CN114929886A - 用于筛选和后续处理取自非无菌场所的样本的方法 - Google Patents

用于筛选和后续处理取自非无菌场所的样本的方法 Download PDF

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Abstract

一种分析包含一种或多于一种微生物种的样本的方法可以包括：生成第一液滴，使得样本的第一部分的一种或多于一种微生物中的每一种被包封在第一液滴的一个内，和对于样本的第二部分的一个或多于一个等分试样中的每一个，生成第二液滴，使得等分试样的一种或多于一种微生物中的每一种被包封在第二液滴中的一个内。可以捕获第一组数据和第二组数据，第一组数据指示样本的第一部分的被包封微生物的身份和数量，第二组数据指示等分试样的被包封微生物对一种或多于一种测试试剂的表型反应。至少通过将第二组数据与第一组数据进行对比，能够确定目标种对测试试剂的表型反应。

Description

用于筛选和后续处理取自非无菌场所的样本的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年8月20日提交的美国临时专利申请序列号62/889414的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明一般地涉及微生物的识别和表型分析，更具体地但不限于涉及使用液滴微流体识别取自非无菌场所的样本中的致病性微生物，并确定其对一种或多于一种测试试剂的表型反应。
背景技术
对取自非无菌场所的样本进行分析可能会带来挑战，因为这些样本可能包括致病性微生物和共生微生物。例如，为了确定适当的患者护理，可能需要识别致病性微生物的身份，并且可能需要评估病原体对各种药物(例如抗生素)的反应，而不是共生微生物的反应。当前用于识别非无菌样本中病原体的技术(例如定量培养、定量聚合酶链反应(QPCR)和核酸扩增测试(NAAT))可能效率低下、昂贵且复杂。例如，在定量培养中，培养并使得样本中的微生物能够实现可识别的生长需要约1至2天。QPCR通常是昂贵的，并且可能仅能够识别一些病原体。并且由于与每种技术相关的复杂工作流程，定量培养、QPCR和NAAT通常必须由技术人员执行。
当样本中还存在共生微生物时，用于例如确定病原体对抗生素的敏感性的常规方法(例如抗生素敏感性测试(AST))可能效率低下、耗时长和/或不准确。例如肉汤微量稀释法和纸片扩散法的表型测试方法通常需要对样本进行额外的培养，这延长了分析所需的时间量。此外，在这些过程中，致病性微生物必须与共生微生物分离(例如，通过将样本划过板)，这是时间和工作密集型的，并且需要技术人员。基因型测试方法(例如NAAT)可能不如表型方法准确，因为它们基于遗传信息间接评估病原体的反应，并且可能无法分析所有种类的病原体或考虑基因突变。例如，NAAT通常针对指示抗性机制的分子标志物。为此，可能必须为每种相关标志物准备独特的引物。当存在大量标志物时，为每种标志物开发特定的引物具有挑战性，并且在没有合适引物的情况下，相关标志物可能会遗漏。此外抗性机制能够进化，这是NAAT可能无法考虑的。
发明内容
因此，本领域需要以快速、节省成本和有效的方式分析取自非无菌场所的样本的方法。本方法和***能够通过使用液滴微流体来满足这种需求。至少通过由包含样品的第一部分的第一液体生成多个第一液滴能够分析样本的第一部分以识别和量化其中的微生物。样本的第一部分的一种或多于一种微生物中的每种能够被包封在第一液滴中的一个中，第一液滴能够具有相对低的容积(例如，纳升或皮升的量级)，使得被包封的微生物的浓度能够相对较高。这可以允许对样本的第一部分进行分析而无需在定量培养和QPCR中进行的冗长培养。并且能够使用易于装载的第一微流体芯片来生成液滴。
为了识别和量化微生物，包封的第一液滴中的每个能够包含生存力指示剂和单一种，使得液滴具有特有特征(例如，随时间变化的荧光)，该特有特征至少部分地归因于包封的种。以这种方式，包封不同种的液滴能够具有不同的特征，从而允许将它们区分。包括这些特有特征的第一组数据能够被捕获和分析，以确定样本的第一部分的微生物的身份(例如，基于特有特征)和数量(例如，基于表现出特定微生物诱导的特征的液滴数量)。基于该数据(例如，如果数据指示样本中种的浓度高于阈值浓度)，能够将至少一种微生物种识别为目标(例如，致病性)种。
如果测试为阴性(例如，未检测到病原体)，则无需进行进一步分析以节省进一步测试的费用。如果识别了目标种，则能够分析样本的第二部分以确定目标种对一种或多于一种测试试剂的表型反应，例如目标种对一种或多于一种抗生素的敏感性。该分析能够使用液滴微流体以与以上所述的基本相同的方式进行。对于样本的第二部分的一个或多于一个等分试样中的每一个，能够由包含该等分试样的第二液体生成多个第二液滴，使得该等分试样的一种或多于一种微生物中的每一种被包封在第二液滴的一个中。第二液滴中的每个能够包含生存力指示剂(例如，用于上述识别和定量的生存力指示剂)，并且能够将测试试剂引入到第二液滴的至少一些中。能够捕获包括包封第二液滴的所得到的特有特征的第二组数据。测试试剂可以影响包封液滴中的每个的特有特征(例如，通过杀死或抑制置于其中的微生物的生长)，能够基于这些变化是否存在来确定包封的微生物的表型反应。
为了确定目标种的表型反应，第二组数据能够与第一组数据进行对比。因为表型分析可以在初始筛选之后进行，所以样本的第二部分中的微生物的相对浓度可能与原始样本中的不同(例如，因为微生物能够复制)。例如，当样本中存在多种微生物的种时，这些种能够具有不同的复制速率，具有相对较快复制速率的共生微生物可能在样本的第二部分中出现致病性。通过将第二组数据与第一组数据进行对比(这能够较好地指示原始微生物浓度)，能够识别用于研究的相关种以及相关的特有特征，使得表型测试能够适当地评估测试试剂对目标(例如，致病性)而不是非目标(例如，共生)种的效果。因为这种方法允许区分包封不同种的液滴，所以不需要进行耗时费力的分离(例如，通过划线)，从而使该测试比定量培养和QPCR更有效。而且由于分析是表型的，它能够比NAAT更准确。
质谱法也能够用于在初始筛选后以更高的分辨率识别微生物。例如，第一液滴中的至少一些能够从微流体芯片中除去并设置在板上。能够确定被去除的包封微生物的第一液滴的位置，以确定从哪里开始筛选，从而加速分析。能够干燥液滴并且能够裂解包封的微生物以准备质谱分析。质谱仪能够是基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱仪。
