se calentó a temperatura ambiente con purga de nitrógeno. Se preparó una solución madre (200 mg/ml) de mPEG2-C2-fmoc-20K-NHS en HCl 2 mM, y se añadió mPEG2-C2-fmoc-20K-NHS al rIL-15 con relaciones molares de mPEG2-C2-fmoc-20K-NHS a rIL-15 que van desde aproximadamente 5:1 a 100:1. La concentración final de rIL-15 en la mezcla fue de 0,5 mg/ml (0,031 mM). Se añadió tampón bicarbonato sódico (1 M, pH 8,0) a la mezcla para alcanzar una concentración final de 100 mM y se dejó que prosiguiera la conjugación durante treinta minutos para proporcionar conjugados [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-15]. Después de treinta minutos, la inactivación se consiguió añadiendo glicina 1 M (pH 6,0) a la mezcla de reacción para conseguir una concentración final de 100 mM. El pH de la mezcla de reacción inactivada se ajustó después a 4,0 usando ácido acético glacial antes de la purificación y caracterización por cromatografía en columna.
Ejemplo 4
PEGilación de rIL-15 con mPEG2-CAC-fmoc-20K-NHS
Figure imgf000042_0002
El derivado de mPEG2-CAC-fmoc-20K-N-Hidroxisuccinimida, 20 kDa, ("mPEG2-CAC-fmoc-20K-NHS") mPEG2-CAC-fmoc-20K-NHS, almacenado a -80 °C en argón, se calentó a temperatura ambiente con purga de nitrógeno. Se preparó una solución madre (200 mg/ml) de mPEG2-CAC-fmoc-20K-NHS en HCl 2 mM, y se añadió mPEG2-CAC-fmoc-20K-NHS al rIL-15 con relaciones molares de mPEG2-CAC-fmoc-20K-NHS a rIL-15 que variaron desde aproximadamente 5:1 a 100:1. La concentración final de rIL-15 en la mezcla fue de 0,5 mg/ml (0,031 mM). Se añadió tampón bicarbonato sódico (1 M, pH 8,0) a la mezcla para alcanzar una concentración final de 100 mM y se dejó que prosiguiera la conjugación durante treinta minutos para proporcionar conjugados [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-15]. Después de treinta minutos, la inactivación se consiguió añadiendo glicina 1 M (pH 6,0) a la mezcla de reacción para conseguir una concentración final de 100 mM. El pH de la mezcla de reacción inactivada se ajustó después a 4,0 usando ácido acético glacial antes de la purificación y caracterización por cromatografía en columna. Ejemplo 5
PEGilación de rIL-15 con derivado de mPEG-N-hidroxisuccinimidilo ramificado, 40 kDa
Figure imgf000043_0001
El derivado de mPEG2-ru-40K-N-hidroxilsuccinimidilo, 40 kDa, ("mPEG2-ru-40K-NHS")
mPEG2-ru-40K-NHS, almacenado a -80 °C en argón, se calentó a temperatura ambiente con purga de nitrógeno. Se preparó una solución madre (200 mg/ml) de mPEG2-ru-40K-NHS en HCl 2 mM y se añadió mPEG2-ru-40K-NHS a rIL-15 con relaciones molares que varían de 5:1 a 100:1. La concentración final de rIL-15 en la mezcla fue de 0,5 mg/ml (0,031 mM). Se añadió tampón bicarbonato sódico (1 M, pH 8,0) a la mezcla para alcanzar una concentración final de 100 mM y se dejó que prosiguiera la conjugación durante treinta minutos para proporcionar conjugados [mPEG2-ru-40K-]-[rIL-15]. Después de treinta minutos, la inactivación se consiguió añadiendo glicina 1 M (pH 6,0) a la mezcla de reacción para conseguir una concentración final de 100 mM. El pH de la mezcla de reacción inactivada se ajustó después a 4,0 usando ácido acético glacial antes de la purificación y caracterización por cromatografía en columna. En la Figura 2 se proporciona un perfil de producto de conjugación de [mPEG2-ru-40K]-[rIL-15]. Como se muestra en la Figura 2, relaciones molares crecientes de mPEG2-ru-40K-NHS a rIL-15 de aproximadamente 5:1 (carril 2), aproximadamente 10:1 (carril 3), aproximadamente 25:1 (carril 4), aproximadamente 50:1 (carril 5) y aproximadamente 100:1 (carril 6) dan como resultado un desplazamiento de productos PEGilados a productos PEGilados superiores. Los distintos conjugados pueden purificarse y caracterizarse.
