JP6726218B6 - 組織サンプルを分析するための方法 - Google Patents
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Description
本願は、2015年5月9日に出願された米国仮出願第62/168,033号の優先権の利益を主張し、その内容全体が、本明細書中に参照によって援用される。
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与されたGM106016、および米国国立科学財団によって授与されたCHE1308114のもとの政府援助によって行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
本発明は、概して、組織サンプルを分析するための方法に関する。
脂質は、種々の異なる頭部基、骨格および疎水性アシル鎖からなるという点において構造的に多様な分子である。脂質は、原形質膜の基本単位として働き、生体系のシグナル伝達およびエネルギー貯蔵において重要な役割を果たす。脂質の頭部基、アシル鎖長および不飽和度が様々であることは、膜の特性および機能(例えば、粘度、脂質−タンパク質相互作用および脂質−脂質相互作用(これらのすべてが正常な細胞機能にとって重要である))の調節に利用される。同様に、全脂質組成の変化は疾患に結びつくため、脂質プロファイルは、実際の診断において病状を探索するためのマーカーとしてますます使用されるようになっている。
不飽和脂質は、生物内の全脂質の大部分を構成しており、それらの物理的特性、化学反応性および生体内変換は、種々の生理学的機能および生理化学的機能と密接な関係がある。しかしながら、脂質C=C異性体、特に、複雑な混合物由来の脂質C=C異性体の同定と定量を同時に行うことは、現在のところ困難である。本発明は、ラジカル反応(例えば、パターノ・ビューチ反応)をタンデム質量分析と連結することによって、組織における脂質C=C異性体の包括的な特徴付けおよび定量を可能にする方法を提供する。それらの方法を用いて、ラットにおいて、脂肪酸(FA)18:1およびC18:1含有リン脂質がすべて、2つのC=C異性体型:C18:1 n−7およびC18:1 n−9として存在し、しかしながら、それらの相対比は、脂質および組織タイプによって異なるすることが実証された。マウスの正常***組織と癌性***組織との間で、FA18:1およびC18:1含有ホスホコリンの異性体組成の有意差が観察された。特許請求される方法は、定量的ショットガンリピドミクスに適しており、基礎をなす不飽和脂質の精密定量による高度な生物学的研究に寄与する。
本発明の方法は、光化学誘導体化をタンデム質量分析と組み合わせたものであり(PCD−MSn)、これによって、ショットガンリピドミクスアプローチにおいて、複雑な脂質混合物由来の脂質C=C異性体の包括的な特徴付けおよび定量が可能になる。本発明の方法は、ラジカル反応(例えば、パターノ・ビューチ(P−B)反応)を使用することにより、不飽和脂質の中のC=Cの位置を正確に指摘する。作動原理は、3つの主要コンポーネントを含む(図1A):(1)まず、254nmのUV照射下でのアセトン(ナノESI溶媒としても同様に使用される)を用いたP−B反応を介して、C=C結合をそれらの対応するP−B反応生成物に変換する。(2)次いで、反応生成物を連続的に単離し、CIDによって断片化することにより(タンデムMS)、元のC=C結合に形成されたオキセタン環が破壊されて、異性体特異的診断用イオン(診断用イオン)が選択的に生成される。(3)次いで、診断用イオンの相対存在比を用いることにより、様々な脂質種のC=C異性体の相対定量および絶対定量が可能な強力な方法が開発される。本発明の方法は、PCD−MSnが、脂質標的化を改善し、ラット脳における脂質C=C異性体を含む96個のユニークな脂質種を同定し、35個の不飽和脂質を定量したことを示す。それは、ラット器官における不飽和脂質の異性体組成の不均一性も明らかにした。癌性組織では、FA18:1およびC18:1含有ホスホコリン(PC)のC=C異性体の相対量の有意な変化が検出されたことから、診断方法、例えば、癌の診断方法としての本発明の方法の有用性が実証された。脂質C=C異性体の産生に関与する種々の生合成経路を考慮すると、本方法は、細胞生物学および疾患診断法などの脂質C=C異性体が関わる研究分野における広範な応用を提供する。
P−B反応がナノESI−MSと連結される実験装置の概略図が、図1Aに図示されている。UV源として主に254nmを発光する低圧水銀(LP−Hg)ランプをP−B反応のために使用した。350.3〜0.5分後に安定状態に達するという点において反応動力学は速い(下記の実施例を参照のこと)。1つのC=Cを含む脂質の場合、アセトンの中のUVによって活性化されるカルボニルがその脂質におけるC=Cに付加されるとき、位置選択性が存在しないので、反応生成物は、2つのオキセタン位置異性体の混合物である。その結果、CIDにおいて、P−B反応生成物は、それぞれが1つの位置異性体に由来する2つの診断用イオンを生成する(図1B)。CIDの後に大量のC=C特異的診断用イオンが選択的に形成されることは、フラグメンテーション抵抗性のC=Cの反応生成物として、CID感受性の高エネルギーのオキセタン環の恩恵を受ける。さらに、診断用イオン対の中の特徴的な26Daの質量差が、特に干渉が存在する場合、診断用イオンの同定において有用である。脂質C=C異性体の混合物の分析に対するPCD−MSnの能力を実証するために、オレイン酸(C18:1 n−9)とcis−バクセン酸(C18:1 n−7)との4:1模擬(mock)混合物を調製し、分析した。m/z281のインタクトなFAの(if)フラグメンテーション(脱プロトン化型)は、C=Cの位置を正確に指摘するのに有用な情報価値のあるイオンを生成しない。対照的に、P−B反応およびタンデムMSの後、2つの異なる診断用イオン対が、m/z171.1/197.2(FA18:1 n−9)およびm/z199.1/225.1(FA18:1 n−7)に現れる(図1E)。各診断用イオン対は、それらの特定の脂質C=C異性体に特有であるので、PCD−MSnは、無限の数の異性体を同時に分析できる。
