CN106574261B - 改良Fc结合蛋白、及制造方法、使用该蛋白的抗体吸附剂和使用该吸附剂的抗体分离方法 - Google Patents

改良Fc结合蛋白、及制造方法、使用该蛋白的抗体吸附剂和使用该吸附剂的抗体分离方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106574261B
CN106574261B CN201580045734.4A CN201580045734A CN106574261B CN 106574261 B CN106574261 B CN 106574261B CN 201580045734 A CN201580045734 A CN 201580045734A CN 106574261 B CN106574261 B CN 106574261B
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
substitution
substituted
amino acid
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201580045734.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106574261A (zh
Inventor
朝冈義晴
田中亨
寺尾阳介
山中直纪
木津奈都子
青木大
井出辉彦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tosoh Corp
Original Assignee
Tosoh Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from JP2014147207A external-priority patent/JP6451119B2/ja
Priority claimed from JP2014147206A external-priority patent/JP6451118B2/ja
Priority claimed from JP2015115078A external-priority patent/JP6699096B2/ja
Application filed by Tosoh Corp filed Critical Tosoh Corp
Priority claimed from PCT/JP2015/068259 external-priority patent/WO2015199154A1/ja
Publication of CN106574261A publication Critical patent/CN106574261A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106574261B publication Critical patent/CN106574261B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
    • B01D15/3804—Affinity chromatography
    • B01D15/3809—Affinity chromatography of the antigen-antibody type, e.g. protein A, G, L chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • B01J20/286—Phases chemically bonded to a substrate, e.g. to silica or to polymers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3202—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the carrier, support or substrate used for impregnation or coating
    • B01J20/3204—Inorganic carriers, supports or substrates
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3202—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the carrier, support or substrate used for impregnation or coating
    • B01J20/3206—Organic carriers, supports or substrates
    • B01J20/3208—Polymeric carriers, supports or substrates
    • B01J20/321—Polymeric carriers, supports or substrates consisting of a polymer obtained by reactions involving only carbon to carbon unsaturated bonds
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3202—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the carrier, support or substrate used for impregnation or coating
    • B01J20/3206—Organic carriers, supports or substrates
    • B01J20/3208—Polymeric carriers, supports or substrates
    • B01J20/3212—Polymeric carriers, supports or substrates consisting of a polymer obtained by reactions otherwise than involving only carbon to carbon unsaturated bonds
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B01J20/3268—Macromolecular compounds
    • B01J20/3272—Polymers obtained by reactions otherwise than involving only carbon to carbon unsaturated bonds
    • B01J20/3274—Proteins, nucleic acids, polysaccharides, antibodies or antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70535—Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64 (CD2314/705F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
    • C07K16/065—Purification, fragmentation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • B01J20/291—Gel sorbents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates
    • G01N2400/02—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates involving antibodies to sugar part of glycoproteins

Abstract

提供：Fc结合性蛋白质的稳定性、特别是对热、酸的稳定性提高了的Fc结合性蛋白质、该蛋白质的制造方法、使用该蛋白质的抗体吸附剂和使用该吸附剂的抗体的分离方法。通过将在人FcγRIIIa中、位于细胞外区域中的特定位点的氨基酸残基置换为其他确定的氨基酸而对热、酸的稳定性提高了的Fc结合性蛋白质、该蛋白质的制造方法、使用该蛋白质的抗体吸附剂和使用该吸附剂的抗体的分离方法，由此解决前述课题。

