JP6699096B2 - 改良Ｆｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法および当該タンパク質を用いた抗体吸着剤 - Google Patents

改良Ｆｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法および当該タンパク質を用いた抗体吸着剤 Download PDF

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本発明は、免疫グロブリンに親和性のあるＦｃ結合性タンパク質に関する。より詳しくは、本発明は、熱や酸に対する安定性が野生型よりも高いＦｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法、および当該タンパク質を不溶性担体に固定化して得られる抗体吸着剤に関する。
Ｆｃレセプターは、免疫グロブリン分子のＦｃ領域に結合する一群の分子である。個々の分子は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する認識ドメインによって、単一の、または同じグループの免疫グロブリンイソタイプをＦｃレセプター上の認識ドメインによって認識している。これによって、免疫応答においてどのアクセサリー細胞が動因されるかが決まってくる。Ｆｃレセプターは、さらにいくつかのサブタイプに分類することができ、ＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）に対するレセプターであるＦｃγレセプター、ＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεレセプター、ＩｇＡのＦｃ領域に結合するＦｃαレセプター等がある。また各レセプターは更に細かく分類されており、Ｆｃγレセプターは、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂの存在が報告されている（非特許文献１）。
Ｆｃγレセプターの中でも、ＦｃγＲＩＩＩａはナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）やマクロファージなどの細胞表面に存在しており、ヒト免疫機構の中でも重要なＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）活性に関与している重要なレセプターである。このＦｃγＲＩＩＩａとヒトＩｇＧとの親和性は結合の強さを示す結合定数（ＫＡ）が１０７Ｍ−１以下であることが報告されている（非特許文献２）。ヒトＦｃγＲＩＩＩａのアミノ酸配列（配列番号１）はＵｎｉＰｒｏｔ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ０８６３７）などの公的データベースに公表されている。また、ヒトＦｃγＲＩＩＩａの構造上の機能ドメイン、細胞膜を貫通するためのシグナルペプチド配列、細胞膜貫通領域の位置についても同様に公表されている。図１にヒトＦｃγＲＩＩＩａの構造略図を示す。なお、図１中の番号はアミノ酸番号を示しており、その番号は配列番号１に記載のアミノ酸番号に対応する。すなわち、配列番号１中の１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から１６番目のアラニン（Ａｌａ）までがシグナル配列（Ｓ）、１７番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までが細胞外領域（ＥＣ）、２０９番目のバリン（Ｖａｌ）から２２９番目のバリン（Ｖａｌ）までが細胞膜貫通領域（ＴＭ）および２３０番目のリジン（Ｌｙｓ）から２５４番目のリジン（Ｌｙｓ）までが細胞内領域（Ｃ）とされている。なおＦｃγＲＩＩＩａはＩｇＧ１からＩｇＧ４まであるヒトＩｇＧサブクラスのうち、特にＩｇＧ１とＩｇＧ３に対し強く結合する一方、ＩｇＧ２とＩｇＧ４に対する結合は弱いことが知られている。
Ｔａｋａｉ．Ｔ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８，３１８−３２６，２００５ Ｊ．Ｇａｌｏｎ等，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７，１９２８−１９３２，１９９７
本発明の課題は、特に熱や酸に対する安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法、および当該タンパク質を用いた抗体吸着剤を提供することにある。
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、ヒトＦｃγＲＩＩＩａにおける安定性向上に関与したアミノ酸残基を特定し、当該アミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換した変異体が、熱や酸に対して優れた安定性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本願は以下の（Ａ）から（Ｏ）に記載の態様を包含する：
（Ａ）配列番号３７に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において以下の（１）から（８４）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じている、Ｆｃ結合性タンパク質。
（１）配列番号３７の４５番目のフェニルアラニンがイソロイシンまたはロイシンに置換
（２）配列番号３７の５５番目のグルタミン酸がグリシンに置換
（３）配列番号３７の６４番目のグルタミンがアルギニンに置換
（４）配列番号３７の６７番目のチロシンがセリンに置換
（５）配列番号３７の７７番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（６）配列番号３７の９３番目のアスパラギン酸がグリシンに置換
（７）配列番号３７の９８番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換
（８）配列番号３７の１０６番目のグルタミンがアルギニンに置換
（９）配列番号３７の１２８番目のグルタミンがロイシンに置換
（１０）配列番号３７の１３３番目のバリンがグルタミン酸に置換
（１１）配列番号３７の１３５番目のリジンがアスパラギンまたはグルタミン酸に置換
（１２）配列番号３７の１５６番目のスレオニンがイソロイシンに置換
（１３）配列番号３７の１５８番目のロイシンがグルタミンに置換
（１４）配列番号３７の１８７番目のフェニルアラニンがセリンに置換
（１５）配列番号３７の１９１番目のロイシンがアルギニンに置換
（１６）配列番号３７の１９６番目のアスパラギンがセリンに置換
（１７）配列番号３７の２０４番目のイソロイシンがバリンに置換
（１８）配列番号３７の３４番目のメチオニンがイソロイシン、リジンまたはスレオニンに置換
（１９）配列番号３７の３７番目のグルタミン酸がグリシンまたはリジンに置換
（２０）配列番号３７の３９番目のロイシンがメチオニンまたはアルギニンに置換
（２１）配列番号３７の４９番目のグルタミンがプロリンに置換
（２２）配列番号３７の６２番目のリジンがイソロイシンまたはグルタミン酸に置換
（２３）配列番号３７の６４番目のグルタミンがトリプトファンに置換
（２４）配列番号３７の６７番目のチロシンがヒスチジンまたはアスパラギンに置換
（２５）配列番号３７の７０番目のグルタミン酸がグリシンまたはアスパラギン酸に置換
（２６）配列番号３７の７２番目のアスパラギンがセリンまたはイソロイシンに置換
（２７）配列番号３７の７７番目のフェニルアラニンがロイシンに置換
（２８）配列番号３７の８０番目のグルタミン酸がグリシンに置換
（２９）配列番号３７の８１番目のセリンがアルギニンに置換
（３０）配列番号３７の８３番目のイソロイシンがロイシンに置換
（３１）配列番号３７の８４番目のセリンがプロリンに置換
（３２）配列番号３７の８５番目のセリンがアスパラギンに置換
（３３）配列番号３７の８７番目のアラニンがスレオニンに置換
（３４）配列番号３７の９０番目のチロシンがフェニルアラニンに置換
（３５）配列番号３７の９１番目のフェニルアラニンがアルギニンに置換
（３６）配列番号３７の９３番目のアスパラギン酸がバリンまたはグルタミン酸に置換
（３７）配列番号３７の９４番目のアラニンがグルタミン酸に置換
（３８）配列番号３７の９７番目のバリンがメチオニンとグルタミン酸に置換
（３９）配列番号３７の９８番目のアスパラギン酸がアラニンに置換
（４０）配列番号３７の１０２番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
（４１）配列番号３７の１０６番目のグルタミンがロイシンに置換
（４２）配列番号３７の１０９番目のロイシンがグルタミンに置換
（４３）配列番号３７の１１７番目のグルタミンがロイシンに置換
（４４）配列番号３７の１１９番目のグルタミン酸がバリンに置換
（４５）配列番号３７の１２１番目のヒスチジンがアルギニンに置換
（４６）配列番号３７の１３０番目のプロリンがロイシンに置換
（４７）配列番号３７の１３５番目のリジンがチロシンに置換
（４８）配列番号３７の１３６番目のグルタミン酸がバリンに置換
（４９）配列番号３７の１４１番目のヒスチジンがグルタミンに置換
（５０）配列番号３７の１４６番目のセリンがスレオニンに置換
（５１）配列番号３７の１５４番目のリジンがアルギニンに置換
（５２）配列番号３７の１５９番目のグルタミンがヒスチジンに置換
（５３）配列番号３７の１６３番目のグリシンがバリンに置換
（５４）配列番号３７の１６５番目のリジンがメチオニンに置換
（５５）配列番号３７の１６７番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（５６）配列番号３７の１６９番目のヒスチジンがチロシンに置換
（５７）配列番号３７の１７４番目のチロシンがフェニルアラニンに置換
（５８）配列番号３７の１７７番目のリジンがアルギニンに置換
（５９）配列番号３７の１８５番目のセリンがグリシンに置換
（６０）配列番号３７の１９４番目のセリンがアルギニンに置換
（６１）配列番号３７の１９６番目のアスパラギンがリジンに置換
（６２）配列番号３７の２０１番目のスレオニンがアラニンに置換
（６３）配列番号３７の２０３番目のアスパラギンがイソロイシンまたはリジンに置換
（６４）配列番号３７の２０７番目のスレオニンがアラニンに置換
（６５）配列番号３７の９４番目のアラニンがセリンに置換
（６６）配列番号３７の９８番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換
（６７）配列番号３７の１１７番目のグルタミンがアルギニンに置換
（６８）配列番号３７の１７４番目のチロシンがヒスチジンに置換
（６９）配列番号３７の１８１番目のリジンがグルタミン酸に置換
（７０）配列番号３７の２０３番目のアスパラギンがアスパラギン酸またはチロシンに置換
（７１）配列番号３７の５６番目のリジンがグルタミンに置換
（７２）配列番号３７の６２番目のリジンがアスパラギンに置換
（７３）配列番号３７の６６番目のアラニンがスレオニンに置換
（７４）配列番号３７の ７２番目のアスパラギンがチロシンに置換
（７５）配列番号３７の７８番目のヒスチジンがロイシンに置換
（７６）配列番号３７の８１番目のセリンがグリシンに置換
（７７）配列番号３７の９０番目のチロシンがヒスチジンに置換
（７８）配列番号３７の１３８番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換
（７９）配列番号３７の１５３番目のヒスチジンがグルタミンに置換
（８０）配列番号３７の１５６番目のスレオニンがアラニン、アルギニン、ロイシン、リジン、フェニルアラニン、セリン、バリンまたはメチオニンに置換
（８１）配列番号３７の１５７番目のチロシンがフェニルアラニンに置換
（８２）配列番号３７の１７４番目のチロシンがロイシン、システイン、イソロイシン、リジン、トリプトファンまたはバリンに置換
（８３）配列番号３７の２０６番目のイソロイシンがバリンに置換
（８４）配列番号３７の２０７番目のスレオニンがイソロイシンに置換
（Ｂ）配列番号３９、配列番号４３、配列番号４７、配列番号５１、配列番号５５、配列番号６３、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７３、配列番号７７、配列番号８３、配列番号８９のいずれかに記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基を含む、（Ａ）に記載のＦｃ結合性タンパク質。
（Ｃ）配列番号３９、配列番号４３、配列番号４７、配列番号５１、配列番号５５、配列番号６３、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７３、配列番号７７、配列番号８３、配列番号８９のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる、（Ｂ）に記載のＦｃ結合性タンパク質。
（Ｄ）（Ａ）に記載のＦｃ結合性タンパク質において、さらに以下の（８５）から（８８）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じている、Ｆｃ結合性タンパク質。
（８５）配列番号３７の８２番目のロイシンがヒスチジンまたはアルギニンに置換
（８６）配列番号３７の１６３番目のグリシンがアスパラギン酸に置換
（８７）配列番号３７の１７４番目のチロシンがヒスチジンに置換
（８８）配列番号３７の１９２番目のバリンがフェニルアラニンに置換
（Ｅ）（Ａ）から（Ｄ）のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化して得られる吸着剤。
（Ｆ）（Ｅ）に記載の吸着剤を用いた抗体の分離方法。
（Ｇ）（Ｆ）に記載の分離方法で得られる抗体。
（Ｈ）（Ｅ）に記載の吸着剤を用いて抗体を分離することで、抗体が有する糖鎖構造の違いを識別する方法。
（Ｉ）（Ｅ）に記載の吸着剤を用いた糖鎖の分離方法。
（Ｊ）（Ｉ）に記載の分離方法で得られる糖鎖。
（Ｋ）（Ａ）から（Ｄ）のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（Ｌ）（Ｋ）に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
（Ｍ）（Ｌ）に記載の発現ベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体。
（Ｎ）宿主が大腸菌である、（Ｍ）に記載の形質転換体。
（Ｏ）（Ｍ）または（Ｎ）に記載の形質転換体を培養することによりＦｃ結合性タンパク質を発現させ、その培養物から発現されたＦｃ結合性タンパク質を回収する、Ｆｃ結合性タンパク質の製造方法。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のＦｃ結合性タンパク質は、抗体のＦｃ領域に結合性を持つタンパク質であり、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるヒトＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域（図１のＥＣの領域）のうち、少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含むタンパク質であって、当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において特定位置におけるアミノ酸置換が生じたタンパク質である。したがって、本発明のＦｃ結合性タンパク質は、細胞外領域のＮ末端側にあるシグナルペプチド領域（図１のＳ）の全てまたは一部を含んでもよいし、細胞外領域のＣ末端側にある細胞膜貫通領域（図１のＴＭ）および細胞外領域（図１のＣ）の全てまたは一部を含んでもよい。前記特定位置におけるアミノ酸置換は、具体的には、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ（この表記は、配列番号１の２７番目（配列番号３７では４３番目）のバリンがグルタミン酸に置換されていることを表す、以下同様）、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕ、Ａｓｎ９２Ｓｅｒ、Ｇｌｕ１２１Ｇｌｙ、およびＰｈｅ２９Ｉｌｅ、Ｐｈｅ２９Ｌｅｕ、Ｇｌｕ３９Ｇｌｙ、Ｇｌｎ４８Ａｒｇ、Ｔｙｒ５１Ｓｅｒ、Ｐｈｅ６１Ｔｙｒ、Ａｓｐ７７Ｇｌｙ、Ａｓｐ８２Ｇｌｕ、Ｇｌｎ９０Ａｒｇ、Ｇｌｎ１１２Ｌｅｕ、Ｖａｌ１１７Ｇｌｕ、Ｌｙｓ１１９Ａｓｎ、Ｌｙｓ１１９Ｇｌｕ、Ｔｈｒ１４０Ｉｌｅ、Ｌｅｕ１４２Ｇｌｎ、Ｐｈｅ１７１Ｓｅｒ、Ｌｅｕ１７５Ａｒｇ、Ａｓｎ１８０Ｓｅｒ、Ｉｌｅ１８８Ｖａｌ、Ｍｅｔ１８Ｉｌｅ、Ｍｅｔ１８Ｌｙｓ、Ｍｅｔ１８Ｔｈｒ、Ｇｌｕ２１Ｇｌｙ、Ｇｌｕ２１Ｌｙｓ、Ｌｅｕ２３Ｍｅｔ、Ｌｅｕ２３Ａｒｇ、Ｇｌｎ３３Ｐｒｏ、Ｌｙｓ４６Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４６Ｇｌｕ、Ｇｌｎ４８Ｔｒｐ、Ｔｙｒ５１Ｈｉｓ、Ｔｙｒ５１Ａｓｎ、Ｇｌｕ５４Ｇｌｙ、Ｇｌｕ５４Ａｓｐ、Ａｓｎ５６Ｓｅｒ、Ａｓｎ５６Ｉｌｅ、Ｐｈｅ６１Ｌｅｕ、Ｇｌｕ６４Ｇｌｙ、Ｓｅｒ６５Ａｒｇ、Ｉｌｅ６７Ｌｅｕ、Ｓｅｒ６８Ｐｒｏ、Ｓｅｒ６９Ａｓｎ、Ａｌａ７１Ｔｈｒ、Ｔｙｒ７４Ｐｈｅ、Ｐｈｅ７５Ａｒｇ、Ａｓｐ７７Ｖａｌ、Ａｓｐ７７Ｇｌｕ、Ａｌａ７８Ｇｌｕ、Ｖａｌ８１Ｍｅｔ、Ｖａｌ８１Ｇｌｕ、Ａｓｐ８２Ａｌａ、Ｇｌｕ８６Ａｓｐ、Ｇｌｎ９０Ｌｅｕ、Ｌｅｕ９３Ｇｌｎ、Ｇｌｎ１０１Ｌｅｕ、Ｇｌｕ１０３Ｖａｌ、Ｈｉｓ１０５Ａｒｇ、Ｐｒｏ１１４Ｌｅｕ、Ｌｙｓ１１９Ｔｙｒ、Ｇｌｕ１２０Ｖａｌ、Ｈｉｓ１２５Ｇｌｎ、Ｓｅｒ１３０Ｔｈｒ、Ｌｙｓ１３８Ａｒｇ、Ｇｌｎ１４３Ｈｉｓ、Ｇｌｙ１４７Ｖａｌ、Ｌｙｓ１４９Ｍｅｔ、Ｐｈｅ１５１Ｔｙｒ、Ｈｉｓ１５３Ｔｙｒ、Ｔｙｒ１５８Ｐｈｅ、Ｌｙｓ１６１Ａｒｇ、Ｓｅｒ１６９Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１７８Ａｒｇ、Ａｓｎ１８０Ｌｙｓ、Ｔｈｒ１８５Ａｌａ、Ａｓｎ１８７Ｉｌｅ、Ａｓｎ１８７Ｌｙｓ、Ｔｈｒ１９１Ａｌａ、Ａｌａ７８Ｓｅｒ、Ａｓｐ８２Ｇｌｕ、Ｇｌｎ１０１Ａｒｇ、Ｔｙｒ１５８Ｈｉｓ、Ｌｙｓ１６５Ｇｌｕ、Ａｓｎ１８７Ａｓｐ、Ａｓｎ１８７Ｔｙｒ、Ｌｙｓ４０Ｇｌｎ、Ｌｙｓ４６Ａｓｎ、Ａｌａ５０Ｔｈｒ、Ａｓｎ５６Ｔｙｒ、Ｈｉｓ６２Ｌｅｕ、Ｓｅｒ６５Ｇｌｙ、Ｔｙｒ７４Ｈｉｓ、Ａｓｐ１２２Ｇｌｕ、Ｈｉｓ１３７Ｇｌｎ、Ｔｈｒ１４０Ａｌａ、Ｔｈｒ１４０Ａｒｇ、Ｔｈｒ１４０Ｌｅｕ、Ｔｈｒ１４０Ｌｙｓ、Ｔｈｒ１４０Ｐｈｅ、Ｔｈｒ１４０Ｓｅｒ、Ｔｈｒ１４０Ｖａｌ、Ｔｈｒ１４０Ｍｅｔ、Ｔｙｒ１４１Ｐｈｅ、Ｔｙｒ１５８Ｌｅｕ、Ｔｙｒ１５８Ｃｙｓ、Ｔｙｒ１５８Ｉｌｅ、Ｔｙｒ１５８Ｌｙｓ、Ｔｙｒ１５８Ｔｒｐ、Ｔｙｒ１５８Ｖａｌ、Ｉｌｅ１９０Ｖａｌ、Ｔｈｒ１９１Ｉｌｅのうち、少なくともいずれかの１つの置換である。なお、野生型ＦｃγＲＩＩＩａには、Ｌｅｕ６６Ｈｉｓ、Ｌｅｕ６６Ａｒｇ、Ｇｌｙ１４７Ａｓｐ、Ｔｙｒ１５８Ｈｉｓ、Ｖａｌ１７６Ｐｈｅのうち、いずれか１つ以上のアミノ酸置換が生じた変異体が知られているが、前記特定位置におけるアミノ酸置換以外にこれらのアミノ酸置換を含んでいてもよい。
アミノ酸置換を行なうことで本発明のＦｃ結合性タンパク質を作製する際、特定位置のアミノ酸残基については、抗体結合活性を有する限り前述したアミノ酸以外のアミノ酸に置換してもよい。その一例として、両アミノ酸の物理的性質と化学的性質またはそのどちらかが類似したアミノ酸間で置換する保守的置換があげられる。保守的置換は、Ｆｃ結合性タンパク質に限らず一般に、置換が生じているものと置換が生じていないものとの間でタンパク質の機能が維持されることが当業者において知られている。保守的置換の一例としては、グリシンとアラニン間、アスパラギン酸とグルタミン酸間、セリンとプロリン間、またはグルタミン酸とアラニン間に生じる置換があげられる（タンパク質の構造と機能，メディカル・サイエンス・インターナショナル社，９，２００５）。
本発明のＦｃ結合性タンパク質において、置換するアミノ酸の数に特に制限はない。一例として、以下の（ａ）から（ｌ）に示すＦｃ結合性タンパク質があげられる。これらのＦｃ結合性タンパク質は熱、酸またはアルカリに対する安定性が向上する点で好ましい。
（ａ）配列番号３７に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において、４５番目のフェニルアラニンがイソロイシンに、１３３番目のバリンがグルタミン酸にそれぞれ置換されているＦｃ結合性タンパク質（配列番号３９に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）。
（ｂ）配列番号３７に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において、４５番目のフェニルアラニンがイソロイシンに、１３３番目のバリンがグルタミン酸に、１８７番目のフェニルアラニンがセリンにそれぞれ置換されているＦｃ結合性タンパク質（配列番号４３に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）。
（ｃ）配列番号３７に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において、４５番目のフェニルアラニンがイソロイシンに、６４番目のグルタミンがアルギニンに、１３３番目のバリンがグルタミン酸に、１８７番目のフェニルアラニンがセリンにそれぞれ置換されているＦｃ結合性タンパク質（配列番号４７に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）。
（ｄ）配列番号３７に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において、４５番目のフェニルアラニンがイソロイシンに、６４番目のグルタミンがアルギニンに、６７番目のチロシンがセリンに、１３３番目のバリンがグルタミン酸に、１８７番目のフェニルアラニンがセリンにそれぞれ置換されているＦｃ結合性タンパク質（配列番号５１に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）。
（ｅ）配列番号３７に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において、４５番目のフェニルアラニンがイソロイシンに、６４番目のグルタミンがアルギニンに、６７番目のチロシンがセリンに、１０６番目のグルタミンがアルギニンに、１３３番目のバリンがグルタミン酸に、１８７番目のフェニルアラニンがセリンにそれぞれ置換されているＦｃ結合性タンパク質（配列番号５５に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）。
（ｆ）配列番号３７に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において、３７番目のグルタミン酸がグリシンに、３９番目のロイシンがメチオニンに、４５番目のフェニルアラニンがイソロイシンに、６４番目のグルタミンがアルギニンに、１３３番目のバリンがグルタミン酸に、１８７番目のフェニルアラニンがセリンに、１９４番目のセリンがアルギニンにそれぞれ置換されているＦｃ結合性タンパク質（配列番号６３に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）。
（ｇ）配列番号３７に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において、３７番目のグルタミン酸がグリシンに、３９番目のロイシンがメチオニンに、４５番目のフェニルアラニンがイソロイシンに、６４番目のグルタミンがアルギニンに、８４番目のセリンがプロリンに、１３３番目のバリンがグルタミン酸に、１８７番目のフェニルアラニンがセリンに、１９４番目のセリンがアルギニンにそれぞれ置換されているＦｃ結合性タンパク質（配列番号６７に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）。
（ｈ）配列番号３７に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において、３７番目のグルタミン酸がグリシンに、３９番目のロイシンがメチオニンに、４５番目のフェニルアラニンがイソロイシンに、６４番目のグルタミンがアルギニンに、８４番目のセリンがプロリンに、１３３番目のバリンがグルタミン酸に、１６３番目のグリシンがバリンに、１８７番目のフェニルアラニンがセリンに、１９４番目のセリンがアルギニンにそれぞれ置換されているＦｃ結合性タンパク質（配列番号６９に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）。
（ｉ）配列番号３７に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において、３７番目のグルタミン酸がグリシンに、３９番目のロイシンがメチオニンに、４５番目のフェニルアラニンがイソロイシンに、６４番目のグルタミンがアルギニンに、６７番目のチロシンがヒスチジン、７０番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に、８４番目のセリンがプロリンに、１３３番目のバリンがグルタミン酸に、１６３番目のグリシンがバリンに、１８７番目のフェニルアラニンがセリンに、１９４番目のセリンがアルギニンにそれぞれ置換されているＦｃ結合性タンパク質（配列番号７３に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）。
（ｊ）配列番号３７に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において、３７番目のグルタミン酸がグリシンに、３９番目のロイシンがメチオニンに、４５番目のフェニルアラニンがイソロイシンに、６４番目のグルタミンがアルギニンに、６７番目のチロシンがヒスチジン、７０番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に、８４番目のセリンがプロリンに、１３３番目のバリンがグルタミン酸に、１５６番目のスレオニンがイソロイシンに、１６３番目のグリシンがバリンに、１７４番目のチロシンがヒスチジンに、１８１番目のリジンがグルタミン酸に、１８７番目のフェニルアラニンがセリンに、１９４番目のセリンがアルギニンにそれぞれ置換されているＦｃ結合性タンパク質（配列番号７７に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）。