PCD−MSnを、脂質C=C異性体を定量する方法として検証するために、異なるモル比の異性体混合物を調製し、分析(典型的なCID質量スペクトルのための分析、下記の実施例を参照のこと)に供した。すべてのPC18:1/18:1またはFA18:1異性体に対して、異性体のモル比と、対応する診断用イオン間の強度比(図2A)との間に優れた線形性が観察された(R2=0.9992および0.9994)ことから、脂質C=C異性体におけるPCD−MSnのロバストネスが示唆される(図2B)。強度比は、1つの異性体に対する診断用イオンの強度と別の異性体に対する診断用イオンの強度との比、すなわち、
C=C異性体の相対定量の基礎が確立されたら、絶対定量のための方法が開発された。2つの異性体(オレイン酸およびcis−バクセン酸)を定量する必要があり、かつ第3の異性体(ペトロセレン酸、FA18:1 n12)が利用可能である場合、絶対定量のために2つの検量線(オレイン酸およびcis−バクセン酸に対する)が作成できる(図2C)。ここでは、FA18:1 n12を共通の内部標準(IS)として使用した。IS濃度を一定(22.7μM)に維持しつつ、オレイン酸またはcis−バクセン酸の濃度を1.4〜45.4μMの範囲で変化させることによって、検量線を作成した。ISは、両方のFAと混合されるので、オレイン酸とcis−バクセン酸が共存することが定量の性能に影響するかを調べることは重要である。cis−バクセン酸/ISおよびオレイン酸/ISの検量線から計算された傾き(0.3587/0.2075=1.729、図2D)を、cis−バクセン酸/オレイン酸混合物を用いて直接計測された傾き(A=1.694)(図2B)と比較した。これらの2つの傾きは一致することが見出された。ゆえに、複数の異性体の共存は、それらの互いの量的相互関係に対して検出可能な影響を及ぼさないと結論付けられた。この特徴のおかげで、PCD−MSnが、無限の数の脂質C=C異性体を特徴付けることおよび定量することが可能である。
確立されたら、PCD−MSnを、ラット脳由来の複雑なFAおよびPL抽出物由来の脂質C=C異性体を定量するために応用した。オゾン誘起解離(OzID)などのC=Cの位置を特定できる方法とクロマトグラフィーを組み合わせることによってPL種のC=C異性体の存在を報告した論文は、最近までほとんどなかった。脂質C=C異性体の特徴付けに加えて、本発明の方法は、相対定量によって脂質C=C異性体の組成情報も提供できる。いかなるクロマトグラフィー分離も行わずに、PCD−MSnをショットガンリピドミクスとつなげることによって、分析を行った。不飽和FAの場合、それらには、モノ不飽和脂肪酸(MUFA)およびポリ不飽和脂肪酸(PUFA)が含まれる。FA20:4を除いては、それらのP−B反応生成物のフラグメンテーションは、大量の診断用イオンを放出する。ラット脳における不飽和FAのうち、FA16:1、18:2および20:4が、FA16:1 n−7、FA18:2 n−6およびFA20:4 n−6の形態で純粋であることが見出された。対照的に、FA19:1は、n−8およびn−10異性体の混合物であり、FA18:1および20:1も、n−7およびn−9異性体の混合物であり、FA22:1は、3つのn−7、n−9およびn−11異性体からなる(図3A)。FA20:4のP−B反応収率は高いが、しかしながら、PUFAおよびそれらの反応生成物のCIDの際の主なCO2ロス(−44Da)に起因して、診断用イオンは生成されなかった。この問題を回避するために、Li+を電荷担体として使用したところ、[PUFA+Li]+付加体を形成することによって、CO2ロスの抑制に成功した。このようなストラテジーは、PCD−MSnとも適合し、PUFA C=C異性体の定量を可能にする(下記の実施例を参照のこと)。リチウム化されたFA20:4のP−B反応生成物のCIDによって、4対のリチウム化された診断用イオンが大量に放出される(下記の実施例を参照のこと)。続いて、ホスファチジルコリン(PC)、リゾPC(LPC)、ホスファチジルエタノールアミン(PE)、リゾPE(LPE)、ホスファチジルイノシトール(PI)、リゾPI(LPI)、ホスファチジルセリン(PS)およびリゾPS(LPS)を含む、検出されたすべての不飽和PLの包括的分析を行った。ネガティブCIDによる不飽和PL異性体の定量原理は、下記の実施例(ポジティブCIDによる定量原理については図1Gに言及している)で詳述されている。FA18:1 n−7およびn−9異性体が共存することと一致して、ラット脳におけるすべてのC18:1含有PLも、n−7およびn−9異性体の混合物に特定される。これは、他のFAおよび対応する脂肪酸アシルを含むそれらの対応するPL(C18:2、C20:1、C20:4およびC22:6)にとって普遍的真実である(図3Aおよび下記の実施例)。このような知見は、遊離FAが基質として使用される良く確立したPL合成機構に基づく。
種々のラット器官における脂質C=C異性体の異性体組成を調査し、比較するために、5つのラット器官の組織由来のFAおよびPL抽出物を分析した。すべての器官に共通の大量のPC種、PC16:0/18:1を本発明の方法の最初の標的とした。そのP−B反応生成物のタンデムMSは、PC16:0/18:1 n−7およびn−9異性体の存在を強く示唆する2対の診断用イオン(m/z650.5/676.6および678.5/704.5)を生成する(図4A〜B)。驚いたことに、PC16:0/18:1の異性体組成は、ラット器官において大きなばらつきを示した。このばらつきは、脳と筋肉の間で最も有意であり:脳では、n−9異性体の診断用イオンは、n−7異性体の診断用イオンよりも大量であったのに対して、筋肉ではその逆であった。分析されたすべてのラット器官におけるPC16:0/18:1 n−7の相対量は、脳<脂肪<腎臓<肝臓<筋肉の順序に従う。このデータは、遊離FAとPLにおける対応する脂肪酸アシルとの間に相関関係があることを示している。FA18:1およびC18:1含有PLを分析した。脳以外のすべての器官において、脂肪、腎臓、肝臓から筋肉まで、FA18:1 n−9およびC18:1 n−9含有PLの相対量の一貫した増加が観察された。脳、筋肉、腎臓および肝臓は24〜26%、脂肪は13%のFA18:1 n−7を含む。これらの結果から、FA異性体の組成が、原形質膜の主要な構成要素であって正常なタンパク質の機能に不可欠なPLの異性体組成の測定において役割を果たすことが実証される。ラット腎臓、肝臓および筋肉において、各器官由来の3セットのC18:1含有PLの異性体組成に関して、不均一性が観察された(下記の実施例を参照のこと)。概して、n−7異性体は、脳、腎臓、肝臓から筋肉において相対量の増加が見られたが、多くのPLは、3つすべての器官において検出できなかった。
