JP6723319B2 - 出血性障害の治療に対する改変セルピン - Google Patents
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Description
療に対して使用する(非特許文献8において再考される)。バイパス止血剤は、冒された凝固因子を直接供給せずに出血を減少し、すなわちバイパス止血剤はテナーゼ複合体の活性を「バイパス」する。現在のバイパス止血剤の例として、組換えfVIIa及びプロトロンビン複合体濃縮物であるFEIBA(Factor Eight Bypassing Activity:第VII
I因子バイパス止血活性)が挙げられる。これらの補充治療は非常に高額であり(非特許文献9、非特許文献10、非特許文献11、非特許文献12)、両製品の短い半減期のため従来の治療法よりも更に頻繁に高用量で与えられる必要がある(非特許文献13において再考される)。さらに、患者の応答は変動的であり、予測不可能であることが示された(非特許文献14において再考される)。
患者より3倍も頻繁に関節置換を必要とすることを見出した(非特許文献17)。Loweらは、血友病Aの患者は血友病Bと比較して3倍に及ぶ頻繁な入院が必要であったことを見出した(非特許文献18)。
本発明は、他の凝固プロテアーゼと比べてAPCに対する特異性を増大するためのセルピンの改変に関する。APCに特異的な改変セルピンバリアントは、例えば凝血促進剤として有用な可能性がある。
ンのベータシートAの鎖5からベータシートCの鎖1へと伸びる。残基P17のGlu、残基P15のGly、及び残基P14のThrはセルピンにおいて保存される。例えば、セルピンのRCLはコンセンサス配列P17のE、P16のE/K/R、P15のG、P14のT/S、P12〜P9の(A/G/S)4(Hopkins et al. 1993、Irving et al.
2000)を含んでもよい。RCLは残基P17で開始し、通常残基P3’で終わる。RC
Lは、PCI等の一部のセルピンにおいて、P’側に対する追加の残基により伸長されてもよい。例えば、α1−抗トリプシンのRCLは残基P17〜P3’からなり、PCIのRCLは残基P17〜P6’からなる。強調されたP1’、P1、P2及びP4の残基を有するセルピンの例を以下の配列番号1〜配列番号11に示す。成熟セルピンの配列を構成する残基も示される。
(1)P4残基がQであり、P2残基がRであり、P1残基がRであり、P1’残基がNである;
(2)P4残基がKであり、P2残基がRであり、P1残基がRであり、P1’残基がHである;
(3)P4残基がSであり、P2残基がLであり、P1残基がRであり、P1’残基がKである;
(4)P4残基がHであり、P2残基がRであり、P1残基がRであり、P1’残基がVである;
(5)P4残基がFであり、P2残基がKであり、P1残基がRであり、P1’残基がKである;
(6)P4残基がFであり、P2残基がRであり、P1残基がRであり、P1’残基がKである;
(7)P4残基がFであり、P2残基がVであり、P1残基がRであり、P1’残基がKである;
(8)P4残基がCであり、P2残基がLであり、P1残基がRであり、P1’残基がKである;
(9)P4残基がFであり、P2残基がFであり、P1残基がRであり、P1’残基がRである;
(10)P4残基がSであり、P2残基がHであり、P1残基がRであり、P1’残基がRである;
(11)P4残基がGであり、P2残基がIであり、P1残基がRであり、P1’残基がRである;
(12)P4残基がRであり、P2残基がQであり、P1残基がRであり、P1’残基がVである;
(13)P4残基がTであり、P2残基がRであり、P1残基がRであり、P1’残基がVである;
(14)P4残基がRであり、P2残基がRであり、P1残基がRであり、P1’残基がIである;
(15)P4残基がVであり、P2残基がRであり、P1残基がRであり、P1’残基がIである;
(16)P4残基がLであり、P2残基がRであり、P1残基がRであり、P1’残基がIである;
(17)P4残基がTであり、P2残基がLであり、P1残基がRであり、P1’残基がYである;
(18)P4残基がAであり、P2残基がQであり、P1残基がRであり、P1’残基がYである;
(19)P4残基がKであり、P2残基がDであり、P1残基がRであり、P1’残基がMである;
(20)P4残基がWであり、P2残基がWであり、P1残基がRであり、P1’残基がNである;
(21)P4残基がAであり、P2残基がKであり、P1残基がRであり、P1’残基がSである;
(22)P4残基がAであり、P2残基がRであり、P1残基がRであり、P1’残基がSである;
(23)P4残基がAであり、P2残基がPであり、P1残基がRであり、P1’残基がEである;
(24)P4残基がAであり、P2残基がPであり、P1残基がRであり、P1’残基がRである;