（ｋ）配列番号３７に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において、３７番目のグルタミン酸がグリシンに、３９番目のロイシンがメチオニンに、４５番目のフェニルアラニンがイソロイシンに、６４番目のグルタミンがアルギニンに、６７番目のチロシンがヒスチジン、７０番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に、８４番目のセリンがプロリンに、９８番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に、１１７番目のグルタミンがロイシンに、１３３番目のバリンがグルタミン酸に、１５６番目のスレオニンがイソロイシンに、１６３番目のグリシンがバリンに、１７４番目のチロシンがヒスチジンに、１８１番目のリジンがグルタミン酸に、１８７番目のフェニルアラニンがセリンに、１９４番目のセリンがアルギニンにそれぞれ置換されているＦｃ結合性タンパク質（配列番号８３に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）。
（ｌ）配列番号３７に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において、３７番目のグルタミン酸がグリシンに、３９番目のロイシンがメチオニンに、４５番目のフェニルアラニンがイソロイシンに、６４番目のグルタミンがアルギニンに、６７番目のチロシンがヒスチジン、７０番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に、８４番目のセリンがプロリンに、９４番目のアラニンがセリンに、９８番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に、１１７番目のグルタミンがロイシンに、１３３番目のバリンがグルタミン酸に、１５６番目のスレオニンがイソロイシンに、１６３番目のグリシンがバリンに、１７４番目のチロシンがヒスチジンに、１８１番目のリジンがグルタミン酸に、１８７番目のフェニルアラニンがセリンに、１９４番目のセリンがアルギニンに、２０１番目のスレオニンがアラニンに、２０３番目のアスパラギンがアスパラギン酸にそれぞれ置換されているＦｃ結合性タンパク質（配列番号８９に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）。
本発明のＦｃ結合性タンパク質は、そのＮ末端側またはＣ末端側に、夾雑物質存在下の溶液から分離する際に有用なオリゴペプチドをさらに付加してもよい。前記オリゴペプチドとしては、ポリヒスチジン、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸等があげられる。また本発明のＦｃ結合性タンパク質をクロマトグラフィー用の支持体等の固相に固定化する際に有用な、システインを含むオリゴペプチドを、本発明のＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側にさらに付加してもよい。Ｆｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に付加するオリゴペプチドの長さは、本発明のＦｃ結合性タンパク質のＩｇＧ結合性や安定性を損なわない限り特に制限はない。前記オリゴペプチドを本発明のＦｃ結合性タンパク質に付加させる際は、前記オリゴペプチドをコードするポリヌクレオチドを作製後、当業者に周知の方法を用いて遺伝子工学的にＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に付加させてもよいし、化学的に合成した前記オリゴペプチドを本発明のＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に化学的に結合させて付加させてもよい。さらに本発明のＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側には、宿主での効率的な発現を促すためのシグナルペプチドを付加してもよい。宿主が大腸菌の場合における前記シグナルペプチドの例としては、ＰｅｌＢ、ＤｓｂＡ、ＭａｌＥ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ０ＡＥＸ９に記載のアミノ酸配列のうち１番目から２６番目までの領域）、ＴｏｒＴなどといったペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドを例示することができる（特開２０１１−０９７８９８号公報）。
本発明のポリヌクレオチドの作製方法の一例として、
（Ｉ）本発明のＦｃ結合性タンパク質のアミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換し、当該ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを人工的に合成する方法や、
（ＩＩ）Ｆｃ結合性タンパク質の全体または部分配列を含むポリヌクレオチドを直接人工的に、またはＦｃ結合性タンパク質のｃＤＮＡ等からＰＣＲ法といったＤＮＡ増幅法を用いて調製し、調製した当該ポリヌクレオチドを適当な方法で連結する方法、が例示できる。
前記（Ｉ）の方法において、アミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換する際、形質転換させる宿主におけるコドンの使用頻度を考慮して変換するのが好ましい。一例として、宿主が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の場合は、アルギニン（Ａｒｇ）ではＡＧＡ／ＡＧＧ／ＣＧＧ／ＣＧＡが、イソロイシン（Ｉｌｅ）ではＡＴＡが、ロイシン（Ｌｅｕ）ではＣＴＡが、グリシン（Ｇｌｙ）ではＧＧＡが、プロリン（Ｐｒｏ）ではＣＣＣが、それぞれ使用頻度が少ないため（いわゆるレアコドンであるため）、それらのコドンを避けるように変換すればよい。コドンの使用頻度の解析は公的データベース（例えば、かずさＤＮＡ研究所のホームページにあるＣｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅなど）を利用することによっても可能である。
本発明のポリヌクレオチドへ変異を導入する場合、エラープローンＰＣＲ法を用いることができる。エラープローンＰＣＲ法における反応条件は、Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドに所望の変異を導入できる条件であれば特に限定はなく、例えば、基質である４種類のデオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄＣＴＰ／ｄＧＴＰ）の濃度を不均一にし、ＭｎＣｌ２を０．０１から１０ｍＭ（好ましくは０．１から１ｍＭ）の濃度でＰＣＲ反応液に添加してＰＣＲを行なうことで、ポリヌクレオチドに変異を導入することができる。またエラープローンＰＣＲ法以外の変異導入方法としては、Ｆｃ結合性タンパク質の全体または部分配列を含むポリヌクレオチドに、変異原となる薬剤を接触・作用させたり、紫外線を照射したりして、ポリヌクレオチドに変異を導入して作製する方法があげられる。当該方法において変異原として使用する薬剤としては、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン等、当業者が通常用いる変異原性薬剤を用いればよい。
本発明のＦｃ結合性タンパク質を発現させる宿主には特に制限はなく、一例として、動物細胞（ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＯＳ細胞等）、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｏｃｔｏｓｐｏｒｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ等）、昆虫細胞（Ｓｆ９、Ｓｆ２１等）、大腸菌（ＪＭ１０９株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株、Ｗ３１１０株等）や枯草菌があげられる。なお動物細胞や大腸菌を宿主として用いると生産性の面で好ましく、大腸菌を宿主として用いるとさらに好ましい。
本発明のポリヌクレオチドを用いて宿主を形質転換する場合、本発明のポリヌクレオチドそのものを用いてもよいが、発現ベクター（例えば、原核細胞や真核細胞の形質転換に通常用いるバクテリオファージ、コスミドやプラスミド等）の適切な位置に本発明のポリヌクレオチドを挿入したものを用いると、より好ましい。なお当該発現ベクターは、形質転換する宿主内で安定に存在し複製できるものであれば特に制限はなく、大腸菌を宿主とする場合は、ｐＥＴプラスミドベクター、ｐＵＣプラスミドベクター、ｐＴｒｃプラスミドベクター、ｐＣＤＦプラスミドベクター、ｐＢＢＲプラスミドベクターを例示することができる。また前記適切な位置とは、発現ベクターの複製機能、所望の抗生物質マーカー、伝達性に関わる領域を破壊しない位置を意味する。前記発現ベクターに本発明のポリヌクレオチドを挿入する際は、発現に必要なプロモータといった機能性ポリヌクレオチドに連結される状態で挿入すると好ましい。当該プロモータの例として、宿主が大腸菌の場合は、ｔｒｐプロモータ、ｔａｃプロモータ、ｔｒｃプロモータ、ｌａｃプロモータ、Ｔ７プロモータ、ｒｅｃＡプロモータ、ｌｐｐプロモータ、さらにはλファージのλＰＬプロモータ、λＰＲプロモータがあげられ、宿主が動物細胞の場合は、ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧプロモーターがあげられる。
前記方法により作製した、本発明のポリヌクレオチドを挿入した発現ベクター（以下、本発明の発現ベクターとする）を用いて宿主を形質転換するには、当業者が通常用いる方法で行なえばよい。例えば、宿主としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物（大腸菌ＪＭ１０９株、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株、大腸菌Ｗ３１１０株等）を選択する場合には、公知の文献（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，２５６，１９９２）に記載の方法等により形質転換すればよい。なお宿主が動物細胞である場合にはエレクトロポレーションやリポフェクションを用いればよい。前述した方法で形質転換して得られた形質転換体は、適切な方法でスクリーニングすることにより、本発明のＦｃ結合性タンパク質を発現可能な形質転換体（以下、本発明の形質転換体とする）を取得することができる。
本発明の形質転換体から本発明の発現ベクターを調製するには、形質転換に用いた宿主に適した方法で、本発明の形質転換体から本発明の発現ベクターを抽出し調製すればよい。
例えば、本発明の形質転換体の宿主が大腸菌の場合、形質転換体を培養して得られる培養物からアルカリ抽出法またはＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（キアゲン製）等の市販の抽出キットを用いて調製すればよい。
本発明の形質転換体を培養し、得られた培養物から本発明のＦｃ結合性タンパク質を回収することで、本発明のＦｃ結合性タンパク質を製造することができる。なお本明細書において培養物とは、培養された本発明の形質転換体の細胞そのもののほか、培養に用いた培地も含まれる。本発明のタンパク質製造方法で用いる形質転換体は、対象宿主の培養に適した培地で培養すればよく、宿主が大腸菌の場合は、必要な栄養源を補ったＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培地が好ましい培地の一例としてあげられる。なお、本発明の発現ベクターの導入の有無により本発明の形質転換体を選択的に増殖させるために、培地に当該ベクターに含まれる薬剤耐性遺伝子に対応した薬剤を添加して培養すると好ましい。例えば、当該ベクターがカナマイシン耐性遺伝子を含んでいる場合は、培地にカナマイシンを添加すればよい。また培地には、炭素、窒素および無機塩供給源の他に、適当な栄養源を添加してもよく、所望により、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレートおよびジチオスレイトールからなる群から選択される一種類以上の還元剤を含んでもよい。さらにグリシンといった前記形質転換体から培養液へのタンパク質分泌を促す試薬を添加してもよく、具体的には、宿主が大腸菌の場合、培地に対してグリシンを２％（ｗ／ｖ）以下で添加すると好ましい。培養温度は宿主が大腸菌の場合、一般に１０℃から４０℃、好ましくは２０℃から３７℃、より好ましくは２５℃前後であるが、発現させるタンパク質の特性により選択すればよい。培地のｐＨは宿主が大腸菌の場合、ｐＨ６．８からｐＨ７．４、好ましくはｐＨ７．０前後である。また本発明のベクターに誘導性のプロモータが含まれている場合は、本発明のＦｃ結合性タンパク質が良好に発現できるような条件下で誘導をかけると好ましい。誘導剤としてはＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を例示することができる。宿主が大腸菌の場合、培養液の濁度（６００ｎｍにおける吸光度）を測定し、約０．５から１．０となったときに適当量のＩＰＴＧを添加後、引き続き培養することで、Ｆｃ結合性タンパク質の発現を誘導することができる。ＩＰＴＧの添加濃度は０．００５から１．０ｍＭの範囲から適宜選択すればよいが、０．０１から０．５ｍＭの範囲が好ましい。ＩＰＴＧ誘導に関する種々の条件は当該技術分野において周知の条件で行なえばよい。
本発明の形質転換体を培養して得られた培養物から本発明のＦｃ結合性タンパク質を回収するには、本発明の形質転換体における本発明のＦｃ結合性タンパク質の発現形態に適した方法で、当該培養物から分離／精製して本発明のＦｃ結合性タンパク質を回収すればよい。例えば、培養上清に発現する場合は菌体を遠心分離操作によって分離し、得られる培養上清から本発明のＦｃ結合性タンパク質を精製すればよい。また、細胞内（ペリプラズムを含む）に発現する場合には、遠心分離操作により菌体を集めた後、酵素処理剤や界面活性剤等を添加したり、超音波やフレンチプレス等を用いて菌体を破砕して本発明のＦｃ結合性タンパク質を抽出した後、精製すればよい。本発明のＦｃ結合性タンパク質を精製するには、当該技術分野において公知の方法を用いればよく、一例として液体クロマトグラフィーを用いた分離／精製があげられる。液体クロマトグラフィーには、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等があり、これらのクロマトグラフィーを組み合わせて精製操作を行なうことにより、本発明のＦｃ結合性タンパク質を高純度に調製することができる。
得られた本発明のＦｃ結合性タンパク質のＩｇＧに対する結合活性を測定する方法としては、例えばＩｇＧに対する結合活性をＥｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（以下、ＥＬＩＳＡと表記）法や表面プラズモン共鳴法などを用いて測定すればよい。結合活性の測定に使用するＩｇＧは、ヒトＩｇＧが好ましく、ヒトＩｇＧ１やヒトＩｇＧ３が特に好ましい。
本発明のＦｃ結合性タンパク質を不溶性担体に結合させることで、本発明の吸着剤を製造することができる。前記不溶性担体には特に限定はなく、アガロース、アルギネート（アルギン酸塩）、カラゲナン、キチン、セルロース、デキストリン、デキストラン、デンプンといった多糖質を原料とした担体や、ポリビニルアルコール、ポリメタクレート、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリウレタンといった合成高分子を原料とした担体や、シリカなどのセラミックスを原料とした担体が例示できる。中でも、多糖質を原料とした担体や合成高分子を原料とした担体が不溶性担体として好ましい。前記好ましい担体の一例として、トヨパール（東ソー製）等の水酸基を導入したポリメタクリレートゲル、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥヘルスケア製）等のアガロースゲル、セルファイン（ＪＮＣ製）等のセルロースゲルがあげられる。不溶性担体の形状については特に限定はなく、粒状物または非粒状物、多孔性または非多孔性、いずれであってもよい。
Ｆｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化するには、不溶性担体にＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）活性化エステル基、エポキシ基、カルボキシル基、マレイミド基、ハロアセチル基、トレシル基、ホルミル基、ハロアセトアミド等の活性基を付与し、当該活性基を介してヒトＦｃ結合性タンパク質と不溶性担体とを共有結合させることで固定化すればよい。活性基を付与した担体は市販の担体をそのまま用いてもよいし、適切な反応条件で担体表面に活性基を導入して調製してもよい。活性基を付与した市販の担体としてはＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＡＦ−Ｅｐｏｘｙ−６５０Ｍ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＡＦ−Ｔｒｅｓｙｌ−６５０Ｍ（いずれも東ソー製）、ＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＨＰ Ｃｏｌｕｍｎｓ、ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ｅｐｏｘｙ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂ（いずれもＧＥヘルスケア製）、ＳｕｌｆｏＬｉｎｋ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｒｅｓｉｎ（サーモサイエンティフィック製）が例示できる。
一方、担体表面に活性基を導入する方法としては、担体表面に存在する水酸基やエポキシ基、カルボキシル基、アミノ基等に対して２個以上の活性部位を有する化合物の一方を反応させる方法が例示できる。当該化合物の一例のうち、担体表面の水酸基やアミノ基にエポキシ基を導入する化合物としては、エピクロロヒドリン、エタンジオールジグリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジルエーテル、ヘキサンジオールジグリシジルエーテルが例示できる。前記化合物により担体表面にエポキシ基を導入した後、担体表面にカルボキシル基を導入する化合物としては、２−メルカプト酢酸、３−メルカプトプロピオン酸、４−メルカプト酪酸、６−メルカプト酪酸、グリシン、３−アミノプロピオン酸、４−アミノ酪酸、６−アミノヘキサン酸を例示できる。
担体表面に存在する水酸基やエポキシ基、カルボキシル基、アミノ基にマレイミド基を導入する化合物としては、Ｎ−（ε−マレイミドカプロン酸）ヒドラジド、Ｎ−（ε−マレイミドプロピオン酸）ヒドラジド、４−［４−Ｎ−マレイミドフェニル］酢酸ヒドラジド、２−アミノマレイミド、３−アミノマレイミド、４−アミノマレイミド、６−アミノマレイミド、１−（４−アミノフェニル）マレイミド、１−（３−アミノフェニル）マレイミド、４−（マレイミド）フェニルイソシアナート、２−マレイミド酢酸、３−マレイミドプロピオン酸、４−マレイミド酪酸、６−マレイミドヘキサン酸、（Ｎ−［α―マレイミドアセトキシ］スクシンイミドエステル）、（ｍ−マレイミドベンゾイル）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、（スクシンイミジル−４−［マレイミドメチル］シクロヘキサンー１−カルボニル−［６−アミノヘキサン酸］）、（スクシンイミジル−４−［マレイミドメチル］シクロヘキサンー１−カルボン酸）、（ｐ−マレイミドベンゾイル）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、（ｍ−マレイミドベンゾイル）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを例示できる。
担体表面に存在する水酸基やアミノ基にハロアセチル基を導入する化合物としては、クロロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、クロロ酢酸クロリド、ブロモ酢酸クロリド、ブロモ酢酸ブロミド、クロロ酢酸無水物、ブロモ酢酸無水物、ヨード酢酸無水物、２−（ヨードアセトアミド）酢酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、３−（ブロモアセトアミド）プロピオン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、４−（ヨードアセチル）アミノ安息香酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを例示できる。なお担体表面に存在する水酸基やアミノ基にω−アルケニルアルカングリシジルエーテルを反応させた後、ハロゲン化剤でω−アルケニル部位をハロゲン化し活性化する方法も例示できる。ω−アルケニルアルカングリシジルエーテルとしては、アリルグリシジルエーテル、３−ブテニルグリシジルエーテル、４−ペンテニルグリシジルエーテルを例示でき、ハロゲン化剤としてはＮ−クロロスクシンイミド、Ｎ−ブロモスクシンイミド、Ｎ−ヨードスクシンイミドを例示できる。
担体表面に活性基を導入する方法の別の例として、担体表面に存在するカルボキシル基に対して縮合剤と添加剤を用いて活性化基を導入する方法がある。縮合剤としては１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、ジシクロヘキシルカルボジアミド、カルボニルジイミダゾールを例示できる。また添加剤としてはＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）、４−ニトロフェノール、１−ヒドロキシベンズトリアゾールを例示できる。
本発明のＦｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化する際用いる緩衝液としては、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液を例示できる。固定化させるときの反応温度は、５℃から５０℃までの温度範囲の中から活性基の反応性や本発明のＦｃ結合性タンパク質の安定性を考慮の上、適宜設定すればよく、好ましくは１０℃から３５℃の範囲である。
本発明のＦｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化して得られる本発明の吸着剤を用いて、糖鎖を有した抗体を分離するには、例えば、本発明の吸着剤を充填したカラムに糖鎖を有した抗体を含む緩衝液をポンプ等の送液手段を用いて添加することで、糖鎖を有した抗体を本発明の吸着剤に特異的に吸着させた後、適切な溶出液をカラムに添加することで、糖鎖を有した抗体を溶出すればよい。なお、糖鎖を有した抗体を含む緩衝液をカラムに添加する前に、適切な緩衝液を用いてカラムを平衡化すると、糖鎖を有した抗体をより高純度に分離できるため好ましい。緩衝液としてはリン酸緩衝液等、無機塩を成分とした緩衝液を例示することができる。なお緩衝液のｐＨは、ｐＨ３から１０、好ましくはｐＨ５から８である。本発明の吸着剤に吸着した、糖鎖を有した抗体を溶出させるには、糖鎖を有した抗体とリガンド（本発明のＦｃ結合性タンパク質）との相互作用を弱めればよく、具体的には、緩衝液によるｐＨ変化、カウンターペプチド、温度変化、塩濃度変化が例示できる。本発明の吸着剤に吸着した、糖鎖を有した抗体を溶出させるための溶出液の具体例として、本発明の吸着剤に糖鎖を有した抗体を吸着させる際に用いた溶液よりも酸性側の緩衝液があげられる。緩衝液の種類としては酸性側に緩衝能を有するクエン酸緩衝液、グリシン塩酸緩衝液、酢酸緩衝液を例示できる。緩衝液のｐＨは、抗体が有する機能を損なわない範囲で設定すればよく、好ましくはｐＨ２．５から６．０、より好ましくはｐＨ３．０から５．０、さらに好ましくはｐＨ３．３から４．０である。
なお糖鎖を有した抗体を含む溶液から、本発明の吸着剤を用いて前記抗体を分離する際、前記抗体が有する糖鎖構造の違いにより、抗体の溶出位置（溶出フラクション）が異なる。従って、本発明の吸着剤を用いて抗体を分離することで、抗体が有する糖鎖構造の違いを識別することができる。識別可能な糖鎖の構造に特に限定はなく、一例として、ＣＨＯ細胞といった動物由来の細胞や、ピキア酵母やサッカロミセス酵母といった酵母を宿主として抗体を発現させたときに付加される糖鎖や、ヒト抗体が有する糖鎖や、化学合成法で抗体に付加した糖鎖があげられる。また本発明の吸着剤は、抗体が有する糖鎖構造の違いに基づき分離できることから、糖鎖そのものの分離にも利用できる。
なお本発明の吸着剤により抗体の糖鎖構造の違いを識別できると前述したが、当該吸着剤に用いるＦｃ結合性タンパク質として、ＦｃγＲＩＩＩａ以外のＦｃレセプター（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂ、ＦｃＲｎ）を用いた場合でも同様に糖鎖構造の違いを識別できる。
本発明のＦｃ結合性タンパク質は、ヒトＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域中の特定位置におけるアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換したタンパク質である。本発明のＦｃ結合性タンパク質は野生型のヒトＦｃγＲＩＩＩａと比較し熱および酸に対する安定性が向上している。そのため、本発明のＦｃ結合性タンパク質はイムノグロブリンを分離するための吸着剤のリガンドとして有用である。