種々のラット器官における脂質C=C異性体の組成の変化が確認された後、正常細胞/組織と癌性細胞/組織との間に同様の差異が存在し得るかに関して調査した。マウス乳癌を研究のモデルとして選択し、正常なマウス***組織をコントロール(野生型、WT)として使用することによって、本発明の方法を検証した。すべての極性脂質抽出物から、PCが、+ナノESIによって検出された最も多い脂質種であった。ゆえに、次いで、C18:1を含むPC(PC16:0/18:1、PC18:0/18:1、PC18:1/18:1を含む)をP−B反応およびタンデムMSに供することにより、異性体組成を測定した(下記の実施例を参照のこと)。異なるプロトコルを用いてFAを抽出し、FA18:1の異性体を定量して、C18:1含有PCと比較した。
本明細書中のデータは、複雑な組織抽出物中の脂質C=C異性体の効率的かつ正確な定量に対するPCD−MSnストラテジーの能力を示す。この方法は、以下の理由から、不飽和脂質を定量分析するための日常的な手法として使用できる:(1)この方法は、構造の特徴付けと異性体定量の両方の能力を有することにより、無限の数の脂質C=C異性体の分析が可能である。(2)定量分析にとって極めて望ましい非常に高い信号雑音比(S/N)を、診断用イオンに対して達成できる。第1に、CIDが適用されて、診断用イオンが生成され、この間にMS1におけるほとんどの干渉が除去された。第2に、オキセタン環は、選択的に開裂されて大量の診断用イオンを生成し得る高エネルギー構造である。(3)P−B反応は、C=Cに対して非常に選択的であるがC=Cの位置に関係ない、ラジカルに基づく反応であるので、すべてのタイプの不飽和脂質が、誘導体化され得、ポジティブモードとネガティブモードの両方において分析され得る。(4)診断用イオンは、タンデムMSにおいて生成されたので、それらは、それらのプリカーサー脂質に容易にマッピングされ得ることから、複雑な混合物の直接的な分析が可能になる。ゆえに、PCD−MSnは、大規模な定量分析のためのショットガンリピドミクスに適合しており、それと容易に組み合わせることができ、前段のクロマトグラフィーによる分離または後段の機器による修飾が不要である。
他の文書(例えば、特許、特許出願、特許公報、学術誌、書籍、論文、ウェブコンテンツ)に対する参照および引用は、本開示全体を通して行われる。そのような文書はすべて、あらゆる目的のためにそれらの全体が参照により本明細書中に援用される。
本明細書中に示されるおよび記載されるものに加えて、本発明およびその多くのさらなる実施形態の様々な改変は、本明細書に引用される科学文献および特許文献への言及を含む本文書の全内容から当業者に明らかになるだろう。本明細書中の主題は、様々な実施形態およびそれらの等価物において本発明の実施に適応され得る重要な情報、例証および指針を含む。
脂肪酸抽出プロトコル:1mLのMeOHおよび25mM HCl(1%v)を50mgの組織に加えた後、ガラス管の中でサンプルを均質化した。次いで、そのサンプルを30秒間ボルテックスした後、2700rpmで10分間遠心した。その後、上清を除去し、乾燥するまで蒸発させた。
図5A〜Bおよび表1におけるデータは、イオン注入時間が長くなる(10〜200ミリ秒)に従って、プリカーサーイオン(P−B反応生成物)、58Daニュートラルロス後のイオンおよびDIのすべての絶対強度が同様に上昇したことを例証している。しかしながら、DIおよび58Daニュートラルロス後のイオンの相対強度は、注入時間が20倍長くなっても非常に安定している。DIおよびニュートラルロスイオンの生成は、2つの逆P−B反応経路であるので、これらの結果は、その2つの逆経路の間の分岐が注入時間に依存しないことを示唆している。このような重要な特徴は、CID分析のためのイオントラップに入れられるプリカーサーイオンの量を慎重に調節することを不要にする。
PC18:1 n9/18:1 n9と18:1 n12/18:1 n12との混合物を用いて、+ナノESIによってP−B反応動態を研究した。P−B反応生成物の量をそれらの抽出イオン電流(EIC)によって表した。LP−Hgランプが温まったら、反応生成物の量の急増が観察された。この反応は、約0.3〜0.5分後に安定になり、プラトーに達した。
方法1:ISとして第3の異性体を使用する絶対定量:定量されるべきものとは異なる1つのC=C異性体を内部標準(IS)として使用した。次いで、ISの診断用イオンとサンプル中の分析されるべきC=C異性体由来の診断用イオンとの比が、計算され得る。C=C異性体の絶対量は、そのISを用いて各異性体に対して作成された検量線から求めることができる。
以下のパラメータを以下のとおり定義する:
I1:標準添加法の前の2対の診断用イオン間の強度比
I2:標準添加法の後の2対の診断用イオン間の強度比
Δc:異性体濃度の増加(この場合、FA18:1 n11の濃度)
c1:FA18:1 n11の濃度
c2:FA18:1 n9の濃度。
C18:1 n11とC18:1 n9との間の検量線は、I=1.6942x−0.017(xは、濃度比(FA18:1 n11対FA18:1 n9)である)であるので、以下が導かれる:
PL頭部基の極性に応じて、PLは、正または負イオンモードで分析され得る。したがって、PCは、+ナノESIによって分析し、PA、PI、PEおよびPSは、−ナノESIによって分析した。ここで、本発明者らは、2つの例(PC18:0/18:1およびリゾPE18:1)を用いて、P−B反応/タンデムMSを用いたPLの相対定量を実証する。PLにおけるアシル鎖情報は、それらのギ酸付加体、酢酸付加体または塩素付加体の(−)CIDを介して得ることができる(図9A〜Bを参照のこと)。