(25)P4残基がAであり、P2残基がPであり、P1残基がRであり、P1’残基がKである;
(26)P4残基がAであり、P2残基がTであり、P1残基がRであり、P1’残基がMである;
(27)P4残基がAであり、P2残基がTであり、P1残基がRであり、P1’残基がHである;
(28)P4残基がAであり、P2残基がTであり、P1残基がRであり、P1’残基がQである;
(29)P4残基がAであり、P2残基がTであり、P1残基がRであり、P1’残基がNである;
(30)P4残基がAであり、P2残基がTであり、P1残基がRであり、P1’残基がYである;
(32)P4残基がAであり、P2残基がTであり、P1残基がRであり、P1’残基がRである;
(33)P4残基がAであり、P2残基がRであり、P1残基がRであり、P1’残基がAである;
(34)P4残基がAであり、P2残基がRであり、P1残基がRであり、P1’残基がHである;
(35)P4残基がAであり、P2残基がRであり、P1残基がRであり、P1’残基がCである;
(36)P4残基がAであり、P2残基がRであり、P1残基がRであり、P1’残基がNである;
(37)P4残基がAであり、P2残基がSであり、P1残基がRであり、P1’残基がRである;
(38)P4残基がAであり、P2残基がKであり、P1残基がRであり、P1’残基がNである;
(39)P4残基がAであり、P2残基がKであり、P1残基がRであり、P1’残基がHである;
(40)P4残基がAであり、P2残基がKであり、P1残基がRであり、P1’残基がKである;
(41)P4残基がAであり、P2残基がVであり、P1残基がRであり、P1’残基がRである;
(42)P4残基がAであり、P2残基がYであり、P1残基がRであり、P1’残基がRである;
(43)P4残基がAであり、P2残基がAであり、P1残基がRであり、P1’残基がRである;
(44)P4残基がAであり、P2残基がCであり、P1残基がRであり、P1’残基がKである;
(45)P4残基がAであり、P2残基がWであり、P1残基がRであり、P1’残基がNである;
(46)P4残基がAであり、P2残基がHであり、P1残基がRであり、P1’残基がNである;
(47)P4残基がAであり、P2残基がQであり、P1残基がRであり、P1’残基がKである;又は、
(48)P4残基がAであり、P2残基がNであり、P1残基がRであり、P1’残基がNである。
(49)P4残基がFであり、P2残基がFであり、P1残基がRであり、P1’残基がKである。
(50)P4残基がAであり、P2残基がKであり、P1残基がRであり、P1’残基がQである、
(51)P4残基がAであり、P2残基がRであり、P1残基がRであり、P1’残基がQである。
〜423に対応する。成熟C1−エステラーゼインヒビター配列は、配列番号3の残基23〜500に対応する。成熟α2−抗プラスミン配列は、配列番号4の残基28〜491に対応する。成熟抗トロンビン(ATIII)配列は、配列番号5の残基33〜464に対応する。成熟ヘパリン補因子II配列は、配列番号6の残基20〜499に対応する。成熟α1−抗トリプシン(α1AT)配列は、配列番号7の残基25〜418に対応する。成熟カリスタチン配列は、配列番号8の残基21〜427に対応する。成熟プラスミノーゲン活性化因子インヒビター配列は、配列番号9の残基24〜402に対応する。成熟プロテインZ依存性インヒビター配列は、配列番号10の残基22〜444に対応する。成熟プロテアーゼネキシン1アイソフォーム配列は、配列番号11の残基20〜398に対応する。
Wisconsin GCG package)を参照して規定される。GAPは、2つの完全配列を整列するため、一致する数を最大化し、ギャップの数を最小化するNeedleman及びWunschのアルゴリズムを使用する。一般的には、ギャップ作製ペナルティ(gap cre
ation penalty)=12及びギャップ伸長ペナルティ(gap extension penalty)=4を有するデフォルトパラメーターを使用する。GAPの使用が好ましい場合があるが、一般的に採用されるデフォルトパラメーターである他のアルゴリズム、例えば、BLAST(Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 405-410の方法を使用する)、FASTA(Pearson and Lipman (1988) PNAS USA 85: 2444-2448の方法を使用する)、若しくはSm
ith−Watermanのアルゴリズム(Smith and Waterman (1981) J. Mol Biol. 147: 195-197)、又は前述のAltschul et al.(1990)のTBLASTNプログラムを使用してもよい。特に、psi−Blastアルゴリズムが使用され得る(Nucl. Acids Res.