Ejemplo 6
PEGilación de rIL-15 con mPEG2-C2-fmoc-40K-NHS
Figure imgf000043_0002
El derivado de mPEG2-C2-fmoc-40K-N-Hidroxisuccinimida, 40 kDa, ("mPEG2-C2-fmoc-40K-NHS")
mPEG2-C2-fmoc-40K-NHS, almacenado a -80 °C en argón, se calentó a temperatura ambiente con purga de nitrógeno. Se preparó una solución madre (200 mg/ml) de mPEG2-C2-fmoc-40K-NHS en HCl 2 mM, y se añadió mPEG2-C2-fmoc-40K-NHS al rIL-15 con relaciones molares de mPEG2-C2-fmoc-40K-NHS a rIL-15 que van desde aproximadamente 5:1 a 100:1. La concentración final de rIL-15 en la mezcla fue de 0,5 mg/ml (0,031 mM). Se añadió tampón bicarbonato sódico (1 M, pH 8,0) a la mezcla para alcanzar una concentración final de 100 mM y se dejó que prosiguiera la conjugación durante treinta minutos para proporcionar conjugados [mPEG2-C2-fmoc-40K]-[rIL-15]. Después de treinta minutos, la inactivación se consiguió añadiendo glicina 1 M (pH 6,0) a la mezcla de reacción para conseguir una concentración final de 100 mM. El pH de la mezcla de reacción inactivada se ajustó después a 4,0 usando ácido acético glacial antes de la purificación y caracterización por cromatografía en columna.
Siguiendo este mismo enfoque general, se prepararon conjugados usando versiones de 10 kDa y 20 kDa del derivado de mPEG2-C2-fmoc-40K-N-hidroxisuccinimida.
Ejemplo 7
PEGilación de rIL-15 con mPEG2-CAC-fmoc-40K-NHS
Figure imgf000044_0001
El derivado de mPEG2-CAC-fmoc-40K-N-Hidroxisuccinimida, 40 kDa, ("mPEG2-CAC-fmoc-40K-NHS") mPEG2-CAC-fmoc-40K-NHS, almacenado a -80 °C en argón, se calentó a temperatura ambiente con purga de nitrógeno. Se preparó una solución madre (200 mg/ml) de mPEG2-CAC-fmoc-40K-NHS en HCl 2 mM, y se añadió mPEG2-CAC-fmoc-40K-NHS al rIL-15 con relaciones molares de mPEG2-CAC-fmoc-40K-NHS a rIL-15 que variaron desde aproximadamente 5:1 a 100:1. La concentración final de rIL-15 en la mezcla fue de 0,5 mg/ml (0,031 mM). Se añadió tampón bicarbonato sódico (1 M, pH 8,0) a la mezcla para alcanzar una concentración final de 100 mM y se dejó que prosiguiera la conjugación durante treinta minutos para proporcionar conjugados [mPEG2-CAC-fmoc-40K]-[rIL-15]. Después de treinta minutos, la inactivación se consiguió añadiendo glicina 1 M (pH 6,0) a la mezcla de reacción para conseguir una concentración final de 100 mM. El pH de la mezcla de reacción inactivada se ajustó después a 4,0 usando ácido acético glacial antes de la purificación y caracterización por cromatografía en columna. Siguiendo este mismo enfoque general, se prepararon conjugados usando versiones de 10 kDa y 20 kDa del derivado de mPEG2-CAC-fmoc-40K-N-hidroxisuccinimida. En estas preparaciones adicionales, se usó una relación molar reactivo:rIL-15 de 100:1 y se llevó a cabo un ajuste de pH a 2,7 con ácido clorhídrico antes de la purificación y caracterización (en lugar del ajuste a pH 4,0 usando ácido acético glacial).
Ejemplo 8
Medición de la actividad de IL-15 de conjugados de rIL-15 basada en la fosforilación de STATS en células CTLL-2 Un día antes del ensayo, las células CTLL-2 se dividieron en medio de crecimiento fresco [RPMI 1640 suplementado con FBS al 10 %, suplemento de cultivo de células T al 10 % (catálogo n.° 354115, Corning, Inc., Tewksbury, MA), L-glutamato 2 mM y piruvato sódico 1 mM]. En el día del ensayo, las células se preincubaron en medio de ensayo (RPMI 1640 suplementado con FBS al 1 %, L-glutamato 2 mM y piruvato sódico 1 mM) durante al menos cuatro horas y después se sembraron en medio de ensayo en una placa de 96 pocillos a 50.000 células/pocillo. Las diluciones del artículo de prueba se prepararon en un tampón apropiado inmediatamente antes del ensayo. La estimulación de las células CTLL-2 se inició mediante la transferencia de soluciones de artículos de prueba 25x a pocillos por triplicado que contenían células CTLL-2. Las placas se incubaron a 37 °C, CO2 al 5 % durante 10 minutos y la reacción se detuvo mediante lisis celular. La detección de los niveles de proteína fosfo-STAT5 y STAT5 total en los lisados celulares se realizó usando el kit MSD Phospho (Tyr694)/Total STATa, b Whole Cell Lysate (n.° de catálogo K15163D, Meso Scale Diagnostics, LLC, Gaithersburg, m D). Después de un tratamiento de 10 minutos, la IL-15 humana recombinante obtenida de PeproTech (catálogo n.° 200-15) demostró actividad de IL-15 al inducir la fosforilación de STAT5 en células CTLL-2 con una CE50 promedio de 0,063 /- 0,028 ng/ml, que sirvió como el control. Se probaron los conjugados preparados de acuerdo con los Ejemplos 2, 3 y 5, con los resultados después de un tratamiento de 10 minutos proporcionados en la Tabla 4.