Description

改良Fc结合蛋白、及制造方法、使用该蛋白的抗体吸附剂和使 用该吸附剂的抗体分离方法
技术领域
本发明涉及对免疫球蛋白有亲和性的Fc结合性蛋白质。更详细而言，本发明涉及：对热、酸的稳定性高于野生型的Fc结合性蛋白质、该蛋白质的制造方法、将该蛋白质固定化于不溶性载体而得到的抗体吸附剂、和使用该吸附剂的抗体的分离方法。
背景技术
Fc受体是与免疫球蛋白分子的Fc区域结合的一组分子。各个分子通过属于免疫球蛋白超家族的识别结构域，利用Fc受体上的识别结构域识别单一或相同组的免疫球蛋白同种型。由此决定免疫应答中何种辅助细胞起作用。Fc受体可进一步分类成几种亚型，有IgG(免疫球蛋白G)的受体即Fcγ受体、与IgE的Fc区域结合的Fcε受体、与IgA的Fc区域结合的Fcα受体等。另外，各受体更详细地分类，报导了Fcγ受体有FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb和FcγRIIIa、FcγRIIIb的存在(非专利文献1)。
Fcγ受体中，FcγRIIIa存在于自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞等细胞表面，是人免疫机构中参与十分重要的ADCC(抗体依赖的细胞介导的细胞毒性)活性的重要的受体。有报导称，该FcγRIIIa与人IgG的亲和性为表示结合强度的结合常数(Ka)为107M-1以下(非专利文献2)。人FcγRIIIa的氨基酸序列(序列号1)被UniProt(Accession number：P08637)等公共数据库发布。另外，对于人FcγRIIIa的结构上的功能结构域、用于贯穿细胞膜的信号肽序列、细胞膜贯穿区域的位置，也同样被发布。图1表示人FcγRIIIa的结构示意图。需要说明的是，图1中的序号表示氨基酸号，该编号与序列号1中记载的氨基酸号对应。即，序列号1中的第1位的甲硫氨酸(Met)至第16位的丙氨酸(Ala)为止为信号序列(S)；第17位的甘氨酸(Gly)至第208位的谷氨酰胺(Gln)为止为细胞外区域(EC)；第209位的缬氨酸(Val)至第229位的缬氨酸(Val)为止为细胞膜贯穿区域(TM)以及第230位的赖氨酸(Lys)至第254位的赖氨酸(Lys)为止为细胞内区域(C)。需要说明的是，已知FcγRIIIa与IgG1至IgG4的人IgG亚类中特别是IgG1和IgG3强结合、而与IgG2和IgG4的结合弱。
另外，近年、癌、免疫疾病等的治疗中使用包含抗体的药品(抗体药物)。抗体药物中使用的抗体将通过基因工程学方法得到的、能够表达该抗体的细胞(例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞等)培养后，使用柱色谱法等纯化为高纯度来制造，但近年来的研究表明，前述抗体通过接受氧化、还原、异构化、糖链附加等修饰而变为各种分子集合体，担心会对药效、安全性带来影响。
作为对抗体药物中使用的抗体的分子结构进行分析的方法，一直以来，实施了肽图谱、利用二维电泳的分析、包含糖链的切出的LC-MS分析(非专利文献3)。然而任意方法均伴随非常复杂的操作。作为更简便的抗体的分子结构的分析方法，可以举出利用色谱法的分析。具体而言，使用凝胶过滤色谱法，基于分子量分离抗体，从而可以对聚集体、分解物进行分离·定量。另外，通过离子交换色谱法，可以分离抗体分子所具有的电荷差异。然而前述利用色谱法的分析中，无法识别抗体分子的微小结构变化，因此所得分析结果受到限制。
另一方面，色谱法中，利用亲和色谱法的分析可以基于固定化于不溶性载体的亲和配体与抗体的亲和性进行分析。因此，能够识别抗体分子的微小结构变化(专利文献1和非专利文献4)。然而使用专利文献1和非专利文献4中记载的方法，以工业规模分离抗体分子在事实上是困难的，期望得到改善。
进而，已知在抗体药物中所使用的人IgG中，根据Fc区域的第297位的天冬酰胺残基上附加的N型糖链的差异，抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性变化，特别是报导了用去除了作为糖链的一种的岩藻糖的抗体，ADCC活性提高(非专利文献5)。
抗体药物中，抗体所具有的ADCC活性的强度具有重要意义。然而，抗体药物通常利用以动物细胞作为宿主的基因重组技术来制造，无法控制宿主内的糖链附加，因此难以使具有一定的ADCC活性的抗体表达。另外，表达的抗体中，基于ADCC活性的强度分离抗体需要大量时间和劳力。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2013/120929号
非专利文献
非专利文献1：Takai.T.，Jpn.J.Clin.Immunol.，28，318-326，2005
非专利文献2：J.Galon等，Eur.J.Immunol.，27，1928-1932，1997
非专利文献3：Journal of Chromatography A，720，217-225，1996
非专利文献4：mAbs，5(4)，576-586，2013
非专利文献5：Shinkawa.T.，J.Biol.Chem.，278，3466-3473，2003
发明内容
发明要解决的问题
本发明的课题在于，提供：特别是对热、酸的稳定性提高了的Fc结合性蛋白质、该蛋白质的制造方法、以及使用了该蛋白质的抗体吸附剂。
另外，本发明的其他课题在于，提供：使用了固定化有亲和配体的载体的抗体的分离方法中，基于其分子结构的差异能够简便并且高效率地分离前述抗体的方法。
另外，本发明的进一步其他课题在于，提供：基于抗体依赖的细胞介导的细胞毒性的强度分离抗体的方法。
用于解决问题的方案
本发明人等为了解决上述课题进行了深入研究的结果发现，确定了人FcγRIIIa中的涉及稳定性提高的氨基酸残基，并且将该氨基酸残基置换为其他的氨基酸残基的突变体具有对热、酸优异的稳定性，至此完成了本发明。
另外，本发明人等为了解决上述所示的其他课题进行了深入研究，结果发现，向填充了固定化有亲和配体的不溶性载体的柱的平衡化液中添加一定浓度的氯化物离子或硫酸根离子，从而抗体的分离能力提高，至此完成了本发明。
另外，本发明人等为了解决上述所示那样的其他课题进行了深入研究，结果发现，通过使用将Fc结合性蛋白质固定化于不溶性载体而得到的吸附剂，从而基于抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性的强度能够分离抗体，至此完成了本发明。
即，本申请包含以下的(A)至(T)中记载的方案：
(A)一种Fc结合性蛋白质，其包含序列号37中记载的氨基酸序列中从第33位至第208位为止的氨基酸残基，并且该从第33位至第208位为止的氨基酸残基中产生以下的(1)至(84)中的至少任1种氨基酸置换。
(1)序列号37的第45位的苯丙氨酸置换为异亮氨酸或亮氨酸
(2)序列号37的第55位的谷氨酸置换为甘氨酸
(3)序列号37的第64位的谷氨酰胺置换为精氨酸
(4)序列号37的第67位的酪氨酸置换为丝氨酸
(5)序列号37的第77位的苯丙氨酸置换为酪氨酸
(6)序列号37的第93位的天门冬氨酸置换为甘氨酸
(7)序列号37的第98位的天门冬氨酸置换为谷氨酸
(8)序列号37的第106位的谷氨酰胺置换为精氨酸
(9)序列号37的第128位的谷氨酰胺置换为亮氨酸
(10)序列号37的第133位的缬氨酸置换为谷氨酸
(11)序列号37的第135位的赖氨酸置换为天冬酰胺或谷氨酸
(12)序列号37的第156位的苏氨酸置换为异亮氨酸
(13)序列号37的第158位的亮氨酸置换为谷氨酰胺
(14)序列号37的第187位的苯丙氨酸置换为丝氨酸
(15)序列号37的第191位的亮氨酸置换为精氨酸
(16)序列号37的第196位的天冬酰胺置换为丝氨酸
(17)序列号37的第204位的异亮氨酸置换为缬氨酸
(18)序列号37的第34位的甲硫氨酸置换为异亮氨酸、赖氨酸或苏氨酸
(19)序列号37的第37位的谷氨酸置换为甘氨酸或赖氨酸
(20)序列号37的第39位的亮氨酸置换为甲硫氨酸或精氨酸
(21)序列号37的第49位的谷氨酰胺置换为脯氨酸
(22)序列号37的第62位的赖氨酸置换为异亮氨酸或谷氨酸
(23)序列号37的第64位的谷氨酰胺置换为色氨酸
(24)序列号37的第67位的酪氨酸置换为组氨酸或天冬酰胺
(25)序列号37的第70位的谷氨酸置换为甘氨酸或天门冬氨酸
(26)序列号37的第72位的天冬酰胺置换为丝氨酸或异亮氨酸
(27)序列号37的第77位的苯丙氨酸置换为亮氨酸
(28)序列号37的第80位的谷氨酸置换为甘氨酸
(29)序列号37的第81位的丝氨酸置换为精氨酸
(30)序列号37的第83位的异亮氨酸置换为亮氨酸
(31)序列号37的第84位的丝氨酸置换为脯氨酸
(32)序列号37的第85位的丝氨酸置换为天冬酰胺
(33)序列号37的第87位的丙氨酸置换为苏氨酸
(34)序列号37的第90位的酪氨酸置换为苯丙氨酸
(35)序列号37的第91位的苯丙氨酸置换为精氨酸
(36)序列号37的第93位的天门冬氨酸置换为缬氨酸或谷氨酸
(37)序列号37的第94位的丙氨酸置换为谷氨酸
(38)序列号37的第97位的缬氨酸置换为甲硫氨酸和谷氨酸
(39)序列号37的第98位的天门冬氨酸置换为丙氨酸
(40)序列号37的第102位的谷氨酸置换为天门冬氨酸
(41)序列号37的第106位的谷氨酰胺置换为亮氨酸
(42)序列号37的第109位的亮氨酸置换为谷氨酰胺
(43)序列号37的第117位的谷氨酰胺置换为亮氨酸
(44)序列号37的第119位的谷氨酸置换为缬氨酸
(45)序列号37的第121位的组氨酸置换为精氨酸
(46)序列号37的第130位的脯氨酸置换为亮氨酸
(47)序列号37的第135位的赖氨酸置换为酪氨酸
(48)序列号37的第136位的谷氨酸置换为缬氨酸
(49)序列号37的第141位的组氨酸置换为谷氨酰胺
(50)序列号37的第146位的丝氨酸置换为苏氨酸
(51)序列号37的第154位的赖氨酸置换为精氨酸
(52)序列号37的第159位的谷氨酰胺置换为组氨酸
(53)序列号37的第163位的甘氨酸置换为缬氨酸
(54)序列号37的第165位的赖氨酸置换为甲硫氨酸
(55)序列号37的第167位的苯丙氨酸置换为酪氨酸
(56)序列号37的第169位的组氨酸置换为酪氨酸
(57)序列号37的第174位的酪氨酸置换为苯丙氨酸
(58)序列号37的第177位的赖氨酸置换为精氨酸
(59)序列号37的第185位的丝氨酸置换为甘氨酸
(60)序列号37的第194位的丝氨酸置换为精氨酸
(61)序列号37的第196位的天冬酰胺置换为赖氨酸
(62)序列号37的第201位的苏氨酸置换为丙氨酸
(63)序列号37的第203位的天冬酰胺置换为异亮氨酸或赖氨酸
(64)序列号37的第207位的苏氨酸置换为丙氨酸
(65)序列号37的第94位的丙氨酸置换为丝氨酸
(66)序列号37的第98位的天门冬氨酸置换为谷氨酸
(67)序列号37的第117位的谷氨酰胺置换为精氨酸
(68)序列号37的第174位的酪氨酸置换为组氨酸
(69)序列号37的第181位的赖氨酸置换为谷氨酸
(70)序列号37的第203位的天冬酰胺置换为天门冬氨酸或酪氨酸
(71)序列号37的第56位的赖氨酸置换为谷氨酰胺
(72)序列号37的第62位的赖氨酸置换为天冬酰胺
(73)序列号37的第66位的丙氨酸置换为苏氨酸
(74)序列号37的第72位的天冬酰胺置换为酪氨酸
(75)序列号37的第78位的组氨酸置换为亮氨酸
(76)序列号37的第81位的丝氨酸置换为甘氨酸
(77)序列号37的第90位的酪氨酸置换为组氨酸
(78)序列号37的第138位的天门冬氨酸置换为谷氨酸
(79)序列号37的第153位的组氨酸置换为谷氨酰胺
(80)序列号37的第156位的苏氨酸置换为丙氨酸、精氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、缬氨酸或甲硫氨酸
(81)序列号37的第157位的酪氨酸置换为苯丙氨酸
(82)序列号37的第174位的酪氨酸置换为亮氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、色氨酸或缬氨酸
(83)序列号37的第206位的异亮氨酸置换为缬氨酸
(84)序列号37的第207位的苏氨酸置换为异亮氨酸
(B)根据(A)所述的Fc结合性蛋白质，其包含序列号39、序列号43、序列号47、序列号51、序列号55、序列号63、序列号67、序列号69、序列号73、序列号77、序列号83、序列号89中任一者记载的氨基酸序列中从第33位至第208位为止的氨基酸残基。
(C)根据(B)所述的Fc结合性蛋白质，其包含序列号39、序列号43、序列号47、序列号51、序列号55、序列号63、序列号67、序列号69、序列号73、序列号77、序列号83、序列号89中任一者记载的氨基酸序列。
(D)一种Fc结合性蛋白质，(A)所述的Fc结合性蛋白质中，进一步产生以下的(85)至(88)中的至少任1种氨基酸置换。
(85)序列号37的第82位的亮氨酸置换为组氨酸或精氨酸
(86)序列号37的第163位的甘氨酸置换为天门冬氨酸
(87)序列号37的第174位的酪氨酸置换为组氨酸
(88)序列号37的第192位的缬氨酸置换为苯丙氨酸
(E)一种吸附剂，其是将(A)至(D)中任一项所述的Fc结合性蛋白质固定化于不溶性载体而得到的。
(F)一种抗体的分离方法，其包括如下工序：向填充有(E)所述的吸附剂的柱中添加平衡化液使柱平衡化的工序；向前述平衡化的柱中添加包含抗体的溶液，使前述抗体吸附于前述载体的工序；和，使用洗脱液，使吸附于前述载体的抗体洗脱的工序。
(G)根据(F)所述的分离方法，其中，平衡化液包含30mM以上的氯化物离子或硫酸根离子。
(H)一种分离抗体的方法，其使用(E)所述的吸附剂，基于抗体依赖的细胞介导的细胞毒性的强度对抗体进行分离。
(I)一种抗体，其是由(F)至(H)中任一项所述的分离方法得到的。
(J)一种识别糖链结构的差异的方法，其通过使用(E)所述的吸附剂分离抗体，从而识别抗体所具有的糖链结构的差异。
(K)一种糖链的分离方法，其使用了(E)所述的吸附剂。
(L)一种糖链，其是由(K)所述的分离方法得到的。
(M)一种多核苷酸，其编码(A)至(D)中任一项所述的Fc结合性蛋白质。
(N)一种表达载体，其包含(M)所述的多核苷酸。
(O)一种转化体，其是以(N)所述的表达载体转化宿主而得到的。
(P)根据(O)所述的转化体，其中，宿主为大肠杆菌。
(Q)一种Fc结合性蛋白质的制造方法，通过对(O)或(P)所述的转化体进行培养而使Fc结合性蛋白质表达，从该培养物中回收表达的Fc结合性蛋白质。
(R)一种抗体的分离方法，其包括如下工序：向填充了固定化有Fc结合性蛋白质的不溶性载体的柱中添加平衡化液使柱平衡化的工序；向前述平衡化的柱中添加包含抗体的溶液，使前述抗体吸附于前述载体的工序；和，使用洗脱液，使吸附于前述载体的抗体洗脱的工序，其中，前述平衡化液包含30mM以上的氯化物离子或硫酸根离子。
(S)一种分离方法，其使用将Fc结合性蛋白质固定化于不溶性载体而得到的吸附剂，基于抗体依赖的细胞介导的细胞毒性的强度对抗体进行分离。
(T)根据(R)或(S)所述的方法，其中，Fc结合性蛋白质为人FcγRIIIa。
以下，对本发明详细地进行说明。
本发明的Fc结合性蛋白质是具有与抗体的Fc区域的结合性的蛋白质，是包含含有序列号1中记载的氨基酸序列的人FcγRIIIa的细胞外区域(图1的EC的区域)中至少第17位的甘氨酸至第192位的谷氨酰胺为止的氨基酸残基的蛋白质，是该第17位至第192位为止的氨基酸残基中的特定位点产生了氨基酸置换的蛋白质。因此，本发明的Fc结合性蛋白质可以包含位于细胞外区域的N末端侧的信号肽区域(图1的S)的全部或者一部分，也可以包含位于细胞外区域的C末端侧的细胞膜贯穿区域(图1的TM)和细胞内区域(图1的C)的全部或者一部分。前述特定位点中的氨基酸置换具体而言，已知有序列号1中记载的氨基酸序列中产生了如下至少任1种置换的突变体：Val27Glu(该标记表示序列号1的第27位(序列号37中为第43位)的缬氨酸置换为谷氨酸，以下同样)、Tyr35Asn、Phe75Leu、Asn92Ser、Glu121Gly、Phe29Ile、Phe29Leu、Glu39Gly、Gln48Arg、Tyr51Ser、Phe61Tyr、Asp77Gly、Asp82Glu、Gln90Arg、Gln112Leu、Val117Glu、Lys119Asn、Lys119Glu、Thr140Ile、Leu142Gln、Phe171Ser、Leu175Arg、Asn180Ser、Ile188Val、Met18Ile、Met18Lys、Met18Thr、Glu21Gly、Glu21Lys、Leu23Met、Leu23Arg、Gln33Pro、Lys46Ile、Lys46Glu、Gln48Trp、Tyr51His、Tyr51Asn、Glu54Gly、Glu54Asp、Asn56Ser、Asn56Ile、Phe61Leu、Glu64Gly、Ser65Arg、Ile67Leu、Ser68Pro、Ser69Asn、Ala71Thr、Tyr74Phe、Phe75Arg、Asp77Val、Asp77Glu、Ala78Glu、Val81Met、Val81Glu、Asp82Ala、Glu86Asp、Gln90Leu、Leu93Gln、Gln101Leu、Glu103Val、His105Arg、Pro114Leu、Lys119Tyr、Glu120Val、His125Gln、Ser130Thr、Lys138Arg、Gln143His、Gly147Val、Lys149Met、Phe151Tyr、His153Tyr、Tyr158Phe、Lys161Arg、Ser169Gly、Ser178Arg、Asn180Lys、Thr185Ala、Asn187Ile、Asn187Lys、Thr191Ala、Ala78Ser、Asp82Glu、Gln101Arg、Tyr158His、Lys165Glu、Asn187Asp、Asn187Tyr、Lys40Gln、Lys46Asn、Ala50Thr、Asn56Tyr、His62Leu、Ser65Gly、Tyr74His、Asp122Glu、His137Gln、Thr140Ala、Thr140Arg、Thr140Leu、Thr140Lys、Thr140Phe、Thr140Ser、Thr140Val、Thr140Met、Tyr141Phe、Tyr158Leu、Tyr158Cys、Tyr158Ile、Tyr158Lys、Tyr158Trp、Tyr158Val、Ile190Val、Thr191Ile。需要说明的是，已知野生型FcγRIIIa中有产生了Leu66His、Leu66Arg、Gly147Asp、Tyr158His、Val176Phe中任意1种以上的氨基酸置换的突变体，但除了前述特定位点中的氨基酸置换以外，也可以含有这些氨基酸置换。
通过进行氨基酸置换来制备本发明的Fc结合性蛋白质时，对于特定位点的氨基酸残基，只要具有抗体结合活性，也可以置换为前述的氨基酸以外的氨基酸。作为其一例，可列举出保守的置换即两氨基酸的物理性质和化学性质或者其一类似的氨基酸间进行置换。对于本领域技术人员来说已知的是，保守的置换不限定于Fc结合性蛋白质，通常在产生置换的氨基酸与没有产生置换的氨基酸之间维持了蛋白质的功能。作为保守的置换的一例，可列举出甘氨酸与丙氨酸之间、天冬氨酸与谷氨酸之间、丝氨酸与脯氨酸之间、或者谷氨酸与丙氨酸之间产生的置换(蛋白质的结构和功能，MEDICAL SCIENCES INTERNATIONAL,LTD.，9，2005)。
本发明的Fc结合性蛋白质中，对置换的氨基酸个的数没有特别限制。作为一例，可以举出以下的(a)至(l)所示的Fc结合性蛋白质。这些Fc结合性蛋白质从对热、酸或碱的稳定性提高的方面出发而优选。
(a)包含序列号37中记载的氨基酸序列中从第33位至第208位为止的氨基酸残基，并且该从第33位至第208位为止的氨基酸残基中，分别地第45位的苯丙氨酸置换为异亮氨酸、第133位的缬氨酸置换为谷氨酸的Fc结合性蛋白质(包含序列号39中记载的氨基酸序列中从第33位至第208位为止的氨基酸序列的Fc结合性蛋白质)。
(b)包含序列号37中记载的氨基酸序列中从第33位至第208位为止的氨基酸残基，并且该从第33位至第208位为止的氨基酸残基中，分别地第45位的苯丙氨酸置换为异亮氨酸、第133位的缬氨酸置换为谷氨酸、第187位的苯丙氨酸置换为丝氨酸的Fc结合性蛋白质(包含序列号43中记载的氨基酸序列中从第33位至第208位为止的氨基酸序列的Fc结合性蛋白质)。
(c)包含序列号37中记载的氨基酸序列中从第33位至第208位为止的氨基酸残基，并且该从第33位至第208位为止的氨基酸残基中，分别地第45位的苯丙氨酸置换为异亮氨酸、第64位的谷氨酰胺置换为精氨酸、第133位的缬氨酸置换为谷氨酸、第187位的苯丙氨酸置换为丝氨酸的Fc结合性蛋白质(包含序列号47中记载的氨基酸序列中从第33位至第208位为止的氨基酸序列的Fc结合性蛋白质)。
(d)包含序列号37中记载的氨基酸序列中从第33位至第208位为止的氨基酸残基，并且该从第33位至第208位为止的氨基酸残基中，分别地第45位的苯丙氨酸置换为异亮氨酸、第64位的谷氨酰胺置换为精氨酸、第67位的酪氨酸置换为丝氨酸、第133位的缬氨酸置换为谷氨酸、第187位的苯丙氨酸置换为丝氨酸的Fc结合性蛋白质(包含序列号51中记载的氨基酸序列中从第33位至第208位为止的氨基酸序列的Fc结合性蛋白质)。
(e)包含序列号37中记载的氨基酸序列中从第33位至第208位为止的氨基酸残基，并且该从第33位至第208位为止的氨基酸残基中，分别地第45位的苯丙氨酸置换为异亮氨酸、第64位的谷氨酰胺置换为精氨酸、第67位的酪氨酸置换为丝氨酸、第106位的谷氨酰胺置换为精氨酸、第133位的缬氨酸置换为谷氨酸、第187位的苯丙氨酸置换为丝氨酸的Fc结合性蛋白质(包含序列号55中记载的氨基酸序列中从第33位至第208位为止的氨基酸序列的Fc结合性蛋白质)。
(f)包含序列号37中记载的氨基酸序列中从第33位至第208位为止的氨基酸残基，并且该从第33位至第208位为止的氨基酸残基中，分别地第37位的谷氨酸置换为甘氨酸、第39位的亮氨酸置换为甲硫氨酸、第45位的苯丙氨酸置换为异亮氨酸、第64位的谷氨酰胺置换为精氨酸、第133位的缬氨酸置换为谷氨酸、第187位的苯丙氨酸置换为丝氨酸、第194位的丝氨酸置换为精氨酸的Fc结合性蛋白质(包含序列号63中记载的氨基酸序列中从第33位至第208位为止的氨基酸序列的Fc结合性蛋白质)。
(g)包含序列号37中记载的氨基酸序列中从第33位至第208位为止的氨基酸残基，并且该从第33位至第208位为止的氨基酸残基中，分别地第37位的谷氨酸置换为甘氨酸、第39位的亮氨酸置换为甲硫氨酸、第45位的苯丙氨酸置换为异亮氨酸、第64位的谷氨酰胺置换为精氨酸、第84位的丝氨酸置换为脯氨酸、第133位的缬氨酸置换为谷氨酸、第187位的苯丙氨酸置换为丝氨酸、第194位的丝氨酸置换为精氨酸的Fc结合性蛋白质(包含序列号67中记载的氨基酸序列中从第33位至第208位为止的氨基酸序列的Fc结合性蛋白质)。
(h)包含序列号37中记载的氨基酸序列中从第33位至第208位为止的氨基酸残基，并且该从第33位至第208位为止的氨基酸残基中，分别地第37位的谷氨酸置换为甘氨酸、第39位的亮氨酸置换为甲硫氨酸、第45位的苯丙氨酸置换为异亮氨酸、第64位的谷氨酰胺置换为精氨酸、第84位的丝氨酸置换为脯氨酸、第133位的缬氨酸置换为谷氨酸、第163位的甘氨酸置换为缬氨酸、第187位的苯丙氨酸置换为丝氨酸、第194位的丝氨酸置换为精氨酸的Fc结合性蛋白质(包含序列号69中记载的氨基酸序列中从第33位至第208位为止的氨基酸序列的Fc结合性蛋白质)。
(i)包含序列号37中记载的氨基酸序列中从第33位至第208位为止的氨基酸残基，并且该从第33位至第208位为止的氨基酸残基中，分别地第37位的谷氨酸置换为甘氨酸、第39位的亮氨酸置换为甲硫氨酸、第45位的苯丙氨酸置换为异亮氨酸、第64位的谷氨酰胺置换为精氨酸、第67位的酪氨酸置换为组氨酸、第70位的谷氨酸置换为天门冬氨酸、第84位的丝氨酸置换为脯氨酸、第133位的缬氨酸置换为谷氨酸、第163位的甘氨酸置换为缬氨酸、第187位的苯丙氨酸置换为丝氨酸、第194位的丝氨酸置换为精氨酸的Fc结合性蛋白质(包含序列号73中记载的氨基酸序列中从第33位至第208位为止的氨基酸序列的Fc结合性蛋白质)。
(j)包含序列号37中记载的氨基酸序列中从第33位至第208位为止的氨基酸残基，并且该从第33位至第208位为止的氨基酸残基中，分别地第37位的谷氨酸置换为甘氨酸、第39位的亮氨酸置换为甲硫氨酸、第45位的苯丙氨酸置换为异亮氨酸、第64位的谷氨酰胺置换为精氨酸、第67位的酪氨酸置换为组氨酸、第70位的谷氨酸置换为天门冬氨酸、第84位的丝氨酸置换为脯氨酸、第133位的缬氨酸置换为谷氨酸、第156位的苏氨酸置换为异亮氨酸、第163位的甘氨酸置换为缬氨酸、第174位的酪氨酸置换为组氨酸、第181位的赖氨酸置换为谷氨酸、第187位的苯丙氨酸置换为丝氨酸、第194位的丝氨酸置换为精氨酸的Fc结合性蛋白质(包含序列号77中记载的氨基酸序列中从第33位至第208位为止的氨基酸序列的Fc结合性蛋白质)。
(k)包含序列号37中记载的氨基酸序列中从第33位至第208位为止的氨基酸残基，并且该从第33位至第208位为止的氨基酸残基中，分别地第37位的谷氨酸置换为甘氨酸、第39位的亮氨酸置换为甲硫氨酸、第45位的苯丙氨酸置换为异亮氨酸、第64位的谷氨酰胺置换为精氨酸、第67位的酪氨酸置换为组氨酸、第70位的谷氨酸置换为天门冬氨酸、第84位的丝氨酸置换为脯氨酸、第98位的天门冬氨酸置换为谷氨酸、第117位的谷氨酰胺置换为亮氨酸、第133位的缬氨酸置换为谷氨酸、第156位的苏氨酸置换为异亮氨酸、第163位的甘氨酸置换为缬氨酸、第174位的酪氨酸置换为组氨酸、第181位的赖氨酸置换为谷氨酸、第187位的苯丙氨酸置换为丝氨酸、第194位的丝氨酸置换为精氨酸的Fc结合性蛋白质(包含序列号83中记载的氨基酸序列中从第33位至第208位为止的氨基酸序列的Fc结合性蛋白质)。
(l)包含序列号37中记载的氨基酸序列中从第33位至第208位为止的氨基酸残基，并且该从第33位至第208位为止的氨基酸残基中，分别地第37位的谷氨酸置换为甘氨酸、第39位的亮氨酸置换为甲硫氨酸、第45位的苯丙氨酸置换为异亮氨酸、第64位的谷氨酰胺置换为精氨酸、第67位的酪氨酸置换为组氨酸、第70位的谷氨酸置换为天门冬氨酸、第84位的丝氨酸置换为脯氨酸、第94位的丙氨酸置换为丝氨酸、第98位的天门冬氨酸置换为谷氨酸、第117位的谷氨酰胺置换为亮氨酸、第133位的缬氨酸置换为谷氨酸、第156位的苏氨酸置换为异亮氨酸、第163位的甘氨酸置换为缬氨酸、第174位的酪氨酸置换为组氨酸、第181位的赖氨酸置换为谷氨酸、第187位的苯丙氨酸置换为丝氨酸、第194位的丝氨酸置换为精氨酸、第201位的苏氨酸置换为丙氨酸、第203位的天冬酰胺置换为天门冬氨酸的Fc结合性蛋白质(包含序列号89中记载的氨基酸序列中从第33位至第208位为止的氨基酸序列的Fc结合性蛋白质)。
本发明的Fc结合性蛋白质也可以在其N末端侧或C末端侧进一步附加在从杂质存在下的溶液中分离时有用的寡肽。作为前述寡肽，可列举出聚组氨酸、聚赖氨酸、聚精氨酸、聚谷氨酸、聚天冬氨酸等。另外，也可以将包含半胱氨酸的寡肽附加于本发明的Fc结合性蛋白质的N末端侧或C末端侧，所述包含半胱氨酸的寡肽在将本发明的Fc结合性蛋白质固定化于色谱法用的支持体等固相时是有用的。对于Fc结合性蛋白质的N末端侧或C末端侧所附加的寡肽的长度，只要不有损作为本发明的Fc结合性蛋白质的IgG结合性、稳定性，则没有特别的限制。可以在使前述寡肽附加于本发明的Fc结合性蛋白质时，制备编码前述寡肽的多核苷酸之后，使用本领域技术人员公知的方法基因工程地附加在Fc结合性蛋白质的N末端侧或C末端侧，也可以使化学地合成的前述寡肽化学地结合并附加于本发明的Fc结合性蛋白质的N末端侧或C末端侧。进而，也可以在本发明的Fc结合性蛋白质的N末端侧附加用于促进在宿主中的有效表达的信号肽。作为宿主为大肠杆菌的情况下的前述信号肽的例子，可例示出：PelB(序列号101)、DsbA、MalE(UniProt No.P0AEX9中记载的氨基酸序列中第1位至第26位为止的区域)、TorT等这样的使蛋白质分泌于周质的信号肽(日本特开2011-097898号公报)。
本发明的Fc结合性蛋白质中可以具有糖链也可以不具有糖链。为了得到具有糖链的Fc结合性蛋白质，也可以使用动物细胞、酵母、昆虫细胞等作为宿主。进而也可以对人工地合成的糖链进行修饰。另外，为了得到不具有糖链的Fc结合性蛋白质，也可以使用大肠杆菌等作为不引起糖链附加的宿主。进而通过进行从具有糖链的Fc结合性蛋白质去除糖链的操作，从而也可以得到不具有糖链的Fc结合性蛋白质。
作为本发明的多核苷酸的制作方法的一例，可例示出：
(I)由本发明的Fc结合性蛋白质的氨基酸序列转换成核苷酸序列，人工地合成包含该核苷酸序列的多核苷酸的方法；
(II)直接人工地制备包含Fc结合性蛋白质的整体或部分序列的多核苷酸，或者由Fc结合性蛋白质的cDNA等使用PCR法这样的DNA扩增法来制备包含Fc结合性蛋白质的整体或部分序列的多核苷酸，用适当的方法将制备的该多核苷酸进行连接的方法。
前述(I)的方法中，由氨基酸序列转换成核苷酸序列时，优选考虑转化的宿主中的密码子的使用频率而进行转换。作为一例，宿主为大肠杆菌(Escherichia coli)的情况下，精氨酸(Arg)中的AGA/AGG/CGG/CGA、异亮氨酸(Ile)中的ATA、亮氨酸(Leu)中的CTA、甘氨酸(Gly)中的GGA、脯氨酸(Pro)中的CCC由于分别使用频率少(由于是所谓的罕用密码子)、所以避开这些密码子而进行更换即可。密码子的使用频率的解析也可以利用公共数据库(例如,Kazusa DNA Research Institute的主页中的Codon Usage Database等)。
对本发明的多核苷酸导入突变的情况下，可以使用易错聚合酶链反应(error-prone PCR)法。对于易错PCR法中的反应条件，只要是对编码Fc结合性蛋白质的多核苷酸导入所希望的突变的条件，则没有特别的限定；例如，将作为底物的4种脱氧核苷酸(dATP/dTTP/dCTP/dGTP)的浓度设为不均匀、以0.01至10mM(优选为0.1至1mM)的浓度向PCR反应液中添加MnCl2而进行PCR，由此能够向多核苷酸中导入突变。另外，作为易错PCR法以外的突变导入方法，可列举出如下方法：使包含Fc结合性蛋白质的整体或部分序列的多核苷酸与作为突变原的试剂接触·作用，或照射紫外线，从而向多核苷酸导入突变来制备。作为该方法中作为突变原而使用的试剂，可以使用羟基胺、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍、亚硝酸、亚硫酸、肼等本领域技术人员通常使用的突变原性试剂。
对于使本发明的Fc结合性蛋白质表达的宿主没有特别限制，作为一例，可以举出：动物细胞(CHO细胞、HEK细胞、Hela细胞、COS细胞等)、酵母[酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、毕赤酵母(Pichia pastoris)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、刺参裂殖酵母(Schizosaccharomyces japonicus)、八孢裂殖酵母(Schizosaccharomycesoctosporus)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)等]、昆虫细胞(Sf9、Sf21等)、大肠杆菌(JM109株、BL21(DE3)株、W3110株等)、枯草杆菌。需要说明的是，使用动物细胞、大肠杆菌作为宿主时，从生产率的方面出发为优选，进一步优选使用大肠杆菌作为宿主。
使用本发明的多核苷酸来转化宿主的情况下，可以使用本发明的多核苷酸其自身，更优选使用在表达载体(例如，原核细胞、真核细胞的转化中通常使用的噬菌体、黏粒、质粒等)的适当的位点***了本发明的多核苷酸的表达载体。需要说明的是，该表达载体只要是能够在转化的宿主内稳定地存在并复制的物质则没有特别的限制，以大肠杆菌作为宿主的情况下，可例示出：pET质粒载体、pUC质粒载体、pTrc质粒载体、pCDF质粒载体、pBBR质粒载体。另外，前述适当的位点是指不破坏涉及表达载体的复制功能、所希望的抗生素标记物、传递性的区域的位点。向前述表达载体中***本发明的多核苷酸时，优选以与表达所需要的启动子这样的功能性多核苷酸连接的状态***。作为该启动子的例子，在宿主为大肠杆菌的情况下，可列举出trp启动子、tac启动子、trc启动子、lac启动子、T7启动子、recA启动子、lpp启动子、进而λ噬菌体的λPL启动子、λPR启动子，宿主为动物细胞的情况下，列举出SV40启动子、CMV启动子、CAG启动子。
为了使用通过前述方法制备的***了本发明的多核苷酸的表达载体(以下，作为本发明的表达载体)来转化宿主，可以用本领域技术人员通常使用的方法进行。例如，作为宿主选择属于埃希氏杆菌(Escherichia)属的微生物(大肠杆菌JM109株、大肠杆菌BL21(DE3)株、大肠杆菌W3110株等)的情况下，可以通过公知的文献(例如,Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory，256，1992)中记载的方法等进行转化。需要说明的是，宿主为动物细胞的情况下，可以使用电穿孔、脂质体转染。对于用前述的方法转化而得到的转化体可以用适当的方法进行筛选，从而得到能够表达本发明的Fc结合性蛋白质的转化体(以下，作为本发明的转化体)。
为了由本发明的转化体制备本发明的表达载体，可以利用适于转化中使用的宿主的方法，从本发明的转化体中提取本发明的表达载体来制备。
例如，本发明的转化体的宿主为大肠杆菌的情况下，可以从培养转化体而得到的培养物中使用碱提取法或QIAprep Spin Miniprep kit(QIAGEN制)等市售的提取试剂盒进行制备。
对本发明的转化体进行培养，由得到的培养物对本发明的Fc结合性蛋白质进行回收，由此能够制造本发明的Fc结合性蛋白质。需要说明的是，本说明书中，培养物除了指所培养的本发明的转化体的细胞自身以外，也包括培养中所使用的培养基。本发明的蛋白质制造方法中所使用的转化体只要用适合于对象宿主培养的培养基进行培养即可，宿主为大肠杆菌的情况下，作为优选的培养基的一例，可列举出添加了必要的营养源的LB(Luria-Bertani)培养基。需要说明的是，为了通过本发明的表达载体有无导入来选择地使本发明的转化体增殖，优选向培养基中添加对应于该载体所包含的药剂耐性基因的药剂而进行培养。例如，该载体包含卡那霉素耐性基因的情况下，可以向培养基中添加卡那霉素。另外，培养基中除了碳、氮和无机盐供给源之外，也可以添加适当的营养源，也可以根据需要含有选自由谷胱甘肽、半胱氨酸、半胱胺、巯基乙酸盐和二硫苏糖醇组成的组的一种以上还原剂。进而，也可以添加甘氨酸这样的促进由前述转化体向培养液分泌蛋白质的试剂；具体而言，宿主为大肠杆菌的情况下，优选对培养基添加2％(w/v)以下的甘氨酸。宿主为大肠杆菌的情况下，培养温度通常为10℃至40℃、优选为20℃至37℃、更优选为25℃左右，根据表达的蛋白质的特性进行选择即可。宿主为大肠杆菌的情况下，培养基的pH为pH6.8至pH7.4，优选为pH7.0左右。另外，本发明的载体中含有诱导性的启动子的情况下，优选在本发明的Fc结合性蛋白质能够良好表达的条件下实施诱导。作为诱导剂，可例示出IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)。宿主为大肠杆菌的情况下，测定培养液的浊度(600nm处的吸光度)，成为约0.5至1.0时，添加适当量的IPTG之后，继续进行培养，由此能够诱导Fc结合性蛋白质的表达。IPTG的添加浓度可以从0.005至1.0mM的范围适宜选择，但优选为0.01至0.5mM的范围。与IPTG诱导相关的各种条件按照该技术领域中公知的条件进行即可。
为了从培养本发明的转化体而得到的培养物中回收本发明的Fc结合性蛋白质，可以采用适合于本发明的转化体中的本发明的Fc结合性蛋白质的表达形态的方法，从该培养物中进行分离/纯化，从而回收本发明的Fc结合性蛋白质。例如，在培养上清中表达的情况下，通过离心分离操作分离菌体，从得到的培养上清中纯化本发明的Fc结合性蛋白质即可。另外，在细胞内(包括周质)表达的情况下，通过离心分离操作收集菌体之后，通过添加酶处理剂、表面活性剂等或使用超声波、弗氏压碎器等而将菌体破碎，提取本发明的Fc结合性蛋白质之后进行纯化即可。为了对本发明的Fc结合性蛋白质进行纯化，使用该技术领域中公知的方法即可，作为一例，可列举出使用了液相色谱法的分离/纯化。液相色谱法中有离子交换色谱法、疏水性相互作用色谱法、凝胶过滤色谱法、亲和色谱法等，通过组合这些色谱法进行纯化操作，从而能够高纯度地制备本发明的Fc结合性蛋白质。
作为测定得到的本发明的Fc结合性蛋白质的对IgG的结合活性的方法，使用例如酶联免疫吸附测定法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，以下，记为ELISA)法、表面等离子共振法等测定对于IgG的结合活性。结合活性的测定中使用的IgG优选为人IgG，特别优选为人IgG1、人IgG3。
通过使本发明的Fc结合性蛋白质与不溶性载体结合，能够制造本发明的吸附剂。对于前述不溶性载体，没有特别的限定，可例示出：以琼脂糖、海藻酸盐(alginate)、角叉菜胶、几丁质、纤维素、糊精、葡聚糖、淀粉这样的多糖作为原料的载体；以聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸酯、聚(甲基丙烯酸2-羟基乙基酯)、聚氨酯、聚丙烯酸、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、乙烯基聚合物这样的合成高分子作为原料的载体；以氧化锆、沸石、二氧化硅、覆膜二氧化硅这样的陶瓷作为原料的载体。其中，优选以多糖作为原料的载体、以合成高分子作为原料的载体作为不溶性载体。作为前述优选的载体的一例，可列举出：TOYOPEARL(TOSOH CORPORATION制)等导入了羟基的聚甲基丙烯酸酯凝胶、Sepharose(GE Healthcare制)等琼脂糖凝胶、Cellufine(JNC Corporation.Corporation.制)等纤维素凝胶。对于不溶性载体的形状，没有特别的限定，可以是粒状物或非粒状物、多孔性或非多孔性的任一者。
为了将Fc结合性蛋白质固定化于不溶性载体，对不溶性载体赋予N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化酯基、环氧基、羧基、马来酰亚胺基、卤代乙酰基、三氟代乙烷磺酰基(Tresyl)、甲酰基、卤代乙酰胺等活性基团,通过该活性基团使人Fc结合性蛋白质与不溶性载体共价结合而进行固定化即可。赋予了活性基团的载体可以直接使用市售的载体；也可以在适当的反应条件下向载体表面导入活性基团而制备。作为赋予了活性基团的市售的载体，可例示出：TOYOPEARL AF-Epoxy-650M、TOYOPEARL AF-Tresyl-650M(均为TOSOH CORPORATION制)、HiTrap NHS-activated HP Columns、NHS-activated Sepharose 4Fast Flow、Epoxy-activated Sepharose 6B(均为GE Healthcare制)、SulfoLink Coupling Resin(ThermoScientific制)。
另一方面，作为向载体表面导入活性基团的方法，可例示出：使存在于载体表面的羟基、环氧基、羧基、氨基等与具有2个以上活性部位的化合物的一者反应的方法。作为该化合物的一例中，作为对载体表面的羟基、氨基导入环氧基的化合物，可例示出：环氧氯丙烷、乙二醇二缩水甘油基醚、丁二醇缩水甘油基醚、己二醇二缩水甘油基醚。通过前述化合物对载体表面导入环氧基之后,作为向载体表面导入羧基的化合物,可例示出:2-巯基乙酸、3-巯基丙酸、4-巯基丁酸、6-巯基丁酸、甘氨酸、3-氨基丙酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸。
作为向载体表面存在的羟基、环氧基、羧基、氨基导入马来酰亚胺基的化合物，可例示出：N-(ε-马来酰亚胺己酸)酰肼、N-(ε-马来酰亚胺丙酸)酰肼、4-[4-N-马来酰亚胺苯基]乙酸酰肼、2-氨基马来酰亚胺、3-氨基马来酰亚胺、4-氨基马来酰亚胺、6-氨基马来酰亚胺、1-(4-氨基苯基)马来酰亚胺、1-(3-氨基苯基)马来酰亚胺、4-(马来酰亚胺)苯基异氰酸酯、2-马来酰亚胺乙酸、3-马来酰亚胺丙酸、4-马来酰亚胺丁酸、6-马来酰亚胺己酸、(N-[α―马来酰亚胺乙酰氧基]琥珀酰亚胺酯)、(马来酰亚胺间苯甲酰)N-羟基琥珀酰亚胺酯、(琥珀酰亚胺基-4-[马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羰基-[6-氨基己酸])、(琥珀酰亚胺基-4-[马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸)、(马来酰亚胺对苯甲酰)N-羟基琥珀酰亚胺酯、(马来酰亚胺间苯甲酰)N-羟基琥珀酰亚胺酯、3-马来酰亚胺丙酸N-琥珀酰亚胺酯。
作为向载体表面存在的羟基、氨基导入卤代乙酰基的化合物，可例示出：氯代乙酸、溴代乙酸、碘代乙酸、氯代乙酰氯、溴代乙酰氯、溴代乙酰溴、氯代乙酸酐、溴代乙酸酐、碘代乙酸酐、2-(碘代乙酰胺)乙酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯、3-(溴代乙酰胺)丙酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯、4-(碘代乙酰基)氨基苯甲酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯。需要说明的是，还可例示出使载体表面存在的羟基、氨基与ω-烯基烷基缩水甘油基醚反应之后，用卤化剂将ω-烯基部位卤化而进行活化的方法。作为ω-烯基烷基缩水甘油基醚，可例示出烯丙基缩水甘油基醚、3-丁烯基缩水甘油基醚、4-戊烯基缩水甘油基醚；作为卤化剂，可例示出N-氯代琥珀酰亚胺、N-溴代琥珀酰亚胺、N-碘代琥珀酰亚胺。
作为向载体表面导入活性基团的方法的其他的例，有如下方法：对于载体表面存在的羧基使用缩合剂和添加剂导入活化基团的方法。作为缩合剂，可例示出1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二酰亚胺(EDC)、二环己基碳二酰亚胺、羰基二咪唑。另外，作为添加剂，可例示出N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、4-硝基苯酚、1-羟基苯并***。
另外，除了前述以外，作为向载体表面导入活性基团的化合物，可以举出：三氟代乙烷磺酰氯(形成三氟代乙烷磺酰基作为活化基团)、溴乙烯(形成乙烯基作为活化基团)。
作为将本发明的Fc结合性蛋白质固定化于不溶性载体时使用的缓冲液，可以举出：乙酸缓冲液、磷酸缓冲液、MES缓冲液、HEPES缓冲液、Tris缓冲液、硼酸缓冲液。对于固定化时的反应温度，在考虑到活性基团的反应性、本发明的Fc结合性蛋白质的稳定性的基础上，从5℃至50℃的温度范围中适当设定即可，优选为10℃至35℃的范围。
本发明的分离方法的特征在于，包括如下工序：向填充了固定化有Fc结合性蛋白质的不溶性载体的柱中添加平衡化液使柱平衡化的工序；向前述平衡化的柱添加包含抗体的溶液，使前述抗体吸附于前述载体的工序；和，使用洗脱液，使吸附于前述载体的抗体洗脱的工序，抗体的分离方法中，前述平衡化液包含30mM以上的氯化物离子或硫酸根离子。根据本发明，可以将抗体成分的分离度以Rs值换算计提高到从1.1倍至1.8倍。因此，也可以检测迄今无法检测到的抗体分子结构的微小的差异，可以提高分析的精度。需要说明的是，前述平衡化液中所含的氯化物离子或硫酸根离子的浓度只要为30mM以上即可，优选为30mM以上且1500mM以下，更优选为30mM以上且1000mM以下，进一步优选为30mM以上且500mM以下，进一步更优选为50mM以上且500mM以下。
为了使用前述平衡化液使前述吸附的抗体洗脱，只要使用减弱前述抗体与Fc结合性蛋白质的亲和性的洗脱液进行洗脱即可。作为一例，可以举出如下梯度洗脱法：分别地，作为平衡化液使用包含30mM以上的氯化物离子或硫酸根离子的pH5.0至6.9的弱酸性缓冲液，作为洗脱液使用pH2.5至4.5的酸性缓冲液。作为缓冲剂，可以从公知的缓冲剂中，基于制成的缓冲液的pH等而适当选择即可，作为一例，可以举出：磷酸、乙酸、甲酸、MES(2-Morpholinoethanesulfonic acid，2-吗啉乙磺酸)、MOPS(3-Morpholinopropanesulfonicacid，3-吗啉乙磺酸)、柠檬酸、琥珀酸、甘氨酸、哌嗪。
对于本发明的分离方法，只要是与Fc结合性蛋白质具有亲和性的、至少包含附加了糖链的抗体的Fc区域的抗体就能够进行分离。作为一例，可以举出：作为抗体药物中使用的抗体一般使用的嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、它们的氨基酸置换体。另外，即使为双特异性抗体(Bispecific antibody)、附加了糖链的抗体的Fc区域与其他蛋白质的融合抗体、附加了糖链的抗体的Fc区域与药物的复合体(ADC)等人工地改变了结构的抗体，也可以用本发明的分离方法进行分离。
另外，对于本发明的分离方法，例如，利用泵等送液手段向填充有将Fc结合性蛋白质固定化于不溶性载体而得到的吸附剂的柱中添加包含抗体的缓冲液，从而使抗体特异性地吸附于前述吸附剂后，向柱中添加适当的洗脱液，由此基于ADCC活性的强度，可以将前述吸附的抗体分离。需要说明的是，在向柱中添加包含抗体的缓冲液之前，使用适当的缓冲液将柱平衡化时，可以将抗体以更高纯度分离，故优选。作为缓冲液，可以举出：磷酸缓冲液等以无机盐作为成分的缓冲液。需要说明的是，缓冲液的pH为pH3～10，优选为pH5～8。为了基于ADCC活性的强度使吸附于前述吸附剂的抗体洗脱，弱化抗体与配体(Fc结合性蛋白质)的相互作用即可，具体而言，可例示出由缓冲液带来的pH变化、抗衡肽(counter peptide)、温度变化、盐浓度变化。作为用于基于ADCC活性的强度使吸附于前述吸附剂的抗体洗脱的洗脱液的具体例，可以举出：比使抗体吸附于前述吸附剂时使用的溶液靠近酸性侧的缓冲液。作为缓冲液的种类，可以举出：在酸性侧具有缓冲能力的柠檬酸缓冲液、甘氨酸盐酸缓冲液、乙酸缓冲液。缓冲液的pH在不破坏抗体所具有的功能的范围内设定即可，优选为pH2.5～6.0，更优选为pH3.0～5.0，进一步优选为pH3.3～4.0。
为了使用将本发明的Fc结合性蛋白质固定化于不溶性载体而得到的本发明的吸附剂，分离具有糖链的抗体，例如，利用泵等送液手段，向填充有本发明的吸附剂的柱中添加包含具有糖链的抗体的缓冲液，从而使具有糖链的抗体特异性地吸附于本发明的吸附剂后，向柱中添加适当的洗脱液，由此可以使具有糖链的抗体洗脱。需要说明的是，在向柱中添加包含具有糖链的抗体的缓冲液之前，使用适当的缓冲液使柱平衡化时，可以将具有糖链的抗体以更高纯度分离，故优选。作为缓冲液，可以举出：磷酸缓冲液等以无机盐作为成分的缓冲液。需要说明的是，缓冲液的pH为pH3～10，优选为pH5～8。为了将本发明的吸附剂所吸附的具有糖链的抗体洗脱，弱化具有糖链的抗体与配体(本发明的Fc结合性蛋白质)的相互作用即可，具体而言，可例示出由缓冲液带来的pH变化、抗衡肽(counter peptide)、温度变化、盐浓度变化。作为用于将本发明的吸附剂所吸附的、具有糖链的抗体洗脱的洗脱液的具体例，可列举出：比使具有糖链的抗体吸附于本发明的吸附剂时所使用的溶液更偏酸性侧的缓冲液。作为缓冲液的种类，可例示出在酸性侧具有缓冲能力的柠檬酸缓冲液、甘氨酸盐酸缓冲液、乙酸缓冲液。对于缓冲液的pH，可以在不有损抗体所具有的功能的范围设定即可，优选pH2.5～6.0，更优选pH3.0～5.0，进而优选pH3.3～4.0。
需要说明的是，从包含具有糖链的抗体的溶液中，使用本发明的吸附剂对前述抗体进行分离时，由于前述抗体所具有的糖链结构的差异，抗体的洗脱位置(洗脱级分)不同。因此，通过使用本发明的吸附剂对抗体进行分离，能够识别抗体所具有的糖链结构的差异。对于能够识别的糖链的结构，没有特别的限定，作为一例，可列举出：以CHO细胞这样的来自动物的细胞或以毕赤酵母、酿酒酵母(Saccharomyces)这样的酵母为宿主使抗体表达时附加的糖链；人抗体所具有的糖链；用化学合成法附加于抗体的糖链。另外，本发明的吸附剂可以基于抗体所具有的糖链结构的差异进行分离，所以也可利用于糖链其自身的分离。
需要说明的是，如上所述通过本发明的吸附剂能够进行抗体的分离、基于ADCC活性的强度能够进行抗体的分离和能够识别抗体的糖链结构的差异，作为该吸附剂中使用的Fc结合性蛋白质，使用除了FcγRIIIa以外的Fc受体(FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa、FcγRIIIb、FcRn)的情况下，也能够同样地识别糖链结构的差异。
发明的效果
本发明的Fc结合性蛋白质是将人FcγRIIIa的细胞外区域中的特定位点的氨基酸残基置换为其他的氨基酸残基的蛋白质。本发明的Fc结合性蛋白质与野生型的人FcγRIIIa相比较，对于热和酸的稳定性提高了。因此，本发明的Fc结合性蛋白质作为用于分离免疫球蛋白的吸附剂的配体是有用的。
另外，本发明的分离方法可以基于药效，利用色谱法、简便并且精度良好地分离抗体或进行包含抗体的Fc区域的分子的分离。因此，根据本发明，可以精度更良好地进行抗体药物的制造工序管理、品质管理。
另外，本发明的分离方法通过使用将Fc结合性蛋白质(例如未附加糖链的人FcγRIIIa)固定化于不溶性载体而得到的吸附剂，从而可以基于抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)的强度分离抗体。
附图说明
图1为人FcγRIIIa的示意图。图中的数字表示序列号1中记载的氨基酸序列的序号。图中的S表示信号序列；EC表示细胞外区域；TM表示细胞膜贯穿区域；C表示细胞内区域。
图2为示出使用FcR5a固定化凝胶的抗体的洗脱图谱的图。图中的FrA、FrB分别表示级分A、级分B的位置。
图3为示出测定利用FcR5a固定化凝胶分离的抗体的ADCC活性的结果的图。
图4为示出附加于抗体的糖链结构的一览的图。图中的N1至N6与表10的N1至N6对应，M1、M2和D1与表11的M1、M2和D1对应。
图5为示出使用FcR9固定化凝胶的抗体的洗脱图谱的图。图中的FrA、FrB、FrC分别表示级分A、级分B、级分C的位置。
图6为示出测定利用FcR9固定化凝胶分离的抗体的ADCC活性的结果的图。
图7为使用添加有氯化钠/或未添加氯化钠的缓冲液(平衡化液)分离单克隆抗体而得到的色谱图。
图8为使用添加有氯化钾的缓冲液(平衡化液)分离单克隆抗体而得到的色谱图。
图9为使用添加有硫酸钠和硫酸铵的缓冲液(平衡化液)分离单克隆抗体而得到的色谱图。
图10为示出评价1个氨基酸置换了的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性的结果的图。图中的野生型表示无氨基酸置换的Fc结合性蛋白质。
图11为示出使用FcR固定化凝胶的抗体的洗脱图谱的图。图中的FrA、FrB分别表示级分A、级分B的位置。
图12为示出测定利用FcR固定化凝胶分离的抗体的ADCC活性的结果的图。
具体实施方式
以下，为了对本发明进一步详细地进行说明示出了实施例，本发明并不限定于实施例。
实施例1Fc结合性蛋白质表达载体的制作
(1)基于从序列号1中记载的人FcγRIIIa氨基酸序列中的第17位的甘氨酸(Gly)至第192位的谷氨酰胺(Gln)为止的氨基酸序列，使用DNAworks法(Nucleic Acids Res.，30，e43，2002)，设计将密码子由人型转换成大肠杆菌型的核苷酸序列。将设计的核苷酸序列示于序列号2。
(2)为了制备包含序列号2中记载的序列的多核苷酸，合成包含序列号3至20中记载的序列的寡核苷酸，使用前述寡核苷酸，进行下述所示的二阶段PCR。
(2-1)第一阶段的PCR：制备表1所示的组成的反应液，对该反应液在98℃下进行5分钟热处理之后，在98℃下进行10秒的第1步骤、在62℃下进行5秒的第2步骤、在72℃下进行90秒的第3步骤，将这3个步骤作为1个循环的反应重复进行10循环，合成多核苷酸，将其作为FcRp1。需要说明的是，表1中的DNA混合物是指将具有序列号3～20中记载的序列的18种寡核苷酸分别采集一定量进行混合而成的溶液。
[表1]
组成 浓度/容量
DNA混合物(序列号3～20) 各2.5mM
5×PrimeSTAR缓冲液(TAKARA BIO INc.制) 10μL
2.5mM dNTPs 4μL
2.5U/μL PrimeSTAR HS(TAKARA BIOI NC.制) 0.5μL
H<sub>2</sub>O 定容至50μL
(2-2)第二阶段的PCR：以(2-1)中合成的FcRp1作为模板、将包含序列号21(5’-TAGCCATGGGCATGCGTACCGAAGATCTGCCGAAAGC-3’)和序列号22(5’-CCCAAGCTTAATGATGATGATGATGATGGCCCCCTTGGGTAATGGTAATATTCACGGTCTCGCTGC-3’)中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物进行实施。具体而言，制备表2所示组成的反应液，对该反应液在98℃下进行5分钟热处理之后，在98℃下进行10秒的第1步骤、在62℃下进行5秒的第2步骤、在72℃下进行1.5分钟的第3步骤，将这3个步骤作为1个循环的反应重复进行30循环来实施。
[表2]
组成 浓度/容量
模板DNA 2μL
正向引物 0.4μM
反向引物 0.4μM
5×PrimeSTAR缓冲液(TAKARA BIO INC.制) 10μL
2.5mM dNTPs 4μL
2.5U/μL PrimeSTAR HS(TAKARA BIO INC.制) 0.5μL
H<sub>2</sub>O 定容至50μL
(3)对(2)中得到的多核苷酸进行纯化，用限制酶NcoI和HindIII进行消化之后，与预先用限制酶NcoI和HindIII进行了消化的表达载体pETMalE(日本特开2011-206046号公报)连接，使用该连接产物转化大肠杆菌BL21株(DE3)。
(4)对得到的转化体用包含50μg/mL的卡那霉素的LB培养基进行培养之后，使用QIAprep Spin Miniprep kit(QIAGEN制)，提取表达载体pET-eFcR。
(5)在(4)中制备的表达载体pET-eFcR中的编码人FcγRIIIa的多核苷酸及其周边的区域中，基于链终止法而使用Big Dye Terminator Cycle Sequencing FS readReaction kit(Life technologies制)供于循环测序反应，利用全自动DNA sequencer ABIPrism 3700DNA analyzer(Life technologies制)对核苷酸序列进行解析。需要说明的是，进行该解析时，使用具有序列号23(5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’)或序列号24(5’-TATGCTAGTTATTGCTCAG-3’)中记载的序列的寡核苷酸作为测序用引物。
分别地，将表达载体pET-eFcR表达的多肽的氨基酸序列示于序列号25中；将编码该多肽的多核苷酸的序列示于序列号26中。需要说明的是，序列号25中，第1位的甲硫氨酸(Met)至第26位的丙氨酸(Ala)为止为MalE信号肽；第27位的赖氨酸(Lys)至第32位的甲硫氨酸(Met)为止为连接子序列；第33位的甘氨酸(Gly)至第208位的谷氨酰胺(Gln)为止为人FcγRIIIa的细胞外区域(序列号1的第17位至第192位为止的区域)；第209位至第210位为止的甘氨酸(Gly)为连接子序列；第211位至第216位的组氨酸(His)为标签序列。
实施例2向Fc结合性蛋白质导入突变以及基因文库的制备
对于实施例1中制备的Fc结合性蛋白质表达载体pET-eFcR中的编码Fc结合性蛋白质的多核苷酸部分，通过易错PCR随机地实施突变导入。
(1)作为模板使用实施例1中制备的pET-eFcR进行易错PCR。易错PCR如下进行：在制备表3所示的组成的反应液之后，将该反应液在95℃下进行2分钟热处理、在95℃下进行30秒的第1步骤、在60℃下进行30秒的第2步骤、在72℃下进行90秒的第3步骤，将这3个步骤作为1个循环的反应进行35循环，最后在72℃下进行7分钟热处理。通过前述易错PCR对编码Fc结合性蛋白质的多核苷酸良好地导入突变，其平均突变导入率为1.26％。
[表3]
组成 浓度/容量
模板DNA(pET-eFcR3) 0.12ng/μL
10μM PCR引物(序列号21) 4μL
10μM PCR引物(序列号22) 4μL
2.5mM MgCl<sub>2</sub> 12μL
10mM dATP 2μL
10mM dGTP 2μL
10mM dCTP 10μL
10mM dTTP 10μL
10mM MnCl<sub>2</sub> 4μL
10×Ex Taq缓冲液(TAKARA BIO INC.制) ×1
GoTaq聚合酶(Promega KK.制) 1μL
H<sub>2</sub>O 定容至100μL
(2)对(1)中得到的PCR产物进行纯化之后，用限制酶NcoI和HindIII进行消化，与预先用相同限制酶消化了的表达载体pETMalE(日本特开2011-206046号公报)连接。
(3)连接反应结束之后，通过电穿孔法将反应液导入至大肠杆菌BL21(DE3)株，用包含50μg/mL的卡那霉素的LB平板培养基进行培养(37℃下18小时)之后，将形成于平板上的菌落作为随机突变体基因文库。
实施例3热稳定化Fc结合性蛋白质的筛选
(1)将实施例2中制备的随机突变体基因文库(转化体)接种于包含50μg/mL的卡那霉素的2YT液体培养基(蛋白胨16g/L、酵母提取物10g/L、氯化钠5g/L)200μL，使用96孔深孔平板在30℃下振荡培养一晚。
(2)培养之后，将5μL的培养液继续植入500μL的包含0.05mM的IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)、0.3％的甘氨酸和50μg/mL的卡那霉素的2YT液体培养基中，使用96孔深孔平板，进一步在20℃下振荡培养一晚。
(3)培养之后，将通过离心操作得到的培养上清用包含150mM的氯化钠的20mM的Tris盐酸缓冲液(pH7.4)稀释2倍。对于稀释后的溶液，在45℃下进行10分钟热处理。
(4)对于(3)的进行了热处理时的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性、以及(3)的没有进行热处理时的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性，分别用下述所示的ELISA法进行测定，将进行了热处理时的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性除以没有进行热处理时的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性，从而计算出残留活性。
(4-1)将作为人抗体的γ-球蛋白制剂(The Chemo-Sero-Therapeutic ResearchInstitute制)以1μg/孔固定化(4℃下18小时)于96孔微孔平板的孔，固定化结束后，利用包含2％(w/v)的SKIM MILK(BD公司制)和150mM的氯化钠的20mM的Tris盐酸缓冲液(pH7.4)进行封闭(blocking)。
(4-2)用洗涤缓冲液(包含0.05％[w/v]的Tween 20、150mM的NaCl的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4))进行洗涤之后，添加评价抗体结合活性的包含Fc结合性蛋白质的溶液，使Fc结合性蛋白质与固定化γ-球蛋白反应(30℃下1小时)。
(4-3)反应结束后，用前述洗涤缓冲液进行洗涤，以100μL/孔添加稀释至100ng/mL的Anti-6His抗体(Bethyl Laboratories公司制)。
(4-4)30℃下使之反应1小时，用前述洗涤缓冲液进行洗涤之后，以50μL/孔添加TMB Peroxidase Substrate(KPL公司制)。通过以50μL/孔添加1M的磷酸来停止显色，用酶标仪(Tecan制)测定450nm的吸光度。
(5)用(4)的方法对约2700株的转化体进行评价，从中选择表达与野生型(没有氨基酸置换)Fc结合性蛋白质相比较热稳定性提高了的Fc结合性蛋白质的转化体。对于前述选择的转化体进行培养，使用QIAprep Spin Miniprep kit(QIAGEN制)制备表达载体。
(6)对于得到的表达载体中所***的编码Fc结合性蛋白质的多核苷酸区域的序列，通过与实施例1(5)的记载同样的方法解析核苷酸序列，从而确定氨基酸的突变位点。
(5)中选择的转化体表达的Fc结合性蛋白质的、相对于野生型(没有氨基酸置换)Fc结合性蛋白质的氨基酸置换位点以及热处理后的残留活性(％)总结示于表4中。包含序列号1中记载的氨基酸序列中的第17位的甘氨酸至第192位的谷氨酰胺为止的氨基酸残基并且该第17位至第192位为止的氨基酸残基中产生Met18Arg(该标记表示序列号1的第18位的甲硫氨酸置换为精氨酸，以下同样)、Val27Glu、Phe29Leu、Phe29Ser、Leu30Gln、Tyr35Asn、Tyr35Asp、Tyr35Ser、Tyr35His、Lys46Ile、Lys46Thr、Gln48His、Gln48Leu、Ala50His、Tyr51Asp、Tyr51His、Glu54Asp、Glu54Gly、Asn56Thr、Gln59Arg、Phe61Tyr、Glu64Asp、Ser65Arg、Ala71Asp、Phe75Leu、Phe75Ser、Phe75Tyr、Asp77Asn、Ala78Ser、Asp82Glu、Asp82Val、Gln90Arg、Asn92Ser、Leu93Arg、Leu93Met、Thr95Ala、Thr95Ser、Leu110Gln、Arg115Gln、Trp116Leu、Phe118Tyr、Lys119Glu、Glu120Val、Glu121Asp、Glu121Gly、Phe151Ser、Phe151Tyr、Ser155Thr、Thr163Ser、Ser167Gly、Ser169Gly、Phe171Tyr、Asn180Lys、Asn180Ser、Asn180Ile、Thr185Ser、Gln192Lys的至少任一种氨基酸置换的Fc结合性蛋白质与野生型的Fc结合性蛋白质相比较，可以说热稳定性提高了。
[表4]
Figure GDA0002777074250000321
将表4所示的进行了氨基酸置换的Fc结合性蛋白质中残留活性最高的产生了Val27Glu和Tyr35Asn的氨基酸置换的Fc结合性蛋白质命名为FcR2，将包含编码FcR2的多核苷酸的表达载体命名为pET-FcR2。将FcR2的氨基酸序列示于序列号27，将编码FcR2的多核苷酸的序列示于序列号28。需要说明的是，序列号27中，第1位的甲硫氨酸(Met)至第26位的丙氨酸(Ala)为止为MalE信号肽；第27位的赖氨酸(Lys)至第32位的甲硫氨酸(Met)为止为连接子序列；第33位的甘氨酸(Gly)至第208位的谷氨酰胺(Gln)为止为FcR2的氨基酸序列(相当于序列号1的第17位至第192位为止的区域)、第209位至第210位为止的甘氨酸(Gly)为连接子序列；第211位至第216位的组氨酸(His)为标签序列。另外，序列号27中，分别地、Val27Glu的谷氨酸存在于第43位、Tyr35Asn的天冬酰胺存在于第51位的位点。
实施例4氨基酸置换Fc结合性蛋白质的制作
