JP6721505B2 - 定常領域が修飾された（ｃｏｎｓｔａｎｔ ｃｈａｉｎ ｍｏｄｉｆｉｅｄ）二重特異性五価及び六価Ｉｇ−Ｍ抗体 - Google Patents

Description

本発明は、五量体または六量体構造を有する結合分子に関係する。

詳細には本発明は、５つまたは６つの二重特異性結合単位を含む五量体または六量体環構造を有する結合分子に関する。本発明の結合分子において、二重特異性結合単位のそれぞれは、２つの異なる結合ターゲット、または同じ結合ターゲット上の異なる結合領域（例えば、エピトープ）に結合し、５つまたは６つの二重特異性結合単位のそれぞれは、同じ結合特異性を有する（同じ２つの結合ターゲットに結合する）。特定の実施形態において、本発明は、５つまたは６つの二重特異性結合単位を含む五量体または六量体構造を有する二重特異性抗体に関係する。

異なる態様において、本発明は、５つまたは６つの単一特異性結合単位を含む結合分子であって、ここで（ｉ）該単一特異性結合単位のそれぞれが、２つのＩｇＭ重鎖定常領域を含み、その定常領域のそれぞれが、結合ターゲットにつながる結合領域にコンジュゲートされた少なくとも１つのＣμ３及びＣμ４ドメインを含み、（ｉｉ）該単一特異性結合単位の少なくとも２つが、異なる結合ターゲットに結合する、該結合分子を包含する。本発明は、５つまたは６つの二重特異性結合単位を含む結合分子であって、ここで（ｉ）該二重特異性結合単位のそれぞれが、２つのＩｇＭ重鎖定常領域を含み、その定常領のそれぞれが、結合ターゲットにつながる結合領域にコンジュゲートされた少なくとも１つのＣμ３及びＣμ４ドメインを含み、（ｉｉ）該二重特異性結合単位の少なくとも２つが、異なる結合ターゲットに結合する、該結合分子をさらに包含する。特定の実施形態において、該結合分子は、多重特異性ＩｇＭ抗体である。

ヒト化抗体の出現以来、リツキサン（登録商標）（リツキシマブ）、ハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）及びアバスチン（登録商標）（ベバシズマブ）などの抗体の治療使用が、腫瘍学をはじめとする医薬品、関節リウマチなどの炎症性障害及び他の多くの適応症の処置の分野を革新した。米国では、３０種を超えるヒトまたはヒト化抗体が、臨床使用で認可されており、６００種を超える新規抗体または抗体様分子が、様々な開発段階にある。幾つかの抗体は、作用が疾患の病理過程の一部である血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）または腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などの可溶性標的分子におけるアンタゴニスト機能を有する。あるいは抗体は、癌などの特定疾患において病的細胞に結合すること、病的細胞の破壊を遮断及び／または誘導することが可能である。これらの治療抗体の主な機能は、Ｆａｂ領域を通した結合、及びＦｃドメイン（抗体の長い循環半減期も媒介する）を介したエフェクター機能の動員である。小分子薬に比較した抗体の主要な利点の１つが、鋭敏な特異性であり得る。抗体は、非常に類似した相同体の排除に向けて、腫瘍遺伝子などの選択されたタンパク質抗体を非常に正確に標的化して、無害の安全性プロファイルを可能にする。このため抗体は、特異的な単一標的化機能について明確に特徴づけられている。

この分野は進歩したため、より高い親和性、より長い半減期及び／またはより良好な組織分布を提供するようなタンパク質設計の独創的手段に加えて、毒性ペイロード送達を介して細胞破壊の焦点を拡大するための小分子技術と大分子技術の組み合わせ（例えば、抗体−薬物コンジュゲート）を通して、抗体機能は向上してきた。抗体機能を改善するための別のアプローチは、１つの免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子を２つの抗原に結合させるＩｇＧ構造の二価結合の利点を利用する。事実、特定の適用において、非対称抗体には２つの異なる標的抗原に同時に結合することにより有用な機能を発揮する、良好な潜在能力が存在する。この要件に取り組むために、２つの異なる抗原を結合させて、本来は認められることのなかった機能を可能にする単一分子を得るために、多様な構築物が製造された。この二重特異性アプローチの例は、Ｔ細胞及びＢ細胞で、それぞれＣＤ３及びＣＤ１９受容体に結合する「ブリナツムマブ（ｂｌｉｎａｔｕｍｕｍａｂ）」（ＭＴ１０３）である。癌性Ｂ細胞への細胞毒性Ｔ細胞のこのテザリングは、Ｂ細胞白血病の効果的処置を可能にする。

しかし、二重特異性抗体の構築、発現及び製造には、依然として少なからぬ技術的難題が存在する。二重特異性抗体は、２つの異なる抗原に同時に結合する能力により有望な治療薬と見なされているが、安定性及び製造の複雑さにかかわる問題により、用途が限定される。

タンパク質設計の様々な形態を用いて、非相同的な重鎖をマッチさせることに加え、重鎖と軽鎖を適切にペアごとにマッチングして、二重特異性ＩｇＧを効率的に生成した。加えて、クアドローマ、化学的ヘテロコンジュゲート、選択されたヘテロ二量体化ドメインを用いた組換え構築物、及び２つの最小抗原結合部位からなる最小サイズの組換え構築物をはじめとする様々な二重特異性抗体形式。

しかし、これらの努力の全てが、難題を含んでいた。

したがって、二重特異性治療抗体の開発に向けて努力したにもかかわらず、二重特異性及び多重特異性抗体のより効率的で柔軟な製造を誘導し、それによりそのような治療の発見から臨床導入までのタイムラインを短縮して、多重特異性及び／または多価を有する新規なタイプの抗体形式の設計及び製造を可能にする、より効率的なプラットフォームの開発が、依然として非常に必要とされている。

発明の概要
本発明は、例えば５つまたは６つの二重特異性結合単位を有する単離されたＩｇＭ抗体など、五量体または六量体環構造を有する結合分子、ならびにそれを生成及び使用する方法及び手段に関係する。

一態様において、本発明は、５つまたは６つの二重特異性結合単位を含む五量体または六量体環構造を有する結合分子であって、ここで該二重特異性結合単位のそれぞれが、同じ２つの結合特異性を有し、第一の結合ターゲットにつながる第一の結合領域にコンジュゲートされたＩｇＭ重鎖定常領域の少なくとも１つのＣμ４ドメインを含む第一の鎖と、ＩｇＭ重鎖定常領域の少なくとも１つのＣμ４ドメイン及び第二の結合ターゲットにつながる第二の結合領域を含む第二の鎖と、を含み、ここで該第一及び第二の結合ターゲットが異なっており、該第一及び第二の鎖が、それらの各ＩｇＭ重鎖定常領域の間に生成された非対称界面の結果として、二重特異性結合単位を生成するように組み立てられる、該結合分子に関係する。

一実施形態において、該二重特異性結合単位は、同一である。

別の実施形態において、該結合分子は、ＩｇＭ Ｊ鎖をさらに含む。

さらに別の実施形態において、該結合分子は、五量体環構造を有する。

さらなる実施形態において、該結合分子は、六量体環構造を有する。

さらなる実施形態において、該結合分子における該第一及び第二の鎖は、ＩｇＭ重鎖定常領域のＣμ３ドメインをさらに含む。

別の実施形態において、該第一及び第二の鎖は、ＩｇＭ重鎖定常領域のＣμ２ドメインをさらに含む。

別の実施形態において、該第一及び第二の結合ターゲットは、非限定的に可溶性ポリペプチド、細胞表面受容体、リガンド、分子トランスポータ、酵素及び酵素基質をはじめとする、ペプチド、ポリペプチド、糖タンパク質、核酸分子、ならびに有機及び非有機小分子から選択される。

さらなる実施形態において、該第一及び第二の結合ターゲットは、同じ可溶性ターゲット上の２つの部位、同じ細胞表面受容体ターゲット上の２つの部位、２つの異なる可溶性ターゲット、２つの細胞表面受容体ターゲット、１つの可溶性ターゲットと１つの細胞表面受容体ターゲット、１つの可溶性もしくは細胞表面受容体ターゲットと１つの長滞留時間ターゲット、１つの可溶性ターゲットと１つのマトリックスタンパク質もしくは基質ターゲット、１つの可溶性もしくは受容体ターゲットと１つの分子トラスポータターゲット、または２つの異なる細胞型である。

該結合領域の、分子の残り部分へのコンジュゲーションは、融合により起こり得る。したがって、例えば該第一及び第二の結合領域は、それぞれ第一及び第二のＩｇＭ重鎖定常領域のＮ末端に融合され得る。

特定の実施形態において、該第一及び第二の結合領域は、抗体の可変領域である。

別の実施形態において、該第一及び第二の結合ターゲットは、２つの異なる抗原である。

さらに別の実施形態において、該第一及び第二の結合ターゲットは、同じ抗原上の異なるエピトープである。

さらなる実施形態において、該第一及び第二の結合領域は、２つの結合ターゲットに結合する、または同じ結合ターゲット上の異なるエピトープに結合する、２つの異なる抗体重鎖可変領域であり得る。

本発明の結合分子において、該抗体重鎖可変領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、及び／またはＩｇＭ抗体のもの、好ましくはＩｇＭ抗体のものであり得る。好ましくは本明細書における結合分子は、二重特異性ＩｇＭ分子であり、２つの異なるＩｇＭ重鎖可変領域のうちの一方と会合する少なくとも１つのＩｇＭ軽鎖可変領域配列をさらに含み得るが、その必要はない。

特定の実施形態において、本発明の結合分子における、結合単位の２つの鎖のＩｇＭ重鎖定常領域の間の非対称界面の少なくとも一部が、前記結合単位の２つの鎖のＣμ２、Ｃμ３及び／またはＣμ４ドメインの少なくとも１つにおける逆電荷アミノ酸残基間のペアごとの切替えに（ｐａｉｒ−ｗｉｓｅ ｓｗｉｔｃｈｅｓ）より形成される塩架橋により生成される。

したがって塩架橋は、結合単位の２つの鎖のＣμ２−Ｃμ２、Ｃμ４−Ｃμ４、及びＣμ２−Ｃμ３−Ｃμ４ドメインのうちの少なくとも１つの間に形成され得る。

一実施形態において、該ペアごとの切替えは、Ｅ→Ｋ、Ｋ→Ｅ；Ｒ→Ｅ、Ｅ→Ｒ；Ｄ→Ｋ、Ｋ→Ｄ；及びＲ→Ｄ、Ｄ→Ｒからなる群から選択される。

別の実施形態において、該結合分子は、Ｃμ４−Ｃμ４ドメイン内に少なくとも１つのペアごとの電荷アミノ酸残基切替えを含むことができ、該切替えは、例えばＲ３２８Ｅ，Ｄ⇔Ｅ３３９Ｒ，Ｋ；Ｒ３４４Ｅ，Ｄ⇔Ｓ３３０Ｒ，Ｋ；Ｋ３７６Ｅ，Ｄ⇔Ｅ３８５Ｒ，Ｋ；Ｒ４２７Ｅ，Ｄ⇔Ｅ３３９Ｒ，Ｋ；及びＴ３５４Ｅ，Ｄ⇔Ｉ３９７Ｒ，Ｋからなる群から選択され得る。

さらなる実施形態において、Ｃμ２−Ｃμ２ドメインの間の少なくとも１つのペアごとの電荷アミノ酸残基切替えであり、例えばＥ１６７Ｒ，Ｋ⇔Ｋ１７７Ｅ，Ｄ及びＫ１６９Ｅ，Ｄ⇔Ｅ１７０Ｒ，Ｋからなる群から選択され得る。

さらなる実施形態において、少なくとも１つのペアごとの電荷アミノ酸残基切替えは、Ｃμ２−Ｃμ３−Ｃμ４ドメイン内にあり、例えばＤ１２１Ｋ，Ｒ⇔Ｋ３１５Ｄ，Ｅ；Ｋ１５０Ｅ，Ｄ⇔Ｅ３８５Ｋ，Ｒ；及びＫ１８５Ｄ，Ｅ⇔Ｄ３６０Ｋ，Ｒからなる群から選択され得る。

さらなる実施形態において、本発明の結合分子における、結合単位の２つの鎖のＩｇＭ重鎖定常領域間の非対称界面の少なくとも一部は、例えばノブ：Ｔ３５０→Ｙ，Ｆ，Ｗ；及びＨ３９５→Ｙ，Ｆと、ホール：Ｌ３５２→Ｇ，Ａ，Ｖ，Ｉ，Ｍ，Ｓ，Ｔ；Ｈ３９５→Ａ，Ｖ，Ｉ，Ｌ，Ｍ，Ｆ，Ｙ；Ｆ３９３→Ｗ，Ｙ；Ｉ３９７→Ａ，Ｖ，Ｓ，Ｔ；Ｔ３５０→Ｓ，Ａ，Ｖ；及びＴ３４８→Ｓと、からなる群から選択される突然変異により生成され得るノブ・イントゥー・ホールの結合を通して生成される。

具体的実施形態において、本発明の結合分子における軽鎖可変領域配列が存在するならば、それは軽鎖と重鎖の間に非対称界面を生成することにより、マッチする重鎖可変領域にカップリングされる。

他の実施形態において、該非対称界面は、ＣｒｏｓｓＭａｂ技術、ノブ・イントゥー・ホールカップリング及び／または塩架橋カップリングにより生成される。

本発明の結合分子は、共通の軽鎖を含むこと、及び／または毒素もしくは化学療法剤にコンジュゲートすることができる。好ましくはコンジュゲーションは、融合によるが、化学的リンカーによるコンジュゲーションもまた、本発明の範囲に含まれる。

本明細書の結合分子は、五量体または六量体構造の二重特異性抗体であり得、キメラまたはヒト化であり得る。

異なる態様において、本発明は、本明細書の先に定義された結合分子を少なくとも約７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％含む組成物に関係する。

特定の実施形態において、該組成物は、医薬組成物である。

本発明は、さらに、５つまたは６つの単一特異性結合単位を含む五量体または六量体環構造を有する多重特異性結合分子であって、ここで（ｉ）該単一特異性結合単位のそれぞれが、２つのＩｇＭ重鎖定常領域を含み、その定常領域のそれぞれが、結合ターゲットにつながる結合領域にコンジュゲートされた少なくとも１つのＣμ３及びＣμ４ドメインを含み、（ｉｉ）該単一特異性結合単位の少なくとも２つが、異なる結合ターゲットに結合し、（ｉｉｉ）外部非対称界面が、異なる結合ターゲットに結合する隣接の単一特異性結合単位の重鎖定常領域の間に生成される、該多重特異性結合分子に関係する。

一実施形態において、該単一特異性結合単位の少なくとも３つは、異なる結合ターゲットに結合する。

別の実施形態において、前記単一特異性結合単位の少なくとも４つは、異なる結合ターゲットに結合する。

さらに別の実施形態において、該結合分子は、五量体環構造を有し、５つの単一特異性結合単位の全てが、異なるターゲットに結合する。

さらなる実施形態において、該結合分子は、六量体環構造を有し、前記単一特異性結合単位の少なくとも５つは、異なるターゲットに結合する。

さらなる実施形態において、該６つの単一特異性結合単位の全てが、異なるターゲットに結合する。

別の態様において、本発明は、５つまたは６つの二重特異性結合単位を含む五量体または六量体環構造を有する多重特異性結合分子であって、ここで（ｉ）該二重特異性結合単位のそれぞれが、２つのＩｇＭ重鎖定常領域を含み、その定常領域のそれぞれが、結合ターゲットにつながる結合領域にコンジュゲートされた少なくとも１つのＣμ３及びＣμ４ドメインを含み、（ｉｉ）該二重特異性結合単位の少なくとも２つが、異なる結合ターゲットに結合し、（ｉｉｉ）内部非対称界面が、各二重特異性結合単位の２つのＩｇＭ重鎖定常領域の間に生成され、（ｉｖ）外部非対称界面が、異なる結合ターゲットに結合する隣接の二重特異性結合単位の重鎖定常領域の間に生成される、該多重特異性結合分子に関係する。

一実施形態において、該二重特異性結合単位の少なくとも３つは、異なる結合ターゲットに結合する。

別の実施形態において、該二重特異性結合単位の少なくとも４つは、異なる結合ターゲットに結合する。

さらに別の実施形態において、該結合分子は、五量体環構造を有し、５つの二重特異性結合単位の全てが、異なるターゲットに結合する。

さらなる実施形態において、該結合分子は、六量体環構造を有し、該二重特異性結合単位の少なくとも５つが、異なるターゲットに結合する。

さらなる実施形態において、６つの二重特異性結合単位の全てが、異なるターゲットに結合する。

異なる実施形態において、該多重特異性結合分子は、ＩｇＭ Ｊ鎖をさらに含む。

様々な実施形態において、該多重特異性結合分子は、五量体または六量体環構造を有し得る。

本発明の多重特異性結合分子の結合特異性の数及び性質にかかわらず、以下の具体的実施形態が適用される：

一実施形態において、該結合単位の少なくとも１つにおける該ＩｇＭ重鎖定常領域は、Ｃμ２ドメインをさらに含む。さらに別の実施形態において、該結合単位の全てにおける該ＩｇＭ重鎖定常領域は、Ｃμ２ドメインをさらに含む。様々な実施形態において、本発明の多重特異性結合分子は、ペプチド、ポリペプチド、糖タンパク質、核酸分子、ならびに有機及び非有機小分子から選択される結合ターゲットに結合し得る。

他の実施形態において、本発明の多重特異性結合分子は、可溶性ポリペプチド、細胞表面受容体、リガンド、分子トランスポータ、酵素及び酵素基質から選択される結合ターゲットに結合する。

さらなる実施形態において、異なるターゲットに結合する本発明の多重特異性結合分子は、同じ可溶性ターゲット上の部位；同じ細胞表面受容体ターゲット上の部位；異なる可溶性ターゲット；異なる細胞表面受容体ターゲット；可溶性及び細胞表面受容体ターゲット；可溶性もしくは細胞表面受容体ターゲット及び長滞留時間ターゲット；可溶性及びマトリックスタンパク質もしくは基質ターゲット；可溶性もしくは受容体及び分子トラスポータターゲット；ならびに異なる細胞型、に結合する結合単位からなる群から選択される。

特定の実施形態において、本発明の結合分子内の結合単位における、ＩｇＭ重鎖定常領域と結合ターゲットにつながる結合領域の間のコンジュゲーションは、融合による。したがって例えば該結合領域は、ＩｇＭ重鎖定常領域のＮ末端に融合され得る。

一実施形態において、該結合領域の少なくとも１つは、抗体の可変領域である。

別の実施形態において、該結合領域の全ては、抗体重鎖可変領域である。

さらに別の実施形態において、少なくとも２つの結合ターゲットは、異なる抗原である。

さらなる実施形態において、少なくとも２つの結合ターゲットは、同じ抗原上の異なるエピトープである。

全ての態様及び実施形態において、該抗原重鎖可変領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ抗体のもの、好ましくはＩｇＭ抗体のものであり得る。

