CN110079514A - 一种制备蛋白酶3重组蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程和生物技术领域,具体涉及一种制备蛋白酶3重组蛋白的方法。本发明以家蚕的五龄期幼虫作为生物反应器,通过家蚕‑杆状病毒表达***实现大规模、低成本、高效率地制备具免疫活性的重组人PR3;通过本发明的方法,重组杆状病毒感染五龄家蚕,感染后,PR3融合蛋白在家蚕中表达并被释放到血淋巴中,经分离纯化后,每条家蚕可制备高达2微克左右目的蛋白酶3,具有很高的表达量,有效降低生产成本,便于大规模的工业化生产,具有很好的经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程和生物技术领域,具体涉及一种制备蛋白酶3重组蛋白的方法。
背景技术
蛋白酶3(Proteinase 3,PR3)是中性粒细胞胞浆嗜天青颗粒中的一种丝氨酸蛋白酶,分子量约为29KDa的糖蛋白。它是抗中性粒细胞和单核细胞胞浆抗体(Anti-NeutrophilCytoplasmic Antibodies,ANCA)的主要靶抗原,约占80% - 90%。通过ANCA,利用间接免疫荧光法的两种荧光模式(胞浆型cANCA和核周型pANCA),对自身免疫***性血管炎和炎症性等疾病进行诊断已成为既定工具。例如,由于cANCA 主要识别PR3,通过PR3-cANCA诊断韦格纳氏肉芽肿(WG)的特异性大于95%,通常它也被用于其他多种原发性血管炎的检测。PR3-cANCA在临床上另一重要应用价值在于该抗体效价与病情活动一致,在WG等原发性血管炎患者常被作为判断标准。
为了深入进行PR3-cANCA病理生理的研究和临床诊断应用,获取大量具有免疫反应活性的PR3蛋白作为cANCA靶抗原成为全世界共同努力的目标。临床上用于自身免疫***相关疾病体外诊断的PR3以人天然蛋白(例如中性白细胞来源)为最佳,但天然蛋白的分离纯化困难,得率低,纯化所得产品纯度较低,夹带一定量的杂蛋白;产品的来源各异,批次之间不一致,且成本昂贵,严重制约了自身免疫***相关疾病体外诊断技术的发展。
发明内容
有鉴于此,本发明的主要目的在于提供一种体外制备蛋白酶3重组蛋白的方法,根据本发明的实施例,可以在体外表达***中实现高效、廉价、大规模的制备具有高免疫反应活性的蛋白酶3重组蛋白。
为实现上述发明目的,本发明提供如下技术方案:
一种制备蛋白酶3重组蛋白的方法,所述方法包括以下步骤:
(1)将人蛋白酶3的基因片段PR3-His克隆到含有昆虫分泌信号肽Mel的转移质粒pMelBacA上,合成带有昆虫分泌信号肽Mel和人PR3序列的重组质粒pMelBacA-PR3-His;。
(2)以步骤(1)合成的重组质粒pMelBacA-PR3-His为模板构建含有昆虫分泌信号肽Mel的重组供体载体pFastBac1-Mel-PR3-His:
(3)将步骤(2)构建的重组供体载体pFastBac1-Mel-PR3-His与杆状病毒共同转染家蚕卵巢细胞BmN,制备重组病毒rBm-pFastBac1-Mel-PR3-His;
(4)将步骤(3)中制备的重组病毒rBm-pFastBac1-Mel-PR3-His接种转染家蚕,在家蚕中表达蛋白酶3重组蛋白;
(5)回收转染后家蚕的血淋巴;
(6)分离纯化血淋巴中的蛋白酶3重组蛋白。
优选地,本发明步骤(1)中所述的重组质粒pMelBacA-PR3-His的制备方法为:对人PR3 cDNA为模板进行第一轮PCR扩增反应,所述PCR扩增引物如序列表中SEQ ID NO.1-2所示,扩增出PR3-His片段,以Xho I和Kpn I分别对对PR3-His片段、转移质粒pMelBacA进行双酶切反应;对两种双酶切产物进行纯化、连接,获得带有昆虫分泌信号肽Mel和人PR3序列的重组质粒pMelBacA-PR3-His;