Tabla 4
Figure imgf000044_0002
continuación
Figure imgf000045_0001
Ejemplo 9
Evaluación de la actividad antitumoral de los conjugados de rIL-15 en el tumor de melanoma B16F10
Para probar y comparar la efectividad de los conjugados de rIL-15 en un modelo in vivo, se indujeron tumores singénicos en ratones hembra C57BL/6 de 6-8 semanas de edad mediante inyección subcutánea, en la región abdominal post ventral, células de melanoma B16F10 metastásico de ratón a una densidad de 1x106 células ml-1 en un volumen de 100 pl de medio de cultivo celular que no contiene suero. Los ratones desarrollaron tumores de aproximadamente 100 mm3 al final de 6-8 días. Los ratones se dividieron en seis grupos, consistiendo cada grupo en 10 animales. A cada grupo se le asignó un artículo de prueba diferente como se muestra en la Tabla 5.
Tabla 5
Figure imgf000045_0002
Los grupos A a D corresponden a conjugados de rIL-15 que se administraron a 0,6 mg/kg de peso corporal mediante inyección intravenosa a los ratones solo una vez, mientras que el grupo E representa IL-15 no conjugada administrada cada dos días mediante inyección intraperitoneal. El grupo F representa un control de vehículo, en donde se administró solución salina tamponada con fosfato mediante inyección intravenosa.
Después de la administración de la dosis, se midieron los cambios en el peso corporal de los ratones y el crecimiento de tumores de melanoma metastásico subcutáneo mediante calibradores digitales tres veces por semana. También se controlaron los signos clínicos diarios. El punto final del estudio se alcanzó cuando el volumen medio de los tumores alcanza los 1500 mm3 (es decir, un volumen tumoral medio de 1500 mm3).
El primer grupo en alcanzar un volumen tumoral medio de 1500 mm3 era el Grupo F (el grupo control de vehículo), que se produjo el día 13 del estudio. Todos los demás grupos (es decir, los grupos A a E) alcanzaron el punto final del estudio alrededor del día 24, lo que indica la efectividad de los conjugados de IL-15 y rIL-15 en la inhibición del crecimiento tumoral.
Adicionalmente, aunque, el retraso del crecimiento del tumor observado para alcanzar 1000 mm3 para los conjugados de IL-15 y rIL-15 no conjugados varió de 1,5 a 4,5 días, se demostró que los conjugados de rIL-15 son aproximadamente tres veces más potentes que la IL-15 no conjugada al menos porque la dosis total de IL-15 no conjugada (administración de 0,3 mg/kg todos los días durante seis dosis) fue tres veces la dosis única de un rI L-15 conjugado (administración de una dosis única de 0,6 mg/kg). Véase la Tabla 6.
Tabla 6
Figure imgf000046_0001
Además de la potencia aumentada de los conjugados de rIL-15, no hubo signos clínicos significativos, tales como una disminución en el porcentaje de peso corporal. En el gráfico proporcionado como FIGURA 3, se muestra el porcentaje de cambio de peso corporal después de la administración de cada uno de los Grupos A a F.
Ejemplo 10
Afinidades del receptor de conjugados de rIL-15 para IL-15Ra
Las afinidades de los conjugados IL-15 y rIL-15 se midieron usando Resonancia de plasmón superficial ("SPR"). Brevemente, la superficie de un chip sensor Biacore CM5 se activó usando una mezcla 1:1 de NHS: EDC para generar ésteres activos de NHS. Se unió covalentemente anticuerpo de cabra anti-Fc humano a la superficie inyectándolo durante cinco minutos en acetato sódico 10 mM (pH 4). Había aproximadamente 8000 RU de anticuerpos unidos a la superficie. A continuación, se inactivó cualquier éster de NHS restante con etanolamina.