通过累积实施例3中判明的、与Fc结合性蛋白质的热稳定性提高相关的氨基酸置换，谋求进一步的稳定性提高。置换氨基酸的累积主要使用PCR进行，制备以下(a)至(c)所示的3种Fc结合性蛋白质。
(a)对于FcR2进一步进行了Phe75Leu的氨基酸置换的FcR3
(b)对于FcR2进一步进行了Phe75Leu和Glu121Gly的氨基酸置换的FcR4
(c)对于FcR4进一步进行了Asn92Ser的氨基酸置换的FcR5a
以下，对各Fc结合性蛋白质的制作方法进行详细说明。
(a)FcR3
从实施例3中已经明确的、涉及热稳定性提高的氨基酸置换中选择Val27Glu、Tyr35Asn和Phe75Leu，从而制备野生型的Fc结合性蛋白质中累积了这些置换的FcR3。具体而言，对于编码FcR2的多核苷酸进行产生Phe75Leu的突变导入，从而制备FcR3。
(a-1)以实施例3中取得的pET-FcR2为模板实施PCR。该PCR中的引物使用具有序列号24和序列号29(5’-AGCCAGGCGAGCAGCTACCTTATTGATGCG-3’)中记载的序列的寡核苷酸。PCR如下进行：制备表5所示组成的反应液之后，对该反应液在98℃下进行5分钟热处理，98℃下进行10秒的第1步骤、55℃下进行5秒的第2步骤、72℃下进行1分钟的第3步骤，将这3个步骤作为1个循环的反应进行30循环，最后在72℃下进行7分钟热处理。将扩增的PCR产物供于琼脂糖凝胶电泳，从该凝胶中使用QIAquick Gel Extraction kit(QIAGEN制)进行纯化。将纯化的PCR产物作为m3F。
[表5]
组成 浓度/容量
模板DNA 2μL
10μM正向引物 1μL
10μM反向引物 1μL
5×PrimeSTAR缓冲液(TAKARA BIO INC.制) 4μL
2.5mM dNTPs 2μL
2.5U/μL PrimeSTAR HS(TAKARA BIO INC.制) 0.5μL
H<sub>2</sub>O 定容至20μL
(a-2)将实施例3中取得的pET-FcR2作为模板、将包含序列号23和序列号30(5’-CCACCGTCGCCGCATCAATAAGGTAGCTGC-3’)中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，除此以外，与(a-1)同样地进行。将纯化的PCR产物作为m3R。
(a-3)将(a-1)和(a-2)中得到的2种PCR产物(m3F、m3R)混合，制备表6所示组成的反应液。进行如下PCR：对该反应液在98℃下进行5分钟热处理之后，98℃下进行10秒的第1步骤、55℃下进行5秒的第2步骤、72℃下进行1分钟的第3步骤，将这3个步骤作为1个循环的反应进行5循环，从而得到连接了m3F和m3R的PCR产物m3p。
[表6]
组成 浓度/容量
PCR产物 各等摩尔
2.5U/μL PrimeSTAR HS(TAKARA BIO INc.制) 0.5μL
5×PrimeSTAR缓冲液(TAKARA BIO INc.制) 4μL
2.5mM dNTPs 2μL
H<sub>2</sub>O 定容至20μL
(a-4)将(a-3)中得到的PCR产物m3p作为模板，将包含序列号23和序列号24中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，进行PCR。PCR如下进行：制备表7所示组成的反应液之后，对该反应液在98℃下进行5分钟热处理，在98℃下进行10秒的第1步骤、在55℃下进行5秒的第2步骤、在72℃下进行1分钟的第3步骤，将这3个步骤作为1个循环的反应进行30循环。由此制备编码对FcR2导入了1位点氨基酸置换的FcR3的多核苷酸。
[表7]
Figure GDA0002777074250000351
(a-5)对(a-4)中得到的多核苷酸进行纯化之后，用限制酶NcoI和HindIII进行消化，与预先用限制酶NcoI和HindIII进行了消化的表达载体pETMalE(日本特开2011-206046号公报)连接，使用其转化大肠杆菌BL21(DE3)株。
(a-6)对得到的转化体用添加了50μg/mL卡那霉素的LB培养基进行培养。通过从回收的菌体(转化体)中提取质粒，从而得到包含编码FcR3的多核苷酸的质粒pET-FcR3，所述FcR3是对野生型Fc结合性蛋白质进行了3位点氨基酸置换的多肽。
(a-7)按照与实施例1(5)同样的方法进行pET-FcR3的核苷酸序列的解析。
将附加了信号序列和聚组氨酸标签的FcR3的氨基酸序列示于序列号31、将编码前述FcR3的多核苷酸的序列示于序列号32。需要说明的是，序列号31中，第1位的甲硫氨酸(Met)至第26位的丙氨酸(Ala)为止为MalE信号肽；第27位的赖氨酸(Lys)至第32位的甲硫氨酸(Met)为止为连接子序列；第33位的甘氨酸(Gly)至第208位的谷氨酰胺(Gln)为止为FcR3的氨基酸序列(相当于序列号1的第17位至第192位为止的区域)、第209位至第210位为止的甘氨酸(Gly)为连接子序列；第211位至第216位的组氨酸(His)为标签序列。另外，序列号31中，分别地、Val27Glu的谷氨酸存在于第43位、Tyr35Asn的天冬酰胺存在于第51位、Phe75Leu的亮氨酸存在于第91位的位点。
(b)FcR4
从实施例3中已经明确的、涉及Fc结合性蛋白质的稳定性提高的氨基酸置换中选择Val27Glu、Tyr35Asn、Phe75Leu和Glu121Gly，从而制备野生型的Fc结合性蛋白质中累积了这些置换的FcR4。具体而言，通过对编码FcR2的多核苷酸进行产生Phe75Leu和Glu121Gly的突变导入来制备FcR4。
(b-1)用与(a-2)同样的方法得到PCR产物m3R。另外，将实施例3中取得的、表达包含Ala71Asp、Phe75Leu和Glu121Gly的氨基酸置换的Fc结合性蛋白质(表4)的质粒作为模板，将包含序列号24和序列号29中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，按照与(a-1)同样的方法进行PCR，从而得到PCR产物m4R。
(b-2)将由(b-1)得到的2种PCR产物(m3R、m4R)进行混合之后，按照与(a-3)同样的方法进行PCR，将m3R和m4R连接。将得到的PCR产物作为m4p。
(b-3)将(b-2)中得到的PCR产物m4p作为模板、将包含序列号23和序列号24中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，按照与(a-4)同样的方法进行PCR。由此制备编码FcR4的多核苷酸。
(b-4)对(b-3)中得到的多核苷酸进行纯化之后，用限制酶NcoI和HindIII进行消化，与预先用限制酶NcoI和HindIII进行了消化的表达载体pETMalE(日本特开2011-206046号公报)连接，使用其转化大肠杆菌BL21(DE3)株。
(b-5)对得到的转化体用添加了50μg/mL卡那霉素的LB培养基进行培养。通过从回收的菌体(转化体)中提取质粒，从而得到包含编码FcR4的多核苷酸的质粒pET-FcR4，所述FcR4是对野生型Fc结合性蛋白质进行了4位点氨基酸置换的多肽。
(b-6)按照与实施例1(5)同样的方法进行pET-FcR4的核苷酸序列的解析。
将附加了信号序列和聚组氨酸标签的FcR4的氨基酸序列示于序列号33、将编码前述FcR4的多核苷酸的序列示于序列号34。需要说明的是，序列号33中，第1位的甲硫氨酸(Met)至第26位的丙氨酸(Ala)为止为MalE信号肽；第27位的赖氨酸(Lys)至第32位的甲硫氨酸(Met)为止为连接子序列；第33位的甘氨酸(Gly)至第208位的谷氨酰胺(Gln)为止为FcR4的氨基酸序列(相当于序列号1的第17位至第192位为止的区域)、第209位至第210位为止的甘氨酸(Gly)为连接子序列；第211位至第216位的组氨酸(His)为标签序列。另外，序列号33中，分别地、Val27Glu的谷氨酸存在于第43位、Tyr35Asn的天冬酰胺存在于第51位、Phe75Leu的亮氨酸存在于第91位、Glu121Gly的甘氨酸存在于第137位的位点。
(c)FcR5a
从实施例3中已经明确的、涉及Fc结合性蛋白质的稳定性提高的氨基酸置换中选择Val27Glu、Tyr35Asn、Phe75Leu、Asn92Ser和Glu121Gly，从而制备野生型的Fc结合性蛋白质中累积了这些置换的FcR5a。具体而言，对于编码(b)中制备的FcR4的多核苷酸进行产生Asn92Ser的突变导入，从而制备FcR5a。
(c-1)将(b)中制备的pET-FcR4作为模板、将包含序列号22和序列号35(5’-GAATATCGTTGCCAGACCAGCCTGAGCACC-3’)中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，除此以外，按照与(a-1)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为m5aF。
(c-2)将(b)中制备的pET-FcR4作为模板、将包含序列号21和序列号36(5’-GATCGCTCAGGGTGCTCAGGCTGGTCTGGC-3’)中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，除此之外，按照与(a-1)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为m5aR。
(c-3)将(c-1)和(c-2)得到的2种PCR产物(m5aF、m5aR)混合之后，用与(a-3)同样的方法进行PCR，将m5aF和m5aR连接。将得到的PCR产物作为m5ap。
(c-4)将(c-3)中得到的PCR产物m5ap作为模板、将包含序列号21和序列号22中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，按照与(a-4)同样的方法进行PCR。由此制备编码FcR5a的多核苷酸。
(c-5)对(c-4)中得到的多核苷酸进行纯化之后，用限制酶NcoI和HindIII进行消化，与预先用限制酶NcoI和HindIII进行了消化的表达载体pETMalE(日本特开2011-206046号公报)连接，使用其转化大肠杆菌BL21(DE3)株。
(c-6)对得到的转化体用添加了50μg/mL卡那霉素的LB培养基进行培养。通过从回收的菌体(转化体)中提取质粒，从而得到包含编码FcR5a的多核苷酸的质粒pET-FcR5a，所述FcR5a是对野生型Fc结合性蛋白质进行了5位点氨基酸置换的多肽。
(c-7)按照与实施例1(5)同样的方法进行pET-FcR5a的核苷酸序列的解析。
将附加了信号序列和聚组氨酸标签的FcR5a的氨基酸序列示于序列号37、将编码前述FcR5a的多核苷酸的序列示于序列号38。需要说明的是，序列号37中，第1位的甲硫氨酸(Met)至第26位的丙氨酸(Ala)为止为MalE信号肽；第27位的赖氨酸(Lys)至第32位的甲硫氨酸(Met)为止为连接子序列；第33位的甘氨酸(Gly)至第208位的谷氨酰胺(Gln)为止为FcR5a的氨基酸序列(相当于序列号1的第17位至第192位为止的区域)、第209位至第210位为止的甘氨酸(Gly)为连接子序列；第211位至第216位的组氨酸(His)为标签序列。另外，序列号37中，分别地、Val27Glu的谷氨酸存在于第43位、Tyr35Asn的天冬酰胺存在于第51位、Phe75Leu的亮氨酸存在于第91位、Asn92Ser的丝氨酸存在于第108位、Glu121Gly的甘氨酸存在于第137位的位点。
实施例5向FcR5a导入突变和基因文库的制作
向编码实施例4(c)中制作的FcR5a的多核苷酸部分通过易错PCR随机地实施突变导入。
(1)作为模板使用实施例4(c)中制作的表达载体pET-FcR5a进行易错PCR。易错PCR如下进行：模板使用pET-FcR5a，除此之外，制备与表3所示的组成同样的反应液后，将该反应液在95℃下进行2分钟热处理，在95℃下进行30秒的第1步骤、在60℃下进行30秒的第2步骤、在72℃下进行90秒的第3步骤，将这3个步骤作为1个循环的反应进行35循环，最后在72℃下进行7分钟热处理。通过该反应，向编码Fc结合性蛋白质的多核苷酸良好地导入突变。
(2)将(1)中得到的PCR产物纯化后，用限制酶NcoI和HindIII进行消化，与预先用相同限制酶消化了的表达载体pETMalE(日本特开2011-206046号公报)连接。
(3)连接反应结束后，通过电穿孔法将反应液导入至大肠杆菌BL21(DE3)株，用包含50μg/mL的卡那霉素的LB平板培养基进行培养后，将形成于平板上的菌落作为随机突变基因文库。
实施例6热稳定化Fc结合性蛋白质的筛选
(1)将实施例5中制作的随机突变基因文库利用实施例3(1)至(2)中记载的方法进行培养，从而使Fc结合性蛋白质表达。
(2)培养后，将通过离心操作而得到的、包含Fc结合性蛋白质的培养上清用纯水稀释至20倍，进而用0.1M的碳酸钠缓冲液(pH10.0)稀释至20倍。之后，将稀释了的溶液在40℃下进行15分钟热处理，用1M的Tris缓冲液(pH7.0)将pH恢复至中性附近。
(3)对进行了(2)的热处理时的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性和未进行(2)的热处理时的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性利用实施例3(4)中记载的ELISA法进行测定，将进行了热处理时的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性除以未进行热处理时的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性，从而算出残留活性。
(4)用(3)的方法评价约2700株的转化体，从中选择表达与FcR5a相比热稳定性提高了的Fc结合性蛋白质的转化体。将选择的转化体用包含50μg/mL的卡那霉素的2YT液体培养基培养，使用QIAprep Spin Miniprep kit(QIAGEN制)制备表达载体。
(5)对于所得表达载体中***的编码Fc结合性蛋白质的多核苷酸区域的序列，通过实施例1(5)中记载的方法解析核苷酸序列，从而确定氨基酸的突变位点。
(4)中选择的转化体表达的Fc结合性蛋白质的、相对于FcR5a的氨基酸置换位点和热处理后的残留活性(％)总结示于表8中。包含序列号37中记载的氨基酸序列中的从第33位的甘氨酸至第208位的谷氨酰胺为止的氨基酸残基，并且该从第33位至第208位为止的氨基酸残基中产生Phe29Ile(该标记表示序列号1的第29位(序列号37中为第45位)的苯丙氨酸置换为异亮氨酸，以下同样)、Phe29Leu、Glu39Gly、Gln48Arg、Tyr51Ser、Phe61Tyr、Asp77Gly、Asp82Glu、Gln90Arg、Gln112Leu、Val117Glu、Lys119Asn、Lys119Glu、Thr140Ile、Leu142Gln、Phe171Ser、Leu175Arg、Asn180Ser和Ile188Val的至少1种氨基酸置换的Fc结合性蛋白质与FcR5a相比，可以说热稳定性提高了。
[表8]
氨基酸置换 残留活性(％)
Gln48Arg 48.7
Asp82Glu 49.0
Gln112Leu 56.8
Val117Glu 52.6
Lys119Asn 58.6
Leu142Gln 72.9
Phe171Ser 58.1
Asn180Ser 43.9
Ile188Val 46.5
Phe29Ile、Val117Glu 57.8
Tyr51Ser、Gln90Arg 49.6
Phe61Tyr、Lys119Glu、Leu175Arg 62.1
Phe29Leu、Glu39Gly、Asp77Gly、Thr140Ile 48.5
FcR5a 43.4
将表8所示的由FcR5a进行了氨基酸置换的Fc结合性蛋白质中的、产生了Phe29Ile和Val117Glu的氨基酸置换的Fc结合性蛋白质命名为FcR7a，将包含编码FcR7a的多核苷酸的表达载体命名为pET-FcR7a。将FcR7a的氨基酸序列示于序列号39，将编码FcR7a的多核苷酸的序列示于序列号40。需要说明的是，序列号39中，第1位的甲硫氨酸(Met)至第26位的丙氨酸(Ala)为止为MalE信号肽，第27号的赖氨酸(Lys)至第32位的甲硫氨酸(Met)为止为连接子序列，第33位的甘氨酸(Gly)至第208位的谷氨酰胺(Gln)为止为FcR7a的氨基酸序列(相当于序列号1的第17位至第192位为止的区域)、第209位至第210位为止的甘氨酸(Gly)为连接子序列，第211位至第216位的组氨酸(His)为标签序列。另外，序列号39中，分别地，Phe29Ile的异亮氨酸存在于第45位，Val117Glu的谷氨酸存在于第133位的位点。
实施例7改良Fc结合性蛋白质的制作
通过在FcR7a中累积实施例6中判明的、与Fc结合性蛋白质的热稳定性提高相关的氨基酸置换，谋求进一步的稳定性提高。置换氨基酸的累积主要使用PCR进行，制作以下的(a)至(d)所示的4种改良Fc结合性蛋白质。
(a)对于FcR7a进一步进行了Phe171Ser的氨基酸置换的FcR8
(b)对于FcR8进一步进行了Gln48Arg的氨基酸置换的FcR9
(c)对于FcR8进一步进行了Gln48Arg和Tyr51Ser的氨基酸置换的FcR10
(d)对于FcR10进一步进行了Gln90Arg的氨基酸置换的FcR11
以下，对各改良Fc结合性蛋白质的制作方法进行详细说明。
(a)FcR8
从实施例6中已经明确的、涉及热稳定性提高的氨基酸置换中选择Phe29Ile、Val117Glu和Phe171Ser，制作FcR5a(实施例4(c))中累积了这些置换的FcR8。具体而言，对于编码FcR7a的多核苷酸进行产生Phe171Ser的突变导入，从而制作FcR8。
(a-1)以实施例6中取得的pET-FcR7a为模板实施PCR。该PCR中的引物使用包含序列号23和序列号41(5’-ACCAGCCCACGGCAGGAATAGCTGCCGCTG-3’)中记载的序列的寡核苷酸。PCR如下进行：制备表5所示的组成的反应液后，对该反应液在98℃下进行5分钟热处理，在98℃下进行10秒的第1步骤、在55℃下进行5秒的第2步骤、在72℃下进行1分钟的第3步骤，将这3个步骤作为1个循环的反应进行30循环，最后在72℃下进行5分钟热处理。将扩增的PCR产物供于琼脂糖凝胶电泳，从该凝胶中使用QIAquick Gel Extraction kit(QIAGEN制)进行纯化。将纯化的PCR产物作为m8F。
(a-2)将实施例6中取得的pET-FcR7a作为模板，将包含序列号42(5’-GACAGCGGCAGCTATTCCTGCCGTGGGCTG-3’)和序列号24中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，除此之外，与(a-1)同样地进行。将纯化的PCR产物作为m8R。
(a-3)将(a-1)和(a-2)中得到的2种PCR产物(m8F、m8R)混合，制备表6所示的组成的反应液。进行如下PCR：对该反应液在98℃下进行5分钟热处理后，在98℃下进行10秒的第1步骤、在55℃下进行5秒的第2步骤、在72℃下进行1分钟的第3步骤，将这3个步骤作为1个循环的反应进行5循环，得到连接了m8F和m8R的PCR产物m8p。
(a-4)将(a-3)中得到的PCR产物m8p作为模板，将包含序列号23和序列号24中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，进行PCR。PCR如下进行：制备表7所示的组成的反应液后，对该反应液在98℃下进行5分钟热处理，在98℃下进行10秒的第1步骤、在55℃下进行5秒的第2步骤、在72℃下进行1分钟的第3步骤，将这将这3个步骤作为1个循环的反应进行30循环。由此，制作编码对FcR7a导入了1位点氨基酸置换的FcR8的多核苷酸。
(a-5)对(a-4)中得到的多核苷酸用限制酶NcoI和HindIII进行消化，与预先用限制酶NcoI和HindIII消化了的表达载体pETMalE(日本特开2011-206046号公报)连接，使用其转化大肠杆菌BL21(DE3)株。
(a-6)对得到的转化体用添加了50μg/mL的卡那霉素的LB培养基进行培养。通过从回收的菌体(转化体)中提取质粒，从而得到包含编码FcR8的多核苷酸的质粒pET-FcR8，所述FcR8是对FcR5a进行了3位点(对于野生型Fc结合性蛋白质为8位点)氨基酸置换的多肽。
(a-7)按照与实施例1(5)同样的方法进行pET-FcR8的核苷酸序列的解析。
将附加了信号序列和聚组氨酸标签的FcR8的氨基酸序列示于序列号43，将编码前述FcR8的多核苷酸的序列示于序列号44。需要说明的是，序列号43中，第1位的甲硫氨酸(Met)至第26位的丙氨酸(Ala)为止为MalE信号肽，第27位的赖氨酸(Lys)至第32位的甲硫氨酸(Met)为止为连接子序列，第33位的甘氨酸(Gly)至第208位的谷氨酰胺(Gln)为止为FcR8的氨基酸序列(相当于序列号1的第17位至第192位为止的区域)、第209位至第210位为止的甘氨酸(Gly)为连接子序列，第211位至第216位的组氨酸(His)为标签序列。另外，序列号43中，分别地，Phe29Ile的异亮氨酸存在于第45位，Val117Glu的谷氨酸存在于第133位，Phe171Ser的丝氨酸存在于第187位的位点。
(b)FcR9
从实施例6中已经明确的、涉及热稳定性提高的氨基酸置换中选择Phe29Ile、Gln48Arg、Val117Glu和Phe171Ser，制作FcR5a(实施例4(c))中累积了这些置换的FcR9。具体而言，通过对编码FcR8的多核苷酸进行产生Gln48Arg的突变导入来制作FcR9。
(b-1)将(a)中制作的pET-FcR8作为模板，将包含序列号24和序列号45(5’-GTGACCCTTAAATGCCGGGGCGCGTATAGC-3’)中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，除此之外，利用与(a-1)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为m9F。
(b-2)将(a)中制作的pET-FcR8作为模板，将包含序列号23和序列号46(5’-CCGGGCTATACGCGCCCCGGCATTTAAGGG-3’)中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，除此之外，利用与(a-1)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为m9R。
(b-3)将(b-1)和(b-2)中得到的2种PCR产物(m9F、m9R)混合后，利用与(a-3)同样的方法进行PCR，将m9F和m9R连接。将所得PCR产物作为m9p。
(b-4)将(b-3)中得到的PCR产物m9p作为模板，将包含序列号21和序列号22中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，利用与(a-4)同样的方法进行PCR。由此，制作编码FcR9的多核苷酸。
(b-5)将(b-4)中得到的多核苷酸纯化后，用限制酶NcoI和HindIII进行消化，与预先用限制酶NcoI和HindIII消化了的表达载体pETMalE(日本特开2011-206046号公报)连接，使用其转化大肠杆菌BL21(DE3)株。
(b-6)对得到的转化体用添加了50μg/mL卡那霉素的LB培养基进行培养。通过从回收的菌体(转化体)中提取质粒，从而得到包含编码FcR9的多核苷酸的质粒pET-FcR9，所述FcR9是对FcR5a进行了4位点(对于野生型Fc结合性蛋白质为9位点)氨基酸置换的多肽。
(b-7)利用与实施例1(5)同样的方法进行pET-FcR9的核苷酸序列的解析。
将附加了信号序列和聚组氨酸标签的FcR9的氨基酸序列示于序列号47，将编码前述FcR9的多核苷酸的序列示于序列号48。需要说明的是，序列号47中，第1位的甲硫氨酸(Met)至第26位的丙氨酸(Ala)为止为MalE信号肽，第27位的赖氨酸(Lys)至第32位的甲硫氨酸(Met)为止为连接子序列，第33位的甘氨酸(Gly)至第208位的谷氨酰胺(Gln)为止为FcR9的氨基酸序列(相当于序列号1的第17位至第192位为止的区域)、第209位至第210位为止的甘氨酸(Gly)为连接子序列、第211位至第216位的组氨酸(His)为标签序列。另外，序列号47中，分别地，Phe29Ile的异亮氨酸存在于第45位，Gln48Arg的精氨酸存在于第64位，Val117Glu的谷氨酸存在于第133位，Phe171Ser的丝氨酸存在于第187位的位点。
(c)FcR10
从实施例6中已经明确的、涉及热稳定性提高的氨基酸置换中选择Phe29Ile、Gln48Arg、Tyr51Ser、Val117Glu和Phe171Ser，制作FcR5a(实施例4(c))中累积了这些置换的FcR10。具体而言，通过对编码FcR8的多核苷酸进行产生Gln48Arg和Tyr51Ser的突变导入，从而制作FcR10。
(c-1)将(a)中制作的pET-FcR8作为模板，将包含序列号22和序列号49(5’-TGCCGGGGCGCGTCTAGCCCGGAAGATAAC-3’)中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，除此之外，利用与(a-1)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为m10F。
(c-2)将(a)中制作的pET-FcR8作为模板，将包含序列号21和序列号50(5’-GCTAGACGCGCCCCGGCATTTAAGGGTCAC-3’)中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，除此之外，利用与(a-1)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为m10R。
(c-3)将(c-1)和(c-2)中得到的2种PCR产物(m10F、m10R)混合后，利用与(a-3)同样的方法进行PCR，将m10F和m10R连接。将所得PCR产物作为m10p。
(c-4)将(c-3)中得到的PCR产物m10p作为模板，将包含序列号21和序列号22中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，利用与(a-4)同样的方法进行PCR。由此，制作编码FcR10的多核苷酸。
(c-5)将(c-4)中得到的多核苷酸纯化后，用限制酶NcoI和HindIII进行消化，与预先用限制酶NcoI和HindIII消化了的表达载体pETMalE(日本特开2011-206046号公报)连接，使用其转化大肠杆菌BL21(DE3)株。
(c-6)对得到的转化体用添加了50μg/mL卡那霉素的LB培养基进行培养。通过从回收的菌体(转化体)中提取质粒，从而得到包含编码FcR10的多核苷酸的质粒pET-FcR10，所述FcR10是对FcR5a进行了5位点(对于野生型Fc结合性蛋白质为10位点)氨基酸置换的多肽。
(c-7)利用与实施例1(5)同样的方法进行pET-FcR10的核苷酸序列的解析。
将附加了信号序列和聚组氨酸标签的FcR10的氨基酸序列示于序列号51，将编码前述FcR10的多核苷酸的序列示于序列号52。需要说明的是，序列号51中，第1位的甲硫氨酸(Met)至第26位的丙氨酸(Ala)为止为MalE信号肽，第27位的赖氨酸(Lys)至第32位的甲硫氨酸(Met)为止为连接子序列，第33位的甘氨酸(Gly)至第208位的谷氨酰胺(Gln)为止为FcR10的氨基酸序列(相当于序列号1的第17位至第192位为止的区域)，第209位至第210位为止的甘氨酸(Gly)为连接子序列，第211位至第216位的组氨酸(His)为标签序列。另外，序列号51中，分别地，Phe29Ile的异亮氨酸存在于第45位，Gln48Arg的精氨酸存在于第64位，Tyr51Ser的丝氨酸存在于第67位，Val117Glu的谷氨酸存在于第133位，Phe171Ser的丝氨酸存在于第187位的位点。
(d)FcR11
从实施例6中已经明确的、涉及热稳定性提高的氨基酸置换中选择Phe29Ile、Gln48Arg、Tyr51Ser、Gln90Arg、Val117Glu和Phe171Ser，制作FcR5a(实施例4(c))中累积了这些置换的FcR11。具体而言，通过对于编码FcR10的多核苷酸进行产生Gln90Arg的突变导入，从而制作FcR11。
(d-1)将(c)中制作的pET-FcR10作为模板，将包含序列号22和序列号53(5’-GGCGAATATCGTTGCCGGACCAGCCTGAGC-3’)中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，除此之外，利用与(a-1)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为m11F。
(d-2)将(c)中制作的pET-FcR10作为模板，将包含序列号21和序列号54(5’-GGTGCTCAGGCTGGTCCGGCAACGATATTC-3’)中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，除此之外，利用与(a-1)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为m11R。
(d-3)将(d-1)和(d-2)中得到的2种PCR产物(m11F、m11R)混合后，利用与(a-3)同样的方法进行PCR，将m11F和m11R连接。将所得PCR产物作为m11p。
(d-4)将(d-3)中得到的PCR产物m11p作为模板，将包含序列号21和序列号22中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，利用与(a-4)同样的方法进行PCR。由此，制作编码FcR11的多核苷酸。
(d-5)将(d-4)中得到的多核苷酸纯化后，用限制酶NcoI和HindIII进行消化，与预先用限制酶NcoI和HindIII消化了的表达载体pETMalE(日本特开2011-206046号公报)连接，使用其转化大肠杆菌BL21(DE3)株。
(d-6)对得到的转化体用添加了50μg/mL卡那霉素的LB培养基进行培养。通过从回收的菌体(转化体)中提取质粒，从而得到包含编码FcR11的多核苷酸的质粒pET-FcR11，所述FcR11是对FcR5a进行了6位点(对于野生型Fc结合性蛋白质为11位点)氨基酸置换的多肽。
(d-7)利用与实施例1(5)同样的方法进行pET-FcR11的核苷酸序列的解析。
将附加了信号序列和聚组氨酸标签的FcR11的氨基酸序列示于序列号55，将编码前述FcR11的多核苷酸的序列示于序列号56。需要说明的是，序列号55中，第1位的甲硫氨酸(Met)至第26位的丙氨酸(Ala)为止为MalE信号肽，第27位的赖氨酸(Lys)至第32位的甲硫氨酸(Met)为止为连接子序列，第33位的甘氨酸(Gly)至第208位的谷氨酰胺(Gln)为止为FcR11的氨基酸序列(相当于序列号1的第17位至第192位为止的区域)，第209位至第210位为止的甘氨酸(Gly)为连接子序列，第211位至第216位的组氨酸(His)为标签序列。另外，序列号55中，分别地，Phe29Ile的异亮氨酸存在于第45位，Gln48Arg的精氨酸存在于第64位，Tyr51Ser的丝氨酸存在于第67位，Gln90Arg的精氨酸存在于第106位，Val117Glu的谷氨酸存在于第133位，Phe171Ser的丝氨酸存在于第187位的位点。
实施例8Fc结合性蛋白质的酸稳定性评价
(1)将表达实施例1中制作的野生型Fc结合性蛋白质、实施例6中选择的Fc结合性蛋白质(FcR7a)和实施例7中制作的Fc结合性蛋白质(FcR8、FcR9、FcR10、FcR11)的转化体分别接种至包含50μg/mL的卡那霉素的3mL的2YT液体培养基，在37℃下好氧地振荡培养一晩，从而进行预培养。
(2)在添加有50μg/mL的卡那霉素的20mL的2YT液体培养基(蛋白胨16g/L、酵母提取物10g/L、氯化钠5g/L)中接种预培养液200μL，在37℃下好氧地进行振荡培养。
(3)培养开始1.5小时后，将培养温度变更为20℃，进行30分钟振荡培养。之后，以终浓度变为0.01mM的方式添加IPTG，接着在20℃下好氧地振荡培养一晩。
(4)培养结束后，通过离心分离进行集菌，使用BugBuster Protein extractionkit(TAKARA BIO INC.制)制备蛋白质提取液。
(5)利用实施例3(4)中记载的ELISA法测定(4)中制备的蛋白质提取液中的野生型Fc结合性蛋白质、FcR7a、FcR8、FcR9、FcR10和FcR11的抗体结合活性。此时，使用市售的FcγRIIIa的细胞外区域(R&D Technologies制：4325-FC-050)制作标准曲线，进行浓度测定。
(6)以各Fc结合性蛋白质的浓度变为30μg/mL的方式用纯水稀释后，将前述稀释了的溶液100μL和0.1M的甘氨酸盐酸缓冲液(pH3.0)200μL混合，在30℃下静置2小时。
(7)通过实施例3(4)中记载的ELISA法测定利用甘氨酸盐酸缓冲液(pH3.0)进行了酸处理后的蛋白质的抗体结合活性和未进行前述酸处理时的蛋白质的抗体结合活性。之后，进行了酸处理时的抗体结合活性除以未进行酸处理时的抗体结合活性，从而算出残留活性。
将结果示于表9。此次评价的Fc结合性蛋白质(FcR7a、FcR8、FcR9、FcR10、FcR11)与野生型Fc结合性蛋白质相比残留活性高。由此确认了，该改良Fc结合性蛋白质的酸稳定性与野生型相比提高了。
[表9]
Figure GDA0002777074250000491
实施例9附加了半胱氨酸标签的FcR5a(FcR5aCys)的制作
(1)将实施例4(c)中制作的pET-FcR5a作为模板实施PCR。该PCR中的引物使用包含序列号21和序列号57(5’-CCCAAGCTTATCCGCAGGTATCGTTGCGGCACCCTTGGGTAATGGTAATATTCACGGTCTCGCTGC-3’)中记载的序列的寡核苷酸。PCR如下实施：制备表2所示的组成的反应液后，将该反应液在98℃下进行5分钟热处理、在98℃下进行10秒的第1步骤、在55℃下进行5秒的第2步骤、在72℃下进行1分钟的第3步骤，将这3个步骤作为1个循环的反应重复30循环。
(2)将(1)中得到的多核苷酸纯化，用限制酶NcoI和HindIII进行消化后，与预先用限制酶NcoI和HindIII消化了的表达载体pETMalE(日本特开2011-206046号公报)连接，使用该连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)株。
(3)将所得转化体用包含50μg/mL的卡那霉素的LB培养基培养后，使用QIAprepSpin Miniprep kit(QIAGEN制)，提取表达载体pET-FcR5aCys。
(4)利用与实施例1(5)同样的方法进行pET-FcR5aCys的核苷酸序列的解析。分别地，将由表达载体pET-FcR5aCys表达的多肽的氨基酸序列示于序列号58，将编码该多肽的多核苷酸的序列示于序列号59。需要说明的是，序列号58中，第1位的甲硫氨酸(Met)至第26位的丙氨酸(Ala)为止为MalE信号肽，第27位的赖氨酸(Lys)至第32位的甲硫氨酸(Met)为止为连接子序列，第33位的甘氨酸(Gly)至第208位的谷氨酰胺(Gln)为止为FcR5a的氨基酸序列(相当于序列号1的第17位至第192位为止的区域)，第209位的甘氨酸(Gly)至第216位的甘氨酸(Gly)为止为半胱氨酸标签序列。
实施例10附加了半胱氨酸标签的FcR9(FcR9Cys)的制作
(1)将实施例7(b)中制作的pET-FcR9作为模板，将包含序列号21和序列号57中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，除此之外，利用与实施例9(1)同样的方法进行PCR。
(2)利用与实施例9(2)同样的方法转化大肠杆菌BL21(DE3)株。
(3)将所得转化体利用与实施例9(3)同样的方法培养后，使用QIAprep SpinMiniprep kit(QIAGEN制)，提取表达载体pET-FcR9Cys。
(4)利用与实施例1(5)同样的方法进行pET-FcR9Cys的核苷酸序列的解析。
分别地，将由表达载体pET-FcR9Cys表达的多肽的氨基酸序列示于序列号60，将编码该多肽的多核苷酸的序列示于序列号61。需要说明的是，序列号60中，第1位的甲硫氨酸(Met)至第26位的丙氨酸(Ala)为止为MalE信号肽，第27位的赖氨酸(Lys)至第32位的甲硫氨酸(Met)为止为连接子序列，第33位的甘氨酸(Gly)至第208位的谷氨酰胺(Gln)为止为FcR9的氨基酸序列(相当于序列号1的第17位至第192位为止的区域)，第209位的甘氨酸(Gly)至第216位的甘氨酸(Gly)为止为半胱氨酸标签序列。
实施例11FcR5aCys的制备
(1)将表达实施例9中制作的FcR5aCys的转化体接种至2L的挡板烧瓶中加入的包含50μg/mL的卡那霉素的400mL的2YT液体培养基(蛋白胨16g/L、酵母提取物10g/L、氯化钠5g/L)，在37℃下好氧地振荡培养一晩，从而进行预培养。
(2)向包含葡萄糖10g/L、酵母提取物20g/L、磷酸三钠十二水合物3g/L、磷酸氢二钠十二水合物9g/L、氯化铵1g/L和硫酸卡那霉素50mg/L的液体培养基1.8L中接种(1)的培养液180mL，使用3L发酵槽(Biott Corporation制)进行正式培养。设定为温度30℃、pH6.9～7.1、透气量1VVM、溶解氧浓度30％饱和浓度的条件，开始正式培养。pH的控制中，分别地，作为酸使用50％磷酸，作为碱使用14％氨水，溶解氧的控制通过改变搅拌速度来控制，搅拌转速设定为下限500rpm、上限1000rpm。培养开始后，在葡萄糖浓度无法测定的时刻，边根据溶解氧(DO)进行控制边加入流加培养基(葡萄糖248.9g/L、酵母提取物83.3g/L、硫酸镁七水合物7.2g/L)。
(3)作为菌体量的目标，600nm的吸光度(OD600nm)达到约150，结果将培养温度降低至25℃，确认了达到设定温度后，以终浓度变为0.5mM的方式添加IPTG，接着在25℃下继续培养。
(4)从培养开始起约48小时后停止培养，将培养液在4℃下通过8000rpm、20分钟的离心分离回收菌体。
(5)将回收了的菌体以变为5mL/1g(菌体)的方式悬浮于20mM的Tris盐酸缓冲液(pH7.0)，使用超声波发生装置(インソネーター201M(商品名)、久保田商事株式会社制)，在4℃下、以约150W的输出功率将菌体破碎约10分钟。菌体破碎液在4℃下进行20分钟、8000rpm的离心分离2次，回收上清。
(6)将(5)中得到的上清以流速5mL/分钟进样至预先用20mM的Tris盐酸缓冲液(pH7.0)平衡化了的填充有140mL的TOYOPEARL CM-650M(TOSOH CORPORATION制)的VL32×250柱(Merckmillipore制)。用平衡化中使用的缓冲液洗涤后，用包含0.5M的氯化钠的20mM的Tris盐酸缓冲液(pH7.0)洗脱。
(7)将(6)中得到的洗脱液进样至预先用包含150mM的氯化钠的20mM的Tris盐酸缓冲液(pH7.4)平衡化了的填充有IgG Sepharose(GE Healthcare制)90mL的XK26/20柱柱(GEHealthcare制)。用平衡化中使用的缓冲液洗涤后，用0.1M的甘氨酸盐酸缓冲液(pH3.0)洗脱。需要说明的是，洗脱液通过加入洗脱液量的1/4量的1MTris盐酸缓冲液(pH8.0)来将pH恢复至中性附近。
通过前述纯化，得到约20mg的高纯度的FcR5aCys。
实施例12FcR5a固定化凝胶的制作和抗体分离
(1)将2mL的分离剂用亲水性乙烯基聚合物(TOSOH CORPORATION制：TOYOPEARL)的表面羟基用碘代乙酰基活化后，使实施例11中制备的FcR5aCys 4mg反应，得到FcR5a固定化凝胶。
(2)将(1)中制备的FcR5a固定化凝胶0.5mL填充至φ4.6mm×75mm的不锈钢柱。
(3)将填充有FcR5a固定化凝胶的柱与AKTA Explorer(GE Healthcare制)连接，用20mM的乙酸缓冲液(pH4.6)平衡化。
(4)将用20mM的乙酸缓冲液(pH4.6)稀释至0.5mg/mL的单克隆抗体(Rituxan，全药工业株式会社制)以流速0.2mL/分钟进样0.4mL。
(5)保持流速0.2mL/分钟不变地用平衡化缓冲液洗涤25分钟后，对以利用20mM的甘氨酸盐酸缓冲液(pH3.0)的pH梯度(在25分钟时20mM的甘氨酸盐酸缓冲液(pH3.0)变为100％的梯度)吸附的单克隆抗体进行洗脱。
将结果(洗脱图谱)示于图2。单克隆抗体与FcR5a相互作用，因此被分离为多个峰而不是凝胶过滤色谱图那样的单一的峰。
实施例13用FcR5a固定化凝胶分离的抗体的ADCC(抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用)活性测定
(1)在实施例12中记载的洗脱条件下分离单克隆抗体，将图2中记载的洗脱图谱中的级分A(FrA)和级分B(FrB)的部分分级。
(2)边将分级了的FrA和FrB用超滤膜(Merckmillipore公司)浓缩，边将缓冲液交换为PBS(Phosphate Buffered Saline，磷酸缓冲生理盐水)(pH7.4)。
(3)以280nm的吸光度测定浓缩、缓冲液交换了的FrA和FrB中所含的抗体、以及分离前的单克隆抗体的浓度。
(4)利用以下所示的方法，测定FrA和FrB中所含的抗体所具有的ADCC活性。
(4-1)使用将1.4mL的Low IgG Serum和33.6mL的RPMI1640培养基混合而制备的ADCC Assay Buffer，对于FrA和FrB中所含的抗体以及分离前的单克隆抗体，从3μg/mL按照1/3稀释制备8梯度的稀释系列。
(4-2)将Raji细胞用ADCC Assay Buffer制备为约5×105细胞/mL，向96孔平板(3917：Corning Incorporated)中以25μL/孔加入。
(4-3)向加入了Raji细胞的孔中以25μL/孔加入(4-1)中制备的级分A、级分B、分离前的单克隆抗体、空白(仅为ADCC Assay Buffer)。
(4-4)将Effector细胞(Promega Corporation制)用ADCC Assay Buffer制备为约3.0×105细胞/mL，向加入了Raji细胞和抗体的孔中以25μL/孔加入。之后，在CO2培养箱(5％CO2、37℃)中静置6小时。
(4-5)将96孔平板在室温下静置5分钟至30分钟后，以75μL/孔加入LuciferaseAssay Reagent(Promega Corporation制)。在室温下使其反应30分钟后，用GloMax MultiDetection System(Promega Corporation制)测定发光。
将对在实施例12中记载的洗脱条件下分级的FrA和FrB以及分离前的单克隆抗体的发光强度进行比较的结果示于图3。需要说明的是，图3的结果表示从测定的发光强度中减去空白的发光强度而得到的值，发光强度越高，表示ADCC活性越高。
FrA与分离前的单克隆抗体相比基本为相同程度的发光强度，因此可以说ADCC活性基本相同。另一方面，FrB与分离前的单克隆抗体相比，提高至约3.2倍，与FrA相比提高至2.5倍。即，可知，FrB与分离前的单克隆抗体和FrA相比ADCC活性高。
实施例14用FcR5a固定化凝胶分离的抗体的糖链解析
(1)将实施例13(1)中分级了的FrA和FrB、以及分离前的单克隆抗体通过100℃、10分钟的热处理进行变性后，用糖酰胺酶A/胃蛋白酶和链霉蛋白酶依次进行处理，经过利用凝胶过滤法的纯化操作取得糖链成分。
(2)将(1)中得到的糖链用蒸发仪浓缩·干燥后，在乙酸溶剂下，使2-氨基吡啶、接着二甲基胺硼烷依次作用，形成荧光标记化糖链，通过凝胶过滤法进行纯化。
(3)将(2)中得到的荧光标记化糖链用阴离子交换柱(TSKgel DEAE-5PW，φ7.5mm×7.5cm：TOSOH CORPORATION制)分离成中性糖链成分和单唾液酸化糖链成分。
(4)对于(3)中得到的中性糖链成分和单唾液酸化糖链成分，使用ODS柱，分离成各糖链。通过MALDI-TOF-MS分析取得分离的糖链的分子量信息后，参照ODS柱色谱图的保留时间归属糖链结构。
分别地，将归属的糖链结构(N1至N6、M1、M2和D1)示于图4，将中性糖链的组成比示于表10，将单唾液酸化和二唾液酸化糖链的组成比示于表11。具有糖链结构N4+N4’和N6的抗体与分离前和FrA相比，FrB中增加了。另一方面，具有N1、N2+N3’、N3和N5的抗体与分离前和FrA相比，FrB中减少了。即，可知具有N4+N4’和N6糖链的抗体与FcR5a牢固结合，具有N1、N2+N3’、N3和N5的抗体的与FcR5a的结合弱。另外，具有M1、M2和D1的抗体与分离前和FrA相比，FrB中增加了。即，可知，具有M1、M2和D1糖链的抗体与FcR5a牢固结合。
[表10]
Figure GDA0002777074250000551
N3′为N3的差向异构化糖链
N4′为N4的差向异构化糖链
[表11]
Figure GDA0002777074250000552
参照前述结果和实施例13的结果时，可知，与分离前和FrA相比，具有FrB中增加了的糖链结构的抗体的ADCC活性高。即，可知，FcR5a固定化凝胶能够识别抗体所具有的糖链结构的差异，并且基于前述识别，能够分离ADCC活性高的抗体。
实施例15FcR9固定化凝胶的制作和抗体分离
(1)使用表达实施例10中制作的FcR9Cys的转化体，利用与实施例11(1)至(4)同样的方法进行培养。
(2)利用与实施例11同样的方法进行纯化，得到约10mg的高纯度的FcR9Cys。
(3)利用与实施例12(1)同样的方法得到FcR9Cys固定化凝胶后，将该凝胶0.5mL填充至φ4.0mm×40mm的不锈钢柱。
(4)将填充有FcR9固定化凝胶的柱与高效液相色谱装置(TOSOH CORPORATION制)连接，用20mM的乙酸缓冲液(pH4.5)进行平衡化。
(5)将用PBS(Phosphate Buffered Saline，磷酸缓冲生理盐水)(pH7.4)稀释至4.0mg/mL的单克隆抗体(Rituxan，全药工业株式会社制)以流速0.3mL/分钟进样0.15mL。
(6)保持流速0.3mL/分钟不变地用平衡化缓冲液洗涤2分钟后，将以利用10mM的甘氨酸盐酸缓冲液(pH3.0)的pH梯度(在38分钟时10mM的甘氨酸盐酸缓冲液(pH3.0)变为100％的梯度)吸附了的单克隆抗体进行洗脱。
将结果(洗脱图谱)示于图5。单克隆抗体与FcR9相互作用，因此被分离成多个峰而不是凝胶过滤色谱法那样的单一的峰。
实施例16用FcR9固定化凝胶分离的抗体的ADCC活性测定
(1)在实施例15的洗脱条件下分离单克隆抗体，将图5中记载的洗脱图谱中的级分A(FrA)、级分B(FrB)和级分C(FrC)的部分进行分级。
(2)以280nm的吸光度测定FrA、FrB和FrC中所含的抗体、以及分离前的单克隆抗体的浓度，利用与实施例13(4)同样的方法测定ADCC活性。
将结果示于图6。需要说明的是，图6的结果表示从测定的发光强度中减去空白的发光强度而得到的值，发光强度越高，表明ADCC活性越高。
FrA和FrB与分离前的单克隆抗体相比，可以说ADCC活性稍低。另一方面，FrC与分离前的单克隆抗体相比，ADCC活性提高至约1.6倍。即，可知，洗脱慢的FrC与洗脱快的FrA和FrB以及分离前的单克隆抗体相比，ADCC活性高。另外，根据实施例14，固定化有本发明的Fc结合性蛋白质的凝胶能够识别抗体所具有的糖链结构的差异，因此暗示了，与FrC中所含的FcR9牢固结合的抗体为具备具有高的ADCC活性的糖链结构的抗体。
实施例17向FcR9导入突变和基因文库的制作
对于编码实施例7(b)中制作的FcR9的多核苷酸部分，通过易错PCR随机地实施突变导入。
(1)作为模板使用实施例7(b)中制作的表达载体pET-FcR9，进行易错PCR。易错PCR如下进行：将pET-FcR9作为模板，将包含序列号23和序列号24中记载的序列的寡核苷酸作为引物，除此之外，制备与表3所示的组成同样的反应液后，将该反应液在95℃下进行2分钟热处理、在95℃下进行30秒的第1步骤、在50℃下进行30秒的第2步骤、在72℃下进行90秒的第3步骤，将这3个步骤作为1个循环的反应进行35循环，最后在72℃下进行7分钟热处理。通过该反应，对编码Fc结合性蛋白质的多核苷酸良好地导入突变。
(2)将(1)中得到的PCR产物进行纯化后，用限制酶NcoI和HindIII进行消化，与预先用相同限制酶消化了的表达载体pETMalE(日本特开2011-206046号公报)连接。
(3)连接反应结束后，通过电穿孔法将反应液导入至大肠杆菌BL21(DE3)株，用包含50μg/mL的卡那霉素的LB平板培养基进行培养后，将形成于平板上的菌落作为随机突变基因文库。
实施例18碱稳定化Fc结合性蛋白质的筛选
(1)将实施例17中制作的随机突变基因文库利用实施例3(1)至(2)中记载的方法进行培养，从而使Fc结合性蛋白质表达。
(2)培养后，将通过离心操作得到的、包含Fc结合性蛋白质的培养上清用纯水稀释至10倍，与等量的60mM的氢氧化钠溶液混合，在30℃下静置1.5小时，从而进行碱处理。之后，用4倍量的1MTris缓冲液(pH7.0)将pH恢复至中性附近。
(3)利用实施例3(4)中记载的ELISA法分别测定进行了(2)中记载的碱处理时的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性和未进行(2)中记载的碱处理时的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性，将进行了碱处理时的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性除以未进行碱处理时的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性，从而算出残留活性。
(4)用(3)的方法对约2700株的转化体进行评价，从中选择表达与FcR9相比稳定性提高了的Fc结合性蛋白质的转化体。将选择的转化体用包含50μg/mL的卡那霉素的2YT液体培养基进行培养，使用QIAprep Spin Miniprep kit(QIAGEN制)制备表达载体。
(5)对于所得表达载体中***的编码Fc结合性蛋白质的多核苷酸区域的序列，通过实施例1(5)中记载的方法解析核苷酸序列，从而确定氨基酸的突变位点。
(4)中选择的转化体表达的Fc结合性蛋白质的、相对于FcR9的氨基酸置换位点和碱处理后的残留活性(％)总结示于表12。包含序列号37中记载的氨基酸序列中第33位的甘氨酸至第208位的谷氨酰胺为止的氨基酸残基，并且该从第33位至第208位为止的氨基酸残基中产生Met18Ile(该标记表示序列号1的第18位(序列号37中为第34位)的甲硫氨酸置换为异亮氨酸，以下同样)、Glu21Lys、Glu21Gly、Leu23Met、Gln33Pro、Lys46Glu、Phe61Tyr、Glu64Gly、Ser65Arg、Ser68Pro、Asp77Val、Asp77Glu、Val81Met、Asp82Ala、Gln101Leu、Glu103Val、His105Arg、Glu120Val、Ser178Arg和Asn180Lys的至少任1种氨基酸置换的Fc结合性蛋白质与FcR9相比，可以说碱稳定性提高了。
[表12]
氨基酸置换 残留活性(％)
Glu21Lys 74.4
Glu21Gly 91.2
Leu23Met 83.3
Ser65Arg 73.2
Ser68Pro 92.9
Asp77Val 75.9
Val81Met 71.2
Glu103Val 75.5
Glu120Val 75.4
Ser178Arg 93.5
ASn180Lys 94.8
Gln33Pro、Ser178Arg 97.2
LyS46Glu、Phe61Tyr 89.9
Met18Ile、Glu120Val 98.7
Asp82Ala、Gln101Leu 71.0
Glu64Gly、Asp77Glu、His105Arg 87.4
FCR9 66.4
实施例19改良Fc结合性蛋白质的制作
通过在FcR9中累积实施例18中判明的、与Fc结合性蛋白质的碱稳定性提高相关的氨基酸置换，谋求进一步的稳定性提高。置换氨基酸的累积主要使用PCR进行，制作以下的(a)和(b)所示的2种改良Fc结合性蛋白质。
(a)对于FcR9进一步进行了Glu21Gly、Leu23Met和Ser178Arg的氨基酸置换的FcR12
(b)对于FcR9进一步进行了Glu21Gly、Leu23Met、Ser68Pro和Ser178Arg的氨基酸置换的FcR13
以下，对各改良Fc结合性蛋白质的制作方法进行详细说明。
(a)FcR12
从实施例18中已经明确的、涉及碱稳定性提高的氨基酸置换中选择Glu21Gly、Leu23Met和Ser178Arg，从而制作FcR9(实施例7(b))中累积了这些置换的FcR12。具体而言，对于实施例18中得到的包含Ser178Arg突变的多核苷酸，进行产生Glu21Gly和Leu23Met的突变导入，从而制作FcR12。
(a-1)将编码实施例18中取得的、FcR9中包含Ser178Arg的突变的Fc结合性蛋白质的多核苷酸作为模板实施PCR。该PCR中的引物使用包含序列号24和序列号62(5’-CTAGCCATGGGCATGCGTACCGGAGATATGCCGAAAGCGGAG-3’)中记载的序列的寡核苷酸。PCR如下进行：除了模板和引物以外，制备表7所示的组成的反应液后，将该反应液在98℃下进行5分钟热处理，在98℃下进行10秒的第1步骤、在55℃下进行5秒的第2步骤、在72℃下进行1分钟的第3步骤，将这3个步骤作为1个循环的反应进行30循环，最后在72℃下进行5分钟热处理。将扩增的PCR产物供至琼脂糖凝胶电泳，从该凝胶中使用QIAquick Gel Extraction kit(QIAGEN制)进行纯化。将纯化的PCR产物作为m12p。
(a-2)将(a-1)中得到的m12p用限制酶NcoI和HindIII进行消化，与预先用限制酶NcoI和HindIII消化了的表达载体pETMalE(日本特开2011-206046号公报)连接，使用其转化大肠杆菌BL21(DE3)株。
(a-3)对得到的转化体用添加了50μg/mL卡那霉素的LB培养基进行培养。通过从回收的菌体(转化体)中提取质粒，从而得到包含编码FcR12的多核苷酸的质粒pET-FcR12，所述FcR12是对FcR9进行了3位点(对于野生型Fc结合性蛋白质为12位点)氨基酸置换的多肽。
(a-4)利用与实施例1(5)同样的方法进行pET-FcR12的核苷酸序列的解析。
将附加了信号序列和聚组氨酸标签的FcR12的氨基酸序列示于序列号63，将编码前述FcR12的多核苷酸的序列示于序列号64。需要说明的是，序列号63中，第1位的甲硫氨酸(Met)至第26位的丙氨酸(Ala)为止为MalE信号肽，第27位的赖氨酸(Lys)至第32位的甲硫氨酸(Met)为止为连接子序列，第33位的甘氨酸(Gly)至第208位的谷氨酰胺(Gln)为止为FcR12的氨基酸序列(相当于序列号1的第17位至第192位为止的区域)，第209位至第210位为止的甘氨酸(Gly)为连接子序列，第211位至第216位的组氨酸(His)为标签序列。另外，序列号63中，分别地，Glu21Gly的甘氨酸存在于第37位，Leu23Met的甲硫氨酸存在于第39位，Val27Glu的谷氨酸存在于第43位，Phe29Ile的异亮氨酸存在于第45位，Tyr35Asn的天冬酰胺存在于第51位，Gln48Arg的精氨酸存在于第64位，Phe75Leu的亮氨酸存在于第91位，Asn92Ser的丝氨酸存在于第108位，Val117Glu的谷氨酸存在于第133位，Glu121Gly的甘氨酸存在于第137位，Phe171Ser的丝氨酸存在于第187位和Ser178Arg的精氨酸存在于第194位的位点。
(b)FcR13
从实施例18中已经明确的、涉及碱稳定性提高的氨基酸置换中选择Glu21Gly、Leu23Met、Ser68Pro和Ser178Arg，制作FcR9(实施例7(b))中累积了这些置换的FcR13。具体而言，对于编码FcR12的多核苷酸，进行产生Ser68Pro的突变导入，制作FcR13。
(b-1)将(a)中制作的pET-FcR12作为模板，将包含序列号24和序列号65(5’-CACAATGAAAGCCTGATTCCCAGCCAGGCG-3’)中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，除此之外，如下进行：制备表5所示的组成的反应液后，将该反应液在98℃下进行5分钟热处理，在98℃下进行10秒的第1步骤、在55℃下进行5秒的第2步骤、在72℃下进行1分钟的第3步骤，将这3个步骤作为1个循环的反应进行30循环，最后在72℃下进行5分钟热处理。将扩增的PCR产物供至琼脂糖凝胶电泳，从该凝胶中使用QIAquick Gel Extraction kit(QIAGEN制)进行纯化。将纯化的PCR产物作为m13F。
(b-2)将(a)中制作的pET-FcR12作为模板，将包含序列号62和序列号66(5’-GTAGCTGCTCGCCTGGCTGGGAATCAGGCT-3’)中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，除此之外，利用与(b-1)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为m13R。
(b-3)将(b-1)和(b-2)中得到的2种PCR产物(m13F、m13R)混合，制备表6所示的组成的反应液。进行如下PCR：将该反应液在98℃下进行5分钟热处理后，在98℃下进行10秒的第1步骤、在55℃下进行5秒的第2步骤、在72℃下进行1分钟的第3步骤，将这3个步骤作为1个循环的反应进行5循环，最后在72℃下进行5分钟热处理，将m13F和m13R连接。将所得PCR产物作为m13p。
(b-4)将(b-3)中得到的PCR产物m13p作为模板，将包含序列号23和序列号24中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，进行PCR。PCR如下进行：制备表7所示的组成的反应液后，将该反应液在98℃下进行5分钟热处理，在98℃下进行10秒的第1步骤、在55℃下进行5秒的第2步骤、在72℃下进行1分钟的第3步骤，将这3个步骤作为1个循环的反应进行30循环。由此，制作编码FcR12中导入了1位点氨基酸置换的FcR13的多核苷酸。
(b-5)将(b-4)中得到的多核苷酸进行纯化后，用限制酶NcoI和HindIII进行消化，与预先用限制酶NcoI和HindIII消化了的表达载体pETMalE(日本特开2011-206046号公报)连接，使用其转化大肠杆菌BL21(DE3)株。
(b-6)对得到的转化体用添加了50μg/mL卡那霉素的LB培养基进行培养。通过从回收的菌体(转化体)中提取质粒，从而得到包含编码FcR13的多核苷酸的质粒pET-FcR13，所述FcR13是对FcR9进行了4位点(对于野生型Fc结合性蛋白质为13位点)氨基酸置换的多肽。
(b-7)利用与实施例1(5)同样的方法进行pET-FcR13的核苷酸序列的解析。
将附加了信号序列和聚组氨酸标签的FcR13的氨基酸序列示于序列号67，将编码前述FcR13的多核苷酸的序列示于序列号68。需要说明的是，序列号67中，第1位的甲硫氨酸(Met)至第26位的丙氨酸(Ala)为止为MalE信号肽，第27位的赖氨酸(Lys)至第32位的甲硫氨酸(Met)为止为连接子序列，第33位的甘氨酸(Gly)至第208位的谷氨酰胺(Gln)为止为FcR13的氨基酸序列(相当于序列号1的第17位至第192位为止的区域)，第209位至第210位为止的甘氨酸(Gly)为连接子序列，第211位至第216位的组氨酸(His)为标签序列。另外，序列号67中，分别地，Glu21Gly的甘氨酸存在于第37位，Leu23Met的甲硫氨酸存在于第39位，Val27Glu的谷氨酸存在于第43位，Phe29Ile的异亮氨酸存在于第45位，Tyr35Asn的天冬酰胺存在于第51位，Gln48Arg的精氨酸存在于第64位，Ser68Pro的脯氨酸存在于第84位，Phe75Leu的亮氨酸存在于第91位，Asn92Ser的丝氨酸存在于第108位，Val117Glu的谷氨酸存在于第133位，Glu121Gly的甘氨酸存在于第137位，Phe171Ser的丝氨酸存在于第187位和Ser178Arg的精氨酸存在于第194位的位点。
实施例20Fc结合性蛋白质的碱稳定性评价
(1)将表达实施例4(c)中制作的Fc结合性蛋白质(FcR5a)、实施例7(b)中制作的Fc结合性蛋白质(FcR9)和实施例19中制作的Fc结合性蛋白质(FcR12、FcR13)的转化体利用实施例8的(1)至(4)中记载的方法进行培养，提取蛋白质，从而制备FcR5a、FcR9、FcR12和FcR13。
(2)利用实施例3(4)中记载的ELISA法测定(1)中制备的蛋白质提取液中的FcR5a、FcR9、FcR12和FcR13的抗体结合活性。此时，使用纯化并定量的FcR9制作标准曲线，进行浓度测定。
(3)以各Fc结合性蛋白质的浓度变为30μg/mL的方式用纯水稀释后，将前述稀释的溶液50μL与40mM的氢氧化钠溶液50μL混合，在30℃下静置2小时，从而进行碱处理。之后，加入4倍量的1MTris盐酸缓冲液(pH7.0)从而进行中和，通过实施例3(4)中记载的ELISA法测定Fc结合性蛋白质的抗体结合活性。
(4)将进行了碱处理时的抗体结合活性除以未进行碱处理时的抗体结合活性，从而算出残留活性，评价碱稳定性。
将结果示于表13。实施例19中制作的FcR12、FcR13与FcR5a、FcR9相比残留活性高，因此确认了，FcR12和FcR13的碱稳定性与FcR5a、FcR9相比提高了。
[表13]
Figure GDA0002777074250000641
实施例21向FcR13导入突变和基因文库的制作
对于编码实施例19(b)中制作的FcR13的多核苷酸部分，通过易错PCR随机地实施突变导入。
(1)作为模板，使用实施例19(b)中制作的表达载体pET-FcR13，进行易错PCR。易错PCR如下进行：将pET-FcR13作为模板，将包含序列号23和序列号24中记载的序列的寡核苷酸作为引物，除此之外，制备与表3所示的组成同样的反应液后，将该反应液在95℃下进行2分钟热处理，在95℃下进行30秒的第1步骤、在50℃下进行30秒的第2步骤、在72℃下进行90秒的第3步骤，将这3个步骤作为1个循环的反应进行35循环，最后在72℃下进行7分钟热处理。通过该反应，对编码Fc结合性蛋白质的多核苷酸良好地导入突变。
(2)将(1)中得到的PCR产物进行纯化后，用限制酶NcoI和HindIII进行消化，与预先用相同限制酶消化了的表达载体pETMalE(日本特开2011-206046号公报)连接。
(3)连接反应结束后，通过电穿孔法将反应液导入至大肠杆菌BL21(DE3)株，用包含50μg/mL的卡那霉素的LB平板培养基进行培养后，将形成于平板上的菌落作为随机突变基因文库。
实施例22碱稳定化Fc结合性蛋白质的筛选
(1)将实施例21中制作的随机突变基因文库利用实施例3(1)至(2)中记载的方法进行培养，从而使Fc结合性蛋白质表达。
(2)培养后，将通过离心操作得到的、包含Fc结合性蛋白质的培养上清利用以下所示的方法进行碱处理。需要说明的是，碱处理后，用4倍量的1MTris缓冲液(pH7.0)将pH恢复至中性附近。
(i)用纯水稀释至5倍，与等量的80mM的氢氧化钠溶液混合后，在30℃下静置2小时
(ii)用纯水稀释至20倍，与等量的60mM的氢氧化钠溶液混合后，在30℃下静置2小时
