JP6695319B2 - マルチプレックスｐｃｒチップ及びそれを含むマルチプレックスｐｃｒ装置 - Google Patents

Description

本発明は、マルチプレックスＰＣＲチップ及びそれを含むマルチプレックスＰＣＲ装置に係り、さらに詳しくは、多数のプローブ間の位置に基づいて相異なる複数の核酸分子を同時に検出するためのマルチプレックスＰＣＲチップ及びそれを含むマルチプレックスＰＣＲ装置に関する。

本発明は、韓国の保健福祉部、韓国保健産業振興院の医療研究開発事業の支援を受けて行われた研究から導き出されたものである[課題固有番号：ＨＩ１３Ｃ２２６２、研究課題名：「マラリア現場検査用遺伝子の超高速診断のためのラボチップベースの多チャンネル同時多重検出全過程自動化Real-time ＰＣＲシステム開発」]。

ポリメラーゼ連鎖反応、すなわちＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）は、核酸を含むサンプル溶液を繰り返し加熱および冷却して核酸の特定の塩基配列を有する部位を連鎖的に複製して、その特定の塩基配列部位を有する核酸を指数関数的に増幅する技術であり、具体的には熱変性（Heat Denaturation）、アニーリング（Annealing）、及び伸長（Extension）などの一連の温度酵素反応ステップに進むことができる。ＰＣＲは、生命科学、遺伝子工学、医療分野などでの分析および診断目的のために幅広く使用されている。

一方、上記のような核酸増幅による診断や特定の遺伝子の検索手法は、一回に１つの鋳型を検索するという点で限界を持つ。複数の鋳型を増幅する必要がある状況で、それぞれの鋳型を一回に１つずつ増幅するのは面倒で多くの時間を要する作業である。例えば、同じ患者に症状が発生するとしても、発症の原因は、複数の種類の感染性病原体による場合が多いので、様々な病原体の診断が個別に必要になる。また、がんや遺伝的な欠陥などは、複数の遺伝子の複合的な変異に起因すると知られている。遺伝子の多形性（polymorphism）や突然変異（mutation）は、様々な遺伝子の座位（loci）の変化に起因するので、追加の接合体（zygote）の検査が必要である。一般的な環境では、限られた試料から抽出することができる核酸の量は有限なので、限られた量の核酸を用いて核酸増幅による反復的な診断ができない場合が頻繁に発生する恐れがある。

したがって、同じ試料から同時に多くの鋳型の核酸を分析する手法が必要であり、このような分析手法は、マルチプレックスＰＣＲ（multiplex ＰＣＲ）と呼ばれることがある。これに関連して、図１は、従来のマルチプレックスＰＣＲの例示的なプロセスを示す。

図１を参照すると、従来のマルチプレックスＰＣＲは、１つの反応容器（またはチューブ（tube））に多種のプライマーセットを注入してＰＣＲを行うことができる。多種のプライマーセットは、核酸分子の様々な配列に特異的に混成化されることができ、そのため、同時に多数の標的核酸配列が増幅されることができる。つまり、マルチプレックスＰＣＲは、一回の実験で複数の遺伝子及び疾病確認／診断可能であり、これにより、実験回数及び労働力を減少させ、コスト削減の効果を提供することができる。

しかし、マルチプレックスＰＣＲの増幅産物をリアルタイムでモニタリングするためには、特殊な検出装置が要求されるが、これは、ＰＣＲ装置の全体的なサイズ及び複雑さを増加させ、結果的にコスト面、すなわち経済性からも好ましくない。 具体的には、マルチプレックスＰＣＲの増幅産物のモニタリングは、増幅反応が進行される間、 励起光線（excitation light）を照射してそこから発生する蛍光（emission light）を検出することにより行うことができ、ここで蛍光発生のためには、増幅反応中に標的核酸配列の存在を示すシグナルを発生することができる蛍光色素によって標識されたオリゴヌクレオチド（すなわち、プライマーまたはプローブ）を使用するが、特にマルチプレックスＰＣＲでは、増幅することができる多数の様々な核酸配列を区別するのために、各核酸配列に特異的な様々なオリゴヌクレオチドが使用されることができる。つまり、従来のマルチプレックスＰＣＲでは、多種の標的核酸配列の検出のために、多種の蛍光色素が標識されるべきであり、また、多種の蛍光色素からの多種の蛍光を検出するために、別個の波長帯域におけるそれぞれの蛍光色素の検出のために最適化されている複数の波長の光源及びフィルタが要求される。これは、複数の波長ごとの測定時間を必要として核酸配列の検出に要する時間を増加させ、ＰＣＲ装置の全体的なサイズ及び複雑さを増加させ、結果的にコスト面、すなわち経済性からも好ましくない。

したがって、全体の構造が単純で、全体のＰＣＲ反応時間を最小化するだけでなく、信頼性の高いＰＣＲ反応収率を得ることができるマルチプレックスＰＣＲ装置が要求される。

本発明は、従来の問題点を解決するためのものであり、多数のプローブ間の位置に基づいて相異なる複数の核酸分子を同時に検出するためのマルチプレックスＰＣＲ装置を提供することを目的とする。

本発明の一実施例に係るマルチプレックスＰＣＲチップが開示される。前記マルチプレックスＰＣＲチップは、相異なる複数の核酸分子を同時に検出するために、前記核酸分子の相異なる増幅された配列と特異的に混成化される多数の混成化反応用プローブ（probe）を含み、前記多数のプローブは、互いに離隔して固着されていることを特徴とすることができる。

本発明の一実施例に係るマルチプレックスＰＣＲ装置が開示される。前記マルチプレックスＰＣＲ装置は、前記マルチプレックスＰＣＲチップと；前記マルチプレックスＰＣＲチップ内の前記プローブに向かって励起光線（excitation light）を照射する光提供部と；前記励起光線によって多数のプローブから発生する蛍光（emission light）を検出する光検出部と；を含み、前記光提供部及び前記光検出部による検出は、単一波長の光を用いて行われることを特徴とすることができる。

本発明の一実施例に係るマルチプレックスＰＣＲ装置が開示される。前記マルチプレックスＰＣＲ装置は、前記マルチプレックスＰＣＲチップと；前記マルチプレックスＰＣＲチップに接触し、前記マルチプレックスＰＣＲチップにマルチプレックスＰＣＲのための熱を伝達する少なくとも１つの熱ブロックと；を含むことを特徴とすることができる。

本発明によれば、相異なる核酸分子の配列と特異的に混成化される多種のプローブを離隔して配置することにより、これらのプローブ間の位置に基づいて、プローブによって混成化される核酸分子の配列を区別することができるので、前記プローブに標識するための相異なる蛍光色素の必要性を排除することができる。

本発明によれば、プローブ間の位置に基づいて、プローブと混成化される核酸分子の配列が区分可能なため、１種の光源及びフィルタのみを使用してマルチプレックスＰＣＲ産物の検出が可能である。これは、光学機器のサイズを小型化し、機器のコストを低減することができるだけでなく、検出にかかる時間を減らすなど、マルチプレックスＰＣＲ装置の動作の効率を向上させることができる。

本発明によれば、多種のプローブがマルチプレックスＰＣＲチップの表面上で所定の接着物質により結合されることにより、より強固な結合力を提供することができ、これは結合の分離及び混成化と洗浄中に発生する歪曲された結果を予防するすることができる。

本発明によれば、前記接着物質は、多孔構造（pore structure）を形成することができ、多孔構造の表面にプローブが結合することにより、プローブとマルチプレックスＰＣＲ産物との間の接触面積を増加させ、反応性を向上させることができる。