分析包含一种或多于一种的微生物种、任选两种或多于两种微生物种的样本的一些方法包括利用第一装置由第一液体生成多个第一液滴。在一些方法中，第一液体包含样本的第一部分，使得样本的第一部分的一种或多于一种微生物中的每一种被包封在第一液滴中的一个内。一些方法包括利用一个或多于一个传感器来捕获第一组数据，第一组数据指示样本的第一部分的包封的微生物的身份和数量。在一些方法中，第一组数据包括在第一测试周期内的第一液滴中的至少一些的荧光的测量值。
一些方法包括基于第一组数据将样本的一种或多于一种微生物种中的至少一种识别为目标种。在一些方法中，对于一种或多于一种微生物种中的每一种，将一种或多于一种微生物种中的至少一种识别为目标种包括基于第一组数据计算样本中种的浓度，并且如果浓度大于或等于阈值浓度，则将该种识别为目标种。
对于样本的第二部分的一个或多于一个等分试样中的每一个，一些方法包括使用第二装置由包含该等分试样的第二液体生成多个第二液滴，使得该等分试样的一种或多于一种微生物中的每一种被包封在第二液滴的一个中。在一些方法中，对于等分试样中的至少一个，任选地通过将测试试剂引入等分试样中来将测试试剂引入第二液滴中的至少一些中。在一些方法中，测试试剂包含抗生素。一些方法包括利用一个或多于一个传感器来捕获第二组数据，第二组数据指示样本的第二部分的包封的微生物对每种测试试剂的表型反应。在一些方法中，第二组数据包括第二液滴中的至少一些在第二测试周期内的荧光的测量值。一些方法包括至少通过将第二组数据与第一组数据对比来确定目标种对每种测试试剂的表型反应。在一些方法中，目标种对每种测试试剂的表型反应包括目标种对抗生素的敏感性。
一些方法包括从第一装置除去第一液滴中的至少一些，除去的第一液滴包括样本的第一部分的包封的微生物中的至少一些。一些方法包括将除去的第一液滴设置于板上并且干燥，任选地使得除去的第一液滴的基本上所有液体蒸发。在一些方法中，将基质材料添加至板。一些方法包括使用质谱仪捕获指示除去的第一液滴的被包封的微生物的身份的光谱数据，其中，任选地，质谱仪是基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱仪。在一些方法中，确定包含被包封的微生物的除去的第一液滴中的一个在板上的位置。
在一些方法中，第一装置包括第一芯片和/或第二装置包括第二芯片。在一些方法中，第一芯片和第二芯片中的至少一个限定了微流体网络，该微流体网络包括一个或多于一个入口端口、测试容积以及在入口端口与测试容积之间延伸的一个或多于一个流动路径。在一些方法中，由第一液体生成第一液滴和/或对于由第二液体生成第二液滴的等分试样中的每个包括将液体设置在第一入口端口内并引导液体沿着流动路径，使得对于流动路径中的每个，液体的至少一部分从第一入口端口流过至少一个液滴生成区域，其中流动路径的最小横截面积沿流动路径增加，并达到测试容积。在一些方法中，捕获第一组数据包括分析设置在第一芯片的测试容积中的第一液滴和/或捕获第二组数据包括分析设置在第二芯片的测试容积中的每个中的第二液滴。
在一些方法中，对于微流体网络中的至少一个、对于流动路径中的至少一个，在液滴生成区域中的至少一个中，流动路径包括收缩段、恒定段和扩张段，使得从第一入口端口流向测试容积的液体被允许离开收缩段、进入恒定段并流向扩张段。在一些方法中，恒定段的深度比收缩段的深度大至少50％，并且任选地，沿着恒定段的长度的至少90％基本上相同。在一些方法中，扩张段的深度随着远离恒定段而增加。
在一些方法中，对于第一微流体芯片，微流体网络包括一个或多于一个出口端口以及在测试容积与出口端口之间流体连通的一个或多于一个出口通道。在一些方法中，生成第一液滴使得第一液滴中的至少一些从测试容积流动通过出口通道，并进入出口端口。一些方法包括从出口端口除去第一液滴中的至少一些。
术语“耦合”定义为连接，尽管不一定是直接地连接，也不一定是机械地连接；“耦合”的两个项目可能彼此是一体的。除非本公开另有明确要求，否则术语“一”和“一个”被定义为一个或多于一个。如本领域普通技术人员所理解的，术语“基本上”被定义为在很大程度上但不一定完全是指定的，并且包括指定的内容；例如，基本上90度包括90度，并且基本上平行包括平行。在任何公开的实施方案中，术语“基本上”可以被指定的“在[百分比]内”替代，其中百分比包括0.1％、1％、5％和10％。
术语“包括”、“具有”以及“包括”是开放式连接动词。因此，“包含”、“具有”或“包括”一个或多于一个元素的装置具有那些一个或多于一个元素，但不限于仅具有那些元素。同样，“包含”、“具有”或“包括”一个或多于一个步骤的方法具有那些一个或多于一个步骤，但不限于仅具有那些一个或多于一个步骤。
任何装置、***和方法的任何实施方案能够由或基本上由任何所描述的步骤、元素和/或特征组成、而不是包含/包括/具有任何所描述的步骤、元件和/或特征。因此，在任何权利要求中，术语“由……组成”或“基本上由……组成”能够代替上面列举的任何开放式连接动词，以与使用开放式连接动词的权利要求相比改变给定权利要求的范围。
此外，以某种方式配置的装置或***至少以这种方式配置，但也可以以不同于具体描述的方式配置。
除非本公开或实施方案的性质被明确禁止，否则一个实施方案的一个或多于一个特征即使没有被描述或说明也可以应用于其他实施方案。
下面描述与上述实施方案和其他实施方案相关的一些细节。
附图说明
以下附图以示例而非限制的方式进行说明。为了简洁明了，给定结构的每个特征并不总是在该结构出现的每个图中都标记出来。相同的附图标记不一定表示相同的结构。相反，可以使用相同的附图标记来指示相似的特征或具有相似功能的特征，不同的附图标记也可以。除非另有说明，否则附图中的视图是按比例绘制的，这意味着至少对于视图中的实施方案，所描绘的元件的尺寸相对于彼此是准确的。
图1示出了本发明使用液滴微流体和任选的质谱法筛选和分析样本的方法中的一些。
图2是能够用于执行图1的至少一些方法的***的示意图。
图3A和图3B是定义微流体网络的芯片的示意图，所述微流体网络被配置为由样本的第一部分生成液滴。示出了使用中的芯片，其中包括样本的第一部分的液体被置于芯片的入口端口(图3A)并被引导至微流体网络的测试容积，从而生成液滴(图3B)。能够在测试容积中分析液滴，以确定样本的第一部分的微生物的身份和数量。
图3C是示出当分析由样本的第一部分生成的液滴时能够获得的测量值的图表。所示测量值包括包封液滴随时间的荧光(相对于非包封液滴的荧光)，其能够用于识别包封微生物的种及其数量。