(3)利用实施例3(4)中记载的ELISA法分别测定进行了(2)中记载的碱处理时的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性和未进行(2)中记载的碱处理时的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性。之后，将进行了碱处理时的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性除以未进行碱处理时的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性，从而算出残留活性。
(4)用(3)的方法对约2700株的转化体进行评价，从中选择表达与FcR13相比稳定性提高了的Fc结合性蛋白质的转化体。将选择的转化体用包含50μg/mL的卡那霉素的2YT液体培养基进行培养，使用QIAprep Spin Miniprep kit(QIAGEN制)制备表达载体。
(5)对于编码所得表达载体中***的Fc结合性蛋白质的多核苷酸区域的序列，通过实施例1(5)中记载的方法解析核苷酸序列，从而确定氨基酸的突变位点。
(4)中选择的转化体表达的Fc结合性蛋白质的、相对于FcR13的氨基酸置换位点和碱处理后的残留活性(％)总结示于表14(碱处理为(i)的条件)和表15(碱处理为(ii)的条件)。包含序列号37中记载的氨基酸序列中第33位的甘氨酸至第208位的谷氨酰胺为止的氨基酸残基(相当于序列号1的第17位至第192位)，并且该从第33位至第208位为止的氨基酸残基中产生Met18Lys(该标记表示序列号1的第18位(序列号37中为第34位)的甲硫氨酸置换为赖氨酸，以下同样)、Met18Thr、Leu(Met)23Arg(该标记表示序列号1的第23位(序列号37中为第39位)的亮氨酸一次置换为甲硫氨酸并进一步置换为精氨酸，以下同样)、Lys46Ile、Gln(Arg)48Trp、Tyr51His、Tyr51Asn、Glu54Asp、Glu54Gly、Asn56Ser、Asn56Ile、Phe61Leu、Phe61Tyr、Glu64Gly、Ile67Leu、Ser69Asn、Ala71Thr、Tyr74Phe、Phe(Leu)75Arg、Ala78Glu、Val81Glu、Asp82Glu、Glu86Asp、Gln90Leu、Leu93Gln、Pro114Leu、Lys119Asn、Lys119Tyr、His125Gln、Ser130Thr、Lys138Arg、Gln143His、Gly147Val、Lys149Met、Phe151Tyr、His153Tyr、Tyr158Phe、Lys161Arg、Ser169Gly、Asn180Ser、Thr185Ala、Asn187Ile、Asn187Lys和Thr191Ala的至少任1种氨基酸置换的Fc结合性蛋白质与FcR13相比，可以说碱稳定性提高了。
[表14]
Figure GDA0002777074250000661
[表15]
氨基酸置换 残留活性(％)
Gly147Val 53.5
Met18Thr、Gln(Arg)48Trp、Ile67Leu 13.3
FcR13 10.5
将表15所示的、由FcR13进行了氨基酸置换的Fc结合性蛋白质中产生了Gly147Val的氨基酸置换的Fc结合性蛋白质命名为FcR14，将包含编码FcR14的多核苷酸的表达载体命名为pET-FcR14。将FcR14的氨基酸序列示于序列号69，将编码FcR14的多核苷酸的序列示于序列号70。需要说明的是，序列号69中，第1位的甲硫氨酸(Met)至第26位的丙氨酸(Ala)为止为MalE信号肽，第27位的赖氨酸(Lys)至第32位的甲硫氨酸(Met)为止为连接子序列，第33位的甘氨酸(Gly)至第208位的谷氨酰胺(Gln)为止为FcR14的氨基酸序列(相当于序列号1的第17位至第192位为止的区域)，第209位至第210位为止的甘氨酸(Gly)为连接子序列，第211位至第216位的组氨酸(His)为标签序列。另外，序列号69中，分别地，Glu21Gly的甘氨酸存在于第37位，Leu23Met的甲硫氨酸存在于第39位，Val27Glu的谷氨酸存在于第43位，Phe29Ile的异亮氨酸存在于第45位，Tyr35Asn的天冬酰胺存在于第51位，Gln48Arg的精氨酸存在于第64位，Ser68Pro的脯氨酸存在于第84位，Phe75Leu的亮氨酸存在于第91位，Asn92Ser的丝氨酸存在于第108位，Va1117Glu的谷氨酸存在于第133位，Glu121Gly的甘氨酸存在于第137位，Gly147Va1的缬氨酸存在于第163位，Phe171Ser的丝氨酸存在于第187位和Ser178Arg的精氨酸存在于第194位的位点。
实施例23改良Fc结合性蛋白质的制作
从实施例22中已经明确的、涉及Fc结合性蛋白质的碱稳定性提高的氨基酸置换中选择Tyr51His和Glu54Asp，通过在FcR14中累积这些置换，从而制作改良Fc结合性蛋白质(FcR16)。以下，对制作方法进行详细说明。
(1)将实施例22中得到的pET-FcR14作为模板，将包含序列号24和序列号71(5’-TGCCGGGGCGCGCATAGCCCGGATGATAAC-3’)中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，除此之外，如下进行：制备表5所示的组成的反应液后，将该反应液在98℃下进行5分钟热处理，在98℃下进行10秒的第1步骤、在55℃下进行5秒的第2步骤、在72℃下进行1分钟的第3步骤，将这3个步骤作为1个循环的反应进行30循环，最后在72℃下进行5分钟热处理。将扩增的PCR产物供至琼脂糖凝胶电泳，从该凝胶中使用QIAquick Gel Extraction kit(QIAGEN制)进行纯化。将纯化的PCR产物作为m16F。
(2)将实施例22中得到的pET-FcR14作为模板，将包含序列号23和序列号72(5’-GGTGCTGTTATCATCCGGGCTATGCGCGCC-3’)中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，除此之外，利用与(1)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为m16R。
(3)将(1)和(2)中得到的2种PCR产物(m16F、m16R)混合，制备表6所示的组成的反应液。进行如下PCR：将该反应液在98℃下进行5分钟热处理后，在98℃下进行10秒的第1步骤、在55℃下进行5秒的第2步骤、在72℃下进行1分钟的第3步骤，将这3个步骤作为1个循环的反应进行5循环，最后在72℃下进行5分钟热处理，得到将m16F和m16R连接的PCR产物m16p。
(4)将(3)中得到的PCR产物m16p作为模板，将包含序列号23和序列号24中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，进行PCR。PCR如下进行：制备表7所示的组成的反应液后，将该反应液在98℃下进行5分钟热处理，在98℃下进行10秒的第1步骤、在55℃下进行5秒的第2步骤、在72℃下进行1分钟的第3步骤，将这3个步骤作为1个循环的反应进行30循环，最后在72℃下进行5分钟热处理进行PCR。由此，制作编码对FcR14导入了2位点氨基酸置换的FcR16的多核苷酸。
(5)将(4)中得到的多核苷酸进行纯化后，用限制酶NcoI和HindIII进行消化，与预先用限制酶NcoI和HindIII消化了的表达载体pETMalE(日本特开2011-206046号公报)连接，使用其转化大肠杆菌BL21(DE3)株。
(6)对得到的转化体用添加了50μg/mL卡那霉素的LB培养基进行培养。通过从回收的菌体(转化体)中提取质粒，从而得到包含编码FcR16的多核苷酸的质粒pET-FcR16，所述FcR16是对FcR14进行了2位点(对野生型Fc结合性蛋白质为16位点)氨基酸置换的多肽。
(7)利用与实施例1(5)同样的方法进行pET-FcR16的核苷酸序列的解析。
将附加了信号序列和聚组氨酸标签的FcR16的氨基酸序列示于序列号73，将编码前述FcR16的多核苷酸的序列示于序列号74。需要说明的是，序列号73中，第1位的甲硫氨酸(Met)至第26位的丙氨酸(Ala)为止为MalE信号肽，第27位的赖氨酸(Lys)至第32位的甲硫氨酸(Met)为止为连接子序列，第33位的甘氨酸(Gly)至第208位的谷氨酰胺(Gln)为止为FcR13的氨基酸序列(相当于序列号1的第17位至第192位为止的区域)，第209位至第210位为止的甘氨酸(Gly)为连接子序列，第211位至第216位的组氨酸(His)为标签序列。另外，序列号73中，分别地，Glu21Gly的甘氨酸存在于第37位，Leu23Met的甲硫氨酸存在于第39位，Val27Glu的谷氨酸存在于第43位，Phe29Ile的异亮氨酸存在于第45位，Tyr35Asn的天冬酰胺存在于第51位，Gln48Arg的精氨酸存在于第64位，Tyr51His的组氨酸存在于第67位，Glu54Asp的天门冬氨酸存在于第70位，Ser68Pro的脯氨酸存在于第84位，Phe75Leu的亮氨酸存在于第91位，Asn92Ser的丝氨酸存在于第108位，Val117Glu的谷氨酸存在于第133位，Glu121Gly的甘氨酸存在于第137位，Gly147Val的缬氨酸存在于第163位，Phe171Ser的丝氨酸存在于第187位和Ser178Arg的精氨酸存在于第194位的位点。
实施例24Fc结合性蛋白质的碱稳定性评价
(1)利用实施例8的(1)至(4)中记载的方法，对表达实施例19(b)中制作的Fc结合性蛋白质(FcR13)、实施例22中取得的Fc结合性蛋白质(FcR14)和实施例23中制作的Fc结合性蛋白质(FcR16)的转化体进行培养，提取蛋白质，从而制备FcR13、FcR14和FcR16。
(2)利用实施例3(4)中记载的ELISA法测定(1)中制备的蛋白质提取液中的FcR13、FcR14和FcR16的抗体结合活性。此时，使用纯化并定量的FcR9制作标准曲线，进行浓度测定。
(3)以各Fc结合性蛋白质的浓度变为10μg/mL的方式用纯水稀释后，将前述稀释的溶液50μL与60mM的氢氧化钠溶液50μL混合，在30℃下静置2小时，从而进行碱处理。之后，加入4倍量的1MTris盐酸缓冲液(pH7.0)进行中和，通过实施例3(4)中记载的ELISA法测定Fc结合性蛋白质的抗体结合活性。
(4)将进行了碱处理时的抗体结合活性除以未进行碱处理时的抗体结合活性，从而算出残留活性，评价碱稳定性。
将结果示于表16。实施例22中制作的FcR14、FcR16与FcR13相比，残留活性高，因此确认了，与FcR13相比，碱稳定性提高了。
[表16]
Figure GDA0002777074250000701
实施例25向FcR16导入突变和基因文库的制作
对于编码实施例23中制作的FcR16的多核苷酸部分，通过易错PCR随机地实施突变导入。
(1)作为模板，使用实施例23中制作的表达载体pET-FcR16，进行易错PCR。易错PCR如下进行：将pET-FcR16作为模板，使用包含序列号23和24中记载的序列的寡核苷酸作为引物，除此之外，制备与表3所示的组成同样的反应液后，将该反应液在95℃下进行2分钟热处理，在95℃下进行30秒的第1步骤、在50℃下进行30秒的第2步骤、在72℃下进行90秒的第3步骤，将这3个步骤作为1个循环的反应进行35循环，最后在72℃下进行7分钟热处理。通过该反应，对编码Fc结合性蛋白质的多核苷酸良好地导入突变。
(2)将(1)中得到的PCR产物进行纯化后，用限制酶NcoI和HindIII进行消化，与预先用相同限制酶消化了的表达载体pETMalE(日本特开2011-206046号公报)连接。
(3)连接反应结束后，通过电穿孔法将反应液导入至大肠杆菌BL21(DE3)株，用包含50μg/mL的卡那霉素的LB平板培养基进行培养后，将形成于平板上的菌落作为随机突变基因文库。
实施例26碱稳定化Fc结合性蛋白质的筛选
(1)对实施例25中制作的随机突变基因文库利用实施例3(1)至(2)中记载的方法进行培养，从而使Fc结合性蛋白质表达。
(2)培养后，将通过离心操作得到的、包含Fc结合性蛋白质的培养上清用纯水稀释至20倍，与等量的80mM的氢氧化钠溶液混合后，在30℃下静置2小时，从而进行碱处理。碱处理后，用4倍量的1MTris缓冲液(pH7.0)将pH恢复至中性附近。
(3)利用实施例3(4)中记载的ELISA法分别测定进行了(2)中记载的碱处理时的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性和未进行(2)中记载的碱处理时的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性。之后，将进行了碱处理时的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性除以未进行碱处理时的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性，从而算出残留活性。
(4)用(3)的方法对约2700株的转化体进行评价，从中选择表达与FcR16相比稳定性提高了的Fc结合性蛋白质的转化体。将选择的转化体用包含50μg/mL的卡那霉素的2YT液体培养基进行培养，使用QIAprep Spin Miniprep kit(QIAGEN制)制备表达载体。
(5)对于所得表达载体中***的编码Fc结合性蛋白质的多核苷酸区域的序列，通过实施例1(5)中记载的方法解析核苷酸序列，从而确定氨基酸的突变位点。
(4)中选择的转化体表达的Fc结合性蛋白质的、相对于FcR13的氨基酸置换位点和碱处理后的残留活性(％)总结示于表17。包含序列号37中记载的氨基酸序列中第33位的甘氨酸至第208位的谷氨酰胺为止的氨基酸残基(相当于序列号1的第17位至第192位)，并且该从第33位至第208位为止的氨基酸残基中产生Ala78Ser(该标记表示序列号1的第78位(序列号37中为第94位)的丙氨酸置换为丝氨酸，以下同样)、Asp82Glu、Gln101Leu、Gln101Arg、Thr140Ile、Gln143His、Tyr158His、Lys161Arg、Lys165Glu、Thr185Ala、Asn187Asp、Asn187Tyr的至少任1种氨基酸置换的Fc结合性蛋白质与FcR16相比，可以说碱稳定性提高了。
[表17]
氨基酸置换 残留活性(％)
Ala78Ser、Thr185Ala 63.8
Asp82Glu、Gln101Leu、Asn187Asp 51.5
Gln101Arg、Lys161Arg 45.3
Thr140Ile 76.5
Gln143His 60.9
Thr140Ile、Tyr158His 104.1
Lys165Glu 43.5
Asn187Tyr 62.6
FcR16 36.0
实施例27改良Fc结合性蛋白质的制作
通过在FcR16中累积实施例26中判明的、涉及Fc结合性蛋白质的碱稳定性提高的氨基酸置换，谋求进一步的稳定性提高。置换氨基酸的累积主要使用PCR进行，制作以下的(a)至(c)所示的3种改良Fc结合性蛋白质。
(a)对于FcR16进一步进行了Thr140Ile、Tyr158His和Lys165Glu的氨基酸置换的FcR19
(b)对于FcR16进一步进行了Asp82Glu、Gln101Leu、Thr140Ile、Tyr158His和Lys165Glu的氨基酸置换的FcR21
(c)对于FcR16进一步进行了Ala78Ser、Asp82Glu、Gln101Leu、Thr140Ile、Tyr158His、Lys165Glu、Thr185Ala和Asn187Asp的氨基酸置换的FcR24
以下，对各改良Fc结合性蛋白质的制作方法进行详细说明。
(a)FcR19
从实施例26中已经明确的、涉及碱稳定性提高的氨基酸置换中选择Thr140Ile、Tyr158His和Lys165Glu，从而制作FcR16(实施例23)中累积了这些置换的FcR19。具体而言，对于包含实施例26中得到的Thr140Ile和Tyr158His的突变的多核苷酸进行产生Lys165Glu的突变导入，从而制作FcR19。
(a-1)将编码实施例26中取得的FcR16中包含Thr140Ile和Tyr158His的突变的Fc结合性蛋白质的多核苷酸作为模板，将包含序列号24和序列号75(5’-ATTCCCAAAGCGACGCTGGAGGACAGCGGC-3’)中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，除此之外，如下进行：制备表5所示的组成的反应液后，将该反应液在98℃下进行5分钟热处理，在98℃下进行10秒的第1步骤、在55℃下进行5秒的第2步骤、在72℃下进行1分钟的第3步骤，将这3个步骤作为1个循环的反应进行30循环，最后在72℃下进行5分钟热处理。将扩增的PCR产物供至琼脂糖凝胶电泳，从该凝胶中使用QIAquick Gel Extraction kit(QIAGEN制)进行纯化。将纯化的PCR产物作为m19F。
(a-2)将编码实施例26中取得的FcR16中包含Thr140Ile和Tyr158His的突变的Fc结合性蛋白质的多核苷酸作为模板，将包含序列号23和序列号76(5’-ATAGCTGCCGCTGTCCTCCAGCGTCGCTTT-3’)中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，除此之外，利用与(a-1)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为m19R。
(a-3)将(a-1)和(a-2)中得到的2种PCR产物(m19F、m19R)混合，制备表6所示的组成的反应液。进行如下PCR：将该反应液在98℃下进行5分钟热处理后，在98℃下进行10秒的第1步骤、在55℃下进行5秒的第2步骤、在72℃下进行1分钟的第3步骤，将这3个步骤作为1个循环的反应进行5循环，得到将m19F和m19R连接了的PCR产物m19p。
(a-4)将(a-3)中得到的PCR产物m19p作为模板，将包含序列号23和序列号24中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，进行PCR。PCR如下进行：制备表7所示的组成的反应液后，将该反应液在98℃下进行5分钟热处理，在98℃下进行10秒的第1步骤、在55℃下进行5秒的第2步骤、在72℃下进行1分钟的第3步骤，将这3个步骤作为1个循环的反应进行30循环。由此制作编码对FcR16导入了3位点氨基酸置换的FcR19的多核苷酸。
(a-5)将(a-4)中得到的多核苷酸进行纯化后，用限制酶NcoI和HindIII进行消化，与预先用限制酶NcoI和HindIII消化了的表达载体pETMalE(日本特开2011-206046号公报)连接，使用其转化大肠杆菌BL21(DE3)株。
(a-6)对得到的转化体用添加了50μg/mL卡那霉素的LB培养基进行培养。通过从回收的菌体(转化体)中提取质粒，从而得到包含编码FcR19的多核苷酸的质粒pET-FcR19，所述FcR19是对FcR16进行了3位点(对于野生型Fc结合性蛋白质为19位点)氨基酸置换的多肽。
(a-7)利用与实施例1(5)同样的方法进行pET-FcR19的核苷酸序列的解析。
将附加了信号序列和聚组氨酸标签的FcR19的氨基酸序列示于序列号77，将编码前述FcR19的多核苷酸的序列示于序列号78。需要说明的是，序列号77中，第1位的甲硫氨酸(Met)至第26位的丙氨酸(Ala)为止为MalE信号肽，第27位的赖氨酸(Lys)至第32位的甲硫氨酸(Met)为止为连接子序列，第33位的甘氨酸(Gly)至第208位的谷氨酰胺(Gln)为止为FcR19的氨基酸序列(相当于序列号1的第17位至第192位为止的区域)，第209位至第210位为止的甘氨酸(Gly)为连接子序列，第211位至第216位的组氨酸(His)为标签序列。另外，序列号73中，分别地，Glu21Gly的甘氨酸存在于第37位，Leu23Met的甲硫氨酸存在于第39位，Val27Glu的谷氨酸存在于第43位，Phe29Ile的异亮氨酸存在于第45位，Tyr35Asn的天冬酰胺存在于第51位，Gln48Arg的精氨酸存在于第64位，Tyr51His的组氨酸存在于第67位，Glu54Asp的天门冬氨酸存在于第70位，Ser68Pro的脯氨酸存在于第84位，Phe75Leu的亮氨酸存在于第91位，Asn92Ser的丝氨酸存在于第108位，Val117Glu的谷氨酸存在于第133位，Glu121Gly的甘氨酸存在于第137位，Thr140Ile的异亮氨酸存在于第156位，Gly147Val的缬氨酸存在于第163位，Tyr158His的组氨酸存在于第174位，Lys165Glu的谷氨酸存在于第181位，Phe171Ser的丝氨酸存在于第187位和Ser178Arg的精氨酸存在于第194位的位点。
(b)FcR21
对于包含实施例26中得到的Asp82Glu、Gln101Leu和Asn187Asp的突变的多核苷酸进行产生Thr140Ile、Tyr158His和Lys165Glu的突变导入，得到改良Fc结合性蛋白质。需要说明的是，前述突变中，Asn187Asp在后述的(b-9)的操作中缺失，因此，本实验中实际得到的改良Fc结合性蛋白质为FcR16(实施例23)中累积了Asp82Glu、Gln101Leu、Thr140Ile、Tyr158His和Lys165Glu的置换的Fc结合性蛋白质(FcR21)。
(b-1)将编码实施例26中取得的FcR16中包含Asp82Glu、Gln101Leu和Asn187Asp的突变的Fc结合性蛋白质的多核苷酸作为模板，将包含序列号24和序列号79(5’-ACCGCCCTGCATAAAGTGATCTACCTGCAA-3’)中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，除此之外，如下进行：制备表5所示的组成的反应液后，将该反应液在98℃下进行5分钟热处理，在98℃下进行10秒的第1步骤、在55℃下进行5秒的第2步骤、在72℃下进行1分钟的第3步骤，将这3个步骤作为1个循环的反应进行30循环，最后在72℃下进行5分钟热处理。将扩增的PCR产物供至琼脂糖凝胶电泳，从该凝胶中使用QIAquick Gel Extraction kit(QIAGEN制)进行纯化。将纯化的PCR产物作为m21-2F。
(b-2)将编码实施例26中取得的FcR16中包含Asp82Glu、Gln101Leu和Asn187Asp的突变的Fc结合性蛋白质的多核苷酸作为模板，将包含序列号23和序列号80(5’-TTGCAGGTAGATCACTTTATGCAGGGCGGT-3’)中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，除此之外，利用与(b-1)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为m21-2R。
(b-3)将(b-1)和(b-2)中得到的2种PCR产物(m21-2F、m21-2R)混合，制备表6所示的组成的反应液。进行如下PCR：将该反应液在98℃下进行5分钟热处理后，在98℃下进行10秒的第1步骤、在55℃下进行5秒的第2步骤、在72℃下进行1分钟的第3步骤，将这3个步骤作为1个循环的反应进行5循环，得到将m21-2F和m21-2R连接了的PCR产物m21-2p。
(b-4)将(b-3)中得到的PCR产物m21-2p作为模板，将包含序列号23和序列号24中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，进行PCR。PCR如下进行：制备表7所示的组成的反应液后，将该反应液在98℃下进行5分钟热处理，在98℃下进行10秒的第1步骤、在55℃下进行5秒的第2步骤、在72℃下进行1分钟的第3步骤，将这3个步骤作为1个循环的反应进行30循环。由此，制作编码FcR16中包含Asp82Glu、Gln101Leu、Thr140Ile和Asn187Asp的突变的FcR21-2的多核苷酸。
(b-5)将(b-4)中取得的、编码FcR16中包含Asp82Glu、Gln101Leu、Thr140Ile和Asn187Asp的突变的FcR21-2的多核苷酸作为模板，将包含序列号24和序列号81(5’-CACCACAACTCCGACTTCCATATTCCCAAA-3’)中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，除此之外，如下进行：制备表5所示的组成的反应液后，将该反应液在98℃下进行5分钟热处理，在98℃下进行10秒的第1步骤、在55℃下进行5秒的第2步骤、在72℃下进行1分钟的第3步骤，将这3个步骤作为1个循环的反应进行30循环，最后在72℃下进行5分钟热处理。将扩增的PCR产物供至琼脂糖凝胶电泳，从该凝胶中使用QIAquick Gel Extraction kit(QIAGEN制)进行纯化。将纯化的PCR产物作为m21-1F。
(b-6)将(b-4)中取得的、编码FcR16中包含Asp82Glu、Gln101Leu、Thr140Ile和Asn187Asp的突变的FcR21-2的多核苷酸作为模板，将包含序列号23和序列号82(5’-CAGCGTCGCTTTGGGAATATGGAAGTCGGA-3’)中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，除此之外，利用与(b-5)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为m21-1R。
(b-7)将(b-5)和(b-6)中得到的2种PCR产物(m21-1F、m21-1R)混合，制备表6所示的组成的反应液。进行如下PCR：将该反应液在98℃下进行5分钟热处理后，在98℃下进行10秒的第1步骤、在55℃下进行5秒的第2步骤、在72℃下进行1分钟的第3步骤，将这3个步骤作为1个循环的反应进行5循环，得到将m21-1F和m21-1R连接了的PCR产物m21-1p。
(b-8)将(b-7)中得到的PCR产物m21-1p作为模板，将包含序列号23和序列号24中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，进行PCR。PCR如下进行：制备表7所示的组成的反应液后，将该反应液在98℃下进行5分钟热处理，在98℃下进行10秒的第1步骤、在55℃下进行5秒的第2步骤、在72℃下进行1分钟的第3步骤，将这3个步骤作为1个循环的反应进行30循环。由此，制作编码FcR16中包含Asp82Glu、Gln101Leu、Thr140Ile、Tyr158His和Asn187Asp的突变的FcR21-1的多核苷酸。
(b-9)将(b-8)中取得的、编码FcR16中包含Asp82Glu、Gln101Leu、Thr140Ile、Tyr158His和Asn187Asp的突变的FcR21-1的多核苷酸作为模板，将包含序列号22和序列号75中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，除此之外，如下进行：制备表5所示的组成的反应液后，将该反应液在98℃下进行5分钟热处理，在98℃下进行10秒的第1步骤、在55℃下进行5秒的第2步骤、在72℃下进行1分钟的第3步骤，将这3个步骤作为1个循环的反应进行30循环，最后在72℃下进行5分钟热处理。将扩增的PCR产物供至琼脂糖凝胶电泳，从该凝胶中使用QIAquick Gel Extraction kit(QIAGEN制)进行纯化。将纯化的PCR产物作为m21F(通过本操作，Asn187Asp的突变缺失)。
(b-10)将(b-8)中取得的、编码FcR16中包含Asp82Glu、Gln101Leu、Thr140Ile、Tyr158His和Asn187Asp的突变的FcR21-1的多核苷酸作为模板，将包含序列号62和序列号76中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，除此之外，利用与(b-9)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为m21R。
(b-11)将(b-9)和(b-10)中得到的2种PCR产物(m21F、m21R)混合，制备表6所示的组成的反应液。进行如下PCR：将该反应液在98℃下进行5分钟热处理后，在98℃下进行10秒的第1步骤、在55℃下进行5秒的第2步骤、在72℃下进行1分钟的第3步骤，将这3个步骤作为1个循环的反应进行5循环，得到将m21F和m21R连接了的PCR产物m21p。
(b-12)将(b-11)中得到的PCR产物m21p作为模板，将包含序列号62和序列号22中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，进行PCR。PCR如下进行：制备表7所示的组成的反应液后，将该反应液在98℃下进行5分钟热处理，在98℃下进行10秒的第1步骤、在55℃下进行5秒的第2步骤、在72℃下进行1分钟的第3步骤，将这3个步骤作为1个循环的反应进行30循环。由此，制作编码FcR16中导入了5位点(Asp82Glu、Gln101Leu、Thr140Ile、Tyr158His和Lys165Glu)(对于野生型Fc结合性蛋白质为21位点)氨基酸置换的FcR21的多核苷酸。
(b-13)将(a-12)中得到的多核苷酸进行纯化后，用限制酶NcoI和HindIII进行消化，与预先用限制酶NcoI和HindIII消化了的表达载体pETMalE(日本特开2011-206046号公报)连接，使用其转化大肠杆菌BL21(DE3)株。
(b-14)对得到的转化体用添加了50μg/mL卡那霉素的LB培养基进行培养。通过从回收的菌体(转化体)中提取质粒，从而得到包含编码FcR21的多核苷酸的质粒pET-FcR21，所述FcR21是对FcR16进行了5位点氨基酸置换的多肽。
(b-15)利用与实施例1(5)同样的方法进行pET-FcR21的核苷酸序列的解析。
将附加了信号序列和聚组氨酸标签的FcR21的氨基酸序列示于序列号83，将编码前述FcR21的多核苷酸的序列示于序列号84。需要说明的是，序列号83中，第1位的甲硫氨酸(Met)至第26位的丙氨酸(Ala)为止为MalE信号肽，第27位的赖氨酸(Lys)至第32位的甲硫氨酸(Met)为止为连接子序列，第33位的甘氨酸(Gly)至第208位的谷氨酰胺(Gln)为止为FcR21的氨基酸序列(相当于序列号1的第17位至第192位为止的区域)，第209位至第210位为止的甘氨酸(Gly)为连接子序列，第211位至第216位的组氨酸(His)为标签序列。另外，序列号83中，分别地，Glu21Gly的甘氨酸存在于第37位，Leu23Met的甲硫氨酸存在于第39位，Val27Glu的谷氨酸存在于第43位，Phe29Ile的异亮氨酸存在于第45位，Tyr35Asn的天冬酰胺存在于第51位，Gln48Arg的精氨酸存在于第64位，Tyr51His的组氨酸存在于第67位，Glu54Asp的天门冬氨酸存在于第70位，Ser68Pro的脯氨酸存在于第84位，Phe75Leu的亮氨酸存在于第91位，Asp82Glu的谷氨酸存在于第98位，Asn92Ser的丝氨酸存在于第108位，Gln101Leu的亮氨酸存在于第117位，Val117Glu的谷氨酸存在于第133位，Glu121Gly的甘氨酸存在于第137位，Thr140Ile的异亮氨酸存在于第156位，Gly147Val的缬氨酸存在于第163位，Tyr158His的组氨酸存在于第174位，Lys165Glu的谷氨酸存在于第181位，Phe171Ser的丝氨酸存在于第187位和Ser178Arg的精氨酸存在于第194位的位点。
(c)FcR24
从实施例26中已经明确的、涉及碱稳定性提高的氨基酸置换中选择Ala78Ser、Asp82Glu、Gln101Leu、Thr140Ile、Tyr158His、Lys165Glu、Thr185Ala和Asn187Asp，制作FcR16(实施例23)中累积了这些置换的FcR24。具体而言，通过对编码FcR21的多核苷酸进行产生Ala78Ser、Thr185Ala和Asn187Asp的突变导入，从而制作FcR24。
(c-1)将(b)中制作的pET-FcR21作为模板，将包含序列号24和序列号85(5’-AGCAGCTACCTTATTGATTCGGCGACGGTG-3’)中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，除此之外，如下进行：制备表5所示的组成的反应液后，将该反应液在98℃下进行5分钟热处理，在98℃下进行10秒的第1步骤、在55℃下进行5秒的第2步骤、在72℃下进行1分钟的第3步骤，将这3个步骤作为1个循环的反应进行30循环，最后在72℃下进行5分钟热处理。将扩增的PCR产物供至琼脂糖凝胶电泳，从该凝胶中使用QIAquick Gel Extraction kit(QIAGEN制)进行纯化。将纯化的PCR产物作为m24-2F。
(c-2)将(b)中制作的pET-FcR21作为模板，将包含序列号23和序列号86(5’-GCTATCTTCCACCGTCGCCGAATCAATAAG-3’)中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，除此之外，利用与(c-1)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为m24-2R。
(c-3)将(c-1)和(c-2)中得到的2种PCR产物(m24-2F、m24-2R)混合，制备表6所示的组成的反应液。进行如下PCR：将该反应液在98℃下进行5分钟热处理后，在98℃下进行10秒的第1步骤、在55℃下进行5秒的第2步骤、在72℃下进行1分钟的第3步骤，将这3个步骤作为1个循环的反应进行5循环，得到将m21-2F和m21-2R连接了的PCR产物m24-2p。
(c-4)将(c-3)中得到的PCR产物m24-2p作为模板，将包含序列号23和序列号24中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，进行PCR。PCR如下进行：制备表7所示的组成的反应液后，将该反应液在98℃下进行5分钟热处理，在98℃下进行10秒的第1步骤、在55℃下进行5秒的第2步骤、在72℃下进行1分钟的第3步骤，将这3个步骤作为1个循环的反应进行30循环。由此，制作编码FcR16中包含Ala78Ser、Asp82Glu、Gln101Leu、Thr140Ile、Tyr158His和Lys165Glu的突变的FcR24-2的多核苷酸。
(c-5)将(c-4)中取得的、编码FcR16中包含Ala78Ser、Asp82Glu、Gln101Leu、Thr140Ile、Tyr158His和Lys165Glu的突变的FcR24-2的多核苷酸作为模板，将包含序列号24和序列号87(5’-AAAAATGTGAGCAGCGAGGCCGTGGATATT-3’)中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，除此之外，如下进行：制备表5所示的组成的反应液后，将该反应液在98℃下进行5分钟热处理，在98℃下进行10秒的第1步骤、在55℃下进行5秒的第2步骤、在72℃下进行1分钟的第3步骤，将这3个步骤作为1个循环的反应进行30循环，最后在72℃下进行5分钟热处理。将扩增的PCR产物供至琼脂糖凝胶电泳，从该凝胶中使用QIAquick Gel Extractionkit(QIAGEN制)进行纯化。将纯化的PCR产物作为m24F。
(c-6)将(c-4)中取得的、编码FcR16中包含Ala78Ser、Asp82Glu、Gln101Leu、Thr140Ile、Tyr158His和Lys165Glu的突变的FcR24-2的多核苷酸作为模板，将包含序列号62和序列号88(5’-GGTAATGGTAATATCCACGGCCTCGCTGCT-3’)中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，除此之外，利用与(c-5)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为m24R。
(c-7)将(c-5)和(c-6)中得到的2种PCR产物(m24F、m24R)混合，制备表6所示的组成的反应液。进行如下PCR：将该反应液在98℃下进行5分钟热处理后，在98℃下进行10秒的第1步骤、在55℃下进行5秒的第2步骤、在72℃下进行1分钟的第3步骤，将这3个步骤作为1个循环的反应进行5循环，得到将m24F和m24R连接了的PCR产物m24p。
(c-8)将(c-7)中得到的PCR产物m24p作为模板，将包含序列号62和序列号24中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，进行PCR。PCR如下进行：制备表7所示的组成的反应液后，将该反应液在98℃下进行5分钟热处理，在98℃下进行10秒的第1步骤、在55℃下进行5秒的第2步骤、在72℃下进行1分钟的第3步骤，将这3个步骤作为1个循环的反应进行30循环。由此，制作编码FcR16中导入了8位点(对于野生型Fc结合性蛋白质为24位点)氨基酸置换的FcR24的多核苷酸。
(c-9)将(c-8)中得到的多核苷酸进行纯化后，用限制酶NcoI和HindIII进行消化，与预先用限制酶NcoI和HindIII消化了的表达载体pETMalE(日本特开2011-206046号公报)连接，使用其转化大肠杆菌BL21(DE3)株。
(c-10)对得到的转化体用添加了50μg/mL卡那霉素的LB培养基进行培养。通过从回收的菌体(转化体)中提取质粒，从而得到包含编码FcR24的多核苷酸的质粒pET-FcR24，所述FcR24是对FcR16进行了8位点氨基酸置换的多肽。
(c-11)利用与实施例1(5)同样的方法进行pET-FcR24的核苷酸序列的解析。
将附加了信号序列和聚组氨酸标签的FcR24的氨基酸序列示于序列号89，将编码前述FcR24的多核苷酸的序列示于序列号90。需要说明的是，序列号89中，第1位的甲硫氨酸(Met)至第26位的丙氨酸(Ala)为止为MalE信号肽，第27位的赖氨酸(Lys)至第32位的甲硫氨酸(Met)为止为连接子序列，第33位的甘氨酸(Gly)至第208位的谷氨酰胺(Gln)为止为FcR24的氨基酸序列(相当于序列号1的第17位至第192位为止的区域)，第209位至第210位为止的甘氨酸(Gly)为连接子序列，第211位至第216位的组氨酸(His)为标签序列。另外，序列号89中，分别地，Glu21Gly的甘氨酸存在于第37位，Leu23Met的甲硫氨酸存在于第39位，Val27Glu的谷氨酸存在于第43位，Phe29Ile的异亮氨酸存在于第45位，Tyr35Asn的天冬酰胺存在于第51位，Gln48Arg的精氨酸存在于第64位，Tyr51His的组氨酸存在于第67位，Glu54Asp的天门冬氨酸存在于第70位，Ser68Pro的脯氨酸存在于第84位，Phe75Leu的亮氨酸存在于第91位，Ala78Ser的丝氨酸存在于第94位，Asp82Glu的谷氨酸存在于第98位，Asn92Ser的丝氨酸存在于第108位，Gln101Leu的亮氨酸存在于第117位，Val117Glu的谷氨酸存在于第133位，Glu121Gly的甘氨酸存在于第137位，Thr140Ile的异亮氨酸存在于第156位，Gly147Val的缬氨酸存在于第163位，Tyr158His的组氨酸存在于第174位，Lys165Glu的谷氨酸存在于第181位，Phe171Ser的丝氨酸存在于第187位，Ser178Arg的精氨酸存在于第194位，Thr185Ala的丙氨酸存在于第201位和Asn187Asp的天门冬氨酸存在于第203位的位点。
实施例28Fc结合性蛋白质的碱稳定性评价
(1)利用实施例8的(1)至(4)中记载的方法对表达实施例23中制作的Fc结合性蛋白质(FcR16)、以及实施例27中取得的Fc结合性蛋白质(FcR19、FcR21和FcR24)的转化体进行培养，提取蛋白质，从而制备FcR16、FcR19、FcR21和FcR24。
(2)利用实施例3(4)中记载的ELISA法测定(1)中制备的蛋白质提取液中的FcR16、FcR19、FcR21和FcR24的抗体结合活性。此时，使用纯化并定量的FcR13制作标准曲线，进行浓度测定。
(3)以各Fc结合性蛋白质的浓度变为10μg/mL的方式用纯水稀释后，将前述稀释的溶液50μL与80mM的氢氧化钠溶液50μL混合，在30℃下静置2小时，从而进行碱处理。之后，加入4倍量的1MTris盐酸缓冲液(pH7.0)，从而进行中和，通过实施例3(4)中记载的ELISA法测定Fc结合性蛋白质的抗体结合活性。
(4)将进行了碱处理时的抗体结合活性除以未进行碱处理时的抗体结合活性，从而算出残留活性，评价碱稳定性。
将结果示于表18。实施例27中制作的FcR19、FcR21和FcR24与FcR16相比残留活性高，因此确认了，与FcR16相比，碱稳定性提高了。
[表18]
Figure GDA0002777074250000831
实施例29向FcR24导入突变和基因文库的制作
对于编码实施例27(c)中制作的FcR24的多核苷酸部分，通过易错PCR随机地实施突变导入。
(1)作为模板，使用实施例27(c)中制作的表达载体pET-FcR24，进行易错PCR。易错PCR如下：将pET-FcR24作为模板，使用包含序列号23和24中记载的序列的寡核苷酸作为引物，除此之外，如下进行：制备与表3所示的组成同样的反应液后，将该反应液在95℃下进行2分钟热处理，在95℃下进行30秒的第1步骤、在50℃下进行30秒的第2步骤、在72℃下进行90秒的第3步骤，将这3个步骤作为1个循环的反应进行35循环，最后在72℃下进行7分钟热处理。通过该反应，对编码Fc结合性蛋白质的多核苷酸良好地导入突变。
(2)将(1)中得到的PCR产物进行纯化后，用限制酶NcoI和HindIII进行消化，与预先用相同限制酶消化了的表达载体pETMalE(日本特开2011-206046号公报)连接。
(3)连接反应结束后，通过电穿孔法将反应液导入至大肠杆菌BL21(DE3)株，用包含50μg/mL的卡那霉素的LB平板培养基进行培养后，将形成于平板上的菌落作为随机突变基因文库。
实施例30碱稳定化Fc结合性蛋白质的筛选
(1)将实施例29中制作的随机突变基因文库利用实施例3(1)至(2)中记载的方法进行培养，从而使Fc结合性蛋白质表达。
(2)培养后，将通过离心操作得到的、包含Fc结合性蛋白质的培养上清用纯水稀释至20倍，与等量的300mM的氢氧化钠溶液混合后，在30℃下静置2小时，进行碱处理。碱处理后，用4倍量的1M Tris缓冲液(pH7.0)将pH恢复至中性附近。
(3)利用实施例3(4)中记载的ELISA法分别测定进行了(2)中记载的碱处理时的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性和未进行(2)中记载的碱处理时的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性。之后，将进行了碱处理时的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性除以未进行碱处理时的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性，从而算出残留活性。
(4)用(3)的方法对约2700株的转化体进行评价，从中选择表达与FcR24相比稳定性提高了的Fc结合性蛋白质的转化体。将选择的转化体用包含50μg/mL的卡那霉素的2YT液体培养基进行培养，使用QIAprep Spin Miniprep kit(QIAGEN制)制备表达载体。
(5)对于所得表达载体中***的编码Fc结合性蛋白质的多核苷酸区域的序列，通过实施例1(5)中记载的方法解析核苷酸序列，从而确定氨基酸的突变位点。
(4)中选择的转化体表达的Fc结合性蛋白质的、相对于FcR24的氨基酸置换位点和碱处理后的残留活性(％)总结示于表19。包含序列号89中记载的氨基酸序列中的第33位的甘氨酸至第208位的谷氨酰胺为止的氨基酸残基(相当于序列号1的第17位至第192位)，并且该从第33位至第208位为止的氨基酸残基中产生Lys40Gln(该标记表示序列号1的第40位(序列号37中为第56位)的赖氨酸置换为谷氨酰胺，以下同样)、Lys46Asn、Ala50Thr、Asn56Tyr、His62Leu、Ser65Gly、Tyr74His、Asp77Val、Gln90Leu、Lys119Thr、Iys119Glu、Asp122Glu、His137Gln、Thr(Ile)140Met(该标记表示序列号1的第140位(序列号37中为第156位)的苏氨酸一次置换为异亮氨酸并进一步置换为甲硫氨酸，以下同样)、Tyr141Phe、Tyr(His)158Leu、Leu175Arg、Asn180Lys、Asn180Ser、Ile190Val、Thr191Ile的至少任1种氨基酸置换的Fc结合性蛋白质与FcR24相比，可以说碱稳定性提高了。
[表19]
氨基酸置换 残留活性(％)
Lys40Gln、Ile190Val 61.4
Lys46Asn、Lys119Thr、Tyr(His)158Leu、Asn180Lys 55.8
Ala50Thr 25.7
Asn56Tyr、Ser65Gly、Gln90Leu、Tyr141Phe 55.7
His62Leu、Tyr74His、Asp122Glu 42.0
Asp77Val、His137Gln、Asn180Lys 62.4
Lys119Glu、Tyr141Phe 72.0
Lys119Glu、Leu175Arg 38.7
Asp122Glu 25.8
Thr(Ile)140Met 33.8
Asn180Ser 32.0
Ile190Val 52.7
Thr191Ile 40.6
FcR24 23.3
实施例31Thr140或Tyr158氨基酸置换体的制作
实施例26中已经明确的、涉及Fc结合性蛋白质的碱稳定性提高的氨基酸置换中，分别地，序列号1的第140位(序列号37中为第156位)的苏氨酸(Thr140)置换为异亮氨酸(Ile)、第158位(序列号37中为第174位)的酪氨酸(Tyr158)置换为组氨酸，从而碱稳定性特别提高了。因此，为了确认Thr140和Tyr158向其他氨基酸的置换的有用性，制作实施例27(c)中制作的FcR24(序列号89)中、将Thr140(序列号89中为第156位)或Tyr158(序列号89中为第174位)置换为其他氨基酸的Fc结合性蛋白质。
(a)Thr140氨基酸置换体的制作
(a-1)将实施例27(c)中制作的pET-FcR24作为模板，将包含序列号24和序列号91(5’-CCTGCATAAAGTGNNKTACCTGCAAAACGG-3’)中记载的序列的寡核苷酸作为引物，除此之外，进行如下PCR：制备与表3所示的组成同样的反应液后，将该反应液在95℃下进行2分钟热处理，在95℃下进行30秒的第1步骤、在50℃下进行30秒的第2步骤、在72℃下进行90秒的第3步骤，将这3个步骤作为1个循环的反应进行35循环，最后在72℃下进行7分钟热处理。将所得PCR产物作为T140p1。
(a-2)将实施例27(c)中制作的pET-FcR24作为模板，使用包含序列号23和序列号92(5’-CCGTTTTGCAGGTAMNNCACTTTATGCAGG-3’)中记载的序列的寡核苷酸作为引物，除此之外，进行如下PCR：制备与表3所示的组成同样的反应液后，将该反应液在95℃下进行2分钟热处理，在95℃下进行30秒的第1步骤、在50℃下进行30秒的第2步骤、在72℃下进行90秒的第3步骤，将这3个步骤作为1个循环的反应进行35循环，最后在72℃下进行7分钟热处理。将所得PCR产物作为T140p2。
(a-3)将(a-1)和(a-2)中得到的2种PCR产物(T140p1、T140p2)混合，制备表6所示的组成的反应液。进行如下PCR：将该反应液在98℃下进行5分钟热处理后，在98℃下进行10秒的第1步骤、在55℃下进行5秒的第2步骤、在72℃下进行1分钟的第3步骤，将这3个步骤作为1个循环的反应进行5循环，得到将T140p1和T140p2连接了的PCR产物T140p。
(a-4)将(a-3)中得到的PCR产物T140p作为模板，将包含序列号23和序列号24中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，进行PCR。PCR如下进行：制备表7所示的组成的反应液后，将该反应液在98℃下进行5分钟热处理，在98℃下进行10秒的第1步骤、在55℃下进行5秒的第2步骤、在72℃下进行1分钟的第3步骤，将这3个步骤作为1个循环的反应进行30循环。由此，得到编码Fc结合性蛋白质(FcR24)的第140位的氨基酸被置换为任意氨基酸的Fc结合性蛋白质的多核苷酸。将所得多核苷酸作为T140p3。
(a-5)将(a-4)中得到的多核苷酸进行纯化后，用限制酶NcoI和HindIII进行消化，与预先用限制酶NcoI和HindIII消化了的表达载体pETMalE(日本特开2011-206046号公报)连接，使用其转化大肠杆菌BL21(DE3)株。
(a-6)对得到的转化体用添加了50μg/mL卡那霉素的LB培养基进行培养。
从回收的菌体(转化体)提取质粒，对于多核苷酸区域的序列，通过实施例1(5)中记载的方法解析核苷酸序列，结果，得到表达Fc结合性蛋白质FcR24的Thr140(序列号89中为第156位的异亮氨酸)被置换为Ala、Arg、Gly、Leu、Lys、Phe、Thr、Ser或Val的Fc结合性蛋白质的转化体。
(b)Tyr158氨基酸置换体的制作
(b-1)将实施例27(c)中制作的pET-FcR24作为模板，使用包含序列号24和序列号93(5’-CAACTCCGACTTCNNKATTCCCAAAGCGAC-3’)中记载的序列的寡核苷酸作为引物，除此之外，进行如下PCR：制备与表3所示的组成同样的反应液后，将该反应液在95℃下进行2分钟热处理，在95℃下进行30秒的第1步骤、在50℃下进行30秒的第2步骤、在72℃下进行90秒的第3步骤，将这3个步骤作为1个循环的反应进行35循环，最后在72℃下进行7分钟热处理。将所得PCR产物作为Y158p1。
(b-2)将实施例27(c)中制作的pET-FcR24作为模板，使用包含序列号23和序列号94(5’-GTCGCTTTGGGAATMNNGAAGTCGGAGTTG-3’)中记载的序列的寡核苷酸作为引物，除此之外，进行如下PCR：制备与表3所示的组成同样的反应液后，将该反应液在95℃下进行2分钟热处理，在95℃下进行30秒的第1步骤、在50℃下进行30秒的第2步骤、在72℃下进行90秒的第3步骤，将这3个步骤作为1个循环的反应进行35循环，最后在72℃下进行7分钟热处理。将所得PCR产物作为Y158p2。
(b-3)将(b-1)和(b-2)中得到的2种PCR产物(Y158p1、Y158p2)混合，制备表6所示的组成的反应液。进行如下PCR：将该反应液在98℃下进行5分钟热处理后，在98℃下进行10秒的第1步骤、在55℃下进行5秒的第2步骤、在72℃下进行1分钟的第3步骤，将这3个步骤作为1个循环的反应进行5循环，得到将Y158p1和Y158p2连接了的PCR产物Y158p。
(b-4)将(b-3)中得到的PCR产物Y158p作为模板，将包含序列号23和序列号24中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，进行PCR。PCR如下进行：制备表7所示的组成的反应液后，将该反应液在98℃下进行5分钟热处理，在98℃下进行10秒的第1步骤、在55℃下进行5秒的第2步骤、在72℃下进行1分钟的第3步骤，将这3个步骤作为1个循环的反应进行30循环。由此，得到编码Fc结合性蛋白质(FcR24)的第158位的氨基酸被置换为任意的氨基酸的Fc结合性蛋白质的多核苷酸。将所得多核苷酸作为Y158p3。
(b-5)将(b-4)中得到的多核苷酸进行纯化后，用限制酶NcoI和HindIII进行消化，与预先用限制酶NcoI和HindIII消化了的表达载体pETMalE(日本特开2011-206046号公报)连接，使用其转化大肠杆菌BL21(DE3)株。
(b-6)对得到的转化体用添加了50μg/mL卡那霉素的LB培养基进行培养。
从回收的菌体(转化体)提取质粒，对于多核苷酸区域的序列，通过实施例1(5)中记载的方法解析核苷酸序列，结果，得到表达Fc结合性蛋白质FcR24的Tyr158(序列号89中为第174位的组氨酸)被置换为Ala、Arg、Asn、Cys、Gln、Glu、Gly、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的Fc结合性蛋白质的转化体。
实施例32Thr140或Tyr158氨基酸置换体的评价
(1)将实施例31中制作的表达Fc结合性蛋白质的转化体利用实施例8的(1)至(4)中记载的方法进行培养，提取蛋白质。
(2)利用实施例3(4)中记载的ELISA法测定(1)中制备的蛋白质提取液中的Fc结合蛋白质的抗体结合活性。此时，使用纯化并定量的FcR24制作标准曲线，进行浓度测定。
(3)以各Fc结合性蛋白质的浓度变为10μg/mL的方式用纯水稀释后，将前述稀释的溶液50μL与300mM(Thr140氨基酸置换体的情况下)或350mM(Tyr158氨基酸置换体的情况下)的氢氧化钠溶液50μL混合，在30℃下静置2小时，从而进行碱处理。之后，加入4倍量的1MTris盐酸缓冲液(pH7.0)，从而进行中和，通过实施例3(4)中记载的ELISA法测定Fc结合性蛋白质的抗体结合活性。
(4)将进行了碱处理时的抗体结合活性除以未进行碱处理时的抗体结合活性，从而算出残留活性，评价碱稳定性。
将所得结果示于表20(Thr140氨基酸置换体的结果)和表21(Tyr158氨基酸置换体的结果)。需要说明的是，表20中Ile的结果和表21中His的结果为FcR24的结果。分别地，Thr140的情况下(表20)，确认了通过置换为A1a、Arg、Ile、Leu、Lys、Phe、Ser或Val从而碱稳定性提高了，Tyr158的情况下(表21)，确认了通过置换为Cys、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Trp或Va1从而碱稳定性提高了。
[表20]
氨基酸置换 残留活性(％)
Ala 12.9
Arg 14.8
Ile 22.4
Gly 2.5
Leu 33.6
Lys 26.5
Phe 30.5
Ser 8.0
Val 23.2
Thr 4.3
[表21]
氨基酸置换 残留活性(％)
Ala 1.7
Arg 2.7
Asn 3.4
Cys 8.4
Gln 3.4
Glu 2.2
Gly 2.1
His 29.2
Ile 32.4
Leu 21.9
Lys 8.4
Met 4.8
Phe 15.7
Pro 1.3
Ser 1.6
Thr 3.8
Trp 29.5
Val 45.5
Tyr 5.5
实施例33 Fc结合性蛋白质固定化凝胶的制备
(1)利用含有编码包含序列号60中记载的氨基酸序列的人Fc结合性蛋白质的多核苷酸的质粒，转化大肠杆菌，对所得转化体进行培养，从所得菌体纯化前述Fc受容体蛋白质，从而制备固定化于不溶性载体的配体。需要说明的是，包含序列号60中记载的氨基酸序列的人Fc结合性蛋白质是在包含序列号58中记载的氨基酸序列的人Fc结合性蛋白质中、产生了以下的(a)至(d)的氨基酸置换的蛋白质。
(a)序列号58的第45位的苯丙氨酸置换为异亮氨酸
(b)序列号58的第64位的谷氨酰胺置换为精氨酸
(c)序列号58的第133位的缬氨酸置换为谷氨酸
(d)序列号58的第187位的苯丙氨酸置换为丝氨酸
(2)对于乙烯基聚合物凝胶(粒径10μm，TOSOH CORPORATION制)所具有的羟基，通过常规方法进行官能团转换，从而得到用碘代乙酰基活化了的乙烯基聚合物凝胶。
(3)使所得前述活化了的凝胶与(1)中制备的配体反应，从而制作人Fc结合性蛋白质固定化凝胶。
(4)将所得凝胶填充至φ4.6×75mm的不锈钢柱，制作分离柱。
比较例1单克隆抗体的分离
(1)将市售的单克隆抗体(Rituxan，全药工业株式会社社制)用PBS(PhosphateBuffered Saline，磷酸缓冲生理盐水)制备成1mg/mL，使用其作为单克隆抗体溶液。
(2)将实施例1中制作的分离柱用20mM的乙酸钠缓冲液(pH5.0)(缓冲液A)平衡化后，添加(1)中制备的单克隆抗体溶液5μL。
(3)添加单克隆抗体溶液后2分钟内，流入缓冲液A，2分钟至40分钟为止的期间内，通过设为缓冲液A100％-10mM的甘氨酸盐酸缓冲液(pH3.0)(缓冲液B)0％至缓冲液A0％-缓冲液B100％的梯度，对添加至柱的单克隆抗体进行分离并洗脱。洗脱的单克隆抗体的检测利用UV检测器(280nm的吸收)进行。
将分离单克隆抗体的结果(色谱图)示于图7。检测到3个大的峰，从洗脱时间快的峰起设为峰1、峰2、峰3。另外，按照下述式算出峰的各自分离度(Rs值)，结果分别地，峰1与峰2的分离度变为0.63，峰2与峰3的分离度变为0.61。
Rs值＝1.18×(洗脱时间慢的峰的洗脱时间-洗脱时间快的峰的洗脱时间)/(洗脱时间快的峰的半值宽度+洗脱时间慢的峰的半值宽度)
实施例34本发明的单克隆抗体的分离(之一)
作为缓冲液A，使用添加有50mM、100mM、200mM、500mM或1000mM氯化钠的20mM的乙酸钠缓冲液(pH5.0)，除此之外，进行与比较例1同样的实验。将结果示于图7。从洗脱时间快的峰起设为峰1、峰2、峰3，利用与比较例1同样的方法算出Rs值，结果变为表22所示的结果。通过在20mM的乙酸钠缓冲液(pH5.0)中添加氯化钠(氯化物离子)，从而可知，峰1与峰2的Rs值和/或峰2与峰3的Rs值提高了。特别是，对于添加有50mM至500mM的氯化钠(氯化物离子)的缓冲液，峰1与峰2的Rs值和峰2与峰3的Rs值提高，因此可以说特别优选。
[表22]
Figure GDA0002777074250000921
实施例35本发明的单克隆抗体的分离(之二)
作为缓冲液A，使用添加有100mM或200mM氯化钾的20mM的乙酸钠缓冲液(pH5.0)，除此之外，进行与比较例1同样的实验。将结果示于图8。从洗脱时间快的峰起设为峰1、峰2、峰3，利用与比较例1同样的方法算出Rs值，结果变为表23所示的结果。由该结果可知，即使使用氯化钾代替氯化钠，也与实施例34的结果同样地，峰1与峰2的Rs值和/或峰2与峰3的Rs值提高了。
[表23]
Figure GDA0002777074250000922
实施例36本发明的单克隆抗体的分离(之三)
作为缓冲液A，使用添加有100mM硫酸钠或硫酸铵的20mM的乙酸钠缓冲液(pH5.0)，除此之外，进行与比较例1同样的实验。将结果示于图9。从洗脱时间快的峰起设为峰1、峰2、峰3，利用与比较例1同样的方法算出Rs值，结果变为表24所示的结果。由该结果可知，即使使用硫酸根离子代替氯化物离子，也与实施例34的结果同样地，峰1与峰2的Rs值和/或峰2与峰3的Rs值提高了。
[表24]
Figure GDA0002777074250000931
实施例37进行了1位点氨基酸置换的Fc结合性蛋白质的制作
对于实施例3中已经明确的、涉及Fc结合性蛋白质的稳定性提高的氨基酸置换中的序列号1的第27位的缬氨酸(Val)、第35位的酪氨酸(Tyr)和第121位的谷氨酸(Glu)置换成其他氨基酸的Fc结合性蛋白质，分别用下述的方法进行制作。
(A)将序列号1的第27位的缬氨酸(Val)置换成其他氨基酸的Fc结合性蛋白质的制作
(A-1)将实施例1中制备的pET-eFcR作为模板、将包含序列号24和序列号95(5’-CTGCCGAAAGCGNNKGTGTTTCTGGAACCG-3’)中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，除此之外，按照与实施例4(a-1)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为27pF。
(A-2)将实施例1中制备的pET-eFcR作为模板、将包含序列号23和序列号96(5’-TTCCAGAAACACMNNCGCTTTCGGCAGATC-3’)中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，除此之外，按照与实施例4(a-1)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为27pR。
(A-3)将(A-1)和(A-2)中得到的2种PCR产物(27pF、27pR)进行混合之后，按照与实施例4(a-3)同样的方法进行PCR，将27pF和27pR连接。将得到的PCR产物作为27p。
(A-4)将(A-3)中得到的PCR产物27p作为模板、将包含序列号23和序列号24中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，按照与实施例4(a-4)同样的方法进行PCR。由此，制备编码将序列号1的第27位的缬氨酸置换成任意氨基酸的Fc结合性蛋白质的多核苷酸。
(A-5)对(A-4)中得到的多核苷酸进行纯化之后，用限制酶NcoI和HindIII进行消化，与预先用限制酶NcoI和HindIII进行了消化的表达载体pETMalE(日本特开2011-206046号公报)连接，使用其转化大肠杆菌BL21(DE3)株。
(A-6)对得到的转化体用添加了50μg/mL卡那霉素的LB培养基进行培养。由回收的菌体(转化体)提取质粒，按照与实施例1(5)同样的方法进行核苷酸序列解析。
结果，得到编码产生了Val27Gly(V27G)、Val27Lys(V27K)、Val27Thr(V27T)、Val27Ala(V27A)、Val27Trp(V27W)或Val27Arg(V27R)的氨基酸置换的Fc结合性蛋白质的多核苷酸。
(B)将序列号1的第35位的酪氨酸(Tyr)置换为其他氨基酸的Fc结合性蛋白质的制作
(B-1)将实施例1中制备的pET-eFcR作为模板、将包含序列号24和序列号97(5’-AACCGCAGTGGNNKCGCGTGCTGGAGAAAG-3’)中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，除此之外，按照与实施例4(a-1)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为35pF。
(B-2)将实施例1中制备的pET-eFcR作为模板、将包含序列号23和序列号98(5’-AGCACGCGMNNCCACTGCGGTTCCAGAAAC-3’)中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，除此之外，按照与实施例4(a-1)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为35pR。
(B-3)将(B-1)和(B-2)中得到的2种PCR产物(35pF、35pR)进行混合之后，按照与实施例4(a-3)同样的方法进行PCR，将35pF和35pR连接。将得到的PCR产物作为35p。
(B-4)将(B-3)中得到的PCR产物35p作为模板、将包含序列号23和序列号24中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，按照与实施例4(a-4)同样的方法进行PCR。由此，制备编码将序列号1的第35位的酪氨酸置换成任意氨基酸的Fc结合性蛋白质的多核苷酸。
(B-5)对(B-4)中得到的多核苷酸进行纯化之后，用限制酶NcoI和HindIII进行消化，与预先用限制酶NcoI和HindIII进行了消化的表达载体pETMalE(日本特开2011-206046号公报)连接，使用其转化大肠杆菌BL21(DE3)株。
(B-6)对得到的转化体用添加了50μg/mL卡那霉素的LB培养基进行培养。由回收的菌体(转化体)提取质粒，按照与实施例1(5)同样的方法进行核苷酸序列解析。
