JP6675185B2 - 免疫誘導剤およびその製造方法 - Google Patents
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Description
ウイルス様粒子とは、当該技術分野において周知のように、通常はウイルスゲノムを有しない構造体である。後述の外殻タンパク質および殻内ペプチドは、ウイルスに由来するタンパク質を用いることができる。
ウイルス分類においては、分類の再編や属名等の改変が頻繁に行われる。よって、将来ICTVまたはそれに準ずる学術的権威機関による分類において分類が再編されたり、属名等が改変されたりしたとしても、2014年のICTV分類におけるポリオーマウイルス属に属するウイルスの各々と同じ属(Genus)に分類されるウイルスは、本明細書でいうところのポリオーマウイルス属ウイルスに包含されるものとする。
また、当該分野においては新種のウイルスが度々発見されるため、将来ICTVまたはそれに準ずる学術的権威機関により公表されるウイルス分類において、現在のポリオーマウイルス属またはそれに相当する分類群に属することとなる新種のウイルスも本明細書でいうところのポリオーマウイルス属ウイルスに包含されるものとする。
「内包」とは、抗原結合タンパク質中の少なくとも抗原が、外殻タンパク質によって形成される外殻の内側に存在する状態をいう。
外殻が外殻タンパク質の単量体から構成される場合、1つの外殻を構成する単量体の数は特に限定されないが、好ましくは100〜1000個、より好ましくは150〜500個である。
外殻がカプソメアから構成される場合、1つの外殻を構成するカプソメアの数は、好ましくは50〜390個、より好ましくは72〜260個である。
外殻の直径は、特に限定されないが、好ましくは30〜300 nm、より好ましくは45〜200 nmである。
滑沢剤としては、限定されないが、例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、コロイドシリカなどが挙げられる。
崩壊剤としては、限定されないが、例えば架橋カルメロースナトリウム、カルメロースカルシウム、架橋ポビドン、カルボキシメチルスターチナトリウムなどが挙げられる。
可塑剤としては、限定されないが、トリアセチン、中鎖脂肪酸トリグリセリドなどが挙げられる。
着色剤としては、限定されないが、食用タール色素、レーキ色素、三酸化二鉄などが挙げられる。
安定剤としては、限定されないが、窒素、二酸化炭素などの不活性ガス、EDTAなどのキレート剤、L-アスコルビン酸などの還元物質などが挙げられる。
保存剤としては、限定されないが、パラオキシ安息香酸エステル、クロロブタノールなどが挙げられる。
緩衝剤としては、限定されないが、クエン酸、酢酸、リン酸などのナトリウム塩などが挙げられる。
無痛化剤としては、限定されないが、ベンジルアルコール、プロカイン塩酸塩、ブドウ糖などが挙げられる。
乳化剤としては、限定されないが、アラビアゴム、ポリソルベート、ラウリル硫酸ナトリウムなどが挙げられる。
懸濁化剤としては、限定されないが、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント、モノステアリン酸アルミニウムなどが挙げられる。
懸濁剤は、たとえば、ウイルス様粒子を発現した宿主細胞をホモジナイズして得られたホモジネートを精製し、必要に応じて抽出、精製、溶媒による希釈などにより調製される。具体的には、カイコなどの鱗翅目昆虫固体を宿主とした場合、ウイルス様粒子を発現した個体を摩砕し、粗精製して調製され得る。
本実施形態の免疫誘導剤は、当業者に公知の方法に従ってウイルス様粒子を調製し、必要に応じて医薬的に許容される賦形剤等と混合して製剤化することによって製造することができる。
具体的には、剤形を固形製剤、例えば錠剤とする場合には、例えばウイルス様粒子と適切な賦形剤、結合剤および/または崩壊剤とを混合し、適切な滑沢剤を添加して更に混合し、混合物を打錠し、必要に応じてコーティングすることなどによって製剤化することができる。