图4A是第一微流体芯片的实施方案的分解立体分解图，该第一微流体芯片能够用于参照图3A和图3B描述的分析。
图4B是显示其入口端口的图4A的芯片的俯视图。
图4C是图4A的芯片的第一片的仰视图，其中芯片的第二片被除去。图4C示出了由芯片定义的微流体网络。
图4D是图4A的芯片的微流体网络中的一个的放大图。
图4E是沿图4B的线4E-4E截取的图4A的芯片的截面图。4E示出了芯片的微流体网络的入口端口和与其连接的流体路径的一部分。
图4F是图4A的芯片的微流体网络中的一个的液滴生成区域中的一个的放大图。在液滴生成区域中，流动路径包括收缩段、恒定段和扩张段，使得流动路径的最小横截面积沿着流动路径增加。
图4G是沿图4F的线4G-4G截取的图4A的芯片的部分截面图。图4G示出了收缩段和连接至收缩段的上游通道的相对尺寸。
图4H是沿图4F的线4H-4H截取的图4A的微流体芯片的部分截面图。图4H示出了相对于收缩段的恒定段和扩张段的几何形状，扩张段具有由单个平面表面限定的斜面。
图5是本发明微流体芯片的另一个实施方案的液滴生成区域的部分截面图，该微流体芯片与图4的芯片基本上相似，主要的区别是图5中的扩张段的斜面由多个台阶限定。
图6A-图6D是示出在液体从收缩段流动至恒定段和扩张段中时，图4A的芯片的液滴生成的示意图。
图7A-图7C是在使用中的第二装置的示意图，其被配置为将样本的第二部分分成一个或多于一个等分试样(图7A和图7B)，并且对于每个等分试样，由包含等分试样的液体生成液滴(图7C)。第二装置能够包括一个或多于一个微流体芯片，其与用于由包含样本的第一部分的液体生成液滴的那些微流体芯片基本上相同，使得能够以基本上相同的方式由含有等分试样的液体生成液滴。第二装置能够被配置成使得能够将测试试剂引入液滴中，在测试容积中能够对其进行分析以确定其对测试试剂的表型反应。
图8A是第二装置的实施方案的立体图，该第二装置能够用于参照图7A-图7C描述的分析。
图8B是图8A的示出其微流体芯片的第二装置的仰视图，微流体芯片中的每个能够与图4A的微流体芯片基本上相似。
图8C是图8A的第二装置的俯视图，其示出了能够容纳样本的第二部分的第二装置的注入端口。
图8D是图8A的第二装置的侧视图。
图8E是图8A的第二装置沿图8C的线8E-8E截取的截面图。图8E示出了装置的注入端口和与其连接的通道，样本的第二部分能够通过该通道流向微流体芯片。第二装置能够包括钻孔器，每个钻孔器被配置为破坏芯片的入口端口中的相应一个的密封，使得等分试样能够被引入其中。
图8F是图8A的第二装置的仰视图，其中芯片中的每个的第二片被除去。图8F示出了芯片的微流体网络。
图8G是图8A的示出了由第二装置限定的通道的第二装置的仰视图，样本的第二部分能够通过该通道被分成等分试样，所述等分试样能够被引导至芯片的微流体网络。
图8H是示出了图8A的第二装置的通道相对于第二装置的芯片的排列的示意图。
图9A和图9B分别是具有使用图3A的芯片生成的一些液滴设置在其上的板的示意性俯视图和侧视图。板能够用于质谱分析。
图9C是示出图9A的液滴设置在其上的板的成像的示意图，使得能够确定包封微生物的液滴的位置。
图9D是示出在液滴干燥后保留在图9A的板上的微生物的示意图。
图9E是示出将裂解试剂施加到图9A的板上以裂解置于其上的微生物的示意图。
图9F是示出置于图9A的板上并与微生物混合的基质材料的示意图。
图9G是用于分析图9A的板上的微生物的MALDI-TOF质谱仪的示意图。
具体实施方式
图1示出了分析样本(例如，46)的本方法中的一些，图2是能够用于执行这些方法中的一些的***42的示意图。虽然参考***42及其说明性装置(例如，54、58和62)描述了本方法中的一些，但***10和那些装置不限制本方法，本方法能够使用任何合适的***来执行。
样本能够包含一种或多于一种、任选两种或多于两种微生物种，例如一种或多于一种细菌和/或真菌的种，并且能够取自患者的非无菌部位。例如，样本能够包括尿液、唾液、皮肤、软组织、从支气管肺泡灌洗(BAL)收集的材料、从气管内抽取(ETA)收集的材料和/或类似物，并且能够是含水液体。因为样本可能取自非无菌部位，因此它可能包括致病微生物和共生微生物。如下文进一步详细描述的，与常规的筛选和测试技术相比，能够以具有成本效益、快速和准确的方式对样本进行分析，以确定样本是否包括致病微生物，并且如果存在，评估致病微生物对一种或多于一种测试试剂的表型反应(例如，抗生素敏感性)，以与样本中的任何共生微生物的表型反应区分。分析能够包括用第一装置(例如，54)筛选样本的第一部分(例如，50a)和(例如，如果在筛选中检测到致病微生物)用第二个装置(例如，58)测试样本的第二部分(例如，50b)来确定微生物的表型反应。在一些方法中，无论是否进行表型测试，样本的第一部分都能够用质谱仪(例如，62)进一步分析。
能够对样本进行处理以准备分析，例如通过尺寸过滤。例如，能够使用具有孔径小于或等于15μm、14μm、13μm、12μm、11μm、10μm、9μm、8μm、7μm或6μm中的任一个或介于其任两个之间(例如，小于或等于10μm)的过滤器来过滤样本。样本也能够(例如，代替尺寸过滤)进行离心。为了促进微生物生长，能够将样本悬浮在肉汤中和/或用肉汤稀释(例如，使得下述第一液体和/或第二液体包含肉汤)。
参照图3A和图3B，为了进行筛选，一些方法包括步骤10，即由包含样本(其能够是含水液体)的第一部分的第一液体(例如，90a)生成多个第一液滴(例如，98a)。第一液滴能够以任何合适的方式生成，例如利用第一装置的第一芯片(例如，66a)，第一芯片限定包括一个或多于一个入口端口(例如，74)的微流体网络(例如，70)、测试容积(例如，78)，以及在入口端口与测试容积之间延伸的一个或多于一个流动路径(例如，82)。为了生成第一液滴，第一液体能够被布置在入口端口的至少一个内(图3A)，并且沿着流动路径被引导通过至少一个液体生成区域(例如，86)至测试容积(图3B)。第一液体能够包括非含水液体(例如，94)(例如，油，如氟化油，其能够包含表面活性剂)，非含水液体与液滴生成区域的构造相结合能够促进液滴生成(例如，通过拉普拉斯压力梯度)，如下文进一步详细描述的。为了促进液滴生成，非含水液体与水相比更致密，例如，非含水液体的比重能够大于或等于1.2、1.3、1.4、1.5、1.6或1.7中的任一个或介于其任两个之间(例如，大于或等于1.5)。微流体网络还能够包括一个或多于一个出口端口以及一个或多于一个出口通道，一个或多于一个出口通道在测试容积与出口端口之间流体连通，使得第一液滴中的至少一些从测试容积流动通过出口通道，并进入出口端口。这些液滴能够用于质谱分析，下文将进一步详细描述。