ヒトＦｃγＲＩＩＩａの概略図である。図中の数字は配列番号１に記載のアミノ酸配列の番号を示している。図中のＳはシグナル配列、ＥＣは細胞外領域、ＴＭは細胞膜貫通領域、Ｃは細胞内領域を示している。 ＦｃＲ５ａ固定化ゲルを用いた抗体の溶出パターンを示した図である。図中のＦｒＡ、ＦｒＢはそれぞれフラクションＡ、フラクションＢの位置を示している。 ＦｃＲ５ａ固定化ゲルで分離した抗体のＡＤＣＣ活性を測定した結果を示した図である。 抗体に付加した糖鎖構造の一覧を示した図である。図中のＮ１からＮ６は表１０のＮ１からＮ６に対応し、Ｍ１、Ｍ２およびＤ１は表１１のＭ１、Ｍ２およびＤ１に対応している。 ＦｃＲ９固定化ゲルを用いた抗体の溶出パターンを示した図である。図中のＦｒＡ、ＦｒＢ、ＦｒＣはそれぞれフラクションＡ、フラクションＢ、フラクションＣの位置を示している。 ＦｃＲ９固定化ゲルで分離した抗体のＡＤＣＣ活性を測定した結果を示した図である。
以下、本発明をさらに詳細に説明するために実施例を示すが、本発明は実施例に限定されるものではない。
実施例１ Ｆｃ結合性タンパク質発現ベクターの作製
（１）配列番号１に記載のヒトＦｃγＲＩＩＩａアミノ酸配列のうち、１７番目のグリシン（Ｇｌｙ）から１９２番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までのアミノ酸配列を基に、ＤＮＡｗｏｒｋｓ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３０，ｅ４３，２００２）を用いて、コドンをヒト型から大腸菌型に変換したヌクレオチド配列を設計した。設計したヌクレオチド配列を配列番号２に示す。
（２）配列番号２に記載の配列を含むポリヌクレオチドを作製するために、配列番号３から２０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを合成し、前記オリゴヌクレオチドを用いて、下記に示す二段階ＰＣＲを行なった。
（２−１）一段階目のＰＣＲは、表１に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、６２℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を１０サイクル繰り返すことでポリヌクレオチドを合成し、これをＦｃＲｐ１とした。なお表１中のＤＮＡミックスとは、配列番号３から２０に記載の配列からなる１８種類のオリゴヌクレオチドをそれぞれ一定量サンプリングし混合した溶液を意味する。
Figure 0006699096
 （２−２）二段階目のＰＣＲは、（２−１）で合成したＦｃＲｐ１を鋳型とし、配列番号２１（５’−ＴＡＧＣＣＡＴＧＧＧＣＡＴＧＣＧＴＡＣＣＧＡＡＧＡＴＣＴＧＣＣＧＡＡＡＧＣ−３’）および配列番号２２（５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＣＣＣＣＴＴＧＧＧＴＡＡＴＧＧＴＡＡＴＡＴＴＣＡＣＧＧＴＣＴＣＧＣＴＧＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして実施した。具体的には、表２に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、６２℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１．５分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。
Figure 0006699096
 （３）（２）で得られたポリヌクレオチドを精製し、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、当該ライゲーション産物を用いて大腸菌ＢＬ２１株（ＤＥ３）を形質転換した。
（４）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンンを含むＬＢ培地にて培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（キアゲン製）を用いて、発現ベクターｐＥＴ−ｅＦｃＲを抽出した。
（５）（４）で作製した発現ベクターｐＥＴ−ｅＦｃＲのうち、ヒトＦｃγＲＩＩＩａをコードするポリヌクレオチドおよびその周辺の領域について、チェーンターミネータ法に基づくＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ ｒｅａｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ライフサイエンス製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７００ ＤＮＡ ａｎａｌｙｚｅｒ（ライフサイエンス製）にてヌクレオチド配列を解析した。なお当該解析の際、配列番号２３（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３’）または配列番号２４（５’−ＴＡＴＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをシークエンス用プライマーとして使用した。
発現ベクターｐＥＴ−ｅＦｃＲで発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号２５に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号２６に、それぞれ示す。なお配列番号２５において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがヒトＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域）であり、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。
実施例２ Ｆｃ結合性タンパク質への変異導入およびライブラリーの作製
実施例１で作製したＦｃ結合性タンパク質発現ベクターｐＥＴ−ｅＦｃＲのうち、Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド部分に、エラープローンＰＣＲによりランダムに変異導入を施した。
（１）鋳型として実施例１で作製したｐＥＴ−ｅＦｃＲを用いてエラープローンＰＣＲを行なった。エラープローンＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９５℃で２分間熱処理し、９５℃で３０秒間の第１ステップ、６０℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３５サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。前記エラープローンＰＣＲによりＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドに良好に変異が導入され、その平均変異導入率は１．２６％であった。
Figure 0006699096
 （２）（１）で得られたＰＣＲ産物を精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ同制限酵素で消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションした。
（３）ライゲーション反応終了後、反応液をエレクトロポレーション法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢプレート培地で培養（３７℃で１８時間）後、プレート上に形成したコロニーをランダム変異体ライブラリーとした。
実施例３ 熱安定化Ｆｃ結合性タンパク質のスクリーニング
（１）実施例２で作製したランダム変異体ライブラリー（形質転換体）を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２ＹＴ液体培地（ペプトン１６ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）２００μＬに接種し、９６穴ディープウェルプレートを用いて、３０℃で一晩振とう培養した。
（２）培養後、５μＬの培養液を５００μＬの０．０５ｍＭのＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、０．３％のグリシンおよび５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２ＹＴ液体培地に植え継ぎ、９６穴ディープウェルプレートを用いて、さらに２０℃で一晩振とう培養した。
（３）培養後、遠心操作によって得られた培養上清を１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で２倍に希釈した。希釈した溶液を４５℃で１０分間熱処理を行なった。
（４）（３）の熱処理を行なったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性と、（３）の熱処理を行なわなかったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を、それぞれ下記に示すＥＬＩＳＡ法にて測定し、熱処理を行なった時のＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を、熱処理を行なわなかったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性で除することで、残存活性を算出した。
（４−１）ヒト抗体であるガンマグロブリン製剤（化学及血清療法研究所製）を、９６穴マイクロプレートのウェルに１μｇ／ｗｅｌｌで固定化し（４℃で１８時間）、固定化終了後、２％（ｗ／ｖ）のＳＫＩＭ ＭＩＬＫ（ＢＤ製）および１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）によりブロッキングした。
（４−２）洗浄緩衝液（０．０５％［ｗ／ｖ］のＴｗｅｅｎ ２０、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４））で洗浄後、抗体結合活性を評価するＦｃ結合性タンパク質を含む溶液を添加し、Ｆｃ結合性タンパク質と固定化ガンマグロブリンとを反応させた（３０℃で１時間）。
（４−３）反応終了後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、１００ｎｇ／ｍＬに希釈したＡｎｔｉ−６Ｈｉｓ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加した。
（４−４）３０℃で１時間反応させ、前記洗浄緩衝液で洗浄した後、ＴＭＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ製）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加した。１Ｍのリン酸を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加することで発色を止め、マイクロプレートリーダー（テカン製）にて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
（５）（４）の方法で約２７００株の形質転換体を評価し、その中から野生型（アミノ酸置換のない）Ｆｃ結合性タンパク質と比較して熱安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体を選択した。前記選択した形質転換体を培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（キアゲン製）を用いて発現ベクターを調製した。
（６）得られた発現ベクターに挿入されたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド領域の配列を実施例１（５）の記載と同様の方法によりヌクレオチド配列を解析し、アミノ酸の変異箇所を特定した。
（５）で選択した形質転換体が発現するＦｃ結合性タンパク質の、野生型（アミノ酸置換のない）Ｆｃ結合性タンパク質に対するアミノ酸置換位置および熱処理後の残存活性（％）をまとめたものを表４に示す。配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、Ｍｅｔ１８Ａｒｇ（この表記は、配列番号１の１８番目のメチオニンがアルギニンに置換されていることを表す、以下同様）、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９Ｌｅｕ、Ｐｈｅ２９Ｓｅｒ、Ｌｅｕ３０Ｇｌｎ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｔｙｒ３５Ａｓｐ、Ｔｙｒ３５Ｓｅｒ、Ｔｙｒ３５Ｈｉｓ、Ｌｙｓ４６Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４６Ｔｈｒ、Ｇｌｎ４８Ｈｉｓ、Ｇｌｎ４８Ｌｅｕ、Ａｌａ５０Ｈｉｓ、Ｔｙｒ５１Ａｓｐ、Ｔｙｒ５１Ｈｉｓ、Ｇｌｕ５４Ａｓｐ、Ｇｌｕ５４Ｇｌｙ、Ａｓｎ５６Ｔｈｒ、Ｇｌｎ５９Ａｒｇ、Ｐｈｅ６１Ｔｙｒ、Ｇｌｕ６４Ａｓｐ、Ｓｅｒ６５Ａｒｇ、Ａｌａ７１Ａｓｐ、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕ、Ｐｈｅ７５Ｓｅｒ、Ｐｈｅ７５Ｔｙｒ、Ａｓｐ７７Ａｓｎ、Ａｌａ７８Ｓｅｒ、Ａｓｐ８２Ｇｌｕ、Ａｓｐ８２Ｖａｌ、Ｇｌｎ９０Ａｒｇ、Ａｓｎ９２Ｓｅｒ、Ｌｅｕ９３Ａｒｇ、Ｌｅｕ９３Ｍｅｔ、Ｔｈｒ９５Ａｌａ、Ｔｈｒ９５Ｓｅｒ、Ｌｅｕ１１０Ｇｌｎ、Ａｒｇ１１５Ｇｌｎ、Ｔｒｐ１１６Ｌｅｕ、Ｐｈｅ１１８Ｔｙｒ、Ｌｙｓ１１９Ｇｌｕ、Ｇｌｕ１２０Ｖａｌ、Ｇｌｕ１２１Ａｓｐ、Ｇｌｕ１２１Ｇｌｙ、Ｐｈｅ１５１Ｓｅｒ、Ｐｈｅ１５１Ｔｙｒ、Ｓｅｒ１５５Ｔｈｒ、Ｔｈｒ１６３Ｓｅｒ、Ｓｅｒ１６７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１６９Ｇｌｙ、Ｐｈｅ１７１Ｔｙｒ、Ａｓｎ１８０Ｌｙｓ、Ａｓｎ１８０Ｓｅｒ、Ａｓｎ１８０Ｉｌｅ、Ｔｈｒ１８５Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１９２Ｌｙｓのいずれかのアミノ酸置換が少なくとも１つ生じているＦｃ結合性タンパク質は、野生型のＦｃ結合性タンパク質と比較し熱安定性が向上しているといえる。
Figure 0006699096
 表４に示す、アミノ酸置換されたＦｃ結合性タンパク質のうち、最も残存活性の高い、Ｖａｌ２７ＧｌｕおよびＴｙｒ３５Ａｓｎのアミノ酸置換が生じたＦｃ結合性タンパク質をＦｃＲ２と命名し、ＦｃＲ２をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターをｐＥＴ−ＦｃＲ２と命名した。ＦｃＲ２のアミノ酸配列を配列番号２７に、ＦｃＲ２をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号２８に示す。なお配列番号２７において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ２のアミノ酸配列（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域に相当）、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号２７において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕのグルタミン酸は４３番目、Ｔｙｒ３５Ａｓｎのアスパラギンは５１番目の位置にそれぞれ存在する。
実施例４ アミノ酸置換Ｆｃ結合性タンパク質の作製
実施例３で判明した、Ｆｃ結合性タンパク質の熱安定性向上に関与するアミノ酸置換を集積することで、さらなる安定性向上を図った。置換アミノ酸の集積は、主にＰＣＲを用いて行ない、以下の（ａ）から（ｃ）に示す３種類のＦｃ結合性タンパク質を作製した。
（ａ）ＦｃＲ２に対し、さらにＰｈｅ７５Ｌｅｕのアミノ酸置換を行なったＦｃＲ３
（ｂ）ＦｃＲ２に対し、さらにＰｈｅ７５ＬｅｕおよびＧｌｕ１２１Ｇｌｙのアミノ酸置換を行なったＦｃＲ４
（ｃ）ＦｃＲ４に対し、さらにＡｓｎ９２Ｓｅｒのアミノ酸置換を行なったＦｃＲ５ａ
以下、各Ｆｃ結合性タンパク質の作製方法を詳細に説明する。
（ａ）ＦｃＲ３
実施例３で明らかになった、熱安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｔｙｒ３５ＡｓｎおよびＰｈｅ７５Ｌｅｕを選択し、それらの置換を野生型のＦｃ結合性タンパク質に集積したＦｃＲ３を作製した。具体的には、ＦｃＲ２をコードするポリヌクレオチドに対してＰｈｅ７５Ｌｅｕを生じさせる変異導入を行なうことにより、ＦｃＲ３を作製した。
（ａ−１）実施例３で取得した、ｐＥＴ−ＦｃＲ２を鋳型としてＰＣＲを実施した。当該ＰＣＲにおけるプライマーは、配列番号２４および配列番号２９（５’−ＡＧＣＣＡＧＧＣＧＡＧＣＡＧＣＴＡＣＣＴＴＡＴＴＧＡＴＧＣＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。ＰＣＲは、表５に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。増幅したＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供し、そのゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（キアゲン製）を用いて精製した。精製したＰＣＲ産物をｍ３Ｆとした。
Figure 0006699096
 （ａ−２）実施例３で取得した、ｐＥＴ−ＦｃＲ２を鋳型とし、配列番号２３および配列番号３０（５’−ＣＣＡＣＣＧＴＣＧＣＣＧＣＡＴＣＡＡＴＡＡＧＧＴＡＧＣＴＧＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ−１）と同様に行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ３Ｒとした。
（ａ−３）（ａ−１）および（ａ−２）で得られた２種類のＰＣＲ産物（ｍ３Ｆ、ｍ３Ｒ）を混合し、表６に示す組成の反応液を調製した。当該反応液を９８℃で５分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を５サイクル行なうＰＣＲを行ない、ｍ３Ｆとｍ３Ｒを連結したＰＣＲ産物ｍ３ｐを得た。
Figure 0006699096
 （ａ−４）（ａ−３）で得られたＰＣＲ産物ｍ３ｐを鋳型とし、配列番号２３および配列番号２４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲを行なった。ＰＣＲは、表７に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。これによりＦｃＲ２に１箇所アミノ酸置換を導入したＦｃＲ３をコードするポリヌクレオチドを作製した。
Figure 0006699096
 （ａ−５）（ａ−４）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ａ−６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して３箇所アミノ酸置換したポリペプチドである、ＦｃＲ３をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴ−ＦｃＲ３を得た。
（ａ−７）ｐＥＴ−ＦｃＲ３のヌクレオチド配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法で行なった。
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃＲ３のアミノ酸配列を配列番号３１に、前記ＦｃＲ３をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号３２に示す。なお配列番号３１において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ３のアミノ酸配列（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域に相当）、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号３１において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕのグルタミン酸は４３番目、Ｔｙｒ３５Ａｓｎのアスパラギンは５１番目、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕのロイシンは９１番目の位置にそれぞれ存在する。
（ｂ）ＦｃＲ４
実施例３で明らかになったＦｃ結合性タンパク質の安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｐｈｅ７５ＬｅｕおよびＧｌｕ１２１Ｇｌｙを選択し、それらの置換を野生型のＦｃ結合性タンパク質に集積したＦｃＲ４を作製した。具体的には、ＦｃＲ２をコードするポリヌクレオチドに対してＰｈｅ７５ＬｅｕおよびＧｌｕ１２１Ｇｌｙを生じさせる変異導入を行なうことにより、ＦｃＲ４を作製した。
（ｂ−１）（ａ−２）と同様の方法でＰＣＲ産物ｍ３Ｒを得た。また実施例３で取得した、Ａｌａ７１Ａｓｐ、Ｐｈｅ７５ＬｅｕおよびＧｌｕ１２１Ｇｌｙのアミノ酸置換を含んだＦｃ結合性タンパク質（表４）を発現するプラスミドを鋳型とし、配列番号２４および配列番号２９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、（ａ−１）と同様の方法でＰＣＲを行なうことでＰＣＲ産物ｍ４Ｒを得た。
（ｂ−２）（ｂ−１）により得られた２種類のＰＣＲ産物（ｍ３Ｒ、ｍ４Ｒ）を混合後、（ａ−３）と同様の方法にてＰＣＲを行ない、ｍ３Ｒとｍ４Ｒを連結した。得られたＰＣＲ産物をｍ４ｐとした。
（ｂ−３）（ｂ−２）で得られたＰＣＲ産物ｍ４ｐを鋳型とし、配列番号２３および配列番号２４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、（ａ−４）と同様の方法でＰＣＲを行なった。これによりＦｃＲ４をコードするポリヌクレオチドを作製した。
（ｂ−４）（ｂ−３）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ｂ−５）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して４箇所アミノ酸置換したポリペプチドである、ＦｃＲ４をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴ−ＦｃＲ４を得た。
（ｂ−６）ｐＥＴ−ＦｃＲ４のヌクレオチド配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法で行なった。
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃＲ４のアミノ酸配列を配列番号３３に、前記ＦｃＲ４をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号３４に示す。なお、配列番号３３において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ４のアミノ酸配列（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域に相当）、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号３３において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕのグルタミン酸は４３番目、Ｔｙｒ３５Ａｓｎのアスパラギンは５１番目、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕのロイシンは９１番目、Ｇｌｕ１２１Ｇｌｙのグリシンは１３７番目の位置にそれぞれ存在する。
（ｃ）ＦｃＲ５ａ
実施例３で明らかになったＦｃ結合性タンパク質の安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕ、Ａｓｎ９２ＳｅｒおよびＧｌｕ１２１Ｇｌｙを選択し、それらの置換を野生型のＦｃ結合性タンパク質に集積したＦｃＲ５ａを作製した。具体的には、（ｂ）で作製したＦｃＲ４をコードするポリヌクレオチドに対してＡｓｎ９２Ｓｅｒを生じさせる変異導入を行なうことにより、ＦｃＲ５ａを作製した。
（ｃ−１）（ｂ）で作製した、ｐＥＴ−ＦｃＲ４を鋳型とし、配列番号２２および配列番号３５（５’−ＧＡＡＴＡＴＣＧＴＴＧＣＣＡＧＡＣＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＡＣＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ−１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ５ａＦとした。
（ｃ−２）（ｂ）で作製したｐＥＴ−ＦｃＲ４を鋳型とし、配列番号２１および配列番号３６（５’−ＧＡＴＣＧＣＴＣＡＧＧＧＴＧＣＴＣＡＧＧＣＴＧＧＴＣＴＧＧＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ−１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ５ａＲとした。
（ｃ−３）（ｃ−１）および（ｃ−２）で得られた２種類のＰＣＲ産物（ｍ５ａＦ、ｍ５ａＲ）を混合後、（ａ−３）と同様の方法にてＰＣＲを行ない、ｍ５ａＦとｍ５ａＲを連結した。得られたＰＣＲ産物をｍ５ａｐとした。
（ｃ−４）（ｃ−３）で得られたＰＣＲ産物ｍ５ａｐを鋳型とし、配列番号２１および配列番号２２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、（ａ−４）と同様の方法でＰＣＲを行なった。これによりＦｃＲ５ａをコードするポリヌクレオチドを作製した。