剤形を注射剤や液状製剤とする場合には、例えばウイルス様粒子を適切な溶剤に分散させ、必要により濾過または滅菌処理し、所定の容器に充填することなどにより製剤化することができる。
剤形を坐剤とする場合には、例えばウイルス様粒子と、予め低温で融解した適切な坐剤用基剤とを混合し、鋳型に注いで冷却し固めることなどにより製剤化することができる。
ウイルス様粒子、ウイルス、外殻タンパク質、外殻、抗原結合タンパク質、抗原等については上記したとおりである。
ウイルス様粒子、ウイルス、外殻タンパク質、外殻、抗原結合タンパク質、抗原、疾患等については上記したとおりである。
ウイルス様粒子、ウイルス、外殻タンパク質、外殻、抗原結合タンパク質、抗原、免疫誘導剤およびその投与方法、生体等については上記したとおりである。
ウイルス様粒子、ウイルス、外殻タンパク質、外殻、抗原結合タンパク質、抗原、免疫誘導剤およびその投与方法、生体、疾患等については上記したとおりである。
ウイルス様粒子、ウイルス、外殻タンパク質、外殻、抗原結合タンパク質、抗原、免疫誘導剤およびその投与方法、生体、疾患等については上記したとおりである。
wt SV40 VP1遺伝子(配列番号1;アミノ酸配列は配列番号2に示す)をpFastBac1プラスミド(invitrogen)のSal Iサイト及びKpn Iサイトに挿入した。得られたプラスミドで、バキュロウイルスゲノムを保持する大腸菌DH10bac (invitrogen)を形質転換し、VP1を組込んだ組換えバキュロウイルスゲノムを調製した。組換えバキュロウイルスゲノムをSf-9細胞にトランスフェクションした。三日後にその上清を回収して、組換えバキュロウイルスを含む溶液とした。この溶液の一部を再び、Sf-9細胞(invitrogen)に感染させることで、組換えバキュロウイルスタイターを上昇させた。これを組換えバキュロウイルスのストック溶液とした。
wt SV40 VP2のアミノ末端 (N末端: amino terminus)をコードするコドンの上流にFLAGタグのコード配列(配列番号13)を付加して更にその上流にBamHIサイトを導入した。また、wt SV40 VP2のストップコドンを除いてEcoRIサイトを導入した。得られたポリヌクレオチドをpFastBac1プラスミドのBamHIサイト、および、EcoRIサイトを介して挿入し、wt SV40 VP2遺伝子を含むプラスミドを作製した。M1タンパク質のN末端をコードするコドンの上流にGGGGSGGGGSGGGGSリンカー(配列番号3;核酸配列は配列番号14に示す)のコード配列を導入し、更にその上流にEcoRIサイトを導入した。また、M1タンパク質コード配列の下流にストップコドンを付加して更にその下流にSal Iサイトを導入した。得られたポリヌクレオチドを、上記のwt SV40 VP2遺伝子を含むプラスミドのEcoRIサイト、および、Sal Iサイトを介して導入し、VP2コード配列の下流にM1コード配列を融合した遺伝子を保持したプラスミドを作製した。
wt SV40 VP1を組込んだ組換えバキュロウイルス(M.O.I. (multiplicity of infection) = 0.05〜0.2)と、VP2-M1を組込んだバキュロウイルス(M.O.I. = 0.015〜0.06)とを、3x107個のSf-9細胞を撒いた15 cm 培養ディッシュ中で共感染させた(wt SV40 VP1 : VP2-M1 = 1 : 0.3の感染比率 (M.O.I.ベース))。これを計10枚作成した。感染3日後に、これら10枚のディッシュに撒いた計3x108個のSf-9細胞を回収した。PBS(-)で洗浄後、細胞を10 mlのVP1超音波処理用バッファー (20 mM Tris-HCl (pH7.9), 1% (w/vol)デオキシコール酸)で再懸濁した。その後、内在性のプロテアーゼ活性を抑制するため、2 mM フッ化フェニルメタンスルホニル (最終濃度2 μM) 、及び、キモスタチン (最終濃度1 μg/ml)、アプロチニン (最終濃度1 μg/ml)、ロイペプチン (最終濃度1 μg/ml)、アンチパイン (最終濃度1 μg/ml)、ペプスタチン (最終濃度1 μg/ml) を加えて、超音波破砕した。その後、15,000 rpm、4℃で5分間遠心分離して上清とペレットに分け、上清をライセート溶液とした。