作为液滴生成的结果，样本的第一部分的一种或多于一种微生物中的每一种能够被包封在第一液滴中的一个中。基本上所有被包封的第一液滴(例如，102)能够包含单一微生物(和任选地，其后代)。为了便于分析微生物，第一液滴中的每个能够具有相对低的容积，例如，小于或等于10000皮升(pL)、5000皮升、1000皮升、500皮升、400皮升、300皮升、200皮升、100皮升、75皮升或25皮升中的任何一个或介于其任两个之间(例如，介于25pL至500pL之间)，使得被第一液滴包封的微生物的浓度相对高，而不管在样本中的微生物浓度。
一些方法包括用一个或多于一个传感器(例如，106)捕获第一组数据的步骤14，第一组数据指示样本的第一部分的被包封微生物的身份和数量(例如，通过分析放置在测试容积中的第一液滴)。第一液体能够包括具有一个或多于一个特征(例如荧光)的报告物，例如生存力指示剂，该特征基于可能受到包封在其中的微生物影响的液滴条件而改变。微生物种中的每种微生物种可以不同地影响液滴条件(例如，由于该微生物种的独特代谢特性)，因此，包封液滴中的每个可以随时间表现出取决于置于其中的种的特有特征。传感器能够检测和测量能够用于评估样本的第一部分的微生物的身份(例如，基于特有特征)和数量(例如，基于表现出微生物诱导的特征的液滴的数量)的这些特征。相对低容积的液滴能够促进这些测量。
为了说明，并且另外参考图3C，生存力指示剂能够具有基于液滴条件而改变的荧光，并且第一组数据能够包括在第一测试周期内第一液滴的至少一些的荧光的测量值。生存力指示剂能够包括例如刃天青。刃天青能够具有低荧光；然而，包封的微生物及其后代能够不可逆地将刃天青还原为试卤灵，试卤灵的荧光可能比刃天青的荧光高。试卤灵可以根据液滴的还原电位进而可逆地还原为非荧光的氢化试卤灵，这可能至少部分地取决于包封的微生物的种。包封液滴中的每个可以相应地表现出基于包封在其中的微生物种而随时间变化的特有荧光特征。能够包括成像传感器的传感器能够测量对于包封液滴中的每个的荧光的变化(例如，相对于不包封微生物的液滴的荧光)，以及能够对表现出每个荧光特征的液滴的数量进行计数，以评估样本的第一部分中的微生物的每种微生物种的数量。例如，如图3C所示，包封大肠杆菌的六个液滴具有与包封表皮葡萄球菌的两个液滴不同的荧光特征。对于样本中的微生物的种中的每种微生物种，其身份能够至少通过将测量的特有荧光特征与已知特征的数据库进行对比来确定。
虽然刃天青是能够在筛选中使用的生存力指示剂的一个实例，但在其他实施方案中，生存力指示剂能够包括任何合适的化合物，通过该化合物，包封液滴中的每个能够表现出指示包封在其中的微生物的身份的特有特征(例如特有荧光特征)。合适的生存力指示剂能够包括例如四唑鎓、香豆素、蒽醌、花青、偶氮、呫吨、芳基次甲基、芘衍生物、钌联吡啶络合物等。
一些方法包括步骤18，即基于第一组数据将样本的一种或多于一种微生物种中的至少一种微生物种识别为目标种。例如，能够基于第一组数据计算样本中一种或多于一种中的每种微生物种的浓度，并且如果浓度大于或等于阈值浓度(其对于每种微生物种能够但不必不同)，该微生物种能够被识别为目标(例如，致病性)种。对于每种微生物种，浓度能够通过确定包封该微生物种的微生物的分析的第一液滴(例如，测试容积中的那些)(例如，如上所述)的比例来评估。浓度低于其各自阈值浓度的种可以被识别为共生种。
如果确定样本中没有微生物的种是致病性的(例如，其浓度低于阈值浓度)，则无需进一步分析样本(例如，使用第二装置或质谱仪)。通过在与用于表型分析的装置分开的装置中进行筛选，能够成本有效地进行样本分析。与第一芯片相比，配置用于表型分析的耗材(例如AST)可能相对昂贵。如果样本不包含病原体，这些成本可能是不必要的，即使用廉价的第一芯片来进行确定可以避免这些不必要的成本。如下文进一步详细描述的，这种多装置分析能够至少部分地由于使用上述微流体液滴分析而有效地进行。
参见图4A-图4H，示出了能够用于样本的微生物的识别和定量的示例性的第一芯片。如图所示，芯片限定了多个微流体网络(例如，如上所述，每个都具有入口端口、流动路径、测试容积、出口通道和出口端口)(图4A-图4C)；然而，在其他实施方案中，芯片能够限定单个微流体网络。多网络芯片可以允许同时分析多个样本，例如，如图所示，第一芯片具有八个微流体网络，因此能够用于分析八个单独的样本。芯片能够包括单片或多片(例如，第一片118a和第二片118b)，其中，片中的至少一片限定了微流体网络的至少一部分。芯片的片能够包括任何合适的材料；例如，第一片和第二片中的至少一个能够包括(例如，刚性的)聚合物，并且任选地，这些片中的一个能够包括聚合物(例如，透明的)膜。
特别参考图4D，其示出了第一芯片的微流体网络中的一个，流动路径能够由一个或多于一个通道和/或流体能够流过的其他流道限定。流动路径中的每个能够具有促进微流体流动的任何合适的最大横向尺寸，例如，垂直于流动路径的中心线截取的最大横向尺寸，其小于或等于2000μm、1500μm、1000μm、500μm、300μm、200μm、100μm、50μm或25μm中的任一个或介于其任两个之间。
芯片能够被配置为允许第一液体的真空装载。例如，在第一液体被引导到微流体网络中的一个的测试容积之前，测试容积中的气体能够至少通过降低入口端口中的第一个处的压力来排出，使得气体从测试容积流动通过流动路径中的至少一个，并离开第一入口端口。第一液体能够设置在第一端口中，使得气体能够通过液体。参考图4E，随着气体通过液体，第一端口和与其连接的流动路径的部分的相对尺寸能够促进气泡形成并且能够最小化或防止液体损失(例如，如果产生段塞流则可能导致损失)。例如，流动路径的该部分能够具有小于入口端口的最小横截面积(例如130)(垂直于入口端口的中心线(例如，26)截取)的最小横截面积(例如134)(垂直于该部分的中心线(例如122)截取)，例如，小于或等于入口端口的最小横截面积的90％、80％、66％、60％、46％、40％、30％、20％或10％中的任一个或介于其任两个之间(例如，小于或等于90％或10％)。连接至第一入口端口的流动路径的部分的较小横截面积能够有助于形成直径小于入口端口的直径的气泡，使得在气体排放期间减轻段塞流并因此减轻液体损失。气泡能够搅动并由此混合第一液体，以促进在测试容积中的装载和/或分析第一液体。