好ましい実施形態において、本発明の多重特異性結合分子は、多重特異性ＩｇＭ抗体である。

一実施形態において、本発明の多重特異性ＩｇＭ抗体は、該結合単位の少なくとも１つのＩｇＭ重鎖可変領域と会合する少なくとも１つのＩｇＭ軽鎖可変領域配列をさらに含む。

別の実施形態において、該多重特異性ＩｇＭ抗体は、該ＩｇＭ重鎖可変領域のそれぞれと会合するＩｇＭ軽鎖可変領域配列をさらに含む。

全ての態様及び実施形態において、該外部非対称界面は、Ｃμ３ドメイン内の改変（複数可）により生成される。一実施形態において、該改変は、Ｃμ３ドメイン内の逆電荷アミノ酸残基の間のペアごとの切替えにより形成される塩架橋により生成される。

様々な実施形態において、該外部非対称界面を提供する塩架橋は、Ｃμ３−Ｃμ３ドメイン内の少なくとも１つのペアごとの電荷アミノ酸残基切替えにより形成され、該切替えは、例えば隣接のμ鎖の中のＫ２３８⇔Ｄ２９３またはＫ２６８⇔Ｄ２９４であり得る。

全ての態様及び実施形態において、本発明の多重特異性結合分子、例えば多重特異性ＩｇＭ抗体において、該内部非対称界面は、Ｃμ２、Ｃμ３及び／またはＣμ４ドメインのうちの少なくとも１つの中の逆電荷アミノ酸残基の間のペアごとの切替えにより形成される塩架橋により生成される。

一実施形態において、塩架橋は、前記結合単位の２つの鎖のＣμ２−Ｃμ２、Ｃμ４−Ｃμ４、及びＣμ２−Ｃμ３−Ｃμ４ドメインのうちの少なくとも１つの間に形成され得る。

別の実施形態において、該ペアごとの切替えは、Ｅ→Ｋ、Ｋ→Ｅ；Ｒ→Ｅ、Ｅ→Ｒ；Ｄ→Ｋ、Ｋ→Ｄ；及びＲ→Ｄ、Ｄ→Ｒからなる群から選択される。

さらなる実施形態において、該多重特異性結合分子、例えば多重特異性ＩｇＭ抗体は、Ｃμ４−Ｃμ４ドメイン内に少なくとも１つのペアごとの電荷アミノ酸残基切替えを含み、該切替えは、例えばＲ３２８Ｅ，Ｄ⇔Ｅ３３９Ｒ，Ｋ；Ｒ３４４Ｅ，Ｄ⇔Ｓ３３０Ｒ，Ｋ；Ｋ３７６Ｅ，Ｄ⇔Ｅ３８５Ｒ，Ｋ；Ｒ４２７Ｅ，Ｄ⇔Ｅ３３９Ｒ，Ｋ；及びＴ３５４Ｅ，Ｄ⇔Ｉ３９７Ｒ，Ｋからなる群から選択され得る。

さらなる実施形態において、該多重特異性結合分子、例えば多重特異性ＩｇＭ抗体は、Ｃμ２−Ｃμ２ドメイン間に少なくとも１つのペアごとの電荷アミノ酸残基切替えを含み、該切替えは、例えばＥ１６７Ｒ，Ｋ⇔Ｋ１７７Ｅ，Ｄ及びＫ１６９Ｅ，Ｄ⇔Ｅ１７０Ｒ，Ｋからなる群から選択され得る。

別の実施形態において、該多重特異性結合分子、例えば多重特異性ＩｇＭ抗体は、Ｃμ２−Ｃμ３−Ｃμ４ドメイン内に少なくとも１つのペアごとの電荷アミノ酸残基切替えを含み、該切替えは、例えばＤ１２１Ｋ，Ｒ⇔Ｋ３１５Ｄ，Ｅ；Ｋ１５０Ｅ，Ｄ⇔Ｅ３８５Ｋ，Ｒ；及びＫ１８５Ｄ，Ｅ⇔Ｄ３６０Ｋ，Ｒからなる群から選択され得る。

全ての態様及び実施形態において、ＩｇＭ重鎖定常領域間の外部及び／または内部非対称界面の少なくとも一部は、ノブ・イントゥー・ホール結合により生成され得る。例えば少なくとも１つのノブ・イントゥー・ホール結合は、ノブ：Ｔ３５０→Ｙ，Ｆ，Ｗ；及びＨ３９５→Ｙ，Ｆと、ホール：Ｌ３５２→Ｇ，Ａ，Ｖ，Ｉ，Ｍ，Ｓ，Ｔ；Ｈ３９５→Ａ，Ｖ，Ｉ，Ｌ，Ｍ，Ｆ，Ｙ；Ｆ３９３→Ｗ，Ｙ；Ｉ３９７→Ａ，Ｖ，Ｓ，Ｔ；Ｔ３５０→Ｓ，Ａ，Ｖ；及びＴ３４８→Ｓと、からなる群から選択される突然変異により生成され得る。

軽鎖可変領域配列を含む多重特異性ＩｇＭ抗体において、そのような軽鎖可変領域配列は、軽鎖と重鎖の間に非対称界面を生成することにより、マッチする重鎖可変領域にカップリングされ得る。様々な実施形態において、該非対称界面は、ＣｒｏｓｓＭａｂ技術、ノブ・イントゥー・ホールカップリング及び／または塩架橋カップリングにより生成され得る。さらなる実施形態において、該多重特異性結合分子の結合単位は、共通の軽鎖を含む。

全ての態様及び実施形態において、該多重特異性結合分子は、毒素または化学療法剤にコンジュゲートされ得、該コンジュゲートションは、例えば融合及び／または化学的リンカーによることができる。

本明細書の多重特異性ＩｇＭ抗体は、キメラまたはヒト化であり得る。

さらなる態様において、本発明は、本明細書における多重特異性結合分子を少なくとも約７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％含む組成物に関係する。該組成物は、例えば少なくとも１種の医薬的に許容し得る原材料を含む医薬組成物であり得る。
[本発明1001]
5つまたは6つの二重特異性結合単位を含む五量体または六量体環構造を有する結合分子であって、ここで前記二重特異性結合単位のそれぞれが、同じ2つの結合特異性を有し、第一の結合ターゲットにつながる第一の結合領域にコンジュゲートされたＩｇＭ重鎖定常領域の少なくとも1つのＣμ4ドメインを含む第一の鎖と、ＩｇＭ重鎖定常領域の少なくとも1つのＣμ4ドメイン及び第二の結合ターゲットにつながる第二の結合領域を含む第二の鎖と、を含み、ここで前記第一及び第二の結合ターゲットが異なっており、前記第一及び第二の鎖が、それらの各ＩｇＭ重鎖定常領域の間に生成された非対称界面の結果として、二重特異性結合単位を生成するように組み立てられる、前記結合分子。
[本発明1002]
前記二重特異性結合単位が、同一である、本発明1001の結合分子。
[本発明1003]
ＩｇＭ Ｊ鎖をさらに含む、本発明1002の結合分子。
[本発明1004]
五量体環構造を有する、本発明1003の結合分子。
[本発明1005]
六量体環構造を有する、本発明1002の結合分子。
[本発明1006]
前記第一及び第二の鎖が、ＩｇＭ重鎖定常領域のＣμ3ドメインをさらに含む、本発明1002の結合分子。
[本発明1007]
前記第一及び第二の鎖が、ＩｇＭ重鎖定常領域のＣμ2ドメインをさらに含む、本発明1002または1006の結合分子。
[本発明1008]
前記第一及び第二の結合ターゲットが、ペプチド、ポリペプチド、糖タンパク質、核酸分子、ならびに有機及び非有機小分子から選択される、本発明1002の結合分子。
[本発明1009]
前記第一及び第二の結合ターゲットが、可溶性ポリペプチド、細胞表面受容体、リガンド、分子トランスポータ、酵素及び酵素基質から選択される、本発明1002の結合分子。
[本発明1010]
前記第一及び第二の結合ターゲットが、同じ可溶性ターゲット上の2つの部位、同じ細胞表面受容体ターゲット上の2つの部位、2つの異なる可溶性ターゲット、2つの細胞表面受容体ターゲット、1つの可溶性ターゲットと1つの細胞表面受容体ターゲット、1つの可溶性もしくは細胞表面受容体ターゲットと1つの長滞留時間ターゲット、1つの可溶性ターゲットと1つのマトリックスタンパク質もしくは基質ターゲット、1つの可溶性もしくは受容体ターゲットと1つの分子トラスポータターゲット、または2つの異なる細胞型に結合する、本発明1002の結合分子。
[本発明1011]
コンジュゲーションが、融合による、本発明1001〜1010のいずれかの結合分子。
[本発明1012]
前記第一及び第二の結合領域が、それぞれ前記第一及び前記第二のＩｇＭ重鎖定常領域のＮ末端に融合される、本発明1011の結合分子。
[本発明1013]
前記第一及び第二の結合領域が、抗体の可変領域である、本発明1012の結合分子。
[本発明1014]
前記第一及び第二の結合ターゲットが、2つの異なる抗原である、本発明1013の結合分子。
[本発明1015]
前記第一及び第二の結合ターゲットが、同じ抗原上の異なるエピトープである、本発明1013の結合分子。
[本発明1016]
前記第一及び第二の結合領域が、それぞれ前記第一及び前記第二の結合ターゲットに結合する2つの異なる抗体重鎖可変領域である、本発明1013の結合分子。
[本発明1017]
前記第一及び第二の結合領域が、2つの異なる抗体重鎖可変領域であり、前記可変領域のそれぞれが、同じ結合ターゲット上の異なるエピトープに結合する、本発明1013の結合分子。
[本発明1018]
前記抗体重鎖可変領域が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ抗体のものである、本発明1016または1017の結合分子。
[本発明1019]
前記抗体重鎖可変領域が、ＩｇＭ抗体のものである、本発明1018の結合分子。
[本発明1020]
二重特異性ＩｇＭ分子である、本発明1016または1017の結合分子。
[本発明1021]
前記2つの異なるＩｇＭ重鎖可変領域のうちの少なくとも一方と会合する少なくとも1つのＩｇＭ軽鎖可変領域配列をさらに含む、本発明1020の結合分子。
[本発明1022]
前記2つの異なるＩｇＭ重鎖可変領域のそれぞれと会合するＩｇＭ軽鎖可変領域配列をさらに含む、本発明1020の結合分子。
[本発明1023]
結合単位の2つの鎖のＩｇＭ重鎖定常領域の間の非対称界面の少なくとも一部が、前記結合単位の2つの鎖のＣμ2、Ｃμ3及び／またはＣμ4ドメインの少なくとも1つにおける逆電荷アミノ酸残基間のペアごとの切替えに（ｐａｉｒ−ｗｉｓｅ ｓｗｉｔｃｈｅｓ）より形成される塩架橋により生成される、本発明1001〜1022のいずれかの結合分子。
[本発明1024]
塩架橋が、前記結合単位の2つの鎖のＣμ2−Ｃμ2、Ｃμ4−Ｃμ4、及びＣμ2−Ｃμ3−Ｃμ4ドメインのうちの少なくとも1つの間に形成される、本発明1023の結合分子。
[本発明1025]
前記ペアごとの切替えが、Ｅ→Ｋ、Ｋ→Ｅ；Ｒ→Ｅ、Ｅ→Ｒ；Ｄ→Ｋ、Ｋ→Ｄ；及びＲ→Ｄ、Ｄ→Ｒからなる群から選択される、本発明1023の結合分子。
[本発明1026]
前記Ｃμ4−Ｃμ4ドメイン内に少なくとも1つのペアごとの電荷アミノ酸残基切替えを含む、本発明1024の結合分子。
[本発明1027]
前記切替えが、Ｒ328Ｅ，Ｄ⇔Ｅ339Ｒ，Ｋ；Ｒ344Ｅ，Ｄ⇔Ｓ330Ｒ，Ｋ；Ｋ376Ｅ，Ｄ⇔Ｅ385Ｒ，Ｋ；Ｒ427Ｅ，Ｄ⇔Ｅ339Ｒ，Ｋ；及びＴ354Ｅ，Ｄ⇔Ｉ397Ｒ，Ｋからなる群から選択される、本発明1026の結合分子。
[本発明1028]
前記Ｃμ2−Ｃμ2ドメインの間に少なくとも1つのペアごとの電荷アミノ酸残基切替えを含む、本発明1024の結合分子。
[本発明1029]
前記切替えが、Ｅ167Ｒ，Ｋ⇔Ｋ177Ｅ，Ｄ及びＫ169Ｅ，Ｄ⇔Ｅ170Ｒ，Ｋからなる群から選択される、本発明1028の結合分子。
[本発明1030]
前記Ｃμ2−Ｃμ3−Ｃμ4ドメイン内に少なくとも1つのペアごとの電荷アミノ酸残基切替えを含む、本発明1024の結合分子。
[本発明1031]
前記切替えが、Ｄ121Ｋ，Ｒ⇔Ｋ315Ｄ，Ｅ；Ｋ150Ｅ，Ｄ⇔Ｅ385Ｋ，Ｒ；及びＫ185Ｄ，Ｅ⇔Ｄ360Ｋ，Ｒからなる群から選択される、本発明1029の結合分子。
[本発明1032]
結合単位の2つの鎖のＩｇＭ重鎖定常領域間の非対称界面の少なくとも一部が、ノブ・イントゥー・ホールの結合を通して生成される、本発明1001〜1022のいずれかの結合分子。
[本発明1033]
少なくとも1つの前記ノブ・イントゥー・ホールの結合が、ノブ：Ｔ350→Ｙ，Ｆ，Ｗ；及びＨ395→Ｙ，Ｆと、ホール：Ｌ352→Ｇ，Ａ，Ｖ，Ｉ，Ｍ，Ｓ，Ｔ；Ｈ395→Ａ，Ｖ，Ｉ，Ｌ，Ｍ，Ｆ，Ｙ；Ｆ393→Ｗ，Ｙ；Ｉ397→Ａ，Ｖ，Ｓ，Ｔ；Ｔ350→Ｓ，Ａ，Ｖ；及びＴ348→Ｓと、からなる群から選択される突然変異により生成される、本発明1032の結合分子。
[本発明1034]
前記軽鎖可変領域配列が、前記軽鎖と重鎖の間に非対称界面を生成することにより、それらのマッチする重鎖可変領域にカップリングされる、本発明1021〜1033のいずれかの結合分子。
[本発明1035]
前記非対称界面が、ＣｒｏｓｓＭａｂ技術、ノブ・イントゥー・ホールカップリング及び／または塩架橋カップリングにより生成される、本発明1034の結合分子。
[本発明1036]
共通の軽鎖を含む、本発明1021〜1035のいずれかの結合分子。
[本発明1037]
毒素にコンジュゲートされる、本発明1001〜1036のいずれかの結合分子。
[本発明1038]
化学療法剤にコンジュゲートされる、本発明1001〜1036のいずれかの結合分子。
[本発明1039]
コンジュゲーションが、融合による、本発明1037または1038の結合分子。
[本発明1040]
コンジュゲーションが、化学的リンカーによる、本発明1037または1038の結合分子。
[本発明1041]
キメラまたはヒト化である、本発明1020〜1040のいずれかの結合分子。
[本発明1042]
本発明1001〜1041のいずれかの結合分子を少なくとも約70％含む組成物。
[本発明1043]
本発明1001〜1041のいずれかの結合分子を少なくとも約80％含む組成物。
[本発明1044]
本発明1001〜1041のいずれかの結合分子を少なくとも約95％含む組成物。
[本発明1045]
本発明1001〜1041のいずれかの結合分子を少なくとも約98％含む組成物。
[本発明1046]
本発明1001〜1042のいずれかの結合分子を少なくとも約99％含む組成物。
[本発明1047]
医薬組成物である、本発明1042〜1046のいずれかの組成物。
[本発明1048]
5つまたは6つの単一特異性結合単位を含む五量体または六量体環構造を有する多重特異性結合分子であって、ここで（ｉ）前記単一特異性結合単位のそれぞれが、2つのＩｇＭ重鎖定常領域を含み、前記定常領域のそれぞれが、結合ターゲットにつながる結合領域にコンジュゲートされた少なくとも1つのＣμ3及びＣμ4ドメインを含み、（ｉｉ）前記単一特異性結合単位の少なくとも2つが、異なる結合ターゲットに結合し、（ｉｉｉ）外部非対称界面が、異なる結合ターゲットに結合する隣接の単一特異性結合単位の重鎖定常領域の間に生成される、多重特異性結合分子。
[本発明1049]
前記単一特異性結合単位の少なくとも3つが、異なる結合ターゲットに結合する、本発明1048の多重特異性結合分子。
[本発明1050]
前記単一特異性結合単位の少なくとも4つが、異なる結合ターゲットに結合する、本発明1048の多重特異性結合分子。
[本発明1051]
前記結合分子が、五量体環構造を有し、5つの単一特異性結合単位の全てが、異なるターゲットに結合する、本発明1048の多重特異性結合分子。
[本発明1052]
前記結合分子が、六量体環構造を有し、前記単一特異性結合単位の少なくとも5つが、異なるターゲットに結合する、本発明1048の多重特異性結合分子。
[本発明1053]
前記6つの単一特異性結合単位の全てが、異なるターゲットに結合する、本発明1052の多重特異性結合分子。
[本発明1054]
5つまたは6つの二重特異性結合単位を含む五量体または六量体環構造を有する多重特異性結合分子であって、ここで（ｉ）前記二重特異性結合単位のそれぞれが、2つのＩｇＭ重鎖定常領域を含み、前記定常領域のそれぞれが、結合ターゲットにつながる結合領域にコンジュゲートされた少なくとも1つのＣμ3及びＣμ4ドメインを含み、（ｉｉ）前記二重特異性結合単位の少なくとも2つが、異なる結合ターゲットに結合し、（ｉｉｉ）内部非対称界面が、各二重特異性結合単位の2つのＩｇＭ重鎖定常領域の間に生成され、（ｉｖ）外部非対称界面が、異なる結合ターゲットに結合する隣接の二重特異性結合単位の重鎖定常領域の間に生成される、多重特異性結合分子。
[本発明1055]
前記二重特異性結合単位の少なくとも3つが、異なる結合ターゲットに結合する、本発明1054の多重特異性結合分子。
[本発明1056]
前記二重特異性結合単位の少なくとも4つが、異なる結合ターゲットに結合する、本発明1054の多重特異性結合分子。
[本発明1057]
前記結合分子が、五量体環構造を有し、5つの二重特異性結合単位の全てが、異なるターゲットに結合する、本発明1054の多重特異性結合分子。
[本発明1058]
前記結合分子が、六量体環構造を有し、前記二重特異性結合単位の少なくとも5つが、異なるターゲットに結合する、本発明1054の多重特異性結合分子。
[本発明1059]
6つの二重特異性結合単位の全てが、異なるターゲットに結合する、本発明1052の多重特異性結合分子。
[本発明1060]
ＩｇＭ Ｊ鎖をさらに含む、本発明1048または1054の多重特異性結合分子。
[本発明1061]
五量体環構造を有する、本発明1048または1054の多重特異性結合分子。
[本発明1062]
六量体環構造を有する、本発明1048または1054の多重特異性結合分子。
[本発明1063]
前記結合単位の少なくとも1つにおいて、前記ＩｇＭ重鎖定常領域が、Ｃμ2ドメインをさらに含む、本発明1048または1054の多重特異性結合分子。
[本発明1064]
前記結合単位の全てにおいて、前記ＩｇＭ重鎖定常領域が、Ｃμ2ドメインをさらに含む、本発明1063の多重特異性結合分子。
[本発明1065]
前記結合単位の全てにおいて、前記重鎖定常領域が、同一である、本発明1048または1054の多重特異性結合分子。
[本発明1066]
前記結合ターゲットが、ペプチド、ポリペプチド、糖タンパク質、核酸分子、ならびに有機及び非有機小分子から選択される、本発明1048または1054の多重特異性結合分子。
[本発明1067]
前記結合ターゲットが、可溶性ポリペプチド、細胞表面受容体、リガンド、分子トランスポータ、酵素及び酵素基質から選択される、本発明1048または1054の多重特異性結合分子。
[本発明1068]
異なるターゲットに結合する前記結合単位が、同じ可溶性ターゲット上の部位；同じ細胞表面受容体ターゲット上の部位；異なる可溶性ターゲット；異なる細胞表面受容体ターゲット；可溶性及び細胞表面受容体ターゲット；可溶性もしくは細胞表面受容体及び長滞留時間ターゲット；可溶性及びマトリックスタンパク質もしくは基質ターゲット；可溶性もしくは受容体及び分子トラスポータターゲット；ならびに異なる細胞型、に結合する結合単位からなる群から選択される、本発明1048または1054の多重特異性結合分子。
[本発明1069]
コンジュゲーションが、融合による、本発明1048〜1068のいずれかの多重特異性結合分子。
[本発明1070]
前記結合領域が、前記ＩｇＭ重鎖定常領域のＮ末端に融合される、本発明1067の多重特異性結合分子。
[本発明1071]
前記結合領域の少なくとも1つが、抗体の可変領域である、本発明1070の多重特異性結合分子。
[本発明1072]
前記結合領域の全てが、抗体重鎖可変領域である、本発明1071の多重特異性結合分子。
[本発明1073]
少なくとも2つの結合ターゲットが、異なる抗原である、本発明1072の多重特異性結合分子。
[本発明1074]
少なくとも2つの結合ターゲットが、同じ抗原上の異なるエピトープである、本発明1072の多重特異性結合分子。
[本発明1075]
前記抗原重鎖可変領域が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ抗体のものである、本発明1071の多重特異性結合分子。
[本発明1076]
前記抗原重鎖可変領域が、ＩｇＭ抗体のものである、本発明1075の多重特異性結合分子。
[本発明1077]
多重特異性ＩｇＭ抗体である、本発明1076の多重特異性結合分子。
[本発明1078]
前記結合単位の少なくとも1つのＩｇＭ重鎖可変領域と会合する少なくとも1つのＩｇＭ軽鎖可変領域配列をさらに含む、本発明1077の多重特異性結合分子。
[本発明1079]
前記ＩｇＭ重鎖可変領域のそれぞれと会合するＩｇＭ軽鎖可変領域配列をさらに含む、本発明1078の多重特異性結合分子。
[本発明1080]
前記内部非対称界面が、Ｃμ2、Ｃμ3及び／またはＣμ4ドメインのうちの少なくとも1つの中の逆電荷アミノ酸残基の間のペアごとの切替えにより形成される塩架橋により生成される、本発明1048〜1079のいずれかの多重特異性結合分子。
[本発明1081]
塩架橋が、前記結合単位の2つの鎖のＣμ2−Ｃμ2、Ｃμ4−Ｃμ4、及びＣμ2−Ｃμ3−Ｃμ4ドメインのうちの少なくとも1つの間に形成される、本発明1080の多重特異性結合分子。
[本発明1082]
前記ペアごとの切替えが、Ｅ→Ｋ、Ｋ→Ｅ；Ｒ→Ｅ、Ｅ→Ｒ；Ｄ→Ｋ、Ｋ→Ｄ；及びＲ→Ｄ、Ｄ→Ｒからなる群から選択される、本発明1081の多重特異性結合分子。
[本発明1083]
前記Ｃμ4−Ｃμ4ドメイン内に少なくとも1つのペアごとの電荷アミノ酸残基切替えを含む、本発明1080の多重特異性結合分子。
[本発明1084]
前記切替えが、Ｒ328Ｅ，Ｄ⇔Ｅ339Ｒ，Ｋ；Ｒ344Ｅ，Ｄ⇔Ｓ330Ｒ，Ｋ；Ｋ376Ｅ，Ｄ⇔Ｅ385Ｒ，Ｋ；Ｒ427Ｅ，Ｄ⇔Ｅ339Ｒ，Ｋ；及びＴ354Ｅ，Ｄ⇔Ｉ397Ｒ，Ｋからなる群から選択される、本発明1083の多重特異性結合分子。
[本発明1085]
前記Ｃμ2−Ｃμ2ドメイン間に少なくとも1つのペアごとの電荷アミノ酸残基切替えを含む、本発明1080の多重特異性結合分子。
[本発明1086]
前記切替えが、Ｅ167Ｒ，Ｋ⇔Ｋ177Ｅ，Ｄ及びＫ169Ｅ，Ｄ⇔Ｅ170Ｒ，Ｋからなる群から選択される、本発明1085の多重特異性結合分子。
[本発明1087]
前記Ｃμ2−Ｃμ3−Ｃμ4ドメイン内に少なくとも1つのペアごとの電荷アミノ酸残基切替えを含む、本発明1080の多重特異性結合分子。
[本発明1088]
前記切替えが、Ｄ121Ｋ，Ｒ⇔Ｋ315Ｄ，Ｅ；Ｋ150Ｅ，Ｄ⇔Ｅ385Ｋ，Ｒ；及びＫ185Ｄ，Ｅ⇔Ｄ360Ｋ，Ｒからなる群から選択される、本発明1087の多重特異性結合分子。
[本発明1089]
前記外部非対称界面が、前記Ｃμ3−Ｃμ3ドメイン内の少なくとも1つのペアごとの電荷アミノ酸残基切替えにより生成される、本発明1048〜1088のいずれかの多重特異性結合分子。
[本発明1090]
前記ペアごとの変換された（ｃｈａｎｇｅｄ）アミノ酸残基切替えが、Ｋ238⇔Ｄ293またはＫ268⇔Ｄ294である、本発明1089の多重特異性結合分子。
[本発明1091]
前記ＩｇＭ重鎖定常領域間の前記外部及び／または内部非対称界面の少なくとも一部が、ノブ・イントゥー・ホール結合により生成される、本発明1048〜1079のいずれかの多重特異性結合分子。
[本発明1092]
少なくとも1つのノブ・イントゥー・ホール結合が、ノブ：Ｔ350→Ｙ，Ｆ，Ｗ；及びＨ395→Ｙ，Ｆと、ホール：Ｌ352→Ｇ，Ａ，Ｖ，Ｉ，Ｍ，Ｓ，Ｔ；Ｈ395→Ａ，Ｖ，Ｉ，Ｌ，Ｍ，Ｆ，Ｙ；Ｆ393→Ｗ，Ｙ；Ｉ397→Ａ，Ｖ，Ｓ，Ｔ；Ｔ350→Ｓ，Ａ，Ｖ；及びＴ348→Ｓと、からなる群から選択される突然変異により生成される、本発明1091の多重特異性結合分子。
[本発明1093]
前記軽鎖可変領域配列が、前記軽鎖と重鎖の間に非対称界面を生成することにより、それらのマッチする重鎖可変領域にカップリングされる、本発明1079〜1092のいずれかの多重特異性結合分子。
[本発明1094]
前記非対称界面が、ＣｒｏｓｓＭａｂ技術、ノブ・イントゥー・ホールカップリング及び／または塩架橋カップリングにより生成される、本発明1093の多重特異性結合分子。
[本発明1095]
共通の軽鎖を含む、本発明1079〜1094のいずれかの多重特異性結合分子。
[本発明1096]
毒素にコンジュゲートされる、本発明1048〜1095のいずれかの多重特異性結合分子。
[本発明1097]
化学療法剤にコンジュゲートされる、本発明1048〜1095のいずれかの多重特異性結合分子。
[本発明1098]
コンジュゲーションが、融合による、本発明1096または1097の多重特異性結合分子。
[本発明1099]
コンジュゲーションが、化学的リンカーによる、本発明1096または1097の多重特異性結合分子。
[本発明1100]
キメラまたはヒト化である、本発明1079〜1099のいずれかの多重特異性結合分子。
[本発明1101]
本発明1048〜1100のいずれかの多重特異性結合分子を少なくとも約70％、または少なくとも80％、または少なくとも90％、または少なくとも95％、または少なくとも98％、または少なくとも99％含む組成物。
[本発明1102]
医薬組成物である、本発明1101の組成物。