优选地,本发明步骤(2)中所述的重组供体载体pFastBac1-Mel-PR3-His的制备为:以步骤(1)中制备的重组质粒pMelBacA-PR3-His为模板进行第二轮PCR扩增反应得到Mel-PR3-His目的片段;以Xba I和Kpn I对Mel-PR3-His目的片段、供体质粒pFastBac1进行双酶切反应,对两种双酶切产物进行纯化、连接,将连接后的产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中,培养后抽提质粒DNA;以Xba I和Kpn I对抽提的质粒DNA进行双酶切鉴定,筛选得到含有昆虫分泌信号肽Mel重组供体载体pFastBac1-Mel-PR3-His。
优选地,本发明步骤(3)中所述重组病毒rBm-pFastBac1-Mel-PR3-His的制备方法为将步骤(2)构建的重组供体载体pFastBac1-Mel-PR3-His转染大肠杆菌,重组供体载体中含有的Tn7转座元件与家蚕BmNPV杆状病毒穿梭载体Bacmid发生转座,抽提发生转座的重组穿梭载体Bacmid DNA并转染家蚕卵巢细胞BmN,制备出重组病毒rBm-pFastBac1-Mel-PR3-His。
优选地,本发明步骤(4)中所述的接种转染为将重组病毒rBm-pFastBac1-Mel-PR3-His皮下注射至家蚕体内。
优选地,本发明步骤(4)中所述的家蚕为五龄期家蚕。
优选地,本发明步骤(5)中所述的血淋巴为家蚕转染后第4-5天产生的血淋巴。
优选地,本发明步骤(6)中所述的分离纯化为将血淋巴稀释后先经过镍柱亲和层析纯化,纯化依次经离子交换柱Mono Q及Mono S纯化后得到高纯度的目的产物蛋白酶3重组蛋白;所述的稀释为用两倍体积的缓冲液稀释血淋巴。
本发明另一方面在于使用本发明方法生产的蛋白酶3重组蛋白。
本发明的有益效果是:
本发明以家蚕幼虫作为生物反应器,通过家蚕-杆状病毒表达***实现大规模、低成本、高效率地制备具免疫活性的重组人PR3 。作为真核表达***的代表,家蚕-杆状病毒表达***具有高表达水平及强大的蛋白质翻译后修饰功能等优点。通过家蚕-杆状病毒***表达的人重组蛋白具有很高的生物活性,其抗原性、免疫原性与人的天然蛋白相似,且家蚕饲养简单方便,成本低。
通过本发明的方法,重组杆状病毒感染五龄期家蚕,感染4-5天后,PR3融合蛋白在家蚕中表达并被释放到血淋巴中,经分离纯化后,每条家蚕可制备高达2微克左右目的蛋白酶3,具有很高的表达量;同时,经过实施例验证,本方法制备的蛋白酶3与人PR3蛋白100%同源,够被PR3-ANCA阳性血清所识别。家蚕可以大规模的商业化无菌饲养,家蚕作为生物反应器制备PR3 避免了AcMNPV杆状病毒-昆虫细胞表达***中细胞培养所需昂贵的培养基和胎牛血清,有效降低生产成本,便于大规模的工业化生产,具有很好的经济效益。
附图说明
图1是实施例1中第一轮PCR扩增反应获得的基因片段PR3-His的琼脂糖凝胶电泳图;M为DNA分子量标准;编号1代表基因片段PR3-His;
图2是对双酶切反应后的转移质粒pMelBacA和PR3-His片段进行琼脂糖凝胶电泳的结果图;M为DNA分子量标准;编号C代表以相同方法制备的含人髓过氧化物酶MPO的重组转移载体双酶切反应的凝胶电泳图;编号1代表转移质粒pMelBacA和PR3-His片段;
图3是实施例1中基因片段Mel-PR3-His的琼脂糖凝胶电泳图;M为DNA分子量标准;编号1代表基因片段Mel-PR3-His;
图4是实施例1中随机挑选的2个双酶切反应后的重组供体载体pFastBac1-Mel-PR3-His的琼脂糖凝胶电泳图;M为DNA分子量标准;编号1~2代表基因片段载体pFastBac1-Mel-PR3-His;
