JP6726680B2 - 多段チャネル乳化のための装置及び方法 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照

本出願は、２０１５年３月１６日出願の米国仮特許出願第６２／１３３，６２１号、及び２０１５年１２月１８日出願の米国仮特許出願第６２／２６９，２８９号に対する優先権を主張するものであり、各仮特許出願の内容は参照により本出願に援用される。

本発明の実施形態は、液滴を形成するための方法及びデバイスに関する。

以下の説明及び実施例は、本節内に含まれることによって従来技術であると認められるものではない。

区画化（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｚａｔｉｏｎ）は、分子診断及び生命科学調査の分野においてますます一般的となっている技法である。用途としては、デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、２段ＰＣＲマルチプレキシング（遺伝子型判定を含む）、単一細胞分析、標的配列決定、マルチプレックスイムノアッセイ、超高感度イムノアッセイ、及び配列決定のためのライブラリ調製が挙げられる。個々の用途はそれぞれ、区画の数、各区画の単分散性及び各区画の容積に関して異なる要求を有する。

区画化反応のための１つのアプローチは、液滴を用いることによるものであり、上記液滴は、第２の流体によって、又は第２の流体及び１つ若しくは複数の表面によって、完全に取り囲まれた、第１の流体の隔離された体積である。分子診断及び生命科学調査の分野では、これは典型的には２つの不混和性液体である。液滴生成のための技法としては、並行流（ｃｏ‐ｆｌｏｗ）、流れ集束（ｆｌｏｗ ｆｏｃｕｓｉｎｇ）及びＴ字ジャンクション（Ｔ‐ｊｕｎｃｔｉｏｎ）が挙げられる。並行流液滴生成は、例えば非特許文献１に記載されているように、並行流設計のオリフィスから内側の流れを取り出すことによって、液滴を形成する。Ｓｔｏｎｅ及びＷｅｉｔｚ（非特許文献２）は、修正された並行流技法を用いた二重エマルジョンを実証している。流れ集束は、チャネル内に幾何学的に閉じ込められた並行流設計を用いて、液滴を生成する（例えば非特許文献３参照）。Ｔ字ジャンクション液滴生成法及びその修正例（例えばＹ字ジャンクション、十字ジャンクション、ψ字ジャンクション）は一般に、連続しかつ分散された相の流れを交差させることを伴う（例えば非特許文献４、５参照）。更に特許文献１（参照により本出願に援用される）は、単一のマイクロチャネルのアスペクト比の急激な変化を用いて、閉じ込められた並行流のストリームを急速に不安定化する、単段乳化技法を記載している。

上述の液滴生成技法は全て、連続しかつ分散された相の流れを必要とする。対照的にＳｕｇｉｕｒａらは、液滴形成が主に界面張力によって実現される技法を記載している（非特許文献５）。この技法を用いると、液滴は、流体チャネルからの排出後に突出部分から落下することによって生成される。更に最近では、Ｄａｎｇｌａらもまた、傾斜した天井を用いて不混和性液体間の界面曲率を変調することによって、「閉じ込めの勾配（ｇｒａｄｉｅｎｔ ｏｆ ｃｏｎｆｉｎｅｍｅｎｔ）」と呼ばれる、連続的に増加するギャップ高さを生成することにより、液滴を生成するための技法を記載している（特許文献２（参照により本出願に援用される）；非特許文献７）。この閉じ込めの勾配は、非特許文献６（上記参照）に記載された別個のステップを用いて達成される界面の曲率の変調と類似性を有する。

米国特許第７９４３６７１号 米国公開特許第２０１３／００７８１６４号

Ｄａｖｉｄ Ｗｅｉｔｚ （"Ｍｏｎｏｄｉｓｐｅｒｓｅ ｅｍｕｌｓｉｏｎ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｖｉａ ｄｒｏｐ ｂｒｅａｋ ｏｆｆ ｉｎ ａ ｃｏｆｌｏｗｉｎｇ ｓｔｒｅａｍ，" Ｌａｎｇｍｕｉｒ， ２０００） Ｓｔｏｎｅ ａｎｄ Ｗｅｉｔｚ （"Ｍｏｎｏｄｉｓｐｅｒｓｅ ｄｏｕｂｌｅ ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｍｉｃｒｏｃａｐｉｌｌａｒｙ ｄｅｖｉｃｅ，" Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２００５） Ｓｔｏｎｅ， "Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ "ｆｌｏｗ ｆｏｃｕｓｉｎｇ" ｉｎ ｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌｓ，" ＡＰＬ， ２００３） Ｑｕａｋｅ， "Ｄｙｎａｍｉｃ ｐａｔｔｅｒｎ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｖｅｓｉｃｌｅ‐ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｄｅｖｉｃｅ"， ＰＲＬ， ２００１ Ｗｅｉｔｚ， Ｄ． Ａ．， Ｓｔｏｎｅ， Ｈ．， "Ｇｅｏｍｅｔｒｉｃａｌｌｙ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｒｅａｋｕｐ ｏｆ ｄｒｏｐｓ ｉｎ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｄｅｖｉｃｅｓ，" ＰＲＬ， ２００４ Ｓｕｇｉｕｒａ， Ｓ．， Ｎａｋａｊｉｍａ， Ｍ． "Ｉｎｔｅｒｆａｃｉａｌ ｔｅｎｓｉｏｎ ｄｒｉｖｅｎ ｍｏｎｏｄｉｓｐｅｒｓｅｄ ｄｒｏｐｌｅｔ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ ｃｈａｎｎｅｌ ａｒｒａｙ，" Ｌａｎｇｍｕｉｒ， １７：５５６２‐５５６６ （２００１） Ｄａｎｇｌａ ｅｔ ａｌ．， "Ｄｒｏｐｌｅｔ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ ｄｒｉｖｅｎ ｂｙ ｇｒａｄｉｅｎｔｓ ｏｆ ｃｏｎｆｉｎｅｍｅｎｔ，" ＰＮＡＳ， １０（３）：８５３‐８５８ （２０１３）

本開示の例示的実施形態は、多段マイクロチャネル乳化デバイスを含む、液滴を形成するためのシステム及び方法に関する。

一実施形態は、流入口部分を有するチャネル；上記流入口部分と流体連通する第１段；上記第１段と流体連通する第２段；及び上記第２段と流体連通する第３段を備える、乳化デバイスを提供する。いくつかの実施形態では、上記乳化デバイスは：複数の流入口部分；単一の連続した第１段、又はそれぞれが上記複数の流入口部分のうちの１つの流入口部分と流体連通する複数の第１段；単一の連続した第２段、又はそれぞれが上記単一の連続した第１段若しくは上記複数の第１段のうちの１つの第１段と流体連通する複数の第２段；及び単一の連続した第３段、又はそれぞれが上記単一の第２段若しくは上記複数の第２段のうちの１つの第２段と流体連通する複数の第３段を備える。

上記流入口部分を有する上記チャネルは、チャネル高さＣＨ及び幅ＣＷを有する。特定の実施形態では、ＣＷはＣＨより大きいが、他の実施形態ではＣＨがＣＷより大きい。特定の実施形態では、比ＣＷ／ＣＨは、０．１〜１０．０、０．２〜８．０、０．５〜５．０、１．０〜４．０、２．０〜４．０又は２．５〜３．５である。特定の実施形態では、比ＣＷ／ＣＨは約３．０である。

具体的な実施形態は、上記流入口部分と流体連通する第１段を含み、ここで上記第１段は、踏み板（ｔｒｅａｄ）長さＴ１及び段高さＳＨ１を有する。特定の実施形態では、ＳＨ１はＣＨより蹴上げ（ｒｉｓｅｒ）高さＲ１だけ大きく、Ｒ１はゼロより大きい。具体的な実施形態では、比ＳＨ１／ＣＨは１．０超かつ１０．０未満、又はより詳細には１．０超かつ５．０未満、又はより詳細には１．０超かつ４．０未満、又はより詳細には１．０超かつ２．０未満である。特定の実施形態では、比ＳＨ１／ＣＨはおよそ１．５である。具体的な実施形態は、上記第１段と流体連通する第２段を含み、ここで上記第２段は、踏み板長さＴ２及び段高さＳＨ２を有する。特定の実施形態では、ＳＨ２はＳＨ１より蹴上げ高さＲ２だけ大きく、Ｒ２はゼロより大きい。特定の実施形態では、比ＳＨ２／ＣＨは１．０超かつ１０．０未満、又はより詳細には１．０超かつ５．０未満、又はより詳細には１．０超かつ３．０未満である。特定の実施形態では、比ＳＨ２／ＣＨはおよそ２．０である。特定の実施形態は、上記第２段と流体連通する第３段を含み、ここで上記第３段は、ＳＨ２より蹴上げ高さＲ３だけ大きい段高さＳＨ３を有し、Ｒ３はゼロより大きい。特定の実施形態では、比ＳＨ３／ＣＨは１．０超かつ１５．０未満、又はより詳細には１．０超かつ１０．０未満、又はより詳細には５．０超かつ１０．０未満である。特定の実施形態では、比ＳＨ３／ＣＨはおよそ７．５である。

特定の実施形態では、Ｒ１は、０．１ミクロン超かつ１０００ミクロン未満、１．０ミクロン超かつ１００ミクロン未満、５．０ミクロン超かつ１００ミクロン未満、５．０ミクロン超かつ５０ミクロン未満、１．０ミクロン超かつ５０ミクロン未満、１．０ミクロン超かつ２０ミクロン未満、３．０ミクロン超かつ３０ミクロン未満、又は５．０ミクロン超かつ２０．０ミクロン未満である。特定の実施形態では、Ｒ１は少なくとも５．０ミクロンである。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、約５、１０若しくは２０ミクロン、又はこれらから導出できるいずれの範囲である。特定の実施形態では、Ｒ２は、０．１ミクロン超かつ１０００ミクロン未満、１．０ミクロン超かつ１００ミクロン未満、５．０ミクロン超かつ１００ミクロン未満、５．０ミクロン超かつ５０ミクロン未満、１．０ミクロン超かつ５０ミクロン未満、１．０ミクロン超かつ２０ミクロン未満、３．０ミクロン超かつ３０ミクロン未満、又は５．０ミクロン超かつ２０．０ミクロン未満である。特定の実施形態では、Ｒ２は少なくとも５．０ミクロンである。いくつかの実施形態では、Ｒ２は、約５、１０若しくは２０ミクロン、又はこれらから導出できるいずれの範囲である。いくつかの実施形態では、Ｒ１はＲ２に等しい。特定の実施形態では、Ｒ３は、０．１ミクロン超かつ１０００ミクロン未満、１．０ミクロン超かつ１０００ミクロン未満、５．０ミクロン超かつ１０００ミクロン未満、５．０ミクロン超かつ５００ミクロン未満、１０．０ミクロン超かつ１０００ミクロン未満、１０．０ミクロン超かつ５００ミクロン未満、５０ミクロン超かつ３００ミクロン未満、又は１００．０ミクロン超かつ１０００．０ミクロン未満である。いくつかの実施形態では、Ｒ３は、約５５、１１０若しくは２７５ミクロン、又はこれらから導出できるいずれの範囲である。特定の実施形態では、Ｒ３は少なくとも５５．０ミクロンである。特定の実施形態では、Ｒ３は少なくとも２７５ミクロンである。異なるサイズの液滴を生成するよう構成された特定の実施形態では、ＣＨは、１０ミクロン、２０ミクロン及び５０ミクロンとなり、またＲ１はＲ２に等しくなり、５ミクロン、１０ミクロン及び２５ミクロンとなる。異なるサイズの液滴を生成するよう構成された特定の実施形態では、Ｒ３は、５５ミクロン、１１０ミクロン及び２７５ミクロン超である。いくつかの実施形態では、Ｒ１はＲ２より大きく、Ｒ２はＲ３より大きい。他の実施形態では、Ｒ３はＲ２より大きく、Ｒ２はＲ１より大きい。いくつかの実施形態では、Ｒ１＝Ｒ２＝Ｒ３である。更に他の実施形態では、Ｒ１＝Ｒ２であり、Ｒ３はＲ１より大きい。いくつかの実施形態では、比Ｒ３／Ｒ１は少なくとも１０．０である。いくつかの実施形態では、比Ｒ３／Ｒ２は少なくとも１０．０である。