Ｊ鎖を含み、鎖Ａ及びＢがネイティブＩｇＭと同一である、ＩｇＭ五量体の構造を示す。 ２つの結合特異性を有し、Ａ及びＢと称される重（μ）鎖が異なる、５員ＩｇＭ分子を示す。 ５つまたは６つの単一特異性結合単位を含む多重特異性ＩｇＭ抗体であって、ここで（ｉ）該単一特異性結合単位のそれぞれが、２つのＩｇＭ重鎖定常領域を含み、その定常領域のそれぞれが、結合ターゲットにつながる結合領域にコンジュゲートされた少なくとも１つのＣμ４ドメインを含み、（ｉｉ）該単一特異性結合単位の少なくとも２つが、異なる結合ターゲットに結合する、該多重特異性ＩｇＭ抗体を示す。 ５つまたは６つの二重特異性結合単位を含む多重特異性ＩｇＭ抗体であって、ここで（ｉ）該二重特異性結合単位のそれぞれが、２つのＩｇＭ重鎖定常領域を含み、その定常領域のそれぞれが、結合ターゲットにつながる結合領域にコンジュゲートされた少なくとも１つのＣμ４ドメインを含み、（ｉｉ）該二重特異性結合単位の少なくとも２つが、異なる結合ターゲットに結合する、該多重特異性ＩｇＭ抗体を示す。 Ｃｚａｊｋｏｗｓｋｙ Ｄ．Ｍ， Ｓｈａｏ Ｚ， ＰＮＡＳ ２００９； １０６：１４９６０−１４９６５において発表されたＩｇＭ分子のＡ及びＢ重鎖の構造モデルである。 それぞれヒトＩｇＧ１、ＩｇＥ及びＩｇＭのＣＧ１、ＣＥ１及びＣＭ１定常ドメインのアライメントを示す。 それぞれヒトＩｇＥ及びＩｇＭのＣＥ２及びＣＭ２定常ドメインのアライメントを示す。 それぞれヒトＩｇＧ１、ＩｇＥ及びＩｇＭのＣＧ２、ＣＥ３及びＣＭ３定常ドメインのアライメントを示す。 それぞれヒトＩｇＧ、ＩｇＥ及びＩｇＭのＣＧ３、ＣＥ４及びＣＭ４定常ドメインのアライメントを示す。 図４Ａ〜４Ｄにおいて、 ヒトＩｇＥ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ Ｊ００２２２．１のものであり、残基のナンバリングは、ＰＤＢ ２ＷＱＲのものであり；らせん（ｈ）及びシート（ｓ）の割り付けはＰＤＢ ２ＷＱＲのものであり； ヒトＩｇＧ１配列は、ＧｅｎＢａｎｋ Ｊ００２２８．１のものであり、残基のナンバリングは、ＰＤＢ １ＯＱＯのものであり；らせん（ｈ）及びシート（ｓ）の割り付けはＰＤＢ １ＯＱＯのものであり； ヒトＩｇＭ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ Ｘ１４９４０．１のものであり、残基のナンバリングは、ＣＭ１ドメインの開始部分から連続しており；以下に示されたヒトＩｇＭ配列において、ヒトＩｇＭ配列についての変異が報告されている。ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＢ３７８３８．１、ＣＡＣ２０４５８．１、ＡＦＭ３７３１２．１、Ｘ５７３３１．１及びＪ００２６０．１ 実施例１において調製されたヘテロモノマーの構造を示す。 野生型及び作製されたＩｇＭ Ｆｃペア２ａ及び２ｂの非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。 レーン１：野生型Ｒｔｘ：Ｆｃ レーン２：Ｒｔｘ２ａ：Ｆｃ２ｂの混合物であり、ここでＲｔｘ２ａは、Ｃ２９１Ｓ、Ｔ３５０Ｙ、Ｔ３５４Ｅ、及びＩ３９７Ｅ突然変異ならびにテールピース欠失を有するヒトμ鎖のＣＭ１〜ＣＭ４が融合されたキメラリツキサン（抗ＣＤ２０）Ｖｈ領域のμ鎖で構成され；Ｆｃ２ｂは、Ｃ２９１Ｓ、Ｌ３５２Ｓ、Ｔ３５４Ｋ、Ｈ３９５Ｖ、及びＩ３９７Ｋ突然変異ならびにテールピース欠失を有するヒトμ鎖ＣＨ２〜ＣＨ４である。 レーン３：Ｒｔｘ２ｂ：Ｆｃ２ａの混合物であり、ここでＲｔｘ２ｂは、Ｃ２９１Ｓ、Ｌ３５２Ｓ、Ｔ３５４Ｋ、Ｈ３９５Ｖ、及びＩ３９７Ｋ突然変異ならびにテールピース欠失を有するヒトμ鎖のＣＭ１〜ＣＭ４が融合されたキメラリツキサン（抗ＣＤ２０）Ｖｈ領域のμ鎖で構成され；Ｆｃ２ａは、Ｃ２９１Ｓ、Ｔ３５０Ｙ、Ｔ３５４Ｅ、及びＩ３９７Ｅ突然変異ならびにテールピース欠失を有するヒトμ鎖ＣＨ２〜ＣＨ４領域からなる。矢印は、ヘテロ二量体を示す。 野生型及び設計されたＩｇＭ Ｆｃペア１ａ及び２ｂの還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示し、称号は図６と同じである。 野生型及び設計されたＩｇＭ Ｆｃペアの非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す： レーン１：野生型Ｏｋｔ：Ｆｃ。Ｏｋｔは、ヒトμ鎖のＣＭ２〜ＣＭ４が融合されたＯＫＴ３（抗ＣＤ３抗体）ｓｃＦｖで構成される。 レーン２：Ｏｋｔ２ａ：Ｆｃ２ｂの混合物であり、ここでＯｋｔ２ａは、Ｃ２９１Ｓ、Ｔ３５０Ｙ、Ｔ３５４Ｅ、及びＩ３９７Ｅ突然変異ならびにテールピース欠失を有するヒトμ鎖のＣＭ２〜ＣＭ４が融合されたＯＫＴ３（抗ＣＤ３抗体）ｓｃＦｖで構成される； レーン３：Ｏｋｔ２ｂ：Ｆｃ２ａの混合物であり、ここでＯｋｔ２ｂは、Ｃ２９１Ｓ、Ｌ３５２Ｓ、Ｔ３５４Ｋ、Ｈ３９５Ｖ、及びＩ３９７Ｋ突然変異ならびにテールピース欠失を有するヒトμ鎖のＣＭ２〜ＣＭ４が融合されたＯＫＴ３（抗ＣＤ３抗体）ｓｃＦｖで構成される；矢印は、ヘテロ二量体を示す。 レーン４〜６：野生型Ｏｋｔ：Ｒｔｘの組み合わせ；設計されたＯｋｔ２ａ：Ｒｔｘ２ｂの組み合わせ；及びＯｋｔ２ｂ：Ｒｔｘ２ａの組み合わせであり、ここでＲｔｘ２ａは、Ｃ２９１Ｓ、Ｔ３５０Ｙ、Ｔ３５４Ｅ、及びＩ３９７Ｅ突然変異ならびにテールピース欠失を有するヒトμ鎖のＣＭ１〜ＣＭ４が融合されたキメラリツキサン（抗ＣＤ２０）Ｖｈ領域のμ鎖で構成され；Ｒｔｘ２ｂは、Ｃ２９１Ｓ、Ｌ３５２Ｓ、Ｔ３５４Ｋ、Ｈ３９５Ｖ、及びＩ３９７Ｋ突然変異ならびにテールピース欠失を有するヒトμ鎖のＣＭ１〜ＣＭ４が融合されたキメラリツキサン（抗ＣＤ２０）Ｖｈ領域のμ鎖で構成される。矢印は、ヘテロ二量体を示す。 図８に示されたものと同じ構築物の２９３Ｆ細胞トランスフェクタントのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでの還元された試料を示す。 Ｃμ３領域内の４つの塩架橋が、本発明の多重特異性結合分子におけるジスルフィド架橋周辺の２つの隣接する（Ａ，Ｂ）μ鎖を安定化させる方法を示す。 表Ａ ノブ−ホール位置、及び潜在的電荷誘導のためのヒトＩｇＭ ＣＭ４ドメイン界面残基を列挙する。 表Ａ ノブ−ホール位置、及び潜在的電荷誘導のためのヒトＩｇＭ ＣＭ４ドメイン界面残基を列挙する。 表Ａ ノブ−ホール位置、及び潜在的電荷誘導のためのヒトＩｇＭ ＣＭ４ドメイン界面残基を列挙する。 表Ａ ノブ−ホール位置、及び潜在的電荷誘導のためのヒトＩｇＭ ＣＭ４ドメイン界面残基を列挙する。 表Ａ ノブ−ホール位置、及び潜在的電荷誘導のためのヒトＩｇＭ ＣＭ４ドメイン界面残基を列挙する。 表Ａ ノブ−ホール位置、及び潜在的電荷誘導のためのヒトＩｇＭ ＣＭ４ドメイン界面残基を列挙する。 表Ａ ノブ−ホール位置、及び潜在的電荷誘導のためのヒトＩｇＭ ＣＭ４ドメイン界面残基を列挙する。 表Ａ ノブ−ホール位置、及び潜在的電荷誘導のためのヒトＩｇＭ ＣＭ４ドメイン界面残基を列挙する。 表Ｂ 潜在的電荷スワップ（ｃｈａｒｇｅ ｓｗａｐ）のためのヒトＩｇＭ ＣＭ４ドメイン界面残基を列挙する。 表Ｃ 潜在的電荷誘導のためのヒトＩｇＭ ＣＭ２ドメイン界面残基を列挙する。 表Ｄ ノブ−ホール位置におけるヒトＩｇＭ ＣＭ２ドメイン界面残基を列挙する。 表Ｄ ノブ−ホール位置におけるヒトＩｇＭ ＣＭ２ドメイン界面残基を列挙する。 表Ｅ 潜在的電荷スワップのためのヒトＩｇＭ ＣＭ２ドメイン界面残基を列挙する。 表Ｆ 電荷交換のためのヒトＩｇＭ ＣＭ２、ＣＭ３及びＣＭ４ドメイン界面残基を列挙する。 表Ｆ 電荷交換のためのヒトＩｇＭ ＣＭ２、ＣＭ３及びＣＭ４ドメイン界面残基を列挙する。