すべてのラット器官におけるFA18:2について、そのP−B反応生成物のCIDは、C9およびC12におけるメチレンによって分断された2つのC=Cと一致する2対の診断用イオンを放出する(FA18:2 n6)。図10を参照のこと。
ラット器官からのPL抽出物を分析したところ、それらの結果は、多価不飽和脂肪酸アシルが、純粋な異性体として存在するという結論に至り(C18:2およびC20:4はC18:2 n6およびC20:4 n6として;ならびにC22:6はC22:6 n3として)、これは、以前に特定されたPUFAと一致する。
図16は、ラット組織におけるオレイン酸およびcis−バクセン酸の生合成経路を示している。ラット組織由来のPL抽出物の組成上の複雑さを考慮して、特定のクラスに属するPLおよびそれらの脂肪酸アシルの特定を速めるために、プリカーサーイオンスキャン(PIS)およびニュートラルロススキャン(NLS)を利用することができる。例えば、m/z184(+MS/MSにおける)のイオンを用いることにより、すべてのPC、リゾPCおよびSMの情報をはっきり限定して抽出することができ、m/z241(−MS/MSにおける)のイオンを用いることにより、複雑な脂質混合物由来のすべてのPIの情報を抽出することができる。187Daおよび141Daのニュートラルロスは、それぞれPSおよびPEに特徴的である。ラット脳の代表的なPISおよびNLSスペクトルを図17A〜Dに示す。
本明細書中のデータは、分析されたすべてのラット組織におけるPC16:0/18:1の異性体組成が種々の器官の間で様々であることを示している。問うべき当然の疑問は、PC16:0/18:1に対して観察された傾向は他のPLに当てはまるのか?である。この疑問に答えるために、腎臓、肝臓および筋肉をはじめとした他のラット組織におけるC18:1含有PLを分析した。PL抽出物のナノESI質量スペクトルから証明されたように、これらの組織における脂質組成は異なるので(図20)、調べた器官に共通する大量のPL種は、ほとんどなかった。しかしながら、この事実は、種々の器官におけるPL異性体組成の不均一性を見抜くことを妨げない。各器官において最も大量だったC18:1含有PLを選択したところ、それらの異性体組成が似ていると見られることが観察された。より興味深いことに、PL異性体組成の器官間のばらつきは、明白であり、図20に示されているように、PC16:0/18:1の異性体組成(図4)と一致する。C18:1 n7異性体の相対量は、筋肉で最も多く、腎臓で最も少なかったとみられる。
図23に示されているように、正常マウス***組織(WT)の結果と比べて、FA18:1 n7およびC18:1 n7含有PCの一貫した増加がマウス乳癌組織において観察された。正常組織(各パネルの左)および癌性組織(各パネルの右)由来の(図23A)FA18:1、(図23B)PC34:1、(図23C)PC36:1および(図23D)PC36:2のP−B反応生成物のCID質量スペクトル。(図23D)では、PC18:0/18:2の相対量の減少も同様に明らかに観察された。PC18:0/18:2の特定に導く診断用イオンは、m/z678.5/704.5および718.5/744.6であった。下記の表4〜5も参照のこと。
ソフトイオン化と連結されたタンデム質量分析(MSn、ここで、nは質量分析工程の数である)は、脂質分析のための好ましいプラットフォームとして登場している。すでに論じたように、C=C結合の位置を明確に決定することは、分析上の難題であり続けている。上記のことは、パターノ・ビューチ(P−B)反応(UVによって励起されたアセトンと不飽和脂質中のC=C結合との間の付加環化)の変法をオンラインナノエレクトロスプレーイオン化(ナノESI)MSnに適用することによって、複雑な混合物中のリン脂質および脂肪酸に対するC=C結合の位置が、高い信頼性で決定できることを例証している。P−B反応は、ボロシリケートナノESIエミッターのUV照射およびスプレープルームを介して実施され得る。この実施例では、ESIの前にその反応を溶融石英キャピラリーである「マイクロリアクター」において実施することによって、上記方法を改変した。シリンジポンプによって、長い光化学反応時間にわたって、溶液がコイル状のキャピラリーを通って加圧送液された。パラメトリック研究から、4.5μL/分での6秒以内のUV曝露において、7:3アセトン:H2O 1%モディファイヤー溶媒条件において、PC16:0_18:1(n−9Z)およびオレイン酸(n−9Z)に対してそれぞれ50%および40%P−B反応収率が達成されたことが示された。この反応は、0.1〜4.5μL/分の流速範囲にわたって首尾良く実行され、脂質溶液における種々のLC溶媒とも適合した。最後に、この方法が生物学的抽出混合物に適用できることを実証するために、酵母極性脂質抽出物を分析することによって、この方法の有用性を試験し、合計35個の不飽和リン脂質に対してC=Cの位置が明らかにされた。
脂質は、疎水性の特色を有する多様な分子であり、脂質は、主要な生体分子脂質として、細胞膜の形成、細胞のシグナル伝達およびエネルギーの貯蔵などの重要な生物学的機能を果たす。生体系における脂質の理解を深めるために、生体系における脂質種の構造同定、空間的および時間的分布に関して完全に特徴付けることを目的に、リピドミクスという分野が強力なツールとして登場した。最先端の脂質分析は、タンデムMS(MSn、ここでnは質量分析工程の数である)を介して高レベルの構造情報を得る際に、その低濃度での感度および選択性に起因して質量分析(MS)と連結される、大気圧の「ソフト」イオン化源、例えば、エレクトロスプレーイオン化(ESI)をほとんど例外なく利用する。