在减压之前，第一端口处(以及任选地，在测试容积中)的压力能够基本上是环境压力；为了从测试容积中排出气体，第一端口处的压力能够降低到环境压力以下。例如，能够执行减压，使得第一端口处的压力小于或等于0.5atm、0.4atm、0.3atm、0.2atm、0.1atm或0atm中的任一个或介于其任两个之间。较大的压降能够增加从测试容积中排出的气体量。在气体排出期间，微流体网络的出口端口能够被堵塞(例如，防止气体通过其流入)；然而，在其他实施方案中，芯片能够没有出口端口。
为了装载第一液体，能够增加第一端口处的压力，任选地使得在装载完成后第一端口处的压力基本上是环境压力。因此，第一液体能够沿着流动路径流动，使得对于流动路径中的每个，第一液体的至少一部分从第一端口流动通过至少一个液滴生成区域，并进入测试容积。随着液体被引入测试容积中，测试容积内的压力能够增加，直到它也基本上达到环境压力。通过实现测试容积与芯片外部环境(例如，环境压力)之间的压力平衡，能够保持测试容积内液滴的位置以进行分析，而无需额外的密封或其他保持机制。此外，可能产生负压梯度，因为气体排空后测试容积内的压力能够低于芯片外部的压力，这种负压梯度能够(例如，在芯片的不同片之间)加强密封以防止芯片分层，并且如果发生故障，能够通过将气体吸入泄漏处来防止意外泄漏。例如，当样本的第一部分包括病原体时，遏制泄漏能够提高安全性。然而，在其他实施方案中，芯片能够在没有气体排出的情况下被装载。
液滴生成区域能够被配置为以任何合适的方式形成液滴。例如，另外参考图4F-4H，对于流动路径中的每个，流动路径的最小横截面积能够沿液滴生成区域的至少一个中的流动路径来增加。为了说明，在液滴生成区域中，流动路径能够包括收缩段(例如，138)、恒定段(例如，142)和/或扩张段(例如，146)。
收缩段能够配置以促进液滴生成。如图所示，例如，收缩段能够在入口和出口(例如，150a和150b)之间延伸，入口连接至通道(例如，166)，使得液体能够从通道进入收缩段(图4F和图4G)。通道能够具有垂直于通道的部分的中心线截取的最大横向尺寸(例如170)和/或垂直于中心线及其横向尺寸截取的最大深度(例如174)，即分别大于收缩段的最大横向尺寸(例如，154)和最大深度(例如，162)。例如，通道的最大横向尺寸和最大深度中的至少一个能够大于或等于10μm、25μm、50μm、75μm、100μm、125μm、150μm、175μm或200μm中的任一个或介于其任两个之间(例如，介于75μm至170μm之间)，同时收缩段的最大横向尺寸能够小于或等于200μm、175μm、150μm、125μm、100μm、75μm或50μm中的任一个或介于其任两个之间，并且最大深度能够小于或等于20μm、15μm、10μm或5μm中的任一个或介于其任两个之间。并且，收缩段能够限定入口与出口之间的收缩，在该收缩段处，垂直于其中心线截取的收缩段的横截面积(例如，178)能够比在入口和/或出口处小(例如，至少小10％)。收缩段(例如，在收缩处)的最小横向尺寸(例如，158)能够小于或等于40μm、35μm、30μm、25μm、20μm或15μm中的任一个或介于其任两个之间，并且在其入口和出口之间的收缩段的长度(例如，160)能够大于或等于250μm、300μm、350μm、400μm、450μm、500μm、550μm、600μm、650μm、700μm或750μm中的任一个或介于其任两个之间(例如，介于450μm至750μm之间)，这能够确保在液滴夹止期间收缩部分保持准备就绪。
液滴形成能够通过使液体在其收缩后扩张来实现。沿着流动路径，来自收缩段的液体能够进入扩张段(例如，184)，其中流动路径的最小横截面积(例如，186)大于收缩段中的流动路径的最小横截面积(图4H)。例如，扩张区域中的流动路径的最小横截面积能够比其在收缩段中的最小横截面积大至少10％、50％、100％、200％、300％、400％、500％或1000％。这种扩张可以包括流动路径的深度的变化。扩张区域中的流动路径的深度(例如，182、194a和/或194b)能够比收缩段的最大深度大至少10％、50％、100％、150％、200％、250％或400％，例如大于或等于或在5μm、15μm、30μm、45μm、60μm、75μm、90μm、105μm或120μm中的任两个或介于其任两个之间(例如，介于35μm至45μm之间或介于65μm至85μm之间)。沿着流动路径从收缩段流入扩张区域的液体能够由此扩张并形成液滴。
这些深度变化能够发生在流动路径的恒定段和/或扩张段，其中允许从入口端口中的一个流动至测试容积的液体离开收缩段，进入恒定段和/或扩张段。在图4H所示的实施方案中，液体的扩张能够通过恒定段和扩张段二者来实现，其几何形状能够促进形成基本相同尺寸的液滴，并有助于在测试容积中进行合适的液滴排列。恒定段和扩张段能够布置成使得从入口端口中的一个流动至测试容积的流体被允许从收缩段流动通过恒定段并流动至扩张段。恒定段的深度(例如，182)能够等于扩张段的最小深度并且大于收缩段的最大深度(例如，大至少10％或至少50％)，例如大于或等于5μm、20μm、35μm、50μm、65μm或80μm中的任一个或介于其任两个之间(例如，介于35μm至45μm之间)。恒定段的深度沿其在收缩段与扩张段之间的长度的至少90％(例如，190)能够基本相同。恒定段能够具有允许完全液滴生成(包括液滴夹止)的任何合适的长度，例如大于或等于15μm、25μm、50μm、100μm、200μm、300μm、400μm或500μm中的任一个或介于其任两个之间的长度(例如，介于150μm至200μm)。
扩张段能够扩张，使得沿着流动路径朝向测试容积移动时，扩张段的深度从第一深度(例如，194a)增加至第二深度(例如，194b)。例如，第一深度和第二深度能够分别是扩张区域的最小深度和最大深度。为了说明，扩张段能够限定具有斜率(例如，202)的斜面(例如，198)，该斜面相对于收缩段以一定角度(例如，206)成角度地设置，使得扩张段的深度随着远离恒定段移动而增加。该角度能够大于或等于5°、10°、20°、30°、40°、50°、60°、70°或80°中的任一个或介于其任两个之间(例如，介于20°至40°之间)，相对于与收缩段的中心线平行的方向测量。斜面能够从恒定段延伸(例如，使得第一深度与恒定段的深度基本相同)至扩张区域达到其最大深度，该最大深度能够大于或等于15μm、30μm、45μm、60μm、75μm、90μm、105μm或120μm中的任一个或介于其任两个之间(例如，介于65μm至85μm之间)。如图所示，斜面由(例如，单个)平面限定。参考图5，在其他实施方案中，斜面能够由多个台阶(例如，210)限定(例如，如果芯片是用光刻生产模具制造的，这能够是成本有效的)，每个台阶具有适当的上升(例如，214)和平台(例如，218)，使得斜面具有任何上述斜率。