图5是实施例2中重组穿梭载体Bacmid DNA的PCR扩增结果图;M为DNA分子量标准;编号1~2代表发生了转座的白斑重组穿梭载体Bacmid DNA,编号3代表蓝斑非重组Bacmid DNA;
图6是实施例3中家蚕接种病毒后重组人PR3在血淋巴中不同时间的表达量分析图;
图7是实施例4中镍柱亲和层析纯化人PR3蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳分析图;M为标准蛋白Marker,单位为kDa;编号Bc为血淋巴上清液;编号Ft为加入镍柱后没有被结合的杂蛋白馏分;编号W1~W4为清洗下来含杂蛋白的馏分;编号E1~E9为洗脱下来的馏分;
图8是实施例4中Mono Q离子交换柱纯化人PR3蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳分析图, Bc为镍-亲和层析柱纯化后合并的馏分, 8-27为梯度洗脱下来的馏分;M为标准蛋白Marker;
图9是实施例4中Mono S离子交换柱纯化人PR3蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳分析图,Bc为Mono Q柱纯化后合并的第10馏分经透析后预上Mono S柱前的样品;W为清洗的杂蛋白馏分;7-20为梯度洗脱下来的馏分;M为标准蛋白Marker;
图10是实施例4中目的蛋白PR3的Western Blot鉴定图;其中,左图中一抗是抗His-标签的鼠单克隆抗体,右图中一抗是抗人PR3鼠单克隆抗体,图中泳道1均表示纯化后的重组PR3蛋白免疫反应样品,泳道M均表示标准蛋白Marker;
图11是实施例5中PR3-His蛋白的MALDI-TOF鉴定序列覆盖结果图。
具体实施方式
下面结合附图以及具体实施例对本发明进一步说明,但本发明的保护范围并不限于此。下面结合附图以及具体实施例对本发明进一步说明,但本发明的保护范围并不限于此。如无特殊说明,本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品,均可以通过商业渠道购买获得。
以下实施例所用主要仪器和材料:
PCR相关试剂、酶切反应、连接试剂盒等常规试剂均购自PROMEGA公司;LB培养基、昆虫细胞培养相关试剂、CELLFECTIN Reagent等化学试剂为GIBCO BRL公司产品;胶回收试剂盒购自QIAGEN公司;PCR产物回收试剂盒购自OMEGA公司;人源蛋白酶3(PR3)的cDNA来源于已公开的DNA序列 (GenBank: BC096183.1),购自PROTEINTECH GROUP公司;含有昆虫分泌信号肽Mel的杆状病毒转移质粒pMelBacA、家蚕卵巢细胞BmN、供体质粒pFastBac1以及大肠杆菌BmDH10Bac为INVITROGEN公司产品;大肠杆菌DH5α为Takara公司产品;家蚕为品种306,来源于中国农科院蚕业研究所;His标签蛋白纯化专用缓冲液购自Pierce公司;离子交换柱Mono Q和Mono S均购自GE HEALTHCARE公司;抗His-标签的鼠单克隆抗体(27E8)购自CellSignaling Technology公司;抗人PR3鼠单克隆抗体(D-1)为SANTACRUZ BIOTECHNOLOGY公司产品;人PR3蛋白ELISA检测试剂盒为卡迈舒(上海)生物科技有限公司产品(Cat No.KMS-EL9531c)。
以下实施例中未作具体说明的实验操作方法均参照《分子克隆实验指南》(Sambrook等编著,科学出版社,1992年版)及产品说明书进行。
实施例一:含有昆虫分泌信号肽Mel重组供体载体pFastBac1-Mel-PR3-His的构建