Ｉ． 定義
用語「抗体」は、モノクローナル抗体（免疫グロブリンＦｃ領域を有する全長抗体を含む）、一本鎖分子、及び抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２及びＦｖ）を包含する。用語「免疫グロブリン（Ｉｇ）」は、本明細書において「抗体」と互換的に用いられる。基本的な４本鎖抗体単位は、２つの同一の軽（Ｌ）鎖と２つの同一重（Ｈ）鎖で構成されたヘテロ四量体糖タンパク質である。

ＩｇＧの場合、４本鎖単位は、一般に、約１５０，０００ダルトンである。各Ｌ鎖は、１つのジスルフィド共有結合によりＨ差に連結され、２つのＨ鎖は、Ｈ鎖のアイソタイプに応じて１つまたは複数のジスルフィド結合により互いに連結されている。各Ｈ及びＬ鎖は、規則的間隔で存在する鎖内ジスルフィド架橋も有する。各Ｈ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）を有し、続いてα及びγ鎖それぞれでは３つの定常ドメイン（Ｃ_Ｈ）を、そしてμ及びεアイソタイプでは４つのＣ_Ｈドメインを有する。各Ｌ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を有し、続いてもう一方の末端に定常ドメインを有する。Ｖ_Ｌは、Ｖ_Ｈとアライメントされ、Ｃ_Ｌは、重鎖の第一の定常ドメイン（Ｃ_Ｈ１）とアライメントされている。特定のアミノ酸残基が、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの間の界面を形成すると考えられている。Ｖ_ＨとＶ_Ｌが互いに対合して、１つの抗原結合部位を形成している。

ＩｇＭ形態は、複数の免疫グロブリンがジスルフィド結合と一緒になって共有結合で連結しているポリマーである。ＩｇＭは、ほとんどが五量体として存在するが六量体としても存在し、それゆえ１０または１２の抗原結合部位を含む。五量体形態は、場合によりＪ鎖と呼ばれる追加のポリペプチドを含むが、Ｊ鎖を含まずに生成することもできる。五量体ＩｇＭ分子は、およそ９７０ｋＤａの分子量を有する。ＩｇＭは、そのポリマー性により、高いアビディティを有し、相補的活性化に特に効果的である。ＩｇＧとは異なり、ＩｇＭ単量体内の重鎖は、１つの可変ドメインと４つの定常ドメインで構成される。ＩｇＭ定常ドメインは、本明細書において、ＣＭ１またはＣμ１、ＣＭ２またはＣμ２、ＣＭ３またはＣμ３、及びＣＭ４またはＣμ４と称され、ここで「ＣＭ」及び「Ｃμ」の称号は、互換的に用いられている。

ＩｇＡ抗体は、単量体形態で存在するが、重合することも可能である。分泌形態において、ＩｇＡは、Ｊ鎖に連結された基本的４本鎖単位２〜５個と、分泌成分とを含む。

ＩｇＥは、単量体形態で存在し、本出願においてＣＥ１、ＣＥ２、ＣＥ３及びＣＥ４と称される４つの定常ドメインを有する。

任意の脊椎動物種のＬ鎖は、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの明確に異なるタイプのうちの１つに割り付けることができる。

抗体の一部のタイプは、さらに様々な下位分類：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２に分別され得る。

異なる抗体分類の構造及び特性のさらなる詳細については、例えばＢａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｄａｎｉｅｌ Ｐ． Ｓｔｉｔｅｓ， Ａｂｂａ Ｉ． Ｔｅｒｒ ａｎｄ Ｔｒｉｓｔｒａｍ Ｇ． Ｐａｒｓｌｏｗ （ｅｄｓ）， Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ， Ｎｏｒｗａｌｋ， Ｃｏｎｎ．， １９９４， ｐａｇｅ ７１及びＣｈａｐｔｅｒ ６を参照されたい。

他に断りがなければ、用語「抗体」は、具体的には天然由来の変異体を含む、ネイティブのヒト抗体及び非ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＭ抗体を包含する。したがって例えばヒトＩｇＭ配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｘ１４９４０．１の下で入手可能であり、変異体は、ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＢ３７８３８．１、ＣＡＣ２０４５８．１、ＡＦＭ３７３１２．１、Ｘ５７３３１．１、及びＪ００２６０．１として報告されている。

本明細書で用いられる用語「モノクローナル抗体」は、実質的に同種の抗体の集団から得られた抗体を指し、即ち該集団を含む個々の抗体は、微量で存在し得る可能な天然由来の突然変異以外では同一である。モノクローナル抗体は、高特異性であり、単一抗原部位を対象とする。さらに、典型的には異なる決定基（エピトープ）を対象とする異なる抗体を含む、従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一決定基を対象とする。修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に同種の集団から得られているという抗体の特徴を指しており、任意の特定の方法による抗体生成を要すると解釈されるべきでない。例えば本発明により用いられるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９７５） Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５に初めて記載されたハイブリドーマ法により作製され得るか、または組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照）により作製され得る。「モノクローナル抗体」はまた、例えばＣｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２２：５８１−５９７に記載された技術を利用して、ファージ抗体ライブラリーから単離することができる。

本明細書におけるモノクローナル抗体は、具体的には「キメラ」抗体(免疫グロブリン)を包含し、所望の生物活性を示す限りにおいて、重鎖及び／または軽鎖の一部が、特定の種に由来する、または特定の抗体分類もしくは下位分類に属する、抗体内の対応する配列と同一である、または相同性があるが、該鎖（複数可）の残り部分は、別の種に由来する、または別の抗体分類もしくは下位分類に属する抗体、及びそのような抗体の断片の中の対応する配列と同一である、または相同性がある（米国特許第４，８１６，５６７号；及びＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：６８５１−６８５５）。

非ヒト（例えば、ネズミ）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含む抗体である。ほとんどの部分で、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域からの残基が、所望の特異性、親和性、及び容量（ｃａｐａｃｉｔｙ）を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域からの残基により置換された、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。幾つかの例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基もまた、対応する非ヒト残基により置換されている。さらにヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体中に見出されない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体の性能をさらに精巧にするために実施される。一般にヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、超可変ループの全てまたは実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全てが、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体は、場合により免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部も含むであろう。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５； Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２９；及びＰｒｅｓｔａ （１９９２） Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ２：５９３−５９６を参照されたい。

「種依存性抗体」は、第一の哺乳動物種からの抗原に対して、第二の哺乳動物種からの抗原の相同体に対するよりも強い結合親和性を有する抗体である。通常、種依存性抗体は、ヒト抗原に「特異的に結合する」(即ち、約１×１０^−７Ｍ以下、好ましくは約１×１０^−８Ｍ以下、最も好ましくは約１×１０^−９Ｍ以下の結合親和性(Ｋ_ｄ)値を有する)が、第２の非ヒト哺乳動物種からの抗原の相同体に対して、ヒト抗原に対する結合親和性よりも、少なくとも約５０倍、または少なくとも約５００倍、または少なくとも約１０００倍弱い結合親和性を有する。種依存性抗体は、先に定義された様々なタイプの抗体のいずれでもあり得るが、好ましくはヒト化またはヒト抗体である。

本明細書で用いられる「抗体突然変異体」または「抗体変異体」は、参照抗体のアミノ酸残基の１つまたは複数が修飾されている該参照抗体のアミノ酸配列変異体を指す。参照抗体は、例えばネイティブ抗体だけでなくネイティブ抗体の既知の変異体でもあり得る。そのような突然変異体は、必然的に参照抗体と１００％未満の配列同一性または類似性を有する。好ましい実施態様において、抗体突然変異体は、参照抗体の重鎖または軽鎖のいずれかの可変ドメインのアミノ酸配列と、少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性または類似性を有するアミノ酸配列を有するであろう。この配列に関する同一性または類似性は、本明細書において、最大配列同一性％を達成するために、必要に応じて、配列をアライメントしギャップを導入した後の、参照抗体残基と同一（即ち、同じ残基)または類似（即ち、共通の側鎖特性に基づく同じ群からのアミノ酸残基)である候補配列内のアミノ酸残基の割合％と定義される。可変ドメインの外部にある抗体配列へのＮ末端、Ｃ末端、または内部の伸長、欠失、または挿入はいずれも、配列同一性または類似性に影響を及ぼすと解釈されてはならない。

本明細書における「単離された」二重特異性または多重特異性結合分子、例えば二重特異性または多重特異性抗体は、天然の組換え宿主細胞内環境の構成成分から同定され、そして分離及び／または回収されたものである。天然の環境の混入成分は、該分子、例えば抗体のための診断または治療使用を妨害する材料であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性または非タンパク質性溶質に加え、望ましくない製造副産物、例えば単一特異性結合単位（ＡＢ結合単位を含む二重特異性分子の場合にはＡＡ及び／またはＢＢ）、または５未満の二重特異性結合単位を有する分子を挙げることができる。好ましい実施形態において、抗体などの二重特異性結合分子は、（１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥもしくはＳＥＣ−ＨＰＬＣ法による測定で９５重量％を超える、もしくは９８重量％を超える、もしくは９９重量％を超えるまで、（２）アミノ酸シークエンサーの使用によりＮ末端もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度に、または（３）クーマシーブルーもしくは好ましくは銀染色を利用して還元もしくは非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均一になるまで、精製されるであろう。普通、単離された多重特異性、例えば二重特異性の結合分子、例えば抗体は、少なくとも１つの精製ステップにより調製されるであろう。

用語「特異的結合」または「特異的に結合する」または「に対して特異性がある」は、標的分子、例えば特定のポリペプチド、または特定のポリペプチド、ペプチドもしくは他のターゲット（例えば、糖タンパク質ターゲット）上のエピトープに対する、抗体などの結合分子の結合を指し、非特異的相互作用と測定可能に異なる結合を意味する（例えば、非特異的相互作用は、ウシ血清アルブミンまたはカゼインへの結合であり得る）。特異的結合は、例えば標的分子への抗体の結合を対照分子への抗体の結合に比較して計測することにより、測定され得る。例えば特異的結合は、ターゲットに類似した対照分子、例えば過剰な非標識ターゲットとの拮抗により決定され得る。この場合、標識されたターゲットによるプローブへの結合が、過剰な非標識ターゲットにより拮抗阻害されれば、特異的結合が示される。本明細書で用いられる、特定のポリペプチド、またはポリペプチドターゲット上のエピトープに関する用語「特異的結合」または「特異的に結合する」または「に対して特異性がある」は、例えば少なくとも約２００ｎＭ、あるいは少なくとも約１５０ｎＭ、あるいは少なくとも約１００ｎＭ、あるいは少なくとも約６０ｎＭ、あるいは少なくとも約５０ｎＭ、あるいは少なくとも約４０ｎＭ、あるいは少なくとも約３０ｎＭ、あるいは少なくとも約２０ｎＭ、あるいは少なくとも約１０ｎＭ、あるいは少なくとも約８ｎＭ、あるいは少なくとも約６ｎＭ、あるいは少なくとも約４ｎＭ、あるいは少なくとも約２ｎＭ、あるいは少なくとも約１ｎＭの、またはそれを超える、ターゲットへのＫｄを有する分子により示され得る。特定の例において、用語「特異的結合」は、分子が、任意の他のポリペプチドまたはポリペプチドエピトープに実質的に結合せずに、特定のポリペプチド、または特定のポリペプチド上のエピトープに結合する場合の結合を指す。

「結合親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）の間の非共有結合的相互作用の総和の強度を指す。他に断りがなければ、本明細書で用いられる「結合親和性」は、結合ペアのメンバー（例えば、抗体と抗原）の間の１：１相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。一般的に、分子ＸのパートナーＹに対する親和性は、解離定数（Ｋｄ）として表すことができる。例えばＫｄは、約２００ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、８ｎＭ、６ｎＭ、４ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、またはそれよりも大きくなり得る。親和性は、本明細書に記載された方法など、当該技術分野で公知の一般的方法により測定することができる。低親和性抗体は、一般に抗原に緩やかに結合して即座に解離する傾向があるのに対し、高親和性抗体は、一般に抗原により急速に結合してより長時間結合を維持する傾向がある。結合親和性を測定する様々な方法が、当該技術分野で公知である。

本明細書で用いられる「Ｋｄ」または「Ｋｄ値」は、抗体及び標的ペアに適した技術により、例えば約１０応答単位（ＲＵ）で固定された抗原ＣＭ５チップを含む２５℃のビアコア（商標）−２０００またはビアコア（商標）−３０００（ビアコア社、ニュージャージー州ピスカタウェイ所在）を用いて、例えば表面プラズモン共鳴アッセイを利用して、測定される解離定数を指す。

用語「二重特異性結合単位」は、本明細書において、一対のＩｇＭ重鎖定常領域ポリペプチドを含む分子であって、その各ポリペプチドが少なくとも１つのＣＭ４ドメインを含み、その各ポリペプチドが異なる結合ターゲットにつながる結合領域にコンジュゲートされている、該分子を指すために用いられる。好ましくは該コンジュゲーションは、好ましくはＩｇＭ鎖定常領域のポリペプチド配列のＮ末端への、融合による。用語「二重特異性結合単位」は、具体的には本明細書の以後に定義される「二重特異性ＩｇＭ抗体結合単位」を包含するが、これに限定されない。本発明の結合分子は、五量体または六量体環構造を有し、５つまたは６つの二重結合単位を含む。

用語「コンジュゲートする」、「コンジュゲートされた」及び「コンジュゲーション」は、共有結合的、または非共有結合的連結のあらゆる形態を指しており、直接の遺伝子融合または化学的融合、リンカーまたは架橋剤を通したカップリング、及び非共有結合的会合を包含するが、これらに限定されない。

用語「二重特異性ＩｇＭ抗体結合単位」は、最も広い意味で用いられ、具体的には可変ドメイン配列（Ｖ_Ｈ）に融合された少なくとも１つのＣＭ４定常ドメインを含むＩｇＭ抗体重鎖定常領域ポリペプチドのペアであって、各可変ドメイン配列が会合する抗体軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）配列と共に、またはそれを伴わずに異なるターゲットに結合する、該ＩｇＭ抗体重鎖定常領域ポリペプチドのペアを包含する。一実施形態において、二重特異性ＩｇＭ抗体は、２つのＶ_ＨＶ_Ｌ抗原結合領域を含み、その領域のそれぞれが１つの抗原上の異なるエピトープまたは２つの異なる抗原上のエピトープに結合することが可能である。二重特異性ＩｇＭ抗体結合単位は、１つの種から得られる全長のものであり得、またはキメラ化もしくはヒト化されたものであり得る。本発明の二重特異性ＩｇＭ抗体は、５つまたは６つの二重特異性ＩｇＭ結合単位を含む五量体または六量体環構造を有する。

「全長ＩｇＭ抗体重鎖」は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体重鎖定常ドメイン１（ＣＭ１またはＣμ１）、抗体重鎖定常ドメイン２（ＣＭ２またはＣμ２）、抗体重鎖定常ドメイン３（ＣＭ３またはＣμ３）、及び抗体重鎖定常ドメイン４（ＣＭ４またはＣμ４）からなるポリペプチドである。本発明による二重特異性全長ＩｇＭ抗体は、５つまたは６つの単量体（結合単位）を含み、それぞれの単量体が２つの抗原結合部位を有し、２つの異なる結合ターゲット（エピトープ）に特異的に結合する。全長抗体の重鎖または軽鎖のＣ末端は、該重鎖または軽鎖のＣ末端にある最後のアミノ酸を表す。全長抗体の重鎖または軽鎖のＮ末端は、該重鎖または軽鎖のＮ末端にある最初のアミノ酸を表す。

本明細書で用いられる用語「価」は、抗体における特定数の結合部位の存在を表す。そのため用語「二価」、「四価」、及び「六価」は、それぞれ２つの結合部位、４つの結合部位、及び６つの結合部位の存在を表す。本発明による二重特異性ＩｇＭ抗体において、各結合単位は、二価である。したがって本明細書における二重特異性ＩｇＭ抗体は、１０または１２価を有する。その定義は、非抗体である結合分子にも同様に適用される。

用語「エピトープ」は、抗体への特異的結合が可能な任意の分子決定基を包含する。特定の実施形態において、エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、またはスルホニルなどの分子の化学的活性の表面基を包含し、特定の実施形態において、特異的三次元構造特性、及び／または特異的電荷特性を有し得る。エピトープは、抗体により結合される抗原の領域である。「結合領域」は、結合分子により結合されるターゲット上の領域である。

「ポリエピトープ特異性（ｐｏｌｙｅｐｉｔｏｐｉｃ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）」は、同一または異なるターゲット（複数可）上の２つ以上の異なるエピトープに特異的に結合する能力を指す。「単一特異性」は、１つのエピトープのみに結合する能力を指す。一実施形態によれば、二重特異性ＩｇＭ抗体は、少なくとも１０^−７Ｍまたは１０^−８Ｍまたはさらに良好な親和性を有する各エピトープに結合する。

用語「ターゲット」は、最も広い意味で用いられており、具体的にはポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、及び天然に存在する通りの生物学的機能を有する他の分子を包含する。「ターゲット」は、例えば二重特異性結合単位が、２つの異なる細胞型、同じ細胞型の異なる亜集団（例えば、異なるＢ細胞集団）、または単一細胞上の２種の異なる物体をターゲットとする、細胞であり得る。

本発明の抗体の「抗原結合部位」または「抗原結合領域」は、典型的には抗原に対する結合部位の親和性に様々な度合いで寄与する６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。３つの重鎖可変ドメインＣＤＲ（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３）及び３つの軽鎖可変ドメインＣＤＲ（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３）が存在する。ＣＤＲ及びフレームワーク領域（ＦＲ）の範囲は、それらの領域が抗体／抗原複合体からの配列及び／または構造情報の変動性に従って定義されている、集められたアミノ酸配列データベースへの比較により決定される。同じく本発明の範囲に含まれるのは、より少ないＣＤＲで構成された（即ち、結合特異性が３つ、４つまたは５つのＣＤＲにより決定された）機能的抗原結合部位である。幾つかの結合ターゲットへの結合には、６つのＣＤＲの完全なセットより少ない数で十分であり得る。したがって幾つかの例において、ＶＨまたはＶＬドメインのみのＣＤＲが、十分となろう。さらに特定の抗体は、抗原への非ＣＤＲ関連結合部位を有し得る。そのような結合部位は、具体的に本発明の定義に含まれる。