具体的な実施形態では、比Ｔ１／ＣＨは０．１〜７、又はより詳細には１超かつ５未満、又はより詳細には３．０超かつ４．０未満である。特定の実施形態では、比Ｔ１／ＣＨは１．０超である。具体的な実施形態では、比Ｔ２／ＣＨは０．１〜７、又はより詳細には１超かつ５未満、又はより詳細には３．０超かつ４．０未満である。特定の実施形態では、比Ｔ２／ＣＨは１．０超である。特定の実施形態では、比Ｔ２／ＣＨはＴ１／ＣＨ未満である。

上記乳化デバイスの特定の実施形態では、ＣＨは１ミクロン〜５０ミクロン、又はより詳細には５ミクロン〜３０ミクロン、又はより詳細には６〜２０ミクロン、又はより詳細には８〜１２ミクロン、又はより詳細にはおよそ１０ミクロンである。特定の実施形態では、ＣＨは少なくとも５ミクロン、１０ミクロン、２０ミクロン又は５０ミクロンである。

特定の実施形態では、上記第１段は、ＣＷを超える幅Ｗ１を有し、上記第２段は、ＣＷを超える幅Ｗ２を有し、上記第３段は、ＣＷを超える幅Ｗ３を有する。特定の実施形態では、上記第１段は、ＣＷを超える幅Ｗ１を有し、上記第２段は、Ｗ１に等しい幅Ｗ２を有し、上記第３段は、Ｗ１を超える幅Ｗ３を有する。特定の実施形態では、Ｗ１＝Ｗ２＝Ｗ３である。特定の実施形態は、複数の流入口部分を含み、第１の複数の流入口部分のうちの各流入口部分は、高さＣＨ及び幅ＣＷを有する。特定の実施形態では、比ＣＷ／ＣＨは、各流入口部分に関して１．０より大きい。特定の実施形態では、比ＣＷ／ＣＨは、各流入口部分に関して、０．１〜１０．０、０．２〜８．０、０．５〜５．０、１．０〜４．０、２．０〜４．０、又は２．５〜３．５である。特定の実施形態では、比ＣＷ／ＣＨは、各流入口部分に関して約３．０である。特定の実施形態は、複数の第１段を含み、上記複数の第１段のうちの各第１段は、上記複数の流入口部分のうちの１つの流入口部分と流体連通し、また長さＴ１及び高さＳＨ１を有し、ＳＨ１はＣＨより蹴上げ高さＲ１だけ大きい。いくつかの実施形態は、上記複数の流入口部分のうちの複数の流入口部分と流体連通する、連続した第１段を含み、また長さＴ１及び高さＳＨ１を有し、ＳＨ１はＣＨより蹴上げ高さＲ１だけ大きい。特定の実施形態では、比ＳＨ１／ＣＨは１．０より大きい。具体的な実施形態では、比ＳＨ１／ＣＨは、１．０超かつ１０．０未満、又はより詳細には１．０超かつ５．０未満、又はより詳細には１．０超かつ４．０未満、又はより詳細には１．０超かつ２．０未満である。特定の実施形態では、比ＳＨ１／ＣＨはおよそ１．５である。特定の実施形態は、複数の第２段を含み、上記複数の第２段のうちの各第２段は、上記複数の第１段のうちの複数の第１段、又は単一の連続した第１段と流体連通し、上記第３段と流体連通し、また長さＴ２及び高さＳＨ２を有し、ＳＨ２はＳＨ１より蹴上げ高さＲ２だけ大きい。いくつかの実施形態は、単一の連続した第１段又は上記複数の第１段と流体連通する、単一の連続した第２段を含み、上記第２段は、上記第３段と流体連通し、また長さＴ２及び高さＳＨ２を有し、ＳＨ２はＳＨ１より蹴上げ高さＲ２だけ大きい。特定の実施形態では、比ＳＨ２／ＣＨは１．０より大きい。特定の実施形態では、比ＳＨ２／ＣＨは、１．０超かつ１０．０未満、又はより詳細には１．０超かつ５．０未満、又はより詳細には１．０超かつ３．０未満である。特定の実施形態では、比ＳＨ２／ＣＨはおよそ２．０である。いくつかの実施形態では、上記単一の連続する第２段又は複数の第２段は、共通の第３段と流体連通する。他の実施形態は、複数の第３段を含み、各第３段は、単一の連続した第２段又は複数の第２段と流体連通する。

いくつかの実施形態では、上記乳化デバイスは、単一の流入口部分を有する。他の実施形態では、上記乳化デバイスは、複数の流入口部分を有する。具体的な実施形態では、上記乳化デバイスは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、５００、若しくは１０００個の流入口部分、又はこれらから導出できるいずれの範囲の流入口部分を有する。上記複数の流入口部分はそれぞれ、複数の第１、第２及び／若しくは第３段のうちの１つ若しくは複数の専用の第１、第２及び／若しくは第３段と流体連通してよく、又は上記複数の流入口部分は、１つ又は複数の共通の第１、第２及び／若しくは第３段と流体連通してよい。

いくつかの実施形態では、上記乳化デバイスは単一のノズルを有する。他の実施形態では、上記乳化デバイスは複数のノズルを有する。具体的な実施形態では、上記乳化デバイスは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、５００、若しくは１０００個のノズル、又はこれらから導出できるいずれの範囲のノズルを有する。上記複数のノズルはそれぞれ、複数の第３段のうちの１つの専用のノズルと流体連通してよく、又は上記複数のノズルは、１つの共通の第３段と流体連通してよい。上記複数のノズルのうちの２つ以上のノズルは、２つ以上の異なるサイズの液滴を形成するよう構成されたジオメトリを有してよい。例えば、乳化デバイスは、ノズルの３つの集合を有してよく、第１の集合は、ジオメトリ：ＣＨ＝１０ミクロン、Ｒ１＝５ミクロン、Ｒ２＝５ミクロンを有し、第２の集合は、ジオメトリ：ＣＨ＝２０ミクロン、Ｒ１＝１０ミクロン、Ｒ２＝１０ミクロンを有し、第３の集合は、ジオメトリ：ＣＨ＝５０ミクロン、Ｒ１＝２５ミクロン、Ｒ２＝２５ミクロンを有し、ノズルの上記第１、第２及び第３の集合はそれぞれ、約４５ミクロン、１２０ミクロン及び３００ミクロンの液滴を生成する。様々にサイズ設定された液滴は、１つの共通の第３段領域において回収されてよく、又は上記様々にサイズ設定された液滴は、同一サイズの他の液滴と共に、別個の第３段領域において回収されてよい。上記デバイスが複数の空間的に離間した第３段を内包する場合、各第３段は、他の第３段領域のうちの１つ又は複数とは異なる蹴上げ高さＲ３又は段高さＳＨ３を有してよい。例として、約４５ミクロン、１２０ミクロン及び３００ミクロンの液滴を用いる上述の例では、３つの別個の第３段領域に関するＲ３の値は、５５ミクロン、１１０ミクロン及び２７５ミクロンとなってよい。

特定の実施形態は、本開示による乳化デバイスを用いてエマルジョンを形成する方法を含む。本方法の特定の実施形態では、上記デバイスの上記第１段、上記第２段及び上記第３段は、略静止した第１の流体を内包する。本方法の具体的な実施形態は、第２の流体を、上記流入口部分へ、そして上記第１段、上記第２段及び上記第３段を通して導入するステップを含む。特定の実施形態では、上記第２の流体の部分的な液滴が上記第１段で形成され、上記第２の流体の完全な液滴が上記第２段で（又は上記複数の第１段と上記複数の第２段との間の遷移中に）形成され、上記第２の流体の上記完全な液滴は、上記第２段から上記第３段へと向けられる。

いくつかの実施形態では、上記第２の流体の上記完全な液滴は、上記第２段における上記完全な液滴の高さが上記第２段における上記完全な液滴の長さより小さくなるように、上記第２段において圧縮される。具体的な実施形態では、上記第２の流体の上記完全な液滴は、上記第３段における上記完全な液滴の高さが上記第３段における上記完全な液滴の長さより小さくなるように、上記第３段において圧縮される。上記第２の流体の上記完全な液滴が上記第３段において圧縮される、特定の実施形態では、上記液滴の（小さい寸法又は「高さ」における）直径＜ＳＨ３＜２×上記液滴の（最大寸法又は「長さ」における）直径である。いくつかの実施形態では、上記第２の流体の上記完全な液滴は、上記第３段における上記完全な液滴の高さが上記第３段における上記完全な液滴の長さに等しくなるよう、上記第３段において圧縮されない。特定の実施形態では、上記第２段における上記完全な液滴の高さは、上記第３段における上記完全な液滴の高さより小さい。特定の実施形態では、上記第１段において形成される上記液滴の長さは、Ｔ１より大きい。特定の実施形態では、上記第２段において形成される上記液滴の長さは、Ｔ２より大きい。特定の実施形態では、上記第２の流体は、関心対象の分析物を含有する。具体的な実施形態では、上記第２の流体は、１つ又は複数のアッセイ試薬を含有し、また特定の実施形態では、上記アッセイ試薬は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマー、塩又は酵素である。特定の実施形態では、第１段及び第２段における上記液滴の長さは、それぞれの踏み板長さ（例えばＴ１及びＴ２）より大きく、これにより、段の表面に接触する上記液滴の一部分は、当該段上の段の縁部にも接触することになる。

いくつかの実施形態では、上記第１の流体は油である。具体的な実施形態では、上記第１の流体は疎水性液体であり、上記第２の流体は親水性液体である。他の実施形態では、上記第１の流体は親水性液体であり、上記第２の流体は疎水性液体である。特定の実施形態では、上記第１の流体又は上記第２の流体は乳化剤を含み、また特定の実施形態では、上記乳化剤は、非イオン性界面活性剤及び／又はブロッキングタンパク質（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）を含む。

本方法のいくつかの実施形態では、上記第２の流体の完全な液滴は、上記第２段において、１秒に少なくとも１０個の完全な液滴という速度で形成される。本方法のいくつかの実施形態では、上記第２の流体の完全な液滴は、上記第２段において、１秒に１〜３０個の完全な液滴という速度、又はより詳細には、１秒に１０〜３０個の完全な液滴という速度、又はより詳細には、１秒におよそ１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０個の完全な液滴という速度で形成される。いくつかの実施形態では、複数のノズルを採用して、１秒に、乳化デバイス１つあたり少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００個、又はこれらから導出できるいずれの範囲の液滴を生成する。

特定の実施形態では、上記第２の流体の上記完全な液滴は、平均直径４０〜４００ミクロン、４５〜３００ミクロン、又は４０〜５０ミクロンの平均直径を有する。特定の実施形態は、例えば２０〜６０、８０〜１６０、及び２００〜４００ミクロンの直径を有する液滴を含む、異なる複数の直径を有する液滴を生成するよう構成される。特定の実施形態は、例えば４５、１２０及び３００ミクロンの直径を有する液滴を含む、異なる複数の直径を有する液滴を生成するよう構成される。具体的な実施形態では、上記第１の流体と上記第２の流体との間で形成されるエマルジョンは、１０％未満の単分散性（液滴の直径の偏差）を有する。特定の実施形態では、上記第１の流体と上記第２の流体との間で形成されるエマルジョンは、１、２、３、４、５、６、７若しくは８％、又はこれらから導出できるいずれの範囲の単分散性を有する。

特定の実施形態では、上記チャネル及び／又は段は、シリコンでエッチングできる。特定の実施形態では、上記エッチングされたシリコンは、ガラス及び／又は可塑性ポリマー（プラスチック、エラストマ、ゴム、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマー［ＣＯＰ］等）、例えばポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）で被覆できる。いくつかの実施形態では、上記チャネル及び／又は段の表面は、疎水性組成物でコーティングしてよい。具体的な実施形態では、上記疎水性組成物は、パーフルオロデシルトリクロロシロキサン（ＦＤＴＳ）である。