结果，得到编码产生了Tyr35Cys(Y35C)、Tyr35Asp(Y35D)、Tyr35Phe(Y35F)、Tyr35Gly(Y35G)、Tyr35Lys(Y35K)、Tyr35Leu(Y35L)、Tyr35Asn(Y35N)、Tyr35Pro(Y35P)、Tyr35Arg(Y35R)、Tyr35Ser(Y35S)、Tyr35Thr(Y35T)、Tyr35Val(Y35V)或Tyr35Trp(Y35W)的氨基酸置换的Fc结合性蛋白质的多核苷酸。
(C)将序列号1的第121位的谷氨酸(Glu)置换为其他氨基酸的Fc结合性蛋白质的制作
(C-1)将实施例1中制备的pET-eFcR作为模板、将包含序列号24和序列号99(5’-GTGTTCAAAGAGNNKGATCCGATTCATCTG-3’)中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，除此之外，按照与实施例4(a-1)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为121pF。
(C-2)将实施例1中制备的pET-eFcR作为模板、将包含序列号23和序列号100(5’-AATCGGATCMNNCTCTTTGAACACCCACCG-3’)中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，除此之外，按照与实施例4(a-1)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为121pR。
(C-3)将(C-1)和(C-2)中得到的2种PCR产物(121pF、121pR)进行混合之后，按照与实施例4(a-3)同样的方法进行PCR，将121pF和121pR连接。将得到的PCR产物作为121p。
(C-4)将(C-3)中得到的PCR产物121p作为模板、将包含序列号23和序列号24中记载的序列的寡核苷酸作为PCR引物，进行与实施例4(a-4)同样的PCR。由此，制备编码序列号1的第121位的谷氨酸置换成任意的氨基酸的Fc结合性蛋白质的多核苷酸。
(C-5)对(C-4)中得到的多核苷酸进行纯化之后，用限制酶NcoI和HindIII进行消化，与预先用限制酶NcoI和HindIII消化的表达载体pETMalE(日本特开2011-206046号公报)连接，使用该连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)株。
(C-6)对得到的转化体用添加了50μg/mL卡那霉素的LB培养基进行培养。由回收的菌体(转化体)提取质粒，按照与实施例1(5)同样的方法进行核苷酸序列解析。
结果，得到编码产生了Glu121Lys(E121K)、Glu121Pro(E121P)、Glu121Arg(E121R)、Glu121Gly(E121G)、Glu121His(E121H)或Glu121Val(E121V)氨基酸置换的Fc结合性蛋白质的多核苷酸。
实施例38 1个位点氨基酸置换Fc结合性蛋白质的抗体结合活性评价
(1)对于表达实施例1中制备的野生型Fc结合性蛋白质和实施例37中制备的进行了1个位点氨基酸置换的Fc结合性蛋白质的转化体，按照与实施例3
(1)和(2)同样的方法分别进行培养，使野生型Fc结合性蛋白质以及进行了1个氨基酸置换的Fc结合性蛋白质表达。
(2)对于表达的进行了1个氨基酸置换的Fc结合性蛋白质，按照与实施例3(3)和(4)中记载的ELISA法检查与抗体的结合活性。
将结果示于图10。通过将序列号1的第27位的缬氨酸置换成甘氨酸(V27G)、赖氨酸(V27K)、苏氨酸(V27T)、丙氨酸(V27A)、精氨酸(V27R)，与野生型Fc结合性蛋白质相比较，抗体结合活性提高。另一方面，序列号1的第27位的Val置换成色氨酸(V27W)时，与野生型Fc结合性蛋白质相比较，抗体结合活性降低。
通过将序列号1的第35位的酪氨酸置换成天冬氨酸(Y35D)、苯丙氨酸(Y35F)、甘氨酸(Y35G)、赖氨酸(Y35K)、亮氨酸(Y35L)、天冬酰胺(Y35N)、脯氨酸(Y35P)、丝氨酸(Y35S)、苏氨酸(Y35T)、缬氨酸(Y35V)、色氨酸(Y35W)，与野生型Fc结合性蛋白质相比较，抗体结合活性提高。其中，Y35D、Y35G、Y35K、Y35L、Y35N、Y35P、Y35S、Y35T、Y35W与野生型Fc结合性蛋白质相比较，抗体结合活性大幅地提高。另一方面，将序列号1的第35位的酪氨酸置换成半胱氨酸(Y35C)、精氨酸(Y35R)的情况下，为与野生型Fc结合性蛋白质几乎同等的抗体结合活性。
通过将序列号1的第121位的谷氨酸置换成赖氨酸(E121K)、精氨酸(E121R)、甘氨酸(E121G)、组氨酸(E121H)，与野生型Fc结合性蛋白质相比较，抗体结合活性提高。其中，E121G与野生型Fc结合性蛋白质相比较，抗体结合活性大幅地提高。另一方面，将序列号1的第121位的谷氨酸置换成缬氨酸(E121V)的情况下，是与野生型Fc结合性蛋白质几乎同等的抗体结合活性；置换成脯氨酸(E121P)的情况下，与野生型Fc结合性蛋白质相比较，抗体结合活性降低。
实施例39Fc结合性蛋白质表达载体的制作
向表达载体pTrc99a中，***编码序列号101(MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA)中记载的PelB信号肽中第6位的脯氨酸(P)置换为丝氨酸(S)的信号肽的多核苷酸，制作包含信号肽的表达载体。
(1)将包含序列号102(5’-CATGAAATACCTGCTGTCGACCGCTGCTGCTGGTCTGCTGCTCCTCGCTGCCCAGCCGGCGATGGC-3’)和序列号103(5’-CATGGCCATCGCCGGCTGGGCAGCGAGGAGCAGCAGACCAGCAGCAGCGGTCGACAGCAGGTATTT-3’)中记载的序列的寡核苷酸等量混合，在95℃下进行5分钟加热后，在1分钟内每1℃地降低温度，达到15℃时进行保持，从而制作双链寡核苷酸。
(2)将(1)中制作的双链寡核苷酸与预先用限制酶NcoI处理过的表达载体pTrc99a连接，使用其转化大肠杆菌JM109株(TAKARA BIO INC.制)。
(3)将所得转化体通过包含100μg/mL的羧苄青霉素的LB培养基进行培养后，使用QIAprep Spin Miniprep kit(QIAGEN制)得到表达载体pTrc-PelBV3。
实施例40附加了半胱氨酸标签的Fc结合性蛋白质(FcRCys)的制作
(1)将实施例1中制作的pET-eFcR作为模板实施PCR。该PCR中的引物使用包含序列号21和序列号57(5’-CCCAAGCTTATCCGCAGGTATCGTTGCGGCACCCTTGGGTAATGGTAATATTCACGGTCTCGCTGC-3’)中记载的序列的寡核苷酸。PCR如下实施：制备表2所示的组成的反应液后，将该反应液在98℃下进行5分钟热处理，在98℃下进行10秒的第1步骤、在55℃下进行5秒的第2步骤、在72℃下进行1分钟的第3步骤，将这3个步骤作为1个循环的反应重复30循环。
(2)将(1)中得到的多核苷酸进行纯化，用限制酶NcoI和HindIII进行消化后，与预先用限制酶NcoI和HindIII进行消化了的实施例39中制作的表达载体pTrc-PelBV3连接，使用该连接产物转化大肠杆菌W3110株。
(3)将所得转化体用包含100μg/mL的羧苄青霉素的LB培养基进行培养后，使用QIAprep Spin Miniprep kit(QIAGEN制)得到表达载体pTrc-eFcRCys。
(4)对于pTrc-eFcRCys的核苷酸序列的解析，使用包含序列号104(5’-TGTGGTATGGCTGTGCAGG-3’)或序列号105(5’-TCGGCATGGGGTCAGGTG-3’)中记载的序列的寡核苷酸作为测序用引物，除此之外，利用与实施例1(5)同样的方法进行。
分别地，将由表达载体pTrc-eFcRCys所表达的多肽的氨基酸序列示于序列号106，将编码该多肽的多核苷酸的序列示于序列号107。需要说明的是，序列号107中，第1位的甲硫氨酸(Met)至第22位的丙氨酸(Ala)为止为第6位的脯氨酸置换为丝氨酸的PelB信号肽，第24位的甘氨酸(Gly)至第199位的谷氨酰胺(Gln)为止为Fc结合性蛋白质的氨基酸序列(相当于序列号1的第17位至第192位为止的区域)，第200位的甘氨酸(Gly)至第207位的甘氨酸(Gly)为止为半胱氨酸标签序列。
实施例41 FcRCys的制备
(1)将表达实施例40中制作的FcRCys的转化体接种至2L的挡板烧瓶中加入的包含100μg/mL的羧苄青霉素的400mL的2YT液体培养基(蛋白胨16g/L、酵母提取物10g/L、氯化钠5g/L)，在37℃下好氧地振荡培养一晩，从而进行预培养。
(2)向包含葡萄糖10g/L、酵母提取物20g/L、磷酸三钠十二水合物3g/L、磷酸氢二钠十二水合物9g/L、氯化铵1g/L和硫酸卡那霉素50mg/L的液体培养基1.8L中接种(1)的培养液180mL，使用3L发酵槽(Biott Corporation制)进行正式培养。设定为温度30℃、pH6.9～7.1、透气量1VVM、溶解氧浓度30％饱和浓度的条件，开始正式培养。pH的控制中，分别地，作为酸使用50％磷酸，作为碱使用14％氨水，溶解氧的控制通过改变搅拌速度来进行控制，搅拌转速设定为下限500rpm、上限1000rpm。培养开始后，在葡萄糖浓度无法测定的时刻，边通过溶解氧(DO)进行控制边加入流加培养基(葡萄糖248.9g/L、酵母提取物83.3g/L、硫酸镁七水合物7.2g/L)。
(3)作为菌体量的目标，600nm的吸光度(OD600nm)达到约150时，将培养温度降低至25℃，确认了达到设定温度后，以终浓度变为0.5mM的方式添加IPTG，接着在25℃下继续培养。
(4)从培养开始起约48小时后停止培养，将培养液在4℃下通过8000rpm、20分钟的离心分离回收菌体。
(5)将回收的菌体以变为5mL/1g(菌体)的方式悬浮于20mM的Tris盐酸缓冲液(pH7.0)，使用超声波发生装置(インソネーター201M(商品名)、久保田商事株式会社制)，在4℃下以约150W的输出功率将菌体破碎约10分钟。对于菌体破碎液，在4℃下进行20分钟、8000rpm的离心分离2次，回收上清。
(6)将(5)中得到的上清以流速5mL/分进样至预先用20mM的磷酸缓冲液(8mM磷酸二氢钠、12mM磷酸氢二钠)(pH7.0)平衡化了的填充有140mL的TOYOPEARL CM-650M(TOSOHCORPORATION制)的VL32×250柱(Merckmillipore制)。利用平衡化中使用的缓冲液进行洗涤后，用包含0.5M的氯化钠的20mM的磷酸缓冲液(pH7.0)进行洗脱。
(7)将(6)中得到的洗脱液进样至预先用包含150mM的氯化钠的20mM的Tris盐酸缓冲液(pH7.4)平衡化了的填充有IgG Sepharose(GE Healthcare制)90mL的XK26/20柱(GEHealthcare制)。利用平衡化中使用的缓冲液进行洗涤后，用0.1M的甘氨酸盐酸缓冲液(pH3.0)进行洗脱。需要说明的是，对于洗脱液，通过加入洗脱液量的1/4量的1MTris盐酸缓冲液(pH8.0)来将pH恢复至中性附近。
通过前述纯化，得到约12mg的高纯度的FcRCys。
实施例42 Fc结合性蛋白质(FcR)固定化凝胶的制作和抗体分离
(1)将2mL的分离剂用亲水性乙烯基聚合物(TOSOH CORPORATION制：TOYOPEARL)表面的羟基用碘代乙酰基活化后，使实施例41中制备的FcRCys 4mg反应，从而得到FcR固定化凝胶。
(2)将(1)中制作的FcR固定化凝胶0.5mL填充至φ4.6mm×75mm的不锈钢柱，制作FcR柱。
(3)将(2)中制作的FcR柱与高效液相色谱法装置(TOSOH CORPORATION制)连接，用20mM的乙酸缓冲液(pH4.5)进行平衡化。
(4)将用PBS(Phosphate Buffered Saline，磷酸缓冲生理盐水)(pH7.4)稀释至4.0mg/mL的单克隆抗体(Rituxan，全药工业株式会社制)以流速0.3mL/分钟进样0.15mL。
(5)保持流速0.3mL/分钟不变地，用平衡化缓冲液进行2分钟洗涤后，通过利用10mM的甘氨酸盐酸缓冲液(pH3.0)的pH梯度(在38分钟时10mM的甘氨酸盐酸缓冲液(pH3.0)变为100％的梯度)将吸附的单克隆抗体进行洗脱，
将结果(洗脱图谱)示于图11。单克隆抗体与FcR相互作用，因此被分离成多个峰而不是凝胶过滤色谱法那样的单一的峰。
实施例43用FcR固定化凝胶分离的抗体的抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性测定
(1)在实施例42中记载的洗脱条件下分离单克隆抗体，将图2中记载的洗脱图谱中的级分A(FrA)和级分B(FrB)的区域分级。
(2)边将分级了的FrA和FrB用超滤膜(Merckmillipore制)浓缩边将缓冲液交换为PBS(10mM磷酸氢二钠、1.76mM磷酸二氢钾、137mM氯化钠、2.7mM氯化钾)(pH7.4)。
(3)以280nm的吸光测定浓缩、缓冲液交换了的FrA和FrB中所含的抗体、以及分离前的单克隆抗体的浓度。
(4)利用以下所示的方法，测定FrA和FrB中所含的抗体以及分离前的单克隆抗体所具有的ADCC活性。
(4-1)使用将1.4mL的Low IgG Serum和33.6mL的RPMI1640培养基混合而制备的ADCC Assay Buffer，将FrA、FrB中所含的单克隆抗体以及分离前的单克隆抗体从3μg/mL按照1/3稀释制备8梯度的稀释系列。
(4-2)将Raji细胞用ADCC Assay Buffer制备成约5×105个细胞/mL，向96孔平板(3917：Corning Incorporated)中以25μL/孔加入。
(4-3)向加入了Raji细胞的孔以25μL/孔仅加入(2)中调整的FrA、FrB、分离前的单克隆抗体、空白的ADCC Assay Buffer。
(4-4)将Effector细胞(Promega Corporation)用ADCC Assay Buffer制备成约3.0×105个细胞/mL，向加入了Raji细胞和抗体的孔以25μL/孔加入。之后，在CO2培养箱(5％CO2、37℃)中静置6小时。
(4-5)将96孔平板在室温下从5分钟静置30分钟后，以75μL/孔加入LuciferaseAssay Reagent(Promega Corporation制)。在室温下使其反应30分钟后，用GloMax MultiDetection System(Promega Corporation)测定发光。
对在实施例42中记载的洗脱条件下分级了的FrA和FrB以及分离前的单克隆抗体的发光强度进行比较，将所得结果示于图12。需要说明的是，图12的结果表示从测定的发光强度中减去空白的发光强度而得到的值，发光强度越高，表示ADCC活性越高。
与分离前的单克隆抗体相比，FrA的发光强度降低，另一方面，FrB的发光强度提高至约1.4倍。即可知，FrB与分离前的单克隆抗体和FcA相比，ADCC活性高。另外，从FcR固定化凝胶的洗脱慢的(柱中保持的时间长)级分(FrB)中包含ADCC活性强的抗体，因此可知，FcR固定化凝胶基于ADCC活性的强度可以进行分离。
需要说明的是，将2014年6月27日申请的日本特愿2014-133181号、2014年7月17日申请的日本特愿2014-147206号、2014年7月17日申请的日本特愿2014-147207号、2014年12月25日申请的日本特愿2014-263407号、2015年3月10日申请的日本特愿2015-047462号以及2015年6月5日申请的日本特愿2015-115078号的说明书、序列表、权利要求，附图和摘要的全部内容引入至此，作为本发明的说明书的公开内容被引入。
序列表
<110> 东曹株式会社(TOSOH CORPORATION)
<120> 改良Fc结合性蛋白质、该蛋白质的制造方法、使用该蛋白质的抗体吸附剂和使用该吸附剂的抗体的分离方法
<130> 214-0065WO
<150> JP2014-133181
<151> 2014-06-27
<150> JP2014-147206
<151> 2014-07-17
<150> JP2014-147207
<151> 2014-07-17
<150> JP2014-263407
<151> 2014-12-25
<150> JP2015-047462
<151> 2015-03-10
<150> JP2015-115078
<151> 2015-06-05
<160> 107
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 254
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala
1 5 10 15
Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro
20 25 30
Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln
35 40 45
Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
50 55 60
Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr
65 70 75 80
Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu
85 90 95
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
100 105 110
Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
115 120 125
His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
130 135 140
Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro
145 150 155 160
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val
165 170 175
Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
180 185 190
Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln
195 200 205
Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly
210 215 220
Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp
225 230 235 240
Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys
245 250
<210> 2
<211> 528
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 多核苷酸编码 Fc γ IIIa (大肠埃希氏菌(E. coli) 密码子)
<400> 2
ggcatgcgta ccgaagatct gccgaaagcg gtggtgtttc tggaaccgca gtggtatcgc 60
gtgctggaga aagattctgt gacccttaaa tgccagggcg cgtatagccc ggaagataac 120
agcacccagt ggttccacaa tgaaagcctg atttccagcc aggcgagcag ctactttatt 180
gatgcggcga cggtggatga tagcggcgaa tatcgttgcc agaccaacct gagcaccctg 240
agcgatccgg tgcagctgga ggtgcacatc gggtggcttc tgttacaggc tccacggtgg 300
gtgttcaaag aggaggatcc gattcatctg cggtgtcact cctggaagaa taccgccctg 360
cataaagtga cctacctgca aaacggcaag ggccgcaagt atttccacca caactccgac 420
ttctatattc ccaaagcgac gctgaaggac agcggcagct atttctgccg tgggctggtg 480
ggcagcaaaa atgtgagcag cgagaccgtg aatattacca ttacccaa 528
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 3
ggcatgcgta ccgaagatct gccgaaagcg gtggtgtttc t 41
<210> 4
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 4
tctccagcac gcgataccac tgcggttcca gaaacaccac cgctttcg 48
<210> 5
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 5
ggtatcgcgt gctggagaaa gattctgtga cccttaaatg ccagggcg 48
<210> 6
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 6
actgggtgct gttatcttcc gggctatacg cgccctggca tttaaggg 48
<210> 7
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 7
ggaagataac agcacccagt ggttccacaa tgaaagcctg atttccag 48
<210> 8
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 8
catcaataaa gtagctgctc gcctggctgg aaatcaggct ttcattgt 48
<210> 9
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 9
gcgagcagct actttattga tgcggcgacg gtggatgata gcggcgaa 48
<210> 10
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 10
cagggtgctc aggttggtct ggcaacgata ttcgccgcta tcatccac 48
<210> 11
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 11
accaacctga gcaccctgag cgatccggtg cagctggagg tgcacatc 48
<210> 12
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 12
ccaccgtgga gcctgtaaca gaagccaccc gatgtgcacc tccagctg 48
<210> 13
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 13
tacaggctcc acggtgggtg ttcaaagagg aggatccgat tcatctgc 48
<210> 14
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 14
agggcggtat tcttccagga gtgacaccgc agatgaatcg gatcctcc 48
<210> 15
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 15
cctggaagaa taccgccctg cataaagtga cctacctgca aaacggca 48
<210> 16
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 16
cggagttgtg gtggaaatac ttgcggccct tgccgttttg caggtagg 48
<210> 17
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 17
agtatttcca ccacaactcc gacttctata ttcccaaagc gacgctga 48
<210> 18
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 18
agcccacggc agaaatagct gccgctgtcc ttcagcgtcg ctttggga 48
<210> 19
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 19
ctatttctgc cgtgggctgg tgggcagcaa aaatgtgagc agcgagac 48
<210> 20
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 20
ttgggtaatg gtaatattca cggtctcgct gctcacattt ttg 43
<210> 21
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 21
tagccatggg catgcgtacc gaagatctgc cgaaagc 37
<210> 22
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 22
cccaagctta atgatgatga tgatgatggc ccccttgggt aatggtaata ttcacggtct 60
cgctgc 66
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 23
taatacgact cactataggg 20
<210> 24
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 24
tatgctagtt attgctcag 19
<210> 25
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pET-CD16
<400> 25
Met Lys Ile Lys Thr Gly Ala Arg Ile Leu Ala Leu Ser Ala Leu Thr
1 5 10 15
Thr Met Met Phe Ser Ala Ser Ala Leu Ala Lys Ile Glu Glu Ala Met
20 25 30
Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro
35 40 45
Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln
50 55 60
Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
65 70 75 80
Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr
85 90 95
Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu
100 105 110
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
115 120 125
Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
130 135 140
His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
145 150 155 160
Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro
165 170 175
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val
180 185 190
Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
195 200 205
Gly Gly His His His His His His
210 215
<210> 26
<211> 648
<212> DNA
<213> pET-CD16
<400> 26
atgaaaataa aaacaggtgc acgcatcctc gcattatccg cattaacgac gatgatgttt 60
tccgcctcgg ctctcgccaa aatcgaagaa gccatgggca tgcgtaccga agatctgccg 120
aaagcggtgg tgtttctgga accgcagtgg tatcgcgtgc tggagaaaga ttctgtgacc 180
cttaaatgcc agggcgcgta tagcccggaa gataacagca cccagtggtt ccacaatgaa 240
agcctgattt ccagccaggc gagcagctac tttattgatg cggcgacggt ggatgatagc 300
ggcgaatatc gttgccagac caacctgagc accctgagcg atccggtgca gctggaggtg 360
cacatcgggt ggcttctgtt acaggctcca cggtgggtgt tcaaagagga ggatccgatt 420
catctgcggt gtcactcctg gaagaatacc gccctgcata aagtgaccta cctgcaaaac 480
ggcaagggcc gcaagtattt ccaccacaac tccgacttct atattcccaa agcgacgctg 540
aaggacagcg gcagctattt ctgccgtggg ctggtgggca gcaaaaatgt gagcagcgag 600
accgtgaata ttaccattac ccaagggggc catcatcatc atcatcat 648
<210> 27
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FcR2
<400> 27
Met Lys Ile Lys Thr Gly Ala Arg Ile Leu Ala Leu Ser Ala Leu Thr
1 5 10 15
Thr Met Met Phe Ser Ala Ser Ala Leu Ala Lys Ile Glu Glu Ala Met
20 25 30
Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Glu Val Phe Leu Glu Pro
35 40 45
Gln Trp Asn Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln
50 55 60
Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
65 70 75 80
Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr
85 90 95
Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu
100 105 110
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
115 120 125
Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
130 135 140
His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
145 150 155 160
Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro
165 170 175
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val
180 185 190
Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
195 200 205
Gly Gly His His His His His His
210 215
<210> 28
<211> 648
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 多核苷酸编码 FcR2
<400> 28
atgaaaataa aaacaggtgc acgcatcctc gcattatccg cattaacgac gatgatgttt 60
tccgcctcgg ctctcgccaa aatcgaagaa gccatgggca tgcgtaccga agatctgccg 120
aaagcggagg tgtttctgga accgcagtgg aatcgcgtgc tggagaaaga ttctgtgacc 180
cttaaatgcc agggcgcgta tagcccggaa gataacagca cccagtggtt ccacaatgaa 240
agcctgattt ccagccaggc gagcagctac tttattgatg cggcgacggt ggatgatagc 300
ggcgaatatc gttgccagac caacctgagc accctgagcg atccggtgca gctggaggtg 360
cacatcgggt ggcttctgtt acaggctcca cggtgggtgt tcaaagagga ggatccgatt 420
catctgcggt gtcactcctg gaagaatacc gccctgcata aagtgaccta cctgcaaaac 480
ggcaagggcc gcaagtattt ccaccataac tccgacttct atattcccaa agcgacgctg 540
aaggacagcg gcagctattt ctgccgtggg ctggtgggca gcaaaaatgt gagcagcgag 600
accgtgaata ttaccattac ccaagggggc catcatcatc atcatcat 648
<210> 29
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 29
agccaggcga gcagctacct tattgatgcg 30
<210> 30
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 30
ccaccgtcgc cgcatcaata aggtagctgc 30
<210> 31
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FcR3
<400> 31
Met Lys Ile Lys Thr Gly Ala Arg Ile Leu Ala Leu Ser Ala Leu Thr
1 5 10 15
Thr Met Met Phe Ser Ala Ser Ala Leu Ala Lys Ile Glu Glu Ala Met
20 25 30
Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Glu Val Phe Leu Glu Pro
35 40 45
Gln Trp Asn Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln
50 55 60
Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
65 70 75 80
Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Leu Ile Asp Ala Ala Thr
85 90 95
Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu
100 105 110
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
115 120 125
Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
130 135 140
His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
145 150 155 160
Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro
165 170 175
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val
180 185 190
Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
195 200 205
Gly Gly His His His His His His
210 215
<210> 32
<211> 648
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 多核苷酸编码 FcR3
<400> 32
atgaaaataa aaacaggtgc acgcatcctc gcattatccg cattaacgac gatgatgttt 60
tccgcctcgg ctctcgccaa aatcgaagaa gccatgggca tgcgtaccga agatctgccg 120
aaagcggagg tgtttctgga accgcagtgg aatcgcgtgc tggagaaaga ttctgtgacc 180
cttaaatgcc agggcgcgta tagcccggaa gataacagca cccagtggtt ccacaatgaa 240
agcctgattt ccagccaggc gagcagctac cttattgatg cggcgacggt ggatgatagc 300
ggcgaatatc gttgccagac caacctgagc accctgagcg atccggtgca gctggaggtg 360
cacatcgggt ggcttctgtt acaggctcca cggtgggtgt tcaaagagga ggatccgatt 420
catctgcggt gtcactcctg gaagaatacc gccctgcata aagtgaccta cctgcaaaac 480
ggcaagggcc gcaagtattt ccaccataac tccgacttct atattcccaa agcgacgctg 540
aaggacagcg gcagctattt ctgccgtggg ctggtgggca gcaaaaatgt gagcagcgag 600
accgtgaata ttaccattac ccaagggggc catcatcatc atcatcat 648
<210> 33
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FcR4
<400> 33
Met Lys Ile Lys Thr Gly Ala Arg Ile Leu Ala Leu Ser Ala Leu Thr
1 5 10 15
Thr Met Met Phe Ser Ala Ser Ala Leu Ala Lys Ile Glu Glu Ala Met
20 25 30
Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Glu Val Phe Leu Glu Pro
35 40 45
Gln Trp Asn Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln
50 55 60
Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
65 70 75 80
Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Leu Ile Asp Ala Ala Thr
85 90 95
Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu
100 105 110
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
115 120 125
Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Gly Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
130 135 140
His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
145 150 155 160
Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro
165 170 175
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val
180 185 190
Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
195 200 205
Gly Gly His His His His His His
210 215
<210> 34
<211> 648
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 多核苷酸编码 FcR4
<400> 34
atgaaaataa aaacaggtgc acgcatcctc gcattatccg cattaacgac gatgatgttt 60
tccgcctcgg ctctcgccaa aatcgaagaa gccatgggca tgcgtaccga agatctgccg 120
aaagcggagg tgtttctgga accgcagtgg aatcgcgtgc tggagaaaga ttctgtgacc 180
cttaaatgcc agggcgcgta tagcccggaa gataacagca cccagtggtt ccacaatgaa 240
agcctgattt ccagccaggc gagcagctac cttattgatg cggcgacggt ggatgatagc 300
ggcgaatatc gttgccagac caacctgagc accctgagcg atccggtgca gctggaggtg 360
cacatcgggt ggcttctgtt acaggctcca cggtgggtgt tcaaagaggg ggatccgatt 420
catctgcggt gtcactcctg gaagaatacc gccctgcata aagtgaccta cctgcaaaac 480
ggcaagggcc gcaagtattt ccaccacaac tccgacttct atattcccaa agcgacgctg 540
aaggacagcg gcagctattt ctgccgtggg ctggtgggca gcaaaaatgt gagcagcgag 600
accgtgaata ttaccattac ccaagggggc catcatcatc atcatcat 648
<210> 35
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 35
gaatatcgtt gccagaccag cctgagcacc 30
<210> 36
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 36
gatcgctcag ggtgctcagg ctggtctggc 30
<210> 37
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FcR5a
<400> 37
Met Lys Ile Lys Thr Gly Ala Arg Ile Leu Ala Leu Ser Ala Leu Thr
1 5 10 15
Thr Met Met Phe Ser Ala Ser Ala Leu Ala Lys Ile Glu Glu Ala Met
20 25 30
Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Glu Val Phe Leu Glu Pro
35 40 45
Gln Trp Asn Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln
50 55 60
Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
65 70 75 80
Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Leu Ile Asp Ala Ala Thr
85 90 95
Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Ser Leu Ser Thr Leu
100 105 110
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
115 120 125
Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Gly Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
130 135 140
His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
145 150 155 160
Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro
165 170 175
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val
180 185 190
Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
195 200 205
Gly Gly His His His His His His
210 215
<210> 38
<211> 648
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 多核苷酸编码 FcR5a
<400> 38
atgaaaataa aaacaggtgc acgcatcctc gcattatccg cattaacgac gatgatgttt 60
tccgcctcgg ctctcgccaa aatcgaagaa gccatgggca tgcgtaccga agatctgccg 120
aaagcggagg tgtttctgga accgcagtgg aatcgcgtgc tggagaaaga ttctgtgacc 180
cttaaatgcc agggcgcgta tagcccggaa gataacagca cccagtggtt ccacaatgaa 240
agcctgattt ccagccaggc gagcagctac cttattgatg cggcgacggt ggatgatagc 300
ggcgaatatc gttgccagac cagcctgagc accctgagcg atccggtgca gctggaggtg 360
cacatcgggt ggcttctgtt acaggctcca cggtgggtgt tcaaagaggg ggatccgatt 420
catctgcggt gtcactcctg gaagaatacc gccctgcata aagtgaccta cctgcaaaac 480
ggcaagggcc gcaagtattt ccaccacaac tccgacttct atattcccaa agcgacgctg 540
aaggacagcg gcagctattt ctgccgtggg ctggtgggca gcaaaaatgt gagcagcgag 600
accgtgaata ttaccattac ccaagggggc catcatcatc atcatcat 648
<210> 39
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FcR7a
<400> 39
Met Lys Ile Lys Thr Gly Ala Arg Ile Leu Ala Leu Ser Ala Leu Thr
1 5 10 15
Thr Met Met Phe Ser Ala Ser Ala Leu Ala Lys Ile Glu Glu Ala Met
20 25 30
Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Glu Val Ile Leu Glu Pro
35 40 45
Gln Trp Asn Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln
50 55 60
Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
65 70 75 80
Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Leu Ile Asp Ala Ala Thr
85 90 95
Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Ser Leu Ser Thr Leu
100 105 110
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
115 120 125
Ala Pro Arg Trp Glu Phe Lys Glu Gly Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
130 135 140
His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
145 150 155 160
Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro
165 170 175
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val
180 185 190
Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
195 200 205
Gly Gly His His His His His His
210 215
<210> 40
<211> 648
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 多核苷酸编码 FcR7a
<400> 40
atgaaaataa aaacaggtgc acgcatcctc gcattatccg cattaacgac gatgatgttt 60
tccgcctcgg ctctcgccaa aatcgaagaa gccatgggca tgcgtaccga agatctgccg 120
aaagcggagg tgattctgga accgcagtgg aatcgcgtgc tggagaaaga ttctgtgacc 180
cttaaatgcc agggcgcgta tagcccggaa gataacagca cccagtggtt ccacaatgaa 240
agcctgattt ccagccaggc gagcagctac cttattgatg cggcgacggt ggatgatagc 300
ggcgaatatc gttgccagac cagcctgagc accctgagcg atccggtgca gctggaggtg 360
cacatcgggt ggcttctgtt acaggctcca cggtgggagt tcaaagaggg ggatccgatt 420
catctgcggt gtcactcctg gaagaatacc gccctgcata aagtgaccta cctgcaaaac 480
ggcaagggcc gcaagtattt ccaccacaac tccgacttct atattcccaa agcgacgctg 540
aaggacagcg gcagctattt ctgccgtggg ctggtgggca gcaaaaatgt gagcagcgag 600
accgtgaata ttaccattac ccaagggggc catcatcatc atcatcat 648
<210> 41
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 41
accagcccac ggcaggaata gctgccgctg 30
<210> 42
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 42
gacagcggca gctattcctg ccgtgggctg 30
<210> 43
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FcR8
<400> 43
Met Lys Ile Lys Thr Gly Ala Arg Ile Leu Ala Leu Ser Ala Leu Thr
1 5 10 15
Thr Met Met Phe Ser Ala Ser Ala Leu Ala Lys Ile Glu Glu Ala Met
20 25 30
Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Glu Val Ile Leu Glu Pro
35 40 45
Gln Trp Asn Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln
50 55 60
Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
65 70 75 80
Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Leu Ile Asp Ala Ala Thr
85 90 95
Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Ser Leu Ser Thr Leu
100 105 110
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
115 120 125
Ala Pro Arg Trp Glu Phe Lys Glu Gly Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
130 135 140
His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
145 150 155 160
Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro
165 170 175
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Ser Cys Arg Gly Leu Val
180 185 190
Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
195 200 205
Gly Gly His His His His His His
210 215
<210> 44
<211> 648
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 多核苷酸编码 FcR8
<400> 44
atgaaaataa aaacaggtgc acgcatcctc gcattatccg cattaacgac gatgatgttt 60
tccgcctcgg ctctcgccaa aatcgaagaa gccatgggca tgcgtaccga agatctgccg 120
aaagcggagg tgattctgga accgcagtgg aatcgcgtgc tggagaaaga ttctgtgacc 180
cttaaatgcc agggcgcgta tagcccggaa gataacagca cccagtggtt ccacaatgaa 240
agcctgattt ccagccaggc gagcagctac cttattgatg cggcgacggt ggatgatagc 300
ggcgaatatc gttgccagac cagcctgagc accctgagcg atccggtgca gctggaggtg 360
cacatcgggt ggcttctgtt acaggctcca cggtgggagt tcaaagaggg ggatccgatt 420
catctgcggt gtcactcctg gaagaatacc gccctgcata aagtgaccta cctgcaaaac 480
ggcaagggcc gcaagtattt ccaccacaac tccgacttct atattcccaa agcgacgctg 540
aaggacagcg gcagctattc ctgccgtggg ctggtgggca gcaaaaatgt gagcagcgag 600
accgtgaata ttaccattac ccaagggggc catcatcatc atcatcat 648
<210> 45
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 45
gtgaccctta aatgccgggg cgcgtatagc 30
<210> 46
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 46
ccgggctata cgcgccccgg catttaaggg 30
<210> 47
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FcR9
<400> 47
Met Lys Ile Lys Thr Gly Ala Arg Ile Leu Ala Leu Ser Ala Leu Thr
1 5 10 15
Thr Met Met Phe Ser Ala Ser Ala Leu Ala Lys Ile Glu Glu Ala Met
20 25 30
Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Glu Val Ile Leu Glu Pro
35 40 45
Gln Trp Asn Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Arg
50 55 60
Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
65 70 75 80
Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Leu Ile Asp Ala Ala Thr
85 90 95
Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Ser Leu Ser Thr Leu
100 105 110
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
115 120 125
Ala Pro Arg Trp Glu Phe Lys Glu Gly Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
130 135 140
His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
145 150 155 160
Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro
165 170 175
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Ser Cys Arg Gly Leu Val
180 185 190
Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
195 200 205
Gly Gly His His His His His His
210 215
<210> 48
<211> 648
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 多核苷酸编码 FcR9
<400> 48
atgaaaataa aaacaggtgc acgcatcctc gcattatccg cattaacgac gatgatgttt 60
tccgcctcgg ctctcgccaa aatcgaagaa gccatgggca tgcgtaccga agatctgccg 120
aaagcggagg tgattctgga accgcagtgg aatcgcgtgc tggagaaaga ttctgtgacc 180
cttaaatgcc ggggcgcgta tagcccggaa gataacagca cccagtggtt ccacaatgaa 240
agcctgattt ccagccaggc gagcagctac cttattgatg cggcgacggt ggatgatagc 300
ggcgaatatc gttgccagac cagcctgagc accctgagcg atccggtgca gctggaggtg 360
cacatcgggt ggcttctgtt acaggctcca cggtgggagt tcaaagaggg ggatccgatt 420
catctgcggt gtcactcctg gaagaatacc gccctgcata aagtgaccta cctgcaaaac 480
ggcaagggcc gcaagtattt ccaccacaac tccgacttct atattcccaa agcgacgctg 540
aaggacagcg gcagctattc ctgccgtggg ctggtgggca gcaaaaatgt gagcagcgag 600
accgtgaata ttaccattac ccaagggggc catcatcatc atcatcat 648
<210> 49