以下の実験はC57BL/6をバックグラウンドとし、HLA-A*0201とH-2Dbのキメラでさらにヒトのβ2mを融合したものを発現しているトランスジェニックマウス(以下、HHDマウス)を使用した。このマウスは、マウスのβ2mおよびH-2Dbをノックアウトしているため、マウス由来のMHC class Iは細胞表面に露出していないと考えられる。
または、40 μl のVP2-M1/ wt SV40 VP1 VLP (500μg/ml)を、全身麻酔を施した8週齢のトランスジェニックマウスに点鼻投与の経鼻経路で投入した。
免疫したマウスから脾臓を摘出し、5 mlのRPMI-1640 培地の入ったφ6 cm ディッシュに置いた。ピンセットを用いて脾臓を培地内で、良く揉みほぐし、培地に溶出されたリンパ球を含む溶液を15 ml チューブに移した。もう一度、φ6 cm ディッシュを5 mlのRPMI-1640 培地で洗浄した。上清を上記の15 ml チューブに加え、総量 10 mlとした。すぐに15 ml チューブの底にたまる組織断片を残して、上清を再び新しい15 ml チューブに移した。その後、室温、1,200 rpmで5分間遠心分離し、リンパ球を含むペレットを得た。上清を除いて、ペレットをほぐした。その後、赤血球を除くために、250 μlのNH4Cl-トリス溶液を加えかき混ぜた。その後、すばやく10 mlのRPMI-1640 培地を加え、室温、1,2000 rpmで5分間遠心分離し、リンパ球を含むペレットを得た。上清を除いて、ペレットをほぐした。その後、再び10 mlのRPMI-1640 培地を加えた。変性した赤血球を極力吸わないようにしてピペットでリンパ球を含む培地を新しい15 ml チューブに移した。その後、再び室温、1,200 rpmで5分間遠心分離した。上清を除いた後、ペレットをほぐした。もう一度10 mlのRPMI-1640 培地で懸濁し、室温、1,200 rpmで5分間遠心分離した。上清を除いて、最後に2 mlの10% FCS混入RPMI-1640 培地で懸濁した。リンパ球を数えるために、490 μlの2%酢酸溶液に10 μlの上記懸濁溶液を加えた。ビュルケルチュルク血球計算版で、細胞数を算出した。1x107 細胞/mlとなるように10%FCS混入RPMI-1640 培地で希釈した。
マウスへ免疫後に、脾臓から回収したリンパ球中に、M1のCTLエピトープ配列(GILGFVFTL) に反応して誘導されるCTLが存在することを調べるために、ICS解析を行った。96 ウェル丸底プレートに10% FCS混入RPMI-1640 培地で25倍希釈したBD GolgiPlug (商標)(BD) を1 ウェル当り5 μl加えた。そこにさらに10% FCS混入RPMI-1640 培地で希釈した20 μMのM1のCTLエピトープのペプチド(GILGFVFTL, Operon)を100 μl加えた。ネガティブコントロールとして、ペプチドを含まない10% FCS混入RPMI-1640 培地を100 μl加えた。このウェルに上記で調製したリンパ球を100 μl加えた。その後、5時間、37℃、5% CO2でインキュベートした。
wt SV40 VP1遺伝子断片をpM01ベクター(シスメックス株式会社;図3にベクターマップを示す)のマルチクローニングサイト(制限酵素SmaI)へ組み込んだ。得られたプラスミドコンストラクトをwtSV40 VP1_pM01と呼ぶ。
さらにVP2-M1遺伝子をpM01ベクター(シスメックス株式会社)のマルチクローニングサイト(制限酵素SmaI)へ組み込んだ。得られたプラスミドコンストラクトをVP2-M1_pM01と呼ぶ。
VP2-M1/wt SV40 VP1 VLPの免疫