特定の実施形態は、エマルジョンを形成する方法を含み、上記方法は、それぞれが流入口部分、第１段、第２段及び第３段を有する第１の複数のチャネル；それぞれが流入口部分、第１段、第２段及び第３段を有する第２の複数のチャネル；並びにそれぞれが流入口部分、第１段、第２段及び第３段を有する第３の複数のチャネルを備え、上記第１、第２及び第３の複数のチャネルに関する上記複数の第１段、上記複数の第２段及び上記複数の第３段は略静止している、乳化デバイスを得るステップを含む。本発明の例示的実施形態は更に、第２の流体を、上記第１、第２及び第３の複数のチャネルの、上記複数の流入口部分へ、そして上記複数の第１段、上記複数の第２段及び上記複数の第３段を通して導入するステップを含んでよく、ここで：上記第２の流体の部分的な液滴が、上記第１、第２及び第３の複数のチャネルの上記複数の第１段で形成され；上記第２の流体の第１の完全な液滴が、上記第１の複数のチャネルそれぞれの、上記複数の第１段と上記複数の第２段との間の遷移中に形成され；上記第２の流体の第２の完全な液滴が、上記第２の複数のチャネルそれぞれの、上記複数の第１段と上記複数の第２段との間の遷移中に形成され；上記第２の流体の第３の完全な液滴が、上記第３の複数のチャネルそれぞれの、上記複数の第１段と上記複数の第２段との間の遷移中に形成され；上記第２の流体の上記第２の完全な液滴は、上記第２の液体の上記第１の完全な液滴より大きく；上記第２の流体の上記第３の完全な液滴は、上記第２の液体の上記第２の完全な液滴より大きい。

本方法の特定の実施形態では、上記第１の完全な液滴の直径は約２５μｍ〜６５μｍであり、上記第２の完全な液滴の直径は約８０μｍ〜２００μｍであり、上記第３の完全な液滴の直径は約２００μｍ〜４００μｍである。本方法の具体的な実施形態では、上記第１の完全な液滴の直径は３５μｍ〜５５μｍであり、上記第２の完全な液滴の直径は１００μｍ〜１４０μｍであり、上記第３の完全な液滴の直径は２５０μｍ〜３５０μｍである。本方法の特定の実施形態では、上記第１の完全な液滴の直径はおよそ４５μｍであり、上記第２の完全な液滴の直径はおよそ１２０μｍであり、上記第３の完全な液滴の直径はおよそ３００μｍである。

用語「連結された（ｃｏｕｐｌｅｄ）」は、接続されていること、ただし必ずしも直接でなく、また必ずしも機械的でないものとして定義される。２つの事物が互いに対して連結可能である場合、これらは「連結可能（ｃｏｕｐｌａｂｌｅ）」であり、連結されても依然として「連結可能」として特性決定され得る。文脈がそうでないことを明確に必要としない限り、連結可能な事物は連結解除可能でもあり、またその逆も成り立つ。第１の構造が第２の構造に対して連結可能となる１つの非限定的な方法は、上記第１の構造を、上記第２の構造に対して連結されるよう構成する（又は連結可能となるよう構成する）ことである。

用語「ある（ａ、ａｎ）」は、本開示がそうでないことを明確に必要としない限り、１つ又は複数として定義される。

用語「略、実質的に（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）」並びにそのバリエーション（例えば「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」及び「約（ａｂｏｕｔ）」は、当業者が理解するように、必ずしも完全にではないが概ね、明記された通りであること（及び明記されたものを完全に含むこと）として定義される。 開示されるいずれの実施形態において、用語「略、実質的に」、「およそ」及び「約」は、明記されたもの「（のあるパーセンテージ）以内」で置換でき、ここで上記パーセンテージは０．１、１、５及び１０パーセントを含む。

用語「備える、含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」（並びに「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」といった「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」のいずれの形態）、「有する（ｈａｖｅ）」（並びに「ｈａｓ」及び「ｈａｖｉｎｇ」といった「ｈａｖｅ」のいずれの形態）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」（並びに「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」及び「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」といった「ｉｎｃｌｕｄｅ」のいずれの形態）、並びに「含有する、内包する（ｃｏｎｔａｉｎ）」（並びに「ｃｏｎｔａｉｎｓ」及び「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ」といった「ｃｏｎｔａｉｎ」のいずれの形態）は、制限のない関連する動詞である。従って、１つ又は複数のステップ又は要素を「備える」、「有する」、「含む」又は「含有する」方法又はデバイスは、これらの１つ又は複数のステップ又は要素を具備するものの、これらの１つ又は複数のステップ又は要素のみを具備するとは限定されない。同様に、１つ又は複数の特徴を「備える」、「有する」、「含む」又は「含有する」、方法のステップ又はデバイスの要素は、これらの１つ又は複数の特徴を具備するものの、これらの１つ又は複数の特徴のみを具備するとは限定されない。例えば、４つのチャネルを備えるシステムは、５つ以上のチャネルを有してよい。

「流体（ｆｌｕｉｄ）」は一般に、流動してそのコンテナの形状に一致する傾向を有する物質を指す。流体は、流動が可能ないずれの好適な粘度を有してよい。２つ以上の流体がある体積内に存在する場合、上記流体は例えば、混和性、わずかに混和性、又は不混和性であってよい。本明細書中で使用される場合、エマルジョンを使用する条件下において一方の流体が他方の流体中に溶解可能でない場合、２つの流体は不混和性である、又は混和性でない。

「本明細書中で使用される場合、「液滴」は、第２の流体で完全に取り囲まれた、又は第２の流体及び１つ若しくは複数の表面で完全に取り囲まれた、第１の流体の隔離された体積である。液滴の非限定的な例としては、疎水性液体中に懸濁された親水性液体、親水性液体中に懸濁された疎水性液体、及び液体中に懸濁された気泡が挙げられる。

「エマルジョン（ｅｍｕｌｓｉｏｎ）」は、液体中の液体の懸濁物である。いくつかの実施形態では、エマルジョンは「マイクロエマルジョン（ｍｉｃｒｏｅｍｕｌｓｉｏｎ）」又は「ナノエマルジョン（ｎａｎｏｅｍｕｌｓｉｏｎ）」、即ち分散相がそれぞれ数マイクロメートル又は数ナノメートル程度の平均直径を有するエマルジョンである。エマルジョンは例えば、所望の１つ又は複数のサイズの液滴を、上記液滴に対して不混和性の溶液中に入れることによって生成してよい。特定の実施形態では、流体のストリーム又は流体の液滴は、マイクロチャネル（即ち約１μｍ〜１ｍｍの平均断面寸法を有するチャネル又は段）中においてミクロ規模で生成できる。

「略静止した（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｓｔａｔｉｃ）」流体は、流れが誘発する圧力の変動が無視できる流体である。例えば本明細書中で開示される様々な実施形態では、第１の流体はチャネル内において略静止しており、上記第１の流体と不混和性の第２の流体は、流入口を介して上記チャネル内へと流れる。上記第２の流体は、例えばポンプによって、上記流入口を通して流すことができる。上記略静止した第１の流体は、上記第２の流体が上記チャネル内へと流れることによる上記第１の流体の変位によって、多少運動し得るが、上記第１の流体の流れを上記チャネル内へと搬送する追加の流入口は存在しない。しかしながら、上記第２の流体によって上記チャネルから排出されたいずれの上記第１の流体を収容する流出口又は廃棄物チャネルは存在し得る。換言すると、上記第１の流体は「受動的（ｐａｓｓｉｖｅ）」である。また、上記第１の流体が受動的であり、上記第２の流体と並行流とならないため、流量は、Ｔ字型ジャンクションデバイス等の他の並行流液滴形成技術におけるように液滴サイズを決定することはない。

本明細書では、上記流入口部分、第１段及び第２段をまとめて「ノズル（ｎｏｚｚｌｅ）」と呼ぶ場合がある。乳化デバイスは、単一のノズル又は複数のノズルを有してよい。複数のノズルは、１つの共通の第３段と流体連通してよく、又は複数のノズルそれぞれが、複数の別個の第３段と流体連通してよい。複数のノズルは複数の流入口部分を有するが、上記第１段は、複数の流入口部分と流体連通した単一の連続した段であってよく、又は上記第１段は、上記複数の流入口部分のうちの専用の流入口部分とそれぞれ流体連通した、複数の構造的に別個の第１段であってよい。同様に、上記第２段は、１つ若しくは複数の上記第１段と流体連通した単一の連続した段であってよく、又は上記第２段は、上記複数の第１段のうちの専用の第１段とそれぞれ流体連通した、複数の構造的に別個の第２段であってよい。

更に、ある特定の方法で構成されたデバイス又は構造は、少なくともその方法で構成されるが、記載されていない複数の方法でも構成され得る。メートル系単位は、英単位から、変換を適用し、最も近いマイクロメートル値に丸めることによって導出できる。

一実施形態の１つ又は複数の特徴は、説明又は図示されていなくても、他の実施形態に適用できる（ただし本開示又は該実施形態の性質によって明らかに不可能となっている場合を除く）。

本開示のデバイス及び方法のうちのいずれの、いずれの実施形態は、本記載の要素及び／又は特徴及び／又はステップのうちのいずれを備える／含む／含有する／有するのではなく、これらから構成できるか又は本質的に構成できる。従って請求項のうちのいずれにおいて、用語「…から構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」又は「…から本質的に構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」を、上に挙げた制限のない関連する動詞に置換することによって、所与の請求項の範囲を、上記制限のない関連する動詞を使用しない場合の範囲から変化させることができる。

他の特徴及び関連する利点は、添付の図面と関連する具体的な実施形態の以下の詳細な説明を参照すると、明らかになるであろう。

以下の図面は例として示されるものであり、限定ではない。簡潔性及び明瞭性のために、所与の構造の全ての特徴を、該構造が見て取れる全ての図において標識しない場合がある。同一の参照番号は必ずしも同一の構造を示さない。寧ろ同一の参照番号は、同様の特徴、又は同様の機能性を有する特徴を示すために使用される場合があり、同一の参照番号でない場合もある。

図１Ａは、本開示による多段乳化デバイスのある例示的実施形態の斜視図である。 図１Ｂは、本開示による多段乳化デバイスのある例示的実施形態の斜視図である。 図２は、図１Ｂの実施形態の断面図である。 図３Ａ〜３Ｃは、動作中の図１の実施形態の断面図である。 図４は、本開示による複数のノズルを備えるデバイスの斜視図である。 図５は、単段乳化デバイスのネットワーク及び多段乳化デバイスのネットワークに関する、流量に対する分散パーセンテージを示すグラフである。 図６は、単段乳化デバイス、及び図５からのデバイスのネットワークの多段乳化デバイスに関して算出された、流量に対する分散パーセンテージを示すグラフである。 図７は、単段乳化デバイス及び多段乳化デバイスに関する、液滴サイズ分散パーセンテージを示すチャートである。 図８は、本開示による多段乳化デバイスのある例示的実施形態の斜視図である。 図９は、図８の実施形態の部分断面図である。 図１０は、図８の実施形態の部分断面図である。 図１１は、図８の実施形態の部分断面図である。 図１２は、図８の例示的実施形態によって形成された液滴の概略図である。 図１３は、様々な液滴サイズ及びエリアに関する異なる複数のダイナミックレンジを示す概略図である。 図１４は、本開示による多段乳化デバイスのある例示的実施形態の斜視図である。

様々な特徴及び有利な詳細を、添付の図面に図示されかつ以下の記載において記載される非限定的な実施形態を参照して、より完全に説明する。しかしながら、この詳細な説明及び具体例は、本発明の実施形態を示すものの、単なる例として与えられるものであり、限定として与えられるものではないことを理解されたい。様々な置換、修正、追加及び／又は再構成が、本開示から当業者に明らかになるだろう。