（ｃ−５）（ｃ−４）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ｃ−６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して５箇所アミノ酸置換したポリペプチドである、ＦｃＲ５ａをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴ−ＦｃＲ５ａを得た。
（ｃ−７）ｐＥＴ−ＦｃＲ５ａのヌクレオチド配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法で行なった。
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃＲ５ａのアミノ酸配列を配列番号３７に、前記ＦｃＲ５ａをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号３８に示す。なお、配列番号３７において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ５ａのアミノ酸配列（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域に相当）、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号３７において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕのグルタミン酸は４３番目、Ｔｙｒ３５Ａｓｎのアスパラギンは５１番目、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕのロイシンは９１番目、Ａｓｎ９２Ｓｅｒのセリンは１０８番目、Ｇｌｕ１２１Ｇｌｙのグリシンは１３７番目の位置にそれぞれ存在する。
実施例５ ＦｃＲ５ａへの変異導入およびライブラリーの作製
実施例４（ｃ）で作製したＦｃＲ５ａをコードするポリヌクレオチド部分に、エラープローンＰＣＲによりランダムに変異導入を施した。
（１）鋳型として実施例４（ｃ）で作製した発現ベクターｐＥＴ−ＦｃＲ５ａを用いてエラープローンＰＣＲを行なった。エラープローンＰＣＲは、鋳型にｐＥＴ−ＦｃＲ５ａを用いた以外は表３に示す組成と同様の反応液を調製後、当該反応液を９５℃で２分間熱処理し、９５℃で３０秒間の第１ステップ、６０℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３５サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。この反応によりＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドに良好に変異が導入された。
（２）（１）で得られたＰＣＲ産物を精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ同制限酵素で消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションした。
（３）ライゲーション反応終了後、反応液をエレクトロポレーション法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢプレート培地で培養後、プレート上に形成したコロニーをランダム変異ライブラリーとした。
実施例６ 熱安定化Ｆｃ結合性タンパク質のスクリーニング
（１）実施例５で作製したランダム変異ライブラリーを実施例３（１）から（２）に記載の方法で培養することでＦｃ結合性タンパク質を発現させた。
（２）培養後、遠心操作によって得られた、Ｆｃ結合性タンパク質を含む培養上清を純水にて２０倍に希釈し、更に０．１Ｍの炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）で２０倍に希釈した。その後、希釈した溶液を４０℃で１５分間熱処理を行ない、１Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ７．０）でｐＨを中性付近に戻した。
（３）（２）の熱処理を行なったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性と、（２）の熱処理を行なわなかったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を、実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法にて測定し、熱処理を行なったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を、熱処理を行なわなかったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性で除することで、残存活性を算出した。
（４）（３）の方法で約２７００株の形質転換体を評価し、その中からＦｃＲ５ａと比較して熱安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体を選択した。選択した形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２ＹＴ液体培地にて培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（キアゲン製）を用いて発現ベクターを調製した。
（５）得られた発現ベクターに挿入されたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド領域の配列を実施例１（５）に記載の方法によりヌクレオチド配列を解析し、アミノ酸の変異箇所を特定した。
（４）で選択した形質転換体が発現するＦｃ結合性タンパク質の、ＦｃＲ５ａに対するアミノ酸置換位置および熱処理後の残存活性（％）をまとめたものを表８に示す。配列番号３７に記載のアミノ酸配列のうち、３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、かつ当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において、Ｐｈｅ２９Ｉｌｅ（この表記は、配列番号１の２９番目（配列番号３７では４５番目）のフェニルアラニンがイソロイシンに置換されていることを表す、以下同様）、Ｐｈｅ２９Ｌｅｕ、Ｇｌｕ３９Ｇｌｙ、Ｇｌｎ４８Ａｒｇ、Ｔｙｒ５１Ｓｅｒ、Ｐｈｅ６１Ｔｙｒ、Ａｓｐ７７Ｇｌｙ、Ａｓｐ８２Ｇｌｕ、Ｇｌｎ９０Ａｒｇ、Ｇｌｎ１１２Ｌｅｕ、Ｖａｌ１１７Ｇｌｕ、Ｌｙｓ１１９Ａｓｎ、Ｌｙｓ１１９Ｇｌｕ、Ｔｈｒ１４０Ｉｌｅ、Ｌｅｕ１４２Ｇｌｎ、Ｐｈｅ１７１Ｓｅｒ、Ｌｅｕ１７５Ａｒｇ、Ａｓｎ１８０ＳｅｒおよびＩｌｅ１８８Ｖａｌのいずれかのアミノ酸置換が少なくとも１つ生じているＦｃ結合性タンパク質は、ＦｃＲ５ａと比較し熱安定性が向上しているといえる。
Figure 0006699096
 表８に示した、ＦｃＲ５ａからアミノ酸置換されたＦｃ結合性タンパク質のうち、Ｐｈｅ２９ＩｌｅおよびＶａｌ１１７Ｇｌｕのアミノ酸置換が生じたＦｃ結合性タンパク質をＦｃＲ７ａと命名し、ＦｃＲ７ａをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターをｐＥＴ−ＦｃＲ７ａと命名した。ＦｃＲ７ａのアミノ酸配列を配列番号３９に、ＦｃＲ７ａをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号４０に示す。なお配列番号３９において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ７ａのアミノ酸配列（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域に相当）、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号３９において、Ｐｈｅ２９Ｉｌｅのイソロイシンは４５番目、Ｖａｌ１１７Ｇｌｕのグルタミン酸は１３３番目の位置にそれぞれ存在する。
実施例７ 改良Ｆｃ結合性タンパク質の作製
実施例６で判明した、Ｆｃ結合性タンパク質の熱安定性向上に関与するアミノ酸置換をＦｃＲ７ａに集積することで、さらなる安定性向上を図った。置換アミノ酸の集積は、主にＰＣＲを用いて行ない、以下の（ａ）から（ｄ）に示す４種類の改良Ｆｃ結合性タンパク質を作製した。
（ａ）ＦｃＲ７ａに対し、さらにＰｈｅ１７１Ｓｅｒのアミノ酸置換を行なったＦｃＲ８
（ｂ）ＦｃＲ８に対し、さらにＧｌｎ４８Ａｒｇのアミノ酸置換を行なったＦｃＲ９
（ｃ）ＦｃＲ８に対し、さらにＧｌｎ４８ＡｒｇおよびＴｙｒ５１Ｓｅｒのアミノ酸置換を行なったＦｃＲ１０
（ｄ）ＦｃＲ１０に対し、さらにＧｌｎ９０Ａｒｇのアミノ酸置換を行なったＦｃＲ１１
以下、各改良Ｆｃ結合性タンパク質の作製方法を詳細に説明する。
（ａ）ＦｃＲ８
実施例６で明らかとなった、熱安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｐｈｅ２９Ｉｌｅ、Ｖａｌ１１７ＧｌｕおよびＰｈｅ１７１Ｓｅｒを選択し、それらの置換をＦｃＲ５ａ（実施例４（ｃ））に集積したＦｃＲ８を作製した。具体的には、ＦｃＲ７ａをコードするポリヌクレオチドに対して、Ｐｈｅ１７１Ｓｅｒを生じさせる変異導入を行なうことにより、ＦｃＲ８を作製した。
（ａ−１）実施例６で取得した、ｐＥＴ−ＦｃＲ７ａを鋳型としてＰＣＲを実施した。当該ＰＣＲにおけるプライマーは、配列番号２３および配列番号４１（５’−ＡＣＣＡＧＣＣＣＡＣＧＧＣＡＧＧＡＡＴＡＧＣＴＧＣＣＧＣＴＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。ＰＣＲは、表５に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で５分間熱処理することで行なった。増幅したＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供し、そのゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（キアゲン製）を用いて精製した。精製したＰＣＲ産物をｍ８Ｆとした。
（ａ−２）実施例６で取得した、ｐＥＴ−ＦｃＲ７ａを鋳型とし、配列番号４２（５’−ＧＡＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＴＡＴＴＣＣＴＧＣＣＧＴＧＧＧＣＴＧ−３’）および配列番号２４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ−１）と同様に行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ８Ｒとした。
（ａ−３）（ａ−１）および（ａ−２）で得られた２種類のＰＣＲ産物（ｍ８Ｆ、ｍ８Ｒ）を混合し、表６に示す組成の反応液を調製した。当該反応液を９８℃で５分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を５サイクル行なうＰＣＲを行ない、ｍ８Ｆとｍ８Ｒを連結したＰＣＲ産物ｍ８ｐを得た。
（ａ−４）（ａ−３）で得られたＰＣＲ産物ｍ８ｐを鋳型とし、配列番号２３および配列番号２４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲを行なった。ＰＣＲは、表７に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。これによりＦｃＲ７ａに１箇所アミノ酸置換を導入したＦｃＲ８をコードするポリヌクレオチドを作製した。
（ａ−５）（ａ−４）で得られたポリヌクレオチドを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ａ−６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、ＦｃＲ５ａに対して３箇所（野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して８箇所）アミノ酸置換したポリペプチドである、ＦｃＲ８をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴ−ＦｃＲ８を得た。
（ａ−７）ｐＥＴ−ＦｃＲ８のヌクレオチド配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法で行なった。
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃＲ８のアミノ酸配列を配列番号４３に、前記ＦｃＲ８をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号４４に示す。なお配列番号４３において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ８のアミノ酸配列（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域に相当）、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号４３において、Ｐｈｅ２９Ｉｌｅのイソロイシンは４５番目、Ｖａｌ１１７Ｇｌｕのグルタミン酸は１３３番目、Ｐｈｅ１７１Ｓｅｒのセリンは１８７番目の位置にそれぞれ存在する。
（ｂ）ＦｃＲ９
実施例６で明らかとなった、熱安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｐｈｅ２９Ｉｌｅ、Ｇｌｎ４８Ａｒｇ、Ｖａｌ１１７ＧｌｕおよびＰｈｅ１７１Ｓｅｒを選択し、それらの置換をＦｃＲ５ａ（実施例４（ｃ））に集積したＦｃＲ９を作製した。具体的には、ＦｃＲ８をコードするポリヌクレオチドに対して、Ｇｌｎ４８Ａｒｇを生じさせる変異導入を行なうことにより、ＦｃＲ９を作製した。
（ｂ−１）（ａ）で作製した、ｐＥＴ−ＦｃＲ８を鋳型とし、配列番号２４および配列番号４５（５’−ＧＴＧＡＣＣＣＴＴＡＡＡＴＧＣＣＧＧＧＧＣＧＣＧＴＡＴＡＧＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ−１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ９Ｆとした。
（ｂ−２）（ａ）で作製したｐＥＴ−ＦｃＲ８を鋳型とし、配列番号２３および配列番号４６（５’−ＣＣＧＧＧＣＴＡＴＡＣＧＣＧＣＣＣＣＧＧＣＡＴＴＴＡＡＧＧＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ−１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ９Ｒとした。
（ｂ−３）（ｂ−１）および（ｂ−２）で得られた２種類のＰＣＲ産物（ｍ９Ｆ、ｍ９Ｒ）を混合後、（ａ−３）と同様の方法にてＰＣＲを行ない、ｍ９Ｆとｍ９Ｒを連結した。得られたＰＣＲ産物をｍ９ｐとした。
（ｂ−４）（ｂ−３）で得られたＰＣＲ産物ｍ９ｐを鋳型とし、配列番号２１および配列番号２２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、（ａ−４）と同様の方法でＰＣＲを行なった。これによりＦｃＲ９をコードするポリヌクレオチドを作製した。
（ｂ−５）（ｂ−４）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ｂ−６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、ＦｃＲ５ａに対して４箇所（野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して９箇所）アミノ酸置換したポリペプチドである、ＦｃＲ９をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴ−ＦｃＲ９を得た。
（ｂ−７）ｐＥＴ−ＦｃＲ９のヌクレオチド配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法で行なった。
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃＲ９のアミノ酸配列を配列番号４７に、前記ＦｃＲ９をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号４８に示す。なお、配列番号４７において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ９のアミノ酸配列（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域に相当）、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号４７において、Ｐｈｅ２９Ｉｌｅのイソロイシンは４５番目、Ｇｌｎ４８Ａｒｇのアルギニンは６４番目、Ｖａｌ１１７Ｇｌｕのグルタミン酸は１３３番目、Ｐｈｅ１７１Ｓｅｒのセリンは１８７番目の位置にそれぞれ存在する。
（ｃ）ＦｃＲ１０
実施例６で明らかとなった、熱安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｐｈｅ２９Ｉｌｅ、Ｇｌｎ４８Ａｒｇ、Ｔｙｒ５１Ｓｅｒ、Ｖａｌ１１７ＧｌｕおよびＰｈｅ１７１Ｓｅｒを選択し、それらの置換をＦｃＲ５ａ（実施例４（ｃ））に集積したＦｃＲ１０を作製した。具体的には、ＦｃＲ８をコードするポリヌクレオチドに対して、Ｇｌｎ４８ＡｒｇおよびＴｙｒ５１Ｓｅｒを生じさせる変異導入を行なうことにより、ＦｃＲ１０を作製した。
（ｃ−１）（ａ）で作製した、ｐＥＴ−ＦｃＲ８を鋳型とし、配列番号２２および配列番号４９（５’−ＴＧＣＣＧＧＧＧＣＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＣＧＧＡＡＧＡＴＡＡＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ−１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ１０Ｆとした。
（ｃ−２）（ａ）で作製したｐＥＴ−ＦｃＲ８を鋳型とし、配列番号２１および配列番号５０（５’−ＧＣＴＡＧＡＣＧＣＧＣＣＣＣＧＧＣＡＴＴＴＡＡＧＧＧＴＣＡＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ−１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ１０Ｒとした。
（ｃ−３）（ｃ−１）および（ｃ−２）で得られた２種類のＰＣＲ産物（ｍ１０Ｆ、ｍ１０Ｒ）を混合後、（ａ−３）と同様の方法にてＰＣＲを行ない、ｍ１０Ｆとｍ１０Ｒを連結した。得られたＰＣＲ産物をｍ１０ｐとした。
（ｃ−４）（ｃ−３）で得られたＰＣＲ産物ｍ１０ｐを鋳型とし、配列番号２１および配列番号２２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、（ａ−４）と同様の方法でＰＣＲを行なった。これによりＦｃＲ１０をコードするポリヌクレオチドを作製した。
（ｃ−５）（ｃ−４）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ｃ−６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、ＦｃＲ５ａに対して５箇所（野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して１０箇所）アミノ酸置換したポリペプチドである、ＦｃＲ１０をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴ−ＦｃＲ１０を得た。
（ｃ−７）ｐＥＴ−ＦｃＲ１０のヌクレオチド配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法で行なった。
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃＲ１０のアミノ酸配列を配列番号５１に、前記ＦｃＲ１０をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号５２に示す。なお、配列番号５１において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ１０のアミノ酸配列（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域に相当）、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号５１において、Ｐｈｅ２９Ｉｌｅのイソロイシンは４５番目、Ｇｌｎ４８Ａｒｇのアルギニンは６４番目、Ｔｙｒ５１Ｓｅｒのセリンは６７番目、Ｖａｌ１１７Ｇｌｕのグルタミン酸は１３３番目、Ｐｈｅ１７１Ｓｅｒのセリンは１８７番目の位置にそれぞれ存在する。
（ｄ）ＦｃＲ１１
実施例６で明らかとなった、熱安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｐｈｅ２９Ｉｌｅ、Ｇｌｎ４８Ａｒｇ、Ｔｙｒ５１Ｓｅｒ、Ｇｌｎ９０Ａｒｇ、Ｖａｌ１１７ＧｌｕおよびＰｈｅ１７１Ｓｅｒを選択し、それらの置換をＦｃＲ５ａ（実施例４（ｃ））に集積したＦｃＲ１１を作製した。具体的には、ＦｃＲ１０をコードするポリヌクレオチドに対して、Ｇｌｎ９０Ａｒｇを生じさせる変異導入を行なうことにより、ＦｃＲ１１を作製した。
（ｄ−１）（ｃ）で作製した、ｐＥＴ−ＦｃＲ１０を鋳型とし、配列番号２２および配列番号５３（５’−ＧＧＣＧＡＡＴＡＴＣＧＴＴＧＣＣＧＧＡＣＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ−１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ１１Ｆとした。
（ｄ−２）（ｃ）で作製したｐＥＴ−ＦｃＲ１０を鋳型とし、配列番号２１および配列番号５４（５’−ＧＧＴＧＣＴＣＡＧＧＣＴＧＧＴＣＣＧＧＣＡＡＣＧＡＴＡＴＴＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ−１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ１１Ｒとした。
（ｄ−３）（ｄ−１）および（ｄ−２）で得られた２種類のＰＣＲ産物（ｍ１１Ｆ、ｍ１１Ｒ）を混合後、（ａ−３）と同様の方法にてＰＣＲを行ない、ｍ１１Ｆとｍ１１Ｒを連結した。得られたＰＣＲ産物をｍ１１ｐとした。
（ｄ−４）（ｄ−３）で得られたＰＣＲ産物ｍ１１ｐを鋳型とし、配列番号２１および配列番号２２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、（ａ−４）と同様の方法でＰＣＲを行なった。これによりＦｃＲ１１をコードするポリヌクレオチドを作製した。
（ｄ−５）（ｄ−４）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ｄ−６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、ＦｃＲ５ａに対して６箇所（野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して１１箇所）アミノ酸置換したポリペプチドである、ＦｃＲ１１をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴ−ＦｃＲ１１を得た。
（ｄ−７）ｐＥＴ−ＦｃＲ１１のヌクレオチド配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法で行なった。
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃＲ１１のアミノ酸配列を配列番号５５に、前記ＦｃＲ１１をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号５６に示す。なお、配列番号５５において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ１１のアミノ酸配列（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域に相当）、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号５５において、Ｐｈｅ２９Ｉｌｅのイソロイシンは４５番目、Ｇｌｎ４８Ａｒｇのアルギニンは６４番目、Ｔｙｒ５１Ｓｅｒのセリンは６７番目、Ｇｌｎ９０Ａｒｇのアルギニンは１０６番目、Ｖａｌ１１７Ｇｌｕのグルタミン酸は１３３番目、Ｐｈｅ１７１Ｓｅｒのセリンは１８７番目の位置にそれぞれ存在する。
実施例８ Ｆｃ結合性タンパク質の酸安定性評価
（１）実施例１で作製した野生型Ｆｃ結合性タンパク質、実施例６で選択したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲ７ａ）、および実施例７で作製したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲ８、ＦｃＲ９、ＦｃＲ１０、ＦｃＲ１１）を発現する形質転換体を、それぞれ５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む３ｍＬの２ＹＴ液体培地に接種し、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。
（２）５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した２０ｍＬの２ＹＴ液体培地（ペプトン１６ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）に前培養液を２００μＬ接種し、３７℃で好気的に振とう培養を行なった。
（３）培養開始１．５時間後、培養温度を２０℃に変更して３０分間振とう培養した。その後、終濃度０．０１ｍＭとなるようＩＰＴＧを添加し、引き続き２０℃で一晩、好気的に振とう培養した。