VP2-M1/ wt SV40 VP1 VLPを発現させたカイコから調製した磨砕液(リン酸緩衝液で調製したカイコ蛹磨砕液(図4A)、Tris緩衝液で調製したカイコ蛹磨砕液(図4B)、リン酸緩衝液で調製した加熱処理カイコ蛹磨砕液(図4C)、およびTris緩衝液で調製した加熱処理カイコ蛹磨砕液(図4D)) 100 μlを、8週齢のHHDマウスに腹腔内の経路で免疫した。免疫には、27ゲージのニードルを挿入した1 mlのシリンジ (マイジェクター、注射針付きシリンジ、インスリン用、TERUMO, SS-10M2713)を用いた。
VP2-M1/wt SV40 VP1 VLPの免疫
VP2-M1/ wt SV40 VP1 VLPを発現させたカイコから調製した磨砕液20 μlを、全身麻酔を施した8週齢のHHDマウスに点鼻投与の経鼻経路で投入した。投入から1週間後に、免疫したマウスの脾臓を回収した。実施例1に記載した方法でリンパ球を調製してIntra-cellular staining (ICS) 解析を行った。
VP2-M1/wt SV40 VP1 VLPの免疫
VP2-M1/ wt SV40 VP1 VLPを発現させたカイコ磨砕液(リン酸緩衝液で調製した非加熱カイコ蛹磨砕液100 μl(図6A)、Tris緩衝液で調製した非加熱カイコ蛹磨砕液100 μl(図6B)、およびTris緩衝液で調製した加熱処理カイコ蛹磨砕液100 μl(図6C))を、全身麻酔を施した8週齢のHHDマウスに経口経路で投入した。投入には、経口ゾンデ (経口ゾンデ針 マウス用 φ0.9 x L50 mm (A), ナツメセイサク, KN-348) を挿入した1 mlのシリンジ (TERUMO)を用いた。投入から1週間後に、免疫したマウスの脾臓を回収した。実施例1に記載した方法でリンパ球を調製してIntra-cellular staining (ICS) 解析を行った。
VP2-M1/wt SV40 VP1 VLPの免疫
100 μl、 または、200 μlのVP2-M1/ wt SV40 VP1 VLPを発現させたカイコ磨砕液を、全身麻酔を施した8週齢のHHDマウスに注腸経路で投入した。投入には、経口ゾンデ (DISPOSABLE経口ゾンデ、マウス用減菌済、5200S, FUCHIGAMI) を挿入した1 mlのシリンジ (TERUMO)を用いた。
実施例1に記載したとおりにして、wt SV40 VP1を発現するバキュロウイルスを作製した。
まず、wt SV40 VP2のアミノ末端 (N末端: amino terminus)をコードするコドンの上流にFLAGタグのコード配列(配列番号13)を付加して更にその上流にBamHIサイトを導入した。また、wt SV40 VP2のストップコドンを除いてEcoRIサイトを導入した。得られたポリヌクレオチドをpFastBac1プラスミドのBamHIサイト、および、EcoRIサイトを介して挿入し、wt SV40 VP2遺伝子を含むプラスミドを作製した。OVAタンパク質のN末端をコードするコドンの上流にGGGGSGGGGSGGGGSリンカー(配列番号3;核酸配列は配列番号14に示す)のコード配列を導入し、更にその上流にEcoRIサイトを導入した。また、OVAタンパク質コード配列の下流にストップコドンを付加して更にその下流にSal Iサイトを導入した。得られたポリヌクレオチドを、上記のwt SV40 VP2遺伝子を含むプラスミドのEcoRIサイト、および、Sal Iサイトを介して導入し、VP2コード配列の下流にOVAコード配列を融合した遺伝子を保持したプラスミドを作製した。
実施例1の「VP2-M1を含むwtSV40 VP1 VLPの調製」と同じ方法で、VP2-OVAを含むwtSV40 VP1 VLPを調製した。
上記の100 μl VP2-OVA/ wt SV40 VP1 VLP (500μg/ml) を8週齢のHHDマウスに腹腔内の経路で免疫した。免疫には、27ゲージのニードルを挿入した1 mlのシリンジ (マイジェクター、注射針付きシリンジ、インスリン用、TERUMO, SS-10M2713)を用いた。また、VP2-OVA/ wt SV40 VP1 VLP 免疫の対象群として100μL OVA 溶液 (1mg/mL)をマウスの皮下に接種した。