不連続な曝露を介するP−B反応とオンラインESI MSnを実施するためのこの実施例での構成を図24に示す。この配置は、UV曝露の程度を変動させるときの実験条件に対する妨げが最小であることに起因して探索的研究に最適であると考えられた。表面積:体積比が20,000m2/m3(マイクロリアクター寸法)である、フルオロポリマーでコーティングされた溶融石英キャピラリー(内径100μm)をESI源に接続し、UV透過性材料として利用した。溶融石英を、直径2.5cmの高密度ポリエチレンチューブに巻きつけ、一巻きに対して1cmの長さがランプに曝露されるように、アルミニウム箔を用いて、その溶融石英を永久に覆った。それぞれの露出部分から0.5cmの距離にランプを配置し、不連続な部分をアルミニウム箔で覆う/覆わないことによって、累積曝露時間を制御した。UVに曝露される溶融石英管の総容積をサンプルの流速で除算することによって、累積曝露時間を決定した。
不飽和脂質におけるC=C結合の位置を特定するために、代表的な[2+2]パターノ・ビューチ反応をオンラインESI MSnに結合するための方法を示した。流速、溶媒組成およびUV曝露時間をはじめとした一連のESI MS条件について、反応の限界を探索した。50%という最高収率が、7:3アセトン:H2O 1%酢酸において6秒間の累積UV曝露を用いたとき、5μM PC16:0_18:1(n−9Z)で達成された。負イオンモードにおけるオレイン酸およびPA18:0_18:1(n−9Z)の塩基性溶液で、40%という収率が得られた。溶液中に分子状酸素が存在するとP−B反応収率が低下したので、分析の前に溶液にN2をパージした。その反応は、0.1〜4.5μL/分の流速範囲において首尾良く実行され、比較的一定した反応生成物の形成を示した。さらに、LC分離において日常的に使用される、アセトニトリル、メタノール、イソプロパノールおよびヘキサンなどの代替溶媒を加えることによっても、P−B反応を行った。最後に、酵母極性抽出物の複雑な混合物のオンライン分析へのこの方法の適用が実証された。反応環境が、上記モデル系と比べてかなり複雑であったにもかかわらず、合計35個の不飽和リン脂質のC=Cの位置が特定された。このような研究から、本明細書中の本発明が、複雑な混合物中の脂質のC=Cの決定のために、カラム分離後のティー接合部を介して、P−B反応をオンラインLC−MSと連結することを達成することが可能になる。
単純な手順を用いた質量分析(MS)による直接組織分析は、リピドミクス分析、特に、異性体脂質の不飽和に関する研究のためのリピドミクス分析を加速させる際に鍵となる工程である。この実施例では、まず、組織由来の不飽和脂質の異性体構造を、体系的な構造プロファイルを用いて、オンラインのパターノ・ビューチ(P−B)反応および抽出スプレー質量分析によって実行されたアンビエント質量分析によって単一工程で直接決定した。大きな塊の組織にステンレス鋼ワイヤを刺し、次いで、ESI−MSによる抽出、反応および検出のための溶媒が予め充填されたナノESIキャピラリーに浸漬することによって、脂質を直接抽出した。UV光(λ=254nm)を用いてP−B反応を促進することにより、元のC=C結合(bound)の位置にオキセタン環が付加された反応生成物イオン(+58Da)が形成され、それはその後、CIDによって開裂されて、特徴的なフラグメントイオンが生成する。広範なダイナミックレンジの濃度(ラット脳における全脂質の0.0013%〜0.5%)の脂質の不飽和が、良好な再現性で特定され得る(検出される脂質の異性体比:RSD<10%、1つの組織の同じ領域においてサンプリング;RSD<21%、同じタイプの組織の同じ領域においてサンプリング)。本方法のサンプル消費は、10μg/サンプルという少なさで達成され得るので、不飽和脂質の異性体比を、まず、ラット脳および腎臓に対してマッピングした。リゾホスファチジン酸(lysophosphatic acid)(LPA)18:1およびホスファチジン酸(phosphatic acid)(PA)18:1−18:1の異性体比の有意差が、ラット脳の異なる領域において観察されたが、脂肪酸(fatty aicd)(FA)18:1の異性体比は、ラット脳および腎臓の両方において比較的安定していた。
脂質は、細胞膜の発生、エネルギーの産生および貯蔵、ホルモンの産生、疎水性環境における膜タンパク質の隔離および保護、ならびにそれらの自己集合および集団的挙動を介した細胞のシグナル伝達プロセスにおいて緊急の物理化学的特性を示す天然に存在する分子群である。脂質の不飽和、すなわち、C=C結合の数および位置は、脂質の形状を決定する重要なパラメータの1つとして、膜透過性、膜貫通構造および酵素作用との関連において細胞膜の湾曲に影響することによって組織の生物学的機能および病状と密接に関係する。例えば、膜内の秩序化は、C=C結合がアシル鎖の中央に位置するとき、最も弱いと見出されたので、膜の流動性を高める。さらに、脂質のメチル末端から3番目に位置するシグニチャC=C結合とともに18〜22個の炭素を含むオメガ−3脂肪酸が、脳の発達において重要であること、ならびに冠状動脈心疾患の一次および二次予防の試験(trails)の両方において心保護機能を発揮することが見出された。しかしながら、C=Cの位置の特定は、なおも大きな難題であり、分子構造をプロファイルするためおよび脂質の異性体を考えられる多くのものと識別するための信頼できる分析プラットフォームが必要とされている。
デザインおよび手順を図29Aに示した。大きな塊の組織にステンレス鋼ワイヤを刺し、次いで、抽出および反応のための溶媒が予め充填されたナノESIキャピラリーに浸漬することによって、脂質を直接抽出した。そのワイヤに高電圧を印加して、ナノESIを行った。254nmのUV光の低圧水銀ランプを用いて、元のC=C結合の位置にオキセタン環が付加された反応生成物イオン(+58Da)を形成させるためのP−B反応を促進し、その後、その反応生成物イオンをCIDによって開裂させて、特徴的なフラグメントイオンを生成した(図29B)。
ヒト疾患に対するバイオマーカー発見のための有望な分野としてリピドミクスが登場した。分子情報が提供され得る直接組織分析は、臨床診断において利用可能であり得る。生物組織由来の脂肪酸および脂質をプロファイリングするために、この実施例では、ポイントオブケア適用のために設計された卓上用のMini12を、直接サンプリングイオン化とともに使用した。脂質の不飽和異性体の相対存在比を定量するために、パターノ・ビューチ(PB)反応を用いた光化学誘導体化も実行した。