以下の説明では、本開示の実施形態の完全な理解を提供するために、多数の具体的詳細が提供される。しかしながら当業者は、これらの具体的詳細のうちの１つ若しくは複数を用いずに、又は他の方法、構成部品、材料等を用いて、本発明を実施できることを認識するだろう。他の例では、公知の構造、材料又は操作については、本発明の態様を煩雑にするのを回避するために、詳細に図示又は説明しない。明瞭性のために、各図において確認できる全ての構成部品に対する全ての参照番号を図示しないことが理解される。

本発明のデバイス及び方法は、開示されている特定の形態に限定されることを意図されたものではないことを理解されたい。寧ろ本発明のデバイス及び方法は、請求項の範囲内の全ての修正例、均等物及び代替例を包含するものである。

図１Ａは、乳化デバイス１９０を斜視図で示す。本実施形態では、乳化デバイス１９０は、チャネル幅ＣＷ及びチャネル高さＣＨを有する流入口チャネル１９５を備える。流入口チャネル１９５は更に、幅が増大した部分を備える。例えば流入口チャネル１９５は、幅ＣＷより大きい幅Ｗ１を有する部分を備える。特定の実施形態では、比Ｗ１／ＣＷは２．０超、５．０超、１０．０超、５０．０超又は１００．０超であってよい。具体的な実施形態では、比Ｗ１／ＣＷは、５．０〜２５．０であってよい。図示されている実施形態では、流入口チャネル１９５は、増大した幅Ｗ２及びＷ３を有する更なる部分を備える。

図１Ｂ、２はそれぞれ、乳化デバイス１００を斜視図及び断面図で示す。図１Ｂ及び図２の実施形態は、以下で更に説明するように、蹴上げ１１０、１２０、１３０及びステップ１０１、１０２、１０３を有するチャネル１０５を含む。明瞭性のために、図１Ｂ、図２のいずれにおいても、全ての要素は標識しない。図１Ｂの実施形態では、チャネル１０５は、チャネル幅ＣＷ及びチャネル高さＣＨを有する流入口部分を含む。チャネル１０５は更に、ＣＨより大きい幅Ｗ１を有する部分を含む。いくつかの実施形態では、複数の流入口部分は、１つの共通の第１段と流体連通してよく、この場合、この共通の段の幅Ｗ１は、いずれの独立した流入口部分の幅ＣＷより有意に大きくなる。この共通の段の幅Ｗ１は、上記段と流体連通する上記流入口部分の全ての幅の合計より大きくなる。図３Ａ〜３Ｃは、動作中の乳化デバイス１００の断面図である。

図１Ｂ及び図２に示す実施形態では、乳化デバイス１００は、それぞれが他と流体連通する流入口部分１０７、第１段１０１、第２段１０２、第３段１０３を有するチャネル１０５を備える、多段構成を備える。更に乳化デバイス１００は、流入口部分１０７と第１段１０１との境界における第１の蹴上げ１１０、第１段１０１と第２段１０２との境界における第２の蹴上げ１２０、及び第２段１０２と第３段１０３との境界における第３の蹴上げ１３０を備える。第１段１０１は、第１段高さＳＨ１及び第１の踏み板長さＴ１を備え、第２段１０２は、第２段高さＳＨ２及び第２の踏み板長さＴ２を備え、第３段１０３は、第３段高さＳＨ３及び第３の踏み板長さＴ３を備える。

本明細書中で使用される場合、踏み板長さＴ１は、第１の蹴上げ１１０と第２の蹴上げ１２０との間の距離に等しく、踏み板長さＴ２は、第２の蹴上げ１２０と第３の蹴上げ１３０との間の距離に等しく、踏み板長さＴ３は、第３の蹴上げ１３０と、流入口部分１０７から遠位にある乳化デバイス１００の液滴回収チャンバの端部との間の距離に等しいか、又は上記乳化デバイスが１つ若しくは複数の更なる段を備える場合は、踏み板長さＴ３は、第３の蹴上１３０と第４の蹴上との間の距離に等しい。更にＳＨ１は、対向する表面１１５と表面１１１との間の距離に等しく、ＳＨ２は、対向する表面１１５と表面１１２との間の距離に等しく、ＳＨ３は、対向する表面１１５と表面１１３との間の距離に等しい。図示されている実施形態では、表面１１５は、第１の蹴上げ１１０、第２の蹴上げ１２０及び第３の蹴上げ１３０から遠位にある。図示されている実施形態では、表面１１１は、第１の蹴上げ１１０と第２の蹴上げ１２０との間に延在し、また表面１１１は、表面１１５に対して平行である。同様に、表面１１２は、第２の蹴上げ１２０と第３の蹴上げ１３０との間に延在し、また表面１１２は、この実施形態では表面１１５に対して平行である。更に、表面１１３は、表面１１５に対して平行であり、また蹴上げ１３０から、流入口部分１０７から遠位にある乳化デバイス１００の端部まで延在する。図示されている実施形態では、第１の蹴上げ１１０、第２の蹴上げ１２０及び第３の蹴上げ１３０は、表面１１５に対して垂直である。

更に後で説明するように、上記チャネル及び段の寸法及びジオメトリは、単一の流体の流れから、単分散性の高いエマルジョンを高い頻度で生成するよう構成される。以下に提示するデータが実証しているように、多段構成は、単段設計に対して単分散性の大幅な改善を提供できる。理論によって拘束されるものではないが、単段設計の性能が劣るのは、形成される液滴が、既に形成されている液滴に、予測できない様式で接触することにより、形成される液滴のサイズに影響するという事実が原因であり得ると考えられている。本明細書で開示される多段構成は、単段設計の単分散性が低いという問題を解決する。特に上記多段構成は、液滴の形成において特定の機能を果たす複数のセクションを定義する。

図示されている実施形態では、流入口部分１０７は、（図１に示す）チャネル高さＣＨ及びチャネル幅ＣＷを備える。特定の実施形態では、比ＣＷ／ＣＨは、０．２超かつ５．０未満である。流入口部分１０７は、第１段１０１と流体連通し、この第１段１０１は、踏み板長さＴ１及び段高さＳＨ１を有し、ＳＨ１はチャネル高さＣＨより、ゼロ超である蹴上げ高さＲ１だけ大きい。具体的な実施形態では、チャネル高さに対する第１段高さの比ＳＨ１／ＣＨは、１．０超かつ５．０未満である。本明細書において図示及び説明される例示的実施形態は、直線構成に配設されたノズルを含むが、他の実施形態は、例えばノズルの円形配置を含む、異なるノズル配置を含んでよい。

高さ、幅、長さといった寸法に関する用語は、単に参照を目的として使用されるものであり、マイクロチャネル乳化デバイス１００の特定の配向を要求することを意図したものではないことを理解されたい。図２、３Ａ〜３Ｃを参照する際に使用される場合、高さは垂直方向（例えば図面のページの上部から底部への）寸法を指し、幅は、図示されている断面図の平面に対して垂直（例えばページに対して垂直）な寸法を指し、長さは、水平方向（例えばページの左から右への）寸法を指す。一般に、用語「高さ」及び「長さ」は、１つの平面における直交する寸法を指し、用語「幅」は、高さ及び長さの平面に対して垂直な寸法を指す。

図示されている実施形態では、ＳＨ１はＣＨより蹴上げ高さＲ１（例えばＳＨ１とＣＨとの間の寸法差）だけ大きい。更にＳＨ２はＳＨ１より蹴上げ高さＲ２だけ大きく、ＳＨ３はＳＨ２より蹴上げ高さＲ３だけ大きい。これら様々な蹴上げ高さＲ１、Ｒ２、Ｒ３は、図２では垂直方向下向きに延在するものとして示されている。しかしながら、これらの蹴上げ高さは、上向き又は側方に延在してもよいことが理解される。液滴はノズル内に内包されたままであり（即ち非球形であり）、従って重力ではなく表面張力が、例示的実施形態の動作中に液滴の形成に影響を及ぼす主要な力であるため、必要な場合は蹴上げ高さをいずれの方向（例えば下向き、上向き又は側方）に形成できる。ＣＨ又はＣＷは（どちらの寸法が小さいかにかかわらず）、デバイス１００が形成する液滴の直径を決定する主要な因子であり、またＳＨ１又はＷ１は、デバイス１００が形成する液滴の直径を決定する二次因子である。

図示されている実施形態では、チャネル１０５の流入口部分１０７は、０．２超かつ５．０未満の幅対高さ比（ＣＷ／ＣＨ）を有する。特定の実施形態では、比ＣＷ／ＣＨは１．５超かつ４．５未満であってよく、特定の実施形態では、比ＣＷ／ＣＨは２．５超かつ３．５未満であってよく、また具体的な実施形態では、比ＣＷ／ＣＨはおよそ３．０であってよい。

上述のように、第１段１０１は流入口部分１０７と流体連通し、第１段１０１の高さＳＨ１は、ＣＨより蹴上げ高さＲ１だけ大きい。例示的実施形態では、比ＳＨ１／ＣＨは、１．０超かつ５．０未満、又は１．２５超かつ２．７５未満、又は１．５超かつ２．５未満、又は１．７５超かつ２．２５未満、又は１．２５超かつ１．７５未満である。

乳化デバイス１００はまた、第１段１０１と流体連通する第２段１０２を備え、第２段１０２の高さＳＨ２は、ＳＨ１より蹴上げ高さＲ２だけ大きい。例示的実施形態では、比ＳＨ２／ＣＨは、０．１超かつ５．０未満である。更に乳化デバイス１００はまた、第２段１０２と流体連通する第３段１０３を備え、第３段１０３の段高さＳＨ３は、ＳＨ２より蹴上げ高さＲ３だけ大きい。例示的実施形態では、Ｒ３は０．１ミクロン超かつ１０００ミクロン未満である。図示されている実施形態では、Ｒ１はＲ２より大きく、Ｒ２はＲ３より大きい。しかしながら他の実施形態では、Ｒ３はＲ２より大きく、Ｒ２はＲ１より大きい。いくつかの実施形態では、Ｒ３はＲ２より大きく、Ｒ２はＲ１に等しい。更に、図示されている実施形態は、０．１〜７．０である比Ｔ１／ＣＨ、及びＴ１／ＣＨ未満である比Ｔ２／ＣＨを含む。

特定の実施形態では、比Ｔ１／Ｒ１は、２．０超、又は５．０超、又は１０．０超である。特定の実施形態では、比Ｔ２／Ｒ２は、２．０超、又は５．０超、又は１０．０超である。

図３Ａ〜３Ｃは、動作中の乳化デバイス１００を示す。明瞭性のために、図３Ａ〜３Ｃでは、乳化デバイス１００の全ての要素は標識されない。図３Ａ〜３Ｃにおいて標識されていない要素に関しては、図２を参照できる。図３Ａは、第１段１０１から第２段１０２へと遷移する部分的な液滴１５２を示す。図３Ｂは、第２段１０２から第３段１０３へと遷移する液滴１５３を示す。図３Ｃは、第３段１０３上の液滴１５４を示す。まず図３Ａを参照すると、動作中、流体ストリーム１５１を、流入口部分１０７内へと導入できる（例えば流れるストリームにおいて高圧から低圧へと向けることができる）。流入口部分１０７は、試料スレッド１５１を、流入口部分１０７と第１段１０１との間の高さＲ１を有する第１の蹴上げ１１０へと送達するよう構成される。

特定の実施形態では、流体ストリーム１５１は、親水性液体を含む試料スレッドであってよく、その一方で段１０１、１０２、１０３は、疎水性液体である流体１５５を内包する。いくつかの実施形態では、流体ストリーム１５１は疎水性液体を含んでよく、その一方で流体１５５は親水性液体を含む。特定の実施形態では、段１０１、１０２、１０３は、疎水性液体（例えば油）を含む流体１５５で充填され、その後、親水性液体（例えば水性流体）を含む流体ストリーム１５１が第１のチャネル１０１内へと導入される。例示的実施形態では、流体１５５は、流体ストリーム１５１が第１のチャネル１０５の流入口部分１０７に導入される際、略静止している。乳化デバイス１００での液滴形成のために使用できる液体のタイプの更なる例は、以下の「エマルジョン」という題の節において提供される。