本発明の詳細な説明で引用される図面をより十分に理解するために、各図面の簡単な説明が提供される。
従来のマルチプレックスＰＣＲの例示的なプロセスを示す図である。 本発明の一実施例に係るマルチプレックスＰＣＲチップを示す図である。 本発明の一実施例に係るマルチプレックスＰＣＲ装置を示す図である。 本発明の一実施例に係るマルチプレックスＰＣＲチップを示す図である。 本発明の一実施例に係るマルチプレックスＰＣＲチップを示す図である。 本発明の一実施例に係るマルチプレックスＰＣＲ装置を示す図である。 本発明の一実施例に係るマルチプレックスＰＣＲ装置を示す図である。 本発明の一実施例に係るマルチプレックスＰＣＲチップの使用例を示す図である。 本発明の一実施例に係る熱ブロックを示す図である。 本発明の一実施例に係る熱ブロックを示す図である。 本発明の一実施例に係る熱ブロックを示す図である。 本発明の一実施例に係る熱ブロックを示す図である。 本発明の一実施例に係るマルチプレックスＰＣＲ装置を示す図である。 本発明の一実施例に係るマルチプレックスＰＣＲ装置を示す図である。 本発明の一実施例に係るマルチプレックスＰＣＲ装置を示す図である。 本発明の一実施例に係るマルチプレックスＰＣＲ装置を示す図である。 本発明の一実施例に係るマルチプレックスＰＣＲ装置の実験例を示す図である。

以下、本発明に係る実施例は、添付図面を参照して説明する。各図面の構成要素に参照符号を付加するにあたり、同一の構成要素に対しては、たとえ他の図面上に表示されていても可能な限り同一の符号を有するようにしていることに留意しなければならない。また、本発明の実施例を説明するにあたり、関連した公知の構成または機能に対する具体的な説明が本発明の実施例の理解を妨げると判断される場合には、その詳細な説明は省略する。また、以下で本発明の実施例を説明するが、本発明の技術的思想はこれに限定されたり制限されず、当業者により変形されて多様に実施することができる。

本明細書全体にわたって、ある部分が他の部分と「接続」されているとすると、これは「直接的に接続」されている場合だけではなく、その中間に他の素子を間に置いて「間接的に接続」されている場合をも含む。本明細書全体にわたって、ある部分がある構成要素を「含む」とするとき、これは特に反対される記載がない限り、他の構成要素を除外するのではなく、他の構成要素を含むことができるということを意味する。

本発明に係るマルチプレックスＰＣＲ装置は、特定の塩基配列を有する様々な核酸を増幅するマルチプレックスＰＣＲ（Multiplex Polymerase Chain Reaction）を行うための装置である。具体的には、マルチプレックスＰＣＲ装置は、特定の塩基配列を有するＤＮＡ（deoxyribonucleic acid）を増幅するために、二本鎖のＤＮＡを含むサンプル溶液を、特定の温度、例えば、約９５℃に加熱して二本鎖のＤＮＡを一本鎖のＤＮＡに分離する変性ステップ（denaturing step）と、サンプル溶液に増幅しようとする特定の塩基配列と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド（oligonucleotide）プライマーを提供し、分離された一本鎖のＤＮＡと一緒に、特定の温度、例えば、５５℃に冷却し、一本鎖のＤＮＡの特定の塩基配列にプライマーを結合させて部分的なＤＮＡ−プライマー複合体を形成するアニーリングステップ（annealing step）と、アニーリングステップの後、サンプル溶液を適温、例えば、７２℃に維持してＤＮＡポリメラーゼ（polymerase）によって部分的なＤＮＡ−プライマー複合体のプライマーをもとに二本鎖のＤＮＡを形成する伸長（または増幅）ステップ（extension step）と、を行い、３つのステップを例えば２０回〜４０回繰り返すことにより、特定の塩基配列を有するＤＮＡを指数関数的に増幅することができる。また、場合によっては、ＰＣＲ装置は、アニーリングステップと伸長（または増幅）ステップを同時に行うことができ、この場合、ＰＣＲ装置は、伸長ステップとアニーリング及び伸長（または増幅）ステップとで構成された２ステップを行うことにより、第１循環を完成することもできる。したがって、本発明の一実施例に係るマルチプレックスＰＣＲ装置は、手順を行うためのモジュールを含む装置を言い、本明細書に記載されていない詳細なモジュールは、ＰＣＲを行うための従来の技術中に開示されて自明の範囲ですべて備えていることを前提とする。

また、本発明に係るマルチプレックスＰＣＲ装置は、マルチプレックスＰＣＲを行うとともに、マルチプレックスＰＣＲ産物の発生の有無及び程度をリアルタイムで測定し、分析することができる。マルチプレックスＰＣＲチップにＰＣＲ反応に必要な試薬だけでなく蛍光物質が添加され、ＰＣＲ産物の生成に応じて蛍光物質が特定の波長の光によって発光することにより、測定及び分析可能な光信号を発生するようになる。

図２は、本発明の一実施例に係るマルチプレックスＰＣＲチップを示す。

図２を参照すると、マルチプレックスＰＣＲチップ２００は、核酸分子の増幅（増幅反応）、標的配列の検出（混成化反応）などを行うためのものであり、流体が収容される１つ以上の反応領域２２４を含むことができる。ここで、流体は、核酸、例えば、二本鎖ＤＮＡ、増幅しようとする特定の塩基配列と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（deoxyribonucleotide triphosphates、ｄＮＴＰ）、ＰＣＲ反応緩衝液（ＰＣＲ reaction buffer）などを含むサンプル溶液であり得る。

マルチプレックスＰＣＲチップ２００の少なくとも一部は、光透過性の材質で実現することができ、好ましくは、光透過性プラスチック材質を含むことができる。マルチプレックスＰＣＲチップ２００は、プラスチック材質を使用し、プラスチックの厚さを調整するだけで熱伝達効率を増大させることができ、製作工程が単純で製造コストを削減することができる。また、マルチプレックスＰＣＲチップ２００は、全体的に光透過的な性質を備えることができるので、熱ブロックの一面に配置された状態で直接光照射が可能であるので、リアルタイムで核酸増幅の有無及び増幅の程度を測定及び分析することができる。増幅反応のために、マルチプレックスＰＣＲチップ２００が熱ブロックに接触した場合、熱ブロックの熱はマルチプレックスＰＣＲチップ２００に伝達され、マルチプレックスＰＣＲチップ２００の反応領域２２４に含まれている流体が加熱されたり冷却されて一定の温度が維持されることができる。マルチプレックスＰＣＲチップ２００は、全体的に平面形状を有することができるが、これらに限定されるものではない。

図２に示すように、マルチプレックスＰＣＲチップ２００は、混成化反応のために内部に付着されたプローブ（probe）２４０を含むことができる。プローブ２４０は、ＰＣＲにより増幅される核酸を検出するために増幅反応の間に標的核酸配列の存在を示すシグナルを発生することができる標識されたオリゴヌクレオチドであり、核酸分子の増幅された配列と特異的に混成化することができる。それぞれのプローブ２４０は、核酸分子の相異なる増幅された配列に混成化することができる。

それぞれのプローブ２４０は、マルチプレックスＰＣＲチップ２００の表面上に互いに離隔して結合することができる。このような結合は、例えば、スポッター（Spotter）、アレイヤー（arrayer）、インクジェット（ink-jet）などを用いてプローブ２４０をマルチプレックスＰＣＲチップ２００の表面上に塗布することにより行うことができる。実施例に応じて、それぞれのプローブ２４０は、マルチプレックスＰＣＲチップ２００の表面上に共有結合するか、接着物質を用いて結合することができる。ここで、接着物質は、ハイドロゲル（hydrogel）、アガロース（agarose）及びパラフィン（paraffin）のうちの少なくとも１つであることができる。前記接着物質は、従来のプローブ２４０とマルチプレックスＰＣＲチップ２００との間の共有結合に比べてより強固な結合力を提供することができ、これは結合の分離及び混成化と洗浄の間に発生する歪曲された結果を予防することができる。また、前記接着物質は多孔構造（pore structure）を形成することができるが、多孔構造の表面にプローブ２４０が結合することにより、プローブ２４０とマルチプレックスＰＣＲ産物（すなわち、増幅された核酸分子）との間の接触面積を増加させ、反応性を向上させることができる。また、プローブ２４０は、反応領域２２４の上面（または、マルチプレックスＰＣＲチップ２００の上部内面または第３板２３０の下部表面）に配置することができる。ＰＣＲ反応中には気泡が発生することができ、このような気泡は、ＰＣＲ反応産物を測定するにあたり干渉を引き起こす可能性があるが、図２に示すように、プローブ２４０が反応領域２２４の上面に配置されることにより、気泡は、プローブ２４０の周辺に移動するようになることで、このような干渉を除去して測定効率を向上させることができる。