（４）培養終了後、遠心分離により集菌し、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（タカラバイオ製）を用いてタンパク質抽出液を調製した。
（５）（４）で調製したタンパク質抽出液中の野生型Ｆｃ結合性タンパク質、ＦｃＲ７ａ、ＦｃＲ８、ＦｃＲ９、ＦｃＲ１０およびＦｃＲ１１の抗体結合活性を、実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。この時、市販のＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域（Ｒ＆Ｄテクノロジーズ製：４３２５−ＦＣ−０５０）を用いて検量線を作製し、濃度測定を行なった。
（６）各Ｆｃ結合性タンパク質の濃度が３０μｇ／ｍＬになるよう純水で希釈後、前記希釈した溶液１００μＬと０．１Ｍのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）２００μＬとを混合し、３０℃で２時間静置した。
（７）グリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）による酸処理を行なった後のタンパク質の抗体結合活性と、前記酸処理を行なわなかったときのタンパク質の抗体結合活性を、実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法によって測定した。その後、酸処理を行なった場合の抗体結合活性を、酸処理を行なわなかったときの抗体結合活性で除することで、残存活性を算出した。
結果を表９に示す。今回評価したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲ７ａ、ＦｃＲ８、ＦｃＲ９、ＦｃＲ１０、ＦｃＲ１１）は、野生型Ｆｃ結合性タンパク質と比較し残存活性が高かった。このことから、当該改良Ｆｃ結合性タンパク質の酸安定性が野生型に比べて向上していることが確認された。
Figure 0006699096
 実施例９ システインタグを付加したＦｃＲ５ａ（ＦｃＲ５ａＣｙｓ）の作製
（１）実施例４（ｃ）で作製したｐＥＴ−ＦｃＲ５ａを鋳型としてＰＣＲを実施した。当該ＰＣＲにおけるプライマーは、配列番号２１および配列番号５７（５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＣＣＧＣＡＧＧＴＡＴＣＧＴＴＧＣＧＧＣＡＣＣＣＴＴＧＧＧＴＡＡＴＧＧＴＡＡＴＡＴＴＣＡＣＧＧＴＣＴＣＧＣＴＧＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。ＰＣＲは、表２に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。
（２）（１）で得られたポリヌクレオチドを精製し、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、当該ライゲーション産物を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（３）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地にて培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（キアゲン製）を用いて、発現ベクターｐＥＴ−ＦｃＲ５ａＣｙｓを抽出した。
（４）ｐＥＴ−ＦｃＲ５ａＣｙｓのヌクレオチド配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法で行なった。発現ベクターｐＥＴ−ＦｃＲ５ａＣｙｓで発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号５８に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号５９にそれぞれ示す。なお配列番号５８において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ５ａのアミノ酸配列（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域に相当）、２０９番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２１６番目のグリシン（Ｇｌｙ）までがシステインタグ配列である。
実施例１０ システインタグを付加したＦｃＲ９（ＦｃＲ９Ｃｙｓ）の作製
（１）実施例７（ｂ）で作製したｐＥＴ−ＦｃＲ９を鋳型とし、配列番号２１および配列番号５７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、実施例９（１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。
（２）実施例９（２）と同様な方法で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（３）得られた形質転換体を実施例９（３）と同様な方法で培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（キアゲン製）を用いて、発現ベクターｐＥＴ−ＦｃＲ９Ｃｙｓを抽出した。
（４）ｐＥＴ−ＦｃＲ９Ｃｙｓのヌクレオチド配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法で行なった。
発現ベクターｐＥＴ−ＦｃＲ９Ｃｙｓで発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号６０に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号６１に、それぞれ示す。なお配列番号６０において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ９のアミノ酸配列（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域に相当）、２０９番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２１６番目のグリシン（Ｇｌｙ）までがシステインタグ配列である。
実施例１１ ＦｃＲ５ａＣｙｓの調製
（１）実施例９で作製したＦｃＲ５ａＣｙｓを発現する形質転換体を２Ｌのバッフルフラスコに入った５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む４００ｍＬの２ＹＴ液体培地（ペプトン１６ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）に接種し、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。
（２）グルコース１０ｇ／Ｌ、酵母エキス２０ｇ／Ｌ、リン酸三ナトリウム十二水和物３ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム十二水和物９ｇ／Ｌ、塩化アンモニウム１ｇ／Ｌおよび硫酸カナマイシン５０ｍｇ／Ｌを含む液体培地１．８Ｌに、（１）の培養液１８０ｍＬを接種し、３Ｌ発酵槽（バイオット製）を用いて本培養を行なった。温度３０℃、ｐＨ６．９から７．１、通気量１ＶＶＭ、溶存酸素濃度３０％飽和濃度の条件に設定し、本培養を開始した。ｐＨの制御には酸として５０％リン酸、アルカリとして１４％アンモニア水をそれぞれ使用し、溶存酸素の制御は撹拌速度を変化させることで制御し、撹拌回転数は下限５００ｒｐｍ、上限１０００ｒｐｍに設定した。培養開始後、グルコース濃度が測定できなくなった時点で、流加培地（グルコース２４８．９ｇ／Ｌ、酵母エキス８３．３ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物７．２ｇ／Ｌ）を溶存酸素（ＤＯ）により制御しながら加えた。
（３）菌体量の目安として６００ｎｍの吸光度（ＯＤ６００ｎｍ）が約１５０に達したところで培養温度を２５℃に下げ、設定温度に到達したことを確認した後、終濃度が０．５ｍＭになるようＩＰＴＧを添加し、引き続き２５℃で培養を継続した。
（４）培養開始から約４８時間後に培養を停止し、培養液を４℃で８０００ｒｐｍ、２０分間の遠心分離により菌体を回収した。
（５）回収した菌体を２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に５ｍＬ／１ｇ（菌体）となるように懸濁し、超音波発生装置（インソネーター２０１Ｍ（商品名）、久保田商事製）を用いて、４℃で約１０分間、約１５０Ｗの出力で菌体を破砕した。菌体破砕液は４℃で２０分間、８０００ｒｐｍの遠心分離を２回行ない、上清を回収した。
（６）（５）で得られた上清を、あらかじめ２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した１４０ｍＬのＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＣＭ−６５０Ｍ（東ソー製）を充填したＶＬ３２×２５０カラム（メルクミリポア製）に流速５ｍＬ／分でアプライした。平衡化に用いた緩衝液で洗浄後、０．５Ｍの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で溶出した。
（７）（６）で得られた溶出液を、あらかじめ１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したＩｇＧセファロース（ＧＥヘルスケア製）９０ｍＬを充填したＸＫ２６／２０カラムカラム（ＧＥヘルスケア製）にアプライした。平衡化に用いた緩衝液で洗浄後、０．１Ｍのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）で溶出した。なお溶出液は、溶出液量の１／４量の１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加えることでｐＨを中性付近に戻した。
前記精製により、高純度のＦｃＲ５ａＣｙｓを約２０ｍｇ得た。
実施例１２ ＦｃＲ５ａ固定化ゲルの作製と抗体分離
（１）２ｍＬの分離剤用親水性ビニルポリマー（東ソー製：トヨパール）の表面の水酸基をヨードアセチル基で活性化後、実施例１１で調製したＦｃＲ５ａＣｙｓを４ｍｇ反応させることにより、ＦｃＲ５ａ固定化ゲルを得た。
（２）（１）で調製したＦｃＲ５ａ固定化ゲル０．５ｍＬをφ４．６ｍｍ×７５ｍｍのステンレスカラムに充填した。
（３）ＦｃＲ５ａ固定化ゲルを充填したカラムをＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（ＧＥヘルスケア製）につなげ、２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ４．６）で平衡化した。
（４）２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ４．６）で０．５ｍｇ／ｍＬに希釈したモノクローナル抗体（リツキサン、全薬工業製）を流速０．２ｍＬ／ｍｉｎにて０．４ｍＬアプライした。
（５）流速０．２ｍＬ／ｍｉｎのまま平衡化緩衝液で２５分洗浄後、２０ｍＭのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）によるｐＨグラジエント（２５分で２０ｍＭのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）が１００％となるグラジエント）で吸着したモノクローナル抗体を溶出した。
結果（溶出パターン）を図２に示す。モノクローナル抗体はＦｃＲ５ａと相互作用するため、ゲルろ過クロマトグラフイーのような単一のピークではなく、複数のピークに分離された。
実施例１３ ＦｃＲ５ａ固定化ゲルで分離した抗体のＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害作用）活性測定
（１）実施例１２に記載の溶出条件でモノクローナル抗体を分離し、図２に記載の溶出パターン中のフラクションＡ（ＦｒＡ）およびフラクションＢ（ＦｒＢ）の部分を分取した。
（２）分取したＦｒＡおよびＦｒＢを限外ろ過膜（メルクミリポア社）で濃縮しながら、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）（ｐＨ７.４）に緩衝液を交換した。
（３）濃縮、緩衝液交換したＦｒＡおよびＦｒＢに含まれる抗体、ならびに分離前のモノクローナル抗体の濃度を２８０ｎｍの吸光度で測定した。
（４）以下に示す方法で、ＦｒＡおよびＦｒＢに含まれる抗体が有するＡＤＣＣ活性を測定した。
（４−１）１．４ｍＬのＬｏｗ ＩｇＧ Ｓｅｒｕｍと３３．６ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地とを混合して調製したＡＤＣＣ Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒを用いて、ＦｒＡおよびＦｒＢに含まれる抗体ならびに分離前のモノクローナル抗体を３μｇ／ｍＬから１／３希釈で８段階の希釈系列を調製した。
（４−２）Ｒａｊｉ細胞をＡＤＣＣ Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒにて約５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、９６ｗｅｌｌプレート（３９１７：コーニング社）に２５μＬ／ｗｅｌｌで加えた。
（４−３）Ｒａｊｉ細胞を加えたｗｅｌｌに（４−１）で調製したフラクションＡ、フラクションＢ、分離前のモノクローナル抗体、ブランク（ＡＤＣＣ Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒのみ）を２５μＬ／ｗｅｌｌ加えた。
（４−４）Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞（プロメガ製）をＡＤＣＣ Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒにて約３．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、Ｒａｊｉ細胞および抗体を加えたｗｅｌｌに２５μＬ／ｗｅｌｌで加えた。その後、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２、３７℃）にて６時間静置した。
（４−５）９６ｗｅｌｌプレートを室温で５分から３０分静置した後、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（プロメガ製）を７５μＬ／ｗｅｌｌで加えた。室温で３０分反応させたのち、ＧｌｏＭａｘ Ｍｕｌｔｉ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ製）で発光を測定した。
実施例１２に記載の溶出条件で分取したＦｒＡおよびＦｒＢならびに分離前のモノクローナル抗体の発光強度を比較した結果を図３に示す。なお図３の結果は、測定した発光強度からブランクの発光強度を引いた値を示しており、発光強度が高いほど、ＡＤＣＣ活性が高いことを意味している。
ＦｒＡは分離前のモノクローナル抗体とほぼ同程度の発光強度であることからＡＤＣＣ活性はほぼ同等といえる。一方、ＦｒＢは分離前のモノクローナル抗体と比べて約３．２倍、ＦｒＡに比べても２．５倍に向上していた。つまり、ＦｒＢは分離前のモノクローナル抗体およびＦｒＡと比べてＡＤＣＣ活性が高いことが分かる。
実施例１４ ＦｃＲ５ａ固定化ゲルで分離した抗体の糖鎖解析
（１）実施例１３（１）で分取したＦｒＡおよびＦｒＢ、ならびに分離前のモノクローナル抗体を１００℃、１０分の熱処理により変性後、グリコアミダーゼＡ／ペプシンおよびプロナーゼで順次処理し、ゲルろ過法による精製操作を経て糖鎖画分を取得した。
（２）（１）で得られた糖鎖をエバポレーターにて濃縮・乾燥後、酢酸溶媒下、２−アミノピリジン、次いでジメチルアミンボランを順次作用させて蛍光ラベル化糖鎖とし、ゲルろ過法により精製した。
（３）（２）で得られた蛍光ラベル化糖鎖を陰イオン交換カラム（ＴＳＫｇｅｌ ＤＥＡＥ−５ＰＷ、φ７．５ｍｍ×７．５ｃｍ：東ソー製）にて、中性糖鎖画分とモノシアリル化糖鎖画分に分離した。
（４）（３）で得られた中性糖鎖画分とモノシアリル化糖鎖画分をＯＤＳカラムを用いて、個々の糖鎖に単離した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析により単離した糖鎖の分子量情報を取得後、ＯＤＳカラムクロマトグラフのリテンションタイムと照らし合わせて糖鎖構造を帰属した。
帰属した糖鎖構造（Ｎ１からＮ６、Ｍ１、Ｍ２およびＤ１）を図４に、中性糖鎖の組成比を表１０に、モノシアリル化およびジシアリル化糖鎖の組成比を表１１にそれぞれ示す。糖鎖構造Ｎ４＋Ｎ４’およびＮ６を有した抗体は、分離前およびＦｒＡと比較してＦｒＢで増加していた。一方、Ｎ１、Ｎ２＋Ｎ３’、Ｎ３およびＮ５を有した抗体は、分離前およびＦｒＡと比較してＦｒＢで減少していた。すなわちＮ４＋Ｎ４’およびＮ６糖鎖を持つ抗体はＦｃＲ５ａと強く結合し、Ｎ１、Ｎ２＋Ｎ３’、Ｎ３およびＮ５を有した抗体はＦｃＲ５ａとの結合が弱いことがわかる。またＭ１、Ｍ２およびＤ１を有した抗体は、分離前およびＦｒＡと比較してＦｒＢで増加していた。すなわちＭ１、Ｍ２およびＤ１糖鎖を持つ抗体はＦｃＲ５ａと強く結合することがわかる。
Figure 0006699096
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 前記結果と実施例１３の結果とを合わせると、分離前およびＦｒＡと比較してＦｒＢで増加した糖鎖構造を有する抗体はＡＤＣＣ活性が高いことがわかる。すなわち、ＦｃＲ５ａ固定化ゲルは、抗体が有する糖鎖構造の違いを識別でき、かつ前記識別に基づきＡＤＣＣ活性の高い抗体を分離することができることがわかる。
実施例１５ ＦｃＲ９固定化ゲルの作製と抗体分離
（１）実施例１０で作製したＦｃＲ９Ｃｙｓを発現する形質転換体を用いて、実施例１１
（１）から（４）と同様な方法で培養を行なった。
（２）実施例１１と同様な方法で精製し、高純度のＦｃＲ９Ｃｙｓを約１０ｍｇ得た。
（３）実施例１２（１）と同様な方法でＦｃＲ９Ｃｙｓ固定化ゲルを得た後、当該ゲル０．５ｍＬをφ４．０ｍｍ×４０ｍｍのステンレスカラムに充填した。
（４）ＦｃＲ９固定化ゲルを充填したカラムを高速液体クロマトグラフィー装置（東ソー製）につなげ、２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で平衡化した。
（５）ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）（ｐＨ７.４）で４．０ｍｇ／ｍＬに希釈したモノクローナル抗体（リツキサン、全薬工業製）を流速０．３ｍＬ／ｍｉｎにて０．１５ｍＬアプライした。
（６）流速０．３ｍＬ／ｍｉｎのまま平衡化緩衝液で２分洗浄後、１０ｍＭのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）によるｐＨグラジエント（３８分で１０ｍＭのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）が１００％となるグラジエント）で吸着したモノクローナル抗体を溶出した。
結果（溶出パターン）を図５に示す。モノクローナル抗体はＦｃＲ９と相互作用するため、ゲルろ過クロマトグラフィーのような単一のピークではなく、複数のピークに分離された。
実施例１６ ＦｃＲ９固定化ゲルで分離した抗体のＡＤＣＣ活性測定
（１）実施例１５の溶出条件でモノクローナル抗体を分離し、図５に記載の溶出パターン中のフラクションＡ（ＦｒＡ）、フラクションＢ（ＦｒＢ）およびフラクションＣ（ＦｒＣ）の部分を分取した。
（２）ＦｒＡ、ＦｒＢおよびＦｒＣに含まれる抗体、ならびに分離前のモノクローナル抗体の濃度を２８０ｎｍの吸光度で測定し、実施例１３（４）と同様な方法でＡＤＣＣ活性を測定した。
結果を図６に示す。なお図６の結果は、測定した発光強度からブランクの発光強度を引いた値を示しており、発光強度が高いほど、ＡＤＣＣ活性が高いことを意味している。
ＦｒＡおよびＦｒＢは分離前のモノクローナル抗体よりＡＤＣＣ活性がやや低いといえる。一方、ＦｒＣは分離前のモノクローナル抗体と比べてＡＤＣＣ活性が約１．６倍に向上していた。つまり溶出の遅いＦｒＣは溶出の早いＦｒＡおよびＦｒＢならびに分離前のモノクローナル抗体と比べてＡＤＣＣ活性が高いことがわかる。また実施例１４より、本発明のＦｃ結合性タンパク質を固定化したゲルは、抗体が有する糖鎖構造の違いを識別できることから、ＦｒＣに含まれるＦｃＲ９と強く結合する抗体は、高いＡＤＣＣ活性を有した糖鎖構造を有する抗体であることが示唆される。
実施例１７ ＦｃＲ９への変異導入およびライブラリーの作製
実施例７（ｂ）で作製したＦｃＲ９をコードするポリヌクレオチド部分に、エラープローンＰＣＲによりランダムに変異導入を施した。
（１）鋳型として実施例７（ｂ）で作製した発現ベクターｐＥＴ−ＦｃＲ９を用いてエラープローンＰＣＲを行なった。エラープローンＰＣＲは、ｐＥＴ−ＦｃＲ９を鋳型とし、配列番号２３および配列番号２４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとした他は表３に示す組成と同様の反応液を調製後、当該反応液を９５℃で２分間熱処理し、９５℃で３０秒間の第１ステップ、５０℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３５サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。この反応によりＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドに良好に変異が導入された。
（２）（１）で得られたＰＣＲ産物を精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ同制限酵素で消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションした。
（３）ライゲーション反応終了後、反応液をエレクトロポレーション法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢプレート培地で培養後、プレート上に形成したコロニーをランダム変異ライブラリーとした。
実施例１８ アルカリ安定化Ｆｃ結合性タンパク質のスクリーニング
（１）実施例１７で作製したランダム変異ライブラリーを実施例３（１）から（２）に記載の方法で培養することでＦｃ結合性タンパク質を発現させた。
（２）培養後、遠心操作によって得られた、Ｆｃ結合性タンパク質を含む培養上清を純水にて１０倍に希釈し、等量の６０ｍＭの水酸化ナトリウム溶液と混合し、３０℃で１．５時間静置することでアルカリ処理した。その後、４倍量の１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．０）でｐＨを中性付近に戻した。
（３）（２）に記載のアルカリ処理を行なったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性と、（２）に記載のアルカリ処理を行なわなかったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を、実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法にてそれぞれ測定し、アルカリ処理を行なったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を、アルカリ処理を行なわなかったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性で除することで、残存活性を算出した。
（４）（３）の方法で約２７００株の形質転換体を評価し、その中からＦｃＲ９と比較して安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体を選択した。選択した形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２ＹＴ液体培地にて培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（キアゲン製）を用いて発現ベクターを調製した。
（５）得られた発現ベクターに挿入されたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド領域の配列を実施例１（５）に記載の方法によりヌクレオチド配列を解析し、アミノ酸の変異箇所を特定した。
（４）で選択した形質転換体が発現するＦｃ結合性タンパク質の、ＦｃＲ９に対するアミノ酸置換位置およびアルカリ処理後の残存活性（％）をまとめたものを表１２に示す。配列番号３７に記載のアミノ酸配列のうち、３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、かつ当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において、Ｍｅｔ１８Ｉｌｅ（この表記は、配列番号１の１８番目（配列番号３７では３４番目）のメチオニンがイソロイシンに置換されていることを表す、以下同様）、Ｇｌｕ２１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ２１Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３Ｍｅｔ、Ｇｌｎ３３Ｐｒｏ、Ｌｙｓ４６Ｇｌｕ、Ｐｈｅ６１Ｔｙｒ、Ｇｌｕ６４Ｇｌｙ、Ｓｅｒ６５Ａｒｇ、Ｓｅｒ６８Ｐｒｏ、Ａｓｐ７７Ｖａｌ、Ａｓｐ７７Ｇｌｕ、Ｖａｌ８１Ｍｅｔ、Ａｓｐ８２Ａｌａ、Ｇｌｎ１０１Ｌｅｕ、Ｇｌｕ１０３Ｖａｌ、Ｈｉｓ１０５Ａｒｇ、Ｇｌｕ１２０Ｖａｌ、Ｓｅｒ１７８ＡｒｇおよびＡｓｎ１８０Ｌｙｓのいずれかのアミノ酸置換が少なくとも１つ生じているＦｃ結合性タンパク質は、ＦｃＲ９と比較しアルカリ安定性が向上しているといえる。
Figure 0006699096
 実施例１９ 改良Ｆｃ結合性タンパク質の作製