第１段１０１は、流体ストリーム１５１の不安定化を開始する（例えば連続する流体ストリーム１５１を、不連続性を内包するように遷移させる）よう構成され、部分的な液滴１５２が第１段１０１において形成される。特定の実施形態では、部分的な液滴１５２は、動作中に第１段１０１において（体積で測定して）およそ９０％形成される。例示的実施形態では、第１段１０１は、完全な液滴の形成を提供せず、部分的な液滴１５２は、流体ストリーム１５１に流体接続される。図３Ａに示すように、部分的な液滴１５２は、流体ストリーム１５１又は部分的な液滴１５２より小さい断面積を有する領域１５８によって、流体ストリーム１５１に流体接続される（例えば流体ストリーム１５１は、部分的な液滴１５２の形成前に領域１５８内に向かって細くなる）。部分的な液滴１５２は第１段１０１によって圧縮され、第１段１０１の高さＳＨ１全体に延在する。流体力学及び物理学の原理に従って、部分的な液滴１５２は、可能な限り最低のエネルギ状態（例えば非圧縮状態）を求めることになる。従って部分的な液滴１５２は、第１の蹴上げ１１０に接触するまで、第２段１０２に向かって前進し続けることになり、第１の蹴上げ１１０において、上記液滴は、第２段１０２が第１段１０１の高さＳＨ１より大きい高さＳＨ２を有することにより、第１段１０１においてよりも圧縮されていない状態となる。

例示的実施形態では、部分的な液滴１５２は、第１段１０１と第２段１０２の境界における第２の蹴上げ１２０に到達するとすぐに、（図３Ｂに示すような）完全な液滴１５３を形成する。動作中、流体ストリーム１５１は、ある期間に亘って第１のチャネル１０１へと導入される。１つの部分的な液滴１５２が前進して完全な液滴１５３を形成する際、後続の部分的な液滴が第１段１０１において形成される。第２段１０２及び（蹴上げ高さＲ２を有する）蹴上げ１２０は、部分的な液滴１５２（及び流体ストリーム１５１）から分離された完全な液滴１５３を形成するよう構成される。

第２段１０２はまた、部分的な液滴１５２が形成される第１段１０１と、完全な液滴１５４が貯蔵される第３段１０３との間の、保護ゾーンを提供するよう構成される。従って形成済みの完全な液滴と、形成中の部分的な液滴との間の接触は、低減されるか又は排除される。段１０１、１０２の長さ（例えば寸法Ｔ１、Ｔ２）は、これらのセクションそれぞれにおいて液滴を収容することによって、各セクションがその機能を適切に達成できるように、サイズ設定される。所望の液滴形成及び前進に関する理論的算出値は、踏み板長さＴ１＝３．８０７（ＣＨ）、踏み板長さＴ２＝１．８５８５（ＣＨ）を指示する。実際の踏み板長さは、理論上算出された寸法から変動してよい。これは、連続傾斜構成、又は１つの傾斜を近似するよう配設された一連の段（各段の機能は同一である）を有する構成とは対照的である。更に、本明細書において開示される多段チャネルはまた、許容誤差の増大を可能とすることにより、連続傾斜構成では利用できない製造オプションも提供する。

例示的実施形態では、完全な液滴１５３は段１０２内において、完全な球形とはならないように圧縮される。例えば、完全な液滴１５３は、ＳＨ２（図２に示されている段１０２の高さ）に等しい高さＤＨ３を有する。更に、液滴１５３はまた、ＤＨ３より大きい長さＤＬ３も有する。流体力学及び物理学の原理に従って、液滴１５３は、可能な限り最低のエネルギ状態（例えば非圧縮状態）を求めることになる。従って液滴１５３は、第２の蹴上げ１２０に接触するまで、第３段１０３に向かって前進し続けることになり、第２の蹴上げ１２０において、上記液滴は、第３段１０３が第２段１０２の高さＳＨ２より大きい高さＳＨ３を有することにより、第２段１０２においてよりも圧縮されていない状態となる。

図示されている実施形態では、第３段１０３は、液滴１５４の貯蔵、及び任意に撮像デバイス１５７（例えばカメラ又は光感受性検出器）による液滴１５４の撮像を提供するよう構成される。液滴１５４の任意の撮像に関する追加の情報は、以下の「液滴の撮像」という題の節において提供される。液滴１５４もまた、完全に球形であってもなくてもよい完全な液滴であるが、液滴１５３より圧縮されていない状態である。従って液滴１５４の高さＤＨ４は、液滴１５３の高さＤＨ３より大きいものの、通常は液滴１５４の長さＤＬ４より小さい。図３Ｃは断面図であり、動作中、複数の液滴１５４が第３段１０３内に位置し得ることが理解される。

図４は、複数のノズル２００を備える乳化デバイス２５０の、分解したアセンブリの斜視図を示す。例示的実施形態では、各ノズル２００は、乳化デバイス１００のチャネル及び段に関して本明細書中に記載した特徴と同等の特徴を有するチャネル及び段を備えてよい。図示されている実施形態では、乳化デバイス２５０は、９個の平行なノズル２００を備える。他の実施形態は、より多数又はより少数のノズルを備えてよい。図示されている実施形態では、乳化デバイス２５０は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）からなる基部２２０、及びガラスからなるカバー２１０を備える。

図５は、１６個の単段乳化デバイス、及び１６個の多段ノズルのネットワークに関する、流量に対する分散パーセンテージをグラフで示す。上記単段乳化デバイスは、およそ１８９μｍの段高さを備えていた。ＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒソフトウェア及び撮像処理パイプラインを用いて、蛍光標識した液滴を検出した。それぞれおよそ３００個の液滴を用いた各試験中に、複数の画像を取得した。上記ソフトウェアは複数のファイルを生成し、全てのファイルに関して、全ての液滴の、関連する液滴直径と併せたリストが存在し、上記直径の平均及び標準偏差を算出した。分散を算出し、２つの構成間で比較した。上記分散は、直径の変動係数（ＣＶ）であり、上記ＣＶは、標準偏差を平均直径で除算したものに等しい。この試験中に使用したチャネル寸法には、チャネル高さ２０μｍと、チャネル幅６０μｍと、比ＣＨ／ＳＨ１＝０．６６６又はＲ１／ＣＨ＝０．５とが含まれていた。

図６は、単段乳化デバイス、及び図５に示した多段乳化デバイスに関して算出された、流量に対する分散パーセンテージをグラフで示す。

図７は、単段乳化デバイス及び多段乳化デバイスに関する、液滴サイズ分散パーセンテージを示すチャートである。この試験中に使用したチャネル寸法には、チャネル高さ２５μｍと、チャネル幅６０μｍと、Δ高さ／高さ＝０．５とが含まれていた。

特定の実施形態では、乳化デバイスは、複数の液滴サイズを生成するよう構成できる。例えば乳化デバイスは、異なるサイズ及び体積の液滴を生成できるよう異なるジオメトリを有する、ノズル及びチャネルの複数のセットを備えてよい。

ここで図８を参照すると、乳化デバイス５００は、第１の複数のノズル３００及び第２の複数のノズル４００を備える。図示されている実施形態では、ノズル３００は、流体供給チャネル３５５によって流体を供給され、その一方でノズル４００は、流体供給チャネル４５５によって流体を供給され。ノズル３００、４００が形成する液滴は、それぞれ回収チャンバ３５０、４５０に回収される。デバイス５００は更に、廃棄材料（例えば過剰な流体又は液滴）が乳化デバイス５００を出て廃棄物回収チャンバに向かうことができるよう構成された、廃棄物チャネル５５０を備える。例示的実施形態では、各ノズル３００、４００は、本明細書に記載の他の実施形態の特徴と同等の特徴を有するチャネル及び段を備えてよい。例えば、第１の複数のノズル３００及び第２の複数のノズル４００の各ノズルは、図９、１０にそれぞれ示すように、チャネル３０５、４０５を備えてよい。チャネル３０５、４０５は、乳化デバイス１００のチャネル及びステップに関して本明細書中で説明した特徴と同等の特徴を有するように構成できる。

動作中、ノズル３００、４００は、異なる直径を有する液滴を生成するよう構成できる。例えば各チャネル４０５は、各チャネル３０５から生成される液滴の直径より大きい直径を有する液滴を生成するよう構成される。更に乳化デバイス５００は、複数のチャネル３０５、４０５それぞれによって生成される液滴の数を制御するよう構成できる。例えば流体供給チャネル３５５、４５５は、チャネル３０５、４０５に供給される流体の量を制御するよう構成できる。特定の実施形態では、流体供給チャネル３５５、４５５は、異なる直径、長さ、並びに／又は上記チャネルを通る流体の流れの抵抗、及びチャネル３０５、４０５への流体の流れの量に影響を及ぼし得る他の因子を有してよい。他の実施形態では、流体供給チャネル３５５、４５５は、チャネル３０５、４０５への流体の流れの量を制御するために操作できる弁を備えてよい。このような構成により、チャネル３０５、４０５への流体の流れを変えることができ、これにより、チャネル３０５、４０５によって様々な数の液滴を形成できる。チャネル３０５、４０５への流体の流れを独立して制御できる能力を用いて、チャネル４０５によって形成される比較的小さい直径の液滴のパーセンテージ、及びチャネル３０５によって形成される比較的大きい直径の液滴のパーセンテージを、正確に制御できる。異なるサイズの液滴を生成できる能力は、概ね同等のサイズの液滴を生成する他の乳化デバイスを上回る有意な利点を提供できる。例えば乳化デバイス５００によって生成された異なるサイズの複数の液滴を用いて、デジタルＰＣＲ分析中に利用可能なダイナミックレンジを増大させることができる。

特定の実施形態では、チャネル３０５、４０５は、既に記載した実施形態のジオメトリと同様のジオメトリを有してよい。例えば、図９の断面図に示されているように、チャネル３０５は、それぞれが他と流体連通する流入口部分３０７、第１段３０１、第２段３０２及び第３段３０３を有する。更にチャネル３０５は、流入口部分３０７と第１段３０１との境界における（蹴上げ高さＲ３１の）第１の蹴上げ３１０、第１段３０１と第２段３０２との境界における（蹴上げ高さＲ３２の）第２の蹴上げ３２０、及び第２段３０２と第３段３０３との境界における（蹴上げ高さＲ３３の）第３の蹴上げ３３０を備える。第１段３０１は、第１段高さＦＳＨ１及び第１の踏み板長さＴ３１を備え、第２段３０２は、第２段高さＦＳＨ２及び第２の踏み板長さＴ３２を備え、第３段３０３は、第３段高さＦＳＨ３及び第３の踏み板長さＴ３３を備える。

図９に示す実施形態では、ＦＳＨ１は、対向する表面３１５と表面３１１との間の距離に等しく、ＦＳＨ２は、対向する表面３１５と表面３１２との間の距離に等しく、ＦＳＨ３は、対向する表面３１５と表面３１３との間の距離に等しい。図示されている実施形態では、表面３１５は、第１の蹴上げ３１０、第２の蹴上げ３２０及び第３の蹴上げ３３０から遠位にある。図示されている実施形態では、表面３１１は、第１の蹴上げ３１０と第２の蹴上げ３２０との間に延在し、また表面３１１は、表面３１５に対して平行である。同様に、表面３１２は、第２の蹴上げ３２０と第３の蹴上げ３３０との間に延在し、また表面３１２は、この実施形態では表面３１５に対して平行である。更に、表面３１３は、表面３１５に対して平行であり、また蹴上げ３３０から、流入口部分３０７から遠位にある乳化デバイス３００の端部まで延在する。図示されている実施形態では、第１の蹴上げ３１０、第２の蹴上げ３２０及び第３の蹴上げ３３０は、表面３１５に対して垂直である。