この実施例は、脂質における炭素−炭素二重結合(C=C)の位置を決定するための方法の開発ならびに定性的および定量的リピドミクスに対するその使用を示す。
生体分子の重要な1クラスとしての脂質は、エネルギー貯蔵および細胞膜の構造成分に関するこれまで認識されていた役割ならびに制御性のシグナル伝達分子および細胞−細胞シグナル伝達分子として後に確立される役割などの多様な機能を果たす。脂質のこれらの多様な機能は、それらの多様な構造に起因する。約40,000(2015年4月2日現在)のユニークな脂質構造が、LIPID MAPSデータベースによって記述されており、それらは、細胞(すなわち膜)内で、および細胞小器官間で、一様に分布していない。脂質研究の大きな難題の1つは、細胞がどのようにして脂質ホメオスタシスを維持および制御しているかを理解することである。生物学および生物分析ツールが進歩するにつれて、完全な細胞の脂質組成の特徴付け(リピドーム)ならびに脂質−脂質および脂質−タンパク質の相互作用は、いまやシステムレベルでアプローチ可能である。細胞の脂質に対する質量分析ベースの分析は、包括的な脂質の同定および定量を提供するためのリピドミクスにおける主要なツールとして確立されている。このようにして得られた脂質プロファイルは、疾患に結びつく全脂質組成の変化を研究するためにますます使用される。リピドミクスはまだ、比較的初期の段階にあり、高感度、高特異性およびハイスループットの脂質分析ツールの開発が、脂質の多様性および脂質ホメオスタシスの機能的意義に関する研究を大きく押し進め得る。
C=Cのユニークな化学的特性は、ラジカル攻撃を受けやすい点であり、それは、ラジカルが関わるMS分析による研究を促す。本明細書中の実施例は、ESIとMSとのインターフェース領域において脂質のC=Cを標的にするラジカル反応の開発に焦点を当てる。このアプローチには、ESIベースのリピドミクスにとって2つの魅力的な特徴がある。第1に、ラジカル反応は、速く(制限された拡散速度)、直接ESI注入法と容易に連結できるか、または分離の後かつESI−MSの前にオンラインで行うことができる。第2に、反応が質量分析計の外で起きるので、その反応は、ESIインターフェースからなる任意のタイプのMSに適用できる。しかしながら、有機化学からC=Cに対して報告された多くのラジカル反応の中でも、脂質分析に対する優れた反応候補は、以下の因子を満たすべきである:1.C=Cに対する高い特異性、2.妥当な反応収率;3.インタクトな脂質と、さらなる構造分析のために反応によって改変された脂質との間に検出可能な関連があるようなC=Cの直接的な開裂がないこと;脂質のMS分析に対する妨害(例えば、イオン化効率、荷電特性)が最小の反応体。
PB反応は、従来、有機合成においてバルク溶液中で行われてきた。このタイプの反応の比較的低い量子収率(0.01〜0.1)を考慮して、有機合成では、高濃度の反応体(mM〜M)、長い反応時間(3〜24時間のUV照射)および無極性溶媒が使用される。これらの条件は、ESI−MS/MSを用いるときの典型的な脂質分析条件とも、PB反応とMS/MSとのオンライン連結の要件とも、直接適合しない。これらの問題に対処するために、オンライン光化学反応ならびにMSによるインサイチュでの反応のモニタリングおよび生成物の分析の実施を可能にする反応容器および方法を開発した。この研究によって、MSによって良好なPB反応収率および高感度の脂質検出を達成するために重要な因子を特徴付けることができた。
C=Cを決定するためのPB−MS/MSの分析能力は、特定の不飽和脂質のPB反応生成物の気相フラグメンテーション挙動に大いに依存する。種々の脂質クラスの構造多様性を考慮して、本発明者らは、頭部基、アシル鎖、C=C位置の決定を含む、得ることができる構造情報の量を最大にすることに関して、タンデムMS法を特定の各脂質クラスに調整する。本発明者らは、脂質C=C位置の異性体を特徴付けるための方法の開発および確立されたMS/MS条件に基づいてそれらを定量することにも焦点を当てる。主要な脂質クラスの、C=Cの位置が既知である純粋な不飽和脂質を、方法を開発するためのモデルとして使用する。この実施例は、不飽和脂質の構造情報と定量情報の両方を得るためにCIDベースのMS/MSを使用するための標準的なガイドラインを提供する。
MSベースのリピドミクス分析は、生物学的サンプル由来の脂質抽出物に対して直接行うことができる(いわゆるショットガンリピドミクス)か、またはLC分離と連結することができる。ショットガン法は、構造情報と定量情報の両方を提供することによってリピドームのハイスループットな包括的プロファイリングを容易にし、バイオマーカーの検出および検証のための強力なツールになる。低存在比の脂質、イオン化効率が低い脂質、ならびに脂質異性体の同定および定量は、高度の複雑さ(200〜400個の脂質種)、異なる化学的−物理的特性、および広範なダイナミックレンジ(4〜6桁の濃度差)に起因して、生物学的サンプル由来の脂質抽出物を分析する際のショットガンアプローチにとって常に難題である。この課題は、LCなどの分離をMS分析の前にまたはMS分析とオンラインで行うと、効果的に対処される。現在、ショットガン法およびLC−MS(/MS)法は、ほぼ等しい頻度で用いられており、合わせると、リピドミクスに関する科学報告の80%を占める。複雑な脂質混合物の分析によるC=C特異性を高めるために、これらの2つのプラットフォームの両方においてPB−MS/MSストラテジーを実施することは、非常に興味深い。
PB−MS/MSを行うために最適化されたパラメータに基づいて、ラット組織由来の脂質抽出物を使用し、不飽和脂質分析に対するその有用性を、C=C位置の異性体の検出および定量のユニークな能力に重点を置いて検証した。このタイプの情報は、哺乳動物のリピドームの内在性の多くの脂質クラスで獲得されていないので、さらなる方法の開発、およびC=Cの決定を可能にする他の分析方法(例えば、OzID)との相互比較のためのベンチマークを形成し得る。このプロジェクトの別の目標は、信頼性の高いC=C割り当て、ならびにC=C異性体が存在する場合、その組成を含む、生物学的サンプル由来の不飽和脂質のデータベースを確立することである。このデータベースは、自動的な未知脂質C=Cのためにも使用され得る。