以人PR3 (GenBankNo: X55668.1)的cDNA为模板设计PCR扩增引物,在人PR3基因序列的N-端和C-端分别引入Xho I和Kpn I酶切位点,以便将该片段连接到同样经双酶切之后的质粒载体中;其C-端引入编码6个组氨酸的碱基,以利于表达的蛋白纯化:引物如下:
正向引物-1(SEQ ID NO.1):AGGAGACTCGAGATCGTGGGCGGGCACGAGGCG;反向引物-1(SEQID NO.2): TACGGTACCCTAGTGATGGTGATGGTGATGACGGCGCAGCGTGGAACG。
应用以上引物,以人PR3的cDNA为模板进行第一轮PCR扩增反应, 反应体系及条件如表1所示:
表1. PCR扩增反应体系及条件条
组分 | 体积/μL(50μL) |
5×Pfu 缓冲液 | 10 |
2.5mM dNTPs | 3 |
Pfu酶 | 0.5 |
正向引物(primer F) | 1 |
反向引物(primer R) | 1 |
cDNA | 0.3 |
ddH<sub>2</sub>O | 34.2 |
PCR反应条件:94 ℃预变性4 min,94 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1.5min,循环30次后72 ℃再延伸10 min。第一轮PCR扩增后将获得的含His-标签的PR3基因片段PR3-His进行1%琼脂糖凝胶电泳。
图1是基因片段PR3-His的琼脂糖凝胶电泳图,由图1可见,在708 bp左右获得PR3-His的目的片段。用手术刀切割下含PR3-His片段的凝胶,以胶回收试剂盒回收扩增出的PR3-His片段,以Xho I和Kpn I对回收的PR3-His片段进行双酶切反应;同时,以Xho I和KpnI对含有昆虫分泌信号肽Mel(昆虫分泌信号肽Mel基因序列见序列表 SEQ ID NO.3:ATGAAATTCTTAGTCAACGTTGCCCTTGTTTTTATGGTCGTATACATTTCTTACATCTATGCG)的转移质粒pMelBacA进行双酶切反应,再用PCR产物纯化试剂盒分别对上述两种双酶切反应产物进行纯化,将纯化后的PCR产物通过连接试剂盒连接到转移质粒上,获得带有昆虫分泌信号肽Mel和人PR3序列的重组质粒pMelBacA-PR3-His。
图2是对双酶切反应后的转移质粒pMelBacA和PR3-His片段进行琼脂糖凝胶电泳的结果图;M为DNA分子量标准;编号C代表以相同方法制备的含人髓过氧化物酶MPO的重组转移载体双酶切反应的凝胶电泳图;编号1代表双酶切后的转移质粒pMelBacA和PR3-His片段,在708 bp左右获得PR3-His的目的片段,在2277 bp左右获得酶切后的转移质粒pMelBacA的片段。经双酶切鉴定,成功将PR3-His片段克隆到含有昆虫分泌信号肽Mel的转移质粒pMelBacA上。
设计正向引物-2(SEQ ID NO.4): 5’-CCGTCTAGAATGAAATTCTTAGTCAAC-3’;应用正向引物-2和反向引物1,以上述步骤中制备的重组质粒pMelBacA-PR3-His为模板进行第二轮PCR扩增反应,反应体系及条件同第一轮PCR扩增。
图3是基因片段Mel-PR3-His的琼脂糖凝胶电泳图,图中可见,在792 bp左右获得Mel-PR3-His的目的片段。用PCR回收试剂盒对从凝胶上切割下的含有目的片段Mel-PR3-His的扩增产物进行回收;以Xba I和Kpn I对回收产物进行双酶切反应,同时,以Xba I和Kpn I对供体质粒pFastBac1也进行双酶切反应,再通过PCR产物纯化试剂盒分别对两种双酶切反应产物进行纯化;将纯化后的PCR产物Mel-PR3-His通过连接试剂盒连接到酶切后的pFastBac1上,连接后的产物随后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中,并涂板于含100 µg/mL氨苄青霉素的LB培养基平板;挑选37℃倒置培养过夜的单个菌落,经LB液体培养基培养,抽提质粒DNA;以Xba I和Kpn I对抽提的质粒DNA进行双酶切鉴定,筛选出已***Mel-PR3-His基因片段的重组供体质粒,通过DNA序列检测,比对结果得到含有昆虫分泌信号肽Mel重组供体载体pFastBac1-Mel-PR3-His。