実施例１８で判明した、Ｆｃ結合性タンパク質のアルカリ安定性向上に関与するアミノ酸置換をＦｃＲ９に集積することで、さらなる安定性向上を図った。置換アミノ酸の集積は、主にＰＣＲを用いて行ない、以下の（ａ）および（ｂ）に示す２種類の改良Ｆｃ結合性タンパク質を作製した。
（ａ）ＦｃＲ９に対し、さらにＧｌｕ２１Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３ＭｅｔおよびＳｅｒ１７８Ａｒｇのアミノ酸置換を行なったＦｃＲ１２
（ｂ）ＦｃＲ９に対し、さらにＧｌｕ２１Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３Ｍｅｔ、Ｓｅｒ６８ＰｒｏおよびＳｅｒ１７８Ａｒｇのアミノ酸置換を行なったＦｃＲ１３
以下、各改良Ｆｃ結合性タンパク質の作製方法を詳細に説明する。
（ａ）ＦｃＲ１２
実施例１８で明らかとなった、アルカリ安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｇｌｕ２１Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３ＭｅｔおよびＳｅｒ１７８Ａｒｇを選択し、それらの置換をＦｃＲ９（実施例７（ｂ））に集積したＦｃＲ１２を作製した。具体的には、実施例１８で得られたＳｅｒ１７８Ａｒｇの変異を含んだポリヌクレオチドに対して、Ｇｌｕ２１ＧｌｙおよびＬｅｕ２３Ｍｅｔを生じさせる変異導入を行なうことにより、ＦｃＲ１２
を作製した。
（ａ−１）実施例１８で取得した、ＦｃＲ９にＳｅｒ１７８Ａｒｇの変異を含んだＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを鋳型としてＰＣＲを実施した。当該ＰＣＲにおけるプライマーは、配列番号２４および配列番号６２（５’−ＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＧＣＡＴＧＣＧＴＡＣＣＧＧＡＧＡＴＡＴＧＣＣＧＡＡＡＧＣＧＧＡＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。ＰＣＲは、鋳型とプライマー以外は表７に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で５分間熱処理することで行なった。増幅したＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供し、そのゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（キアゲン製）を用いて精製した。精製したＰＣＲ産物をｍ１２ｐとした。
（ａ−２）（ａ−１）で得られたｍ１２ｐを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ａ−３）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、ＦｃＲ９に対して３箇所（野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して１２箇所）アミノ酸置換したポリペプチドである、ＦｃＲ１２をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴ−ＦｃＲ１２を得た。
（ａ−４）ｐＥＴ−ＦｃＲ１２のヌクレオチド配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法で行なった。
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃＲ１２のアミノ酸配列を配列番号６３に、前記ＦｃＲ１２をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号６４に示す。なお配列番号６３において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ１２のアミノ酸配列（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域に相当）、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号６３において、Ｇｌｕ２１Ｇｌｙのグリシンは３７番目、Ｌｅｕ２３Ｍｅｔのメチオニンは３９番目、Ｖａｌ２７Ｇｌｕのグルタミン酸は４３番目、Ｐｈｅ２９Ｉｌｅのイソロイシンは４５番目、Ｔｙｒ３５Ａｓｎのアスパラギンは５１番目、Ｇｌｎ４８Ａｒｇのアルギニンは６４番目、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕのロイシンは９１番目、Ａｓｎ９２Ｓｅｒのセリンは１０８番目、Ｖａｌ１１７Ｇｌｕのグルタミン酸は１３３番目、Ｇｌｕ１２１Ｇｌｙのグリシンは１３７番目、Ｐｈｅ１７１Ｓｅｒのセリンは１８７番目およびＳｅｒ１７８Ａｒｇのアルギニンは１９４番目の位置にそれぞれ存在する。
（ｂ）ＦｃＲ１３
実施例１８で明らかとなった、アルカリ安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｇｌｕ２１Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３Ｍｅｔ、Ｓｅｒ６８ＰｒｏおよびＳｅｒ１７８Ａｒｇを選択し、それらの置換をＦｃＲ９（実施例７（ｂ））に集積したＦｃＲ１３を作製した。具体的には、ＦｃＲ１２をコードするポリヌクレオチドに対して、Ｓｅｒ６８Ｐｒｏを生じさせる変異導入を行なうことにより、ＦｃＲ１３を作製した。
（ｂ−１）（ａ）で作製した、ｐＥＴ−ＦｃＲ１２を鋳型とし、配列番号２４および配列番号６５（５’−ＣＡＣＡＡＴＧＡＡＡＧＣＣＴＧＡＴＴＣＣＣＡＧＣＣＡＧＧＣＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、表５に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で５分間熱処理することで行なった。増幅したＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供し、そのゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（キアゲン製）を用いて精製した。精製したＰＣＲ産物をｍ１３Ｆとした。
（ｂ−２）（ａ）で作製したｐＥＴ−ＦｃＲ１２を鋳型とし、配列番号６２および配列番号６６（５’−ＧＴＡＧＣＴＧＣＴＣＧＣＣＴＧＧＣＴＧＧＧＡＡＴＣＡＧＧＣＴ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ｂ−１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ１３Ｒとした。
（ｂ−３）（ｂ−１）および（ｂ−２）で得られた２種類のＰＣＲ産物（ｍ１３Ｆ、ｍ１３Ｒ）を混合し、表６に示す組成の反応液を調製した。当該反応液を９８℃で５分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を５サイクル行ない、最後に７２℃で５分間熱処理するＰＣＲを行ない、ｍ１３Ｆとｍ１３Ｒを連結した。得られたＰＣＲ産物をｍ１３ｐとした。
（ｂ−４）（ｂ−３）で得られたＰＣＲ産物ｍ１３ｐを鋳型とし、配列番号２３および配列番号２４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、ＰＣＲを行なった。ＰＣＲは、表７に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。これによりＦｃＲ１２に１箇所アミノ酸置換を導入したＦｃＲ１３をコードするポリヌクレオチドを作製した。
（ｂ−５）（ｂ−４）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ｂ−６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、ＦｃＲ９に対して４箇所（野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して１３箇所）アミノ酸置換したポリペプチドである、ＦｃＲ１３をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴ−ＦｃＲ１３を得た。
（ｂ−７）ｐＥＴ−ＦｃＲ１３のヌクレオチド配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法で行なった。
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃＲ１３のアミノ酸配列を配列番号６７に、前記ＦｃＲ１３をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号６８に示す。なお、配列番号６７において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ１３のアミノ酸配列（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域に相当）、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号６７において、Ｇｌｕ２１Ｇｌｙのグリシンは３７番目、Ｌｅｕ２３Ｍｅｔのメチオニンは３９番目、Ｖａｌ２７Ｇｌｕのグルタミン酸は４３番目、Ｐｈｅ２９Ｉｌｅのイソロイシンは４５番目、Ｔｙｒ３５Ａｓｎのアスパラギンは５１番目、Ｇｌｎ４８Ａｒｇのアルギニンは６４番目、Ｓｅｒ６８Ｐｒｏのプロリンは８４番目、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕのロイシンは９１番目、Ａｓｎ９２Ｓｅｒのセリンは１０８番目、Ｖａｌ１１７Ｇｌｕのグルタミン酸は１３３番目、Ｇｌｕ１２１Ｇｌｙのグリシンは１３７番目、Ｐｈｅ１７１Ｓｅｒのセリンは１８７番目およびＳｅｒ１７８Ａｒｇのアルギニンは１９４番目の位置にそれぞれ存在する。
実施例２０ Ｆｃ結合性タンパク質のアルカリ安定性評価
（１）実施例４（ｃ）で作製したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲ５ａ）、実施例７（ｂ）で作製したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲ９）、および実施例１９で作製したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲ１２、ＦｃＲ１３）を発現する形質転換体を、実施例８の（１）から（４）に記載の方法で培養し、タンパク質を抽出することでＦｃＲ５ａ、ＦｃＲ９、ＦｃＲ１２およびＦｃＲ１３を調製した。
（２）（１）で調製したタンパク質抽出液中のＦｃＲ５ａ、ＦｃＲ９、ＦｃＲ１２およびＦｃＲ１３の抗体結合活性を、実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。この時、精製し定量したＦｃＲ９を用いて検量線を作製し、濃度測定を行なった。
（３）各Ｆｃ結合性タンパク質の濃度が３０μｇ／ｍＬになるよう純水で希釈後、前記希釈した溶液５０μＬと４０ｍＭの水酸化ナトリウム溶液５０μＬとを混合し、３０℃で２時間静置することでアルカリ処理した。その後、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）を４倍量加えることで中和し、Ｆｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を、実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法によって測定した。
（４）アルカリ処理を行なった場合の抗体結合活性をアルカリ処理を行なわなかったときの抗体結合活性で除することで、残存活性を算出しアルカリ安定性を評価した。
結果を表１３に示す。実施例１９で作製したＦｃＲ１２、ＦｃＲ１３はＦｃＲ５ａ、ＦｃＲ９と比較し残存活性が高いことから、ＦｃＲ１２およびＦｃＲ１３のアルカリ安定性がＦｃＲ５ａ、ＦｃＲ９に比べて向上していることが確認された。
Figure 0006699096
 実施例２１ ＦｃＲ１３への変異導入およびライブラリーの作製
実施例１９（ｂ）で作製したＦｃＲ１３をコードするポリヌクレオチド部分に、エラープローンＰＣＲによりランダムに変異導入を施した。
（１）鋳型として実施例１９（ｂ）で作製した発現ベクターｐＥＴ−ＦｃＲ１３を用いてエラープローンＰＣＲを行なった。エラープローンＰＣＲは、ｐＥＴ−ＦｃＲ１３を鋳型とし、配列番号２３および配列番号２４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとした他は表３に示す組成と同様の反応液を調製後、当該反応液を９５℃で２分間熱処理し、９５℃で３０秒間の第１ステップ、５０℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３５サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。この反応によりＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドに良好に変異が導入された。
（２）（１）で得られたＰＣＲ産物を精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ同制限酵素で消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションした。
（３）ライゲーション反応終了後、反応液をエレクトロポレーション法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢプレート培地で培養後、プレート上に形成したコロニーをランダム変異ライブラリーとした。
実施例２２ アルカリ安定化Ｆｃ結合性タンパク質のスクリーニング
（１）実施例２１で作製したランダム変異ライブラリーを実施例３（１）から（２）に記載の方法で培養することでＦｃ結合性タンパク質を発現させた。
（２）培養後、遠心操作によって得られた、Ｆｃ結合性タンパク質を含む培養上清を以下に示す方法でアルカリ処理した。なおアルカリ処理後は、４倍量の１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．０）でｐＨを中性付近に戻した。
（ｉ）純水にて５倍に希釈し、等量の８０ｍＭの水酸化ナトリウム溶液と混合した後、３０℃で２時間静置
（ｉｉ）純水にて２０倍に希釈し、等量の６０ｍＭの水酸化ナトリウム溶液と混合した後、３０℃で２時間静置
（３）（２）に記載のアルカリ処理を行なったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性と、（２）に記載のアルカリ処理を行なわなかったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を、実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法にてそれぞれ測定した。その後、アルカリ処理を行なったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を、アルカリ処理を行なわなかったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性で除することで、残存活性を算出した。
（４）（３）の方法で約２７００株の形質転換体を評価し、その中からＦｃＲ１３と比較して安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体を選択した。選択した形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２ＹＴ液体培地にて培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（キアゲン製）を用いて発現ベクターを調製した。
（５）得られた発現ベクターに挿入されたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド領域の配列を実施例１（５）に記載の方法によりヌクレオチド配列を解析し、アミノ酸の変異箇所を特定した。
（４）で選択した形質転換体が発現するＦｃ結合性タンパク質の、ＦｃＲ１３に対するアミノ酸置換位置およびアルカリ処理後の残存活性（％）をまとめたものを表１４（アルカリ処理は（ｉ）の条件）および表１５（アルカリ処理は（ｉｉ）の条件）に示す。配列番号３７に記載のアミノ酸配列のうち、３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基（配列番号１の１７番目から１９２番目に該当）を含み、かつ当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において、Ｍｅｔ１８Ｌｙｓ（この表記は、配列番号１の１８番目（配列番号３７では３４番目）のメチオニンがリジンに置換されていることを表す、以下同様）、Ｍｅｔ１８Ｔｈｒ、Ｌｅｕ（Ｍｅｔ）２３Ａｒｇ（この表記は配列番号１番の２３番目（配列番号３７では３９番目）のロイシンが一度メチオニンに置換されさらにアルギニンに置換されたことを表す、以下同様）、Ｌｙｓ４６Ｉｌｅ、Ｇｌｎ（Ａｒｇ）４８Ｔｒｐ、Ｔｙｒ５１Ｈｉｓ、Ｔｙｒ５１Ａｓｎ、Ｇｌｕ５４Ａｓｐ、Ｇｌｕ５４Ｇｌｙ、Ａｓｎ５６Ｓｅｒ、Ａｓｎ５６Ｉｌｅ、Ｐｈｅ６１Ｌｅｕ、Ｐｈｅ６１Ｔｙｒ、Ｇｌｕ６４Ｇｌｙ、Ｉｌｅ６７Ｌｅｕ、Ｓｅｒ６９Ａｓｎ、Ａｌａ７１Ｔｈｒ、Ｔｙｒ７４Ｐｈｅ、Ｐｈｅ（Ｌｅｕ）７５Ａｒｇ、Ａｌａ７８Ｇｌｕ、Ｖａｌ８１Ｇｌｕ、Ａｓｐ８２Ｇｌｕ、Ｇｌｕ８６Ａｓｐ、Ｇｌｎ９０Ｌｅｕ、Ｌｅｕ９３Ｇｌｎ、Ｐｒｏ１１４Ｌｅｕ、Ｌｙｓ１１９Ａｓｎ、Ｌｙｓ１１９Ｔｙｒ、Ｈｉｓ１２５Ｇｌｎ、Ｓｅｒ１３０Ｔｈｒ、Ｌｙｓ１３８Ａｒｇ、Ｇｌｎ１４３Ｈｉｓ、Ｇｌｙ１４７Ｖａｌ、Ｌｙｓ１４９Ｍｅｔ、Ｐｈｅ１５１Ｔｙｒ、Ｈｉｓ１５３Ｔｙｒ、Ｔｙｒ１５８Ｐｈｅ、Ｌｙｓ１６１Ａｒｇ、Ｓｅｒ１６９Ｇｌｙ、Ａｓｎ１８０Ｓｅｒ、Ｔｈｒ１８５Ａｌａ、Ａｓｎ１８７Ｉｌｅ、Ａｓｎ１８７ＬｙｓおよびＴｈｒ１９１Ａｌａのいずれかのアミノ酸置換が少なくとも１つ生じているＦｃ結合性タンパク質は、ＦｃＲ１３と比較しアルカリ安定性が向上しているといえる。
Figure 0006699096
Figure 0006699096
 表１５に示した、ＦｃＲ１３からアミノ酸置換されたＦｃ結合性タンパク質のうち、Ｇｌｙ１４７Ｖａｌのアミノ酸置換が生じたＦｃ結合性タンパク質をＦｃＲ１４と命名し、ＦｃＲ１４をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターをｐＥＴ−ＦｃＲ１４と命名した。ＦｃＲ１４のアミノ酸配列を配列番号６９に、ＦｃＲ１４をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号７０に示す。なお配列番号６９において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ１４のアミノ酸配列（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域に相当）、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号６９において、Ｇｌｕ２１Ｇｌｙのグリシンは３７番目、Ｌｅｕ２３Ｍｅｔのメチオニンは３９番目、Ｖａｌ２７Ｇｌｕのグルタミン酸は４３番目、Ｐｈｅ２９Ｉｌｅのイソロイシンは４５番目、Ｔｙｒ３５Ａｓｎのアスパラギンは５１番目、Ｇｌｎ４８Ａｒｇのアルギニンは６４番目、Ｓｅｒ６８Ｐｒｏのプロリンは８４番目、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕのロイシンは９１番目、Ａｓｎ９２Ｓｅｒのセリンは１０８番目、Ｖａｌ１１７Ｇｌｕのグルタミン酸は１３３番目、Ｇｌｕ１２１Ｇｌｙのグリシンは１３７番目、Ｇｌｙ１４７Ｖａｌのバリンは１６３番目、Ｐｈｅ１７１Ｓｅｒのセリンは１８７番目およびＳｅｒ１７８Ａｒｇのアルギニンは１９４番目の位置にそれぞれ存在する。
実施例２３ 改良Ｆｃ結合性タンパク質の作製
実施例２２で明らかとなった、Ｆｃ結合性タンパク質のアルカリ安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｔｙｒ５１ＨｉｓおよびＧｌｕ５４Ａｓｐを選択し、それらの置換をＦｃＲ１４に集積することで、改良Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲ１６）を作製した。以下、作製方法を詳細に説明する。
（１）実施例２２で得られた、ｐＥＴ−ＦｃＲ１４を鋳型とし、配列番号２４および配列番号７１（５’−ＴＧＣＣＧＧＧＧＣＧＣＧＣＡＴＡＧＣＣＣＧＧＡＴＧＡＴＡＡＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、表５に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で５分間熱処理することで行なった。増幅したＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供し、そのゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（キアゲン製）を用いて精製した。精製したＰＣＲ産物をｍ１６Ｆとした。
（２）実施例２２で得られたｐＥＴ−ＦｃＲ１４を鋳型とし、配列番号２３および配列番号７２（５’−ＧＧＴＧＣＴＧＴＴＡＴＣＡＴＣＣＧＧＧＣＴＡＴＧＣＧＣＧＣＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ１６Ｒとした。
（３）（１）および（２）で得られた２種類のＰＣＲ産物（ｍ１６Ｆ、ｍ１６Ｒ）を混合し、表６に示す組成の反応液を調製した。当該反応液を９８℃で５分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を５サイクル行ない最後に７２℃で５分間熱処理するＰＣＲを行ない、ｍ１６Ｆとｍ１６Ｒを連結したＰＣＲ産物ｍ１６ｐを得た。
（４）（３）で得られたＰＣＲ産物ｍ１６ｐを鋳型とし、配列番号２３および配列番号２４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、ＰＣＲを行なった。ＰＣＲは、表７に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない最後に７２℃で５分間熱処理するＰＣＲを行なった。これによりＦｃＲ１４に２箇所アミノ酸置換を導入したＦｃＲ１６をコードするポリヌクレオチドを作製した。
（５）（４）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、ＦｃＲ１４に対して２箇所（野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して１６箇所）アミノ酸置換したポリペプチドである、ＦｃＲ１６をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴ−ＦｃＲ１６を得た。
（７）ｐＥＴ−ＦｃＲ１６のヌクレオチド配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法で行なった。
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃＲ１６のアミノ酸配列を配列番号７３に、前記ＦｃＲ１６をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号７４に示す。なお、配列番号７３において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ１３のアミノ酸配列（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域に相当）、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号７３において、Ｇｌｕ２１Ｇｌｙのグリシンは３７番目、Ｌｅｕ２３Ｍｅｔのメチオニンは３９番目、Ｖａｌ２７Ｇｌｕのグルタミン酸は４３番目、Ｐｈｅ２９Ｉｌｅのイソロイシンは４５番目、Ｔｙｒ３５Ａｓｎのアスパラギンは５１番目、Ｇｌｎ４８Ａｒｇのアルギニンは６４番目、Ｔｙｒ５１Ｈｉｓのヒスチジンは６７番目、Ｇｌｕ５４Ａｓｐのアスパラギン酸は７０番目、Ｓｅｒ６８Ｐｒｏのプロリンは８４番目、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕのロイシンは９１番目、Ａｓｎ９２Ｓｅｒのセリンは１０８番目、Ｖａｌ１１７Ｇｌｕのグルタミン酸は１３３番目、Ｇｌｕ１２１Ｇｌｙのグリシンは１３７番目、Ｇｌｙ１４７Ｖａｌのバリンは１６３番目、Ｐｈｅ１７１Ｓｅｒのセリンは１８７番目およびＳｅｒ１７８Ａｒｇのアルギニンは１９４番目の位置にそれぞれ存在する。
実施例２４ Ｆｃ結合性タンパク質のアルカリ安定性評価
（１）実施例１９（ｂ）で作製したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲ１３）、実施例２２で取得したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲ１４）、および実施例２３で作製したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲ１６）を発現する形質転換体を、実施例８の（１）から（４）に記載の方法で培養し、タンパク質を抽出することでＦｃＲ１３、ＦｃＲ１４およびＦｃＲ１６を調製した。
（２）（１）で調製したタンパク質抽出液中のＦｃＲ１３、ＦｃＲ１４およびＦｃＲ１６の抗体結合活性を、実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。この時、精製し定量したＦｃＲ９を用いて検量線を作製し、濃度測定を行なった。