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 49
tgccggggcg cgtctagccc ggaagataac 30
<210> 50
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 50
gctagacgcg ccccggcatt taagggtcac 30
<210> 51
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FcR10
<400> 51
Met Lys Ile Lys Thr Gly Ala Arg Ile Leu Ala Leu Ser Ala Leu Thr
1 5 10 15
Thr Met Met Phe Ser Ala Ser Ala Leu Ala Lys Ile Glu Glu Ala Met
20 25 30
Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Glu Val Ile Leu Glu Pro
35 40 45
Gln Trp Asn Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Arg
50 55 60
Gly Ala Ser Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
65 70 75 80
Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Leu Ile Asp Ala Ala Thr
85 90 95
Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Ser Leu Ser Thr Leu
100 105 110
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
115 120 125
Ala Pro Arg Trp Glu Phe Lys Glu Gly Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
130 135 140
His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
145 150 155 160
Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro
165 170 175
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Ser Cys Arg Gly Leu Val
180 185 190
Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
195 200 205
Gly Gly His His His His His His
210 215
<210> 52
<211> 648
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 多核苷酸编码 FcR10
<400> 52
atgaaaataa aaacaggtgc acgcatcctc gcattatccg cattaacgac gatgatgttt 60
tccgcctcgg ctctcgccaa aatcgaagaa gccatgggca tgcgtaccga agatctgccg 120
aaagcggagg tgattctgga accgcagtgg aatcgcgtgc tggagaaaga ttctgtgacc 180
cttaaatgcc ggggcgcgtc tagcccggaa gataacagca cccagtggtt ccacaatgaa 240
agcctgattt ccagccaggc gagcagctac cttattgatg cggcgacggt ggatgatagc 300
ggcgaatatc gttgccagac cagcctgagc accctgagcg atccggtgca gctggaggtg 360
cacatcgggt ggcttctgtt acaggctcca cggtgggagt tcaaagaggg ggatccgatt 420
catctgcggt gtcactcctg gaagaatacc gccctgcata aagtgaccta cctgcaaaac 480
ggcaagggcc gcaagtattt ccaccacaac tccgacttct atattcccaa agcgacgctg 540
aaggacagcg gcagctattc ctgccgtggg ctggtgggca gcaaaaatgt gagcagcgag 600
accgtgaata taaccattac ccaagggggc catcatcatc atcatcat 648
<210> 53
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 53
ggcgaatatc gttgccggac cagcctgagc 30
<210> 54
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 54
ggtgctcagg ctggtccggc aacgatattc 30
<210> 55
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FcR11
<400> 55
Met Lys Ile Lys Thr Gly Ala Arg Ile Leu Ala Leu Ser Ala Leu Thr
1 5 10 15
Thr Met Met Phe Ser Ala Ser Ala Leu Ala Lys Ile Glu Glu Ala Met
20 25 30
Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Glu Val Ile Leu Glu Pro
35 40 45
Gln Trp Asn Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Arg
50 55 60
Gly Ala Ser Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
65 70 75 80
Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Leu Ile Asp Ala Ala Thr
85 90 95
Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Arg Thr Ser Leu Ser Thr Leu
100 105 110
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
115 120 125
Ala Pro Arg Trp Glu Phe Lys Glu Gly Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
130 135 140
His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
145 150 155 160
Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro
165 170 175
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Ser Cys Arg Gly Leu Val
180 185 190
Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
195 200 205
Gly Gly His His His His His His
210 215
<210> 56
<211> 648
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 多核苷酸编码 FcR11
<400> 56
atgaaaataa aaacaggtgc acgcatcctc gcattatccg cattaacgac gatgatgttt 60
tccgcctcgg ctctcgccaa aatcgaagaa gccatgggca tgcgtaccga agatctgccg 120
aaagcggagg tgattctgga accgcagtgg aatcgcgtgc tggagaaaga ttctgtgacc 180
cttaaatgcc ggggcgcgtc tagcccggaa gataacagca cccagtggtt ccacaatgaa 240
agcctgattt ccagccaggc gagcagctac cttattgatg cggcgacggt ggatgatagc 300
ggcgaatatc gttgccggac cagcctgagc accctgagcg atccggtgca gctggaggtg 360
cacatcgggt ggcttctgtt acaggctcca cggtgggagt tcaaagaggg ggatccgatt 420
catctgcggt gtcactcctg gaagaatacc gccctgcata aagtgaccta cctgcaaaac 480
ggcaagggcc gcaagtattt ccaccacaac tccgacttct atattcccaa agcgacgctg 540
aaggacagcg gcagctattc ctgccgtggg ctggtgggca gcaaaaatgt gagcagcgag 600
accgtgaata ttaccattac ccaagggggc catcatcatc atcatcat 648
<210> 57
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 57
cccaagctta tccgcaggta tcgttgcggc acccttgggt aatggtaata ttcacggtct 60
cgctgc 66
<210> 58
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FcR5aCys
<400> 58
Met Lys Ile Lys Thr Gly Ala Arg Ile Leu Ala Leu Ser Ala Leu Thr
1 5 10 15
Thr Met Met Phe Ser Ala Ser Ala Leu Ala Lys Ile Glu Glu Ala Met
20 25 30
Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Glu Val Phe Leu Glu Pro
35 40 45
Gln Trp Asn Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln
50 55 60
Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
65 70 75 80
Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Leu Ile Asp Ala Ala Thr
85 90 95
Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Ser Leu Ser Thr Leu
100 105 110
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
115 120 125
Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Gly Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
130 135 140
His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
145 150 155 160
Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro
165 170 175
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val
180 185 190
Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
195 200 205
Gly Cys Arg Asn Asp Thr Cys Gly
210 215
<210> 59
<211> 648
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 多核苷酸编码 FcR5aCys
<400> 59
atgaaaataa aaacaggtgc acgcatcctc gcattatccg cattaacgac gatgatgttt 60
tccgcctcgg ctctcgccaa aatcgaagaa gccatgggca tgcgtaccga agatctgccg 120
aaagcggagg tgtttctgga accgcagtgg aatcgcgtgc tggagaaaga ttctgtgacc 180
cttaaatgcc agggcgcgta tagcccggaa gataacagca cccagtggtt ccacaatgaa 240
agcctgattt ccagccaggc gagcagctac cttattgatg cggcgacggt ggatgatagc 300
ggcgaatatc gttgccagac cagcctgagc accctgagcg atccggtgca gctggaggtg 360
cacatcgggt ggcttctgtt acaggctcca cggtgggtgt tcaaagaggg ggatccgatt 420
catctgcggt gtcactcctg gaagaatacc gccctgcata aagtgaccta cctgcaaaac 480
ggcaagggcc gcaagtattt ccaccacaac tccgacttct atattcccaa agcgacgctg 540
aaggacagcg gcagctattt ctgccgtggg ctggtgggca gcaaaaatgt gagcagcgag 600
accgtgaata ttaccattac ccaagggtgc cgcaacgata cctgcgga 648
<210> 60
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FcR9Cys
<400> 60
Met Lys Ile Lys Thr Gly Ala Arg Ile Leu Ala Leu Ser Ala Leu Thr
1 5 10 15
Thr Met Met Phe Ser Ala Ser Ala Leu Ala Lys Ile Glu Glu Ala Met
20 25 30
Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Glu Val Ile Leu Glu Pro
35 40 45
Gln Trp Asn Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Arg
50 55 60
Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
65 70 75 80
Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Leu Ile Asp Ala Ala Thr
85 90 95
Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Ser Leu Ser Thr Leu
100 105 110
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
115 120 125
Ala Pro Arg Trp Glu Phe Lys Glu Gly Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
130 135 140
His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
145 150 155 160
Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro
165 170 175
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Ser Cys Arg Gly Leu Val
180 185 190
Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
195 200 205
Gly Cys Arg Asn Asp Thr Cys Gly
210 215
<210> 61
<211> 648
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 多核苷酸编码 FcR9Cys
<400> 61
atgaaaataa aaacaggtgc acgcatcctc gcattatccg cattaacgac gatgatgttt 60
tccgcctcgg ctctcgccaa aatcgaagaa gccatgggca tgcgtaccga agatctgccg 120
aaagcggagg tgattctgga accgcagtgg aatcgcgtgc tggagaaaga ttctgtgacc 180
cttaaatgcc ggggcgcgta tagcccggaa gataacagca cccagtggtt ccacaatgaa 240
agcctgattt ccagccaggc gagcagctac cttattgatg cggcgacggt ggatgatagc 300
ggcgaatatc gttgccagac cagcctgagc accctgagcg atccggtgca gctggaggtg 360
cacatcgggt ggcttctgtt acaggctcca cggtgggagt tcaaagaggg ggatccgatt 420
catctgcggt gtcactcctg gaagaatacc gccctgcata aagtgaccta cctgcaaaac 480
ggcaagggcc gcaagtattt ccaccacaac tccgacttct atattcccaa agcgacgctg 540
aaggacagcg gcagctattc ctgccgtggg ctggtgggca gcaaaaatgt gagcagcgag 600
accgtgaata ttaccattac ccaagggtgc cgcaacgata cctgcgga 648
<210> 62
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 62
ctagccatgg gcatgcgtac cggagatatg ccgaaagcgg ag 42
<210> 63
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FcR12
<400> 63
Met Lys Ile Lys Thr Gly Ala Arg Ile Leu Ala Leu Ser Ala Leu Thr
1 5 10 15
Thr Met Met Phe Ser Ala Ser Ala Leu Ala Lys Ile Glu Glu Ala Met
20 25 30
Gly Met Arg Thr Gly Asp Met Pro Lys Ala Glu Val Ile Leu Glu Pro
35 40 45
Pro Trp Asn Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Arg
50 55 60
Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
65 70 75 80
Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Leu Ile Asp Ala Ala Thr
85 90 95
Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Ser Leu Ser Thr Leu
100 105 110
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
115 120 125
Ala Pro Arg Trp Glu Phe Lys Glu Gly Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
130 135 140
His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
145 150 155 160
Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro
165 170 175
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Ser Cys Arg Gly Leu Val
180 185 190
Gly Arg Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
195 200 205
Gly Gly His His His His His His
210 215
<210> 64
<211> 648
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 多核苷酸编码 FcR12
<400> 64
atgaaaataa aaacaggtgc acgcatcctc gcattatccg cattaacgac gatgatgttt 60
tccgcctcgg ctctcgccaa aatcgaagaa gccatgggca tgcgtaccgg agatatgccg 120
aaagcggagg tgattctgga accgccgtgg aatcgcgtgc tggagaaaga ttcagtgacc 180
cttaaatgcc ggggcgcgta tagcccggaa gataacagca cccagtggtt ccacaatgaa 240
agcctgattt ccagccaggc gagcagctac cttattgatg cggcgacggt ggatgatagc 300
ggcgaatatc gttgccagac cagcctgagc accctgagcg atccggtgca gctggaggtg 360
cacatcgggt ggcttctgtt acaggctcca cggtgggagt tcaaagaggg ggatccgatt 420
catctgcggt gtcactcctg gaagaatacc gccctgcata aagtgaccta cctgcaaaac 480
ggcaagggcc gcaagtattt ccaccacaac tccgacttct atattcccaa agcgacgctg 540
aaggacagcg gcagctattc ctgccgtggg ctggtgggca gaaaaaatgt gagcagcgag 600
accgtgaata ttaccattac ccaagggggc catcatcatc atcatcat 648
<210> 65
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 65
cacaatgaaa gcctgattcc cagccaggcg 30
<210> 66
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 66
gtagctgctc gcctggctgg gaatcaggct 30
<210> 67
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FcR13
<400> 67
Met Lys Ile Lys Thr Gly Ala Arg Ile Leu Ala Leu Ser Ala Leu Thr
1 5 10 15
Thr Met Met Phe Ser Ala Ser Ala Leu Ala Lys Ile Glu Glu Ala Met
20 25 30
Gly Met Arg Thr Gly Asp Met Pro Lys Ala Glu Val Ile Leu Glu Pro
35 40 45
Pro Trp Asn Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Arg
50 55 60
Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
65 70 75 80
Ser Leu Ile Pro Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Leu Ile Asp Ala Ala Thr
85 90 95
Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Ser Leu Ser Thr Leu
100 105 110
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
115 120 125
Ala Pro Arg Trp Glu Phe Lys Glu Gly Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
130 135 140
His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
145 150 155 160
Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro
165 170 175
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Ser Cys Arg Gly Leu Val
180 185 190
Gly Arg Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
195 200 205
Gly Gly His His His His His His
210 215
<210> 68
<211> 648
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 多核苷酸编码 FcR13
<400> 68
atgaaaataa aaacaggtgc acgcatcctc gcattatccg cattaacgac gatgatgttt 60
tccgcctcgg ctctcgccaa aatcgaagaa gccatgggca tgcgtaccgg agatatgccg 120
aaagcggagg tgattctgga accgccgtgg aatcgcgtgc tggagaaaga ttcagtgacc 180
cttaaatgcc ggggcgcgta tagcccggaa gataacagca cccagtggtt ccacaatgaa 240
agcctgattc ccagccaggc gagcagctac cttattgatg cggcgacggt ggatgatagc 300
ggcgaatatc gttgccagac cagcctgagc accctgagcg atccggtgca gctggaggtg 360
cacatcgggt ggcttctgtt acaggctcca cggtgggagt tcaaagaggg ggatccgatt 420
catctgcggt gtcactcctg gaagaatacc gccctgcata aagtgaccta cctgcaaaac 480
ggcaagggcc gcaagtattt ccaccacaac tccgacttct atattcccaa agcgacgctg 540
aaggacagcg gcagctattc ctgccgtggg ctggtgggca gaaaaaatgt gagcagcgag 600
accgtgaata ttaccattac ccaagggggc catcatcatc atcatcat 648
<210> 69
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FcR14
<400> 69
Met Lys Ile Lys Thr Gly Ala Arg Ile Leu Ala Leu Ser Ala Leu Thr
1 5 10 15
Thr Met Met Phe Ser Ala Ser Ala Leu Ala Lys Ile Glu Glu Ala Met
20 25 30
Gly Met Arg Thr Gly Asp Met Pro Lys Ala Glu Val Ile Leu Glu Pro
35 40 45
Pro Trp Asn Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Arg
50 55 60
Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
65 70 75 80
Ser Leu Ile Pro Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Leu Ile Asp Ala Ala Thr
85 90 95
Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Ser Leu Ser Thr Leu
100 105 110
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
115 120 125
Ala Pro Arg Trp Glu Phe Lys Glu Gly Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
130 135 140
His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
145 150 155 160
Gly Lys Val Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro
165 170 175
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Ser Cys Arg Gly Leu Val
180 185 190
Gly Arg Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
195 200 205
Gly Gly His His His His His His
210 215
<210> 70
<211> 648
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 多核苷酸编码 FcR14
<400> 70
atgaaaataa aaacaggtgc acgcatcctc gcattatccg cattaacgac gatgatgttt 60
tccgcctcgg ctctcgccaa aatcgaagaa gccatgggca tgcgtaccgg agatatgccg 120
aaagcggagg tgattctgga accgccgtgg aatcgcgtgc tggagaaaga ttcagtgacc 180
cttaaatgcc ggggcgcgta tagcccggaa gataacagca cccagtggtt ccacaatgaa 240
agcctgattc ccagccaggc gagcagctac cttattgatg cggcgacggt ggatgatagc 300
ggcgaatatc gttgccagac cagcctgagc accctgagcg atccggtgca gctggaggtg 360
cacatcgggt ggcttctgtt acaggctcca cggtgggagt tcaaagaggg ggatccgatt 420
catctgcggt gtcactcctg gaagaatacc gccctgcata aagtgaccta cctgcaaaac 480
ggcaaggtcc gcaagtattt ccaccacaac tccgacttct atattcccaa agcgacgctg 540
aaggacagcg gcagctattc ctgccgtggg ctggtgggca gaaaaaatgt gagcagcgag 600
accgtgaata ttaccattac ccaagggggc catcatcatc atcatcat 648
<210> 71
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 71
tgccggggcg cgcatagccc ggatgataac 30
<210> 72
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 72
ggtgctgtta tcatccgggc tatgcgcgcc 30
<210> 73
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FcR16
<400> 73
Met Lys Ile Lys Thr Gly Ala Arg Ile Leu Ala Leu Ser Ala Leu Thr
1 5 10 15
Thr Met Met Phe Ser Ala Ser Ala Leu Ala Lys Ile Glu Glu Ala Met
20 25 30
Gly Met Arg Thr Gly Asp Met Pro Lys Ala Glu Val Ile Leu Glu Pro
35 40 45
Pro Trp Asn Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Arg
50 55 60
Gly Ala His Ser Pro Asp Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
65 70 75 80
Ser Leu Ile Pro Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Leu Ile Asp Ala Ala Thr
85 90 95
Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Ser Leu Ser Thr Leu
100 105 110
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
115 120 125
Ala Pro Arg Trp Glu Phe Lys Glu Gly Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
130 135 140
His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
145 150 155 160
Gly Lys Val Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro
165 170 175
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Ser Cys Arg Gly Leu Val
180 185 190
Gly Arg Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
195 200 205
Gly Gly His His His His His His
210 215
<210> 74
<211> 648
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 多核苷酸编码 FcR16
<400> 74
atgaaaataa aaacaggtgc acgcatcctc gcattatccg cattaacgac gatgatgttt 60
tccgcctcgg ctctcgccaa aatcgaagaa gccatgggca tgcgtaccgg agatatgccg 120
aaagcggagg tgattctgga accgccgtgg aatcgcgtgc tggagaaaga ttcagtgacc 180
cttaaatgcc ggggcgcgca tagcccggat gataacagca cccagtggtt ccacaatgaa 240
agcctgattc ccagccaggc gagcagctac cttattgatg cggcgacggt ggatgatagc 300
ggcgaatatc gttgccagac cagcctgagc accctgagcg atccggtgca gctggaggtg 360
cacatcgggt ggcttctgtt acaggctcca cggtgggagt tcaaagaggg ggatccgatt 420
catctgcggt gtcactcctg gaagaatacc gccctgcata aagtgaccta cctgcaaaac 480
ggcaaggtcc gcaagtattt ccaccacaac tccgacttct atattcccaa agcgacgctg 540
aaggacagcg gcagctattc ctgccgtggg ctggtgggca gaaaaaatgt gagcagcgag 600
accgtgaata ttaccattac ccaagggggc catcatcatc atcatcat 648
<210> 75
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 75
attcccaaag cgacgctgga ggacagcggc 30
<210> 76
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 76
atagctgccg ctgtcctcca gcgtcgcttt 30
<210> 77
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FcR19
<400> 77
Met Lys Ile Lys Thr Gly Ala Arg Ile Leu Ala Leu Ser Ala Leu Thr
1 5 10 15
Thr Met Met Phe Ser Ala Ser Ala Leu Ala Lys Ile Glu Glu Ala Met
20 25 30
Gly Met Arg Thr Gly Asp Met Pro Lys Ala Glu Val Ile Leu Glu Pro
35 40 45
Pro Trp Asn Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Arg
50 55 60
Gly Ala His Ser Pro Asp Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
65 70 75 80
Ser Leu Ile Pro Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Leu Ile Asp Ala Ala Thr
85 90 95
Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Ser Leu Ser Thr Leu
100 105 110
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
115 120 125
Ala Pro Arg Trp Glu Phe Lys Glu Gly Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
130 135 140
His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Ile Tyr Leu Gln Asn
145 150 155 160
Gly Lys Val Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe His Ile Pro
165 170 175
Lys Ala Thr Leu Glu Asp Ser Gly Ser Tyr Ser Cys Arg Gly Leu Val
180 185 190
Gly Arg Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
195 200 205
Gly Gly His His His His His His
210 215
<210> 78
<211> 648
<212> DNA
<213> 多核苷酸编码 FcR19
<400> 78
atgaaaataa aaacaggtgc acgcatcctc gcattatccg cattaacgac gatgatgttt 60
tccgcctcgg ctctcgccaa aatcgaagaa gccatgggca tgcgtaccgg agatatgccg 120
aaagcggagg tgattctgga accgccgtgg aatcgcgtgc tggagaaaga ttcagtgacc 180
cttaaatgcc ggggcgcgca tagccctgat gataacagca cccagtggtt ccacaatgaa 240
agcctgattc ccagccaggc gagcagctac cttattgatg cggcgacggt ggatgatagc 300
ggcgaatatc gttgccagac cagcctgagc accctgagcg atccggtgca gctggaggtg 360
cacatcgggt ggcttctgtt acaggctcca cggtgggagt tcaaagaggg ggatccgatt 420
catctgcggt gtcactcctg gaagaatacc gccctgcata aagtgatcta cctgcaaaac 480
ggcaaggtcc gcaagtattt ccaccacaac tccgacttcc atattcccaa agcgacgctg 540
gaggacagcg gcagctattc ctgccgtggg ctggtgggca gaaaaaatgt gagcagcgag 600
accgtgaata ttaccattac ccaagggggc catcatcatc atcatcat 648
<210> 79
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 79
accgccctgc ataaagtgat ctacctgcaa 30
<210> 80
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 80
ttgcaggtag atcactttat gcagggcggt 30
<210> 81
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 81
caccacaact ccgacttcca tattcccaaa 30
<210> 82
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 82
cagcgtcgct ttgggaatat ggaagtcgga 30
<210> 83
<211> 216
<212> PRT
<213> FcR21
<400> 83
Met Lys Ile Lys Thr Gly Ala Arg Ile Leu Ala Leu Ser Ala Leu Thr
1 5 10 15
Thr Met Met Phe Ser Ala Ser Ala Leu Ala Lys Ile Glu Glu Ala Met
20 25 30
Gly Met Arg Thr Gly Asp Met Pro Lys Ala Glu Val Ile Leu Glu Pro
35 40 45
Pro Trp Asn Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Arg
50 55 60
Gly Ala His Ser Pro Asp Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
65 70 75 80
Ser Leu Ile Pro Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Leu Ile Asp Ala Ala Thr
85 90 95
Val Glu Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Ser Leu Ser Thr Leu
100 105 110
Ser Asp Pro Val Leu Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
115 120 125
Ala Pro Arg Trp Glu Phe Lys Glu Gly Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
130 135 140
His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Ile Tyr Leu Gln Asn
145 150 155 160
Gly Lys Val Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe His Ile Pro
165 170 175
Lys Ala Thr Leu Glu Asp Ser Gly Ser Tyr Ser Cys Arg Gly Leu Val
180 185 190
Gly Arg Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
195 200 205
Gly Gly His His His His His His
210 215
<210> 84
<211> 648
<212> DNA
<213> 多核苷酸编码 FcR21
<400> 84
atgaaaataa aaacaggtgc acgcatcctc gcattatccg cattaacgac gatgatgttt 60
tccgcctcgg ctctcgccaa aatcgaagaa gccatgggca tgcgtaccgg agatatgccg 120
aaagcggagg tgattctgga accgccgtgg aatcgcgtgc tggagaaaga ttcagtgacc 180
cttaaatgcc ggggcgcgca tagcccggat gataacagca cccagtggtt ccacaatgaa 240
agcctgattc ccagccaggc gagcagctac cttattgatg cggcgacggt ggaagatagc 300
ggcgaatatc gttgccagac cagcctgagc accctgagcg atccggtgct gctggaggtg 360
cacatcgggt ggcttctgtt acaggctcca cggtgggagt tcaaagaggg ggatccgatt 420
catctgcggt gtcactcctg gaagaatacc gccctgcata aagtgatcta cctgcaaaac 480
ggcaaggtcc gcaagtattt ccaccacaac tccgacttcc atattcccaa agcgacgctg 540
gaggacagcg gcagctattc ctgccgtggg ctggtgggca gaaaaaatgt gagcagcgag 600
accgtgaata ttaccattac ccaagggggc catcatcatc atcatcat 648
<210> 85
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 85
agcagctacc ttattgattc ggcgacggtg 30
<210> 86
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 86
gctatcttcc accgtcgccg aatcaataag 30
<210> 87
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 87
aaaaatgtga gcagcgaggc cgtggatatt 30
<210> 88
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 88
ggtaatggta atatccacgg cctcgctgct 30
<210> 89
<211> 216
<212> PRT
<213> FcR24
<400> 89
Met Lys Ile Lys Thr Gly Ala Arg Ile Leu Ala Leu Ser Ala Leu Thr
1 5 10 15
Thr Met Met Phe Ser Ala Ser Ala Leu Ala Lys Ile Glu Glu Ala Met
20 25 30
Gly Met Arg Thr Gly Asp Met Pro Lys Ala Glu Val Ile Leu Glu Pro
35 40 45
Pro Trp Asn Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Arg
50 55 60
Gly Ala His Ser Pro Asp Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
65 70 75 80
Ser Leu Ile Pro Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Leu Ile Asp Ser Ala Thr
85 90 95
Val Glu Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Ser Leu Ser Thr Leu
100 105 110
Ser Asp Pro Val Leu Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
115 120 125
Ala Pro Arg Trp Glu Phe Lys Glu Gly Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
130 135 140
His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Ile Tyr Leu Gln Asn
145 150 155 160
Gly Lys Val Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe His Ile Pro
165 170 175
Lys Ala Thr Leu Glu Asp Ser Gly Ser Tyr Ser Cys Arg Gly Leu Val
180 185 190
Gly Arg Lys Asn Val Ser Ser Glu Ala Val Asp Ile Thr Ile Thr Gln
195 200 205
Gly Gly His His His His His His
210 215
<210> 90
<211> 648
<212> DNA
<213> 多核苷酸编码 FcR24
<400> 90
atgaaaataa aaacaggtgc acgcatcctc gcattatccg cattaacgac gatgatgttt 60
tccgcctcgg ctctcgccaa aatcgaagaa gccatgggca tgcgtaccgg agatatgccg 120
aaagcggagg tgattctgga accgccgtgg aatcgcgtgc tggagaaaga ttcagtgacc 180
cttaaatgcc ggggcgcgca tagcccggat gataacagca cccagtggtt ccacaatgaa 240
agcctgattc ccagccaggc gagcagctac cttattgatt cggcgacggt ggaagatagc 300
ggcgaatatc gttgccagac cagcctgagc accctgagcg atccggtgct gctggaggtg 360
cacatcgggt ggcttctgtt acaggctcca cggtgggagt tcaaagaggg ggatccgatt 420
catctgcggt gtcactcctg gaagaatacc gccctgcata aagtgatcta cctgcaaaac 480
ggcaaggtcc gcaagtattt ccaccacaac tccgacttcc atattcccaa agcgacgctg 540
gaggacagcg gcagctattc ctgccgtggg ctggtgggca gaaaaaatgt gagcagcgag 600
gccgtggata ttaccattac ccaagggggc catcatcatc atcatcat 648
<210> 91
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> n 代表任意碱基
<400> 91
cctgcataaa gtgnnktacc tgcaaaacgg 30
<210> 92
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(17)
<223> n 代表任意碱基
<400> 92
ccgttttgca ggtamnncac tttatgcagg 30
<210> 93
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> n 代表任意碱基
<400> 93
caactccgac ttcnnkattc ccaaagcgac 30
<210> 94
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(17)
<223> n 代表任意碱基
<400> 94
gtcgctttgg gaatmnngaa gtcggagttg 30
<210> 95
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(14)
<223> n 是 a, c, g, 或者 t
<400> 95
ctgccgaaag cgnnkgtgtt tctggaaccg 30
<210> 96
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> n 是 a, c, g, 或者 t
<400> 96
ttccagaaac acmnncgctt tcggcagatc 30
<210> 97
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(13)
<223> n 是a, c, g, 或者 t
<400> 97
aaccgcagtg gnnkcgcgtg ctggagaaag 30
<210> 98
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(11)
<223> n 是 a, c, g, 或者 t
<400> 98
agcacgcgmn nccactgcgg ttccagaaac 30
<210> 99
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(14)
<223> n 是 a, c, g, 或者 t
<400> 99
gtgttcaaag agnnkgatcc gattcatctg 30
<210> 100
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(12)
<223> n 是 a, c, g, 或者 t
<400> 100
aatcggatcm nnctctttga acacccaccg 30
<210> 101
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PelB 信号肽
<400> 101
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala
1 5 10 15
Ala Gln Pro Ala Met Ala
20
<210> 102
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 102
catgaaatac ctgctgtcga ccgctgctgc tggtctgctg ctcctcgctg cccagccggc 60
gatggc 66
<210> 103
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 103
catggccatc gccggctggg cagcgaggag cagcagacca gcagcagcgg tcgacagcag 60
gtattt 66
<210> 104
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 104
tgtggtatgg ctgtgcagg 19
<210> 105
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 105
tcggcatggg gtcaggtg 18
<210> 106
<211> 207
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FcRCys
<400> 106
Met Lys Tyr Leu Leu Ser Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala
1 5 10 15
Ala Gln Pro Ala Met Ala Met Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys
20 25 30
Ala Val Val Phe Leu Glu Pro Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp
35 40 45
Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser
50 55 60
Thr Gln Trp Phe His Asn Glu Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser
65 70 75 80
Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys
85 90 95
Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His
100 105 110
Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu
115 120 125
Asp Pro Ile His Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His
130 135 140
Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His
145 150 155 160
Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser
165 170 175
Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr
180 185 190
Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln Gly Cys Arg Asn Asp Thr Cys Gly
195 200 205
<210> 107
<211> 621
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 多核苷酸编码 FcRCys
<400> 107
atgaaatacc tgctgtcgac cgctgctgct ggtctgctgc tcctcgctgc ccagccggcg 60
atggccatgg gcatgcgtac cgaagatctg ccgaaagcgg tggtgtttct ggaaccgcag 120
tggtatcgcg tgctggagaa agattctgtg acccttaaat gccagggcgc gtatagcccg 180
gaagataaca gcacccagtg gttccacaat gaaagcctga tttccagcca ggcgagcagc 240
tactttattg atgcggcgac ggtggatgat agcggcgaat atcgttgcca gaccaacctg 300
agcaccctga gcgatccggt gcagctggag gtgcacatcg ggtggcttct gttacaggct 360
ccacggtggg tgttcaaaga ggaggatccg attcatctgc ggtgtcactc ctggaagaat 420
accgccctgc ataaagtgac ctacctgcaa aacggcaagg gccgcaagta tttccaccac 480
aactccgact tctatattcc caaagcgacg ctgaaggaca gcggcagcta tttctgccgt 540
gggctggtgg gcagcaaaaa tgtgagcagc gagaccgtga atattaccat tacccaaggg 600
tgccgcaacg atacctgcgg a 621