图4是随机挑选的2个双酶切反应后的重组供体载体pFastBac1-Mel-PR3-His的凝胶电泳图,图中可见,在792bp左右是Mel-PR3-His的目的片段,在4776 bp左右是质粒pFastBac1的片段。至此,通过测序和双酶切鉴定,获得了含有昆虫分泌信号肽Mel重组供体载体pFastBac1-Mel-PR3-His。
实施例二:重组家蚕杆状病毒rBm-pFastBac1-Mel-PR3-His的制备
将实施例一中所构建的含有昆虫分泌信号肽Mel重组供体载体pFastBac1-Mel-PR3-His转染大肠杆菌BmDH10Bac,载体pFastBac1-Mel-PR3-His中含有的Tn7转座元件与家蚕BmNPV杆状病毒穿梭载体Bacmid发生转座,经蓝白斑筛选后对获得的重组穿梭载体进行鉴定。随机挑选2个白斑重组穿梭载体Bacmid DNA,并以蓝斑非重组Bacmid DNA作为对照,应用特异性通用pUC/M13正向引物(SEQ ID NO.5):5’-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3’和反向引物(SEQ ID NO.6):5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’,对重组穿梭载体Bacmid DNA进行PCR反应验证。
图5是重组和非重组穿梭载体Bacmid DNA的PCR扩增结果图;M为DNA分子量标准;编号1~2代表白斑重组穿梭载体Bacmid DNA的PCR结果,编号3代表未发生转座的蓝斑非重组Bacmid DNA的PCR结果;如图5所示,对照组蓝斑非重组Bacmid DNA未发生Tn7转座子转座的PCR反应产物在300 bp左右出现目的条带,而随机挑选的2个白斑重组穿梭载体BacmidDNA均在预期位置3161 bp左右出现条带,表明所挑选的2个白斑均通过Tn7转座子发生了转座, Mel-PR3-His基因片段已成功地通过同源重组被整合到家蚕穿梭载体Bacmid DNA上。
以CELLFECTIN Reagent介导重组穿梭载体Bacmid DNA转染家蚕卵巢细胞BmN,经两轮病毒的扩增,获得含昆虫分泌信号肽Mel和编码人PR3基因序列且带有His-标签的重组家蚕杆状病毒rBm-pFastBac1-Mel-PR3-His,对其进行病毒滴度测定,测定结果可达2×107 PFU/mL,表明病毒的浓度可以用于感染五龄家蚕。
实施例三:重组家蚕杆状病毒rBm-pFastBac1-Mel-PR3-His在五龄期家蚕中的表达情况
将实施例二所制备的重组家蚕杆状病毒rBm-pFastBac1-Mel-PR3-His接种转染至五龄期后第二天的家蚕,每条家蚕皮下注射5 µL重组家蚕杆状病毒rBm-pFastBac1-Mel-PR3-His,即:每头家蚕接种1.0×105 PFU病毒。接种病毒后每隔24小时收集一次家蚕血淋巴,同时将未接种病毒的家蚕作为阴性对照组,与接种病毒后的家蚕一同收集血淋巴,应用人PR3蛋白ELISA检测试剂盒,在不同时间收集5头家蚕的混合血淋巴作为样本,测定血淋巴中所含人PR3蛋白与微孔板上所包被的人PR3抗体的酶联免疫反应活性,计算出接种病毒后重组人PR3在血淋巴中的表达量。