(1997) 25 3389-3402)。また、Genomequest(商標)ソフトウェア(米国マサチューセッツ州ウースターのGene-IT)を使用して配列の同一性及び類似性を決定して
もよい。
S/E/K/R、P15 G、P14 T/S、P12−P9(A/G/S)4を含むことが好ましい。
0F、147F、157I、158N、161V、165T、167G、169I、180T、184L、186N、190F、191K、192G、194W、198F、203T、208F、218V、220M、221M、277Y、254L、255P、289P、290K、299L、303L、307G、312F、316A、327L、334H、342E、344G、347A、369P、370F、383L、384F、386G及び391P(Irving et al 2008)の幾つか又は全てを含み得る。他のセルピン配
列において対応する保存された残基は、通例の配列分析を使用して容易に決定され得る。
らなってもよい。
PCI)は、SNP rs6115における置換によって生じた対立遺伝子バリアントVAR_013081(S45Nバリアント、プロペプチドを含む成熟タンパク質によるナンバリング)であって、配列番号1に示される配列を有してもよい。配列番号1の残基1〜19はシグナル配列に対応する。血漿では、PCIは、配列番号1の残基20〜25のプロペプチドを含む全長形態(すなわち、配列番号1の残基20〜406)、又はプロペプチドを欠くN末端切断形態(すなわち、配列番号1の残基26〜406)で存在し得る。
GI:21361302(配列番号8)の参照アミノ酸配列を有してもよく、またNM_006215.2 GI:21361301の参照ヌクレオチド配列によってコードされてもよい。
GI:211904152又はNP_006207.1 GI:211904156(配列番号11)の参照アミノ酸配列を有してもよく、NM_001136528.1 GI:211904151、NM_001136530.1 GI:211904155又はNM_006216.3 GI:211904150の参照ヌクレオチド配列によってコードされてもよい。
導される12aaタグ)、Cruzタグ09(商標)(MKAEFRRQESDR、Santa Cruz Biotechnology Inc.)及びCruzタグ22(商標)(MRDALDRLDRL
A、Santa Cruz Biotechnology Inc.)が挙げられる。既知のタグ配列は、Terpe (2003) Appl. Microbiol. Biotechnol. 60 523-533に概説される。好ましい実施形態では、(H
)6、His−SUMOタグ(InvitrogenのChampion pET SUMO発現システム)、又はMRGS(H)6等のポリ−Hisタグを使用することができる。
ルピンシグナル配列であってもよく、又は改変セルピンに対して異種性、すなわち非セルピンシグナル配列であってもよい。例えば、α−因子分泌シグナル又はBiPシグナル配列が採用されてもよい。シグナルペプチドは、上記ポリペプチドの発現後に翻訳後プロセシングによって除去されることが好ましい。
プロモーター領域、及び選択可能なマーカー等の配列を含んでもよい。
、例えばピキア・パストリス(Pichia pastoris)の細胞を含む真核細胞を挙げることが
できる。
ン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸;抗酸化剤、例えばアスコルビン酸及びメチオニン;防腐剤(オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;ヘキサメトニウムクロリド;ベンザルコニウムクロリド;ベンゼトニウムクロリド;フェノール、ブチルアルコール又はベンジルアルコール;アルキルパラベン、例えばメチルパラベン又はプロピルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3’−ペンタノール;及びm−クレゾール等);低分子量ポリペプチド;タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン若しくは免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン;アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン若しくはリシン;グルコース、マンノース若しくはデキストリンを含む、単糖、二糖及び他の炭水化物;キレート剤、例えばEDTA;糖、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース若しくはソルビトール;塩形成対イオン、例えばナトリウムイオン;金属錯体(例えばZn−タンパク質錯体);及び/又は非イオン性界面活性剤、例えばTWEEN(商標)、PLURONICS(商標)若しくはポリエチレングリコール(PEG)が挙げられる。