（３）各Ｆｃ結合性タンパク質の濃度が１０μｇ／ｍＬになるよう純水で希釈後、前記希釈した溶液５０μＬと６０ｍＭの水酸化ナトリウム溶液５０μＬとを混合し、３０℃で２時間静置することでアルカリ処理した。その後、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）を４倍量加えることで中和し、Ｆｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を、実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法によって測定した。
（４）アルカリ処理を行なった場合の抗体結合活性をアルカリ処理を行なわなかったときの抗体結合活性で除することで、残存活性を算出しアルカリ安定性を評価した。
結果を表１６に示す。実施例２２で作製したＦｃＲ１４、ＦｃＲ１６はＦｃＲ１３と比較し残存活性が高いことから、ＦｃＲ１３に比べてアルカリ安定性が向上していることが確認された。
Figure 0006699096
 実施例２５ ＦｃＲ１６への変異導入およびライブラリーの作製
実施例２３で作製したＦｃＲ１６をコードするポリヌクレオチド部分に、エラープローンＰＣＲによりランダムに変異導入を施した。
（１）鋳型として実施例２３で作製した発現ベクターｐＥＴ−ＦｃＲ１６を用いてエラープローンＰＣＲを行なった。エラープローンＰＣＲは、ｐＥＴ−ＦｃＲ１６を鋳型とし、配列番号２３および２４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた他は表３に示す組成と同様の反応液を調製後、当該反応液を９５℃で２分間熱処理し、９５℃で３０秒間の第１ステップ、５０℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３５サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。この反応によりＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドに良好に変異が導入された。
（２）（１）で得られたＰＣＲ産物を精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ同制限酵素で消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションした。
（３）ライゲーション反応終了後、反応液をエレクトロポレーション法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢプレート培地で培養後、プレート上に形成したコロニーをランダム変異ライブラリーとした。
実施例２６ アルカリ安定化Ｆｃ結合性タンパク質のスクリーニング
（１）実施例２５で作製したランダム変異ライブラリーを実施例３（１）から（２）に記載の方法で培養することでＦｃ結合性タンパク質を発現させた。
（２）培養後、遠心操作によって得られた、Ｆｃ結合性タンパク質を含む培養上清を純水にて２０倍に希釈し、等量の８０ｍＭの水酸化ナトリウム溶液と混合した後、３０℃で２時間静置することでアルカリ処理した。アルカリ処理後は、４倍量の１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．０）でｐＨを中性付近に戻した。
（３）（２）に記載のアルカリ処理を行なったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性と、（２）に記載のアルカリ処理を行なわなかったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を、実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法にてそれぞれ測定した。その後、アルカリ処理を行なったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を、アルカリ処理を行なわなかったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性で除することで、残存活性を算出した。
（４）（３）の方法で約２７００株の形質転換体を評価し、その中からＦｃＲ１６と比較して安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体を選択した。選択した形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２ＹＴ液体培地にて培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（キアゲン製）を用いて発現ベクターを調製した。
（５）得られた発現ベクターに挿入されたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド領域の配列を実施例１（５）に記載の方法によりヌクレオチド配列を解析し、アミノ酸の変異箇所を特定した。
（４）で選択した形質転換体が発現するＦｃ結合性タンパク質の、ＦｃＲ１３に対するアミノ酸置換位置およびアルカリ処理後の残存活性（％）をまとめたものを表１７に示す。配列番号３７に記載のアミノ酸配列のうち、３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基（配列番号１の１７番目から１９２番目に該当）を含み、かつ当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において、Ａｌａ７８Ｓｅｒ（この表記は、配列番号１の７８番目（配列番号３７では９４番目）のアラニンがセリンに置換されていることを表す、以下同様）、Ａｓｐ８２Ｇｌｕ、Ｇｌｎ１０１Ｌｅｕ、Ｇｌｎ１０１Ａｒｇ、Ｔｈｒ１４０Ｉｌｅ、Ｇｌｎ１４３Ｈｉｓ、Ｔｙｒ１５８Ｈｉｓ、Ｌｙｓ１６１Ａｒｇ、Ｌｙｓ１６５Ｇｌｕ、Ｔｈｒ１８５Ａｌａ、Ａｓｎ１８７Ａｓｐ、Ａｓｎ１８７Ｔｙrのいずれかのアミノ酸置換が少なくとも１つ生じているＦｃ結合性タンパク質は、ＦｃＲ１６と比較しアルカリ安定性が向上しているといえる。
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 実施例２７ 改良Ｆｃ結合性タンパク質の作製
実施例２６で判明した、Ｆｃ結合性タンパク質のアルカリ安定性向上に関与するアミノ酸置換をＦｃＲ１６に集積することで、さらなる安定性向上を図った。置換アミノ酸の集積は、主にＰＣＲを用いて行ない、以下の（ａ）から（ｃ）に示す３種類の改良Ｆｃ結合性タンパク質を作製した。
（ａ）ＦｃＲ１６に対し、さらにＴｈｒ１４０Ｉｌｅ、Ｔｙｒ１５８ＨｉｓおよびＬｙｓ１６５Ｇｌｕのアミノ酸置換を行なったＦｃＲ１９
（ｂ）ＦｃＲ１６に対し、さらにＡｓｐ８２Ｇｌｕ、Ｇｌｎ１０１Ｌｅｕ、Ｔｈｒ１４０Ｉｌｅ、Ｔｙｒ１５８ＨｉｓおよびＬｙｓ１６５Ｇｌｕのアミノ酸置換を行なったＦｃＲ２１
（ｃ）ＦｃＲ１６に対し、さらにＡｌａ７８Ｓｅｒ、Ａｓｐ８２Ｇｌｕ、Ｇｌｎ１０１Ｌｅｕ、Ｔｈｒ１４０Ｉｌｅ、Ｔｙｒ１５８Ｈｉｓ、Ｌｙｓ１６５Ｇｌｕ、Ｔｈｒ１８５ＡｌａおよびＡｓｎ１８７Ａｓｐのアミノ酸置換を行なったＦｃＲ２４
以下、各改良Ｆｃ結合性タンパク質の作製方法を詳細に説明する。
（ａ）ＦｃＲ１９
実施例２６で明らかとなった、アルカリ安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｔｈｒ１４０Ｉｌｅ、Ｔｙｒ１５８ＨｉｓおよびＬｙｓ１６５Ｇｌｕを選択し、それらの置換をＦｃＲ１６（実施例２３）に集積したＦｃＲ１９を作製した。具体的には、実施例２６で得られたＴｈｒ１４０ＩｌｅおよびＴｙｒ１５８Ｈｉｓの変異を含んだポリヌクレオチドに対して、Ｌｙｓ１６５Ｇｌｕを生じさせる変異導入を行なうことにより、ＦｃＲ１９を作製した。
（ａ−１）実施例２６で取得した、ＦｃＲ１６にＴｈｒ１４０ＩｌｅおよびＴｙｒ１５８Ｈｉｓの変異を含んだＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを鋳型とし、配列番号２４および配列番号７５（５’−ＡＴＴＣＣＣＡＡＡＧＣＧＡＣＧＣＴＧＧＡＧＧＡＣＡＧＣＧＧＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、表５に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で５分間熱処理することで行なった。増幅したＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供し、そのゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（キアゲン製）を用いて精製した。精製したＰＣＲ産物をｍ１９Ｆとした。
（ａ−２）実施例２６で取得した、ＦｃＲ１６にＴｈｒ１４０ＩｌｅおよびＴｙｒ１５８Ｈｉｓの変異を含んだＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを鋳型とし、配列番号２３および配列番号７６（５’−ＡＴＡＧＣＴＧＣＣＧＣＴＧＴＣＣＴＣＣＡＧＣＧＴＣＧＣＴＴＴ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ−１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ１９Ｒとした。
（ａ−３）（ａ−１）および（ａ−２）で得られた２種類のＰＣＲ産物（ｍ１９Ｆ、ｍ１９Ｒ）を混合し、表６に示す組成の反応液を調製した。当該反応液を９８℃で５分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を５サイクル行なうＰＣＲを行ない、ｍ１９Ｆとｍ１９Ｒを連結したＰＣＲ産物ｍ１９ｐを得た。
（ａ−４）（ａ−３）で得られたＰＣＲ産物ｍ１９ｐを鋳型とし、配列番号２３および配列番号２４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲを行なった。ＰＣＲは、表７に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。これによりＦｃＲ１６に３箇所アミノ酸置換を導入したＦｃＲ１９をコードするポリヌクレオチドを作製した。
（ａ−５）（ａ−４）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ａ−６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、ＦｃＲ１６に対して３箇所（野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して１９箇所）アミノ酸置換したポリペプチドである、ＦｃＲ１９をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴ−ＦｃＲ１９を得た。
（ａ−７）ｐＥＴ−ＦｃＲ１９のヌクレオチド配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法で行なった。
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃＲ１９のアミノ酸配列を配列番号７７に、前記ＦｃＲ１９をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号７８に示す。なお、配列番号７７において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ１９のアミノ酸配列（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域に相当）、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号７３において、Ｇｌｕ２１Ｇｌｙのグリシンは３７番目、Ｌｅｕ２３Ｍｅｔのメチオニンは３９番目、Ｖａｌ２７Ｇｌｕのグルタミン酸は４３番目、Ｐｈｅ２９Ｉｌｅのイソロイシンは４５番目、Ｔｙｒ３５Ａｓｎのアスパラギンは５１番目、Ｇｌｎ４８Ａｒｇのアルギニンは６４番目、Ｔｙｒ５１Ｈｉｓのヒスチジンは６７番目、Ｇｌｕ５４Ａｓｐのアスパラギン酸は７０番目、Ｓｅｒ６８Ｐｒｏのプロリンは８４番目、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕのロイシンは９１番目、Ａｓｎ９２Ｓｅｒのセリンは１０８番目、Ｖａｌ１１７Ｇｌｕのグルタミン酸は１３３番目、Ｇｌｕ１２１Ｇｌｙのグリシンは１３７番目、Ｔｈｒ１４０Ｉｌｅのイソロイシンは１５６番目、Ｇｌｙ１４７Ｖａｌのバリンは１６３番目、Ｔｙｒ１５８Ｈｉｓのヒスチジンは１７４番目、Ｌｙｓ１６５Ｇｌｕのグルタミン酸は１８１番目、Ｐｈｅ１７１Ｓｅｒのセリンは１８７番目およびＳｅｒ１７８Ａｒｇのアルギニンは１９４番目の位置にそれぞれ存在する。
（ｂ）ＦｃＲ２１
実施例２６で得られたＡｓｐ８２Ｇｌｕ、Ｇｌｎ１０１ＬｅｕおよびＡｓｎ１８７Ａｓｐの変異を含んだポリヌクレオチドに対して、Ｔｈｒ１４０Ｉｌｅ、Ｔｙｒ１５８ＨｉｓおよびＬｙｓ１６５Ｇｌｕを生じさせる変異導入を行ない、改良Ｆｃ結合性タンパク質を得た。なお前記変異のうちＡｓｎ１８７Ａｓｐは後述の（ｂ−９）の操作で欠失したため、本実験で実際に得られた改良Ｆｃ結合性タンパク質はＡｓｐ８２Ｇｌｕ、Ｇｌｎ１０１Ｌｅｕ、Ｔｈｒ１４０Ｉｌｅ、Ｔｙｒ１５８ＨｉｓおよびＬｙｓ１６５Ｇｌｕの置換をＦｃＲ１６（実施例２３）に集積したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲ２１）である。
（ｂ−１）実施例２６で取得した、ＦｃＲ１６にＡｓｐ８２Ｇｌｕ、Ｇｌｎ１０１ＬｅｕおよびＡｓｎ１８７Ａｓｐの変異を含んだＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを鋳型とし、配列番号２４および配列番号７９（５’−ＡＣＣＧＣＣＣＴＧＣＡＴＡＡＡＧＴＧＡＴＣＴＡＣＣＴＧＣＡＡ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、表５に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で５分間熱処理することで行なった。増幅したＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供し、そのゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（キアゲン製）を用いて精製した。精製したＰＣＲ産物をｍ２１−２Ｆとした。
（ｂ−２）実施例２６で取得した、ＦｃＲ１６にＡｓｐ８２Ｇｌｕ、Ｇｌｎ１０１ＬｅｕおよびＡｓｎ１８７Ａｓｐの変異を含んだＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを鋳型とし、配列番号２３および配列番号８０（５’−ＴＴＧＣＡＧＧＴＡＧＡＴＣＡＣＴＴＴＡＴＧＣＡＧＧＧＣＧＧＴ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ｂ−１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ２１−２Ｒとした。
（ｂ−３）（ｂ−１）および（ｂ−２）で得られた２種類のＰＣＲ産物（ｍ２１−２Ｆ、ｍ２１−２Ｒ）を混合し、表６に示す組成の反応液を調製した。当該反応液を９８℃で５分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を５サイクル行なうＰＣＲを行ない、ｍ２１−２Ｆとｍ２１−２Ｒを連結したＰＣＲ産物ｍ２１−２ｐを得た。
（ｂ−４）（ｂ−３）で得られたＰＣＲ産物ｍ２１−２ｐを鋳型とし、配列番号２３および配列番号２４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲを行なった。ＰＣＲは、表７に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。これによりＦｃＲ１６にＡｓｐ８２Ｇｌｕ、Ｇｌｎ１０１Ｌｅｕ、Ｔｈｒ１４０ＩｌｅおよびＡｓｎ１８７Ａｓｐの変異を含んだＦｃＲ２１−２をコードするポリヌクレオチドを作製した。
（ｂ−５）（ｂ−４）で取得した、ＦｃＲ１６にＡｓｐ８２Ｇｌｕ、Ｇｌｎ１０１Ｌｅｕ、Ｔｈｒ１４０ＩｌｅおよびＡｓｎ１８７Ａｓｐの変異を含んだＦｃＲ２１−２をコードするポリヌクレオチドを鋳型とし、配列番号２４および配列番号８１（５’−ＣＡＣＣＡＣＡＡＣＴＣＣＧＡＣＴＴＣＣＡＴＡＴＴＣＣＣＡＡＡ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、表５に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で５分間熱処理することで行なった。増幅したＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供し、そのゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（キアゲン製）を用いて精製した。精製したＰＣＲ産物をｍ２１−１Ｆとした。
（ｂ−６）（ｂ−４）で取得した、ＦｃＲ１６にＡｓｐ８２Ｇｌｕ、Ｇｌｎ１０１Ｌｅｕ、Ｔｈｒ１４０ＩｌｅおよびＡｓｎ１８７Ａｓｐの変異を含んだＦｃＲ２１−２をコードするポリヌクレオチドを鋳型とし、配列番号２３および配列番号８２（５’−ＣＡＧＣＧＴＣＧＣＴＴＴＧＧＧＡＡＴＡＴＧＧＡＡＧＴＣＧＧＡ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ｂ−５）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ２１−１Ｒとした。
（ｂ−７）（ｂ−５）および（ｂ−６）で得られた２種類のＰＣＲ産物（ｍ２１−１Ｆ、ｍ２１−１Ｒ）を混合し、表６に示す組成の反応液を調製した。当該反応液を９８℃で５分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を５サイクル行なうＰＣＲを行ない、ｍ２１−１Ｆとｍ２１−１Ｒを連結したＰＣＲ産物ｍ２１−１ｐを得た。
（ｂ−８）（ｂ−７）で得られたＰＣＲ産物ｍ２１−１ｐを鋳型とし、配列番号２３および配列番号２４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲを行なった。ＰＣＲは、表７に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。これによりＦｃＲ１６にＡｓｐ８２Ｇｌｕ、Ｇｌｎ１０１Ｌｅｕ、Ｔｈｒ１４０Ｉｌｅ、Ｔｙｒ１５８ＨｉｓおよびＡｓｎ１８７Ａｓｐの変異を含んだＦｃＲ２１−１をコードするポリヌクレオチドを作製した。
（ｂ−９）（ｂ−８）で取得した、ＦｃＲ１６にＡｓｐ８２Ｇｌｕ、Ｇｌｎ１０１Ｌｅｕ、Ｔｈｒ１４０Ｉｌｅ、Ｔｙｒ１５８ＨｉｓおよびＡｓｎ１８７Ａｓｐの変異を含んだＦｃＲ２１−１をコードするポリヌクレオチドを鋳型とし、配列番号２２および配列番号７５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、表５に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で５分間熱処理することで行なった。増幅したＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供し、そのゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（キアゲン製）を用いて精製した。精製したＰＣＲ産物をｍ２１Ｆとした（本操作によりＡｓｎ１８７Ａｓｐの変異が欠失している）。
（ｂ−１０）（ｂ−８）で取得した、ＦｃＲ１６にＡｓｐ８２Ｇｌｕ、Ｇｌｎ１０１Ｌｅｕ、Ｔｈｒ１４０Ｉｌｅ、Ｔｙｒ１５８ＨｉｓおよびＡｓｎ１８７Ａｓｐの変異を含んだＦｃＲ２１−１をコードするポリヌクレオチドを鋳型とし、配列番号６２および配列番号７６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ｂ−９）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ２１Ｒとした。
（ｂ−１１）（ｂ−９）および（ｂ−１０）で得られた２種類のＰＣＲ産物（ｍ２１Ｆ、ｍ２１Ｒ）を混合し、表６に示す組成の反応液を調製した。当該反応液を９８℃で５分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を５サイクル行なうＰＣＲを行ない、ｍ２１Ｆとｍ２１Ｒを連結したＰＣＲ産物ｍ２１ｐを得た。
（ｂ−１２）（ｂ−１１）で得られたＰＣＲ産物ｍ２１ｐを鋳型とし、配列番号６２および配列番号２２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲを行なった。ＰＣＲは、表７に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。これによりＦｃＲ１６に５箇所（Ａｓｐ８２Ｇｌｕ、Ｇｌｎ１０１Ｌｅｕ、Ｔｈｒ１４０Ｉｌｅ、Ｔｙｒ１５８ＨｉｓおよびＬｙｓ１６５Ｇｌｕ）（野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して２１箇所）アミノ酸置換を導入したＦｃＲ２１をコードするポリヌクレオチドを作製した。
（ｂ−１３）（ａ−１２）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ｂ−１４）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、ＦｃＲ１６に対して５箇所アミノ酸置換したポリペプチドである、ＦｃＲ２１をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴ−ＦｃＲ２１を得た。
（ｂ−１５）ｐＥＴ−ＦｃＲ２１のヌクレオチド配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法で行なった。
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃＲ２１のアミノ酸配列を配列番号８３に、前記ＦｃＲ２１をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号８４に示す。なお、配列番号８３において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ２１のアミノ酸配列（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域に相当）、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号８３において、Ｇｌｕ２１Ｇｌｙのグリシンは３７番目、Ｌｅｕ２３Ｍｅｔのメチオニンは３９番目、Ｖａｌ２７Ｇｌｕのグルタミン酸は４３番目、Ｐｈｅ２９Ｉｌｅのイソロイシンは４５番目、Ｔｙｒ３５Ａｓｎのアスパラギンは５１番目、Ｇｌｎ４８Ａｒｇのアルギニンは６４番目、Ｔｙｒ５１Ｈｉｓのヒスチジンは６７番目、Ｇｌｕ５４Ａｓｐのアスパラギン酸は７０番目、Ｓｅｒ６８Ｐｒｏのプロリンは８４番目、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕのロイシンは９１番目、Ａｓｐ８２Ｇｌｕのグルタミン酸は９８番目、Ａｓｎ９２Ｓｅｒのセリンは１０８番目、Ｇｌｎ１０１Ｌｅｕのロイシンは１１７番目、Ｖａｌ１１７Ｇｌｕのグルタミン酸は１３３番目、Ｇｌｕ１２１Ｇｌｙのグリシンは１３７番目、Ｔｈｒ１４０Ｉｌｅのイソロイシンは１５６番目、Ｇｌｙ１４７Ｖａｌのバリンは１６３番目、Ｔｙｒ１５８Ｈｉｓのヒスチジンは１７４番目、Ｌｙｓ１６５Ｇｌｕのグルタミン酸は１８１番目、Ｐｈｅ１７１Ｓｅｒのセリンは１８７番目およびＳｅｒ１７８Ａｒｇのアルギニンは１９４番目の位置にそれぞれ存在する。
（ｃ）ＦｃＲ２４
実施例２６で明らかとなった、アルカリ安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ａｌａ７８Ｓｅｒ、Ａｓｐ８２Ｇｌｕ、Ｇｌｎ１０１Ｌｅｕ、Ｔｈｒ１４０Ｉｌｅ、Ｔｙｒ１５８Ｈｉｓ、Ｌｙｓ１６５Ｇｌｕ、Ｔｈｒ１８５ＡｌａおよびＡｓｎ１８７Ａｓｐを選択し、それらの置換をＦｃＲ１６（実施例２３）に集積したＦｃＲ２４を作製した。具体的には、ＦｃＲ２１をコードするポリヌクレオチドに対して、Ａｌａ７８Ｓｅｒ、Ｔｈｒ１８５ＡｌａおよびＡｓｎ１８７Ａｓｐを生じさせる変異導入を行なうことにより、ＦｃＲ２４を作製した。
（ｃ−１）（ｂ）で作製した、ｐＥＴ−ＦｃＲ２１を鋳型とし、配列番号２４および配列番号８５（５’−ＡＧＣＡＧＣＴＡＣＣＴＴＡＴＴＧＡＴＴＣＧＧＣＧＡＣＧＧＴＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、表５に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で５分間熱処理することで行なった。増幅したＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供し、そのゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（キアゲン製）を用いて精製した。精製したＰＣＲ産物をｍ２４−２Ｆとした。
（ｃ−２）（ｂ）で作製した、ｐＥＴ−ＦｃＲ２１を鋳型とし、配列番号２３および配列番号８６（５’−ＧＣＴＡＴＣＴＴＣＣＡＣＣＧＴＣＧＣＣＧＡＡＴＣＡＡＴＡＡＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ｃ−１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ２４−２Ｒとした。
（ｃ−３）（ｃ−１）および（ｃ−２）で得られた２種類のＰＣＲ産物（ｍ２４−２Ｆ、ｍ２４−２Ｒ）を混合し、表６に示す組成の反応液を調製した。当該反応液を９８℃で５分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を５サイクル行なうＰＣＲを行ない、ｍ２１−２Ｆとｍ２１−２Ｒを連結したＰＣＲ産物ｍ２４−２ｐを得た。