本明細書で用いられる用語「界面」は、第二のＩｇＭ重鎖定常領域内の１つまたは複数の「接触する」アミノ酸残基（または他の非アミノ酸基）と相互作用する第一のＩｇＭ重鎖定常領域内の「接触する」アミノ酸残基（または例えば炭水化物基などの他の非アミノ酸基）を含む領域を指すために用いられる。

用語「非対称界面」は、第一及び第二のＩｇＭ重鎖定常領域などの２つの抗原鎖の間、及び／またはＩｇＭ重鎖定常領域とそのマッチする軽鎖の間に形成された界面（本明細書の先に定義された）であって、ここで第一及び第二の鎖の接触残基が、設計が異なり、相補性接触残基を含む、該界面を指すために用いられる。非対称界面は、ノブ／ホール相互作用及び／または塩架橋カップリング（電荷スワップ）及び／または当該技術分野で公知の他の技術、例えばμ重鎖のマッチする軽鎖へのカップリングのためのＣｒｏｓｓＭａｂアプローチにより、生成され得る。

「キャビティー」または「ホール」は、第二のポリペプチドの界面から引っ込んでいるため、第一のポリペプチドの隣接する界面上の対応する突起（「ノブ」）を収容する、少なくとも１つのアミノ酸側鎖を指す。キャビティー（ホール）は、本来の界面の中に存在し得るか、または合成により（例えば、界面をコードする核酸を改変することにより）導入され得る。通常、第二のポリペプチドの界面をコードする核酸は、キャビティーをコードするように改変される。これを実現するために、第二のポリペプチドの界面にある少なくとも１つの「本来の」アミノ酸残基をコードする核酸が、該本来のアミノ酸残基よりも小さな側鎖体積を有する少なくとも１つの「移入された（ｉｍｐｏｒｔ）」アミノ酸残基をコードするＤＮＡと置換される。１つを超える本来の残基、及び対応する移入された残基が存在し得ることは、認識されよう。置換される本来の残基の数の上限は、第二のポリペプチドの界面にある残基の総数である。キャビティーの形成に好ましい移入された残基は、通常、天然由来アミノ酸残基であり、好ましくはアラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）及びグリシン（Ｇ）から選択される。最も好ましいアミノ酸残基は、セリン、アラニンまたはトレオニン、最も好ましくはアラニンである。好ましい実施形態において、突起形成のための本来の残基は、チロシン（Ｙ）、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）またはトリプトファン（Ｗ）などの大きな側鎖体積を有する。

「本来の」アミノ酸残基は、該本来の残基よりも小さな、または大きな側鎖体積を有し得る「移入された」残基により置換されるものである。移入されたアミノ酸残基は、天然由来または非天然由来のアミノ酸残基であり得るが、好ましくは前者である。

「非天然由来」アミノ酸残基は、遺伝子コードによりコードされていないが、ポリペプチド鎖内の隣接するアミノ酸残基（複数可）に共有結合し得る残基を意味する。非天然由来アミノ酸残基の例は、例えばＥｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍ． ２０２：３０１−３３６ （１９９１）に記載されるものなどのノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリン及び他のアミノ酸残基類似体である。そのような非天然由来アミノ酸残基を作製するために、Ｎｏｒｅｎ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４： １８２ （１９８９）及び上掲のＥｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，の手順を用いることができる。手短に述べると、これは、非天然由来アミノ酸残基でのサプレッサｔＲＮＡの化学的活性化と、続くＲＮＡのインビトロ転写及び翻訳を含む。特定の実施形態における本発明の方法は、ＩｇＭ重鎖内の少なくとも１つの本来のアミノ酸残基を置換することを含むが、１つを超える本来の残基を置換することができる。通常、多くとも第一または第二のポリペプチドの界面の全残基が、置換される本来のアミノ酸残基を含む。置換に好ましい本来の残基は、「埋め込まれている（ｂｕｒｉｅｄ）」。「埋め込まれる」は、残基が本質的に溶媒に到達し難いことを意味する。好ましい移入された残基は、システインではなく、ジスルフィド結合の可能な酸化または誤対合が防止される。

突起は、キャビティー内で「位置決め可能」であるが、それは界面での第一及び第二のポリペプチドの正常な会合を著しく混乱させることなく、突起がキャビティー内に配置され得るような、それぞれ第一のポリペプチド及び第二のポリペプチドの界面にある突起及びキャビティーの空間配置と、突起及びキャビティーのサイズにすることを意味する。Ｔｙｒ、Ｐｈｅ及びＴｒｐなどの突起は、典型的には界面の軸から垂直方向に延在せず、好ましい立体配座を有するため、突起の対応するキャビティーとのアライメントは、Ｘ線結晶構造解析または核磁気共鳴（ＮＭＲ）により得られるような三次元構造に基づく突起／キャビティーペアをモデリングすることに依存する。これは、分子モデリングの技術など、当該技術分野で広く容認された技術を利用して実行され得る。

「本来の核酸」は、突起またはキャビティーをコードするように「改変」（即ち、遺伝子操作または突然変異）することが可能な該当するポリペプチドをコードする核酸を意味する。本来の、または出発時の核酸は、天然由来核酸であり得るか、または予め改変を受けた核酸を含み得る（例えば、ヒト化抗体断片）。核酸を「改変すること」は、本来のアミノ酸が、該当するアミノ酸残基をコードする少なくとも１つのコドンを挿入、欠失または置換することにより突然変異されることを意味する。通常、本来の残基をコードするコドンは、移入された残基をコードするコドンにより置換される。この手法でＤＮＡを遺伝子修飾するための技術は、Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ： ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｍ． Ｊ． ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ， Ｅｄ．， （ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， ＵＫ． （１９９１）で論評されており、例えば部位特異的変異導入法、カセット変異導入法及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）変異導入法が挙げられる。

突起またはキャビティーは、合成手段により、例えば組換え技術、インビトロペプチド合成、過去に記載された非天然由来アミノ酸残基を導入するそれらの技術、ペプチドの酵素的もしくは化学的カップリング、またはこれらの技術の幾つかの組み合わせにより、第一または第二のポリペプチドの界面に「導入」することができる。したがって「導入される」突起またはキャビティーは、「非天然由来」または「非ネイティブ」であり、それは天然に、または本来のポリペプチド（例えば、ヒト化モノクローナル抗体）中に存在しないことを意味する。

好ましくは、突起を形成するための移入されたアミノ酸残基は、比較的少ない「回転異性体」の数（例えば、約３〜６）を有する。「回転異性体」は、アミノ酸側鎖のエネルギー的に好都合の立体配座である。様々なアミノ酸残基の回転異性体の数が、Ｐｏｎｄｅｒｓ ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９３： ７７５−７９１ （１９８７）に論評されている。

本出願において用いられる用語「宿主細胞」は、本発明により抗体を作製するように設計され得る任意の種類の細胞系を表す。一実施形態において、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が、宿主細胞として用いられる。

本明細書で用いられる表現「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養物」は、互換的に用いられ、そのような名称は全て、子孫を含む。したがって言語「形質転換体」及び「形質転換された細胞」は、初代対象細胞、及び継代回数にかかわらず該初代細胞に由来する培養物を包含する。計画的な、または偶発的な突然変異により、全ての子孫のＤＮＡ量が精密に同一になり得ないことも、理解される。元々形質転換されていた細胞でスクリーニングされたものと同じ機能または生物活性を有する変異体子孫が含まれる。

核酸が、別の核酸配列との機能的関連性が認められた場合に、その核酸は、「作動可能に連結されている」。例えば、前駆配列または分泌リーダーのＤＮＡが、ポリペプチドの分泌に関係するプレタンパク質として発現される場合、そのＤＮＡは、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結されており；プロモーターもしくはエンハンサーが、コード配列の転写に影響を及ぼす場合、そのプロモーターもしくはエンハンサーは、コード配列に作動可能に連結されており；またはリボソーム結合部位が、翻訳を容易にするように配置されている場合、その結合部位は、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、“作動可能に連結されている”は、連結されたＤＮＡ配列が連続であり、分泌リーダーの場合には、連続かつリーディングフレーム内にあることを意味する。しかしエンハンサーは、連続である必要がない。連結は、簡便な制限部位におけるライゲーションによって遂行される。そのような部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、従来の実践法に従って用いられる。

詳細な説明
ＩｇＭは、抗原による刺激に応答したＢ細胞により産生された最初の免疫グロブリンであり、血清中におよそ１．５ｍｇ／ｍｌで存在し、５日の半減期である。ＩｇＭは、五量体または六量体分子である。まさしくＩｇＧと同様に、ＩｇＭ単量体は、２つの軽鎖及び２つの重鎖からなる。しかしＩｇＧは、３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）を含むが、ＩｇＭの重（μ）鎖は、ＩｇＥ内のε重鎖と同様に４番目の定常ドメイン（ＣＨ４）をさらに含む。この追加の定常ドメインは、ＩｇＧ及びＩｇＡ抗体のＦｃドメインを中心とした抗体結合Ｆａｂドメインの回転自由度を担うＩｇＧ及びＩｇＡプロリンリッチヒンジ領域の代わりに配置されている。

５つのＩｇＭ単量体は、更なる小さいポリペプチド鎖（Ｊ鎖）と複合体を形成して、ネイティブＩｇＭ分子を形成する。Ｊ鎖は、ＩｇＭが抗体産生細胞から分泌される前に、μ鎖の重合を容易にすると見なされている。ＩｇＭの結晶化は、悪名高い程難題であることが立証されているが、Ｃｚａｊｋｏｗｓｋｙ及びＳｈａｏ（ＰＮＡＳ １０６（３５）：１４９６０−１４９６５， ２００９）は、近年になり、ＩｇＥ Ｆｃドメインの構造及び公知のジスルフィド対合に基づき、ＩｇＭの相同性に基づく構造モデルを発表した。その著者らは、ヒトＩｇＭ五量体が屈曲偏向（ｆｌｅｘｕｒａｌ ｂｉａｓ）を有するマッシュルーム形分子であることを報告している。

自然な五量体または六量体ＩｇＭ抗体分子において、全ての重（μ）鎖は、同一であり、軽鎖もまた、同一である。本発明は、２つのμ鎖が互いに異なるＩｇＭ分子の製造を可能にする。

一態様において、本発明は、５つまたは６つの二重特異性結合単位により形成される五量体または六量体構造を有する、２つの異なる結合領域への結合特異性を備えた二重特異性結合分子であって、そのような二重特異性結合単位のそれぞれが、同じ２つの結合特異性を有し、第一の結合ターゲットにつながる第一の結合領域にコンジュゲートされたＩｇＭ重鎖定常領域の少なくとも１つのＣＭ４ドメインを含む第一の鎖と、ＩｇＭ重鎖定常領域の少なくとも１つのＣＭ４ドメイン及び第二の結合ターゲットにつながる第二の結合領域を含む第二の鎖と、を含み、該第一のターゲットと第二の結合ターゲットが異なり、該第一及び第二の鎖が、各ＩｇＭ重鎖定常領域間に生成された非対称界面の結果、二重特異性結合単位を生成するように組み立てられる、該二重特異性結合分子に関係する。

様々な実施形態において、該ＩｇＭ重鎖定常領域は、ＣＭ２及びＣＭ３ドメインの一方または両方またはそれらの断片と、潜在的に他のＩｇＭ重鎖定常ドメイン配列と、をさらに含む。一実施形態において、本発明の結合分子は、２つの重鎖間に非対称界面を生成するために１つまたは複数の修飾を有する、完全なＩｇＭ重（μ）鎖定常ドメインを含む。

２つの異なるμ重鎖（鎖Ａ及びＢ）を有するＩｇＭ分子を生成するためには、２つの異なる結合特異性を有する２つのマッチするμ重鎖（Ａ及びＢ）を互いにカップリングさせるための解決手段が見出されなければならない。加えて、結合領域を形成するのに軽鎖が必要となる場合には、所望の結合特異性を提供するために、各重鎖をそのマッチする軽鎖とカップリングさせるための解決手段が見出されなければならない。

カップリングは、特定の残基間の塩架橋ペア電荷切替え（電荷スワップまたは電荷反転とも称される）により、及び／または２つの鎖の間にノブ−ホール相互作用を生成することにより、実現され得る。重鎖は、ＣｒｏｓｓＭａｂ技術を利用することにより、マッチする軽鎖と対合することもできる。最適な結果を実現するために、異なるアプローチを組み合わせることもできる。

別の態様において、五量体または六量体構造を有する２つ以上の異なる結合ターゲットへの結合特異性を有する多重特異性結合分子に関係する。本発明は、５つまたは６つの単一特異性結合単位を含む結合分子であって、ここで（ｉ）該単一特異性結合単位のそれぞれが、２つのＩｇＭ重鎖定常領域を含み、その定常領域のそれぞれが、結合ターゲットにつながる結合領域にコンジュゲートされた少なくとも１つのＣμ３及びＣμ４ドメインを含み、（ｉｉ）該単一特異性結合単位の少なくとも２つが、異なる結合ターゲットに結合する、該結合分子を包含する。本発明は、５つまたは６つの二重特異性結合単位を含む結合分子であって、ここで（ｉ）該二重特異性結合単位のそれぞれが、２つのＩｇＭ重鎖定常領域を含み、その定常領域のそれぞれが、結合ターゲットにつながる結合領域にコンジュゲートされた少なくとも１つのＣμ３及びＣμ４ドメインを含み、（ｉｉ）該二重特異性結合単位の少なくとも２つが、異なる結合ターゲットに結合する、該結合分子をさらに包含する。特定の実施形態において、該結合分子は、多重特異性ＩｇＭ抗体である。

様々な実施形態において、該ＩｇＭ重鎖定常領域は、Ｃμ２ドメインまたはその断片と、潜在的に他のＩｇＭ重鎖定常ドメイン配列と、をさらに含む。一実施形態において、本発明の結合分子は、２つの重鎖の間に非対称界面を生成するために１つまたは複数の修飾を有する、完全なＩｇＭ重（μ）鎖定常ドメインを含む。

少なくとも１つの二重特異性結合単位を含む本発明の多重特異性結合分子において、２つの異なるμ重鎖（鎖Ａ及びＢ）を有するＩｇＭ分子を生成するためには、内部非対称界面を介して、２つの異なる結合特異性を有する２つのマッチするμ重鎖（Ａ及びＢ）を互いにカップリングさせるための解決策が見出されなければならない。加えて、結合領域を形成するのに軽鎖が必要となる場合には、所望の結合特異性を提供するために、各重鎖をそのマッチする軽鎖とカップリングさせるための解決策が見出されなければならない。

加えて、異なる結合ターゲットに結合する隣接する単一特異性結合単位の重鎖定常領域間に外部非対称界面を生成するための解決策が見出されなければならない。

内部及び外部非対称界面を生成するための技術としては、特定の残基間での塩架橋ペア電荷切替え（電荷スワップまたは電荷反転とも称される）及び２つの鎖の間のノブ−ホール相互作用の生成が挙げられるが、これらに限定されない。重鎖は、ＣｒｏｓｓＭａｂ技術を利用することにより、マッチする軽鎖と対合することもできる。最適な結果を実現するために、異なるアプローチを組み合わせることもできる。

１．ノブ・イントゥー・ホール技術
本発明の五量体または六量体二重特異性または多重特異性結合分子の収率を改善するために、ＩｇＭ重鎖定常領域、例えばＣＭ４、ＣＭ２及び／またはＣＭ３ドメインを、「ノブ・イントゥー・ホール」技術により改変することができ、その技術は、例えばＷＯ９６／０２７０１１、Ｒｉｄｇｗａｙ， Ｊ．， Ｂ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ ９ （１９９６） ６１７−６２１；及びＭｅｒｃｈａｎｔ， Ａ． Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １６ （１９９８） ６７７−６８１における複数の実施例によって詳細に記載されている。この方法において、２つのＩｇＭ重鎖定常ドメインの相互作用表面を、異なる結合特異性を有する２つの重鎖のヘテロ二量体化、及び／または重鎖とそのマッチする軽鎖の間のヘテロ二量体化を増加させるように改変する。２つの重鎖ドメインのそれぞれ、例えばＣＭ４−ＣＭ４、ＣＭ２−ＣＭ２及び／またはＣＭ２−ＣＭ３−ＣＭ４／ＣＭ２−ＣＭ３−ＣＭ４が、「ノブ」であり得、他方が「ホール」である。ジスルフィド架橋の導入により、ヘテロ二量体が安定化し(Ｍｅｒｃｈａｎｔ， Ａ． Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １６ （１９９８） ６７７−６８１； Ａｔｗｅｌｌ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２７０ （１９９７） ２６−３５）、収率が上昇する。同様にマッチする重鎖と軽鎖を、この技術により互いにカップリングさせることができる。Ｚｈｕ， Ｚ．； Ｐｒｅｓｔａ， Ｌ．Ｇ．； Ｚａｐａｔａ， Ｇ．； Ｃａｒｔｅｒ， Ｐ． Ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ ｔｏ ｅｎｈａｎｃｅ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ． Ｐｒｏｔ． Ｓｃｉ． ６：７８１−７８８ （１９９７）。

このアプローチに従って、二重特異性ＩｇＭ結合分子（例えば、抗体）内の他の重鎖の対応するドメインの本来の界面に適合する１つの重鎖のＣＨ４、ＣＨ２及び／またはＣＨ３ドメインの本来の界面内の二重特異性ＩｇＭ結合分子の場合、アミノ酸残基をより大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基と置換し、それにより突起を該界面内に生成させて、該他のＩｇＭ重鎖定常領域内の対応するドメインの界面内のキャビティーに配置可能にすることができる。同様に、第一のＩｇＭ重鎖の定常領域内の対応するドメインとの界面の中のアミノ酸残基を、より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基と置換し、それにより２つの重鎖領域間の界面の中にホール（キャビティー）を生成することにより、第二のＩｇＭ重鎖を改変することができる。

ノブ−ホール位置のヒトＩｇＭ ＣＭ４及びＣＭ２ドメイン界面残基を、表Ａ及びＤに示す。これらの表に、図４Ｄ及び４Ｂに示されたナンバリングに従って、それぞれ図４Ｄ内に示されたＣＭ４配列及び図４Ｂに示されたＣＭ２配列の示された位置のネイティブ残基と、ノブ−ホールペアを生成するために用いられ得る潜在的突然変異を識別している。したがって例えばＣＭ４ドメインにおいて、位置３５０にあるネイティブトレオニン（Ｔ）残基をチロシン（Ｙ）に突然変異させてノブを生成することができ、それをネイティブＣＭ４配列の残基３５２、３９３及び３９５に関して列挙された潜在的突然変異の任意の組み合わせで組み合わせることができる（セットＮｏ．１）。場合によりセットＮｏ．１と組み合わせ得る位置２５４及び３９７のさらなる突然変異を、セットＮｏ．２及びセットＮｏ．３に示している。同様にセットＮｏ．４に、位置３５２、３９３、３９５、及び３９７のうちの１つまたは複数にあるホール突然変異と組み合わせた、位置３５０及び３９５のノブ突然変異を例示している。セットＮｏ．４と組み合わせたさらなる突然変異を、セットＮｏ．５及びセットＮｏ．６に列挙している。表Ａの残りを、類似の方法で読み取ることができる。これらのセットの幾つかは、電荷導入、即ち非電荷残基から電荷残基への変換も含む（以下に議論される表Ｃと同様）。