好適な担体、賦形剤等は、標準的な医薬書、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1990に見ることができる。
には、上記組成物は、液体担体若しくは微粉化された固体担体、又はそれらの両方と活性化合物とを均一に及び密接に合わせた後、必要に応じて製品を成形することによって作製される。
症度、治療される特定の哺乳動物、個別の患者の臨床状態、障害の原因、組成物の送達部位、投与方法、投与計画、及び医師に知られている他の要因に依存する。
変セルピンの治療的有効量又は好適な用量は、動物モデルにおけるそのin vitro活性及びin vivo活性を比較することによって特定され得る。マウス及び他の試験動物における有効投薬量をヒトに外挿する方法が知られている。正確な用量は、改変セルピンが予防用であるのか又は治療用であるのか、治療される領域の大きさ及び位置、改変セルピンの正確な特徴、並びに改変セルピンに付着された任意の検出可能な標識又は他の分子の特徴を含む多くの要因に依存する。
する。改変セルピンは止血を促進する可能性があり、すなわち、改変セルピンは、身体、例えば出血性障害又は外傷を有する個体の血管からの出血及び大出血の阻止を促進又は増大し得る。
て置き換えられる「を含む(comprising)」という用語を伴う上に記載の態様及び実施形態、並びに「から本質的になる(consisting essentially of)」という用語で置き換え
られる「を含む(comprising)」という用語を伴う上に記載の態様及び実施形態を提供する。
て、完全な阻害に近づくことはなさそうである。
α1AT Pitts C232S P2KP1’K及びFL α1AT Pitts
C232Sによるトロンビン及びAPCの阻害に対する二次速度定数を示す。
P2RP1’Cに対して示される反応を除いて、3回行った。示される誤差は標準偏差である。aPTTアッセイは単独の実験であり、誤差を示していない。PT及びaPTTの両方に対して、タンパク質に代えてバッファー(TBS)を血漿に添加したバッファーのみの対照を対照として使用した。対照に関してPT又はaPTTの増加は、凝血原プロテアーゼの阻害の指標である。PT及びaPTTアッセイの両方に対して、セルピン変異体を5μMの濃度で使用した。比較のため、P2K変異体及びP1’K変異体を3回のアッセイの平均として示す。表1及び表3の阻害速度定数から示されるように、これらの変異体はトロンビンよりもAPCに対して高い特異性を示すが、fXaを顕著に阻害する。
したがって、これらの変異体は、トロンビン以外の凝血原プロテアーゼの阻害に良好なコンパレーター(comparator)である。NDは特定されていないことを示す。
凝固カスケード及びこのカスケードにおけるセルピンの調節的役割を図1に示す。外因系カスケード(すなわち組織因子経路)及び内因系経路(接触活性化経路)の2つの経路が凝固カスケードの活性化をもたらす。活性化の主な生理学的経路は外因系経路であると考えられている。この経路では、組織因子(TF)が損傷した血管の表面に露出される。その後、TFはfVIIa及びfVIIに結合することができる。TF:fVIIaはfVIIを活性化し、同様にTF:fVIIはTF:fVIIaへと自然に活性化する。TF:fVIIaはfXをfXaへと活性化し、これがプロトロンビンを凝固カスケードの中心的なプロテアーゼであるトロンビン(fIIa)へと活性化する。トロンビンはプロテアーゼ活性化受容体(PAR)の開裂によって血小板を活性化し、フィブリノゲンをフィブリンへと開裂する。フィブリンは、それ自体がトロンビンによって活性化されるfXIIIaにより架橋されて安定なフィブリン塊を形成する。さらに、トロンビンはそれ自体の形成を増強するポジティブフィードバック機構を活性化する。トロンビンはfVIIIをfVIIIaへと活性化し、fVをfVaへと活性化する。fVIIIaはfIXaに結合して内因系テナーゼ(Xase)複合体を形成する。