多数のプローブ２４０には同じ蛍光色素が使用されることができる。従来のマルチプレックスＰＣＲでは、多数のプローブ２４０によって混成化される核酸分子の配列を区別するために相異なる色を有する蛍光色素（dye）によって標識されたプローブ２４０が使用されるべきであったが、本発明では、同じ蛍光色素が使用されるとしても、多数のプローブ２４０が所定の間隔で離隔して配置され、このため、このようなプローブ２４０間の位置に基づいてプローブ２４０によって混成化される核酸分子の配列を区別することができので、相異なる蛍光色素の必要性を排除することができる。

このような同じ蛍光色素を使用することから、蛍光色素による蛍光を検出するための光学装置を簡素化することができる。従来のマルチプレックスＰＣＲでは、１つの反応容器内に核酸分子の増幅された配列と特異的に混成化することができる多数の相異なるプローブ２４０が相異なる蛍光色素によって標識され、このような蛍光色素による蛍光（emission light）を区別するために、各蛍光色素に特異的な多数の波長を有する光学装置が使用された。しかし、本発明では、多種のプローブ２４０に向かって１つの波長を有する励起光線（excitation light）を照射して、同じ染色試料による蛍光、すなわち同じ色の蛍光が発生しても、プローブ２４０間の位置に基づいて増幅される核酸分子の配列を区別することができる。つまり、本発明では、１種の光源及びフィルタを使用することにより、マルチプレックスＰＣＲ産物の検出が可能であり、これは、光学機器のサイズを小型化し、機器のコストを低減することができるだけでなく、検出にかかる時間を減らすなど、マルチプレックスＰＣＲ装置の動作の効率を向上させることができる。

図２に示すマルチプレックスＰＣＲチップ２００の構造をより詳細に説明すると、マルチプレックスＰＣＲチップ２００のベースとして平板状の第１板２１０が提供されることができる。第１板２１０上に第２板２２０及び第３板２３０が順次配置されることができる。第１板２１０は、様々な材質で具現できるが、好ましくは、ポリメチルメタクリレート（polymethylmethacrylate、ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（polycarbonate、ＰＣ）、シクロオレフィンコポリマー（cycloolefin copolymer、ＣＯＣ）、ポリアミド（polyamide、ＰＡ）、ポリエチレン（polyethylene、ＰＥ）、ポリプロピレン（polypropylene、ＰＰ）、ポリフェニレンエーテル（polyphenylene ether、ＰＰＥ）、ポリスチレン（polystyrene、ＰＳ）、ポリオキシメチレン（polyoxymethylene、ＰＯＭ）、ポリエーテルエーテルケトン（polyetheretherketone、ＰＥＥＫ）、ポリテトラフルオロエチレン（polytetrafluoroethylene、ＰＴＦＥ）、ポリ塩化ビニル（polyvinylchloride、ＰＶＣ）、ポリフッ化ビニリデン（polyvinylidene fluoride、ＰＶＤＦ）、ポリブチレンテレフタレート（polybutyleneterephthalate、ＰＢＴ） 、フッ素化エチレンプロピレン（fluorinated ethylenepropylene、ＦＥＰ）、パーフルオロアルコキシアルカン（perfluoralkoxyalkane、ＰＦＡ）、及びその組み合わせからなる群から選択される熱可塑性樹脂又は熱硬化性樹脂材質であることができる。

第１板２１０上に第２板２２０が配置されることができる。第２板２２０は、流体（例えば、増幅しようとする核酸を含むサンプル溶液など）が流入される流入部２２２と、流入した流体が移動してＰＣＲ反応及び混成化反応が行われる反応領域２２４と、反応が終了した流体が排出される流出部２２６と、を含むことができる。同図に示すように、第２板２２０の反応領域２２４は、第２板２２０の表面（例えば、上面及び／又は下面）から陥没したり、第２板２２０を貫通して形成される。また、第２板２２０の流入部２２２及び流出部２２６は、以下でより詳細に説明するように、第２板２２０を貫通するとともに、第２板２２０の表面から突設される。

第２板２２０は、様々な材質で具現できるが、好ましくは、ポリジメチルシロキサン（polydimethylsiloxane、ＰＤＭＳ）、シクロオレフィンコポリマー（cycle olefin copolymer、ＣＯＣ）、ポリメチルメタクリレート（polymethylmetharcylate、ＰＭＭＡ） 、ポリカーボネート（polycarbonate、ＰＣ）、ポリプロピレンカーボネート（polypropylene carbonate、ＰＰＣ）、ポリエーテルスルホン（polyether sulfone、ＰＥＳ）、ポリエチレンテレフタレート（polyethylene terephthalate、ＰＥＴ）、及びその組み合わせからなる群から選択される材質であり得る。

また、第２板２２０の厚さは様々であり得るが、０.１ｍｍ〜２.０ｍｍから選択することができる。また、反応領域２２４の幅と長さは様々であり得るが、好ましくは、反応領域２２４の幅は０.５ｍｍ〜３ｍｍから選択し、反応領域２２４の長さは２０ｍｍ〜６０ｍｍから選択することができる。また、第２板２２０の内壁は、ＤＮＡ、タンパク質（protein）吸着を防止するためにシラン（silane）系、ウシ血清アルブミン（Bovine Serum Albumin、ＢＳＡ）などの物質でコーティングすることができ、物質の処理は、当業界における公知の方法に基づいて行うことができる。また、流入部２２２は、様々なサイズを備えることができるが、好ましくは直径１.０ｍｍ〜３.０ｍｍから選択することができる。また、流出部２２６は、様々なサイズを備えることができるが、好ましくは直径１.０ｍｍ〜３.０ｍｍから選択することができる。

第２板２２０上に第３板２３０を配置することができる。具体的には、第３板２３０は、第２板２２０上に配置されて第２板２２０の反応領域２２４の一部領域（すなわち、第２板２２０の反応領域２２４中の貫通領域）をカバーするとともに、第３板２３０の下面の一部領域上に互いに離隔配置された少なくとも１つのプローブ２４０により、ＰＣＲ反応産物を測定することができる。

第３板２３０は、様々な材質で具現できるが、好ましくは、ポリジメチルシロキサン（polydimethylsiloxane、ＰＤＭＳ）、シクロオレフィンコポリマー（cycle olefin copolymer、ＣＯＣ）、ポリメチルメタクリレート（polymethylmetharcylate、ＰＭＭＡ） 、ポリカーボネート（polycarbonate、ＰＣ）、ポリプロピレンカーボネート（polypropylene carbonate、ＰＰＣ）、ポリエーテルスルホン（polyether sulfone、ＰＥＳ）、ポリエチレンテレフタレート（polyethylene terephthalate、ＰＥＦ）、及びその組み合わせからなる群から選択される材質であり得る。また、第３板２３０の厚さは異なりますが、好ましくは０.１ｍｍ乃至２.０ｍｍから選択することができる。

第１板２１０、第２板２２０及び第３板２３０のうち少なくとも１つの形状は、射出成形、ホットエンボス（hot-embossing）、キャスティング（casting）、レーザーアブレーション （laser ablation）などの様々な機械的、化学的加工工程によって形成されることができる。前記加工工程は、例示的なものであり、本発明が適用される実施例に応じて様々な加工工程が適用できる。また、第１板２１０と第２板２２０との間の結合及び／又は第２板２２０と第３板２３０との間の接合は、例えば、熱接合、超音波接合、紫外線接合、溶媒接合、テープ接合などの当該分野で適用可能な様々な接合方法によって行うことができる。

実施例に応じて、マルチプレックスＰＣＲチップ２００の内部表面の少なくとも一部（例えば、第２板２２０の内壁など）には、表面処理が行われる。例えば、表面上にＤＮＡ、タンパク質（protein）吸着を防止するためにシラン（Ｓilane）系、ウシ血清アルブミン（Bovine Serum Albumin、ＢＳＡ）などの物質でコーティングすることができ、このような表面処理は、当該技術分野における公知の様々な技術に基づいて行うことができる。

また、実施例に応じて、マルチプレックスＰＣＲチップ２００は、流入部２２２及び／又は流出部２２６のための別のカバー手段（図示せず）を備えて、流入部２２２及び流出部２２６によるマルチプレックスＰＣＲチップ２００の内部の汚染を防止したり、マルチプレックスＰＣＲチップ２００に注入された流体の漏れなどを防止することができる。このようなカバー手段は、様々な形状、サイズ、または材質で具現できる。

図２に示すマルチプレックスＰＣＲチップ２００の形状や構造は例示的なものであって、本発明が適用される実施例に応じて様々な形状や構造のマルチプレックスＰＣＲチップが用いられる。

図３は、本発明の一実施例に係るマルチプレックスＰＣＲ装置を示す。

図３を参照すると、マルチプレックスＰＣＲチップ３００の内部表面の少なくとも一部領域（すなわち、第３板２３０の下部の一部領域）には親水性物質３１０が処理されて、マルチプレックスＰＣＲの円滑な遂行を助ける。親水性物質３１０は、様々な物質であり得るが、好ましくは、カルボキシ基（−ＣＯＯＨ）、アミン基（−ＮＨ２）、ヒドロキシ基（−ＯＨ）、及びスルホン基（−ＳＨ）からなる群から選択することができる。また、親水性物質３１０の処理は、酸素及びアルゴンプラズマ処理、コロナ放電処理、及び界面活性剤の塗布からなる群から選択される方法により処理することができるが、これは例示的なものであって、本発明が適用される実施例に応じて当該技術分野における公知の様々な処理方法が適用できる。

図４は、本発明の一実施例に係るマルチプレックスＰＣＲチップを示す。

図４を参照すると、マルチプレックスＰＣＲチップ４００において、第３板２３０は、第２板２２０の反応領域２２４の一部領域（すなわち、第２板２２０の反応領域２２４のうち貫通領域）に挿設できる。このために、第３板２３０の下面の一部領域４１０は、下方に向けて突設されることができる。このように突設される領域４１０が第２板２２０の反応領域２２４のうち貫通領域をカバーするとともに、貫通領域への挿入により、第３板２３０と第２板２２０の容易な接合アライメントを達成することができる。

図４に示すマルチプレックスＰＣＲチップ４００の形状は、例示的なものであって、本発明が適用される実施例に応じて様々な形状が適用できる。

図５は、本発明の一実施例に係るマルチプレックスＰＣＲチップを示す。

具体的には、図５の（ａ）は、マルチプレックスＰＣＲチップ５００の平面図であり、図５の（ｂ）は、マルチプレックスＰＣＲチップ５００のＡ−Ａ’線における断面図であり、図５の（ｃ）は、図５の（ａ）及び（ｂ）に示すマルチプレックスＰＣＲチップ５００の内部表面の底面斜視図である。

図５を参照すると、マルチプレックスＰＣＲチップ５００は、プローブ固定部５１０をさらに含むことができる。プローブ固定部５１０は、標的配列の検出のためのプローブ２４０を収容および固定するためのものであり、例えば、マルチプレックスＰＣＲチップ５００の第３板２３０の下面の一部領域に形成される中心部５１２と、中心部５１２を囲むように突出される周辺部５１４とからなり得る。ここで、中心部５１２は、プローブ２４０の収容空間を提供することができ、周辺部５１４は、中心部５１２に収容されたプローブ２４０の離脱を防止することができる。

図５に示すプローブ固定部５１０の形状は、例示的なものであって、本発明が適用される実施例に応じて様々な形状のプローブ固定部使用することができる。

図６は、本発明の一実施例に係るマルチプレックスＰＣＲ装置を示す図である。

具体的には、図６の（ａ）は、マルチプレックスＰＣＲチップ６００の平面図であり、図６の（ｂ）は、マルチプレックスＰＣＲチップ６００のＡ−Ａ’線における断面図であり、図６の（ｃ）は、図６の（ａ）及び（ｂ）に示すマルチプレックスＰＣＲチップ６００の一部の底面斜視図である。

本発明における反応領域２２４は、反応領域２２４内で行われる各種反応（例えば、ＰＣＲ反応、混成化反応など）の産物を測定するための光測定領域を含むことができる。ここで、光測定領域は、反応産物から放出される光信号が検出される反応領域２２４の少なくとも一部の領域として、混成化反応の結果が表示されるプローブ２４０が配置される領域に対応することができる。

図６を参照すると、マルチプレックスＰＣＲチップ６００は、気泡除去部６１０をさらに含むことができる。気泡除去部６１０は、流体に含まれている気泡が反応領域のうち所定の領域（例えば、プローブ２４０またはプローブ固定部５１０）に位置することを防止するためのもので、同図に示すように、第３板２３０の内面から下方に向けて突設されることができる。具体的には、気泡除去部６１０は、第３板２３０の下部内面から反応領域の内側に突設されるので、流体内に含まれている気泡が浮力に起因して気泡除去部６１０からの周辺に押されて周辺空間に配置されることになる。つまり、気泡は、光測定領域から外部に離脱してしまうので、光測定領域に存在する反応産物から放出される光信号の感度に影響を及ぼさないようになる。

特に、第３板２３０の少なくとも一部としての気泡除去部６１０は、光透過性の材質で構成することができ、このため、光測定領域内の反応産物から発生する光信号は、気泡除去部６１０を通過して、感度を損なうことなく、マルチプレックスＰＣＲチップ６００の外部に放出することができる。このように、マルチプレックスＰＣＲチップ６００を用いて反応領域２２４内（すなわち、プローブ２４０）の反応産物を測定する場合、マルチプレックスＰＣＲチップ６００の極小型化にもかかわらず、反応領域２２４内で発生した気泡の影響を受けないので、光信号の感度が非常に増加し、これにより多数の少量の反応産物を同時に迅速で正確に測定することができるようになる。

このような気泡除去部６１０の使用は、例示的なものであって、本発明が適用される実施例に応じて気泡除去部６１０は様々な用途に活用することができる。例えば、気泡除去部６１０は、反応領域を経由する流体の移動中に流体に含まれている気泡を流体の流れから除去するために使用することができる。

また、図６に示す気泡除去部６１０の形状は、例示的なものであって、これに限定されるものではなく、本発明の実施例に応じて多様に変形されて適用することができる。

図７は、本発明の一実施例に係るマルチプレックスＰＣＲ装置を示す図である。

具体的には、図７の（ａ）は、マルチプレックスＰＣＲチップ７００の平面図であり、図７の（ｂ）は、マルチプレックスＰＣＲチップ７００のＡ−Ａ’線における断面図であり、図７の（ｃ）は、図７の（ａ）及び（ｂ）に示すマルチプレックスＰＣＲチップ７００の一部の底面斜視図である。

図７を参照すると、気泡除去部７１０は、第３板２３０の下部内面から下方に向けて延設され、プローブ固定部５１０に接続される傾斜面からなり得る。このように、気泡除去部７１０の側面が傾斜面からなる場合、気泡が傾斜面に沿って反応領域の上側へ移動可能であるため、気泡が気泡除去部７１０の周辺空間にさらに容易に移動配置できるようにすることができる。

図６及び図７に示されていないが、実施例に応じて、プローブ固定部は、プローブ固定部の周辺部の底面に形成される平坦面と、平坦面の周囲から延長されて気泡除去部に接続される傾斜面と、からなり得る。このように、プローブ固定部の周りの側面が傾斜面からなる場合、側面に傾斜面を有する気泡除去と同様に、プローブの周囲の気泡が傾斜面に沿って光測定領域の外部へ（または反応領域の上側へ）容易に移動するため、光測定効率をさらに向上させることができる。

また、図６及び図７に示されていないが、実施例に応じて、気泡除去部は、気泡除去の周囲に沿って第３板の下面が上側に陥没されて形成される気泡捕集部をさらに含むことができる。気泡捕集部は、気泡捕集部以外の領域に比べて相対的に反応領域の上側に位置するので、気泡除去部から押し出された気泡は、気泡捕集部に捕集することができる。

図８は、本発明の一実施例に係るマルチプレックスＰＣＲチップの使用例を示す。

図８を参照すると、マルチプレックスＰＣＲチップ２００の流入部２２２及び流出部２２６にヒーター（heater）８１０、８１０ 'が設けられて、マルチプレックスＰＣＲチップ内部（すなわち、反応領域２２４）を密封することができる。

より具体的には、マルチプレックスＰＣＲチップ２００の流入部２２２及び流出部２２６のそれぞれは、第２板２２０を貫通して形成される開口部８２０、８３０と、開口部８２０、８３０に隣接して第２板２２０の表面が突出して形成される突出部８４０、８５０と、を含むことができる。つまり、ヒータ８１０、８１０ 'が、マルチプレックスＰＣＲチップ２００の流入部２２２及び流出部２２６に設けられて熱を伝達することにより、流入部２２２及び流出部２２６の突出部８４０、８５０が融解されて開口部８２０、８３０を密封することができる。これにより、流体が流入部２２２を通して反応領域２２４に流入された後にＰＣＲ反応などを行う過程において、流体の少なくとも一部が外部に消失することを防止することができる。

図９ａ乃至図９ｄは、本発明の一実施例に係る熱ブロックを示す。

図９aを参照すると、本発明の一実施例に係るマルチプレックスＰＣＲチップ２００乃至７００には少なくとも１つ熱ブロック９００が接するので、核酸分子を増幅するための変性ステップ、アニーリングステップ及び伸長（または増幅）ステップを行うための温度を維持することができる。ここで、熱ブロック９００は、基板９１０と、基板９１０上に配置された発熱層９２０と、発熱層９２０上に配置された絶縁保護層９３０と、発熱層９２０と接続配置された電極９４０と、を備えることができる。

基板９１０は、耐熱度が高いプラスチック材質、金属材質等の板材であり、平板形を示しているが、半円筒形、半球面形などの様々な形状を有することができる。また、基板９１０は、発熱層９２０を支持する役割を果たすことができる。

発熱層９２０は、マルチプレックスＰＣＲの変性ステップ、アニーリングステップ及び伸長（または増幅）ステップを行うため熱ブロック９００の熱源の役割を果たすことができる。

一実施例において、発熱層９２０は、熱源として熱線を含むことができる。熱線は、電極９４０から印加された電力を用いて発熱することができ、このような熱線の温度をモニタリングするための様々な温度センサ（図示せず）と駆動可能に接続することができる。熱線は、熱ブロック９００の内部の温度を全体的に一定に維持するために、熱ブロック９００面の中心点を基準に上下及び／又は左右方向に対称に配置されることができる。上下及び／又は左右方向に対称な熱線の配置形態は多様であり得る。

一実施例において、発熱層９２０を基板９１０に強く固定するために、基板９１０と発熱層９２０との間に接着力強化層（図示せず）を形成することができる。接着力強化層はシリカまたはポリマーで形成することができる。

絶縁保護層９３０は、発熱層９２０を物理的及び／又は電気的に保護するためのものであって、絶縁性物質を含むことができる。例えば、絶縁性物質は、誘電体酸化物、フェリリン、ナノ粒子および高分子フィルムからなる群から選択することができる。一方、絶縁保護層９３０は、透明であり得る。

電極９４０は、発熱層９２０と直接または間接的に接続配置されて発熱層９２０に電力を供給する。電極９４０としては、電力を供給し得る様々な物質を用いることができ、例えば、金属材質、導電性エポキシ、導電性ペースト、はんだ及び導電性フィルムからなる群から選択することができる。図９によれば、電極９４０は、発熱層９２０の両側面に接続配置されるが、発熱層９２０に電力を供給することができれば、動作可能な様々な位置で接続配置することができる。また、電極９４０は、マルチプレックスＰＣＲ装置に含まれるか、又は外部に配置された電源と電気的に接続することもできる。例えば、電極９４０は発熱層９２０に直接接触し、配線（図示せず）を介して外部回路（図示せず）に発熱層９２０を接続させ、配線が電極９４０に安定的に固定されるように端子が配置されることができる。

マルチプレックスＰＣＲチップ２００乃至７００は、熱ブロック９００の上部面の少なくとも一部の領域に接触することにより、熱ブロック９００の熱供給又は熱回収に応じて加熱または冷却されて、マルチプレックスＰＣＲの各反応ステップを行うことができる。実施例に応じて、マルチプレックスＰＣＲチップ２００乃至７００は、熱ブロック９００に直接又は間接的に接触して熱供給を行うことができる。

図９ｂによれば、光反射防止層９５０が絶縁保護層９３０の上部面に接触配置されてセンシング効率をさらに高めることができる。具体的には、光反射防止層９５０は、絶縁保護層９３０と組み合わせて絶縁保護機能及び光反射防止機能を行い、光反射防止物質を含むことができる。ここで、光反射防止物質は、例えば、ＭｇＦ₂のようなフッ化物、ＳｉＯ₂、Ａｌ₂ 、Ｏ₃のような酸化物であり得るが、光の反射を防止することができる性質を有する物質であれば制限されない。

図９ｃによれば、吸光層９６０が絶縁保護層９３０の上部面に接触配置され、吸光層９６０は、吸光物質を含むことができる。ここで、吸光物質は、例えば、マイカ（mica）であり得るが、光を吸収する性質を有する物質であれば制限されない。したがって、光源からの光の一部を吸光層９６０が吸収し、光信号のノイズとして作用する反射光の発生を極力抑えることができる。

図９ｄによれば、熱ブロック９００の下部面に吸光物質を処理して吸光層９６０を形成し、同時に熱ブロック９００の上部面に光反射防止物質を処理して光反射防止層９５０を形成してセンシング効率をさらに高めることができる。つまり、効果的なリアルタイムマルチプレックスＰＣＲのモニタリングのために、ノイズ対比光信号の割合は、可能な最大値であるべきであり、また、ノイズ対比光信号の割合は、マルチプレックスＰＣＲチップ２００乃至７００からの励起光線の反射率が低いほど向上することができる。

図９ａ乃至図９ｄに示す熱ブロック９００の構造及び形状は例示的なものであり、本発明の実施例に応じて様々に変形して適用することができる。例えば、実施例に応じて、熱ブロック９００をなす各構成要素９１０乃至９６０間の積層順序を変更することができる。

図１０は、本発明の一実施例に係るマルチプレックスＰＣＲ装置を示す。

図１０を参照すると、マルチプレックスＰＣＲ装置１０００は、熱ブロック９００と、マルチプレックスＰＣＲチップ２００乃至７００と、マルチプレックスＰＣＲチップ２００乃至７００に光を提供するように駆動可能に配置された光提供部１０１０と、マルチプレックスＰＣＲチップ２００乃至７００から放出される光を収容するように駆動可能に配置された光検出部１０２０と、をさらに含むことができる。

光提供部１０１０は、マルチプレックスＰＣＲチップ２００乃至７００に光を提供するためのモジュールであり得る。一実施例において、光提供部１０１０は、発光ダイオード（ＬＥＤ：Light Emitting Diode）光源やレーザー光源などのように光を放出する光源と、光源から放出される光のうちから所定の波長を有する光を選択する第１の光フィルターと、第１の光フィルタから放出される光を捕集して放出光の強度を増加させる第１の光レンズと、を含むことができる。付加的な実施例に応じて、光提供部１０１０は、光源と第１の光フィルターとの間に光を広げるように配置された第１非球面レンズをさらに含むことができる。つまり、第１非球面レンズの配置方向を調整することにより、光源から放出される光の範囲を拡張して、測定可能な領域に到達させることができる。ただし、光提供部１０１０の構成はこれに限定されない。

光検出部１０２０は、マルチプレックスＰＣＲチップ２００乃至７００から放出される光を受容してマルチプレックスＰＣＲチップ２００乃至７００で行われるＰＣＲ反応産物を測定するためのモジュールであり、光提供部１０１０から放出された光は、マルチプレックスＰＣＲチップ２００乃至７００、具体的にマルチプレックスＰＣＲチップ２００乃至７００の反応領域２２４またはプローブ２４０を通過するか反射し、この場合、核酸増幅によって発生する光信号を光検出部１０２０が検出することができる。一実施例において、光検出部１０２０は、マルチプレックスＰＣＲチップ２００乃至７００から放出される光を捕集して放出光の強度を増加させる第２の光レンズと、第２の光レンズから放出される光のうちから予め決定された波長を有する光を選択する第２の光フィルターと、第２の光フィルターから放出される光から光信号を検出する光分析器と、を含むことができる。付加的な実施例に応じて、第２の光フィルターと光分析器との間に、第２の光フィルターから放出される光を集積するように配置された第２の非球面レンズ、及び／又は、第２の非球面レンズと光分析器との間に、第２非球面レンズから放出される光のノイズ（noise）を除去し、第２非球面レンズから放出される光を増幅するように配置された光ダイオード集積素子（photodiode integrated circuit）をさらに含むことができる。

光提供部１０１０がマルチプレックスＰＣＲチップ２００乃至７００内の多種のプローブ２４０に向かって１つの波長を有する励起光線を照射して同じ染色試料による蛍光、すなわち同じ色の蛍光が発生しても、プローブ２４０間の位置に基づいて増幅される核酸分子の配列を区別することができる。したがって、光提供部１０１０は、多種の光源及びフィルターを備える必要なく、１種の光源及びフィルターのみを使用することによりマルチプレックスＰＣＲ産物を検出することができる。同様に、光検出部１０２０も、１種のフィルターのみを備えても、マルチプレックスＰＣＲ産物を検出することができる。光提供部１０１０及び光検出部１０２０のこのような構成は、従来のマルチプレックスＰＣＲ装置に比べて、光学機器のサイズを小型化し、機器のコストを低減することができるだけでなく、検出にかかる時間を減らすことができる。

また、マルチプレックスＰＣＲチップ２００乃至７００においてマルチプレックスＰＣＲの各循環ステップが進行される間、反応領域２２４内で、特にプローブ２４０における核酸の増幅による反応の結果をリアルタイムでモニタリングすることにより、標的核酸配列の増幅有無及び増幅程度をリアルタイムで測定し、分析することができる。

図１０には示されていないが、実施例に応じて、マルチプレックスＰＣＲ装置１０００は、光提供部１０１０から放出された光が光検出部１０２０まで到達できるように光の進行方向を調整し、予め決定された波長を有する光を分離するための少なくとも１つの二色性フィルターをさらに含むことができる。ここで、ダイクロイックフィルター（dichroic filter）は、光を波長に応じて選択的に透過または選択的に調整された角度で反射させるモジュールである。例えば、第１ダイクロイックフィルターを、光提供部１０１０から放出される光の光軸に対して約４５度の角度で傾斜して配置することにより、光をその波長に応じて選択的に短波長成分を透過させ、長波長成分を直角に反射させてマルチプレックスＰＣＲチップ２００乃至７００に到達させることができる。また、例えば、第２のダイクロイックフィルターを、マルチプレックスＰＣＲチップ２００乃至７００と熱ブロックから反射された光の光軸に対して約４５度の角度で傾斜して配置することにより、光をその波長に応じて選択的に短波長成分を透過させ、長波長成分を直角に反射させて光検出部１０２０に到達させることができる。

図１０には、光提供部１０１０及び光検出部１０２０が、マルチプレックスＰＣＲチップ２００乃至７００及び熱ブロック９００の上部に配置されることが示されているが（反射型）、これは例示的なものであり、本発明が適用される実施例に応じて様々な位置に配置されることができる。例えば、光提供部１０１０及び光検出部１０２０は、マルチプレックスＰＣＲチップ２００乃至７００及び熱ブロック９００を中心として上下に配置（透過型）されることができる。

図１１ａ及び図１１ｂは、本発明の一実施例に係るマルチプレックスＰＣＲ装置を示す。

図１１aを参照すると、マルチプレックスＰＣＲ装置１１００は、基板１１１０と、基板１１１０上に配置された第１熱ブロック９００Ａと、第１熱ブロック９００Ａと離隔配置された第２熱ブロック９００Ｂと、マルチプレックスＰＣＲチップ２００乃至７００が装着されるチップホルダー１１２０と、チップホルダー１１２０を移動させる駆動部１１３０と、を含むことができる。

基板１１１０は、第１熱ブロック９００Ａ及び第２熱ブロック９００Ｂの加熱及び温度維持のため、その物理的及び／又は化学的性質が変わらず、第１熱ブロック９００Ａと第２熱ブロック９００Ｂとの間で相互に熱交換が起こらないようにする材質を有するすべての物質を含むことができる。例えば、基板１１１０は、プラスチックなどの材質を含むか、またはそのような材質で構成することができる。

第１熱ブロック９００Ａ及び第２熱ブロック９００Ｂは、核酸を増幅するための変性ステップ、アニーリングステップおよび伸長（または増幅）ステップを行うための温度を維持するためのものであり、図９を参照して説明した熱ブロック９００と同様に説明し、そのため、重複する説明は省略する。熱ブロック９００Ａ、９００Ｂのそれぞれは、変性ステップ、またはアニーリング及び伸長（または増幅）ステップを行うための適切な温度を維持するために具現される。例えば、熱ブロック９００Ａ、９００Ｂは、５０℃〜１００℃を維持することができ、好ましくは、熱ブロック９００Ａ、９００Ｂで変性ステップを行う場合、９０℃〜１００℃を維持することができ、さらに好ましくは９５℃を維持することができ、熱ブロック９００Ａ、９００Ｂでアニーリングと伸長（または増幅）ステップを行う場合では、５５℃〜７５℃を維持することができ、好ましくは７２℃を維持することができる。ただし、変性ステップ、またはアニーリングおよび伸長（または増幅）ステップを行うことができる温度であれば、これらに限定されるものではない。第１熱ブロック９００Ａと第２熱ブロック９００Ｂは、相互に熱交換が起こらないように、予め決められた距離で離隔配置されることができる。これにより、第１熱ブロック９００Ａと第２熱ブロック９００Ｂとの間で熱交換が起こらないので、微細な温度変化によっても重大な影響を受ける可能性がある核酸増幅反応において、変性ステップとアニーリング及び伸長（または増幅）のステップの正確な温度制御が可能である。また、マルチプレックスＰＣＲチップ２００乃至７００が、各熱ブロック９００Ａ、９００Ｂの一面に接触した場合、第１熱ブロック９００Ａ及び第２熱ブロック９００Ｂは、マルチプレックスＰＣＲチップ２００乃至７００との接触面を全体的に加熱及び温度維持することができることから、マルチプレックスＰＣＲチップ２００乃至７００内の流体を均一に加熱及び温度維持することができる。従来、単一の熱ブロックを使用するマルチプレックスＰＣＲ装置では、単一の熱ブロックにおける温度変化率が毎秒３〜７℃の範囲内で行われるに対して、マルチプレックスＰＣＲ装置１１００では、２つの熱ブロックを含み、このため、各熱ブロック９００Ａ、９００Ｂにおける温度変化率が毎秒２０〜４０℃の範囲内で行われてマルチプレックスＰＣＲ反応時間を大幅に短縮することができる。

チップホルダー１１２０には、マルチプレックスＰＣＲチップ２００乃至７００が装着されることができる。マルチプレックスＰＣＲチップ２００乃至７００のチップホルダー１１２０からの離脱を防止するために、チップホルダー１１２０の内壁は、マルチプレックスＰＣＲチップ２００乃至７００の外壁と固定するための形状と構造を有することができる。また、マルチプレックスＰＣＲチップ２００乃至７００は、チップホルダー１１２０に着脱可能である。チップホルダー１１２０は、駆動部１１３０に駆動可能に接続することができる。

駆動部１１３０は、熱ブロック９００Ａ、９００Ｂ上で(above)／上へ(to)チップホルダー１１２０を左右及び／又は上下に移動させることができる。具体的には、駆動部１１３０は、チップホルダー１１２０を第１熱ブロック９００Ａ及び第２熱ブロック９００Ｂ上 で(above)／上へ(to)左右及び／又は上下に移動可能にするすべての手段を含むことができる。駆動部１１３０の左右移動により、チップホルダー１１２０は、第１熱ブロック９００Ａと第２熱ブロック９００Ｂとの間で往復運動が可能で、駆動部１１３０の上下移動により、チップホルダー１１２０は、第１熱ブロック９００Ａと第２熱ブロック９００Ｂに接触および分離することができる。このために、駆動部１１３０は、左右方向に沿って延設されたレール１１３２と、レール１１３２に沿って左右方向にスライド移動可能に配置され、上下方向にスライド移動可能な接続部材１１３４と、を含み、接続部材１１３４の一端にチップホルダー１１２０が配置されることができる。

図１１ｂを参照すると、駆動部１１３０は、チップホルダー１１２０に装着されたマルチプレックスＰＣＲチップ２００乃至７００を第１熱ブロック９００Ａと第２熱ブロック９００Ｂとの間で往復移動させながらＰＣＲ反応を行うことができる。

まず、第１熱ブロック９００Ａを変性ステップのための温度、例えば、９０℃〜１００℃に加熱及び維持し、好ましくは９５℃に加熱及び維持することができる。また、第２熱ブロック９００Ｂをアニーリング及び伸長（または増幅）のステップのための温度、例えば、５５℃〜７５℃に加熱及び維持し、好ましくは７２℃に加熱及び維持することができる。

マルチプレックスＰＣＲチップ２００乃至７００をチップホルダー１１２０に装着した後、または同時に駆動１１３０の接続部材１１３４を制御してマルチプレックスＰＣＲチップ２００乃至７００を下方に移動させて、マルチフレックスＰＣＲチップ２００乃至７００が装着されたチップホルダー１１２０を第１熱ブロック９００Ａに接触させてマルチプレックスＰＣＲの第１変性ステップを行うことができる（ｘステップ）。

続いて、駆動部１１３０の接続部材１１３４を制御してマルチプレックスＰＣＲチップ２００乃至７００を上方に移動させて、マルチプレックスＰＣＲチップ２００乃至７００が装着されたチップホルダー１１２０を第１熱ブロック９００Ａから分離させてマルチプレックスＰＣＲの第１変性ステップを終了し、その後、駆動部１１３０のレール１１３２により、マルチプレックスＰＣＲチップ２００乃至７００を第２熱ブロック９００Ｂ上に移動させることができる（ｙステップ）。

続いて、駆動部１１３０の接続部材１１３４を制御してマルチプレックスＰＣＲチップ２００乃至７００を下方に移動させて、マルチプレックスＰＣＲチップ２００乃至７００が装着されたチップホルダー１１２０を第２熱ブロック９００Ｂに接触させてマルチプレックスＰＣＲの第１アニーリング及び伸長（または増幅）ステップを行うことができる（zステップ）。

最後に、駆動部１１３０の接続部材１１３４を制御してマルチプレックスＰＣＲチップ２００乃至７００を上方に移動させて、マルチプレックスＰＣＲチップ２００乃至７００が装着されたチップホルダー１１２０を第２熱ブロック９００Ｂから分離させてマルチプレックスＰＣＲの第１アニーリング及び伸長（または増幅）のステップを終了し、その後、駆動部１１３０のレール１１３２を介してマルチプレックスＰＣＲチップ２００乃至７００を第１熱ブロック９００Ａの上に移動させ、その後、x、y、zのステップを繰り返すことにより、核酸増幅反応を行うことができる（循環ステップ）。

図１２は、本発明の一実施例に係るマルチプレックスＰＣＲ装置を示す。

図１２を参照すると、マルチプレックスＰＣＲ装置１２００では、第１熱ブロック９００Ａ及び第２熱ブロック９００Ｂを間に置いて光提供部１０１０と光検出部１０２０が配置されることができる。光測定のために駆動部１１３０には、光提供部１０１０から放出される光を通過させるための貫通部１１３６が形成されることができ、マルチプレックスＰＣＲチップ２００乃至７００は、光透過性材質、具体的に光透過性プラスチック材質であり得る。

図１２に示す光提供部１０１０及び光検出部１０２０の配置により、マルチプレックスＰＣＲ装置１２００による核酸増幅反応中にマルチプレックスＰＣＲチップ２００乃至７００内で核酸が増幅される度合をリアルタイムで検出することができる。具体的には、マルチプレックスＰＣＲチップは、ＰＣＲ反応の各ステップを行うために第１熱ブロック９００Ａと第２熱ブロック９００Ｂとの間を往復することになる。このような過程において、駆動部１１３０は、マルチプレックスＰＣＲチップ２００乃至７００を、第１熱ブロック９００Ａと第２熱ブロック９００Ｂとの間の離隔した空間上に停止させることができる。この時、光提供部１０１０から光を放出し、放出された光は、マルチプレックスＰＣＲチップ２００乃至７００、具体的にマルチプレックスＰＣＲチップ２００乃至７００の反応領域２２４またはプローブ２４０を通過するので、核酸の増幅によって発生する光信号を光検出部１０２０が検出することができる。

このように、マルチプレックスＰＣＲ装置１２００によれば、マルチプレックスＰＣＲ反応の各循環ステップが行われる間、反応領域２２４内で、特にプローブ２４０における核酸の増幅による反応の結果をリアルタイムでモニタリングすることにより、標的核酸配列の量をリアルタイムで測定及び分析することができる。

図１２では、光提供部１０１０が下端に、光検出部１０２０が上端に位置することを示しているが、これは例示的なものであり、光提供部１０１０が上端に、光検出部１０２０が下端に位置することもできる。

一方、図１１a、図１１ｂ及び図１２には、２つの熱ブロック９００Ａ、９００Ｂを用いてＰＣＲ反応を行うマルチプレックスＰＣＲ装置が示されているが、これは例示的なものであり、ＰＣＲ反応を行うために用いられる熱ブロックの数は様々であり得る。例えば、１つのマルチプレックスＰＣＲチップ２００乃至７００に対して１つ熱ブロックのみを用いることができる。

図１３は、本発明の一実施例に係るマルチプレックスＰＣＲ装置の実験例を示す。

本実験例では、プローブを製造して、マルチプレックスＰＣＲチップに離隔配置し、前記プローブによって検針可能なＰＣＲ試薬を注入した後、ＰＣＲを行うとともに蛍光を測定する。

まず、所定の試薬を混合してプレポリマー（prepolymer）（またはハイドロゲル（hydrogel））溶液を製造し、プレポリマー溶液をエルシニアエンテロコリチカ・フォワードプライマー（Yersinia enterocolitica Forward Primer）などと混合してプローブ溶液を製造する。

プレポリマー溶液の試薬組成は以下の通りである

また、プローブ溶液の組成は以下の通りである

続いて、プローブ溶液をマルチプレックスＰＣＲチップ内に配置した後、紫外線照射して硬化させることができる。硬化された溶液は、その後に洗浄剤を用いて洗浄する。プローブに相補的に結合可能なリバースプライマー（reverse primer）を含むＰＣＲ試薬をマルチプレックスＰＣＲチップ内に２０μＬ注入後、ＰＣＲを行い、その後、蛍光を測定した。

ＰＣＲ試薬の組成は以下の通りである

また、ＰＣＲの駆動条件は以下の通りである

図１３には、上記条件に基づいた本発明のマルチプレックスＰＣＲチップの実験結果が示されている。同図に示すように、マルチプレックスＰＣＲチップによれば、相異なる核酸分子の配列と特異的に混成化される多種のプローブを離隔して配置することにより、このようなプローブ間の位置に基づいて、プローブによって混成化される核酸分子の配列を区別することができる。これは、それぞれのプローブに標識するための相異なる蛍光色素の使用及び複雑な構成の光源及びフィルターを用いたＰＣＲ産物の検出の必要性を排除することができる。したがって、光学機器のサイズを小型化し、機器のコストを低減することができるだけでなく、検出にかかる時間を減らすなど、マルチプレックスＰＣＲ装置の動作の効率を向上させることができる。

以上のように図面及び明細書で最適の実施形態が開示された。ここで特定の用語が使われたが、これは単に本発明を説明するための目的で使われたものであり、意味限定や特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を制限するために使われたものではない。したがって、 本技術分野の通常の知識を有する者であれば、これより多様な変形及び均等な他の実施例が可能であるという点を理解できるであろう。したがって、本発明の真の技術的保護範囲は、添付された特許請求の範囲の技術的思想により定められねばならない。

210 第１板
220 第２板
222 流入部
224 反応領域
226 流出部
230 第３板
240 プローブ
310 親水性物質
410 領域
510 プローブ固定部
512 中心部
514 周辺部
610 気泡除去部
710 気泡除去部

Claims (14)

1. 相異なる複数の核酸分子を同時に検出するために、前記核酸分子の相異なる増幅された配列と特異的に混成化される多数の混成化反応用プローブ（probe）を含み、前記多数のプローブは前記核酸分子の相異なる増幅された配列と特異的に混成化された後に同一の蛍光染料によって標識されるものであり、前記多数のプローブは、お互いに離隔して固着され、前記多数のプローブ間の離隔位置に基づいて前記多数のプローブそれぞれと混成化する核酸分子の配列を識別できることを特徴とするマルチプレックスＰＣＲ(Multiplex Polymerase Chain Reaction)チップであって、
   前記多数のプローブが、前記マルチプレックスＰＣＲチップのＰＣＲ反応領域の上部内面に下方に向けて突設される突設部の下面に配置されて、下方へ垂れた形態であり、また、前記多数のプローブが、多孔構造を形成する接着物質を介して、前記突設部の下面に結合され、さらに、前記突設部は前記反応領域内の気泡が前記プローブ上に位置することを防止するためのものであることを特徴とするマルチプレックスＰＣＲチップ。
2. 前記多孔構造は、ハイドロゲル（hydrogel）、アガロース（agarose）及びパラフィン（paraffin）のうちから選ばれる少なくとも１種からなることを特徴とする請求項１に記載のマルチプレックスＰＣＲチップ。
3. 前記マルチプレックスＰＣＲチップは、平板状の第１板と；前記第１板上に配置され、流入部、反応領域及び流出部を有する第２板と；前記第２板上に配置されて前記反応領域をカバーし、下部の表面に前記プローブが離隔配置される第３板と；を含むことを特徴とする請求項１に記載のマルチプレックスＰＣＲチップ。
4. 前記マルチプレックスＰＣＲチップは、前記プローブが配置される中心部と、前記中心部を囲むように前記中心部に隣接して突設される周辺部と、からなるプローブ固定部をさらに含むことを特徴とする請求項３に記載のマルチプレックスＰＣＲチップ。
5. 前記マルチプレックスＰＣＲチップは、前記反応領域内の気泡が前記プローブ上に位置することを防止するために、前記第３板の下部内面から下方に向けて突設される光透過性材質の気泡除去部を含むことを特徴とする請求項３に記載のマルチプレックスＰＣＲチップ。
6. 前記第１板は、ポリメチルメタクリレート（polymethylmethacrylate、ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（polycarbonate、ＰＣ）、シクロオレフィンコポリマー（cycloolefin c opolymer、ＣＯＣ）、ポリアミド（polyamide、ＰＡ）、ポリエチレン（polyethylene、
   ＰＥ）、ポリプロピレン（polypropylene、ＰＰ）、ポリフェニレンエーテル（polypheny lene ether、ＰＰＥ）、ポリスチレン（polystyrene、ＰＳ）、ポリオキシメチレン（pol yoxymethylene、ＰＯＭ）、ポリエーテルエーテルケトン（polyetheretherketone、ＰＥＥＫ）、ポリテトラフルオロエチレン（polytetrafluoroethylene、ＰＴＦＥ）、ポリ塩化ビニル（polyvinylchloride、ＰＶＣ）、ポリフッ化ビニリデン（polyvinylidene fluo ride、ＰＶＤＦ）、ポリブチレンテレフタレート（polybutyleneterephthalate、ＰＢＴ）、フッ素化エチレンプロピレン（fluorinated ethylenepropylene、ＦＥＰ）、パーフルオロアルコキシアルカン（perfluoralkoxyalkane、ＰＦＡ）、及びその組み合わせからなる群から選択される熱可塑性樹脂又は熱硬化性樹脂材質であり、
   前記第２板及び第３板のそれぞれは、ポリジメチルシロキサン（polydimethylsiloxane 、ＰＤＭＳ）、シクロオレフィンコポリマー（cycle olefin copolymer、ＣＯＣ）、ポリメチルメタクリレート（polymethylmetharcylate、ＰＭＭＡ） 、ポリカーボネート（polycarbonate、ＰＣ）、ポリプロピレンカーボネート（polypropylene carbonate、ＰＰＣ）、ポリエーテルスルホン（polyether sulfone、ＰＥＳ）、ポリエチレンテレフタレート（polyethylene terephthalate、ＰＥＴ）、及びその組み合わせからなる群から選択される材質からなることを特徴とする請求項３に記載のマルチプレックスＰＣＲチップ。
7. 前記第２板の前記反応領域に対応するように前記第３板の下面の少なくとも一部領域が突設されることを特徴とする請求項３に記載のマルチプレックスＰＣＲチップ。
8. 前記流入部及び前記流出部のそれぞれは、流体が流入される開口部と、前記開口部に隣接して突設される突出部と、を含み、前記突出部は、熱を印加されて融解されることにより前記開口部を密封することを特徴とする請求項３に記載のマルチプレックスＰＣＲチップ。
9. 請求項１に係るマルチプレックスＰＣＲチップと；
   前記マルチプレックスＰＣＲチップ内の前記プローブに向かって励起光線（excitation light）を照射する光提供部と；
   前記励起光線によって多数のプローブから発生する蛍光（emission light）を検出する光検出部と；を含み、
   前記光提供部及び前記光検出部による検出は、単一波長の光を用いて行われることを特徴とするマルチプレックスＰＣＲ装置。
10. 請求項１に係るマルチプレックスＰＣＲチップと；
    前記マルチプレックスＰＣＲチップに接触し、前記マルチプレックスＰＣＲチップにマルチプレックスＰＣＲのための熱を伝達する少なくとも１つの熱ブロックと；を含むことを特徴とするマルチプレックスＰＣＲ装置。
11. 前記マルチプレックスＰＣＲチップが装着されるチップホルダーと；前記チップホルダーを熱ブロック上で(above)／上へ(to)左右及び／又は上下に移動させる駆動部と；をさらに含み、
    前記熱ブロックは、第１熱ブロック及び第２熱ブロックを含むことを特徴とする請求項１０に記載のマルチプレックスＰＣＲ装置。
12. 前記第１熱ブロック及び前記第２熱ブロックのうちいずれか一方の熱ブロックは、ＰＣＲ反応の変性ステップの温度を維持するように具現され、他方の熱ブロックは、ＰＣＲ反応のアニーリング及び伸長（または増幅）ステップの温度を維持するように具現されたこ とを特徴とする請求項１１に記載のマルチプレックスＰＣＲ装置。
13. 前記第１熱ブロックと前記第２熱ブロックは、相互に熱交換が起こらないように離隔配置されることを特徴とする請求項１１に記載のマルチプレックスＰＣＲ装置。
14. 前記駆動部は、左右方向に延設されたレールと；レールに沿って左右方向にスライド移動可能に配置され、上下方向にスライド移動可能な接続部材と；を含み、接続部材の一端にはチップホルダーが配置されることを特徴とする請求項１１に記載のマルチプレックスＰＣＲ装置。
    

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