セットＮｏ．１〜３０内に列挙されたノブ−ホール突然変異が、表Ａに示された様々な組み合わせで用いられ得ることを強調する。さらに、該列挙された突然変異は、表の残りに列挙された他のノブ−ホール及び／または電荷スワップ及び／または電荷導入突然変異と組み合わせることができる。したがって以下に議論される通り、表Ａに示されたノブ−ホール突然変異の１つまたは複数を、表Ｄに示されたノブ−ホール突然変異の１つまたは複数と任意の組み合わせで、そして／または表Ｂ、Ｃ、Ｅ及びＦに列挙された電荷スワップ／電荷導入突然変異の１つまたは複数と組み合わせることができる。したがって任意の順序または組み合わせで、表Ａのいずれかのセットを選択し、それを表Ｂの任意のセットと混合し、表Ｃの任意のセットと混合する、などが可能である。

２．塩架橋ペア電荷切替え（電荷スワッピング）
逆電荷は互いに誘引し、同じ電荷は互いに反発する。アミノ酸分子の電荷は、ｐＨ依存性であり、ｐＫ値により特徴づけることができ、ｐＫ値は、遊離アミノ酸のαアミノ基（Ｎ）、αカルボキシ基（Ｃ）及び側鎖に関して決定される。アミノ酸がタンパク質またはペプチドの一部である場合、局部環境が、側鎖のｐＫ_ａを変化させる可能性がある。

アミノ酸分子の電荷特性は、等電点（ｐＩ）、つまり分子の全体的電荷が中性となるｐＨにより特徴づけることもできる。アミノ酸は、その側鎖において互いに異なるため、ｐＩは、側鎖のｐＫの差を反映する。

ほとんどのアミノ酸（１５／２０）は、６付近のｐＩを有し、そのため中性の全体的電荷を有すると見なされる。Ａｓｐ及びＧｌｕは、負電荷であり、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇは、正電荷である。

マッシュルーム形ＩｇＭ複合体内の２つの結合単位の間の界面において、単量体を連結するジスルフィド架橋の上及び下に、４つの塩架橋が存在する。これらの相互作用に関与する残基（Ｌｙｓ−２３８、Ｌｙｓ−２６８、Ａｓｐ−２９３及びＡｓｐ２９４）は、２つの単量体内では同一であるが、ＩｇＭ Ｆｃ構造内のＣＭ３ドメインが非対称であるため、これらの界面での相対的配置は異なる。

電荷スワッピングまたは電荷導入突然変異のための位置及びアミノ酸残基を、表Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、及びＦに列挙する。先に議論された通り、またはこれらの突然変異のより多く、または突然変異のセットを、ノブ−ホール突然変異の１つまたは複数のセットと組み合わせて、２つの異なるＩｇＭ重鎖の間、及び／またはＩｇＭ重鎖とそのマッチする軽鎖の間に所望の非対称界面を提供することができる。

好ましくは、２つの異なるＩｇＭ重鎖定常領域間の非対称界面は、１つのＩｇＭ重鎖内に最大８、例えば１〜８、もしくは１〜７、もしくは１〜６、もしくは１〜５、もしくは１〜４、もしくは１〜３、もしくは１〜２の突然変異、または２つのＩｇＭ重鎖内に２〜１０、もしくは２〜９、もしくは２〜８、もしくは２〜７、もしくは２〜６、もしくは２〜５、もしくは２〜４、もしくは２〜３の組み合わせた突然変異が生成される。

本明細書における多重特異性結合分子の場合、外部非対称界面が、Ｃμ３ドメイン内の改変により生成される。特に外部非対称界面を生成するために、塩架橋がＣμ３ドメイン内の逆電荷アミノ酸残基間でペアごとの切替えにより形成される。様々な実施形態において、外部非対称界面を提供する塩架橋は、Ｃμ３−Ｃμ３ドメイン内の少なくとも１つのペアごとの電荷アミノ酸残基切替えにより形成され、その切替えは、例えば隣接するμ鎖内のＫ２３８⇔Ｄ２９３またはＫ２６８⇔Ｄ２９４であり得る。

３．ＣｒｏｓｓＭａｂ技術
先に議論された通り、ノブ・イントゥー・ホール技術または電荷スワッピングは、抗体重鎖のヘテロ二量体化を可能にする。軽鎖と関連の重鎖との正しい会合は、二重特異性抗体結合単位の半分の抗原結合断片（Ｆａｂ）内での重鎖ドメインと軽鎖ドメインとの交換により実現され得る。クロスオーバーは、ＩｇＭ抗体の二重特異性結合単位の半分の中の、完全なＶＨ−ＣＭドメインとＶＬ−ＣＬドメインのクロスオーバー、ＶＨドメインとＶＬドメインのみ、またはＣＭドメインとＣＬドメインのみのクロスオーバーとして起こり得る。この「クロスオーバー」は、抗原結合親和性を保持するが、２つのアームを非常に異ならせるため、軽鎖の誤対合はもはや起こり得ない。ＩｇＧ抗体の状況におけるさらなる詳細については、例えばＳｃｈａｅｆｆｅｒ ｅｔ ａｌ．， （２０１１） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０８（２７）： １１１８７−１１１９２を参照されたい。

４．二重特異性及び多重特異性ＩｇＭ結合分子の生成
所望の突然変異を有する（ノブ・イントゥー・ホール、電荷スワップ及び／またはＣｒｏｓｓＭａｂ技術に従う）二重特異性ＩｇＭ抗体結合単位の重鎖のコード配列は、適切なヌクレオチド変換を抗体ＤＮＡに導入することにより、またはヌクレオチド合成により生成され得る。抗体は、その後、組換え手段により生成され得る。

組換え生成の方法は、最先端技術で広く知られており、原核及び真核細胞内でのタンパク質発現と、それに続く抗体の単離、そして通常は医薬的に許容し得る純度までの精製を含む。宿主細胞内での抗体発現の場合、各修飾された重鎖及び場合により軽鎖をコードする核酸が、標準法により発現ベクターに挿入される。発現は、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、酵母、または大腸菌細胞のような適切な原核または真核宿主細胞において実施され、抗体が細胞（溶解後の上清または細胞）から回収される。抗体の組換え生成についての一般的方法は、例えばＭａｋｒｉｄｅｓ， Ｓ． Ｃ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ． Ｐｕｒｉｆ． １７ （１９９９） １８３−２０２； Ｇｅｉｓｓｅ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ． Ｐｕｒｉｆ． ８ （１９９６） ２７１−２８２； Ｋａｕｆｍａｎ， Ｒ． Ｊ．， Ｍｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １６ （２０００） １５１−１６１； Ｗｅｒｎｅｒ， Ｒ． Ｇ．， Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ． ４８ （１９９８） ８７０−８８０の論評文献に記載されている。

二重特異性及び多重特異性抗体は、例えばプロテインＡ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順により培地から適切に分離される。

組換えＩｇＭの大規模生成は、その複雑な構造により困難であったが、Ｃ６グリオーマ細胞、ＣＨＯ細胞、及びＨｅＬａ細胞内でのＩｇＭ重（Ｈ）鎖及び軽（Ｌ）鎖の共発現をはじめとする、非リンパ球細胞を用いたＩｇＭの複数の組換え産生系が報告された。共発現はポリマー形成の成功をもたらしたが、収率は典型的には低く（例えば、ＣＨＯ細胞内での発現に関するＷ０８９／０１９７５及びＷｏｏｄ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４５， ３０１１−３０１６ （１９９０）参照）、五量体または六量体分子の厳密なポリマー構造は、即座に決定することができなかった。アデノウイルスのＥ１Ａ及びＥ１Ｂタンパク質を発現する不死化ヒト網膜細胞株内でのＩｇＭ産生が、米国特許出願公開第２００６００６３２３４号に記載されている。本発明の二重特異性ＩｇＭ抗体生成のさらなる詳細を、以下の実施例に提供する。

本発明の方法は、主成分としての二重特異性または多重特異性ＩｇＭ抗体などの二重特異性または多重特異性ＩｇＭ結合分子を、所望の五量体または六量体構造の代わりに単一特異性抗体、抗体断片、二重特異性結合単位の単量体、二量体、三量体及び／または四量体などの製造工程の様々な副産物と共に含む組成物をもたらすであろう。生成された該組成物は、一般に、少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９５％の所望の五量体または六量体二重特異性結合分子、例えば抗体を含み、それらは当該技術分野で公知の方法によりさらに精製されて、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．５％、または少なくとも約９９．９％の純度を有する生成物を生じるであろう。

５．二重特異性及び多重特異性ＩｇＭ結合分子の適用
本発明の二重特異性及び多重特異性ＩｇＭ結合分子、例えば抗体は、広範囲の治療及び診断適用を有する。

一実施形態において、本明細書における二重特異性結合分子は、同じ可溶性ターゲット、例えばＶＥＧＦ、ＴＮＦα、またはＩＬ６の２つの部位に結合する。その目的は、例えば該タンパク質上の複数の部位をアンタゴナイズすること、及び／または所与のターゲットへのアビディティを増大させることであり得る。

別の実施形態において、本明細書における二重特異性または多重特異性結合分子は、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）などの同じ細胞表面（受容体）ターゲット上の２つ以上の部位に結合する。したがって例えば二重特異性または多重特異性結合分子は、ＨＥＲ２分子上の４Ｄ５エピトープ及び２Ｃ４エピトープの両方を標的化し得る。このアプローチは、所与のターゲットへのバイオポテンシー（ｂｉｏ−ｐｏｔｅｎｃｙ）及び／またはアビディティを増大させ得る。

さらに別の実施形態において、本発明の二重特異性または多重特異性結合分子は、２つ以上の異なる可溶性ターゲット（球状タンパク質またはペプチド）、例えばＴＮＦαとＩＬ６、ＶＥＧＦαとＡｎｇ２、または２つのサイトカインに結合する。このアプローチは、特異的経路のより完全なブロッキング；いわゆる「サイトカインストーム」のブロッキングをもたらすか、または酵素及びその基質、例えば第ＩＸａ因子及び第Ｘ因子を調整し得る。

さらなる実施形態において、本明細書における二重特異性または多重特異性結合分子は、可溶性ターゲット及び細胞表面受容体ターゲット、例えば血管新生因子及び新生血管特異性受容体に結合し得る。このアプローチの目的は、特異的部位または組織での送達及び遮断を増加させることでもあり得る。

さらなる実施形態において、本明細書における二重特異性結合分子は、例えばＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）及びＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）など、２つの異なる細胞表面受容体ターゲットに結合するように設計される。同様に本明細書における多重特異性結合分子は、例えばＨＥＲ１、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）及びＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）など、２つ以上の異なる細胞表面受容体ターゲットに結合するように設計され得る。これは、特異性及び選択性の増大、ならびに／または所与の経路のより完全な遮断をもたらし得る。

本発明の二重特異性及び多重特異性結合分子、例えば抗体は、１つの可溶性ターゲットまたは細胞表面受容体ターゲット、及び長期滞留時間ターゲット、例えばＴＮＦαと血清アルブミン、またはＶＥＧＦと血清アルブミンに結合するように設計させることもできる。これらの分子は、アルブミン特異性を有さない結合分子よりも長い循環半減期を有すると予測される。

さらなる実施形態において、本明細書における二重特異性結合分子は、１つの可溶性ターゲット及びマトリックスタンパク質または基質、例えばＶＥＧＦα及びヒアルロン酸に結合し得る。同様に本明細書の多重特異性結合分子は、１つまたは複数の可溶性ターゲット、ならびに１つまたは複数のマトリックスタンパク質及び／または基質、例えばＶＥＧＦα及びヒアルロン酸に結合し得る。得られた二重特異性または多重特異性結合分子は、例えば眼内空間への滞留時間増加により、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）などの眼科疾病の抗血管新生治療において用途を見出し得る。

１つの可溶性または受容体ターゲット＋トランスポータ受容体（即ち、トランスフェリン受容体）に結合する二重特異性分子、例えば抗体、例えば抗トランスフェリン特異性と併せた、グリオブラストーマに見出される抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ（エクソンＩＩＩが欠失した突然変異形態）は、血液脳関門を通過する抗体送達において用途を見出し得る。

同様に、１つまたは複数の可溶性または受容体ターゲット＋１つまたは複数のトランスポータ受容体（即ち、トランスフェリン受容体）に結合する多重特異性分子、例えば抗体、例えば抗トランスフェリン特異性と併せた、グリオブラストーマに見出される抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ（エクソンＩＩＩが欠失した突然変異形態）は、血液脳関門を通過する抗体送達において用途を見出し得る。

６．組成物、医薬組成物、及び処置方法
一態様において、本発明は、本明細書における二重特異性または多重特異性ＩｇＭ抗体などの精製された二重特異性または多重特異性ＩｇＭ結合分子を含む組成物に関係する。該組成物は、一般に、少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の所望の二重特異性または多重特異性ＩｇＭ結合分子、例えば抗体を含有するであろう。該組成物は、二重特異性または多重特異性結合分子、例えば抗体が、少なくとも１種の医薬的に許容し得る担体と混和されている、医薬組成物であり得る。

本発明の医薬組成物は、当該技術分野で公知の様々な方法により投与され得る。当業者に認識される通り、投与経路及び／または方式は、標的疾患または疾病、及び所望の結果に応じて変動するであろう。特定の投与経路により本発明の化合物を投与するためには、不活性化を予防する材料で該化合物をコーティングすること、または該材料と該化合物を共投与することが必要となり得る。例えば該化合物は、適切な担体、例えばリポソーム、または希釈剤中で対象に投与され得る。医薬的に許容し得る希釈剤としては、生理食塩水及び水性緩衝溶液が挙げられる。医薬的担体としては、滅菌水性溶液または分散液、及び滅菌注射溶液または分散液の即時調製用の滅菌粉末が挙げられる。医薬的活性物質のためのそのような媒体及び薬剤の使用は、当該技術分野で公知である。

該組成物は、防腐剤、湿潤剤、乳化剤及び／または分散剤などのアジュバントも含有し得る。微生物の存在の予防は、滅菌手順、ならびに様々な抗菌及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などの含有の両方により確実になり得る。糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を該組成物に含めることが望ましい場合もある。加えて、注射用医薬形態の長期吸収が、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなど、吸収を遅延する薬剤の含有によりもたらされ得る。

本発明の医薬組成物中の有効成分の実際の投与レベルは、特定の患者、組成及び投与方式にとって望ましい治療応答を実現するのに効果的となる有効成分量を、患者にとって有毒にならずに得るように変動され得る。選択された投与レベルは、用いられる本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与時間、用いられる特定の化合物の排出速度、処置期間、用いられる特定の組成物と併用で用いられる他の薬物、化合物及び／または材料、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、一般的健康状態及び過去の医療歴、ならびに医療業界で周知の類似因子をはじめとし、様々な薬物動態因子に依存するであろう。

該組成物は、滅菌されていなければならず、シリンジにより送達可能な程度に流動しなければならない。担体は、水に加え、好ましくは等張の緩衝生理食塩液である。

以下の実施例、配列の列挙及び図は、本発明の理解を促すために提供されており、本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に示されている。本発明の主旨を逸脱することなく示された手順の中で修正を施し得ることを理解する。

本開示全体で引用された全ての特許及び科学的参考資料は、参照により本明細書に明白に組み入れられる。

実施例１
１．設計された突然変異を有するＤＮＡ構築物の作製
材料及び方法
ａ．ＤＮＡ構築物の合成
当該技術分野で公知の方法を利用して、各発現ベクターにサブクローニングするために両端に適合性のある制限部位を有する、設計された突然変異を有するＤＮＡ構築物の全てが、商業的供給業者（ジーンウィズ社）により合成された。

ｂ．発現ベクターの構築
合成されたＤＮＡ構築物を、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液で１μｇ／ｍｌに再懸濁させた。ＤＮＡ（１μｇ）を酵素消化に供して、合成された遺伝子を電気泳動により担体プラスミドＤＮＡから分離した。消化されたＤＮＡを、標準の分子生物学的技術により、予め消化されたプラスミドＤＮＡ（μ鎖ではｐＦＵＳＥｓｓ−ＣＨＩｇ−ｈＭ^＊０３；カッパ鎖ではｐＦＵＳＥ２ｓｓ−ＣＬＩｇ−ｈｋ、インビボゲン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ））にライゲートした。ライゲートされたＤＮＡを能力のある細菌に形質転換して、多重選択性の（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ）抗生物質と共にＬＢプレートに播種した。複数の細菌コロニーを選び出して、標準の分子生物学的技術によりＤＮＡ調製物を作製した。調製されたＤＮＡを配列決定により検証した。ＤＮＡ配列が設計されたＤＮＡ配列と１００％マッチする細菌クローンのみを、プラスミドＤＮＡ調製と、次の細胞トランスフェクションに用いた。

ｃ．異なるサイズのμ鎖
ＣＭ４相互作用界面突然変異を有する、または有さない２つの異なるμ鎖（Ａ及びＢ）を互いにカップリングし得ることを実証するために、異なる分子量及びリガンド特異性を有する異なるサイズのμ鎖の２組を構築した。

ｉ．Ｒｔｘ鎖は、Ｃ２９１Ｓ突然変異及びテールピース欠失を有するヒトＩｇＭ抗体μ鎖のＣＭ１領域が融合されたキメラ抗ＣＤ２０抗体リツキサン（リツキシマブ）Ｖｈ領域のμ鎖で構成される。

Ｒｔｘ鎖は、約６０ｋＤ（グリコシル化なし）及び６６ｋＤ（４Ｎ−グリコシル化部位あり）の計算された分子量を有し、ＣＤ２０陽性Ｂ細胞、例えばＲａｊｉ細胞に結合することができる。

ｉｉ．Ｆｃ鎖は、ｃＭｙｃタグを含み、６Ｈｉｓタグにより置換されたテールピースを有し、Ｃ２９１Ｓ突然変異を有する、ヒトＩｇＭμ鎖ＣＭ２〜ＣＭ４領域を含む：

Ｆｃ鎖は、約３９ｋＤ（グリコシル化なし）及び４３ｋＤ（３Ｎ−グリコシル化部位あり）の分子量を有し、抗ｍｙｃモノクローナル抗体９Ｅ４または他の抗ｍｙｃ抗体に結合することができる。