内因系XaseはfXをより活性化する。このfXaはfVaに結合してプロトロンビナーゼを形成することができる。プロトロンビナーゼはプロトロンビンをトロンビンへと活性化し、凝固の開始後に生成されるトロンビンの大半を担う。トロンビンのポジティブフィードバック機構に加えて、トロンビンはネガティブフィードバック機構によってそれ自体の活性化を停止することもできる。トロンビンがその補因子であるトロンボモデュリン(TM)に結合すると、トロンビン:TM複合体がプロテインC(PC)を活性化プロテインC(APC)へと活性化することができる。APCは開裂し、fVIIIa及びfVaの両方を不活性化し、トロンビン生成を効果的に停止する。セルピンは凝固カスケードの重要なインヒビターである。セルピンプロテインCインヒビター(PCI)、抗トロンビン(ATIII)、ヘパリ
ン補因子II(HCII)及びα1−抗トリプシン(α1AT)の阻害作用を図1に示す。
、Fortenberry et al, 2011、Meijers et al, 1988)。結果として、PCIは凝血促進剤及び抗凝血剤の両方として機能することができる。PCIの活性は、ヘパリン及びヘパラン硫酸等のグリコサミノグリカンに結合することによって調節される(Pratt & Church, 1992、Pratt et al, 1992、Li & Huntington, 2008)。凝固カスケードにおけるPCIの役割の概要については図1を参照されたい。
g又はLeuのいずれかをP1に有する凝固カスケードの他のセルピンと異なり、α1ATは代わりにMetを有する。これは、α1ATを凝固プロテアーゼの非常に乏しいインヒビターとする。それにもかかわらず、血漿中の高濃度のα1ATのため、α1ATは生理学的に有意な程度までAPCを阻害すると考えられている(Heeb & Griffin, 1988)。P1残基の変異導入は、P1におけるArg又はLeuの使用がα1ATによる凝固プロテアーゼの阻害を大幅に改善することを示した(Heeb et al, 1990)。これは、重篤な出血性障害を引き起こすα1ATのピッツバーグ(M358R(P1R)、Pitts)バリアントによって説明される(Owen et al, 1983)。
3)pLysS)から発現され、Niクロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、またPCIの場合はヘパリンアフィニティクロマトグラフィーの組み合せを使用して精製した。SUMOプロテアーゼの開裂によって実質的にSUMOタグを除去し、α1ATのピッツバーグ(Pitts、P1R)に対するタンデムNi−アニオン交換クロマトグラフィー、及びPCIに対するタンデムアニオン交換−ヘパリンクロマトグラフィーによってタグを除去した。PCIコンストラクトはN末端が切断され、Ala22で開始する(A22、プロペプチドから開始する、成熟タンパク質配列に従って番号を付する)。α1AT Pitts(P1R)コンストラクトは全長(FL)であり、発現及び精製の間の分子間のジスルフィド結合形成及び他の修飾を消滅させるため更なるC232S変異を有する(Yamasaki et al, 2011)。使用した発現ベクターに起因して、α1AT Pittsコンストラクトはその第1の残基としてGlu(E)に代えてSer(S)を有する。C232S変異及びE1S変異は、α1ATの活性を変更するとは予想されていない。
プロテアーゼのインヒビターによる阻害についてスクリーニングも試験も行わず、他の凝固プロテアーゼに対して顕著な残留阻害活性を有した場合に上記インヒビターを更に改変する可能性があった。セルピンに対するSchechter-Berger命名法に従ってRCL残基に番号を付した(Schechter & Berger, 1967)。
テアーゼ活性のプロットは、実測速度定数kobsを与えた。二次速度定数k2は、kobs対セルピン濃度のプロットの傾きである(線形回帰モデルを使用して適合させた)。傾きの標準誤差を示す(表3)。
PCIと比較して、より高い又は同等の残留トロンビン活性、及びより低い又は同等の残留APC活性を有する任意の溶解物を有望なAPC特異的候補とした。これらの配列を表7に示す。P4位、P2位及びP1’位を太字で示す。
興味深いことに、ランダム変異導入は、P2位及びP1’位における正電荷を持つ残基の有利な効果を確認した。しかしながら、代替的なRCL組成物も見出された。