另外参考图6A-图6D，其说明了使用如关于图4H描述的收缩段、恒定段和扩张段的液滴形成，根据尺寸，恒定段能够压缩液滴以防止其完全扩张(图6A和图6B)。恒定段能够由此防止液滴彼此堆叠，使得液滴能够在测试容积中以二维阵列排列。这样的阵列能够促使对液滴的准确分析。从恒定段流向扩张段的压缩液滴能够沿斜面行进和减压(图6C和图6D)。减压能够降低液滴的表面能量，使得液滴沿着斜面被推进并离开扩张段。至少通过将液滴推出扩张段，斜面能够减轻液滴在收缩段的出口与恒定段之间的界面处的积聚，使得液滴不会阻碍随后的液滴形成。因为这种阻碍能够导致液滴尺寸的不一致，所以通过减轻阻碍，扩张段能够促进形成尺寸一致的液滴，例如，每个液滴的直径在液滴彼此直径的3％至6％的范围内。
液滴生成区域能够具有其他配置以形成液滴。例如，液体的扩张能够通过单独的恒定段、单独的扩张段或恒定段上游的扩张段来实现。并且尽管液滴生成能够通过扩张来实现，在其他实施方案中，液滴生成区域能够被配置为以任何合适的方式形成液滴，例如通过T形接头(例如，在该T形接头处，两个通道-样本的第一部分流动通过两个通道中的一个并且非含水液体流动通过两个通道中的另一个)、流动聚焦、共流等。在一些这样的替代实施方案中，微流体网络能够包括多个入口端口，并且样本的第一部分和非含水液体能够设置在不同的入口端口中(例如，使得它们能够在接合处相遇用于液滴生成)。也能够使用不使用微流体芯片的其他液滴生成技术。
参考图7A-图7C，能够使用样本的第二部分进行目标种的表型分析。样本的第二部分能够是布置在第一芯片的入口端口中的一个入口端口中并且不用于生成第一液滴的样本的一部分，或者没有引入到第一芯片中的样本的一部分。样本的第二部分能够分为一个或多于一个、任选两个或多于两个等分试样(例如，230)。当样本的第二部分被分为多个等分试样时，能够将一个或多于一个等分试样暴露于不同的测试试剂，其中等分试样中的至少一个不暴露于测试试剂以作为对照(例如，以确定哪种测试试剂提供所需的表型反应)。
样本的第二部分的分析能够使用液滴微流体来进行，对于等分试样中的每个，一些方法包括步骤22，即用第二装置从包含等分试样(其能够是含水液体)的第二液体(例如，90b)生成多个第二液滴(例如，98b)。该液滴生成能够以与上述关于第一液滴的方式基本相同的方式进行。例如，能够将样本的第二部分引入到第二装置(图7A)的注入端口(例如，222)中，并且分为等分试样，其能够通过一个或多于一个通道(例如，226)传送至由一个或多于一个第二芯片(例如，66b)限定的一个或多于一个微流体网络中的相应一个(图7B)。第二芯片中的每个能够与第一芯片基本相同(例如，由第二芯片限定的微流体网络能够是上述那些中的任何一个)，并且任选地，能够预先装载有非含水液体，使得第二液体包含等分试样和非含水液体。对于等分试样中的每个，第二液体能够布置在入口端口中的至少一个中，并沿着流动路径引导通过至少一个液滴生成区域并到达测试容积以用于分析(图7C)。因此，等分试样中的一种或多于一种微生物中的每种能够被包封在第二液滴的一个中。
一些方法包括步骤26，即对于等分试样中的至少一个，将测试试剂引入第二液滴中的至少一些中，任选地对于等分试样中的至少一个，测试试剂不被引入第二个液滴中(例如，以作为对照)。这能够通过将测试试剂引入等分试样中(例如，通过用测试试剂预装载微流体网络或在等分试样到达微流体网络之前将测试试剂添加到等分试样)来执行，使得第二液滴中的至少一些在生成时包含测试试剂。替代地，液滴能够由测试试剂形成并且与第二液滴合并。
测试试剂能够根据所研究的表型反应来选择。例如，当确定对患者的适当治疗时，测试试剂能够包括药物，例如抗生素(例如，抗菌剂或抗真菌剂)。当测试试剂包含抗生素时，用于分析的表型反应能够包括目标种对抗生素的敏感性。为了说明，当使用多个等分试样时，能够将等分试样中的每个暴露于不同的抗生素，以确定哪种抗生素在杀死或抑制目标种的生长方面最有效。不需要将测试试剂引入由等分试样中的至少一个形成的第二液滴中，其液滴不包含测试试剂的等分试样能够用作下文描述的表型分析的对照。
一些方法包括步骤30，即利用一个或多于一个传感器(例如，106)捕获第二组数据，第二组数据指示样本的第二部分的被包封的微生物对每种测试试剂的表型反应。第二组数据能够以与第一组数据基本相同的方式被捕获。例如，第二液体能够包括生存力指示剂(例如，刃天青)，使得包封的第二液滴(例如，102b)表现出基于包封在其中的微生物的种随时间变化的特有特征(例如，随第二时间段变化的荧光)。测试试剂能够影响特征。为了说明，当测试试剂包含抗生素时，抗生素可以杀死或抑制被包封微生物的生长，使得液滴条件以及因此生存力指示剂的特性不同于没有测试试剂的情况下存在的条件。例如，当生存力指示剂包含刃天青时，包含杀死被包封的微生物的抗生素的液滴可以具有与不包封任何微生物的液滴相似的荧光。
参考图8A-图8H，所示的是示例性第二装置，其能够用于将样本的第二部分分为等分试样，从等分试样中的每个生成第二液滴，并捕获第二组数据。第二装置能够包括上部部件和下部部件(例如，224a和224b)以及多个微流体芯片。如图所示，第二装置包括四个芯片，四个芯片中的每个定义了八个微流体网络，使得芯片共同定义了三十二个微流体网络。因此，该装置能够用于评估多达32种不同的测试试剂(或带有对照的31种)对被包封的微生物的影响。
芯片的微流体网络中的每个能够预装载有非含水液体和/或测试试剂。为了防止其损失，能够密封网络中的每个的入口端口。第二装置能够包括用于入口端口中的每个的钻孔器(例如，234)，钻孔器中的每个能够配置为破坏入口端口中的相应之一的密封，使得等分试样之一能够被引入其中(图8E)。第二装置的通道能够由第二装置的下部部件限定并且能够在注入端口与多个出口(例如，238)之间延伸，所述多个出口中的每个允许等分试样被转移到微流体网络之一。例如，第二装置的出口中的每个能够与微流体网络的入口端口中的相应之一对准，使得液体能够从注入端口流动通过通道中的至少一个到出口端口之一，并进入微流体网络之一(图8F-图8H)。