脂肪酸(FA)のプロファイリングは、表現型情報を提供するので、広範囲の生物学的および生物医学的研究にとってかなり興味深い。不飽和FAの定量、特に、高い信頼性で炭素−炭素二重結合(C=C)の位置を割り当てることを伴う不飽和FAの定量は、従来のガスクロマトグラフィー−質量分析を用いるとき、サンプルと時間の両方を消費する。この研究において、本発明者らは、クロマトグラフ分離を頼りにせずに不飽和FAをプロファイリングするための迅速かつ高感度の定量的方法を開発した。この方法は、FAにおけるC=Cの溶液中での光化学的タギングと、その後のニュートラルロススキャンタンデム質量分析による気相デタギング(de−tagging)との組み合わせに基づいた。この方法は、生物学的サンプル(血液、血漿および細胞株)由来の一連の不飽和FAの直接的な定量を可能にした。ここで、従来から見過ごされていたFAのC=C位置の異性体の定量情報を得ることができ、正常なヒト前立腺細胞と癌性ヒト前立腺細胞との間のFAの変化の研究に応用できた。
光化学的タギングに続く58Da NLSの方法を、ヒト血漿(20μL)におけるFA分析に適用した。FA17:1(10Z)(7.5μM)をISとして抽出物に加えた。ナノESI−MSからのFAのプロファイルは、図59Dに示され、一方、不飽和FAのプロファイルは、58DaのNLSから見出すことができる(図59F)。C=Cの位置を決定するためおよびC=C位置の任意の異性体の存在を判定するために、定量的研究の前に、PB−MS/MSを各個別の不飽和FA(単一のアセトンでタグ化されたFA)に適用した。本発明者らは、FA16:1(9)、18:2(9,12)および20:4(5,8,11,14)が、純粋な形態として存在することを見出した(ここで、括弧内の数字はC=Cの位置を示している)。次いで、これらのFAの定量を58Da NLSから得、以下のとおり測定された:28.9±1.6μMのFA16:1、193±20μMのFA18:2および18.2±2.3μMのFA20:4(図69)。PB−MS/MSは、FA18:1およびFA18:3が、C=C位置の異性体からなることを明らかにした。図62Aに示されているように、タグ化されたFA18:1(m/z339)のMS/MS CIDが、m/z171、197およびm/z199、225に2対の診断用イオンを生成した。これらの診断用イオンの検出は、それぞれΔ9およびΔ11におけるC=C位置の異性体の存在を明らかに示唆した。それらの2つの異性体のC=C診断用イオン強度比(Δ11/Δ9=0.0662)および確立されたモル比検量線(図62B)に基づいて、FA18:1は、91.5%Δ9および8.5%Δ11異性体からなると見出された。
癌生物学の研究を助けるために、脂肪酸などの代謝産物の変化の定量的モニタリングが、ますます用いられる。FAのプロファイルは、細胞代謝の変化に起因して、正常細胞から癌(cancel)細胞に有意に変化することが示された。しかしながら、不飽和FAの同一性は、代表的には、C=Cの位置特異性のレベルで測定されない;ゆえに、異性体における個々のC=Cの位置の変化は、未知である。光化学的タギングに続く58Da NLSという本発明者らの方法を用いることによって、不飽和FAに対して高い分子特異性で定量することが可能であった。正常ヒト前立腺細胞(RWPE1)および癌性ヒト前立腺細胞(PC3細胞)を比較研究のためのモデル系として使用した。主要なFA種は、FA16:0、16:1、18:0、18:1および18:2を含むと見出された(図73に要約された2つの細胞株のFAプロファイル)。FA16:1およびFA18:2は、本発明者らの方法を用いて純粋であると判定され、両方の細胞株でC=Cが、それぞれΔ9およびΔ9、12に位置し、FA18:1は、Δ9およびΔ11異性体からなった(図74)。
すべてのFAおよびジュウテリウムで標識されたFA標準物質をCayman Chemical(Ann Arbor,MI)から購入し、さらに精製せずに使用した。プールされたヒト血漿(抗凝固薬としてLiヘパリン)をInnovative Research(Novi,MI)から購入した。他の化学物質は、Sigma Aldrich(St.Louis,MO)から購入した。
すべての細胞を、37℃の湿度恒温器内において5%CO2供給で培養した。前立腺癌PC3細胞を、10%ウシ胎児血清(FBS)、100単位/mLペニシリンおよび100μg/mLストレプトマイシンが補充されたF−12K培地中で維持した。正常な前立腺上皮RWPE1細胞を、30μg/mlウシ下垂体抽出物および0.2ng/mlヒト組換え上皮成長因子(Invitrogen,Carlsbad,CA)が補充されたケラチノサイト無血清培地中で培養した。
以下の方法を用いて、ヒト血漿からFAを抽出した。
以下の方法を用いて、細胞からFAを抽出した:
定量に向けて、MS分析の前に、MUFAをアセトン/水(50/50v/v)中の5%エタノールに溶解し、一方、PUFAをアセトン/水(50/50v/v)中の40%エタノールに溶解した。ネガティブモードナノESI−MSによるFAの検出を容易にするために、0.5%(v/v)NH4OH(NH3として28%〜30%)をすべてのFA溶液に加えた。ホウケイ酸ガラスキャピラリーチップ(外径1.5mmおよび内径0.86mm)を用いて、P−1000 Flaming/Brownマイクロピペットプラー(Sutter Instrument,Novato,CA,USA)によって、外径が約10μmのナノESIチップを引き延ばして作製した。そのホウケイ酸ガラスチップの後ろの開口部から脂質溶液を充填した。電気接点として働くそのチップにステンレス鋼ワイヤを挿入し、ナノESIチップをMSサンプリングオリフィスと整列させた。PB反応1を介した光化学的タギングを惹起するために、低圧水銀(LP−Hg)ランプ(254nm,Model No.:80−1057−01,BHK,Inc.,CA,USA)をナノESIエミッターから1.0cmに配置した。