れたことから、fXIIaに対するあらゆる可能性のある悪影響を特定するため、本発明者らはaPTTアッセイを更に行った。このアッセイは、凝固の内因系経路によって開始された凝固を測定する以外はPTアッセイに類似する。それによりaPTTを使用して、fXIa及び凝固の接触活性化経路に対するあらゆる悪影響を検出することができた。このアッセイでは、FL α1AT Pitts C232Sと共にインキュベートした血漿は、0.67μMのセルピンを用いた1つの反応以外は上記アッセイの時間内に凝固しなかった(図5A)。FL α1AT Pitts C232S P2KP1’Kは、凝固時間のわずかな増加を示したが、用量依存性の増加はなかった(図5B)。これは、FL α1AT Pitts C232S P2KP1’KのfXIa阻害活性は非常に遅い可能性が高いため、接触活性化経路に顕著に影響を及ぼさないことを示す。さらに、接触活性化経路はfIXaの活性化によって凝固カスケードを活性化する。血友病患者はfIX又はその必須の補因子であるfVIIIのいずれかを欠くことから、血友病患者における接触活性化経路のわずかな阻害の役割は最小である可能性が高い。
基質(Z−Gly−Gly−Arg−AMC)の開裂によりトロンビン生成を測定した。Technothrombin較正キット(Technoclone)を使用して、既知濃度のトロ
ンビンに対して蛍光単位を較正することにより、蛍光単位をトロンビン濃度に変換した。
があった。トロンビン生成に対するTFにおける増加の影響を実証するため、ベースライン条件において上記アッセイを誘発するため使用されるRB試薬に加えてTF試薬の種々の希釈液(Siemens製のDade Innovin)を用いて反応をスパイクした。In
novin試薬におけるTFの濃度は製造業者によって開示されていないが、以前の測定からおよそ7.36nMであることが分かっている(Duckers et al, 2010)。TF誘発
を増大することは遅延時間を短縮し、ヒトNP、fVIII欠乏(HA)及びfIX欠乏(HB)の血漿におけるピークトロンビン及び内因性トロンビン活性(ETP)の両方を増大した。これらの実験より、本発明者らは、トロンビン生成を開始するため最終反応において1:4000のInnovin希釈率を選択した。上記アッセイにリン脂質を添加する必要があるため、リン脂質及びTFの両方を含有するRB試薬を添加した。
することにより、蛍光単位をトロンビン濃度に変換した。トロンボモデュリン(TM)は、fVIII欠乏血漿(HA)におけるトロンビン生成アッセイ(TGA)でトロンビン生成を減少することが分かった。
α1AT Pitts C232S P2KP1’KがAPCを阻害することができ、凝血促進経路に干渉しないこと、またこれらの効果がfIX及びfVIIIの存在又は不在と独立していることを確かに示している。
使用して行った(Bunce et al, 2011; Ivanciu et al, 2011)。標準的な条件下でTGAアッセイを妨げるマウス血漿中の阻害タンパク質の濃度の増加のため、これらの改変が必要であった(Tchaikovski et al, 2007、Bunce et al, 2011、Ivanciu et al, 2011)。
ヒトの系と同様に、アッセイのベースライン条件の下でHBマウス血漿におけるトロンビン生成はなかった。したがって、本発明者らは異なる濃度のInnovinにおける滴定スパイク(titration spiking)を行った。後のアッセイのため1:12000のInn
ovinの濃度を選択した。
を促進する作用が弱いことを示す。750nMの濃度のヒトTMを後の実験で使用した。
1997; Ivanciu et al, 2011)。
をテールクリップ試料と類似の方式で加工し、標準曲線を作成することによって失血容量を計算した。赤血球溶解の後、575nmでの吸光度を特定し、失血容量に対してプロットして標準曲線を作成した。テールクリップアッセイは、FL α1AT Pitts C232S P2KP1’Kの強力な凝血促進効果を示した(図12)。15mg/kgの用量において、HBマウスの失血を、PBSを注射したWTマウスのレベルまで回復した(図12)。より低用量のFL α1AT Pitts C232S P2KP1’Kもまた、HBマウスに関して出血の減少傾向を示したが、これは統計学的には有意ではなかった。FL α1AT Pitts C232Sは、7.5mg/kgで失血に対して有意な効果を示さなかった。