または、40 μl VP2-OVA/ wt SV40 VP1 VLP (500μg/ml)を全身麻酔を施した8週齢のHHDマウスに点鼻投与の経鼻経路で投入した。
OVAに反応して血清中に誘導される抗OVA抗体が存在することを確認するために、上記のようにして回収したマウス血清を用いて、抗体検出を次のようにして行った。OVAをTBS (20mM Tris-HCl (pH 8.0), 150mM NaCl)に1μg/100μLになるように溶解した。これを96穴プレート(Nunc MaxiSorp flat-bottom 96 well plate)の各ウェルに100μLずつ添加した。室温で2時間、または4℃で一晩静置し、OVAをプレート底面に結合させた。OVA固定化後、TBS-T (20mM Tris-HCl (pH 8.0), 150mM NaCl、0.005%(w/v) Tween 20)でプレートを洗浄した。その後、5%(w/v)スキムミルク溶液を各ウェルに300μLずつ添加し室温で2時間、または4℃で一晩静置した。スキムミルク溶液を除いた後、TBS-Tで各ウェルを洗浄した。上記で得られたマウス血清をTBS-Tで所望の濃度に希釈した溶液を50μLずつ各ウェルに添加し室温で1時間静置した。マウス血清溶液を取り除き、TBS-Tで各ウェルを洗浄した。その後、TBS-Tで2,000倍に希釈したHRP標識抗マウスIgG (H+L鎖) (MBL社)を各ウェルに100μLずつ添加して室温で1時間静置した。静置後、各ウェルをTBS-Tで洗浄した。TMBパーオキシダーゼ EIA 複合体基質キット(Bio-Rad社)をキット付属の説明書にしたがって各ウェルに添加し、各ウェル中に存在するHRP標識抗マウスIgG (H+L鎖)を測定した。なお、測定はiMark microplate Absorbance Reader (Bio Rad 社)を用いて655nmの吸光値を測定した。
Claims (7)
- ウイルス様粒子を含む免疫誘導剤であって、
前記ウイルス様粒子が、
・SV40由来の外殻タンパク質VP1と、抗原結合タンパク質とを含み、
・前記外殻タンパク質VP1が前記ウイルス様粒子の外殻を構成し、前記抗原結合タンパク
質が前記外殻内に内包されており、
・前記抗原結合タンパク質が、抗原と、SV40由来の殻内ペプチドVP2及び/又はVP3との融合タンパク質であり、
・前記抗原に対する抗体の産生及び細胞傷害性T細胞を誘導する、
前記免疫誘導剤。 - 固形製剤、半固形製剤、液状製剤、注射剤又は坐剤の形態にある、請求項1に記載の免疫誘導剤。
- 経口投与、経鼻投与、鼻内投与、口腔投与、注腸投与、腹腔内注射、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、組織の間隙の空間への注射又は経皮的投与により投与される、請求項1又は2に記載の免疫誘導剤。
- 前記VP1が、配列番号2で表されるアミノ酸配列を有する、請求項1〜3のいずれか1つに記載の免疫誘導剤。
- 抗原に対する抗体の産生及び細胞傷害性T細胞を誘導する免疫誘導剤の製造方法であって、
SV40由来の外殻タンパク質VP1と、抗原結合タンパク質とを混合することにより、ウイルス様粒子を調製する工程を含み、
前記外殻タンパク質VP1が前記ウイルス様粒子の外殻を構成し、前記抗原結合タンパク質が、抗原と、SV40由来の殻内ペプチドVP2及び/又はVP3との融合タンパク質であって前記外殻内に内包されている、
ウイルス様粒子を含む免疫誘導剤の製造方法。 - 前記調製工程の前に
前記外殻タンパク質をコードするDNAと、前記抗原結合タンパク質をコードするDNAとを宿主細胞に導入し、前記宿主細胞に前記外殻タンパク質と前記抗原結合タンパク質とを発現させることにより、前記外殻タンパク質と前記抗原結合タンパク質とを取得する工程、
を含む、請求項5に記載の製造方法。 - 前記宿主細胞が、昆虫細胞、大腸菌、酵母、植物細胞からなる群より選択される、請求項6に記載の製造方法。
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