Claims (23)

1.一种Fc结合性蛋白质，其氨基酸序列为序列号37中记载的氨基酸序列中从第33位至第208位为止的氨基酸残基，并且该从第33位至第208位为止的氨基酸残基中产生以下的(1)至(14)中的任1种氨基酸置换，
(1)序列号37的第133位的缬氨酸置换为谷氨酸，
(2)序列号37的第45位的苯丙氨酸置换为异亮氨酸，并且序列号37的第133位的缬氨酸置换为谷氨酸，
(3)序列号37的第187位的苯丙氨酸置换为丝氨酸，
(4)序列号37的第64位的谷氨酰胺置换为精氨酸，
(5)序列号37的第98位的天门冬氨酸置换为谷氨酸，
(6)序列号37的第128位的谷氨酰胺置换为亮氨酸，
(7)序列号37的第135位的赖氨酸置换为天冬酰胺，
(8)序列号37的第158位的亮氨酸置换为谷氨酰胺，
(9)序列号37的第196位的天冬酰胺置换为丝氨酸，
(10)序列号37的第204位的异亮氨酸置换为缬氨酸，
(11)序列号37的第67位的酪氨酸置换为丝氨酸，并且序列号37的第106位的谷氨酰胺置换为精氨酸，
(12)序列号37的第77位的苯丙氨酸置换为酪氨酸，序列号37的第135位的赖氨酸置换为谷氨酸，并且序列号37的第191位的亮氨酸置换为精氨酸，
(13)序列号37的第45位的苯丙氨酸置换为亮氨酸，序列号37的第55位的谷氨酸置换为甘氨酸，序列号37的第93位的天门冬氨酸置换为甘氨酸，并且序列号37的第156位的苏氨酸置换为异亮氨酸，
(14)序列号37的第45位的苯丙氨酸置换为异亮氨酸，序列号37的第64位的谷氨酰胺置换为精氨酸，序列号37的第133位的缬氨酸置换为谷氨酸，并且序列号37的第187位的苯丙氨酸置换为丝氨酸。
2.一种Fc结合性蛋白质，其氨基酸序列为序列号47中记载的氨基酸序列中从第33位至第208位为止的氨基酸残基，并且该从第33位至第208位为止的氨基酸残基中产生以下的(15)至(29)中的任1种氨基酸置换，
(15)序列号47的第37位的谷氨酸置换为赖氨酸或甘氨酸，
(16)序列号47的第39位的亮氨酸置换为甲硫氨酸，
(17)序列号47的第81位的丝氨酸置换为精氨酸，
(18)序列号47的第84位的丝氨酸置换为脯氨酸，
(19)序列号47的第93位的天门冬氨酸置换为缬氨酸，
(20)序列号47的第97位的缬氨酸置换为甲硫氨酸，
(21)序列号47的第119位的谷氨酸置换为缬氨酸，
(22)序列号47的第136位的谷氨酸置换为缬氨酸，
(23)序列号47的第194位的丝氨酸置换为精氨酸，
(24)序列号47的第196位的天冬酰胺置换为赖氨酸，
(25)序列号47的第49位的谷氨酰胺置换为脯氨酸，并且序列号47的第194位的丝氨酸置换为精氨酸，
(26)序列号47的第62位的赖氨酸置换为谷氨酸，并且序列号47的第77位的苯丙氨酸置换为酪氨酸，
(27)序列号47的第34位的甲硫氨酸置换为异亮氨酸，并且序列号47的第136位的谷氨酸置换为缬氨酸，
(28)序列号47的第98位的天门冬氨酸置换为丙氨酸，并且序列号47的第117位的谷氨酰胺置换为亮氨酸，
(29)序列号47的第80位的谷氨酸置换为甘氨酸，序列号47的第93位的天门冬氨酸置换为谷氨酸，并且序列号47的第121位的组氨酸置换为精氨酸。
3.一种Fc结合性蛋白质，其氨基酸序列为序列号67中记载的氨基酸序列中从第33位至第208位为止的氨基酸残基，并且该从第33位至第208位为止的氨基酸残基中产生以下的(30)至(49)中的任1种氨基酸置换，
(30)序列号67的第39位的亮氨酸置换为精氨酸，
(31)序列号67的第67位的酪氨酸置换为组氨酸，
(32)序列号67的第70位的谷氨酸置换为天门冬氨酸或甘氨酸，
(33)序列号67的第77位的苯丙氨酸置换为亮氨酸，
(34)序列号67的第94位的丙氨酸置换为谷氨酸，
(35)序列号67的第135位的赖氨酸置换为天冬酰胺，
(36)序列号67的第201位的苏氨酸置换为丙氨酸，
(37)序列号67的第72位的天冬酰胺置换为丝氨酸，并且序列号67的第102位的谷氨酸置换为天门冬氨酸，
(38)序列号67的第106位的谷氨酰胺置换为亮氨酸，并且序列号67的第201位的苏氨酸置换为丙氨酸，
(39)序列号67的第169位的组氨酸置换为酪氨酸，并且序列号67的第203位的天冬酰胺置换为异亮氨酸，
(40)序列号67的第34位的甲硫氨酸置换为赖氨酸，序列号67的第62位的赖氨酸置换为异亮氨酸，并且序列号67的第72位的天冬酰胺置换为异亮氨酸，
(41)序列号67的第67位的酪氨酸置换为天冬酰胺，序列号67的第97位的缬氨酸置换为谷氨酸，并且序列号67的第154位的赖氨酸置换为精氨酸，
(42)序列号67的第72位的天冬酰胺置换为丝氨酸，序列号67的第201位的苏氨酸置换为丙氨酸，并且序列号67的第207位的苏氨酸置换为丙氨酸，
(43)序列号67的第87位的丙氨酸置换为苏氨酸，序列号67的第130位的脯氨酸置换为亮氨酸，并且序列号67的第167位的苯丙氨酸置换为酪氨酸，
(44)序列号67的第91位的苯丙氨酸置换为精氨酸，序列号67的第159位的谷氨酰胺置换为组氨酸，并且序列号67的第196位的天冬酰胺置换为丝氨酸，
(45)序列号67的第109位的亮氨酸置换为谷氨酰胺，序列号67的第177位的赖氨酸置换为精氨酸，并且序列号67的第185位的丝氨酸置换为甘氨酸，
(46)序列号67的第77位的苯丙氨酸置换为酪氨酸，序列号67的第85位的丝氨酸置换为天冬酰胺，序列号67的第90位的酪氨酸置换为苯丙氨酸，序列号67的第141位的组氨酸置换为谷氨酰胺，并且序列号67位的第165位的赖氨酸置换为甲硫氨酸，
(47)序列号67的第80位的谷氨酸置换为甘氨酸，序列号67的第98位的天门冬氨酸置换为谷氨酸，序列号67的第135位的赖氨酸置换为酪氨酸，序列号67的第146位的丝氨酸置换为苏氨酸，序列号67的第174位的酪氨酸置换为苯丙氨酸，并且序列号67的第203位的天冬酰胺置换为赖氨酸，
(48)序列号67的第163位的甘氨酸置换为缬氨酸，
(49)序列号67的第34位的甲硫氨酸置换为苏氨酸，序列号67的第64位的谷氨酰胺置换为色氨酸，并且序列号67的第83位的异亮氨酸置换为亮氨酸。
4.一种Fc结合性蛋白质，其氨基酸序列为序列号73中记载的氨基酸序列中从第33位至第208位为止的氨基酸残基，并且该从第33位至第208位为止的氨基酸残基中产生以下的(50)至(57)中的任1种氨基酸置换，
(50)序列号73的第94位的丙氨酸置换为丝氨酸，并且序列号73的第201位的苏氨酸置换为丙氨酸，
(51)序列号73的第98位的天门冬氨酸置换为谷氨酸，序列号73的第117位的谷氨酰胺置换为亮氨酸，并且序列号73的第203位的天冬酰胺置换为天门冬氨酸，
(52)序列号73的第117位的谷氨酰胺置换为精氨酸，并且序列号73的第177位的赖氨酸置换为精氨酸，
(53)序列号73的第156位的苏氨酸置换为异亮氨酸，
(54)序列号73的第159位的谷氨酰胺置换为组氨酸，
(55)序列号73的第156位的苏氨酸置换为异亮氨酸，并且序列号73的第174位的酪氨酸置换为组氨酸，
(56)序列号73的第181位的赖氨酸置换为谷氨酸，
(57)序列号73的第203位的天冬酰胺置换为酪氨酸。
5.一种Fc结合性蛋白质，其氨基酸序列为序列号89中记载的氨基酸序列中从第33位至第208位为止的氨基酸残基，并且该从第33位至第208位为止的氨基酸残基中产生以下的(58)至(72)中的任1种氨基酸置换，
(58)序列号89的第56位的赖氨酸置换为谷氨酰胺，并且序列号89的第206位的异亮氨酸置换为缬氨酸，
(59)序列号89的第62位的赖氨酸置换为天冬酰胺，序列号89的第135位的赖氨酸置换为苏氨酸，序列号89的第174位的酪氨酸置换为亮氨酸，并且序列号89的第196位的天冬酰胺置换为赖氨酸，
(60)序列号89的第66位的丙氨酸置换为苏氨酸，
(61)序列号89的第72位的天冬酰胺置换为酪氨酸，序列号89的第81位的丝氨酸置换为甘氨酸，序列号89的第106位的谷氨酰胺置换为亮氨酸，并且序列号89的第157位的酪氨酸置换为苯丙氨酸，
(62)序列号89的第78位的组氨酸置换为亮氨酸，序列号89的第90位的酪氨酸置换为组氨酸，并且序列号89的第138位的天门冬氨酸置换为谷氨酸，
(63)序列号89的第93位的天门冬氨酸置换为缬氨酸，序列号89的第153位的组氨酸置换为谷氨酰胺，并且序列号89的第196位的天冬酰胺置换为赖氨酸，
(64)序列号89的第135位的赖氨酸置换为谷氨酸，并且序列号89的第157位的酪氨酸置换为苯丙氨酸，
(65)序列号89的第135位的赖氨酸置换为谷氨酸，并且序列号89的第191位的亮氨酸置换为精氨酸，
(66)序列号89的第138位的天门冬氨酸置换为谷氨酸，
(67)序列号89的第156位的苏氨酸置换为甲硫氨酸，
(68)序列号89的第196位的天冬酰胺置换为丝氨酸，
(69)序列号89的第206位的异亮氨酸置换为缬氨酸，
(70)序列号89的第207位的苏氨酸置换为异亮氨酸，
(71)序列号89的第156位的苏氨酸置换为丙氨酸、精氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸或缬氨酸，
(72)序列号89的第174位的酪氨酸置换为半胱氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或缬氨酸。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的Fc结合性蛋白质，其氨基酸序列为序列号39、序列号43、序列号47、序列号51、序列号55、序列号63、序列号67、序列号69、序列号73、序列号77、序列号83、序列号89中任一者记载的氨基酸序列中从第33位至第208位为止的氨基酸残基。
7.根据权利要求6所述的Fc结合性蛋白质，其氨基酸序列为序列号39、序列号43、序列号47、序列号51、序列号55、序列号63、序列号67、序列号69、序列号73、序列号77、序列号83、序列号89中任一者记载的氨基酸序列。
8.一种Fc结合性蛋白质，其在权利要求1所述的Fc结合性蛋白质中，进一步产生以下的(73)至(76)中的任1种氨基酸置换，
(73)序列号37的第82位的亮氨酸置换为组氨酸或精氨酸，
(74)序列号37的第163位的甘氨酸置换为天门冬氨酸，
(75)序列号37的第174位的酪氨酸置换为组氨酸，
(76)序列号37的第192位的缬氨酸置换为苯丙氨酸。
9.一种Fc结合性蛋白质，其在权利要求2所述的Fc结合性蛋白质中，进一步产生以下的(77)至(80)中的任1种氨基酸置换，
(77)序列号47的第82位的亮氨酸置换为组氨酸或精氨酸，
(78)序列号47的第163位的甘氨酸置换为天门冬氨酸，
(79)序列号47的第174位的酪氨酸置换为组氨酸，
(80)序列号47的第192位的缬氨酸置换为苯丙氨酸。
10.一种Fc结合性蛋白质，其在权利要求3所述的Fc结合性蛋白质中，进一步产生以下的(81)至(84)中的任1种氨基酸置换，
(81)序列号67的第82位的亮氨酸置换为组氨酸或精氨酸，
(82)序列号67的第163位的甘氨酸置换为天门冬氨酸，
(83)序列号67的第174位的酪氨酸置换为组氨酸，
(84)序列号67的第192位的缬氨酸置换为苯丙氨酸。
11.一种Fc结合性蛋白质，其在权利要求4所述的Fc结合性蛋白质中，进一步产生以下的(85)至(88)中的任1种氨基酸置换，
(85)序列号73的第82位的亮氨酸置换为组氨酸或精氨酸，
(86)序列号73的第163位的甘氨酸置换为天门冬氨酸，
(87)序列号73的第174位的酪氨酸置换为组氨酸，
(88)序列号73的第192位的缬氨酸置换为苯丙氨酸。
12.一种Fc结合性蛋白质，其在权利要求5所述的Fc结合性蛋白质中，进一步产生以下的(89)至(92)中的任1种氨基酸置换，
(89)序列号89的第82位的亮氨酸置换为组氨酸或精氨酸，
(90)序列号89的第163位的甘氨酸置换为天门冬氨酸，
(91)序列号89的第174位的酪氨酸置换为组氨酸，
(92)序列号89的第192位的缬氨酸置换为苯丙氨酸。
13.一种吸附剂，其是将权利要求1至12中任一项所述的Fc结合性蛋白质固定化于不溶性载体而得到的。
14.一种抗体的分离方法，其包括如下工序：
向填充有权利要求13所述的吸附剂的柱中添加平衡化液使柱平衡化的工序；向所述平衡化的柱中添加包含抗体的溶液，使所述抗体吸附于所述吸附剂的工序；和，使用洗脱液，使吸附于所述载体的抗体洗脱的工序。
15.根据权利要求14所述的分离方法，其中，平衡化液包含30mM以上的氯化物离子或硫酸根离子。
16.一种分离抗体的方法，其使用权利要求13所述的吸附剂，基于抗体依赖的细胞介导的细胞毒性的强度对抗体进行分离。
17.一种识别糖链结构的差异的方法，其通过使用权利要求13所述的吸附剂分离抗体，从而识别抗体所具有的糖链结构的差异。
18.一种糖链的分离方法，其使用了权利要求13所述的吸附剂。
19.一种多核苷酸，其编码权利要求1至12中任一项所述的Fc结合性蛋白质。
20.一种表达载体，其包含权利要求19所述的多核苷酸。
21.一种转化体，其是以权利要求20所述的表达载体转化宿主而得到的。
22.根据权利要求21所述的转化体，其中，宿主为大肠杆菌。
23.一种Fc结合性蛋白质的制造方法，通过对权利要求21或22所述的转化体进行培养而使Fc结合性蛋白质表达，从其培养物中回收表达的Fc结合性蛋白质。
CN201580045734.4A 2014-06-27 2015-06-24 改良Fc结合蛋白、及制造方法、使用该蛋白的抗体吸附剂和使用该吸附剂的抗体分离方法 Active CN106574261B (zh)