ここで図１０の断面図を参照すると、チャネル４０５は、それぞれが他と流体連通する流入口部分４０７、第１段４０１、第２段４０２及び第３段４０３を有する。更にチャネル４０５は、流入口部分４０７と第１段４０１との境界における（蹴上げ高さＲ４１の）第１の蹴上げ４１０、第１段４０１と第２段４０２との境界における（蹴上げ高さＲ４２の）第２の蹴上げ４２０、及び第２段４０２と第３段４０３との境界における（蹴上げ高さＲ４３の）第３の蹴上げ４３０を備える。第１段４０１は、第１段高さＳＳＨ１及び第１の踏み板長さＴ４１を備え、第２段４０２は、第２段高さＳＳＨ２及び第２の踏み板長さＴ４２を備え、第３段４０３は、第３段高さＳＳＨ３及び第３の踏み板長さＴ４３を備える。

図１０に示す実施形態では、ＳＳＨ１は、対向する表面４１５と表面４１１との間の距離に等しく、ＳＳＨ２は、対向する表面４１５と表面４１２との間の距離に等しく、ＳＳＨ３は、対向する表面４１５と表面４１３との間の距離に等しい。図示されている実施形態では、表面４１５は、第１の蹴上げ４１０、第２の蹴上げ４２０及び第３の蹴上げ４３０から遠位にある。図示されている実施形態では、表面４１１は、第１の蹴上げ４１０と第２の蹴上げ４２０との間に延在し、また表面４１１は、表面４１５に対して平行である。同様に、表面４１２は、第２の蹴上げ４２０と第３の蹴上げ４３０との間に延在し、また表面４１２は、この実施形態では表面４１５に対して平行である。更に、表面４１３は、表面４１５に対して平行であり、また蹴上げ４３０から、流入口部分４０７から遠位にある乳化デバイス４００の端部まで延在する。図示されている実施形態では、第１の蹴上げ４１０、第２の蹴上げ４２０及び第３の蹴上げ４３０は、表面４１５に対して垂直である。

例示的実施形態では、ＳＳＨ１（「第２の」チャネル［例えばチャネル４０５］の上記第１段高さ）は、ＦＳＨ１（「第１の」チャネル［例えばチャネル３０５］の上記第１段高さ）より大きい。更に、ＳＳＨ２（「第２の」チャネルの上記第２段高さ）は、ＦＳＨ２（「第１の」チャネルの上記第２段高さ）より大きい。従ってチャネル４０５のジオメトリは、チャネル３０５によって形成される液滴の直径より大きい直径を有する液滴を形成するよう構成される。特定の実施形態では、ＳＳＨ１は、ＦＳＨ１より少なくとも５０％大きく、また特定の実施形態では、ＳＳＨ１は、ＦＳＨ１より少なくとも１００％大きい。更にＳＳＨ２は、いくつかの実施形態では、ＦＳＨ２より少なくとも５０％大きくてよい。このようなジオメトリにより、チャネル４０５は、チャネル３０５によって生成される液滴の直径より少なくとも５０％大きい直径を有する液滴を生成できる。特定の実施形態では、ＳＳＨ２は、ＦＳＨ２より少なくとも１００％大きくてよく、これによりチャネル４０５は、チャネル３０５によって生成される液滴の直径より少なくとも１００％大きい直径を有する液滴を生成できる。特定の実施形態では、ＳＳＨ３はＦＳＨ３に等しくてよく、これは、チャネル４０５、３０５によって形成される液滴が、乳化デバイス５００の共通のエリアに向かうためである（図面中の図は、そうでないことが注記されていない限り、正確な縮尺ではないことが理解される）。

図９において説明したもののような特定の実施形態では、図１〜３の議論において既に説明したように、チャネル３０５によって形成される液滴の直径は、流入口部分３０７の寸法ＣＨ又はＣＷ（どちらの方が小さいかにかかわらず）によって主に決定され得、またＦＳＨ１によって二次的に決定され得る。

ここで図１１を参照すると、チャネル３０５の代替実施形態が示されている。この実施形態は、ＦＳＨ３の値がＳＳＨ３の値に等しくないことを除いて、図９に図示及び説明されている実施形態と同等であり、従ってこの実施形態は、液滴の前進を提供するための追加の段を備える。

チャネル３０５、４０５によって形成される各液滴の体積は、（球形の液滴を想定すると）上記液滴の直径の３乗に比例する。図９、１０に示されている実施形態では、流入口部分４０７に関する寸法ＣＨ、ＣＷのうちの小さい方が、流入口部分３０７に関する寸法ＣＨ、ＣＷのうちの小さい方より少なくとも５０％大きい場合、チャネル４０５によって形成される液滴の直径は、チャネル３０５によって形成される液滴の直径より少なくとも５０％大きい。結果として、チャネル４０５によって形成される液滴の体積は、チャネル３０５によって形成される液滴の体積より、少なくとも３．３７５倍大きくなる。同様に、流入口部分４０７に関する寸法ＣＨ、ＣＷのうちの小さい方が、流入口部分３０７に関する寸法ＣＨ、ＣＷのうちの小さい方より少なくとも１００％大きい場合、チャネル４０５によって形成される液滴の直径は、チャネル３０５によって形成される液滴の２倍の直径のものである。従って、チャネル４０５によって形成される液滴の体積は、チャネル３０５によって形成される液滴の体積より、少なくとも８倍大きくなる。本明細書に記載の寸法比は単なる例であること、及び他の実施形態は、本開示において提供されているもの以外の値を有するチャネル寸法を備えてよいことが理解される。

ここで図１２を参照すると、異なるサイズの液滴が含まれていることを示すために、チャネル４０５、３０５によって形成される液滴の概略図が示されている。この実施形態では、複数の液滴４５４がチャネル４０５によって形成され、その一方で複数の液滴３５４がチャネル３０５によって形成される。図示されているように、複数の液滴４５４内の各液滴は、液滴３５４それぞれの直径Ｄ３より大きい直径Ｄ４を備える。この実施形態では、Ｄ３は、流入口部分３０７の寸法ＣＨ又はＣＷによって決定される。同様にＤ４は、流入口部分４０７の寸法ＣＨ又はＣＷによって決定される。

図１２に示されているような様々な体積の液滴を生成できる能力は、デジタルＰＣＲ分析中に多大な便益を提供できる。例えば、複数の体積の液滴を使用すると、所与の空間量及び全体の体積に対して、より大きいダイナミックレンジが提供される。

均一な体積の液滴を使用するシステムでは、検出の上限は主に、各液滴の体積によって制御される。検出の下限は一般に、合計体積によって制御され、従って均一液滴システムで生成される液滴の数によって制御される。従って、均一液滴システムにおける大きいダイナミックレンジは、体積が小さい液滴を極めて多数必要とする。様々な体積の液滴を生成することによって、均一液滴システムに比べて、提供される所与の体積及びエリアに関して、ダイナミックレンジを増大させることができる。検出の上限は、体積が低減された液滴を用いることによって上昇させることができる。更に検出の下限は、体積が増大した液滴を用いることによって低下させることができ、これにより、同一のエリア内でより多くの試料体積を処理できる。

図１３は、異なる複数のエリアに関する異なる複数のダイナミックレンジの図解を提供する。図示されているように、直径１２０μｍの液滴で低いダイナミックレンジ（例えば４〜５ログ）を得るには、３１７平方ミリメートルが必要となる。直径２７μｍの液滴を用い、希釈又は再構成を行わずに、高いダイナミックレンジ（例えば７〜８ログ）を得るには、１４１３平方ミリメートルが必要となる。直径１２０μｍの液滴を用い、２つのチャンバ内で１００倍に希釈して、同様に高いダイナミックレンジを得るには、６３４平方ミリメートルが必要となる。対照的に、直径２７μｍ及び直径１２０μｍ両方の液滴を用い、２つのチャンバでの再構成を用いて、７〜８ログの高いダイナミックレンジを得るには、３７３平方ミリメートルの空間しか必要でない。従って、異なる複数の直径を有する液滴の使用により、均一なサイズ及び体積の液滴を利用するシステムに比べて、より高いダイナミックレンジを提供でき、及び／又は必要な空間をより小さくすることができる。

既に記載した実施形態は、１つ又は２つの異なる直径の液滴を生成するよう構成されるが、他の実施形態は、３つ以上の異なる直径の液滴を生成するよう構成してよい。ここで図１４を参照すると、乳化デバイス９００は、それぞれ流体供給チャネル６５５、７５５、８５５を備える、複数のチャネル６００、７００、８００を備える。更にデバイス９００は、チャネル６００、７００、８００それぞれのための回収チャンバ６５０、７５０、８５０を備える。例示的実施形態では、回収チャンバ６５０、７５０、８５０は、異なる直径の液滴を収容するために、異なる高さを有してよい。デバイス９００は更に、廃棄材料（例えば過剰な流体又は液滴）が乳化デバイス９００を出て廃棄物回収チャンバに向かうことができるよう構成された、廃棄物チャネル９５０を備える。

エマルジョン
本明細書において開示される様々な実施形態は、非水性連続相中に複数の水性液滴を含む、油中水エマルジョンを採用する。上記水性液滴の全て又はサブセットは、関心対象の分析物を含有してよい。エマルジョンは、２つの不混和性相（例えば水及び油）を、場合によっては１つ又は複数の界面活性剤の存在下で組み合わせることによって形成される。基本的なタイプのエマルジョンは、水中油（ｏ／ｗ）、油中水（ｗ／ｏ）、及び両連続エマルジョンである。液滴ベースの生物学的アッセイでは、エマルジョンは典型的には、水性相にアッセイ試薬（例えばＰＣＲプライマー、塩、酵素等）が含有された油中水エマルジョンである。「油」相は、単一の油、又は異なる複数の油の混合物であってよい。いずれの好適な非水性流体が、本明細書において開示されるエマルジョンの非水性連続相を形成してよい。いくつかの実施形態では、上記非水性連続相は、鉱油、シリコーン油、又はフッ素化油（例えばＦｌｕｏｒｉｎｅｒｔ（登録商標）ＦＣ‐４０［Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ］）を含む。

エマルジョンは、１つ又は複数の乳化剤を含めることによって安定化させることができ、上記乳化剤は、水／油界面において作用して、相の分離を防止するか又は遅延させる。乳化剤はまた、アレイ上の隣接した液滴が混ざり合うのを阻害することもできる。本明細書において開示される組成物もまた、１つ又は複数の乳化剤を含有してよい。特定の実施形態では、上記乳化剤は、非イオン界面活性剤又はブロッキングタンパク質を含む。非イオン界面活性剤の非限定的な例としては、Ｔｗｅｅｎ ２０（ポリソルベート２０）、ＴｒｉｔｏｎＴＭ Ｘ‐１００（４‐（１，１，３，３‐テトラメチルブチル）フェニル‐ポリエチレングリコール）、Ｓｐａｎ（登録商標）８０（ソルビタンモノオレエート）、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、オクチルフェノキシエトキシエタノールが挙げられる。コール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウムといったイオン性界面活性剤も、乳化剤として使用してよい。乳化剤の更なる例としては、ポリシロキサン‐ポリセチル‐ポリエチレングリコールコポリマー等のシリコーン系界面活性剤；パーフルオロ化ポリエーテル（ＰＦＰＥ）及びＰＦＰＥ‐ＰＥＧコポリマー等のフルオロ界面活性剤；並びにコレステロールが挙げられる。ブロッキングタンパク質の非限定的な例としては、ウシ血清アルブミン、アセチル化ウシ血清アルブミンといった血清アルブミンが挙げられる。