Pitts C232S P2KP1’Kの提案された作用機序は、その凝血促進効果はfIX又はfVIIIの欠乏と無関係のはずであることから、血友病A及びBの両方において使用され得ることを示す。in vivoで見られた凝血促進効果は、WTマウスについて見られたものと同じレベルまで出血を減少するのに十分であり(図12)、APCを阻害するセルピンを、予防として、又は既存の治療に対するアジュバントとしてのみならず出血障害の治療に使用可能であることを示す。
る。しかしながら、シングルバリアントライブラリに存在しなかった、ダブルバリアントライブラリにおける有利な残基の出現は特異性に対するこれらの残基の効果が協同的である可能性があり、特異性の増大において単一変異よりも二重変異の方がより効果的な可能性があることを示す。
つの変異体のみがこの効果を示した(P2TP1’N)。P2KP1’H及びP2KP1’N等の幾つかの変異体は、比較的小さいaPTTの延長を示したに過ぎず、したがって興味深い可能性があった。
ロンビン及びfXaの低阻害に基づいて選択されたことから、APC阻害はこの段階では考慮しなかった。セルピン及びプロテアーゼを種々の時間に亘ってインキュベートし、指定の時間点で過剰な発色基質の添加により反応を停止した。残留プロテアーゼ活性を初期プロテアーゼ活性で除し、この値の自然対数を時間に対してプロットした(図15)。セルピン濃度で除されたこの線の傾きは、阻害の二次速度定数の推定を与える。これらのアッセイは、最も速いインヒビターである二次速度定数約50.3M−1.s−1を有するP2WP1’Hによる(FL α1AT Pitts C232Sの阻害定数2.928×105M−1.s−1と比較して)以外は、全ての変異体がほとんどトロンビンを阻害しないことを示した。しかしながら、P2RP1’A、P2WP1’I及びP2WP1’Hは、fXaに対しては顕著な阻害を示した。二次速度定数は、FL α1AT Pitts C232Sと比較してわずか約10倍減少されたに過ぎない(FL α1AT Pitts C232Sに対する4.13×104M−1.s−1と比較して、P2RP1’Aに対して4070.1M−1.s−1)。P2RP1’A、P2WP1’I及びP2WP1’Hは、互いに同様のfXa阻害を示した。
進剤として有望であることを示す。
プロペプチドを含む成熟タンパク質は残基20〜406に対応する。シグナル配列は残基1〜19に対応する。プロペプチドは残基20〜25に対応する。RCLのP4、P2、P1及びP1’の残基を太字及び下線で示す。
成熟タンパク質は残基26〜423に対応する。RCLのP4、P2、P1、及びP1’の残基を太字及び下線で示す。
成熟タンパク質は残基23〜500に対応する。RCLのP4、P2、P1、及びP1’の残基を太字及び下線で示す。
成熟タンパク質は残基28〜491に対応する。キモトリプシンの阻害に対するRCLのP4、P2、P1及びP1’の残基を太字、プラスミンの阻害に対する残基を下線で示す。
成熟タンパク質は残基33〜464に対応する。RCLのP4、P2、P1、及びP1’の残基を太字及び下線で示す。
成熟タンパク質は残基20〜499に対応する。RCLのP4、P2、P1、及びP1’の残基を太字及び下線で示す。
成熟タンパク質は残基25〜418に対応する。RCLのP4、P2、P1、及びP1’の残基を太字及び下線で示す。
成熟タンパク質は残基21〜427に対応する。RCLのP4、P2、P1、及びP1’の残基を太字及び下線で示す。
成熟タンパク質は残基24〜402に対応する。RCLのP4、P2、P1、及びP1’の残基を太字及び下線で示す。
成熟タンパク質は残基22〜444に対応する。RCLのP4、P2、P1、及びP1’の残基を太字及び下線で示す。
成熟タンパク質は残基20〜398に対応する。RCLのP4、P2、P1、及びP1’の残基を太字及び下線で示す。
成熟タンパク質は残基25〜418に対応する。RCLのP4、P2、P1、及びP1’の残基を太字及び下線で示す。
Claims (18)
- 改変セルピンであって、その反応中心ループ(RCL)の残基P1’及び残基P2に変異を有し、
改変セルピンの残基P1がRであり、又はRに変異されており、
残基P1’がQ、H、K又はRに変異されており、且つ残基P2がH、K又はRに変異されており、且つ
前記変異が、トロンビン、fVIIa、fXa、fIXa及びfXIaから選択される1又は複数の凝固原プロテアーゼの阻害に対する活性化プロテインCの阻害を増大する、
改変セルピン。 - 前記P1’残基がK、又はQに変異されている、請求項1に記載の改変セルピン。