ｉｉｉ．Ｏｋｔ鎖は、Ｃ２９１Ｓ及びテールピース欠失を有するヒトミュー鎖のＣＭ２が融合されたＯＫＴ３（抗ＣＤ３）の一本鎖Ｆｖバージョンで構成される：

Ｏｋｔ鎖は、グリコシル化部位を有さない約６１ｋＤ及び４Ｎ−グリコシル化部位を含む６７ｋＤの計算された分子量を有し、ＣＤ３陽性Ｔ細胞に結合することができる。

ｄ．軽鎖カップリング：
ｉ．ネイティブキメラリツキサンカッパ（κ）鎖
ＱＩＶＬＳＱＳＰＡＩＬＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＲＡＳＳＳＶＳＹＩＨＷＦＱＱＫＰＧＳＳＰＫＰＷＩＹＡＴＳＮＬＡＳＧＶＰＶＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＲＶＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＴＳＮＰＰＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）

該カッパ鎖は、約２３ｋＤの計算された分子量を有し、リツキサンＩｇＭ重鎖に連結することができる。

ｅ．界面突然変異
ノブ及びホール、静電荷カップリングをＣＭ３相互作用界面に非対称に導入して、２つのμ鎖のヘテロ二量体化を最大にした。２対のＣＭ３相互作用界面突然変異体を作製した。

ｉ．Ｆｃ１ａは、Ｃ２９１Ｓ及びＴ３５０Ｙ突然変異及びテールピース欠失を有するヒトμ鎖ＣＨ２〜ＣＨ４領域である：

Ｆｃ１ａ鎖は、グリコシル化部位を有さない約３６ｋＤ及び３Ｎ−グリコシル化部位を含む場合には４１ｋＤの計算された分子量を有する。

ｉｉ．Ｆｃ１ｂは、Ｃ２９１Ｓ、Ｌ３５２Ｓ及びＨ３９５Ｖ突然変異及びテールピース欠失を有するヒトμ鎖ＣＨ２〜ＣＨ４である。

Ｆｃ１ｂ鎖は、グリコシル化部位を有さない約３６ｋＤ及び３Ｎ−グリコシル化部位を含む４１ｋＤの計算された分子量を有する。

ｉｉｉ．Ｆｃ２ａは、Ｃ２９１Ｓ、Ｔ３５０Ｙ、Ｔ３５４Ｅ、及びＩ３９７Ｅ突然変異及びテールピース欠失を有するヒトμ鎖ＣＨ２〜ＣＨ４からなる。

Ｆｃ２ａ鎖は、グリコシル化部位を有さない約３６ｋＤ及び３Ｎ−グリコシル化部位を含む４１ｋＤの計算された分子量を有する。

ｉｖ．Ｆｃ２ｂは、Ｃ２９１Ｓ、Ｌ３５２Ｓ、Ｔ３５４Ｋ、Ｈ３９５Ｖ、及びＩ３９７Ｋ突然変異及びテールピース欠失を有するヒトμ鎖ＣＨ２〜ＣＨ４である。

Ｆｃ２ｂ鎖は、グリコシル化部位を有さない約３６ｋＤ及び３Ｎ−グリコシル化部位を含む４１ｋＤの計算された分子量を有する。

ｆ．界面突然変異
ノブ、ホール、及び静電荷カップリングを有するＦｃ２ａ鎖及びＦｃ２ｂ鎖を、２つのμ鎖の非対称ヘテロ二量体化のための分子クローニングによりリツキサン及びＯＫＴ３（抗ＣＤ３抗体）ｓｃＦｖの両方にさらに連結させた。

ｉ．Ｒｔｘ２ａは、Ｃ２９１Ｓ、Ｔ３５０Ｙ、Ｔ３５４Ｅ、及びＩ３９７Ｅ突然変異及びテールピース欠失を有するヒトμ鎖のＣＭ１〜ＣＭ４が融合されたキメラリツキサン（抗ＣＤ２０）Ｖｈ領域のμ鎖で構成される。

Ｒｔｘ２ａ鎖は、グリコシル化部位を有さない約６１ｋＤ及び４Ｎ−グリコシル化部位を有する６７ｋＤの計算された分子量を有する。

ｉｉ．Ｒｔｘ２ｂは、Ｃ２９１Ｓ、Ｌ３５２Ｓ、Ｔ３５４Ｋ、Ｈ３９５Ｖ、及びＩ３９７Ｋ突然変異及びテールピース欠失を有するヒトμ鎖のＣＭ１〜ＣＭ４が融合されたキメラリツキサン（抗ＣＤ２０）Ｖｈ領域のμ鎖で構成される。

Ｒｔｘ２ｂ鎖は、グリコシル化部位を有さない約６１ｋＤ及び４Ｎ−グリコシル化部位を含む６７ｋＤの計算された分子量を有する。

ｉｉｉ．Ｏｋｔ２ａは、Ｃ２９１Ｓ、Ｔ３５０Ｙ、Ｔ３５４Ｅ、及びＩ３９７Ｅ突然変異及びテールピース欠失を有するヒトμ鎖のＣＭ２〜ＣＭ４が融合されたＯＫＴ３（抗ＣＤ３抗体）ｓｃＦｖで構成される。

Ｏｋｔ２ａ鎖は、グリコシル化部位を有さない約６２ｋＤ及び４Ｎ−グリコシル化部位を含む６８ｋＤの計算された分子量を有する。

ｉｖ．Ｏｋｔ２ｂは、Ｃ２９１Ｓ、Ｌ３５２Ｓ、Ｔ３５４Ｋ、Ｈ３９５Ｖ、及びＩ３９７Ｋ突然変異及びテールピース欠失を有するヒトμ鎖のＣＭ２〜ＣＭ４が融合されたＯＫＴ３（抗ＣＤ３抗体）ｓｃＦｖで構成される。

Ｏｋｔ２ｂ鎖は、グリコシル化部位を有さない約６２ｋＤ及び４Ｎ−グリコシル化部位を含む６８ｋＤの計算された分子量を有する。

２．タンパク質の発現、精製及び特徴づけ
ａ．トランスフェクション
複数の異なる発現ベクターを等モル比で哺乳動物細胞、例えば２９３Ｆ細胞（インビトロジェン）にコトランスフェクトすることにより、ＩｇＭを作製した。発現ベクターのための混合ＤＮＡ１０μｇを、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（インビトロジェン）２ｍｌ中で２９３フェクチン（インビトロジェン）２０μｌと室温で３０分間混合し、その後、２９３Ｆ細胞１０^７個に添加した。２９３Ｆ細胞のトランスフェクション物を、トランスフェクション後７２時間インキュベートした後、上清を回収した。

ｂ．免疫沈降によるタンパク質の精製
ｉ．キャプチャー・セレクトＩｇＭ（カタログＮｏ．２８９０．０５、ＢＡＣ、サーモフィッシャー）
トランスフェクトされた上清を２，０００Ｇでの１０分間の遠心分離により回収した。ＩｇＭタンパク質を、アフィニティー・キャプチャー・セレクトＩｇＭ・アフィニティーマトリックスでの免疫沈降により精製した。キャプチャー・セレクトＩｇＭスラリー１００μｌを、回収された上清１５ｍｌに添加した。上清及びアフィニティーマトリックスの混合物を、ロッカー上、室温で２時間インキュベートした。アフィニティーマトリックスを、その後、３００ｇで２分間遠心分離し、溶液をデカンテーションした。アフィニティーマトリックスを、ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎでさらに３回洗浄した。最後に、精製されたＩｇＭタンパク質を、４×ＬＳＤ試料ローディングバッファー（インビトロジェン）２０μｌと共に室温で５分間インキュベートし、続いて１０，０００ｇで遠心分離することにより、アフィニティーマトリックスから洗い流した。アフィニティーマトリックスをＰＢＳ ６０μｌでさらに洗浄して、ゲル電気泳動での分析用に上清をプールした。

ｃ．ゲル電気泳動
ｉ．非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを利用して、異なる分子量の様々な突然変異体ＩｇＭタンパク質を分離した。ノベックス４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（ライフ・テクノロジーズ）を、ノベックスＭＥＳ ＳＤＳランニングバッファー（ライフ・テクノロジーズ）と共に用いた。

ｉｉ．還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ＮｕＰａｇｅ ＬＤＳサンプルバッファー（ライフ・テクノロジーズ）及びＮｕＰａｇｅ還元剤ジチオトレイトール（ライフ・テクノロジーズ）をＩｇＭタンパク質試料に添加して、８０℃まで１０分間加熱した後、ＮｕＰａｇｅノベックス４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（ライフ・テクノロジーズ、カタログＮｏ．ＮＰＯ３２２）上にロードした。ＮｕＰａｇｅ ＭＥＳ ＳＤＳランニングバッファー（ライフ・テクノロジーズ、カタログＮｏ．ＮＰ０００２）をゲル電気泳動に用いた。電気泳動が完了した後、ゲルを装置から取り出して、コロイダルブルー染色（ライフ・テクノロジーズ、マニュアルＮｏ．ＬＣ６０２５）を用いて染色した。

ｉｉｉ．ゲルバンド定量
タンパク質ゲルを乾燥させ、その後、画像スキャナーでデジタル化する。ゲル画像をＩｍａｇｅ Ｊプログラムで処理して、ゲル定量機能を利用して特定バンドのタンパク質量を計測する。

ｉｖ．ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの分析
野生型及び設計されたＩｇＭ Ｆｃペア２ａ及び２ｂ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを含むＲｔｘ：Ｆｃ。非還元ＳＤＳ−ＰＧＥゲル上のレーン１、２、及び３（図６）は、モノ二量体Ｒｔｘ（Ｈ２Ｌ２、予測されるＭＷ１６８〜１８０ｋＤａ）に相当する上のバンド、ならびにＲｔｘ２ａ単独、Ｒｔｘ２ｂ単独及び野生型Ｒｔｘの半抗体（ＨＬ、予測されるＭＷ８４〜９０ｋＤａ）に相当する下のバンドを示す。非会合Ｆｃ（予測されるＭＷ３６〜４１ｋＤａ）のバンドが、３つのレーン全てに存在し；会合したＦｃ（予測されるＭＷ７２〜８２ｋＤａ）は、８０〜９０ｋＤａバンドの成分でもあり得る。レーン２は、Ｒｔｘ２ａ：Ｆｃ２ｂの混合物を示し、レーン３は、Ｒｔｘ２ｂ：Ｆｃ２ａの混合物を示す。両方のレーンにおいて、ヘテロ二量体（予測されるＭＷ１２０〜１３１ｋＤａ）を矢印で示している。設計されたＲｔｘ２ａ：Ｆｃ２ｂ及びＲｔｘ２ｂ：Ｆｃ２ａの組み合わせは両者とも、著しいヘテロ二量体の存在を示しているが、野生型Ｒｔｘ：Ｆｃの組み合わせは、少量だけのヘテロ二量体を示している。

Ｆｃは、実際に、図７に示された還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥのレーン１〜３に認められる通り存在し、上のバンドはＲｔｘ重鎖（予測されるＭＷ６１〜６７ｋＤａ）であり、中央のバンドはＦｃであり（予測されるＭＷ３６〜４１ｋＤａ）、下のバンドはＲｔｘ軽鎖（予測されるＭＷ２３ｋＤａ）である。

野生型及び設計されたＩｇＭ Ｆｃペア２ａ及び２ｂを含むＯｋｔ：Ｆｃ。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、図８のレーンの１〜３
野生型Ｏｋｔ：Ｆｃ組み合わせ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、図８のレーン１）は、Ｏｋｔ：Ｆｃヘテロ二量体（予測されるＭＷ９８〜１０７ｋＤａ）の上のバンド、非会合Ｆｃ（予測されるＭＷ３６〜４１）に相当する下のバンド、及び会合Ｆｃ（予測されるＭＷ７２〜８２）を表す大きな中央のバンドを示す。これに対して、Ｏｋｔ２ａ：Ｆｃ２ｂ及びＯｋｔ２ｂ：Ｆｃ２ａ組み合わせについては、図８のレーン２に示されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、ヘテロ二量体の目立つバンドと、会合したＦｃ２ｂ、及び上のＯｋｔ２ａモノ二量体及びＯｋｔ２ａ：Ｆｃ２ｂヘテロ二量体と一致する非常に薄いバンドを示している。矢印は、ヘテロ二量体を示す。

Ｏｋｔ２ａ及びＦｃ２ｂは両者とも、還元ゲル（図９のレーン２に示されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル）に存在する。類似の結果が、図８及び９に示されたゲルのＯｋｔ２ｂ：Ｆｃ２ａペアに関して認められる。

図８及び９のレーン４〜６に示された野生型及び設計されたＩｇＭ Ｆｃペア２ａ及び２ｂ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを含むＯｋｔ：Ｒｔｘ
野生型Ｏｋｔ：Ｒｔｘ組み合わせ（図８のレーン４に示されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル）は、野生型Ｒｔｘモノ二量体（Ｈ２Ｌ２、予測されるＭＷ１６８〜１８０ｋＤａ）のバンド、野生型Ｒｔｘ半抗体（ＨＬ、予測されるＭＷ８４〜９０ｋＤａ）のバンド、及びＯｋｔモノ二量体（予測されるＭＷ１２４〜１３３ｋＤａ）の可能性がある薄いバンドを示す。これに対して、設計されたＯｋｔ２ａ：Ｒｔｘ２ｂ組み合わせ（図８のレーン５に示されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル）は、著しいヘテロ二量体（予測されるＭＷ１４６〜１５７）に加え、Ｒｔｘ２ｂモノ二量体（予測されるＭＷ１６８〜１８０ｋＤａ）及び半抗体（予測されるＭＷ８４〜９０ｋＤａ）の存在を示している。還元された場合（図９のレーン５に示されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル）、Ｒｔｘ２ｂ軽鎖は、ＭＷ２３ｋＤａのバンドを示し；６０〜８０ｋＤａの重鎖は、Ｒｔｘ２ｂ重鎖（予測されるＭＷ６１〜６７ｋＤａ）及びＯｋｔ２ａ重鎖（予測されるＭＷ６２〜６７ｋＤａ）で構成される可能性がある。同様の結果が、Ｏｋｔ２ｂ：Ｒｔｘ２ａペアで認められる。

結論
テストされた３つの系：Ｏｋｔ：Ｒｔｘ、Ｏｋｔ：Ｆｃ、Ｒｔｘ：Ｆｃの全てについて、設計されたＩｇＭ Ｆｃ変異体が、ネイティブ（非設計）ＩｇＭ Ｆｃに比較して実質的に増加されたヘテロ二量体形成を示した。一対の配列（即ち、Ｆｃ ２ａ及び２ｂ）をテストし、ホモ二量体形成をさらに減少させてヘテロ二量体形成を最適化させる、設計されたＦｃ界面の更なる変異体を評価することができる。

３．二重特異性機能分析
ａ．２つのリガンドについてのＥＬＩＳＡ分析
ＯＫＴ３（鎖Ａ）及びｃＭｙｃペプチド（鎖Ｂ）を有するＩｇＭを、可溶性ＣＤ３イプシロンタンパク質捕捉及び抗ｃＭｙｃ（９Ｅ１０）検出を伴うＥＬＩＳＡ分析によりアッセイする。可溶性ＣＤ３ｅタンパク質を、１５０ｍＭ ＮａＨＣＯ_３中の２ｍｇ／ｍｌでＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、その後ＰＢＳ中の３％ＢＳＡでブロッキングする。トランスフェクトされたＩｇＭ−ＯＫＴ３−ｃＭｙｃを含む上清（１００μｌ）を、ブロッキングされたＥＬＩＳＡプレートに２５℃で４時間添加する。ＰＢＳで洗浄した後、９Ｅ１０抗体をＥＬＩＳＡプレートに室温で２時間添加する。ＰＢＳで洗浄した後、抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰを添加する。ＨＲＰ基質を添加した後にＯＤ４５０で読み取ることにより、二重特異性ＩｇＭの存在を検出する。

Ｏｋｔ３（鎖Ａ）及びリツキサン（鎖Ｂ）を有するＩｇＭを、可溶性ＣＤ３イプシロンタンパク質捕捉及びプロテイン−Ｌ−ＨＲＰ検出を伴うＥＬＩＳＡ分析によりアッセイする。可溶性ＣＤ３ｅタンパク質を、１５０ｍＭ ＮａＨＣＯ_３中の２ｍｇ／ｍｌでＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、その後ＰＢＳ中の３％ＢＳＡでブロッキングする。トランスフェクトされたＩｇＭ−Ｏｋｔａ：ＲｔｘｂまたはＯｋｔｂ：Ｒｔｘａを含む上清（１００μｌ）を、ブロッキングされたＥＬＩＳＡプレートに２５℃で４時間添加する。ＰＢＳで洗浄した後、プロテイン−Ｌ−ＨＲＰをＥＬＩＳＡプレートに室温で２時間添加する。ＨＲＰ基質を添加した後にＯＤ４５０で読み取ることにより、二重特異性ＩｇＭの存在を検出する。

ｂ．標的結合のＦＡＣＳ分析
Ｔ細胞株（ピア（ｐｅｅｒ）、陽性細胞株）及びＢ細胞株（ダウジ、陰性対照細胞株）への抗体の結合により、Ｔ細胞へのＩｇＭ−ＯＫＴ３−ｃＭｙｃ結合を確認する。洗浄後、ローダミン標識された９Ｅ１０を細胞懸濁液に添加する。細胞標的結合を、ＣＤ２０抗原を含む、または含まない陽性及び陰性対照細胞の両方のＭＦＩにより検出する。

ｃ．二重特異性結合についての蛍光顕微鏡アッセイ
各細胞型が２種の異なる生体染色色素で予め標識されたＣＤ３陽性細胞及びＣＤ２０陽性細胞の２集団を集合させる能力により、設計されたＩｇＭの二重特異性結合を検証する。例えば
ｉ．ＣＤ３陽性細胞株（ピア）を標識する緑色蛍光細胞基質生体染色色素（セルトレース（商標）カルセイン・グリーンＡＭ）
ｉｉ．赤色蛍光細胞基質生体染色色素（セルトレース（商標）カルセイン・レッド−オレンジＡＭ）が標識されたＣＤ２０陽性Ｂ細胞株（ダウジ）