特定の実施形態では、上記エマルジョンは、様々な試薬又は分析物が上記エマルジョンの液滴中に含有されるように調製される。特定の実施形態では、特定の分析物又は試薬を、これもまた液滴内に配置される固体支持体に付着させてよい。例えば、プローブ及び／又はプライマーを固体支持体に付着させてよい。このような固体支持体は例えば、マイクロスフィア（例えばビーズ）、又はマイクロ粒子、金若しくは他の金属のナノ粒子、量子ドット若しくはナノドットといった他の粒子であってよい。特定の態様では、上記粒子は、磁性、強磁性又は超強磁性であってよい。マイクロスフィア、ビーズ及び粒子の例は、Ｆｕｌｔｏｎによる米国特許第５，７３６，３３０号、Ｃｈａｎｄｌｅｒらによる米国特許第５，９８１，１８０号、Ｆｕｌｔｏｎらによる米国特許第６，０５７，１０７号、Ｃｈａｎｄｌｅｒらによる米国特許第６，２６８，２２２号、Ｃｈａｎｄｌｅｒらによる米国特許第６，４４９，５６２号、Ｃｈａｎｄｌｅｒらによる米国特許第６，５１４，２９５号、Ｃｈａｎｄｌｅｒらによる米国特許第６，５２４，７９３号、Ｃｈａｎｄｌｅｒらによる米国特許第６，５２８，１６５号に例示されており、これらの特許文献は参照によって本出願に援用される。

液滴の撮像
例示的実施形態では、上記液滴を、多用な技法によって撮像してよい。撮像を容易にするために、上記液滴を含有する組成物をある表面上に、上記液滴が上記表面上に略単層として配置されるように分散させてよい。上記撮像表面は例えば、スライド上、又はガラス、プラスチック若しくは石英チャンバといったチャンバ内に存在してよい。上記液滴、及び上記液滴中の標識された分析物又は反応産物は、撮像システムを用いて検出できる。例えば、標識された増幅産物を検出するステップは、上記標識された増幅産物から放出される蛍光波長及び／又は蛍光強度を撮像するステップを含んでよい。上記液滴がコード化マイクロスフィア等のコード化粒子を含有する実施形態では、上記撮像するステップは、上記コード化粒子のデコード画像を取得するステップ、及び上記液滴中の増幅産物を検出するためのアッセイ画像を得るステップを含んでよい。上記デコード画像と上記アッセイ画像との比較により、複数の蛍光体の組み合わせを用いることによるより高い多重化能力が可能となる。本発明の方法は更に、直接又は間接的に標識された増幅産物からの信号を、試料中のＤＮＡ又はＲＮＡの濃度と相関させるステップを含んでよい。本明細書において開示される方法及び組成物と共に使用するために適合させることができる撮像システムの例は、米国特許第８，２９６，０８８号及び米国公開特許第２０１２／０２８８８９７号に記載されており、これらは参照によって本出願に援用される。

上記液滴を、いずれの好適な光源を用いて照明してよい。上記光源は、発光ダイオード（ＬＥＤ）又はレーザといった光源によって放出されて、撮像領域に直接又は光導波路を介して送達された光を用いて、広範な照明（即ち撮像領域の全エリア又は比較的大きなエリアに亘って同時に提供される照明）を提供するよう構成してよい。あるいは上記照明源は、上記撮像領域中の比較的小さいスポットの照明を提供するよう構成してよく、また上記システムは、上記撮像領域に亘って、上記比較的小さいスポットを走査するよう構成してよい。このようにして、上記照明は、１つ若しくは複数のＬＥＤ、１つ若しくは複数のレーザ、１つ若しくは複数の他の好適な光源、又はこれらの何らかの組み合わせから生成された集束光の比較的「微小なフライングスポット（ｔｉｎｙ ｆｌｙｉｎｇ ｓｐｏｔ）」として構成してよい。上記照明された液滴を撮像するステップは、光感受性検出器を用いて、上記チャンバの上記撮像領域から放出又は反射された光を検出するステップを含んでよい。光感受性検出器の非限定的な例としては、光電子増倍管（ＰＭＴ）、アバランシェフォトダイオード、ＣＣＤ、ＣＭＯＳ又は量子ドットカメラが挙げられる。

上記液滴は、蛍光体、量子ドット、希土類金属及び化学発光化合物を含むがこれらに限定されない、標識剤を含んでよい。上記標識剤は、自由に浮遊してよく、分析物に付着してよく、試薬（例えばプライマー、プローブ若しくは抗体）に付着してよく、磁性粒子に付着してよく、又はこれらのいずれの組み合わせであってよい。特定の実施形態では、上記標識剤は、１つ若しくは複数の標識されたプライマー、又はｄｓＤＮＡ結合染料である。一実施形態では、上記１つ又は複数の標識されたプライマーは、蛍光体／クエンチャのペア又はＦＲＥＴペアを含む。

撮像チャンバは、単一のタイプの材料又は複数の材料で構成してよい。いくつかの実施形態では、上記撮像チャンバの少なくとも１つの部分は、特に上記撮像領域の近傍に、光学的に透明な材料（限定するものではないが、光学的に透明なガラス、プラスチック又は石英等）を含み、これにより、照明ビームは上記撮像チャンバを通過して、撮像領域中の液滴を撮像できる。場合によっては、少なくとも上記撮像領域に対応する上記撮像チャンバの後部は、上記照明システムによって放出された光の波長にとって無視できる反射率及び透過率を提供するよう構成してよい。

アッセイ
広範な分析物に対する多数のタイプのアッセイを、液滴の内部で実施してよい。液滴内にある分析物は、（ＤＮＡ又はＲＮＡを含む）核酸、（酵素又は抗体を含む）タンパク質、ホルモン、炭水化物及び細胞を含むがこれらに限定されない、いずれの関心対象の分析物であってよい。検出、増幅、評価等を行われる分析物のタイプに応じて、液滴中に追加の成分を投入してよい。例えば上記分析物が標的核酸である場合、水性液滴は更に、プライマー、ポリメラーゼ、ＭｇＣｌ₂、バッファ、標識剤及び／又はｄＮＴＰといった、１つ又は複数のＰＣＲ試薬を含んでよい。一実施形態では、１種類のプライマーを、上記液滴中に配置された固体支持体に付着させる。上記固体支持体は例えば、マイクロスフィア又はナノスフィアであってよい。更なる例では、上記分析物がタンパク質である場合、上記水性液滴は更に、抗体、酵素、酵素基質、標識剤及び／又はＢＳＡのうちの１つ又は複数を含んでよい。検出を容易にするために、分析物又は反応産物を、蛍光体、量子ドット、希土類金属及び化学発光化合物等の標識剤を用いて、直接又は間接的に標識してよい。上記標識剤は、自由に浮遊してよく、分析物に付着してよく、試薬（例えばプライマー、プローブ若しくは抗体）に付着してよく、磁性粒子に付着してよく、又はこれらのいずれの組み合わせであってよい。特定の実施形態では、上記標識剤は、１つ若しくは複数の標識されたプライマー、又はｄｓＤＮＡ結合染料である。一実施形態では、上記１つ又は複数の標識されたプライマーは、蛍光体／クエンチャのペア又はＦＲＥＴペアを含む。いくつかの実施形態では、上記標識剤は、ストレプトアビジン結合酵素及び蛍光発生基質を含む。一実施形態では、上記ストレプトアビジン結合酵素は、ストレプトアビジン結合βガラクトシダーゼであり、上記蛍光発生基質は、レゾルフィンβ‐Ｄ‐ガラクトピラノシドである。

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、液滴内で実施され得る反応の例である。特に液滴は、デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）技法において有用である。ｄＰＣＲは、試料に含有された個々の核酸分子が、マイクロウェルプレート内の独立した複数のウェル、エマルジョンの分散相、又は拡散結合表面のアレイといった、多くの別個の領域に局在化されるように、上記試料を区画化するステップを伴う。各区画は（例えば液滴）は、０又は０超の分子を含有し、それぞれ陰性又は陽性反応を提供する。従来のＰＣＲとは異なり、ｄＰＣＲは、試料中の標的核酸の初期量を決定するために、多数の増幅サイクルに依存しない。従ってｄＰＣＲは、標的核酸の定量化のための指数的データへの依存を排除し、絶対定量化をもたらす。エマルジョン中のビーズ上で核酸をクローン的に増幅する、ビーズエマルジョンＰＣＲは、反応物が複数の液滴へと分割されるｄＰＣＲ技法の一例である。例えば米国特許第８，０４８，６２７号、米国特許第７，８４２，４５７号（これらは参照によって本出願に援用される）を参照。以下でより詳細に議論するようにｄＰＣＲをエマルジョン中で実施する場合、上記エマルジョンは、熱サイクル条件に耐えられるよう、熱安定性である必要がある。

エマルジョン中でｄＰＣＲを実施する様々な方法が存在する。例えばあるアプローチでは、ＤＮＡ試料を適切な濃度まで希釈し、ＰＣＲ試薬（プライマー、ｄＮＴＰ等）と混合し、上述のようにエマルジョン中の液滴内にカプセル化することにより、多数の別個の反応物試料が得られる。液滴をＰＣＲ熱サイクルに供し、アンプリコンが、上述のような蛍光（又は他の好適なレポータ）撮像によって検出される。

別のアプローチでは、コード化マイクロスフィアも上記液滴に含有される。上記マイクロスフィアは、プライマーを固定するために使用できる。異なるプライマーを異なるコード化マイクロスフィアに固定することにより、異なる複数のプライマーそれぞれ、及び対応するアンプリコンを、これらが付着したコード化マイクロスフィアによって識別できる。ビーズエマルジョンＰＣＲの例は、米国特許第８，０４８，６２７号に記載されており、これは参照によって本出願に援用される。しかしながら、米国特許第８，０４８，６２７号に記載の技法は、上記エマルジョンを破壊するステップ、及びそれに続いて磁石を用いてビーズを単離し、上記ビーズ上のシーケンスを分析するステップを伴うことに留意されたい。対照的に、本開示に記載の方法及び組成物を用いると、アンプリコンを液滴内で（例えばエマルジョンを破壊することなく）検出できる。

上記液滴の熱サイクルは、当該技術分野において公知のいずれの好適な方法で実施してよい。例えば液滴を、加熱及び冷却が可能なチューブ又はチャンバ内で、熱サイクルに供してよい。いくつかの実施形態では、本方法は、核酸テンプレートを増幅するために、連続流増幅を採用する。連続流増幅の様々な方法が報告されている。例えば米国特許第７，９２７，７９７号（これは参照によって本出願に援用される）は、連続流ＰＣＲと併用される油中水エマルジョンを記載している。熱伝達要素を横断するエマルジョンの連続流により、効率的かつ迅速な反応サイクルが可能となり、またこれは、熱増幅反応（例えばＰＣＲ）又は等温反応（例えばローリングサークル増幅、全ゲノム増幅、ＮＡＳＢＡ若しくは鎖置換増幅）のために使用できる。特定の実施形態では、上記エマルジョンは、連続流増幅に続いて、撮像領域へと直接流される。

単一分子イムノアッセイ及び酵素アッセイを液滴中で実施することもできる（例えばＳａｋａｋｉｈａｒａ ｅｔ ａｌ．， “Ａ ｓｉｎｇｌｅ‐ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｓｓａｙ ｉｎ ａ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ ｆｅｍｔｏｌｉｔｅｒ ｄｒｏｐｌｅｔ ａｒｒａｙ，” Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ １０：３３５５‐３３６２ （２０１０）； Ｓｉｓｔａ ｅｔ ａｌ．， “Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ Ｕｓｉｎｇ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｂｅａｄｓ Ｏｎ ａ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｐｌａｔｆｏｒｍ，” Ｌａｂ Ｃｈｉｐ． ８（１２）：２１８８‐２１９６ （２００８）を参照）。

動作例
本開示によるある例示的実施形態の第１の動作例では、液滴を、以下の寸法を有する単一の多段ノズルを備えた乳化デバイスを用いて生成した：ＣＨ＝２０μｍ、ＣＷ＝６０μｍ、ＳＨ１／ＣＨ＝１．５、ＳＨ２／ＣＨ＝１．７５。上記多段チャネルの表面を、疎水性パーフルオロデシルトリクロロシラン（ＦＤＴＳ）でコーティングした。この例では、界面活性剤（液滴を安定させるため；ＰＦＰＥ‐ＰＥＧ‐ＰＦＰＥ）と混合された化学的に不活性の油（Ｆｌｕｏｒｉｎｅｒｔ（登録商標）ＦＣ‐４０）を、上記デバイス内に配置した。水中の、ＡＰ５５９蛍光染料と結合させたオリゴヌクレオチドの２μＭ溶液を、流量１〜１００ｎＬ／秒で、上記多段チャネルの流入口部分へと向けた。１秒あたり１〜３０個の液滴という生成速度で、またおよそ３．８％の平均分散パーセンテージで、直径およそ１２０ミクロンの液滴が形成された。