- 前記P2残基がKに変異されている、請求項1又は2に記載の改変セルピン。
- 前記改変セルピンにおける前記P2残基及び前記P1’残基がそれぞれ、KK、RK、RH、KH、RQ又はKQである、請求項1に記載の改変セルピン。
- 前記改変セルピンがP4に変異を含み、
任意に、前記P4残基がF、S、R、V、C、W、K、G、L、H、T、Q又はAに変異されている、
請求項1〜4のいずれか一項に記載の改変セルピン。 - 前記改変セルピンの前記RCLにおける前記P4残基がAであり、前記P2残基がKであり、前記P1’残基がKである;
前記改変セルピンの前記RCLにおける前記P4残基がAであり、前記P2残基がRであり、前記P1’残基がHである;
前記改変セルピンの前記RCLにおける前記P4残基がAであり、前記P2残基がKであり、前記P1’残基がHである;
前記改変セルピンの前記RCLにおける前記P4残基がAであり、前記P2残基がRであり、前記P1’残基がQである;
前記改変セルピンの前記RCLにおける前記P4残基がAであり、前記P2残基がKであり、前記P1’残基がQである;
前記改変セルピンの前記RCLにおける前記P4残基がAであり、前記P2残基がKであり、前記P1残基がRであり、前記P1’残基がKである;
前記改変セルピンの前記RCLにおける前記P4残基がAであり、前記P2残基がKであり、前記P1残基がRであり、前記P1’残基がQである;
前記改変セルピンの前記RCLにおける前記P4残基がAであり、前記P2残基がRであり、前記P1残基がRであり、前記P1’残基がQである;
前記改変セルピンの前記RCLにおける前記P4残基がKであり、前記P2残基がRであり、前記P1’残基がHである;
前記改変セルピンの前記RCLにおける前記P4残基がFであり、前記P2残基がKであり、前記P1’残基がKである;
前記改変セルピンの前記RCLにおける前記P4残基がFであり、前記P2残基がRであり、前記P1’残基がKである;又は
前記改変セルピンの前記RCLにおける前記P4残基がSであり、前記P2残基がHであり、前記P1’残基がRである、
請求項1〜5のいずれか一項に記載の改変セルピン。 - 野生型セルピンの配列に対して少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を
含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の改変セルピン。 - 前記野生型セルピンが、α1−抗キモトリプシン(SERPINA3)、C1−エステラーゼインヒビター、α2−抗プラスミン(SERPINF2)、抗トロンビン(ATIII)(SERPINC1)、ヘパリン補因子II(HCII)(SERPIND1)、プロテインCインヒビター(PCI)(SERPINA5)又はα1−抗トリプシン(α1AT)(SERPINA1)、カリスタチン(SERPINA4)、プラスミノーゲン活性化因子インヒビター(SERPINE1)、プロテアーゼネキシン1(SERPINE2)及びプロテインZ依存性プロテアーゼインヒビター(SERPINA10)からなる群から選択される、請求項7に記載の改変セルピン。
- 配列番号12の残基25〜418に対して少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記改変セルピンの前記RCLにおける前記P4残基がAであり、前記P2残基がKであり、P1残基がRであり、前記P1’残基がKである、請求項1〜8のいずれか一項に記載の改変セルピン。
- 請求項1〜9のいずれか一項に記載の改変セルピンをコードする核酸。
- 請求項1〜9のいずれか一項に記載の改変セルピンをコードする核酸を含むベクター。
- 請求項1〜9のいずれか一項に記載の改変セルピンを発現するベクターを含む組換え細胞。
- 請求項1〜9のいずれか一項に記載の改変セルピン、及び薬学的に許容可能な賦形剤を含む、医薬組成物。
- ヒト又は動物の身体の治療用である、請求項13に記載の医薬組成物。
- 個体における出血の治療用若しくは予防用、又は止血の促進用である、請求項13に記載の医薬組成物。
- 前記個体が出血性障害を有する、請求項15に記載の医薬組成物。
- 前記出血性障害が血友病である、請求項16に記載の医薬組成物。
- 前記個体が外傷患者である、請求項15に記載の医薬組成物。
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