Al inicio de cada ciclo de inyección, se capturó IL-15-Ra-Fc en un canal de chip sensor mediante una etapa de inyección de cinco minutos en PBSP. Normalmente, Se unieron 150-200 RU de receptores en la superficie.
Los conjugados de rIL-15 se diluyeron a 10 pM en PBS (que contenía Tween 20 al 0,05 % y BSA 0,1 mg/ml). Se realizó una serie de diluciones triples y se inyectó en un chip sensor que se revistió con IL-15Ra. Las afinidades se midieron determinando las tasas ka y ko por separado y la relación entre ko y ka se utilizó para calcular los valores de Kd.
Como se muestra en la Tabla 7, IL-15 tiene una afinidad por IL-Ra de 3,8 pM. Esta afinidad disminuye a 43 pM con una especie monoPEG y a 183 pM con las especies di y tri-PEG (todas las especies preparadas de acuerdo con el Ejemplo 2). El efecto es mayor con un PEG de 40 kDa; la afinidad disminuye a 2-4 nM con mono- y di- y tri- especies y a 9,4 nM con las especies de tri-PEG (todas las especies preparadas de acuerdo con el Ejemplo 5).

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un conjugado que comprende una fracción de interleucina-15 (IL-15) que está unida covalentemente, a través de uno o más de sus grupos amino, a un polímero de poli(etilenglicol) ramificado.
2. El conjugado de la reivindicación 1, en donde el polímero de poli(etilenglicol) ramificado está unido covalentemente a uno o más grupos amino de la fracción de IL-15 a través de un enlace liberable.
3. El conjugado de la reivindicación 1, en donde el polímero de poli(etilenglicol) ramificado está unido covalentemente a uno o más grupos amino de la fracción de IL-15 a través de un enlace estable.
4. El conjugado de la reivindicación 1, 2 o 3, en donde el poli(etilenglicol) ramificado está protegido terminalmente con una fracción de protección terminal seleccionada del grupo que consiste en hidroxi, alcoxi, alcoxi sustituido, alquenoxi, alquenoxi sustituido, alquinoxi, alquinoxi sustituido, ariloxi y ariloxi sustituido.
5. El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde se unen uno, dos, tres o cuatro polímeros de poli(etilenglicol) ramificados a la fracción de IL-15.
6. El conjugado de la reivindicación 2, en donde el polímero de poli(etilenglicol) ramificado se libera de la fracción de IL-15 in vivo sin dejar un fragmento del polímero.
7. Un conjugado de la reivindicación 1, que comprende una estructura:
Figure imgf000051_0001
en donde:
POLI1 es un primer polímero de poli(etilenglicol);
POLI2 es un segundo polímero de poli(etilenglicol);
X1 es una primera fracción espaciadora;
X2 es una segunda fracción espaciadora;
Ha es un átomo de hidrógeno ionizable;
R1 es H o un radical orgánico;
R2 es H o un radical orgánico;
(a) es cero o bien uno;
(b) es cero o bien uno;
Re1, cuando está presente, es un primer grupo de alteración de electrones;
Re2, cuando está presente, es un segundo grupo de alteración de electrones;
Y1 es O o S;
Y2 es O o S; e
IL-15 es una fracción de IL-15.
8. El conjugado de la reivindicación 7, que tiene una estructura seleccionada de:
Figure imgf000051_0002
Figure imgf000052_0001
en donde, para cada estructura y en cada caso, (n) es independientemente un número entero de 4 a 1500 e IL-15 es una fracción de IL-15.
9. El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde la fracción de IL-15 es una fracción de IL-15 recombinante.
10. El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde la fracción de IL-15 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 1 a 3 o comprende una secuencia de aminoácidos sustancialmente homóloga a las mismas.
11. El conjugado de la reivindicación 10, en donde el resto de IL-15 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1.
12. El conjugado de la reivindicación 3, que tiene un grado medible de actividad IL-15 de la fracción de IL-15 sin modificar.
13. Una composición farmacéutica que comprende un conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
14. La composición farmacéutica de la reivindicación 13 para su uso en terapia.
15. La composición farmacéutica de la reivindicación 13, para su uso en el tratamiento de una afección seleccionada de melanoma, cáncer renal, cáncer de pulmón de células no microcíticas, cáncer de pulmón de células microcíticas, cáncer de próstata, cáncer de mama, cánceres hematológicos, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de ovario y cáncer de colon.
16. El conjugado de la reivindicación 1, en donde el polímero de poli(etilenglicol) ramificado tiene un peso molecular promedio ponderado de aproximadamente 20.000 Dalton o aproximadamente 40.000 Dalton.
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