本開示によるある例示的実施形態の第２の動作例では、９９個のノズルを備えた乳化デバイスを用いて、１分あたりおよそ２００００個の液滴という生成速度で液滴を生成した。この例では、上記液滴の平均直径はおよそ１２２ミクロンであり。分散率はおよそ９％であった。この例における分散率は、一貫性のない液滴を生成する単一の欠陥ノズルのために、予想よりも高かったと考えられる。これらのノズルは、上記単一ノズル部において使用されたものと同一のジオメトリ：ＣＨ＝２０μｍ、ＣＷ＝６０μｍ、ＳＨ１／ＣＨ＝１．５、ＳＨ２／ＣＨ＝１．７５、ノズル１個につき１秒あたり１〜３０個の液滴という液滴生成速度であった。連続相流は、ＦＣ‐４０中の界面活性剤（ＰＦＰＥ‐ＰＥＧ‐ＰＦＰＥ）の溶液であり、分散相は、水中の、ＡＰ５５９蛍光染料と結合させたオリゴヌクレオチドの２μＭ溶液であった。

以上の明細書及び実施例は、ある例示的実施形態の構造及び使用の完全な説明を提供する。ある程度詳細に、又は１つ若しくは複数の独立した実施形態を参照して、特定の実施形態について上述したが、当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく、本開示の実施形態に多数の改変を行うことができる。従って、本デバイスの例示的実施形態は、開示されている特定の形態に限定されることを意図したものではない。寧ろこれらは、請求項の範囲内の全ての修正例及び代替例を含み、またここで示されているもの以外の実施形態は、図示されている実施形態の特徴のうちのある程度又は全てを含んでよい。更に、適切である場合には、上述の例のうちのいずれの態様を、記載されている他の例のいずれの態様と組み合わせることにより、同等の又は異なる特性を有する、同一の又は異なる問題に対処する更なる例を形成できる。同様に、上述の便益及び利点は、１つの実施形態に関連してよく、又は複数の実施形態に関連してもよいことが理解されるだろう。

請求項は、ミーンズ・プラス・ファンクション（ｍｅａｎｓ‐ｐｌｕｓ‐ｆｕｎｃｔｉｏｎ）又はステップ・プラス・ファンクション（ｓｔｅｐ‐ｐｌｕｓ‐ｆｕｎｃｔｉｏｎ）制限を含むものとして解釈されないものとする。ただし所与の請求項中において、それぞれ「…のための手段（ｍｅａｎｓ ｆｏｒ）」又は「…のためのステップ（ｓｔｅｐ ｆｏｒ）」という１つ又は複数の句を用いて、このような制限が明示的に記載されている場合を除く。

参考文献
以下の参考文献は、参照により本出願に援用される：
Ｓｕｇｉｕｒａ， “Ｉｎｔｅｒｆａｃｉａｌ Ｔｅｎｓｉｏｎ Ｄｒｉｖｅｎ Ｍｏｎｏｄｉｓｐｅｒｓｅｄ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ Ｃｈａｎｎｅｌ Ａｒｒａｙ”， Ｌａｎｇｍｕｉｒ ２００１， １７， ５５６２‐５５６６．
Ｄａｎｇｌａ， “Ｄｒｏｐｌｅｔ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ ｄｒｉｖｅｎ ｂｙ ｇｒａｄｉｅｎｔｓ ｏｆ ｃｏｎｆｉｎｅｍｅｎｔ”， ＰＮＡＳ； Ｊａｎｕａｒｙ １５， ２０１３； ｖｏｌ． １１０， ｎｏ． ３， ８５３-８５８．
米国特許第５，７３６，３３０号
米国特許第５，９８１，１８０号
米国特許第６，０５７，１０７号
米国特許第６，２６８，２２２号
米国特許第６，４４９，５６２号
米国特許第６，５１４，２９５号
米国特許第６，５２４，７９３号
米国特許第６，５２８，１６５号
米国特許第７，８４２，４５７号
米国特許第７，９２７，７９７号
米国特許第８，０４８，６２７号
米国特許第８，２９６，０８８号
米国公開特許第２０１３／００７８１６４号
米国公開特許第２０１２／０２８８８９７号

Claims (25)

1. 乳化デバイスであって：
   チャネル高さＣＨ及び幅ＣＷを有する流入口部分を有するチャネルであって、比ＣＷ／ＣＨは０．２超かつ５．０未満である、チャネル；
   前記流入口部分と流体連通している第１段であって：
   前記第１段は、踏み板長さＴ１及び段高さＳＨ１を有し；
   ＳＨ１は、ＣＨよりも蹴上げ高さＲ１だけ大きく；
   比ＳＨ１／ＣＨは、１．０超かつ５．０未満である、第１段；
   前記第１段と流体連通している第２段であって：
   前記第２段は、踏み板長さＴ２及び段高さＳＨ２を有し；
   ＳＨ２は、ＳＨ１よりも蹴上げ高さＲ２だけ大きく；
   比ＳＨ２／ＣＨは、１．０超かつ５．０未満であり、
   比Ｔ２／ＣＨは、比Ｔ１／ＣＨ未満である、第２段；
   前記第２段と流体連通している第３段であって：
   前記第３段は、段高さＳＨ３を有し；
   ＳＨ３は、ＳＨ２より蹴上げ高さＲ３だけ大きく；
   Ｒ３はゼロより大きい、第３段
   を備える、乳化デバイス。
2. 前記比ＳＨ１／ＣＨは、１．０超かつ２．０未満である、請求項１に記載の乳化デバイス。
3. Ｒ３は５０ミクロンより大きい、請求項１に記載の乳化デバイス。
4. 比Ｔ１／ＣＨは３．０〜４．０である、請求項１に記載の乳化デバイス。
5. 比Ｔ２／ＣＨは２．０〜４．０である、請求項１に記載の乳化デバイス。
6. ＣＨは１０ミクロン〜５０ミクロンである、請求項１に記載の乳化デバイス。
7. 複数の流入口部分であって、前記複数の流入口部分の各流入口部分は、高さＣＨ及び幅ＣＷを有し、比ＣＷ／ＣＨは０．２超かつ５．０未満である、複数の流入口部分；
   複数の第１段であって、前記複数の第１段の各前記第１段は：
   前記複数の流入口部分のうちの１つの流入口部分と流体連通しており；
   長さＴ１及び高さＳＨ１を有し、ＳＨ１は、ＣＨよりも蹴上げ高さＲ１だけ大きく、比ＳＨ１／ＣＨは１．０超かつ５．０未満である、複数の第１段；
   複数の第２段であって、前記複数の第２段の各前記第２段は：
   前記複数の第１段のうちの１つの第１段と流体連通しており；
   前記第３段と流体連通しており；
   長さＴ２及び高さＳＨ２を有し、ＳＨ２は、ＳＨ１よりも蹴上げ高さＲ２だけ大きく、比ＳＨ２／ＣＨは１．０超かつ５．０未満である、複数の第２段
   を更に備える、請求項１に記載の乳化デバイス。
8. 前記複数の流入口部分は、１０〜１００個の前記流入口部分を備える、請求項７に記載の乳化デバイス。
9. エマルジョンを形成する方法であって、
   前記方法は：
   請求項１に記載の乳化デバイスを得るステップであって、第１段、第２段及び第３段は、略静止している第１の流体を内包する、ステップ；並びに
   第２の流体を、流入口部分に、そして前記第１段、前記第２段及び前記第３段を通して導入するステップ
   を含み、
   前記第２の流体の部分的な液滴は、前記第１段において形成され；
   前記第２の流体の完全な液滴は、前記第２段において形成され；
   前記第２の流体の前記完全な液滴は、前記第２段から前記第３段へと向けられる、方法。
10. 前記第２の流体は、関心対象の分析物およびアッセイ試薬を含有する、請求項９に記載の方法。
11. 前記第１の流体は疎水性液体であり、
    前記第２の流体は親水性液体である、請求項９に記載の方法。
12. 前記第１の流体は親水性液体であり、
    前記第２の流体は疎水性液体である、請求項９に記載の方法。
13. 前記第１の流体又は前記第２の流体は、乳化剤を含む、請求項９に記載の方法。
14. 前記乳化剤は、非イオン性界面活性剤またはブロッキングタンパク室を含む、請求項１３に記載の方法。
15. 前記第２の流体の前記完全な液滴は、前記第２段において、１秒に１〜３０個の完全な液滴という速度で形成される、請求項９に記載の方法。
16. 前記第２の流体の前記完全な液滴は、４０〜３００ミクロンの平均直径を有する、請求項９に記載の方法。
17. 前記第１の流体と前記第２の流体との間で形成される前記エマルジョンは、２〜１０％の単分散性を有する、請求項９に記載の方法。
18. エマルジョンを形成する方法であって、
    前記方法は：
    請求項７に記載の乳化デバイスを得るステップであって、複数の第１段、複数の第２段及び複数の第３段は、略静止している第１の流体を内包する、ステップ；並びに
    第２の流体を、複数の流入口部分に、そして前記複数の第１段、前記複数の第２段及び前記複数の第３段を通して導入するステップ
    を含み、
    前記第２の流体の部分的な液滴は、前記複数の第１段のそれぞれにおいて形成され；
    前記第２の流体の完全な液滴は、前記複数の第１段と前記複数の第２段との間の遷移中に形成され；
    前記第２の流体の前記完全な液滴は、前記複数の第２段から前記第３段へと向けられる、方法。
19. １分に少なくとも１００００個の前記完全な液滴が、前記複数の第２段から前記第３段へと向けられる、請求項１８に記載の方法。
20. 前記液滴は、１０％未満の平均分散を有する、請求項１９に記載の方法。
21. 前記第３段における前記液滴の平均液滴直径は、４０〜３００ミクロンである、請求項１８に記載の方法。
22. 複数の第１段であって、前記複数の第１段の各前記第１段は：
    前記複数の流入口部分のうちのそれぞれと流体連通しており；
    長さＴ１及び高さＳＨ１を有し、ＳＨ１は、ＣＨよりも蹴上げ高さＲ１だけ大きく、比ＳＨ１／ＣＨは１．０超かつ５．０未満である、複数の第１段、
    を更に備える、請求項７に記載の乳化デバイス。
23. 複数の第２段であって、前記複数の第２段の各前記第２段は：
    前記複数の第１段のうちの１つの第１段と流体連通しており；
    前記第３段と流体連通しており；
    長さＴ２及び高さＳＨ２を有し、ＳＨ２は、ＳＨ１よりも蹴上げ高さＲ２だけ大きく、比ＳＨ２／ＣＨは１．０超かつ５．０未満である、複数の第２段
    を更に備える、請求項２２に記載の乳化デバイス。
24. 単一の連続した第１段であって、前記単一の連続した第１段の各前記第１段は：
    前記複数の流入口部分のうちのそれぞれと流体連通しており；
    長さＴ１及び高さＳＨ１を有し、ＳＨ１は、ＣＨよりも蹴上げ高さＲ１だけ大きく、比ＳＨ１／ＣＨは１．０超かつ５．０未満である、複数の第１段、
    を更に備える、請求項７に記載の乳化デバイス。
25. 単一の連続した第２段であって、前記単一の連続した第２段の各前記第２段は：
    前記複数の第１段のうちの１つの第１段と流体連通しており；
    前記第３段と流体連通しており；
    長さＴ２及び高さＳＨ２を有し、ＳＨ２は、ＳＨ１よりも蹴上げ高さＲ２だけ大きく、比ＳＨ２／ＣＨは１．０超かつ５．０未満である、複数の第２段
    を更に備える、請求項２４に記載の乳化デバイス。

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