Applications Claiming Priority (13)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2014133181 2014-06-27
JP2014-133181 2014-06-27
JP2014-147206 2014-07-17
JP2014147207A JP6451119B2 (ja) 2014-07-17 2014-07-17 抗体依存性細胞傷害活性の強さに基づき抗体を分離する方法
JP2014147206A JP6451118B2 (ja) 2014-07-17 2014-07-17 抗体の分離方法
JP2014-147207 2014-07-17
JP2014263407 2014-12-25
JP2014-263407 2014-12-25
JP2015047462 2015-03-10
JP2015-047462 2015-03-10
JP2015-115078 2015-06-05
JP2015115078A JP6699096B2 (ja) 2014-06-27 2015-06-05 改良Ｆｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法および当該タンパク質を用いた抗体吸着剤
PCT/JP2015/068259 WO2015199154A1 (ja) 2014-06-27 2015-06-24 改良Ｆｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法、当該タンパク質を用いた抗体吸着剤および当該吸着剤を用いた抗体の分離方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106574261A CN106574261A (zh) 2017-04-19
CN106574261B true CN106574261B (zh) 2021-02-05

Family

ID=58401216

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580045734.4A Active CN106574261B (zh) 2014-06-27 2015-06-24 改良Fc结合蛋白、及制造方法、使用该蛋白的抗体吸附剂和使用该吸附剂的抗体分离方法

Country Status (3)

Country Link
US (1) US10815289B2 (zh)
EP (1) EP3162895B1 (zh)
CN (1) CN106574261B (zh)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10611817B2 (en) 2013-09-18 2020-04-07 Tosoh Corporation Fc-binding protein, method for producing said protein, and antibody adsorbent using said protein, and methods for purifying and identifying antibody using said adsorbent
CN106574261B (zh) * 2014-06-27 2021-02-05 东曹株式会社 改良Fc结合蛋白、及制造方法、使用该蛋白的抗体吸附剂和使用该吸附剂的抗体分离方法
JP2018050616A (ja) 2016-09-23 2018-04-05 東ソー株式会社 改良型組換えＦｃγＲＩＩ
JP7047425B2 (ja) 2017-02-20 2022-04-05 東ソー株式会社 抗体の分離能が向上したＦｃ結合性タンパク質およびそれを用いた抗体の分離方法
JP6911490B2 (ja) 2017-04-26 2021-07-28 東ソー株式会社 安定型Ｆｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法および当該タンパク質を用いた抗体吸着剤
CN111263813B (zh) * 2017-10-27 2023-10-17 东曹株式会社 耐碱性提高的Fc结合性蛋白质及其制造方法、使用该蛋白质的抗体吸附剂和分离抗体的方法
JP7293657B2 (ja) * 2018-02-22 2023-06-20 東ソー株式会社 酸安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法および当該タンパク質を用いた抗体吸着剤

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1006183A1 (en) * 1998-12-03 2000-06-07 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Recombinant soluble Fc receptors
CN103038344A (zh) * 2010-03-10 2013-04-10 公益财团法人相模中央化学研究所 Fc结合性蛋白质及其制造方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE68929546D1 (de) * 1988-05-27 2006-05-11 Schering Biotech Corp Menschlicher Fc-gamma-Rezeptor III
US6444789B1 (en) 1995-05-03 2002-09-03 Applied Research Systems Ars Holding N.V. CD16-II variants
AU2003236018A1 (en) * 2002-04-09 2003-10-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. METHOD OF ENHANCING ACTIVITY OF ANTIBODY COMPOSITION OF BINDING TO FcGamma RECEPTOR IIIa
JP6152120B2 (ja) 2012-02-15 2017-06-21 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ Ｆｃ受容体に基づくアフィニティークロマトグラフィー
WO2015041303A1 (ja) * 2013-09-18 2015-03-26 東ソー株式会社 Ｆｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法および当該タンパク質を用いた抗体吸着剤、ならびに当該吸着剤を用いた抗体の精製方法および識別方法
CN106574261B (zh) * 2014-06-27 2021-02-05 东曹株式会社 改良Fc结合蛋白、及制造方法、使用该蛋白的抗体吸附剂和使用该吸附剂的抗体分离方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1006183A1 (en) * 1998-12-03 2000-06-07 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Recombinant soluble Fc receptors
CN103038344A (zh) * 2010-03-10 2013-04-10 公益财团法人相模中央化学研究所 Fc结合性蛋白质及其制造方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
IgG Fc Receptor III Homologues in Nonhuman Primate Species:Genetic Characterization and Ligand Interactions;Kenneth A.Rogers et al.;《The Journal of Immunology》;20061231;第177卷;第3848-3856页 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP3162895A4 (en) 2018-02-14
EP3162895A1 (en) 2017-05-03
CN106574261A (zh) 2017-04-19
EP3162895B1 (en) 2020-11-25
US20170218044A1 (en) 2017-08-03
US10815289B2 (en) 2020-10-27
US20190211077A2 (en) 2019-07-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106574261B (zh) 改良Fc结合蛋白、及制造方法、使用该蛋白的抗体吸附剂和使用该吸附剂的抗体分离方法
CN105555801B (zh) Fc结合性蛋白质、该蛋白质的制造方法和使用了该蛋白质的抗体吸附剂、以及使用了该吸附剂的抗体的纯化方法及识别方法
WO2015199154A1 (ja) 改良Ｆｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法、当該タンパク質を用いた抗体吸着剤および当該吸着剤を用いた抗体の分離方法
WO2015041303A1 (ja) Ｆｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法および当該タンパク質を用いた抗体吸着剤、ならびに当該吸着剤を用いた抗体の精製方法および識別方法
JP6507522B2 (ja) 改良Ｆｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法および当該タンパク質を用いた抗体吸着剤
CN111315887B (zh) 免疫球蛋白结合性蛋白质
JP6932923B2 (ja) 改良Ｆｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法および当該タンパク質を用いた抗体吸着剤
JP6699096B2 (ja) 改良Ｆｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法および当該タンパク質を用いた抗体吸着剤
CN111263813B (zh) 耐碱性提高的Fc结合性蛋白质及其制造方法、使用该蛋白质的抗体吸附剂和分离抗体的方法
EP3517609B1 (en) Improved recombinant fc gamma rii
WO2018150973A1 (ja) 抗体の分離能が向上したＦｃ結合性タンパク質およびそれを用いた抗体の分離方法
EP3757216A1 (en) Fc-binding protein having improved acid stability, production method for said protein, and antibody-adsorbing agent using said protein
CN110573621B (zh) 稳定型Fc结合性蛋白质、所述蛋白质的制造方法和使用了所述蛋白质的抗体吸附剂
JP7009913B2 (ja) アミノ酸置換したＦｃ結合性タンパク質
JP7310142B2 (ja) アルカリ耐性が向上したＦｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法、当該タンパク質を用いた抗体吸着剤および当該抗体吸着剤を用いて抗体を分離する方法
JP7293657B2 (ja) 酸安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法および当該タンパク質を用いた抗体吸着剤
JP7432813B2 (ja) 免疫グロブリン結合性タンパク質
JP2022034943A (ja) 免疫グロブリン結合性ポリペプチド
JP2021136967A (ja) 熱に対する安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法および当該タンパク質を用いた抗体吸着剤

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant