JP6690424B2 - 顕微鏡装置、観察方法、及び制御プログラム - Google Patents

Description

本発明は、顕微鏡装置、観察方法、及び制御プログラムに関する。

超解像顕微鏡の一形態として、空間変調された照明光により標本を照明して変調画像を取得し、その変調画像を復調することにより、標本の超解像画像を生成する構造化照明顕微鏡（ＳＩＭ：Structured Illumination Microscopy）が知られている（例えば、特許文献１を参照）。

米国再発行特許発明第３８３０７号

超解像顕微鏡は、画像取得の高速化が期待される。

本発明は、画像取得を高速化することができる顕微鏡装置、観察方法、及び制御プログラムを提供することを目的とする。

本発明の第１の態様に従えば、音波定在波が生成され、入射した光を複数の光束に分岐する光変調器と、複数の光束の少なくとも一部を干渉させて、干渉縞で試料を照明する照明光学系と、干渉縞が照射された試料の像を形成する結像光学系と、結像光学系により形成された試料の像を撮像する撮像部と、複数の光束の少なくとも１つの光束の位相を変化させる位相調整部と、制御部と、を有し、制御部は、光変調器に第１の駆動信号を与えて音波定在波を生成させたとき、位相調整部に位相を第１のパターンで変化させて撮像部に第１の画像を撮像させ、位相調整部に位相を第２のパターンで変化させて撮像部に第２の画像を撮像させ、光変調器に第２の駆動信号を与えて音波定在波を生成させたとき、位相調整部に位相を第３のパターンで変化させて撮像部に第３の画像を撮像させ、位相調整部に位相を第４のパターンで変化させて撮像部に第４の画像を撮像させ、光変調器に第３の駆動信号を与えて音波定在波を生成させたとき、位相調整部に位相を第５のパターンで変化させて撮像部に第５の画像を撮像させ、位相調整部に位相を第６のパターンで変化させて撮像部に第６の画像を撮像させる、顕微鏡装置が提供される。

本発明の第２の態様に従えば、音波定在波が生成され、入射した光を光変調器によって複数の光束に分岐することと、複数の光束の少なくとも一部を干渉させて、干渉縞で試料を照明することと、干渉縞が照射された試料の像を形成することと、形成された試料の像を撮像することと、複数の光束の少なくとも１つの光束の位相を変化させることと、光変調器による音波定在波の生成、位相の変化、及び撮像を制御することと、を含み、制御は、光変調器に第１の駆動信号を与えて音波定在波を生成させたとき、位相を第１のパターンで変化させて第１の画像を撮像させ、位相を第２のパターンで変化させて第２の画像を撮像させることと、光変調器に第２の駆動信号を与えて音波定在波を生成させたとき、位相を第３のパターンで変化させて第３の画像を撮像させ、位相を第４のパターンで変化させて第４の画像を撮像させることと、光変調器に第３の駆動信号を与えて音波定在波を生成させたとき、位相を第５のパターンで変化させて第５の画像を撮像させ、位相を第６のパターンで変化させて第６の画像をさせることと、を含む、観察方法が提供される。

本発明の第３の態様に従えば、音波定在波が生成され、入射した光を複数の光束に分岐する光変調器と、複数の光束の少なくとも一部を干渉させて、干渉縞で試料を照明する照明光学系と、干渉縞が照射された試料の像を形成する結像光学系と、結像光学系により形成された試料の像を撮像する撮像部と、複数の光束の少なくとも１つの光束の位相を変化させる位相調整部と、を有する顕微鏡装置の制御をコンピュータに実行させる制御プログラムであって、制御は、光変調器に第１の駆動信号を与えて音波定在波を生成させたとき、位相調整部に位相を第１のパターンで変化させて撮像部に第１の画像を撮像させ、位相調整部に位相を第２のパターンで変化させて撮像部に第２の画像を撮像させることと、光変調器に第２の駆動信号を与えて音波定在波を生成させたとき、位相調整部に位相を第３のパターンで変化させて撮像部に第３の画像を撮像させた後、位相調整部に位相を第４のパターンで変化させて撮像部に第４の画像を撮像させることと、光変調器に第３の駆動信号を与えて音波定在波を生成させたとき、位相調整部に位相を第５のパターンで変化させて撮像部に第５の画像を撮像させ位相調整部に位相を第６のパターンで変化させて撮像部に第６の画像を撮像させることと、を含む、制御プログラムが提供される。

本発明によれば、画像取得を高速化することができる顕微鏡装置、観察方法、及び制御プログラムを提供することができる。

本実施形態の顕微鏡装置を示す図である。 本実施形態に係る分岐部を示す図である。 分岐部から視野絞りまでの光路を示す図である。 照明光学系の光軸の方向から見たマスクの例を示す図である。 光変調器の音波伝搬路における屈折率の分布の時間変化を示す図である。 定在波のパターンと、１次回折光の干渉縞との対応を示す概念図である。 （Ａ）は音波伝搬路における光の入射領域を示す図、（Ｂ）は波本数の変化に伴う干渉縞のずれを示す図である。 前半期および後半期のそれぞれの定在波と干渉縞を示す図である。 ２Ｄ−ＳＩＭモードにおける動作を示すフローチャートである。 ３Ｄ−ＳＩＭモードにおける光源部から試料までの光路を示す図である。 分岐部から視野絞りまでの光路、及び駆動信号を示す図である。 定在波、位相調整前後の干渉縞を示す図である。 複数のフレームにおける駆動信号、定在波、及び干渉縞を示す図である。 ３Ｄ−ＳＩＭモードにおける動作を示すフローチャートである。 干渉縞の１方向に関する設定条件を示す図である。 位相変調器の駆動信号の他の例を示す図である。 位相変調器による位相調整量の例を示す図である。 定在波の腹の屈折率、０次回折光の位相変調量の時間変化を示す図である。 位相変調器の駆動信号の他の例を示す図である。 光変調器の他の例を示す図である。

次に、図面を参照しながら実施形態について説明する。図１は、本実施形態の顕微鏡装置１を示す図である。顕微鏡装置１は、構造化照明装置２と、撮像装置３と、制御装置４と、表示装置５とを備える。顕微鏡装置１は、例えば蛍光顕微鏡であり、予め蛍光染色された細胞などを含む試料Ｘの観察などに利用される。試料Ｘは、例えば、不図示のステージに保持される。

顕微鏡装置１は、概略すると以下のように動作する。構造化照明装置２は、干渉縞を生成し、干渉縞で試料Ｘを照明する。撮像装置３は、干渉縞により変調された試料Ｘの像（試料像、モアレ像）を撮像する。モアレ像は、試料Ｘの情報を含んでおり、試料Ｘよりも空間周波数が低いので撮像装置３の光学系を介して撮像可能である。制御装置４は、顕微鏡装置１の各部を制御する。制御装置４は、構造化照明装置２を制御して、干渉縞の位相および向きを複数の状態に切り替える。制御装置４は、撮像装置３を制御して、干渉縞の複数の状態のそれぞれにおいて試料Ｘの像を撮像させ、複数の画像を取得する。制御装置４は、複数の画像を用いて復調処理を行うことにより、撮像装置３の光学系の解像限界を超えた超解像画像を生成することができる。

顕微鏡装置１は、試料Ｘのうち観察対象の面（以下、試料面という）の２次元的な超解像画像を生成する２Ｄ−ＳＩＭモードと、試料面に垂直な方向の情報を含む３次元的な超解像画像を生成する３Ｄ−ＳＩＭモードとを備える。まず、２Ｄ−ＳＩＭモードについて説明し、次に３Ｄ−ＳＩＭモードについて説明する。

構造化照明装置２は、光源部１０と、照明光学系１１とを備える。光源部１０は、例えばレーザー素子などの光源を含み、所定の波長帯の可干渉光を射出する。蛍光顕微鏡の場合、所定の波長帯は、試料Ｘの励起波長を含む波長帯に設定される。なお、光源部１０の少なくとも一部は、構造化照明装置２に含まれていなくてもよい。例えば、光源部１０は、構造化照明装置２に交換可能（取り付け可能、取り外し可能）に設けられていてもよい。例えば、光源部１０は、顕微鏡装置１による観察時などに、構造化照明装置２に取り付けられてもよい。

照明光学系１１は、光源部１０の光出射側に、コレクタレンズ１２と、分岐部１３とを備える。光源部１０から射出した光は、コレクタレンズ１２によって平行光に変換され、分岐部１３へ入射する。分岐部１３は、入射した光を複数の光束に分岐する。分岐部１３は、光源部１０からの光を回折により複数の光束に分岐する。なお、図１には、複数の光束のうち０次回折光（実線で示す）、＋１次回折光（破線で示す）、及び−１次回折光（２点鎖線で示す）を代表的に示した。以下の説明において、回折光のうち＋１次回折光と−次回折光の一方または双方を指す場合に、単に１次回折光と表記する。

図２（Ａ）は、本実施形態に係る分岐部１３を示す図、図２（Ｂ）は分岐部１３の動作を示す図である。分岐部１３は、例えば音響光学モジュレータ（以下、ＡＯＭと略記する）などを含む光変調器（例、空間光変調器）である。分岐部１３は、音響光学媒体２２と、トランスデューサ２３ａと、トランスデューサ２３ｂと、トランスデューサ２３ｃとを備える。

音響光学媒体２２は、例えば石英ガラス、テルライトガラス、重フリントガラス、フリントガラスなどからなる角柱状の部材である。音響光学媒体２２は、照明光学系１１の光軸１１ａの周囲に一対の側面２２ａ、一対の側面２２ｂ、及び一対の側面２２ｃを有する。一対の側面２２ａ、一対の側面２２ｂ、及び一対の側面２２ｃは、それぞれ、互いに対向しかつ平行な２面を含み、例えば照明光学系１１の光軸と平行に配置される。側面２２ａが側面２２ｂとなす角度は例えば１２０°であり、側面２２ａが側面２２ｃとなす角度は例えば１２０°である。

音響光学媒体２２は、その内部に音波伝搬路Ｒを有する。音波伝搬路Ｒは、一対の側面２２ａの間の音波伝搬路Ｒａと、一対の側面２２ｂの間の音波伝搬路Ｒｂと、一対の側面２２ｃの間の音波伝搬路Ｒｃとを含む。音波伝搬路Ｒａ〜Ｒｃは、照明光学系１１の光軸の方向から見た場合に一部が重複している。以下、音波伝搬路Ｒａと音波伝搬路Ｒｂと音波伝搬路Ｒｃとがいずれも重複する部分は、照明光学系１１の光軸１１ａおよびその周囲に配置される。この重複部分の少なくとも一部は、光源部１０からの光が入射する入射領域Ｓａになっている。

トランスデューサ２３ａは、側面２２ａに設けられている。トランスデューサ２３ａは、例えば超音波トランスデューサであり、圧電体と、圧電体を挟んで形成された２つの電極とを備える。トランスデューサ２３ａは、一方の電極を介して音響光学媒体２２の側面２２ａに接合されている。トランスデューサ２３ａは、２つの電極の間に高周波の正弦波状の交流電圧（駆動信号）が印加されると、圧電体が厚み方向（側面２２ａの法線方向）に振動（伸縮）する。これにより、音波伝搬路Ｒａを往復する平面超音波が生じ、この平面超音波は、交流電圧の周波数が特定の周波数に設定されている場合に音波定在波（以下、定在波と略記する）となる。この定在波により、音波伝搬路Ｒａに粗密の周期的な分布（例、正弦波状の分布）が生じ、音響光学媒体２２のうち音波伝搬路Ｒａの部分は、超音波の伝搬方向と垂直な位相格子を持った位相型回折格子となる。以下、音波伝搬路Ｒａにおける超音波の伝搬方向を第１方向という。

トランスデューサ２３ｂは、側面２２ｂに設けられている。トランスデューサ２３ｂは、トランスデューサ２３ａと同様の構成であり、圧電体と、２つの電極とを備える。トランスデューサ２３ｂは、２つの電極の間に所定の周波数の正弦波状の交流電圧（駆動信号）が印加されることにより、音波伝搬路Ｒｂに定在波を発生させる。これにより、音波伝搬路Ｒｂは、超音波の伝搬方向と垂直な位相格子を持った位相型回折格子となる。以下、音波伝搬路Ｒｂにおける超音波の伝搬方向を第２方向という。第２方向は、第１方向と６０°の角度をなす方向である。

トランスデューサ２３ｃは、側面２２ｃに設けられている。トランスデューサ２３ｃは、トランスデューサ２３ａと同様の構成であり、圧電体と、２つの電極とを備える。トランスデューサ２３ｃは、２つの電極の間に所定の周波数の正弦波状の交流電圧（駆動信号）が印加されることにより、音波伝搬路Ｒｃに定在波を発生させる。これにより、音波伝搬路Ｒｃは、超音波の伝搬方向と垂直な位相格子を持った位相型回折格子となる。以下、音波伝搬路Ｒｃにおける超音波の伝搬方向を第３方向という。第３方向は、第１方向に対して第２方向と反対周りに６０°の角度をなす方向である。

分岐部１３は、駆動部２１により駆動される。駆動部２１は、電源回路２５およびスイッチ２６を備える。電源回路２５は、交流電源２７に接続されている。電源回路２５は、交流電源２７から供給される電力により駆動信号を生成する。電源回路２５は、制御装置４によって制御され、制御装置４から指定された周波数の駆動信号を生成する。電源回路２５は、生成した駆動信号をスイッチ２６に出力する。

スイッチ２６は、入力側の端子２８、及び出力側の端子２９ａ〜２９ｃを有する。スイッチ２６は、制御装置４に制御され、出力側の端子２９ａ〜２９ｃのうち制御装置４から指定された端子と、入力側の端子とを接続する（導通状態にする）。スイッチ２６は、例えばトランジスタなどを含み、入力側の端子２８と出力側の端子２９ａ〜２９ｃとの導通状態と絶縁状態とを、電気的に切替可能である。端子２９ａは、トランスデューサ２３ａの一方の電極に接続されている。端子２９ｂは、トランスデューサ２３ｂの一方の電極に接続されている。端子２９ｃは、トランスデューサ２３ｃの一方の電極に接続されている。なお、トランスデューサ２３ａ〜２３ｃにおいて、他方の電極は、駆動信号の基準電位（グランド）と接続されている。

電源回路２５から駆動信号がスイッチ２６の端子２８に供給され、かつ端子２８が端子２９ａと接続されている場合、この駆動信号によってトランスデューサ２３ａが駆動され、音波伝搬路Ｒａが位相型回折格子になる。この状態において、図２（ｂ）に示すように音波伝搬路Ｒａに入射した光は、回折により第１方向に分岐する。１次以上の回折光（例、±１次回折光）は、０次回折光に対して第１方向に偏向する。以下の説明において、１次以上の回折光が０次回折光に対して偏向する方向を回折方向という。

また、電源回路２５から駆動信号がスイッチ２６の端子２８に供給され、かつ端子２８が端子２９ｂと接続されている場合、音波伝搬路Ｒｂが位相型回折格子になり、入射領域Ｓａに入射した光は、回折により第２方向に分岐する。同様に、電源回路２５から駆動信号がスイッチ２６の端子２８に供給され、かつ端子２８が端子２９ｃと接続されている場合、音波伝搬路Ｒｃが位相型回折格子になり、入射領域Ｓａに入射した光は、回折により第３方向に分岐する。

このような分岐部１３は、周期構造（音響光学媒体２２の密度の周期）のピッチ（密度の極大位置の間隔）を、定在波の周波数に応じて変化させることができる。また、分岐部１３は、音波伝搬路Ｒａ〜Ｒｃのいずれを有効にするか（定在波により周期構造にするか）を、スイッチ２６によって電気的に選択（切替）可能である。分岐部１３は、０次回折光に対する±１次回折光の偏向方向（回折方向）を電気的に切り替えることができる。

なお、分岐部１３は、駆動部２１の少なくとも一部を含んでもよい。また、分岐部１３は、周期構造が固定の回折格子を含んでいてもよい。このような回折格子としては、例えば、石英板に溝を複数本切った石英格子などが挙げられる。このような回折格子により回折方向を変化させるには、例えば、光源部１０からの光と交差する面内で回折格子を回転させればよい。また、分岐部１３は、空間光変調器として、ＡＯＭの代わりに液晶素子などを用いたものでもよい。

図１の説明に戻り、照明光学系１１は、分岐部１３の光出射側に、レンズ３０、位相調整部１４、レンズ３１、視野絞り３２、レンズ３３、フィルタ３４、ダイクロイックミラー３５、及び対物レンズ３６を備える。

図３は、分岐部１３から視野絞り３２までの光路を示す図である。分岐部１３で発生した回折光は、レンズ３０に入射する。レンズ３０は、例えば、その前側焦点位置が分岐部１３の位置とほぼ一致するように、配置される。分岐部１３で分岐した複数の光束のうち同じ次数の回折光を同じ位置に集光し、いわゆる瞳共役面Ｐ１を形成する。例えば、レンズ３０は、分岐部１３で発生した０次回折光（図３に実線で示す）を、照明光学系１１の光軸１１ａ上（前側焦点位置）に集光する。レンズ３０は、分岐部１３で発生した＋１次回折光（図３に破線で示す）を、照明光学系１１の光軸１１ａから離れた位置に集光する。レンズ３０は、分岐部１３で発生した−１次回折光（図３に２点鎖線で示す）を、照明光学系１１の光軸１１ａに関して＋１次回折光と対称的な位置に集光する。

位相調整部１４は、干渉縞の生成に使われる回折光を通し、干渉縞の生成に使われない回折光を遮断する。２Ｄ−ＳＩＭモードにおいて、照明光学系１１は、例えば、＋１次回折光と−１次回折光との干渉縞を生成し、０次回折光および２次以上の回折光を干渉縞の生成に用いない。位相調整部１４は、２Ｄ−ＳＩＭモードにおいて、１次回折光を通し、０次回折光および２次以上の回折光を遮断する。３Ｄ−ＳＩＭモードにおいて、照明光学系１１は、例えば、＋１次回折光と−１次回折光との干渉縞と、０次回折光と１次回折光との干渉縞との合成縞を生成する。位相調整部１４は、３Ｄ−ＳＩＭモードにおいて、０次回折光および１次回折光を通し、２次以上の回折光を遮断する。

また、位相調整部１４は、分岐部１３によって分岐された複数の光束の少なくとも１つの光束の位相を変化させる。位相調整部１４は、干渉縞の生成に使われる回折光の位相を適宜調整する。例えば、位相調整部１４は、３Ｄ−ＳＩＭモードにおいて、０次回折光と１次回折光との相対的な位相を調整する（変化させる）。なお、位相調整部１４は、２Ｄ−ＳＩＭモードにおいて、＋１次回折光と−１次回折光との相対的な位相を調整してもよいし、調整しなくてもよい。

位相調整部１４は、０次回折光の光路と１次回折光の光路とが分離する位置に配置される。位相調整部１４は、例えば、瞳共役面Ｐ１に配置される。瞳共役面Ｐ１は、瞳面Ｐ０（対物レンズ３６の後側焦点面）と光学的に共役な面である。位相調整部１４は、例えば、レンズ３０の後側焦点位置に配置される。本実施形態に係る位相調整部１４は、マスク４０、位相変調器４１、補正ブロック４２、及び駆動部４３を備える。マスク４０および位相変調器４１は、干渉縞に使われない光を遮断する。位相変調器４１および補正ブロック４２は、０次回折光と１次回折光との相対的な位相を変化させることができる。

位相変調器４１は、照明光学系１１の光軸１１ａ上に配置されている。位相変調器４１は、０次回折光が集光する位置に配置されている。位相変調器４１は、例えば、入射光（ここでは０次回折光）の位相を時間方向にかけて変調幅πで変調する。位相変調器４１は、例えば、カー効果を利用した電気光学モジュレータ（以下、ＥＯＭと略記する）、ポッケルス効果を利用したＥＯモジュレータ、またはＡＯＭを含む。

ところで、位相変調器４１において０次回折光が通る部分は、例えば雰囲気ガスと異なる屈折率であり、雰囲気ガス中の光路と光学的距離が異なる。そのため、位相変調器４１を通った０次回折光は、位相変調器４１の代わりに雰囲気ガス中を通る場合に比べて、位相のオフセットが加わる。補正ブロック４２は、このオフセットにより生じる０次回折光と１次回折光との位相差の少なくとも一部を相殺する。補正ブロック４２は、−１次回折光が集光する位置と＋１次回折光が集光する位置のそれぞれに設けられている。補正ブロック４２は、１次回折光が透過する材質の部材である。補正ブロック４２内の光路の光学的距離は、例えば、位相変調器４１による位相変調量が基準値（例、下限値）である状態における、位相変調器４１内の光路の光学的距離とほぼ同じに設定される。

位相変調器４１は、駆動部４３に駆動される。駆動部４３は、電源回路２５および位相調整回路４４を含む。電源回路２５は、例えば分岐部１３の駆動部２１と共用であるが、駆動部２１と別に設けられていてもよい。駆動部４３は、制御装置４に制御され、位相変調器４１を制御する。位相変調器４１を用いた位相の調整については、３Ｄ−ＳＩＭモードの説明とともに後述する。

図４（Ａ）〜図４（Ｃ）は、それぞれ、照明光学系１１の光軸の方向から見たマスク４０の例を示す図である。図４（Ａ）〜図４（Ｃ）に示すマスク４０は、それぞれ、いわゆる開口絞りである。マスク４０は、試料Ｘに入射する光線の角度を規定する。マスク４０は、例えば、瞳共役面Ｐ１（開口絞りの位置）に配置される。

図４（Ａ）のマスク４０は、開口部４０ａ〜４０ｃを有する。開口部４０ａは、０次回折光が入射する位置に配置される。開口部４０ａには、位相変調器４１が設けられている。例えば、位相変調器４１は、マスク４０を支持基板とし、開口部４０ａの内側に配置される。位相変調器４１は、例えば、０次回折光を通す状態と遮断する状態とを切り替えるシャッタ部を兼ねている。開口部４０ｂは、＋１次回折光が入射する位置に配置され、開口部４０ｃは、−１次回折光が入射する位置に配置される。補正ブロック４２は、開口部４０ｂに設けられている。例えば、補正ブロック４２は、マスク４０を支持基板とし、開口部４０ｂの内側と開口部４０ｃの内側のそれぞれに配置される。

なお、図４（Ａ）においては、分岐部１３による回折方向が第１方向に設定されている状態であり、回折方向を切り替えた場合、マスク４０において１次回折光が入射する位置は、照明光学系１１の光軸１１ａの周りで回転した位置に切り替わる。回折方向を切り替える場合、マスク４０は、照明光学系１１の光軸１１ａの周りで回転可能に設けられ、１次回折光が入射する位置に開口部４０ｂおよび開口部４０ｃが配置されるように駆動される。

図４（Ｂ）のマスク４０は、開口部４０ａ〜４０ｇを有する。開口部４０ｄおよび開口部４０ｅは、例えば、回折方向が第２方向に設定されている場合に、１次回折光が入射する位置に配置されている。開口部４０ｄおよび開口部４０ｅは、例えば、開口部４０ｂおよび開口部４０ｃを照明光学系１１の光軸１１ａの周りで６０°回転させた位置に配置される。開口部４０ｆおよび開口部４０ｇは、例えば、回折方向が第３方向に設定されている場合に、１次回折光が入射する位置に配置されている。開口部４０ｆおよび開口部４０ｇは、例えば、開口部４０ｂおよび開口部４０ｃを照明光学系１１の光軸１１ａの周りで−６０°回転させた位置に配置される。このマスク４０を用いる場合、補正ブロック４２は、例えば開口部４０ａ〜４０ｇのそれぞれに設けられる。このマスク４０は、回折方向が第１方向、第２方向、第３方向のいずれに設定される場合にも１次回折光を通すことができる。そのため、マスク４０を回折方向に応じて回転させる機構を省略できる。

図４（Ｃ）のマスク４０は、円環枠状であり、開口部４０ｈを有する。開口部４０ｈには、位相変調器４１および補正ブロック４２が設けられている。例えば、位相変調器４１は、光軸を含む領域に設けられ、また、補正ブロック４２は、位相変調器４１と、開口部４０ｈを規定するエッジ（開口部４０ｈの内側側面）とに接するように設けられる。つまり、補正ブロック４２は、マスク４０に支持され、位相変調器４１は、補正ブロック４２に支持されていてもよい。このマスク４０は、回折方向が第１方向、第２方向、第３方向のいずれに設定される場合にも１次回折光を通すことができる。そのため、マスク４０を回折方向に応じて回転させる機構を省略できる。なお、マスク４０は、円環枠状の部分から内側に延びて位相変調器４１を支持するステイを含んでいてもよい。このステイは、例えば、回折方向が第１方向、第２方向、第３方向のいずれに設定される場合にも１次回折光が入射しない位置に配置される。

なお、位相変調器４１と補正ブロック４２の少なくとも一方は、マスク４０と別の部材に支持されていてもよいし、マスク４０に支持されていなくてもよい。位相変調器４１へ電力と信号を供給する配線、ケーブル等は、マスク４０に支持されていてもよいし、マスク４０以外の部材に支持されていてもよい。また、位相調整部１４は、マスク４０を含んでいなくてもよく、例えば、マスク４０は照明光学系１１に含まれていてもよい。なお、位相変調器４１は、０次回折光の通過と遮断とを切り替え可能なシャッタ部を兼ねていなくてもよい。このようなシャッタ部は、位相変調器４１と別に設けられていてもよいし、照明光学系１１に含まれていてもよい。

図１の説明に戻り、位相調整部１４を通った光は、レンズ３１に入射する。レンズ３０およびレンズ３１は、分岐部１３と光学的に共役な面（以下、中間像面３１ａという）を形成する。視野絞り３２は、例えば中間像面３１ａに配置される。視野絞り３２は、照明光学系１１の光軸１１ａに垂直な面内において、照明光学系１１から試料Ｘに光が照射される範囲（照野、照明領域）を規定する。視野絞り３２を通った光は、レンズ３３に入射する。レンズ３３は、分岐部１３から射出された＋１次回折光を瞳面Ｐ０（対物レンズ３６の後側焦点面）において、光軸１１ａから離れた位置に集光する。また、レンズ３３は、分岐部１３上から射出された−１次回折光を、瞳面Ｐ０（対物レンズ３６の後側焦点面）において、照明光学系１１の光軸に関して＋１次回折光と対称的な位置に集光する。

レンズ３３を通った光は、フィルタ３４に入射する。フィルタ３４は、例えば励起フィルタである。フィルタ３４は、試料Ｘに含まれる蛍光物質の励起波長を含む波長帯の光が選択的に通る特性を有する。フィルタ３４は、例えば、光源部１０からの光のうち励起波長以外の波長の少なくとも一部、迷光、外光などを遮断する。フィルタ３４を通った光は、ダイクロイックミラー３５に入射する。ダイクロイックミラー３５は、試料Ｘに含まれる蛍光物質の励起波長を含む波長帯の光が反射し、試料Ｘからの光のうち所定の波長帯の光（例、蛍光）が通る特性を有する。フィルタ３４からの光は、ダイクロイックミラー３５で反射し、対物レンズ３６に入射する。

対物レンズ３６およびレンズ３３は、中間像面３１ａと光学的に共役な面、すなわち分岐部１３と光学的に共役な面を形成する。上述したように、＋１次回折光は、対物レンズ３６の瞳面Ｐ０上で光軸１１ａから離れた位置に集光される。また、−１次回折光は、瞳面Ｐ０において、光軸１１ａに関して＋１次回折光と対称的な位置に集光される。

試料Ｘは、観察時に、その観察対象の部分が対物レンズ３６の前側焦点面に配置される。試料Ｘには、＋１次回折光と−１次回折光との干渉により干渉縞が形成される。この干渉縞は、例えば、照明光学系１１の光軸１１ａに垂直な方向に光強度の周期的な分布を有する。この干渉縞は、分岐部１３による回折方向に応じた方向に周期的に並ぶ明部および暗部を含む。試料Ｘのうち干渉縞の明部に配置されている部分は、蛍光物質が励起されて、蛍光を発する。この蛍光の像は、照明光学系１１が形成する干渉縞と、試料Ｘにおける蛍光物質の分布のパターン（以下、試料パターンという）とのモアレ像（変調像）である。撮像装置３は、このモアレ像（変調像）の画像を取得する。

撮像装置３は、撮像光学系５０（結像光学系）および撮像素子５１を備える。撮像光学系５０は、対物レンズ３６、ダイクロイックミラー３５、フィルタ５２、及びレンズ５３を備える。撮像光学系５０は、対物レンズ３６およびダイクロイックミラー３５を照明光学系１１と共用している。試料Ｘからの光（観察光）は、対物レンズ３６に入射して平行化され、ダイクロイックミラー３５を通ってフィルタ５２に入射する。

フィルタ５２は、例えば蛍光フィルタである。フィルタ５２は、試料Ｘからの光のうち所定の波長帯の光（例、蛍光）が選択的に通る特性を有する。フィルタ５２は、例えば、照明光学系１１から試料Ｘに照射され試料Ｘで反射した光、外光、迷光などを遮断する。フィルタ５２を通った光は、レンズ５３に入射する。レンズ５３および対物レンズ３６は、対物レンズ３６の前側焦点面（物体面）と光学的に共役な面（像面）を形成する。試料Ｘからの蛍光による像（モアレ像）は、この像面に形成される。

撮像素子５１（撮像部）は、撮像光学系５０により形成された試料Ｘの像を撮像する。撮像素子５１は、例えばＣＣＤイメージセンサやＣＭＯＳイメージセンサなどの二次元イメージセンサを含む。撮像素子５１は、例えば、二次元的に配列された複数の画素を有し、各画素にフォトダイオードなどの光電変換素子が配置された構造である。撮像素子５１は、例えば、試料Ｘからの光により光電変換素子に蓄積された電荷をデジタルデータに変換し、デジタル形式の画像データを出力する。撮像素子５１による１フレーム当たりの電荷蓄積時間は、例えば約１／３０秒、約１／６０秒などである。

ところで、モアレ像の空間周波数は、試料パターンの空間周波数と、照明光学系１１が形成する干渉縞の空間周波数との差に相当し、試料パターンの空間周波数よりも低い。そのため、撮像光学系５０の解像限界内で取得したモアレ像を復調すると、撮像光学系５０の解像限界を超えた解像度の試料Ｘの像（超解像画像）が得られる。制御装置４は、例えば、超解像画像を表示装置５に表示させる。

顕微鏡装置１は、撮像装置３が取得した画像を使って復調処理を行う復調部５５を備える。復調部５５は、例えば、制御装置４に設けられるが、制御装置４と別に設けられていてもよい。復調部５５は、干渉縞の向きおよび方向が互いに異なる状態で撮像された、複数の変調像を用いて、復元画像を生成することができる。復調部５５は、例えば、米国特許番号８１１５８０６号明細書に開示された方法で復調処理を行ってもよいが、この方法に限られない。

また、制御装置４は、顕微鏡装置１の各部を制御する制御部５６を備える。制御部５６は、分岐部１３による音波定在波の生成、位相調整部１４による位相の変化（調整）、及び撮像素子５１による撮像を制御する。制御部５６は、図２（Ａ）に示した分岐部１３のスイッチ２６を制御して、回折方向を切り替えることで、干渉縞の周期方向を変更する。また、制御装置４は、電源回路２５を制御して、干渉縞の位相を変更する。以下、干渉縞の位相を制御する仕組みについて説明する。

図５は、分岐部１３の音波伝搬路Ｒにおける屈折率の分布の時間変化を示す図である。図５には、音波伝搬路の屈折率が均一になる時刻ｔをｔ＝０とし、定在波の腹の振動の１周期をＴとし、時刻ｔ＝０からＴ／８ごとの各時刻における屈折率の分布を示した。周期Ｔは、分岐部１３に供給される交流電圧の周波数の逆数に相当する。各時刻において、横軸は音波伝搬路の伝搬方向における位置を示し、縦軸は屈折率を示す。音波伝搬路の伝搬方向において、屈折率が時間変化しない節の位置を丸印で示し、２つの節の間の１つの腹の位置を符号ａで示し、腹ａの隣の腹の位置を符号ｂで示した。

腹ａの屈折率は、時刻ｔ＝０から増加し、時刻ｔ＝２Ｔ／８において極大になる。腹ａの屈折率は、時刻ｔ＝２Ｔ／８から減少し、時刻ｔ＝４Ｔ／８において時刻ｔ＝０と同じ値になり、時刻ｔ＝６Ｔ／８において極小になる。腹ａの屈折率は、時刻ｔ＝６Ｔ／８から増加し、時刻ｔ＝８Ｔ／８において時刻ｔ＝０と同じ値になる。以下の説明において、時刻ｔ＝０から時刻ｔ＝４Ｔ／８の期間を前半期、時刻ｔ＝４Ｔ／８から時刻ｔ＝８Ｔ／８の期間を後半期という。腹ａの屈折率は、前半期において節の屈折率以上になり、後半期において節の屈折率以下になる。

腹ｂの屈折率は、腹ａの屈折率と反対の挙動を示す。腹ｂの屈折率は、時刻ｔ＝０から減少し、時刻ｔ＝２Ｔ／８において極小となった後に増加に転じて、時刻ｔ＝４Ｔ／８において時刻ｔ＝０と同じ値になる。また、腹ｂの屈折率は、時刻ｔ＝４Ｔ／８から増加し、時刻ｔ＝６Ｔ／８において極大となった後に減少に転じて、時刻ｔ＝８Ｔ／８において時刻ｔ＝０と同じ値になる。腹ｂの屈折率は、前半期において節の屈折率以下になり、後半期において節の屈折率以上になる。

次に、定在波のパターンと干渉縞との関係について説明する。図６は、ある時刻における定在波のパターンと、１次回折光の干渉縞との対応を示す概念図である。図６の上図において、定在波により屈折率が節の屈折率以下になる部分を明部で示し、定在波により屈折率が節の屈折率以上になる部分を暗部で示した。その１つの暗部ピークから明部を経て次の暗部ピークまでを１つの波とし、その数を定在波の波本数という。また、干渉縞において、１つの暗部と１つの明部との組を１本の縞とし、その数を干渉縞の縞本数という。＋１次回折光と−１次回折光との干渉縞の場合、干渉縞の縞本数は、定在波の波本数の２倍になる。

図６の下図において、ｆ_−１、ｆ_０、ｆ_＋１、の波はそれぞれ分岐部１３を周波数ｆ_−１、ｆ_０、ｆ_＋１で駆動したときの定在波を示す。また、符号Ｌは、音波伝搬路Ｒの長さを示す。定在波の波本数を２、（２＋１／２）、３のように１／２ずつ変化させると、干渉縞の縞本数は４、５、６のように１ずつ変化する。ここで、音波伝搬路Ｒの一端からＬ／２だけずれた部分（図６に白矢印で示す）に対応する干渉縞の位相は、周波数ｆ_−１の場合に周波数ｆ_０の場合よりも−πずれており、周波数ｆ_＋１の場合に周波数ｆ_０の場合よりもπずれている。また、音波伝搬路Ｒの一端からＬ／３だけずれた部分（図６に黒矢印で示す）に対応する干渉縞の位相は、周波数ｆ_−１の場合に周波数ｆ_０の場合よりも−２π／３ずれており、周波数ｆ_＋１の場合に周波数ｆ_０の場合よりも２π／３ずれている。そのため、図２（Ａ）に示した入射領域Ｓａの位置を音波伝搬路Ｒの端からＬ／３だけずれた位置に設定した場合、駆動信号の周波数をｆ_−１、ｆ_０、ｆ_＋１とで切り替えることにより、干渉縞の位相を３通りに設定できる。

例えば、試料Ｘ上の縞本数を２００にする場合、分岐部１３における波本数は１００となり、音波伝搬路Ｒの長さ（Ｌ）を３０ｍｍとすると、駆動信号の周波数（例、ｆ_０）は、８０ＭＨｚになる。このような基準状態に対して、縞本数を１減らす場合、分岐部１３における波本数は９９．５となり、駆動信号の周波数（例、ｆ_−１）は、７９．９４６ＭＨｚになる。このような周波数の駆動信号により分岐部１３を駆動すると、試料Ｘ上の干渉縞の位相が−２π／３だけシフトする。また、基準状態に対して縞本数を１増やす場合、分岐部１３における波本数は１００．５となり、駆動信号の周波数（例、ｆ_＋１）は、８０．０５４ＭＨｚになる。このような周波数の駆動信号により分岐部１３を駆動すると、試料Ｘ上の干渉縞の位相が＋２π／３だけシフトする。

図７（Ａ）は、音波伝搬路Ｒにおける光の入射領域Ｓａを示す図、図７（Ｂ）は、波本数の変化に伴う干渉縞のずれを示す図である。入射領域Ｓａは、光源部１０からの光により音波伝搬路Ｒに形成されるスポットに相当する。入射領域Ｓａの中心は、例えば、音波伝搬路Ｒの端から距離Ｄ（例、Ｄ＝Ｌ／３）だけ離れた位置に設定される。図７（Ｂ）に示すように、定在波の波本数が１／２変化すると、試料Ｘに形成される干渉縞Ｓｂの縞本数が１変化し、明部と暗部の位置がずれる。なお、図７（Ｂ）では、波本数の変更前（縞本数のずれが０）の干渉縞Ｓｂのパターンを破線で示し、波本数の変更後の干渉縞Ｓｂのパターンを実線で示し、双方の差を強調して示した。

音波伝搬路Ｒの長さＬは、例えば干渉縞Ｓｂの縞本数のずれが許容値以下となるように、入射領域Ｓａの径φに比べて十分に大きく設定される。例えば、音波伝搬路Ｒの長さＬと、入射領域Ｓａの径φとは、干渉縞Ｓｂの縞本数のずれの許容量δに対して、φ／Ｌ＜δの関係を満たすように設定される。

画像の復元処理では複数の周波数成分を画像として重ね合わせており、その際の各周波数成分の持つ位相はできるだけ一致している必要がある。その誤差の許容値を、例えば、０．５ラジアンであるとする。これは縞本数に換算すると０．０７９本となる。視野中央の位置が上述のように音波伝搬路Ｒの端からの距離Ｄ（Ｄ＝Ｌ／３）となるように音波伝搬路Ｒが設置されている場合には、図７（Ｂ）に示す中央部での干渉縞Ｓｂのずれを縞本数に換算した値ｄｐ０は無視できると考えてよいが、その場合の視野端におけるずれｄｐ１は両端においてほぼ等しく、それぞれ逆方向となる。各々が上述の０．０７９本以内となっている必要があることから、視野全体における干渉縞Ｓｂの縞本数のずれの許容値δはその２倍の０．１５本となる。ここでは小数第３位を切り捨てた。

一方、音波伝搬路Ｒ全体で音波の波本数が０．５変化するのであるから干渉縞Ｓｂの縞本数変化は音波伝搬路Ｒ全体に対応する範囲で１変化することになる。従って、入射領域Ｓａの径φの範囲内では干渉縞Ｓｂの縞本数変化２ｄｐ１はφ／Ｌに等しくなる。従って、φ／Ｌ≦０．１５を満たす必要がある。例えば、入射領域Ｓａの径φを４ｍｍとし、音波伝搬路Ｒの長さＬを３０ｍｍとすると、φ／Ｌ＝０．１３３であり、上述の条件を満たすことができる。

ところで、分岐部１３に音響光学モジュールを用いる場合、定在波の各位置における屈折率は、図５に示したように前半期と後半期とで変化する。図８は、前半期および後半期のそれぞれの定在波と干渉縞を示す図である。図８に示すように、定在波の後半期のパターンは、定在波の前半期のパターンと位相がπずれた状態になる（図５参照）。−１次回折光と＋１次回折光との干渉縞である場合、定在波の波本数に対して干渉縞の縞本数が２倍になるので、干渉縞の後半期のパターンは、前半期のパターンに対して位相が２πずれた状態になる。そのため、前半期の明部の部分は、後半期には、位相が２πずれた明部になり、前半期の暗部の部分は、後半期には、位相が２πずれた暗部になる。このように、２Ｄ−ＳＩＭモードでは、干渉縞の位相が前半期と後半期とで実質的に変化しない。

次に、顕微鏡装置１の動作に基づいて、２Ｄ−ＳＩＭモードにおける観察方法について説明する。図９は、２Ｄ−ＳＩＭモードにおける顕微鏡装置１の動作を示すフローチャートである（顕微鏡装置１の各部については図１〜図３参照）。ステップＳ１１において、制御装置４の制御部５６は、スイッチ２６を制御し、スイッチ２６の接続先をトランスデューサ２３ａに設定する。これにより、干渉縞Ｓｂの周期方向は、第１方向に対応する方向に設定される。

ステップＳ１２において、制御部５６は、電源回路２５を制御して駆動信号の周波数をｆ_−１に設定する。これにより、干渉縞Ｓｂの位相のシフト量は、−２π／３に設定される。ステップＳ１３において、制御部５６は、位相のシフト量が−２π／３に設定された状態で、撮像装置３を制御して試料Ｘを撮像させ、画像データＩ_−１を取得する。

ステップＳ１４において、制御部５６は、電源回路２５を制御して駆動信号の周波数をｆ_０に設定する。これにより、干渉縞Ｓｂの位相のシフト量は、０に設定される。ステップＳ１５において、制御部５６は、位相のシフト量が０に設定された状態で、撮像装置３を制御して試料Ｘを撮像させ、画像データＩ_０を取得する。

ステップＳ１６において、制御部５６は、電源回路２５を制御して駆動信号の周波数をｆ_＋１に設定する。これにより、干渉縞Ｓｂの位相のシフト量は、＋２π／３に設定される。ステップＳ１７において、制御部５６は、位相のシフト量が＋２π／３に設定された状態で、撮像装置３を制御して試料Ｘを撮像させ、画像データＩ_＋１を取得する。以上のようにして、顕微鏡装置１は、干渉縞の周期方向を第１方向に設定しつつ、位相を３通りに切り替えて、３枚の画像を取得する。

ステップＳ１８において、制御部５６は、干渉縞Ｓｂの周期方向を３方向の全てに設定済みであるか否かを判定する。制御部５６は、干渉縞の３つの周期方向に応じた撮像が完了していないと判定した場合（ステップＳ１８；Ｎｏ）、ステップＳ１９において、スイッチ２６の接続先を次のトランスデューサに切り替える。また、ステップ１９の処理の終了後に、制御部５６は、干渉縞の周期方向を変更した状態（例、第２方向）で、ステップＳ１２からステップＳ１７の処理を繰り返し、この周期方向に応じた画像データを取得する。また、制御部５６は、干渉縞の周期方向に応じた撮像が完了したと判定した場合（ステップＳ１８；Ｙｅｓ）、一連の処理を終了する。

このように、顕微鏡装置１は、３方向のそれぞれについて３枚の画像を取得し、合計９枚の画像を取得する。また、制御装置４の復調部５５は、取得された画像データを使って復調処理を実行し、超解像画像のデータを生成する。制御装置４は、例えば、超解像画像のデータを図示略の記憶装置に記憶させる。また、制御装置４は、例えば、超解像画像を表示装置５に記憶させる。

次に、３Ｄ−ＳＩＭモードについて説明する。図１０は、３Ｄ−ＳＩＭモードにおける光源部１０から試料Ｘまでの光路を示す図である。図１０においては、図を見やすくするために試料Ｘから撮像素子５１までの光路を省略したが、撮像装置３は、図１と同様に試料Ｘを撮像する。３Ｄ−ＳＩＭモードにおいて、構造化照明装置２は、＋１次回折光と−１回折光との干渉縞、＋１次回折光と０次回折光との干渉縞、及び−１次回折光と０次回折光との干渉縞が合成された合成干渉縞を形成する。この合成干渉縞は、照明光学系１１の光軸１１ａに垂直な２方向と、光軸１１ａに平行な１方向との合計３方向に周期構造を有する。

図１１は、分岐部１３から視野絞り３２までの光路、及び駆動信号を示す図である。３Ｄ−ＳＩＭモードにおいて、制御装置４（制御部５６）は、位相調整部１４を制御することにより、０次回折光と１次回折光との相対的な位相を調整する。まず、撮像の１フレームの期間（１フレーム内の露光期間）における位相の調整について説明する。

図１２は、前半期と後半期のそれぞれにおける、定在波、位相の調整前後の０次回折光と１次回折光との干渉縞を示す図である。上述のように定在波は、前半期と後半期とで位相がπずれた関係になる。０次回折光と１次回折光との干渉縞の場合、次数の差が１であるので、干渉縞の縞本数は、波本数の１倍になる。そのため、図１２の調整前干渉縞（前半期、後半期）のように、干渉縞は、前半期と後半期とで位相がπずれる。位相の調整を行わないで前半期と後半期とにわたって試料Ｘを照明した場合、得られる画像はコントラストが低下する。例えば、撮像の１フレームに含まれる前半期の総露光量と後半期の総露光量が同じである場合、０次回折光と１次回折光との干渉縞による構造化照明に関する限り、得られる画像は均一な照明を標本に照射した際に得られる画像になる。

そこで、位相調整部１４は、０次回折光と１次回折光との相対的な位相（位相差）を、前半期と後半期とで異なる値に調整する。相対的な位相を調整しない場合、前半期における干渉縞の強度分布は下記の式（１）で表され、後半期の干渉縞の強度分布は、下記の式（２）で表される。
Ii(r)=I0+2I+4・√I0・√I・cos(kxX)・cos(kzZ)+2・I・cos(2kxX) ・・・（１）
Ii(r)=I0+2I+4・√I0・√I・cos(kxX+π)・cos(kzZ)+2・I・cos(2kxX+2π)・・・（２）

式（１）および式（２）において、Ｘは、位相型回折格子のピッチ方向（周期方向）に対応した方向の位置を示し、Ｚは、照明光学系１１の光軸１１ａに平行な方向の位置を示す。I0は、０次回折光の強度を示し、Iは、±１次回折光の強度を示し、kx、kzは、それぞれＸ方向、Ｚ方向の波数を示す。式（１）、（２）における第１項は、０次回折光の強度であり、第２項は、＋１次回折光の強度と−１次回折光の強度との和であり、第３項は、±１次回折光と０次回折光との間の干渉強度分布であり、第４項は、±１次回折光同士の干渉強度分布である。式（１）と式（２）との間では、第３項のみが異なる。

ここで、説明の便宜上、前半期における０次回折光の位相調整量をπとし、後半期における０次回折光の位相調整量を０とし、＋１次回折光および−１次回折光については前半期および後半期の位相調整量を０とする。この場合、前半期の干渉縞の強度分布は、下記の式（３）で表される。この式（３）は、上記の式（２）と等価であり、位相調整後の前半期の干渉縞のパターンは、後半期の干渉縞のパターンと同じになる（図１２の調整後干渉縞参照）。なお、実施形態に係る位相調整量は、上記のように０でもよい。
Ii(r)=I0 +2I+4・√I0・√I・cos(kxX+π)・cos(kzZ)+2・I・cos(2kxX）・・・（３）

図１１の説明に戻り、制御装置４は、電源回路２５を制御して、スイッチ２６に対して駆動信号ＤＷ１を供給させ、かつ位相調整回路４４に対して駆動信号ＤＷ２を供給させる。電源回路２５は、例えば、駆動信号ＤＷ１と駆動信号ＤＷ２の周波数を同じにする。駆動信号ＤＷ１は、スイッチ２６を介して、分岐部１３に供給される。駆動信号ＤＷ１は、例えば正弦波状の電圧波形である。

駆動信号ＤＷ２は、位相調整回路４４を介して、位相調整部１４の位相変調器４１に供給される。位相調整回路４４は、制御装置４（制御部５６）に制御され、駆動信号ＤＷ２の位相を調整する。駆動信号ＤＷ２は、例えば矩形波状である。駆動信号ＤＷ２のローレベル（Ｌ）は、グランド電位などの基準電位であり、例えば位相変調器４１の電気光学物質に電界を印加しない電位である。ここでは、位相変調器４１の電気光学物質に電界が印加されていない状態の位相調整量が０であるものとし、電気光学物質の屈折率による位相調整量（補正ブロック４２により相殺されるオフセット）を無視する。駆動信号ＤＷ２のハイレベル（Ｈ）は、ローレベル時と比較して０次回折光にπの位相を付与するように、電気光学物質に電界を印加するレベルである。駆動信号ＤＷ２は、駆動信号ＤＷ１のレベルが基準電位（例、グランド電位）に対して正電位に変化する際にＨに立ち上がり、駆動信号ＤＷ１のレベルが基準電位から負電位に変化する際にＬに立ち下がる波形である。駆動信号ＤＷ２は、駆動信号ＤＷ１のレベルが正電位である期間にＨに維持され、駆動信号ＤＷ１のレベルが負電位である期間にＬに維持される。

駆動信号ＤＷ１は、信号レベルがＨに立ち上がってから次にＨに立ち上がるまでを１周期のパルスとして、例えば撮像の１フレームに複数周期のパルスを含む。駆動信号ＤＷ１の周期がＴである場合、駆動信号ＤＷ２の周期はＴであり、前半期にＨとなり後半期にＬとなる。なお、０次回折光と１次回折光との相対的な位相を、前半期と後半期とでπだけ変化させる場合、駆動信号ＤＷ２は、前半期にＬとなり後半期にＨとなる波形であってもよい。

次に、撮像の複数のフレームにおける位相の調整について説明する。３Ｄ−ＳＩＭモードにおいて１枚の超解像画像を生成するには、一般的に、干渉縞の向きを３通りに変化させ、干渉縞の各向きに対して干渉縞の位相を５通りに変化させて、１５状態の干渉縞のそれぞれを用いた撮像が行われる。位相を５通りに変化させるには、例えば、分岐部１３において、入射領域Ｓａを音波伝搬路Ｒの端からＬ／５の位置に設定し、波本数を５通りに変化させる手法がある。この手法においては、３Ｄ−ＳＩＭモード用の光変調器が必要になり、その入射領域Ｓａに対して音波伝搬路Ｒが大型になる。また、２Ｄ−ＳＩＭモードと３Ｄ−ＳＩＭモードとで光変調器を交換する必要が生じる。

本実施形態に係る構造化照明装置２は、０次回折光と１次回折光の相対的な位相を、撮像の複数のフレームのうち第１フレームと第２フレームとで変化させることにより、干渉縞の位相をシフトさせることができる。これにより、例えば、２Ｄ−ＳＩＭモードと３Ｄ−ＳＩＭモードとで分岐部１３を共用にすることができる。

図１３は、複数のフレームにおける駆動信号、定在波、及び干渉縞を示す説明図である。制御装置４（制御部５６）は、電源回路２５を制御し、撮像の第１フレームの期間において、分岐部１３に対して駆動信号ＤＷ１を供給させる。また、制御部５６は、撮像の第２フレームの期間において、周波数および位相が第１フレームと同じ駆動信号（例、駆動信号ＤＷ１）を分岐部１３に供給させる。すなわち、第１フレームにおける駆動信号は、第１フレームの開始時刻を基準として所定のタイミングで負電位から正電位に変化し、第２フレームにおける駆動信号は、第２フレームの開始時刻を基準として所定のタイミングで負電位から正電位に変化する。なお、図１３において、所定のタイミングは、各フレームの開始時刻と同時であるが、各フレームの開始時刻からずれていてもよい。

制御部５６は、電源回路２５および位相調整回路４４を制御して、撮像の第１フレームの期間において、位相調整部１４の位相変調器４１に対して駆動信号ＤＷ２を供給させる。また、制御部５６は、電源回路２５および位相調整回路４４を制御して、撮像の第２フレームの期間において、第１フレームと異なる駆動信号ＤＷ３を位相変調器４１に供給させる。

図１３において、駆動信号ＤＷ３は、駆動信号ＤＷ２と位相が同じである。駆動信号ＤＷ２は、第１フレームの開始時刻を基準として所定のタイミングで立ち上がり、駆動信号ＤＷ３は、第２フレームの開始時刻を基準として所定のタイミングで立ち上がる。また、駆動信号ＤＷ１と比較すると、第１フレームにおいて、駆動信号ＤＷ１は、第１フレームの開始時刻から所定のタイミングで負電位から正電位に変化し、駆動信号ＤＷ２は、第１フレームの開始時刻から所定のタイミングで立ち上がる。第２フレームにおいて、駆動信号ＤＷ１は、第２フレームの開始時刻から所定のタイミングで負電位から正電位に変化し、駆動信号ＤＷ３は、第２フレームの開始時刻から所定のタイミングで立ち上がる。なお、図１３において、所定のタイミングは、各フレームの開始時刻と同時であるが、各フレームの開始時刻からずれていてもよい。

図１３において、駆動信号ＤＷ３は、駆動信号ＤＷ２と電圧値が異なる。第１フレームにおける駆動信号ＤＷ２は、信号のレベルがローレベル（Ｌ）と第１ハイレベル（Ｈ１）とで切り替わる波形である。Ｈ１は、Ｌと比較して、位相変調器４１による位相の調整量がπ変化するレベルである。第２フレームにおける駆動信号ＤＷ３は、レベルがＨ１と第２ハイレベル（Ｈ２）とで切り替わる波形である。Ｈ２は、Ｈ１と比較して、位相変調器４１による位相の調整量がπだけ変化するレベルであり、Ｌと比較して、位相変調器４１による位相の調整量が２πだけ変化するレベルである。すなわち、駆動信号ＤＷ２と駆動信号ＤＷ３とで、位相変調器４１の変調幅の上限値、中心値、下限値が変化する、例えば、電源回路２５は、制御装置４に制御され、駆動信号ＤＷ２にオフセット（例えば、Ｈ１）を付加することで駆動信号ＤＷ３を生成する。

駆動信号ＤＷ２の信号レベル（電圧値）は、位相調整量と対応関係にある。第１フレームにおいて、駆動信号ＤＷ２の電圧値はＬとＨ１とで切り替わっており、ここでは、電圧値がＬである場合の位相調整量を第１の位相調整量とし、電圧値がＨ１である場合の位相調整量を第２の位相調整量とする。第１フレームにおいて、位相調整部１４が位相を変化させるパターン（第１のパターン、第３のパターン、第５のパターン）は、電圧値Ｌに対応する第１の位相調整量と、電圧値Ｈ１に対応する位相調整量（第２の位相調整量）とを時間に応じて付与して位相を変化させるパターンである。第１のパターン、第３のパターン、第５のパターンは、周波数が互いに異なる。例えば、第１のパターン、第３のパターン、第５のパターンは、それぞれ、駆動信号ＤＷ２の周波数をｆ_−１、ｆ_０、ｆ_＋１に設定することで実現される。

また、駆動信号ＤＷ３の信号レベル（電圧値）は、位相調整量と対応関係にある。第２フレームにおいて、駆動信号ＤＷ３の電圧値はＨ１とＨ２とで切り替わっており、ここでは、電圧値がＨ１である場合の位相調整量は、第１の位相調整量にπを加算した位相調整量である。また、電圧がＨ２である場合の位相調整量は、第２の位相調整量にπを加算した位相調整量である。第２フレームにおいて、位相調整部１４が位相を変化させるパターン（第２のパターン、第４のパターン、第６のパターン）は、第１の位相調整量にπを加算した位相調整量と、第２の位相調整量のπを加算した位相調整量とを時間に応じて付与して位相を変化させるパターンである。第２のパターン、第４のパターン、第６のパターンは、周波数が互いに異なる。例えば、第２のパターン、第４のパターン、第６のパターンは、それぞれ、駆動信号ＤＷ３の周波数をｆ_−１、ｆ_０、ｆ_＋１に設定することで実現される。

定在波のパターンは、第１フレームと第２フレームとで同じである。また、第２フレームにおける干渉縞は、０次回折光と１次回折光との相対的な位相が第１フレームと変化していることにより、第１フレームの干渉縞と位相がずれる。例えば、第１フレームの明部の中心位置は、ΔＢのピッチで周期的に配置される。また、第２フレームの明部の中心位置は、第１フレームの明部の中心位置から約ΔＢ／２ずれた位置から、ΔＢのピッチで周期的に配置される。制御部５６は、例えば、第１フレームにおける干渉縞の明部の中心が第２フレームにおける干渉縞の暗部の中心と一致するように、位相調整部１４を制御する。

ここでは、位相変調器４１は、駆動信号ＤＷ２の１周期の前半期において位相をπ付与し、後半期において付与しない。また、位相変調器４１は、駆動信号ＤＷ３の１周期の前半期において位相を２π付与し、後半期において位相をπ付与する。例えば、第１フレームにおける０次回折光と１次回折光との相対的な位相は、０とπとで切り替えられ、第２フレームにおける０次回折光と１次回折光との相対的な位相は、πと２πとで切り替えられる。なお、位相変調器４１は、干渉縞のコントラストに応じて、駆動信号ＤＷ２の１周期の前半期において位相を（β＋π）付与し、後半期においてβ付与し、駆動信号ＤＷ３の１周期の前半期において、（β＋2π）付与し、後半期において（β＋π）付与してもよい。

このように、０次回折光と１次回折光との相対的な位相が、第１フレームと第２フレームとでずれていると、第１フレームにおける明部の位置に第２フレームにおける暗部が配置される。すなわち、第２フレームの干渉縞は、第１フレームの干渉縞に対して位相がπずれた関係になる。例えば、第１フレームにおける干渉縞の位相のシフト量が−２π／３である場合、第２フレームにおいて干渉縞の位相のシフト量がπ／３となる。第１フレームにおける干渉縞の位相のシフト量が０である場合、第２フレームにおいて干渉縞の位相のシフト量がπとなる。また、第１フレームにおける干渉縞の位相のシフト量が２π／３である場合、第２フレームにおいて干渉縞の位相のシフト量が５π／３となる。つまり、分岐部１３の駆動信号の周波数をｆ_−１、ｆ_０、ｆ_＋１とで切替るとともに、各周波数に対して位相変調器４１により位相を調整すると、位相のシフト量を０、π／３、２π／３、π、４π／３、５π／３の６通りに切り替えることができる。

次に、３Ｄ−ＳＩＭモードにおける観察方法について説明する。図１４は、３Ｄ−ＳＩＭモードにおける顕微鏡装置１の動作を示すフローチャートである（顕微鏡装置１の各部については図１０、図１１参照）。ステップＳ２１において、制御装置４の制御部５６は、スイッチ２６を制御し、スイッチ２６の接続先をトランスデューサ２３ａに設定する。これにより、干渉縞Ｓｂの周期方向は、第１方向に対応する方向に設定される。

ステップＳ２２において、制御部５６は、分岐部１３に第１の駆動信号を与えて音波定在波を生成させる。第１の駆動信号は、周波数がｆ_−１の駆動信号（図６参照）であり、制御部５６は、電源回路２５を制御して駆動信号の周波数をｆ_−１に設定する。ステップＳ２３において、制御部５６は、例えば、０次回折光の位相を第１のパターンで変化させることにより、０次回折光と１次回折光との相対的な位相を変化させる。ここで、第１のパターンは、２種類の位相調整量を時間に応じて付与して位相を変化させるパターンであり、２種類の位相調整量の差はπである。制御部５６は、０次回折光の位相を第１のパターンで変化させるために、電源回路２５を制御して位相変調器４１の駆動信号を駆動信号ＤＷ２（図１３参照）に設定する。これにより、干渉縞Ｓｂの位相のシフト量は、−２π／３に設定される。ステップＳ２４において、制御部５６は、撮像素子５１に試料Ｘの第１の画像を撮像させ、第１の画像に対応する画像データＩ_−１ａを取得する。ステップＳ２５において、制御部５６は、分岐部１３に第１の駆動信号が与えられる状態で、例えば、０次回折光の位相を第２のパターンで変化させることにより、０次回折光と１次回折光との相対的な位相を変化させる。ここで、第２のパターンは、２種類の位相調整量を時間に応じて付与して位相を変化させるパターンであり、２種類の位相調整量の差はπである。制御部５６は、０次回折光の位相を第２のパターンで変化させるために、電源回路２５を制御して位相変調器４１の駆動信号を駆動信号ＤＷ３（図１３参照）に設定する。これにより、干渉縞Ｓｂの位相のシフト量は、π／３に設定される。ステップＳ２６において、制御部５６は、撮像素子５１に試料Ｘの第２の画像を撮像させ、第２の画像に対応する画像データＩ_−１ｂを取得する。

ステップＳ２７において、制御部５６は、分岐部１３に第２の駆動信号を与えて音波定在波を生成させる。第２の駆動信号は、周波数がｆ_０の駆動信号（図６参照）であり、制御部５６は、電源回路２５を制御して駆動信号の周波数をｆ_０に設定する。ステップＳ２８において、制御部５６は、例えば、０次回折光の位相を第３のパターンで変化させることにより、０次回折光と１次回折光との相対的な位相を変化させる。ここで、第３のパターンは、２種類の位相調整量を時間に応じて付与して位相を変化させるパターンであり、２種類の位相調整量の差はπである。制御部５６は、０次回折光の位相を第３のパターンで変化させるために、電源回路２５を制御して位相変調器４１の駆動信号を、駆動信号ＤＷ２の周波数をｆ_０に変換した駆動信号に切り替える。なお、この駆動信号は、０次回折光に対する位相調整量を０とπとで切り替える駆動信号である。これにより、干渉縞Ｓｂの位相のシフト量は、０に設定される。ステップＳ２９において、制御部５６は、撮像素子５１に試料Ｘの第３の画像を撮像させ、第３の画像に対応する画像データＩ_０ａを取得する。ステップＳ３０において、制御部５６は、分岐部１３に第２の駆動信号が与えられる状態で、例えば、０次回折光の位相を第４のパターンで変化させることにより、０次回折光と１次回折光との相対的な位相を変化させる。ここで、第４のパターンは、２種類の位相調整量を時間に応じて付与して位相を変化させるパターンであり、２種類の位相調整量の差はπである。制御部５６は、０次回折光の位相を第４のパターンで変化させるために、電源回路２５を制御して駆動信号を、ステップＳ２８における第３のパターンに対応する駆動信号に電圧値のオフセットを加えた駆動信号に切り替える。例えば、制御部５６は、電源回路２５を制御して位相変調器４１の駆動信号を、駆動信号ＤＷ３の周波数をｆ_０に変換した駆動信号に切り替える。なお、この駆動信号は、０次回折光に対する位相調整量をπと２πとで切り替える駆動信号である。これにより、干渉縞Ｓｂの位相のシフト量は、πに設定される。ステップＳ３１において、制御部５６は、撮像装置３を制御して試料Ｘを撮像させ、画像データＩ_０ｂを取得する。

ステップＳ３２において、制御部５６は、分岐部１３に第３の駆動信号を与えて音波定在波を生成させる。第３の駆動信号は、周波数がｆ_＋１の駆動信号（図６参照）であり、制御部５６は、電源回路２５を制御して駆動信号の周波数をｆ_＋１に設定する。ステップＳ３３において、制御部５６は、例えば、０次回折光の位相を第５のパターンで変化させることにより、０次回折光と１次回折光との相対的な位相を変化させる。こで、第５のパターンは、２種類の位相調整量を時間に応じて付与して位相を変化させるパターンであり、２種類の位相調整量の差はπである。制御部５６は、０次回折光の位相を第５のパターンで変化させるために、電源回路２５を制御して位相変調器４１の駆動信号を、駆動信号ＤＷ２の周波数をｆ_＋１に変換した駆動信号に切り替える。なお、この駆動信号は、０次回折光に対する位相調整量を０とπとで切り替える駆動信号である。これにより、干渉縞Ｓｂの位相のシフト量は、２π／３に設定される。ステップＳ３４において、制御部５６は、撮像素子５１に試料Ｘの第５の画像を撮像させ、第５の画像に対応する画像データＩ_＋１ａを取得する。ステップＳ３５において、分岐部１３に第３の駆動信号が与えられる状態で、例えば、０次回折光の位相を第６のパターンで変化させることにより、０次回折光と１次回折光との相対的な位相を変化させる。ここで、第６のパターンは、２種類の位相調整量を時間に応じて付与して位相を変化させるパターンであり、２種類の位相調整量の差はπである。制御部５６は、電源回路２５を制御して駆動信号を、ステップＳ３３における第５のパターンに対応する駆動信号に電圧値のオフセットを加えた駆動信号に切り替える。例えば、制御部５６は、電源回路２５を制御して位相変調器４１の駆動信号を、駆動信号ＤＷ３の周波数をｆ_＋１に変換した駆動信号に切り替える。なお、この駆動信号は、０次回折光に対する位相調整量をπと２πとで切り替える駆動信号である。これにより、干渉縞Ｓｂの位相のシフト量は、５π／３に設定される。ステップＳ３６において、制御部５６は、撮像素子５１に試料Ｘの第６の画像を撮像させ、第６の画像に対応する画像データＩ_＋１ｂを取得する。以上のようにして、顕微鏡装置１は、干渉縞の周期方向を第１方向に設定しつつ、位相を６通りに切り替えて、６枚の画像を取得する。

ステップＳ３７において、制御部５６は、干渉縞Ｓｂの周期方向を３方向の全てに設定済みであるか否かを判定する。制御部５６は、干渉縞の周期方向に応じた撮像が完了していないと判定した場合（ステップＳ３７；Ｎｏ）、ステップＳ３８において、スイッチ２６の接続先を次のトランスデューサに切り替える。また、ステップＳ３８の処理の終了後に、制御部５６は、干渉縞の周期方向を変更した状態（例、第２方向）で、ステップＳ２２からステップＳ３６の処理を繰り返し、この周期方向に応じた画像データを取得する。また、制御部５６は、干渉縞の周期方向に応じた撮像が完了したと判定した場合（ステップＳ３７；Ｙｅｓ）、一連の処理を終了する。

図１５は、干渉縞の１方向に関する設定条件を示す図である。構造化照明装置２は、分岐部１３の駆動信号の周波数をｆ_−１、ｆ_０、ｆ_＋１の３通りに切り替え、分岐部１３の駆動信号の各周波数に対して、位相変調器による位相変調量を０とπとで切り替えることで、干渉縞の位相を０、π／３、２π／３、π、４π／３、５π／３の６通りに切り替えることができる。顕微鏡装置１は、３方向のそれぞれについて位相を６通りに切り替えて、合計１８枚の画像を取得する。

また、制御装置４の復調部５５は、取得された画像データを使って復調処理を実行し、超解像画像のデータを生成する。復調部５５は、例えば、干渉縞の各方向において位相が異なる６枚の画像のうちの５枚（３方向で１５枚）を使って復調処理を行い、各方向における残りの１枚（３方向で３枚）の画像については補間などに用いてもよいし、復調処理に用いなくてもよい。なお、制御部５６は、復調処理に用いられない画像については、撮像装置３に撮像させなくてもよく、例えば、干渉縞の位相を０、π／３、２π／３、π、４π／３、５π／３のうち５通りに変化させて５枚の画像を取得してもよい。

図１６は、位相変調器４１の駆動信号の他の例を示す図である。図１６において、第２フレームの駆動信号ＤＷ４は、信号のレベルがＬとＨ１とで切り替わる波形である。駆動信号ＤＷ４は、位相が第１フレームの駆動信号ＤＷ２と異なる。駆動信号ＤＷ４は、第２フレームの開始時刻から立ち上がりまでの時間が、駆動信号ＤＷ２において第１フレームの開始時刻から立ち上がりまでの時間と異なる。駆動信号ＤＷ４は、フレームの開始時刻から立ち上がりまでの時間が駆動信号ＤＷ２とＴ／２（位相でπ）ずれている。例えば、位相調整回路４４は、電源回路２５から駆動信号ＤＷ２を供給され、駆動信号ＤＷの位相をπ調整することにより、駆動信号ＤＷ４を生成する。

駆動信号ＤＷ２の信号レベル（電圧値）は、位相調整量と対応関係にある。第１フレームにおいて、駆動信号ＤＷ２の電圧値はＬとＨ１とで切り替わっており、ここでは、電圧値がＬである場合の位相調整量を第１の位相調整量とし、電圧がＨ１である場合の位相調整量を第２の位相調整量とする。第１フレームにおいて、位相調整部１４が位相を変化させるパターン（第１のパターン、第３のパターン、第５のパターン）は、電圧値Ｌに対応する第１の位相調整量と、電圧値Ｈ１に対応する第２の位相調整量とを時間に応じて交互に付与して位相を変化させるパターンである。

また、駆動信号ＤＷ４の信号レベル（電圧値）は、位相調整量と対応関係にある。駆動信号ＤＷ４は、駆動信号ＤＷ２と比較して信号レベルをＬとＨ１とで反転させた駆動信号である。第２フレームにおいて、位相調整部１４が位相を変化させるパターン（第２のパターン、第４のパターン、第６のパターン）は、第１フレームにおいて位相調整部１４が位相を変化させるパターン（第１のパターン、第３のパターン、第５のパターン）を反転させたパターンである。

位相変調器４１は、駆動信号ＤＷ２により駆動されることで、０次回折光の位相を前半期にπだけ調整し後半期に０だけ調整し、駆動信号ＤＷ４により駆動されることで、０次回折光の位相を前半期に０だけ調整し後半期にπだけ調整する。このように、第２フレームにおける位相変調器４１の駆動信号は、第１フレームにおける位相変調器の駆動信号と各フレーム内での位相がずれていてもよい。

上述したような本実施形態に係る構造化照明装置２は、位相調整部１４によって０次回折光と１次回折光との相対的な位相を調整するので、干渉縞の位相を変化させることができ、画像取得を高速化することができる。また、例えば、分岐部１３が音響光学モジュールを用いた構成である場合、２Ｄ−ＳＩＭモードと３Ｄ−ＳＩＭモードとで分岐部１３を共用することができる。また、例えば、位相調整部１４を用いないで分岐部１３により干渉縞の位相を６通りに変化させる構成と比較して、光源からの光の入射領域Ｓａに対して分岐部１３が大型化することを回避できる。

なお、分岐部１３は、石英基板などに形成された回折格子を用いる構成であってもよいし、液晶素子などの空間光変調素子を用いる構成であってもよい。例えば石英基板などに形成された回折格子により、干渉縞の方向または位相を変化させる場合、回折格子を５位相で移動させるが、位相調整部１４を併用すると３位相の移動でよい。その結果、例えば回折格子の移動に伴う振動が収まるまでの待機時間を減らすことができる。また、液晶素子を分岐部１３に用いる場合、１ピクセルで５位相分ずらす場合、明部と暗部をあわせて５ピクセル要するが、位相調整部１４を併用すると３位相の移動でよいので、１周期分に３ピクセルあればよい。そのため、同じ画素数の液晶素子を用いる場合、形成できるパターンの周期数を増やすことができる。

なお、上述した顕微鏡装置１において、制御装置４は、例えば、ＣＰＵおよびメモリーを有するコンピュータにより構成される。このコンピュータは、外部または内部の記憶装置から制御プログラムを読み出し、この制御プログラムに従って上述した各処理を実行させる。この制御プログラムは、例えば、音波定在波が生成され、入射した光を複数の光束に分岐する光変調器と、複数の光束の少なくとも一部を干渉させて、干渉縞で試料を照明する照明光学系と、干渉縞が照射された試料の像を形成する結像光学系と、結像光学系により形成された試料の像を撮像する撮像部と、複数の光束の少なくとも１つの光束の位相を変化させる位相調整部と、を有する顕微鏡装置の制御をコンピュータに実行させる制御プログラムであって、制御は、光変調器に第１の駆動信号を与えて音波定在波を生成させたとき、位相調整部に位相を第１のパターンで変化させて撮像部に第１の画像を撮像させ、位相調整部に位相を第２のパターンで変化させて撮像部に第２の画像を撮像させることと、光変調器に第２の駆動信号を与えて音波定在波を生成させたとき、位相調整部に位相を第３のパターンで変化させて撮像部に第３の画像を撮像させた後、位相調整部に位相を第４のパターンで変化させて撮像部に第４の画像を撮像させることと、光変調器に第３の駆動信号を与えて音波定在波を生成させたとき、位相調整部に位相を第５のパターンで変化させて撮像部に第５の画像を撮像させ位相調整部に位相を第６のパターンで変化させて撮像部に第６の画像を撮像させることと、を含む。

なお、位相変調器４１による前半期の位相調整量と後半期の位相調整量は、適宜、変更できる。例えば、上述の実施形態において、位相変調器４１は、０次回折光の位相調整量が０、π、２πなどに設定されるが、これ以外の位相調整量に設定されていてもよい。例えば、制御装置４は、例えばキャリブレーション用の試料など予め特性が分かっている試料を用いて、撮像装置３から出力される画像のコントラストを参照しながら位相変調器４１の位相調整量を変化させ、そのコントラストが最大となった時点（又は、そのコントラストが閾値以上となった時点）で、その位相調整量を初期値に設定してもよい。

図１７は、位相変調器４１による位相調整量の例を示す図である。図１７（Ａ）の例は、上述した実施形態と同様に、前半期において、１次回折光に対する位相調整量が０であり、０次回折光に対する位相調整量がπである。前半期において、０次回折光と１次回折光の相対的な位相調整量はπである。また、後半期において、１次回折光に対する位相調整量が０であり、０次回折光に対する位相調整量が０である。後半期において、０次回折光と１次回折光の相対的な位相調整量は０である。このように、０次回折光と１次回折光の相対的な位相調整量が前半期と後半期で異なっている。

図１７（Ｂ）の例では、前半期において、１次回折光に対する位相調整量がπであり、０次回折光に対する位相調整量が０である。前半期において、０次回折光と１次回折光の相対的な位相調整量はπである。また、後半期において、１次回折光に対する位相調整量が０であり、０次回折光に対する位相調整量が０である。後半期において、０次回折光と１次回折光の相対的な位相調整量は０である。図１３から図１６の説明においては、０次回折光を第１から第６のパターンで変化させることにより、０次回折光と１次回折光との相対的な位相を変化させるが、本例のように、０次回折光の代わりに１次回折光の位相調整量を前半期と後半期とで変化させてもよい。例えば、０次回折光を第１乃至第６のパターンで変化させる代わりに、１次回折光を第１乃至第６のパターンで変化させることで、図１３から図１６で説明したのと同様に０次回折光と１次回折光との相対的な位相を変化させることができる。１次回折光を０次回折光を第１乃至第６のパターンで変化させる手法としては、例えば、図１１の補正ブロック４２の代わりに位相変調器を設けておき、この位相変調器に駆動信号ＤＷ２あるいは駆動信号ＤＷ３のような駆動信号を前半期と後半期とで切り替えて供給する手法がある。

なお、±１次回折光と０次回折光との相対的な位相を調整するには、位相変調の対象を±１次回折光と０次回折光の双方としてもよい。この場合は、±１次回折光が入射する領域と０次回折光が入射する領域のそれぞれに、位相変調器４１を配置すればよい。例えば、０次回折光が入射する領域と１次回折光が入射する領域とにわたって同じ位相変調器４１が配置されていてもよいし、０次回折光が入射する領域と１次回折光が入射する領域とに、それぞれ位相変調器４１が配置されていてもよい。

図１７（Ｃ）の例では、前半期において、＋１次回折光に対する位相調整量がα＋πであり、−１次回折光に対する位相調整量が−α＋πであり、０次回折光に対する位相調整量が０である。後半期において、＋１次回折光に対する位相調整量がαであり、−１次回折光に対する位相調整量が−αであり、０次回折光に対する位相調整量が０である。このように、＋１次回折光と−１次回折光とで位相調整量が異なっていてもよい。このようなα（オフセット）は、例えば、以下のように設定される。まず、２Ｄ−ＳＩＭモードにおいて、０次回折光を遮光し、＋１次回折光に対して位相オフセットαを付与し、−１次回折光に対して位相オフセット−αを付与する。つまり、０次回折光に対する＋１次回折光の位相オフセットと、０次回折光に対する−１次回折光の位相オフセットとを、等量反対符号に設定する。この状態でも、適正な２光束構造化照明を生成できる。そして、干渉縞の位相を切り換える際には、前述した定在波の波長を所定パターンで切り換える代わりに、位相オフセット量αを所定パターンで切り換える。例えば、位相オフセット量αを２π／３のピッチで３通りに切り換えれば、干渉縞の位相を２π／３のピッチで３通りに切り換えることができる。なお、０次回折光の代わりに１次回折光の位相を変化させることで、０次回折光と１次回折光との相対的な位相を調整することについては、図１７（Ｂ）の説明と同様である。

なお、上述した実施形態では、干渉縞（２光束の干渉縞、３光束の干渉縞）を形成するための回折光として、±１次回折光及び０次回折光の組み合わせを用いたが、他の組み合わせを用いてもよい。

なお、撮像の１フレーム内において、位相変調器４１に供給される駆動信号ＤＷ２は、分岐部１３に供給される駆動信号ＤＷ１と位相がずれていてもよい。図１８は、定在波の腹ａの屈折率の時間変化と、０次回折光の位相変調量の時間変化との比較を示す図である。図１８では、腹ａの屈折率の時間変化を実線で示し、０次回折光の位相変調量の時間変化を破線で示した。

図１８（Ａ）において、腹ａの屈折率の時間変化を示す波形と０次回折光の位相変調量の時間変化を示す波形との間の位相差ΔΨがπ／２の偶数倍に一致している。この場合、０次回折光の位相の変位する期間が、屈折率変化の前半期または後半期と一致するので、得られる画像のコントラストが最大となる。

図１８（Ｂ）において、腹ａの屈折率の時間変化を示す波形と０次回折光の位相変調量の時間変化を示す波形との間の位相差ΔΨがπ／２の偶数倍に一致していない。この場合、前半期と後半期それぞれで干渉縞Ｓｂの位相が反転するため、互いに打ち消しあって干渉縞のコントラストが低下する。そのため、ΔΨはπ／２の偶数倍に等しいことが望ましいが、復調処理に必要とされる明部と暗部とのコントラストを確保できる範囲内において、ΔΨは、π／２の偶数倍からずれていてもよい。

図１８（Ｃ）において、腹ａの屈折率の時間変化を示す波形と０次回折光の位相変調量の時間変化を示す波形との間の位相差ΔΨは、π／２の奇数倍に一致している。この場合、撮像の１フレームに含まれる前半期の露光総量と後半期の露光総量が同じであり、得られる画像のコントラストがほぼ０となる。そのため、図１８（Ｂ）のように、ΔΨがπ／２の偶数倍からずれていたとしても、π／２の奇数倍とはならないように設定される。

なお、３Ｄ−ＳＩＭモードにおいて、屈折率の時間変化波形と０次回折光の位相変調量の時間変化波形との間の位相差ΔΨの調整は、制御装置４が自動で行ってもよいし、ユーザが手動で行ってもよい。例えば、調整中の画像のコントラストをユーザが確認できるよう、撮像装置３から出力される画像を制御装置４がリアルタイムで表示装置５へ表示してもよい。

なお、３Ｄ−ＳＩＭモードにおいて、位相変調器４１の駆動信号の周波数は、分岐部１３の駆動信号の周波数を正弦信号の周波数と一致しなくてもよい。図１９は、位相変調器４１の駆動信号の他の例を示す図である。例えば、位相変調器４１の駆動信号の周波数を、分岐部１３の駆動信号の周波数の１／Ｎ倍（Ｎは１以上の整数）に設定し、位相変調器４１の駆動信号のデューティー比（信号のレベルがＨの期間／駆動信号の周期）を１／（２Ｎ）に設定してもよい。図１９は、Ｎ＝３とした場合の例である。

この場合、位相変調器４１は、分岐部１３による定在波の３周期のうち１周期において前半期と後半期との位相を調整する。このような場合にであっても、位相を調整した１周期において明部と暗部とのコントラストが得られる。また、このような場合に、撮像装置３は、位相変調器４１が位相を調整した１周期において電荷蓄積を行い、位相変調器４１が位相を調整しない２周期において電荷蓄積を行わなくてもよい。この場合、電荷蓄積期間は、例えば、位相変調周期（Ｎ×Ｔ）のうち、０次回折光の位相の変位する期間（Ｔ／２）と、その前又は後における同等期間（Ｔ／２）とを合わせた期間（Ｔ）に設定されればよい。なお、デューティー比は、コントラストが確保できる範囲内において、デューティー比は１／（２Ｎ）からずれていてもよい。また、位相変調器４１の駆動信号は、矩形波状でなくてもよく、例えば正弦波状であってもよいし、他の波形であってもよい。

なお、位相調整部１４は、回折光の位相を変調する位相変調器４１を備えるが、位相変調器４１の代わりに又は位相変調器４１と併用して、厚さが異なる屈折部材を備えていてもよい。厚さの異なる屈折部材は、例えば、楔形や階段状のガラス部材などであってもよい。例えば、０次回折光の入射する領域に楔形や階段状のガラス部材を配置し、所定の方向にガラス部材を移動させる、或いは、所定の軸を中心としてガラス部材を回転させることで、０次回折光が通過するガラス部材の厚さを周期的に変化させて、ガラス部材を通過する回折光の位相を変調することも可能である。

なお、分岐部１３において、音波伝搬路Ｒを伝播する音波の方向は３方向でなくてもよく、例えば１方向、２方向、又は４方向以上であってもよい。また、トランスデューサに与えられる交流電圧の周波数の変化パターンは、定在波の波本数がＭ／２本ずつ変化するようなパターンであればよい。この場合、干渉縞の位相のシフト量のピッチを任意の値Δψに設定するためには、音波伝搬路の一端から入射領域Ｓａの中心までの距離Ｄと、音波伝搬路の全長Ｌとは、Ｄ：Ｌ＝Δψ／Ｍ：２πの関係を満たせばよい。Ｍ＝１の場合には、定在波の本数が１／２本ずつしか変化しないので、縞本数のずれを抑えることができる。また、分離演算に使用する画像データの数がｋである場合は、Δψ＝２π／ｋとすれば、画像データに取得することができる。但し、ｋは３以上の整数であることが好ましい。

なお、分岐部１３の音波伝搬路Ｒにおける光の通過領域（入射領域Ｓａ）は、音波伝搬路Ｒの両端から離れた部分領域に制限されていなくてもよい。例えば、音波伝搬路Ｒを通過した光を視野絞り３２により絞る場合、音波伝搬路Ｒのうち試料Ｘの照明領域に形成される干渉縞に寄与する光のする領域が、Ｄ：Ｌ＝Δψ／Ｍ：２πの関係を満たしていればよい。

図２０は、分岐部１３の他の例を示す図である。この分岐部１３において、３つの音波伝搬路Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃは、入射領域Ｓａの中心に関して回転対称な関係で配置されている。なお、上述の実施形態において、音波伝搬路Ｒａ〜Ｒｃの長さが同じであり、トランスデューサ２３ａ〜２３ｃに与えられる駆動信号が共通であるが、音波伝搬路Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃの長さが互いに異なり、トランスデューサ２３ａ〜２３ｃに与えられる駆動信号が互いに異なっていてもよい。

なお、本発明の技術範囲は、上述の実施形態などで説明した態様に限定されるものではない。上述の実施形態などで説明した要件の１つ以上は、省略されることがある。また、上述の実施形態などで説明した要件は、適宜組み合わせることができる。また、法令で許容される限りにおいて、上述の実施形態などで引用した全ての文献の開示を援用して本文の記載の一部とする。

１・・・顕微鏡装置、２・・・構造化照明装置、３・・・撮像装置、４・・・制御装置、１１・・・照明光学系、１３・・・光変調器、１４・・・位相調整部、５６・・・制御部、ＤＷ１・・・駆動信号、ＤＷ２・・・駆動信号、ＤＷ３・・・駆動信号、ＤＷ４・・・駆動信号、Ｒ・・・音波伝搬路、Ｘ・・・試料

Claims (10)

1. 音波定在波が生成され、入射した光を複数の光束に分岐する光変調器と、
   前記複数の光束の少なくとも一部を干渉させて、干渉縞で試料を照明する照明光学系と、
   前記干渉縞が照射された前記試料の像を形成する結像光学系と、
   前記結像光学系により形成された前記試料の像を撮像する撮像部と、
   前記複数の光束の少なくとも１つの光束の位相を変化させる位相調整部と、
   制御部と、
   を有し、
   前記制御部は、
   前記光変調器に第１の駆動信号を与えて前記音波定在波を生成させたとき、
   前記位相調整部に前記位相を第１のパターンで変化させて前記撮像部に第１の画像を撮像させ、前記位相調整部に前記位相を第２のパターンで変化させて前記撮像部に第２の画像を撮像させ、
   前記光変調器に第２の駆動信号を与えて前記音波定在波を生成させたとき、
   前記位相調整部に前記位相を第３のパターンで変化させて前記撮像部に第３の画像を撮像させ、前記位相調整部に前記位相を第４のパターンで変化させて前記撮像部に第４の画像を撮像させ、
   前記光変調器に第３の駆動信号を与えて前記音波定在波を生成させたとき、
   前記位相調整部に前記位相を第５のパターンで変化させて前記撮像部に第５の画像を撮像させ、前記位相調整部に前記位相を第６のパターンで変化させて前記撮像部に第６の画像を撮像させる
   顕微鏡装置。
2. 前記制御部は、前記撮像部に撮像させた複数の画像のうち少なくとも５枚の画像を用いて、前記試料の画像を生成する
   請求項１に記載の顕微鏡装置。
3. 前記第１のパターン、前記第２のパターン、前記第３のパターン、前記第４のパターン、前記第５のパターンおよび前記第６のパターンは、それぞれ、２種類の位相調整量を時間に応じて付与して前記位相を変化させるパターンであり、前記２種類の位相調整量の差はπである
   請求項１又は請求項２に記載の顕微鏡装置。
4. 前記第１のパターン、前記第３のパターンおよび前記第５のパターンは、それぞれ、第１の位相調整量と第２の位相調整量とを時間に応じて付与して前記位相を変化させるパターンであり、
   前記第２のパターン、前記第４のパターンおよび前記第６のパターンは、それぞれ、前記第１の位相調整量にπを加算した位相調整量と、前記第２の位相調整量にπを加算した位相調整量とを時間に応じて付与して、前記位相を変化させるパターンである
   請求項３に記載の顕微鏡装置。
5. 前記第１のパターン、前記第３のパターンおよび前記第５のパターンは、それぞれ、第１の位相調整量と第２の位相調整量とを時間に応じて交互に付与して前記位相を変化させるパターンであり、
   前記第２のパターン、前記第４のパターンおよび前記第６のパターンは、それぞれ、前記第１のパターン、前記第３のパターンおよび前記第５のパターンを反転させたパターンである
   請求項３に記載の顕微鏡装置。
6. 前記複数の光束は、前記光変調器により回折された回折光であり、
   前記位相調整部は、前記回折光のうち０次回折光の位相を変化させる
   請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の顕微鏡装置。
7. 前記複数の光束は、前記光変調器により回折された回折光であり、
   前記位相調整部は、前記回折光のうち１次回折光の位相を変化させる
   請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の顕微鏡装置。
8. 前記光変調器は、前記音波定在波を生成する方向を、前記光が入射する方向と交差する面内において、複数の方向で切り替える
   請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の顕微鏡装置。
9. 音波定在波が生成され、入射した光を光変調器によって複数の光束に分岐することと、
   前記複数の光束の少なくとも一部を干渉させて、干渉縞で試料を照明することと、
   前記干渉縞が照射された前記試料の像を形成することと、
   前記形成された前記試料の像を撮像することと、
   前記複数の光束の少なくとも１つの光束の位相を変化させることと、
   前記光変調器による前記音波定在波の生成、前記位相の変化、及び前記撮像を制御することと、を含み、
   前記制御は、
   前記光変調器に第１の駆動信号を与えて前記音波定在波を生成させたとき、前記位相を第１のパターンで変化させて第１の画像を撮像させ、前記位相を第２のパターンで変化させて第２の画像を撮像させることと、
   前記光変調器に第２の駆動信号を与えて前記音波定在波を生成させたとき、前記位相を第３のパターンで変化させて第３の画像を撮像させ、前記位相を第４のパターンで変化させて第４の画像を撮像させることと、
   前記光変調器に第３の駆動信号を与えて前記音波定在波を生成させたとき、前記位相を第５のパターンで変化させて第５の画像を撮像させ、前記位相を第６のパターンで変化させて第６の画像をさせることと、を含む
   観察方法。
10. 音波定在波が生成され、入射した光を複数の光束に分岐する光変調器と、
    前記複数の光束の少なくとも一部を干渉させて、干渉縞で試料を照明する照明光学系と、
    前記干渉縞が照射された前記試料の像を形成する結像光学系と、
    前記結像光学系により形成された前記試料の像を撮像する撮像部と、
    前記複数の光束の少なくとも１つの光束の位相を変化させる位相調整部と、
    を有する顕微鏡装置の制御をコンピュータに実行させる制御プログラムであって、
    前記制御は、
    前記光変調器に第１の駆動信号を与えて前記音波定在波を生成させたとき、前記位相調整部に前記位相を第１のパターンで変化させて前記撮像部に第１の画像を撮像させ、前記位相調整部に前記位相を第２のパターンで変化させて前記撮像部に第２の画像を撮像させることと、
    前記光変調器に第２の駆動信号を与えて前記音波定在波を生成させたとき、前記位相調整部に前記位相を第３のパターンで変化させて前記撮像部に第３の画像を撮像させた後、前記位相調整部に前記位相を第４のパターンで変化させて前記撮像部に第４の画像を撮像させることと、
    前記光変調器に第３の駆動信号を与えて前記音波定在波を生成させたとき、前記位相調整部に前記位相を第５のパターンで変化させて前記撮像部に第５の画像を撮像させ前記位相調整部に前記位相を第６のパターンで変化させて前記撮像部に第６の画像を撮像させることと、を含む
    制御プログラム。

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