一些方法包括步骤34，确定目标种对测试试剂中的每种的表型反应。因为表型分析能够在初始筛选之后进行，这可能需要一个或多于一个小时，并且微生物能够在此期间复制，所以样本的第二部分中的微生物的浓度可能与原始样本中的不同。这能够给从非无菌场所采集的样本构成挑战，这些样本可以包括具有不同复制速率的多个种的微生物。例如，在样本的第二部分中，具有相对较快复制速率的共生(例如，非目标)微生物可能至少部分由于该复制速率(例如，其能够产生较高浓度的共生微生物)而看起来是致病的(例如，目标种)。因此，单独的第二组数据可能不足以确定哪些测量值是相关的(例如，说明目标而不是非目标种的表型反应的测量值)。
为了解决这些挑战，目标种对测试试剂的表型反应能够至少通过将第二组数据参考第一组数据来确定。因为第一组数据可以反映原始微生物浓度，参考该数据能够有助于解释第二组数据，使得能够确定测试试剂对目标种的影响并将其与它们对任何非目标种的影响区分开来。例如，能够参考第一组数据以确定哪个种是目标种，从而确定与分析相关的特有特征(例如，荧光特点)。数据表明，对于引入测试试剂的第二液滴，与相关特有特征存在偏差——无论包含非目标物质的包封液滴的特有特征是否存在偏差——能够证明测试试剂影响目标种。
为了确定是否存在偏差，第二组数据能够包括从省略了测试试剂的等分试样形成的第二液滴捕获的对照数据，如上所述。该对照数据能够指示当未暴露于测试试剂时存在的包封微生物的数量。从其他等分试样(其中引入了测试试剂)形成的第二个液滴中捕获的数据能够与第一组数据一起参考对照数据，以确定测试试剂对目标种的影响。例如，当从非对照等分试样的分析中获得的数据显示，对于这些等分试样中的至少之一，目标种的特有特征相对于对照存在偏差时(例如，如果表现出相关特有特征的液滴较少)，能够确定测试试剂影响目标种。作为说明，当测试试剂包含抗生素并且相关特有特征未被测量或与对照相比较少的液滴表现出相关特有特征时，即使抗生素未杀死或抑制非目标种的生长，也能够确定目标种对抗生素敏感(例如，因为如果目标种存活并且允许繁殖，则目标种的特有特征将被检测到更多的数量)。这种交叉引用至少部分是可以实现的，因为样本的第一和第二部分能够使用液滴微流体进行分析，其中，被包封的第一和第二液滴中的每个都能够包封单一种以产生允许区分的独特的特有特征。
这种表型分析方法能够比传统技术准确和有效。例如，因为微流控分析是表型的(例如，它直接测量目标种对测试试剂的反应)，它能够比基因型技术(例如，NAAT)准确地评估测试试剂的效果(例如，它作为抗生素的有效性)，基因型技术根据遗传信息间接地进行这些评估。例如，基因型技术可能无法解释突变(例如，抗性机制的进化)。此外，通过使用液滴微流体，表型分析能够比传统的表型测试(如微稀释和圆盘扩散)更快和更有效。这些测试可能需要额外培养样本和分离目标种(例如，通过将样本划过板)，这既费时又费力。如上所述，由于包封液滴中的每个的容积小，其中的微生物的浓度能够相对较高，使得不需要额外的培养。并且由于液滴形成通过包封不同种的微生物来分离不同种的微生物，使得物种能够被区分，因此在表型分析之前(例如，在AST之前)分离目标种也可能是不必要的，使得该分析能够在明显较少的时间内进行。
另外参考图9A-图9G，在初始筛选之后，能够使用质谱分析进一步分析样本，以提供目标种的更高分辨率分类。这种分析能够使用一些第一液滴来执行。一些方法包括步骤38，即，从第一装置(例如，从第一芯片的出口端口)去除第一液滴中的至少一些，并且可选地，将去除的第一液滴设置在板(例如，242)上(图9A-图9B)。去除的第一液滴能够包括样本的第一部分的被包封微生物中的至少一些，并且能够布置在板上，使得液滴形成用于对其进行分析的阵列。
能够确定包括包封的微生物的被去除的第一液滴中的一个或多于一个在板上的位置。例如，诸如成像传感器的传感器(例如，106)能够捕获指示包封目标种的液滴的位置的数据(例如荧光测量值)(图9C)。该位置信息能够用于确定用质谱仪最初筛选的位置，以加速分析。
去除的第一液滴能够在板上干燥，使得去除的第一液滴的基本上所有液体蒸发(例如，通过等待这种蒸发发生)(图9D)。由于在去除的第一液滴中的每个的微生物的浓度相对较高，在液滴干燥后，浓缩的微生物点(例如，246)能够保留在布置有包封液滴的板上。能够将一个或多于一个裂解试剂(例如，250)添加到板以裂解布置在其上的微生物(图9E)，然而在某些情况下可能不需要裂解步骤。光谱分析能够使用基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱法进行，其中，微生物被电离。在为该分析做准备时，能够将诸如芥子酸、CHCA或DHB的基质材料(例如，254)添加到板(例如，使它们与微生物混合)(图9F)。
一些方法包括步骤42，即用质谱仪捕获指示被除去的第一液滴的包封的微生物的身份(例如，目标种的身份)的光谱数据。当电离微生物放置在板上时，能够通过分析电离微生物来捕获光谱数据(图9G)。如图所示，质谱仪是MALDI-TOF质谱仪，其包括激光器(例如，258)、一个或多于一个电场发生器(例如，262)和检测器(例如，266)。激光能够被引导到板上，使得微生物和基质材料被离子化并从板喷射。喷射的材料能够在由电场发生器产生的电场的影响下移动到检测器。可能取决于粒子的质荷比的喷射粒子的飞行时间(例如，根据检测器捕获的数据确定)能够用于产生光谱数据。质谱分析能够对目标种的身份提供较高分辨率的分析。
以上说明书和实施例提供了对示例性实施方案的结构和使用的完整描述。尽管上面已经以某种程度的特殊性或参考一个或多于一个单独的实施方案描述了某些实施方案，但是本领域技术人员可以对所公开的实施方案进行多种改变而不脱离本发明的范围。因此，方法和***的各种说明性实施方案不旨在限于所公开的特定形式。相反，它们包括落入权利要求范围内的所有修改和替代方案，并且除了所示实施方案之外的实施方案可以包括所示实施方案的特征中的一些或全部。例如，元件可以被省略或组合为单一结构，和/或连接可以被替换。此外，在适当的情况下，上述任何实施例的任何的方面可以与所描述的任何其他实施例的任何的方面结合以形成具有可比较或不同的特性和/或功能并解决相同或不同问题的其他实施例。类似地，应当理解，上述益处和优点可以涉及一个实施方案或可以涉及几个实施方案。
权利要求不旨在包括也不应被解释为包括方式加功能或步骤加功能限制，除非在给定的权利要求中使用短语“用于……的方式”或“用于……的步骤”明确叙述了这种限制。

Claims (20)

1.一种分析包含一种或多于一种微生物种的样本的方法，所述方法包括：