実施例２
１．設計された突然変異を有するＤＮＡ構築物の作製
ＤＮＡ構築物の合成及び発現ベクターの構築を、実施例１と同様に実施する。

ａ．異なるサイズのμ鎖
Ａ鎖は、ヒトミュー鎖のＣＭ１が融合されたキメラＯＫＴ３（抗ＣＤ３）Ｖｈ領域の全長μ鎖で構成される：
ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＴＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＧＳＡＳＡＰＴＬＦＰＬＶＳＣＥＮＳＰＳＤＴＳＳＶＡＶＧＣＬＡＱＤＦＬＰＤＳＩＴＦＳＷＫＹＫＮＮＳＤＩＳＳＴＲＧＦＰＳＶＬＲＧＧＫＹＡＡＴＳＱＶＬＬＰＳＫＤＶＭＱＧＴＤＥＨＶＶＣＫＶＱＨＰＮＧＮＫＥＫＮＶＰＬＰＶＩＡＥＬＰＰＫＶＳＶＦＶＰＰＲＤＧＦＦＧＮＰＲＫＳＫＬＩＣＱＡＴＧＦＳＰＲＱＩＱＶＳＷＬＲＥＧＫＱＶＧＳＧＶＴＴＤＱＶＱＡＥＡＫＥＳＧＰＴＴＹＫＶＴＳＴＬＴＩＫＥＳＤＷＬＳＱＳＭＦＴＣＲＶＤＨＲＧＬＴＦＱＱＮＡＳＳＭＣＶＰＤＱＤＴＡＩＲＶＦＡＩＰＰＳＦＡＳＩＦＬＴＫＳＴＫＬＴＣＬＶＴＤＬＴＴＹＤＳＶＴＩＳＷＴＲＱＮＧＥＡＶＫＴＨＴＮＩＳＥＳＨＰＮＡＴＦＳＡＶＧＥＡＳＩＣＥＤＤＷＮＳＧＥＲＦＴＣＴＶＴＨＴＤＬＰＳＰＬＫＱＴＩＳＲＰＫＧＶＡＬＨＲＰＤＶＹＬＬＰＰＡＲＥＱＬＮＬＲＥＳＡＴＩＴＣＬＶＴＧＦＳＰＡＤＶＦＶＱＷＭＱＲＧＱＰＬＳＰＥＫＹＶＴＳＡＰＭＰＥＰＱＡＰＧＲＹＦＡＨＳＩＬＴＶＳＥＥＥＷＮＴＧＥＴＹＴＣＶＶＡＨＥＡＬＰＮＲＶＴＥＲＴＶＤＫＳＴＧＫＰＴＬＹＮＶＳＬＶＭＳＤＴＡＧＴＣＹ
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）

Ａ鎖は、約６３ｋＤの分子量を有し、ＣＤ３（１０９７７−Ｈ０８Ｈ、シノバイオロジカル）またはＴ細胞の可溶性イプシロン鎖に結合することができる。

Ｂ鎖は、ヒトμ鎖のＣＨ２が融合されたｃＭｙｃタグを有する：
ＱＶＱＬＧＧＰＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮＳＡＶＬＰＶＩＡＥＬＰＰＫＶＳＶＦＶＰＰＲＤＧＦＦＧＮＰＲＫＳＫＬＩＣＱＡＴＧＦＳＰＲＱＩＱＶＳＷＬＲＥＧＫＱＶＧＳＧＶＴＴＤＱＶＱＡＥＡＫＥＳＧＰＴＴＹＫＶＴＳＴＬＴＩＫＥＳＤＷＬＳＱＳＭＦＴＣＲＶＤＨＲＧＬＴＦＱＱＮＡＳＳＭＣＶＰＤＱＤＴＡＩＲＶＦＡＩＰＰＳＦＡＳＩＦＬＴＫＳＴＫＬＴＣＬＶＴＤＬＴＴＹＤＳＶＴＩＳＷＴＲＱＮＧＥＡＶＫＴＨＴＮＩＳＥＳＨＰＮＡＴＦＳＡＶＧＥＡＳＩＣＥＤＤＷＮＳＧＥＲＦＴＣＴＶＴＨＴＤＬＰＳＰＬＫＱＴＩＳＲＰＫＧＶＡＬＨＲＰＤＶＹＬＬＰＰＡＲＥＱＬＮＬＲＥＳＡＴＩＴＣＬＶＴＧＦＳＰＡＤＶＦＶＱＷＭＱＲＧＱＰＬＳＰＥＫＹＶＴＳＡＰＭＰＥＰＱＡＰＧＲＹＦＡＨＳＩＬＴＶＳＥＥＥＷＮＴＧＥＴＹＴＣＶＶＡＨＥＡＬＰＮＲＶＴＥＲＴＶＤＫＳＴＧＫＰＴＬＹＮＶＳＬＶＭＳＤＴＡＧＴＣＹ
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）

Ｂ鎖は、約４１ｋＤの分子量を有し、抗ｍｙｃモノクローナル抗体９Ｅ４または他の抗ｍｙｃ抗体に結合することができる。

別のＢ鎖は、ヒトミュー鎖のＣＨ２が融合されたＣｒｏｓｓＭａｂ^Ｍ−ＣＬ（Ｖ_Ｈ＋Ｃ_Ｌ）リツキシマブ（抗ＣＤ２０）のための全長μ鎖を有する：
ＱＶＱＬＱＱＰＧＡＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＮＭＨＷＶＫＱＴＰＧＲＧＬＥＷＩＧＡＩＹＰＧＮＧＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＳＴＹＹＧＧＤＷＹＦＮＶＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＡＳＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣＤＫＴＨＬＰＶＩＡＥＬＰＰＫＶＳＶＦＶＰＰＲＤＧＦＦＧＮＰＲＫＳＫＬＩＣＱＡＴＧＦＳＰＲＱＩＱＶＳＷＬＲＥＧＫＱＶＧＳＧＶＴＴＤＱＶＱＡＥＡＫＥＳＧＰＴＴＹＫＶＴＳＴＬＴＩＫＥＳＤＷＬＳＱＳＭＦＴＣＲＶＤＨＲＧＬＴＦＱＱＮＡＳＳＭＣＶＰＤＱＤＴＡＩＲＶＦＡＩＰＰＳＦＡＳＩＦＬＴＫＳＴＫＬＴＣＬＶＴＤＬＴＴＹＤＳＶＴＩＳＷＴＲＱＮＧＥＡＶＫＴＨＴＮＩＳＥＳＨＰＮＡＴＦＳＡＶＧＥＡＳＩＣＥＤＤＷＮＳＧＥＲＦＴＣＴＶＴＨＴＤＬＰＳＰＬＫＱＴＩＳＲＰＫＧＶＡＬＨＲＰＤＶＹＬＬＰＰＡＲＥＱＬＮＬＲＥＳＡＴＩＴＣＬＶＴＧＦＳＰＡＤＶＦＶＱＷＭＱＲＧＱＰＬＳＰＥＫＹＶＴＳＡＰＭＰＥＰＱＡＰＧＲＹＦＡＨＳＩＬＴＶＳＥＥＥＷＮＴＧＥＴＹＴＣＶＶＡＨＥＡＬＰＮＲＶＴＥＲＴＶＤＫＳＴＧＫＰＴＬＹＮＶＳＬＶＭＳＤＴＡＧＴＣＹ
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）

Ｂ鎖は、約６４ｋＤの分子量を有し、ＣＤ２０陽性Ｂ細胞に結合することができる。

ｂ．異なる軽鎖カップリング
ネイティブキメラＯＫＴ３カッパ鎖
ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＡＨＦＲＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＧＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＮＲＡＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）

リツキシマブのためのＣｒｏｓｓＭａｂ^{ＣＭ１−ＣＬ}
ＱＩＶＬＳＱＳＰＡＩＬＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＲＡＳＳＳＶＳＹＩＨＷＦＱＱＫＰＧＳＳＰＫＰＷＩＹＡＴＳＮＬＡＳＧＶＰＶＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＲＶＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＴＳＮＰＰＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣ
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）

ｃ．異なる発現ベクターのための異なる選択マーカ
コトランスフェクションに用いられる異なる発現ベクターにおいて、異なる選択マーカが用いられる。ＩｇＭ生成に関連して必要な発現ベクターの全てを収容するために、複数の薬物が細胞の選択のために用いられる。これらのベクターに特異的ＤＮＡをクローニングするために、標準の分子生物学的技術が利用される。
ｉ．ミュー鎖は、ゼオシン選択（ａｎｔ−ｚｎ−１、インビトロジェン）を利用する。ゼオシンは、１００μｇ／ｍｌの濃度で用いられる。Ｓｈ ｂｌｅ遺伝子を含むプラスミドでトランスフェクトした後、細胞を、ゼオシンを含むＯｐｔｉ−ＣＨＯ培地で１００μｇ／ｍｌでインキュベートして、安定したトランスフェクタントを選択する。
ｉｉ．カッパ鎖は、ブラスチシジンＳ選択（ａｎｔ−ｂｌ−１、インビトロジェン）を利用する。ブラスチシジンＳは、１０μｇ／ｍｌの濃度で使用される。ｂｓｒ遺伝子を含むプラスミドでトランスフェクトした後、細胞を、ブラスチシジンＳを含むＯｐｔｉ−ＣＨＯ培地で１０μｇ／ｍｌでインキュベートして、安定したトランスフェクタントを選択する。

ｄ．タンパク質の発現、精製及び特徴づけ
ｉ．トランスフェクション
複数の異なる発現ベクターを等モル比または様々なモル比（５〜１０倍差）で哺乳動物細胞、例えば２９３細胞またはＣＨＯ細胞にコトランスフェクトすることにより、ＩｇＭを作製する。発現ベクターのためのＤＮＡをＰＥＩと混合し、その後、ＣＨＯ−Ｓ細胞に添加する。ＣＨＯ−Ｓ細胞でのＰＥＩトランスフェクションを、確立された技術（“Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｖｏｌ ８７， ５５３−５４５”参照）に従って実施する。

ｉｉ．タンパク質の精製
・キャプチャー・セレクトＩｇＭ（カタログ２８９０．０５、ＢＡＣ、サーモフィッシャー）
トランスフェクトされたＣＨＯ−Ｓ細胞上清からのＩｇＭタンパク質を、製造業者のプロトコルに従ってアフィニティー・キャプチャー・セレクトＩｇＭ・アフィニティーマトリックスにより精製する。
・キャプト−Ｌ（カタログ１７−５４７８−０１、ＧＥヘルスケア）
ＣＨＯ−Ｓ細胞上清中の、カッパ鎖を含有するトランスフェクトされたＩｇＭタンパク質を、製造業者のプロトコルに従ってキャプト−Ｌアフィニティーマトリックスにより精製する。

ｉｉｉ．ゲル電気泳動
・非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで、ネイティブＩｇＭとその突然変異形態をサイズにより分離する。ホモ二量体重鎖（ＡＡ）で構成された五量体ＩｇＭは、およそ１，０００，０００分子量のタンパク質バンドを生じる。より短い型のモノ二量体重鎖（ＢＢ）で構成された五量体ＩｇＭは、著しく低い分子量のタンパク質バンドを生じる。ヘテロ二量体重鎖（キメラＡＢ）で構成された五量体ＩｇＭは、ＢＢよりも大きくＡＡよりも小さい分子量の複数のタンパク質を生じる。

ＮｕＰａｇｅ ＬＤＳサンプルバッファー（ライフ・テクノロジーズ）をＩｇＭタンパク質試料に２５℃で３０分間添加した後、ゲルにロードする。ＮａｔｉｖｅＰａｇｅ ノベックス３−１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（ライフ・テクノロジーズ）を、ノベックスＴｒｉｓ−酢酸ＳＤＳランニングバッファー（ライフ・テクノロジーズ）と共に使用する。色素の先頭がゲルの最下部に達するまで、ゲルを泳動にかける。

・還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ＮｕＰａｇｅ ＬＤＳサンプルバッファー（ライフ・テクノロジーズ）及びＮｕＰａｇｅ還元剤ジチオトレイトール（ライフ・テクノロジーズ）をＩｇＭタンパク質試料に添加して、８０℃まで１０分間加熱した後、ＮｕＰａｇｅノベックス４−１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（ライフ・テクノロジーズ、カタログＮｏ．ＮＰ０３２２）にロードする。ＮｕＰａｇｅ ＭＥＳ ＳＤＳランニングバッファー（ライフ・テクノロジーズ、カタログＮｏ．ＮＰ０００２）をゲル電気泳動に使用する。色素の先頭がゲルの最下部に達するまで、ゲルを泳動にかける。

電気泳動が完了した後、ゲルを装置から取り出して、コロイダルブルー染色（ライフ・テクノロジーズ、マニュアルＮｏ．ＬＣ６０２５）を用いてゲルを染色する。

・ゲルバンド定量
タンパク質ゲルを乾燥させ、その後、画像スキャナーでデジタル化する。ゲル画像をＩｍａｇｅ Ｊプログラムで処理して、ゲル定量機能を利用して特定バンドのタンパク質量を計測することができる。

ｉｖ．二重特異性調製物中の様々なｍＡｂを同定／定量するための質量分析法

ｖ．示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を利用した安定性分析
ｅ．二重特異性機能分析
ｉ．２つのリガンドのＥＬＩＳＡ分析
ＯＫＴ３（鎖Ａ）及びｃＭｙｃペプチド（鎖Ｂ）を有するＩｇＭを、可溶性ＣＤ３イプシロンタンパク質捕捉及び抗ｃＭｙｃ（９Ｅ１０）検出を伴うＥＬＩＳＡ分析によりアッセイする。可溶性ＣＤ３ｅタンパク質を、１５０ｍＭ ＮａＨＣＯ_３中の２ｍｇ／ｍｌでＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、その後ＰＢＳ中の３％ＢＳＡでブロッキングする。トランスフェクトされたＩｇＭ−ＯＫＴ３−ｃＭｙｃを含む上清（１００μｌ）を、ブロッキングされたＥＬＩＳＡプレートに２５℃で４時間添加する。ＰＢＳで洗浄した後、９Ｅ１０抗体をＥＬＩＳＡプレートに室温で２時間添加する。ＰＢＳで洗浄した後、抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰを添加する。ＨＲＰ基質を添加した後にＯＤ４５０で読み取ることにより、二重特異性ＩｇＭの存在を検出する。

ｉｉ．標的結合のＦＡＣＳ分析
Ｔ細胞株（ピア、陽性細胞株）及びＢ細胞株（ダウジ、陰性対照細胞株）への抗体の結合により、Ｔ細胞へのＩｇＭ−ＯＫＴ３−ｃＭｙｃ結合を確認する。洗浄後、ローダミン標識された９Ｅ１０を細胞懸濁液に添加する。細胞標的結合を、ＣＤ２０抗原を含む、または含まない陽性及び陰性対照細胞の両方のＭＦＩにより検出する。

ｉｉｉ．二重特異性結合についての蛍光顕微鏡アッセイ
各細胞型の２種の異なる生体染色色素で予め標識されたＣＤ３陽性細胞及びＣＤ２０陽性細胞の２集団を集合させる能力により、設計されたＩｇＭの二重特異性結合を検証する。例えば
・ＣＤ３陽性細胞株（ピア）を標識する緑色蛍光細胞基質生体染色色素（セルトレース（商標）カルセイン・グリーンＡＭ）
・赤色蛍光細胞基質生体染色色素（セルトレース（商標）カルセイン・レッド−オレンジＡＭ）が標識されたＣＤ２０陽性Ｂ細胞株（ダウジ）

多重特異性結合及び多重特異性機能分析を、先に記載されたものなどの当該技術分野で公知の技術を利用して、類似の手法で実施することができる。

Claims (13)

1. ５つまたは６つの二重特異性結合単位を含む五量体または六量体環構造を有する結合分子であって、
   ここで前記二重特異性結合単位のそれぞれが、同じ２つの結合特異性を有し、第一の結合ターゲットに結合する第一の結合領域にコンジュゲートされたＩｇＭ重鎖定常領域の少なくともＣμ４ドメイン、Ｃμ３ドメインおよびＣμ２ドメインを含む第一の鎖と、第二の結合ターゲットに結合する第二の結合領域にコンジュゲートされたＩｇＭ重鎖定常領域の少なくともＣμ４ドメイン、Ｃμ３ドメインおよびＣμ２ドメインを含む第二の鎖とを含み、
   ここで前記第一及び第二の結合ターゲットが異なっており、前記第一及び第二の鎖が、それらの各ＩｇＭ重鎖定常領域の間における非対称界面の生成により、二重特異性結合単位を生成するように組み立てられ、
   ここで、前記非対称界面が、
   （i）前記結合単位の２つの鎖のＣμ２、Ｃμ３及び／またはＣμ４ドメインの少なくとも１つにおける逆電荷アミノ酸残基間の１または複数のペアごとの切替え（ｐａｉｒ−ｗｉｓｅ ｓｗｉｔｃｈｅｓ）により形成される塩架橋の導入、
   ここで、前記逆電荷アミノ酸残基間の１または複数のペアごとの切替えが、
   Ｃμ４ Ｔ３５４Ｅ⇔Ｃμ４ Ｉ３９７Ｋ；
   を含む；
   または
   （ii）ノブ： Ｃμ４ Ｔ３５０→Ｙと、
   ホール：Ｃμ４ Ｌ３５２→Ｓ；若しくは
   Ｃμ４ Ｈ３９５→Ｖと、
   を含むノブ・イントゥー・ホールの結合の導入、
   により生成され、
   ここで、前記アミノ酸の位置は、配列番号：３３に示される野生型ヒトＩｇＭ重鎖定常領域に対応する、
   前記結合分子。
2. 前記二重特異性結合単位が、同一である、請求項１に記載の結合分子。
3. 前記第一及び第二の結合領域が、それぞれ前記第一及び前記第二の結合ターゲットに結合する２つの異なるＩｇＭ抗体重鎖可変領域である、請求項１または２に記載の結合分子。
4. 前記結合分子が、前記２つの異なるＩｇＭ重鎖可変領域の少なくとも一方と会合する少なくとも１つのＩｇＭ軽鎖可変領域配列をさらに含む、請求項３に記載の結合分子。
5. 前記軽鎖可変領域配列が、前記軽鎖と重鎖の間に非対称界面を生成することにより、それがマッチする重鎖可変領域にカップリングされる、請求項４に記載の結合分子。
6. 前記結合ターゲットが、可溶性ポリペプチド、細胞表面受容体、リガンド、分子トランスポータ、酵素及び酵素基質などのペプチド、ポリペプチド、糖タンパク質、核酸分子、ならびに有機及び非有機小分子から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の結合分子。
7. 異なるターゲットに結合する前記結合単位が、同じ可溶性ターゲット上の部位；同じ細胞表面受容体ターゲット上の部位；異なる可溶性ターゲット；異なる細胞表面受容体ターゲット；可溶性及び細胞表面受容体ターゲット；可溶性もしくは細胞表面受容体及び長滞留時間ターゲット；可溶性及びマトリックスタンパク質もしくは基質ターゲット；可溶性もしくは受容体及び分子トラスポータターゲット；ならびに異なる細胞型、に結合する結合単位からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の結合分子。
8. ＩｇＭ Ｊ鎖をさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の結合分子。
9. 前記結合領域の少なくとも１つが、抗体の可変領域である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の結合分子。
10. 毒素または化学療法剤にコンジュゲートされている、請求項１〜９のいずれか１項に記載の結合分子。
11. 前記コンジュゲーションが、融合または化学的リンカーによる、請求項１０に記載の結合分子。
12. キメラまたはヒト化である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の結合分子。
13. 請求項１〜１２のいずれか１項に記載の結合分子および医薬的に許容し得る担体を含む医薬組成物。

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