すべてのMS実験を4000QTRAP三連四重極/リニアイオントラップ(LIT)ハイブリッド質量分析計(Applied Biosystems/Sciex,Toronto,Canada)において行い、その概略図を図64に示す。機器のパラメータは、以下のとおりであった:ESI電圧、−1200〜1800V;カーテンガス、10psi;インターフェースヒーター温度、40℃;デクラスタリング電位:−20V。選択されたPB反応生成物のMS/MS分析のために、単離幅を1.5Thに設定し、プリカーサー強度をおよそ4×106カウントで維持した。イオン注入時間は、10〜200ミリ秒であった。FAのPB反応生成物のために使用した衝突エネルギー(CE)は、35V(ビーム型CID)または50a.u.(共鳴トラップCID)であるように最適化された。ニュートラルロススキャン(NLS)の場合、35VのCEを使用した。
図65に示すスキームに従って、FA抽出効率を推定した(同位体で標識された内部標準を用いて)。結果を表12に示す。
Claims (27)
- 組織サンプルを分析するための方法であって、該方法は、
不飽和化合物を含む組織サンプルを得る工程;
該不飽和化合物内の炭素−炭素二重結合を標的にするラジカル反応を該組織サンプルにおいて行うことにより、複数の化合物異性体を生成する工程;
該複数の化合物異性体を質量分析に供する工程であって、該不飽和化合物内の該炭素−炭素二重結合の位置を特定する工程;および
正常組織と罹患組織とを識別するために該複数の化合物異性体を定量する工程
を含む、方法。 - 前記不飽和化合物が、脂質または脂肪酸である、請求項1に記載の方法。
- 前記ラジカル反応が、前記不飽和化合物および該ラジカル反応用の試薬を紫外線に曝露する工程を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記不飽和化合物が質量分析プローブ内に存在している間に、前記ラジカル反応が行われる、請求項3に記載の方法。
- 前記質量分析プローブの少なくとも一部が紫外線に対して透過性である、請求項4に記載の方法。
- 前記質量分析プローブが、およそ200nmの波長の紫外線に対して透過性である材料から構成される、請求項5に記載の方法。
- 前記ラジカル反応が容器内で行われ、該反応の後、前記化合物異性体が質量分析プローブに移される、請求項3に記載の方法。
- 前記ラジカル反応が、高圧液体クロマトグラフィーシステムと関連して行われ、該ラジカル反応用の試薬が、溶出溶媒中に存在する、請求項1に記載の方法。
- 前記ラジカル反応が、パターノ・ビューチ(PB)反応である、請求項1に記載の方法。
- 前記パターノ・ビューチ(PB)反応が、アセトンを含む溶媒混合物中で行われる、請求項8に記載の方法。
- 組織サンプルを分析するための方法であって、該方法は、
不飽和化合物がサンプリングプローブ上に保持されるように、該不飽和化合物を含む組織に該サンプリングプローブを接触させる工程;
該サンプリングプローブを中空体に挿入する工程であって、ここで、ラジカル反応用の試薬が、該中空体内に存在し、該ラジカル反応は、該不飽和化合物内の炭素−炭素二重結合を標的にする、工程;
該ラジカル反応を該中空体内で行う工程であって、反応生成物を生成する工程;
該反応生成物を該中空体の遠位端から放出する工程;および
該不飽和化合物内の該炭素−炭素二重結合の位置を特定するために、放出された反応生成物を質量分析計において分析する工程
を含む、方法。 - 前記不飽和化合物が、脂質または脂肪酸である、請求項11に記載の方法。
- 前記サンプリングプローブが、針を備える、請求項11に記載の方法。
- 前記ラジカル反応が、前記不飽和化合物および前記ラジカル反応用の試薬を紫外線に曝露する工程を含む、請求項13に記載の方法。
- 前記反応が行われている間に、前記不飽和化合物を前記中空体に通過させる、請求項14に記載の方法。
- 前記中空体の少なくとも一部が、紫外線に対して透過性である、請求項15に記載の方法。
- 前記中空体が、およそ200nmの波長の紫外線に対して透過性である材料から構成される、請求項16に記載の方法。
- 前記中空体が、石英ガラスまたは溶融石英から構成される、請求項17に記載の方法。
- 前記ラジカル反応が、パターノ・ビューチ(PB)反応である、請求項11に記載の方法。
- 前記パターノ・ビューチ(PB)反応が、アセトンを含む溶媒混合物中で行われる、請求項19に記載の方法。
- 組織サンプルをイメージングするための方法であって、該方法は、
不飽和化合物を含む組織にラジカル反応用の試薬を導入する工程であって、ここで、該ラジカル反応は、該不飽和化合物内の炭素−炭素二重結合を標的にする、工程;
該ラジカル反応を行う工程であって、反応生成物を生成する工程;
該反応生成物が時間分解的に脱離され、イオン化されるように、該組織を走査する工程;
該脱離され、イオン化された反応生成物を質量分析計において分析する工程;および
該分析工程の結果に基づいて該組織のイメージを生成する工程
を含む、方法。 - 走査が、前記組織上の複数の異なる位置において脱離エレクトロスプレーイオン化プローブを用いて脱離エレクトロスプレーイオン化法を行うことを含む、請求項21に記載の方法。
- 前記ラジカル反応用の前記試薬が、前記脱離エレクトロスプレーイオン化プローブを介して前記組織に導入され、紫外線が、該組織に適用される、請求項22に記載の方法。
- 前記ラジカル反応を行う工程と前記走査する工程が同時に行われる、請求項23に記載の方法。
- 前記導入する工程が、MALDIマトリックス中のラジカル反応用の試薬を前記組織に適用する工程を含む、請求項21に記載の方法。
- 走査が、前記組織上の複数の異なる位置においてMALDIソースを用いてMALDI法を行うことを含む、請求項25に記載の方法。
- 前記ラジカル反応を行う工程と前記走査する工程が同時に行われる、請求項26に記載の方法。
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