（ｃ−４）（ｃ−３）で得られたＰＣＲ産物ｍ２４−２ｐを鋳型とし、配列番号２３および配列番号２４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲを行なった。ＰＣＲは、表７に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。これによりＦｃＲ１６にＡｌａ７８Ｓｅｒ、Ａｓｐ８２Ｇｌｕ、Ｇｌｎ１０１Ｌｅｕ、Ｔｈｒ１４０Ｉｌｅ、Ｔｙｒ１５８ＨｉｓおよびＬｙｓ１６５Ｇｌｕの変異を含んだＦｃＲ２４−２をコードするポリヌクレオチドを作製した。
（ｃ−５）（ｃ−４）で取得した、ＦｃＲ１６にＡｌａ７８Ｓｅｒ、Ａｓｐ８２Ｇｌｕ、Ｇｌｎ１０１Ｌｅｕ、Ｔｈｒ１４０Ｉｌｅ、Ｔｙｒ１５８ＨｉｓおよびＬｙｓ１６５Ｇｌｕの変異を含んだＦｃＲ２４−２をコードするポリヌクレオチドを鋳型とし、配列番号２４および配列番号８７（５’−ＡＡＡＡＡＴＧＴＧＡＧＣＡＧＣＧＡＧＧＣＣＧＴＧＧＡＴＡＴＴ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、表５に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で５分間熱処理することで行なった。増幅したＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供し、そのゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（キアゲン製）を用いて精製した。精製したＰＣＲ産物をｍ２４Ｆとした。
（ｃ−６）（ｃ−４）で取得した、ＦｃＲ１６にＡｌａ７８Ｓｅｒ、Ａｓｐ８２Ｇｌｕ、Ｇｌｎ１０１Ｌｅｕ、Ｔｈｒ１４０Ｉｌｅ、Ｔｙｒ１５８ＨｉｓおよびＬｙｓ１６５Ｇｌｕの変異を含んだＦｃＲ２４−２をコードするポリヌクレオチドを鋳型とし、配列番号６２および配列番号８８（５’−ＧＧＴＡＡＴＧＧＴＡＡＴＡＴＣＣＡＣＧＧＣＣＴＣＧＣＴＧＣＴ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ｃ−５）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ２４Ｒとした。
（ｃ−７）（ｃ−５）および（ｃ−６）で得られた２種類のＰＣＲ産物（ｍ２４Ｆ、ｍ２４Ｒ）を混合し、表６に示す組成の反応液を調製した。当該反応液を９８℃で５分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を５サイクル行なうＰＣＲを行ない、ｍ２４Ｆとｍ２４Ｒを連結したＰＣＲ産物ｍ２４ｐを得た。
（ｃ−８）（ｃ−７）で得られたＰＣＲ産物ｍ２４ｐを鋳型とし、配列番号６２および配列番号２４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲを行なった。ＰＣＲは、表７に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。これによりＦｃＲ１６に８箇所（野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して２４箇所）アミノ酸置換を導入したＦｃＲ２４をコードするポリヌクレオチドを作製した。
（ｃ−９）（ｃ−８）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ｃ−１０）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、ＦｃＲ１６に対して８箇所アミノ酸置換したポリペプチドである、ＦｃＲ２４をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴ−ＦｃＲ２４を得た。
（ｃ−１１）ｐＥＴ−ＦｃＲ２４のヌクレオチド配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法で行なった。
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃＲ２４のアミノ酸配列を配列番号８９に、前記ＦｃＲ２４をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号９０に示す。なお、配列番号８９において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ２４のアミノ酸配列（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域に相当）、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号８９において、Ｇｌｕ２１Ｇｌｙのグリシンは３７番目、Ｌｅｕ２３Ｍｅｔのメチオニンは３９番目、Ｖａｌ２７Ｇｌｕのグルタミン酸は４３番目、Ｐｈｅ２９Ｉｌｅのイソロイシンは４５番目、Ｔｙｒ３５Ａｓｎのアスパラギンは５１番目、Ｇｌｎ４８Ａｒｇのアルギニンは６４番目、Ｔｙｒ５１Ｈｉｓのヒスチジンは６７番目、Ｇｌｕ５４Ａｓｐのアスパラギン酸は７０番目、Ｓｅｒ６８Ｐｒｏのプロリンは８４番目、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕのロイシンは９１番目、Ａｌａ７８Ｓｅｒのセリンは９４番目、Ａｓｐ８２Ｇｌｕのグルタミン酸は９８番目、Ａｓｎ９２Ｓｅｒのセリンは１０８番目、Ｇｌｎ１０１Ｌｅｕのロイシンは１１７番目、Ｖａｌ１１７Ｇｌｕのグルタミン酸は１３３番目、Ｇｌｕ１２１Ｇｌｙのグリシンは１３７番目、Ｔｈｒ１４０Ｉｌｅのイソロイシンは１５６番目、Ｇｌｙ１４７Ｖａｌのバリンは１６３番目、Ｔｙｒ１５８Ｈｉｓのヒスチジンは１７４番目、Ｌｙｓ１６５Ｇｌｕのグルタミン酸は１８１番目、Ｐｈｅ１７１Ｓｅｒのセリンは１８７番目、Ｓｅｒ１７８Ａｒｇのアルギニンは１９４番目、Ｔｈｒ１８５Ａｌａのアラニンは２０１番目およびＡｓｎ１８７Ａｓｐのアスパラギン酸は２０３番目の位置にそれぞれ存在する。
実施例２８ Ｆｃ結合性タンパク質のアルカリ安定性評価
（１）実施例２３で作製したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲ１６）、ならびに実施例２７で取得したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲ１９、ＦｃＲ２１およびＦｃＲ２４）を発現する形質転換体を、実施例８の（１）から（４）に記載の方法で培養し、タンパク質を抽出することでＦｃＲ１６、ＦｃＲ１９、ＦｃＲ２１およびＦｃＲ２４を調製した。
（２）（１）で調製したタンパク質抽出液中のＦｃＲ１６、ＦｃＲ１９、ＦｃＲ２１およびＦｃＲ２４の抗体結合活性を、実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。この時、精製し定量したＦｃＲ１３を用いて検量線を作製し、濃度測定を行なった。
（３）各Ｆｃ結合性タンパク質の濃度が１０μｇ／ｍＬになるよう純水で希釈後、前記希釈した溶液５０μＬと８０ｍＭの水酸化ナトリウム溶液５０μＬとを混合し、３０℃で２時間静置することでアルカリ処理した。その後、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）を４倍量加えることで中和し、Ｆｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を、実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法によって測定した。
（４）アルカリ処理を行なった場合の抗体結合活性をアルカリ処理を行なわなかったときの抗体結合活性で除することで、残存活性を算出しアルカリ安定性を評価した。
結果を表１８に示す。実施例２７で作製したＦｃＲ１９、ＦｃＲ２１およびＦｃＲ２４はＦｃＲ１６と比較し残存活性が高いことから、ＦｃＲ１６に比べてアルカリ安定性が向上していることが確認された。
Figure 0006699096
 実施例２９ ＦｃＲ２４への変異導入およびライブラリーの作製
実施例２７（ｃ）で作製したＦｃＲ２４をコードするポリヌクレオチド部分に、エラープローンＰＣＲによりランダムに変異導入を施した。
（１）鋳型として実施例２７（ｃ）で作製した発現ベクターｐＥＴ−ＦｃＲ２４を用いてエラープローンＰＣＲを行なった。エラープローンＰＣＲは、ｐＥＴ−ＦｃＲ２４を鋳型とし、配列番号２３および２４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた他は表３に示す組成と同様の反応液を調製後、当該反応液を９５℃で２分間熱処理し、９５℃で３０秒間の第１ステップ、５０℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３５サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。この反応によりＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドに良好に変異が導入された。
（２）（１）で得られたＰＣＲ産物を精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ同制限酵素で消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションした。
（３）ライゲーション反応終了後、反応液をエレクトロポレーション法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢプレート培地で培養後、プレート上に形成したコロニーをランダム変異ライブラリーとした。
実施例３０ アルカリ安定化Ｆｃ結合性タンパク質のスクリーニング
（１）実施例２９で作製したランダム変異ライブラリーを実施例３（１）から（２）に記載の方法で培養することでＦｃ結合性タンパク質を発現させた。
（２）培養後、遠心操作によって得られた、Ｆｃ結合性タンパク質を含む培養上清を純水にて２０倍に希釈し、等量の３００ｍＭの水酸化ナトリウム溶液と混合した後、３０℃で２時間静置することでアルカリ処理した。アルカリ処理後は、４倍量の１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．０）でｐＨを中性付近に戻した。
（３）（２）に記載のアルカリ処理を行なったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性と、（２）に記載のアルカリ処理を行なわなかったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を、実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法にてそれぞれ測定した。その後、アルカリ処理を行なったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を、アルカリ処理を行なわなかったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性で除することで、残存活性を算出した。
（４）（３）の方法で約２７００株の形質転換体を評価し、その中からＦｃＲ２４と比較して安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体を選択した。選択した形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２ＹＴ液体培地にて培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（キアゲン製）を用いて発現ベクターを調製した。
（５）得られた発現ベクターに挿入されたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド領域の配列を実施例１（５）に記載の方法によりヌクレオチド配列を解析し、アミノ酸の変異箇所を特定した。
（４）で選択した形質転換体が発現するＦｃ結合性タンパク質の、ＦｃＲ２４に対するアミノ酸置換位置およびアルカリ処理後の残存活性（％）をまとめたものを表１９に示す。配列番号８９に記載のアミノ酸配列のうち、３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基（配列番号１の１７番目から１９２番目に該当）を含み、かつ当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において、Ｌｙｓ４０Ｇｌｎ（この表記は、配列番号１の４０番目（配列番号３７では５６番目）のリジンがグルタミンに置換されていることを表す、以下同様）、Ｌｙｓ４６Ａｓｎ、Ａｌａ５０Ｔｈｒ、Ａｓｎ５６Ｔｙｒ、Ｈｉｓ６２Ｌｅｕ、Ｓｅｒ６５Ｇｌｙ、Ｔｙｒ７４Ｈｉｓ、Ａｓｐ７７Ｖａｌ、Ｇｌｎ９０Ｌｅｕ、Ｌｙｓ１１９Ｔｈｒ、Ｌｙｓ１１９Ｇｌｕ、Ａｓｐ１２２Ｇｌｕ、Ｈｉｓ１３７Ｇｌｎ、Ｔｈｒ（Ｉｌｅ）１４０Ｍｅｔ（この表記は、配列番号１の１４０番目（配列番号３７では１５６番目）のスレオニンが一度イソロイシンに置換されさらにメチオニンに置換されたことを示す、以下同様）、Ｔｙｒ１４１Ｐｈｅ、Ｔｙｒ（Ｈｉｓ）１５８Ｌｅｕ、Ｌｅｕ１７５Ａｒｇ、Ａｓｎ１８０Ｌｙｓ、Ａｓｎ１８０Ｓｅｒ、Ｉｌｅ１９０Ｖａｌ、Ｔｈｒ１９１Ｉｌｅのいずれかのアミノ酸置換が少なくとも１つ生じているＦｃ結合性タンパク質は、ＦｃＲ２４と比較しアルカリ安定性が向上しているといえる。
Figure 0006699096
 実施例３１ Ｔｈｒ１４０またはＴｙｒ１５８アミノ酸置換体の作製
実施例２６で明らかになったＦｃ結合性タンパク質のアルカリ安定性向上に寄与するアミノ酸置換のうち、配列番号１の１４０番目（配列番号３７では１５６番目）のスレオニン（Ｔｈｒ１４０）がイソロイシン（Ｉｌｅ）に、１５８番目（配列番号３７では１７４番目）のチロシン（Ｔｙｒ１５８）がヒスチジンにそれぞれ置換されることでアルカリ安定性が特に向上した。そこで、Ｔｈｒ１４０およびＴｙｒ１５８の他のアミノ酸への置換の有用性を確認するため、実施例２６（ｃ）で作製したＦｃＲ２４（配列番号８９）のうちＴｈｒ１４０（配列番号８９では１５６番目）またはＴｙｒ１５８（配列番号８９では１７４番目）を他のアミノ酸に置換したＦｃ結合性タンパク質を作製した。
（ａ）Ｔｈｒ１４０アミノ酸置換体の作製
（ａ−１）実施例２７（ｃ）で作製した、ｐＥＴ−ＦｃＲ２４を鋳型とし、配列番号２４および配列番号９１（５’−ＣＣＴＧＣＡＴＡＡＡＧＴＧＮＮＫＴＡＣＣＴＧＣＡＡＡＡＣＧＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた他は表３に示す組成と同様の反応液を調製後、当該反応液を９５℃で２分間熱処理し、９５℃で３０秒間の第１ステップ、５０℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３５サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。得られたＰＣＲ産物をＴ１４０ｐ１とした。
（ａ−２）実施例２７（ｃ）で作製した、ｐＥＴ−ＦｃＲ２４を鋳型とし、配列番号２３および配列番号９２（５’−ＣＣＧＴＴＴＴＧＣＡＧＧＴＡＭＮＮＣＡＣＴＴＴＡＴＧＣＡＧＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた他は表３に示す組成と同様の反応液を調製後、当該反応液を９５℃で２分間熱処理し、９５℃で３０秒間の第１ステップ、５０℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３５サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。得られたＰＣＲ産物をＴ１４０ｐ２とした。
（ａ−３）（ａ−１）および（ａ−２）で得られた２種類のＰＣＲ産物（Ｔ１４０ｐ１、Ｔ１４０ｐ２）を混合し、表６に示す組成の反応液を調製した。当該反応液を９８℃で５分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を５サイクル行なうＰＣＲを行ない、Ｔ１４０ｐ１とＴ１４０ｐ２を連結したＰＣＲ産物Ｔ１４０ｐを得た。
（ａ−４）（ａ−３）で得られたＰＣＲ産物Ｔ１４０ｐを鋳型とし、配列番号２３および配列番号２４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲを行なった。ＰＣＲは、表７に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。これによりＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲ２４）の１４０番目のアミノ酸が任意のアミノ酸に置換されたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得た。得られたポリヌクレオチドをＴ１４０ｐ３とした。
（ａ−５）（ａ−４）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ａ−６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。
回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出し、ポリヌクレオチド領域の配列を実施例１（５）に記載の方法によりヌクレオチド配列を解析したところ、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲ２４のＴｈｒ１４０（配列番号８９では１５６番目のイソロイシン）がＡｌａ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＶａｌに置換されたＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体を得た。
（ｂ）Ｔｙｒ１５８アミノ酸置換体の作製
（ｂ−１）実施例２７（ｃ）で作製した、ｐＥＴ−ＦｃＲ２４を鋳型とし、配列番号２４および配列番号９３（５’−ＣＡＡＣＴＣＣＧＡＣＴＴＣＮＮＫＡＴＴＣＣＣＡＡＡＧＣＧＡＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた他は表３に示す組成と同様の反応液を調製後、当該反応液を９５℃で２分間熱処理し、９５℃で３０秒間の第１ステップ、５０℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３５サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。得られたＰＣＲ産物をＹ１５８ｐ１とした。
（ｂ−２）実施例２７（ｃ）で作製した、ｐＥＴ−ＦｃＲ２４を鋳型とし、配列番号２３および配列番号９４（５’−ＧＴＣＧＣＴＴＴＧＧＧＡＡＴＭＮＮＧＡＡＧＴＣＧＧＡＧＴＴＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた他は表３に示す組成と同様の反応液を調製後、当該反応液を９５℃で２分間熱処理し、９５℃で３０秒間の第１ステップ、５０℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３５サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。得られたＰＣＲ産物をＹ１５８ｐ２とした。
（ｂ−３）（ｂ−１）および（ｂ−２）で得られた２種類のＰＣＲ産物（Ｙ１５８ｐ１、Ｙ１５８ｐ２）を混合し、表６に示す組成の反応液を調製した。当該反応液を９８℃で５分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を５サイクル行なうＰＣＲを行ない、Ｙ１４０ｐ１とＹ１４０ｐ２を連結したＰＣＲ産物Ｙ１４０ｐを得た。
（ｂ−４）（ｂ−３）で得られたＰＣＲ産物Ｙ１４０ｐを鋳型とし、配列番号２３および配列番号２４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲを行なった。ＰＣＲは、表７に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。これによりＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲ２４）の１５８番目のアミノ酸が任意のアミノ酸に置換されたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得た。得られたポリヌクレオチドをＹ１５８ｐ３とした。
（ｂ−５）（ｂ−４）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ｂ−６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。
回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出し、ポリヌクレオチド領域の配列を実施例１（５）に記載の方法によりヌクレオチド配列を解析したところ、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲ２４のＴｙｒ１５８（配列番号８９では１７４番目のヒスチジン）がＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＶａｌに置換されたＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体を得た。
実施例３２ Ｔｈｒ１４０またはＴｙｒ１５８アミノ酸置換体の評価
（１）実施例３１で作製したＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体を、実施例８の（１）から（４）に記載の方法で培養し、タンパク質を抽出した。
（２）（１）で調製したタンパク質抽出液中のＦｃ結合タンパク質の抗体結合活性を、実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。この時、精製し定量したＦｃＲ２４を用いて検量線を作製し、濃度測定を行なった。
（３）各Ｆｃ結合性タンパク質の濃度が１０μｇ／ｍＬになるよう純水で希釈後、前記希釈した溶液５０μＬと、３００ｍＭ（Ｔｈｒ１４０アミノ酸置換体の場合）または３５０ｍＭ（Ｔｙｒ１５８アミノ酸置換体の場合）の水酸化ナトリウム溶液５０μＬとを混合し、３０℃で２時間静置することでアルカリ処理した。その後、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）を４倍量加えることで中和し、Ｆｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を、実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法によって測定した。
（４）アルカリ処理を行なった場合の抗体結合活性をアルカリ処理を行なわなかったときの抗体結合活性で除することで、残存活性を算出しアルカリ安定性を評価した。
得られた結果を表２０（Ｔｈｒ１４０アミノ酸置換体の結果）および表２１（Ｔｙｒ１５８アミノ酸置換体の結果）に示した。なお表２０のうちＩｌｅの結果、および表２１のうちＨｉｓの結果はＦｃＲ２４の結果である。Ｔｈｒ１４０の場合（表２０）は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、ＳｅｒまたはＶａｌに置換することで、Ｔｙｒ１５８の場合（表２１）は、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、ＴｒｐまたはＶａｌに置換することで、それぞれアルカリ安定性が向上することを確認した。
Figure 0006699096
Figure 0006699096

Claims (12)

  1. 配列番号３９、配列番号４３、配列番号４７、配列番号５１、配列番号５５、配列番号６３、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７３、配列番号７７、配列番号８３、配列番号８９のいずれかに記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基を含む、ＦｃγＲＩＩＩａ。
  2. 配列番号３９、配列番号４３、配列番号４７、配列番号５１、配列番号５５、配列番号６３、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７３、配列番号７７、配列番号８３、配列番号８９のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のＦｃγＲＩＩＩａ。
  3. 請求項１または２に記載のＦｃγＲＩＩＩａにおいて、さらに以下の（８５）から（８８）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じている、ＦｃγＲＩＩＩａ。
    （８５）配列番号３７の８２番目に相当するロイシンがヒスチジンまたはアルギニンに置換
    （８６）配列番号３７の１６３番目相当するグリシンがアスパラギン酸に置換
    （８７）配列番号３７の１７４番目相当するチロシンがヒスチジンに置換
    （８８）配列番号３７の１９２番目相当するバリンがフェニルアラニンに置換
  4. 請求項１から３のいずれかに記載のＦｃγＲＩＩＩａを不溶性担体に固定化して得られる吸着剤。
  5. 請求項４に記載の吸着剤を用いた抗体の分離方法。
  6. 請求項４に記載の吸着剤を用いて抗体を分離することで、抗体が有する糖鎖構造の違いを識別する方法。
  7. 請求項４に記載の吸着剤を用いた糖鎖の分離方法。
  8. 請求項１から３のいずれかに記載のＦｃγＲＩＩＩａをコードするポリヌクレオチド。
  9. 請求項８に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  10. 請求項９に記載の発現ベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体。
  11. 宿主が大腸菌である、請求項１０に記載の形質転換体。
  12. 請求項１０または１１に記載の形質転換体を培養することによりＦｃγＲＩＩＩａを発現させ、その培養物から発現されたＦｃγＲＩＩＩａを回収する、ＦｃγＲＩＩＩａの製造方法。
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