利用第一装置由包含样本的第一部分的第一液体生成多个第一液滴，使得样本的第一部分的一种或多于一种微生物中的每种被包封在第一液滴中的一个内；
利用一个或多于一个传感器来捕获第一组数据，所述第一组数据指示样本的第一部分的被包封的微生物的身份和数量；
基于第一组数据将样本的一种或多于一种微生物种中的至少一种识别为目标种；
对于样本的第二部分的一个或多于一个等分试样中的每一个，利用第二装置由包含等分试样的第二液体生成多个第二液滴，使得等分试样的一种或多于一种微生物中的每种被包封在第二液滴中的一个内；
对于等分试样中的至少一个，将测试试剂引入第二液滴中的至少一些中；
利用一个或多于一个传感器来捕获第二组数据，所述第二组数据指示样本的第二部分的被包封的微生物对每种测试试剂的表型反应；和
至少通过将第二组数据与第一组数据对比来确定目标种对每种测试试剂的表型反应。
2.根据权利要求1所述的方法，其中第一液体包含肉汤。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中第一液体和第二液体中的至少一个包含生存力指示剂。
4.根据权利要求3所述的方法，其中生存力指示剂包括刃天青。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中第一液体和第二液体中的至少一个包含非含水液体。
6.根据权利要求5所述的方法，其中非含水液体具有大于或等于1.2的比重。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中对于一种或多于一种微生物种中的每一种，将一种或多于一种微生物种中的至少一种识别为目标种包括：
基于第一组数据计算样本中的所述种的浓度；和
如果浓度大于或等于阈值浓度，则将所述种识别为目标种。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中第一组数据包括在第一测试周期内第一液滴中的至少一些的荧光的测量值。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中第二组数据包括在第二测试周期内第二液滴中的至少一些的荧光的测量值。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中对于等分试样中的至少一个，将测试试剂引入第二液滴中包括将测试试剂引入等分试样中。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中，
每种测试试剂包含抗生素；和
目标种对每种测试试剂的表型反应包括目标种对抗生素的敏感性。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中，
第一装置包括限定微流体网络的第一芯片，所述微流体网络包括：
一个或多于一个入口端口；
测试容积；和
在入口端口与测试容积之间延伸的一个或多于一个流动路径；和
在第一芯片的微流体网络中，至少通过以下方式生成第一液滴：
在入口端口的第一入口端口内设置第一液体；和
沿着流动路径引导第一液体，使得对于流动路径中的每一个，第一液体的至少一部分从第一入口端口流动通过至少一个液滴生成区域，并流动至测试容积，在所述至少一个液滴生成区域中，流动路径的最小横截面积沿着流动路径增加；和
捕获第一组数据包括分析设置在测试容积中的第一液滴。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中，
第二装置包括第二芯片，所述第二芯片包括一个或多于一个微流体网络，每个微流体网络包括：
一个或多于一个入口端口；
测试容积；和
在入口端口与测试容积之间延伸的一个或多于一个流动路径；和
对于等分试样中的每一个，在第二芯片的微流体网络中的相应一个中至少通过以下方式生成第二液滴：
在微流体网络的入口端口的第一入口端口内设置第二液体；和
沿着流动路径引导第二液体，使得对于流动路径中的每一个，第二液体的至少一部分从第一入口端口流动通过至少一个液滴生成区域，并流动至测试容积，在所述至少一个液滴生成区域中，流动路径的最小横截面积沿着流动路径增加；和
捕获第二组数据包括分析设置在测试容积中的每一个中的第二液滴。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其中对于微流体网络中的至少一个：
对于流动路径中的至少一个，在液滴生成区域中的至少一个中，流动路径包括收缩段、恒定段和扩张段，使得从第一入口端口流向测试容积的液体被允许离开收缩段、进入恒定段并流向扩张段；
其中，
恒定段的深度比收缩段的深度大至少50％，并且沿着恒定段的长度的至少90％基本上相同；和
扩张段的深度随着远离恒定段而增加。
15.根据权利要求12至14中任一项所述的方法，其中对于第一微流体芯片：
微流体网络包括：
一个或多于一个出口端口；和
在测试容积与出口端口之间流体连通的一个或多于一个出口通道；和
生成第一液滴以使得第一液滴中的至少一些从测试容积流动通过出口通道，并进入出口端口。
16.根据权利要求15所述的方法，其包括从出口端口除去第一液滴中的至少一些。
17.一种分析包含一种或多于一种微生物种的样本的方法，所述方法包括：
利用装置由包含样本的至少一部分的液体生成多个液滴，使得样本的该部分的一种或多于一种微生物中的每种被包封在液滴中的一个内；
利用一个或多于一个传感器来捕获第一组数据，所述第一组数据指示样本的该部分的被包封的微生物的身份和数量；
基于第一组数据将一种或多于一种微生物种中的至少一种识别为目标种；
从装置中除去液滴中的至少一些，除去的液滴包含样本的该部分的被包封的微生物中的至少一些；和
利用质谱仪捕获指示除去的液滴的被包封的微生物的身份的光谱数据。
18.根据权利要求17所述的方法，其包括：
将除去的液滴设置于板上并且对其干燥，使得除去的液滴的基本上所有液体蒸发；和
将基质材料添加至板；
其中质谱仪是基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱仪。
19.根据权利要求18所述的方法，其包括确定包含包封的微生物的被除去的第一液滴中的一个在板上的位置。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中样本包含两种或多于两种微生物种。
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