图6是家蚕接种病毒后重组人PR3在血淋巴中不同时间的表达量分析图;横坐标表示感染病毒后收集家蚕血淋巴的时间,纵坐标表示血淋巴中人PR3与人PR3蛋白ELISA检测标准品对比计算得到的浓度;图中可见,病毒接种后48小时能够检测到人PR3蛋白的表达,至96和120小时时达最高值,说明所表达的重组人PR3经由昆虫分泌信号肽介导而被成功地释放到血淋巴中,并能够被人PR3蛋白ELISA检测试剂盒微孔板上所包被的抗人源PR3抗体所识别。
实施例四:在五龄期家蚕中表达并释放到血淋巴中的重组人PR3的分离纯化
根据实施例三中重组人PR3蛋白在五龄期家蚕中的表达可知,表达量在接种病毒后第4和第5天时达最高值。据此,接种600只家蚕,收集接种4-5天的家蚕血淋巴冻存于-800C冰箱备用;取1mL所收集的血淋巴样品,用两倍体积的50mM磷酸缓冲液稀释,高速离心后取血淋巴上清液,经镍-柱分离纯化; 图7是镍-柱亲和层析纯化人PR3蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳分析图;M为标准蛋白Marker,单位为kDa;编号Bc为血淋巴上清液;编号Ft为加入镍柱后没有被结合的杂蛋白馏分;编号W1~W4为清洗下来含杂蛋白的馏分;编号E1~E9为洗脱下来的馏分。图中可见,疑似目的蛋白从第一馏分到第四馏分(E1-E4)被洗脱,但其含较多成分的杂蛋白;合并E1-E4馏分进行透析除盐,然后经离子交换柱Mono Q纯化。图8是Mono Q离子交换柱纯化人PR3蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳分析图,图中,Bc为镍-柱亲和层析纯化后合并的馏分,即经透析后预加入Mono Q柱前的样品;8-27为梯度洗脱下来的馏分;M为标准蛋白Marker;如图8所示,较纯的目的蛋白在第10馏分被洗脱,而所含杂蛋白在第11馏分开始被分开;合并多批次经Mono Q纯化后的第10馏分,经透析除盐后再通过离子交换柱Mono S进行纯化。图9是Mono S离子交换柱纯化人PR3蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳分析图,如图9箭头所示,高纯度的目的蛋白在第14和15馏分被洗脱,其分子量大约为32 kDa,与昆虫细胞Sf-9中所表达的34kDa重组人PR3蛋白的大小一致。
分别以抗His-标签的鼠单克隆抗体(27E8)和抗人PR3鼠单克隆抗体(D-1)作为一抗,以标记了碱性磷酸酶的抗鼠源IgG作为二抗,对经Mono S柱纯化后的第15号馏分进行Western Blot鉴定,通过碱性磷酸酶试剂盒进行显色反应。图10是目的蛋白PR3的WesternBlot鉴定图,其中,左图是应用抗His-标签的鼠单克隆抗体作为一抗的免疫反应,以α -His表示;右图是应用抗人PR3鼠单克隆抗体作为一抗的免疫反应,以α-PR3(Human)表示;图中泳道1表示纯化后的重组PR3蛋白免疫反应样品,泳道M表示标准蛋白Marker;如图10所示,所制备的分子量约为32 kDa的目的蛋白不但被抗His-标签的抗体所识别,同时也能够被商品化抗人源PR3的抗体所识别,初步验证了所纯化的蛋白为重组人PR3。获得的重组人PR3纯度接近100%、分子量约为32 kDa,经过测定得知,平均每条家蚕可获得约2微克纯化后的重组人PR3目的蛋白。
实施例五:重组人PR3目的蛋白质谱鉴定
对实施例四中所得到的重组人PR3目的蛋白进行一级质谱(MS)和二级质谱(MS/MS)综合分析,应用Mascot 2.2软件,通过NCBI数据库,对所测蛋白进行鉴定。质谱分析条件:仪器型号:5800 MALDI-TOF/TOF(AB SCIEX公司);检测方式:正离子,反射模式;样品靶:384Opti-TOF 123 mm ╳81 mm ss AB SCIEX;基质:CHCA;分析结果如图11所示,质谱获得的肽段以加深字体表示,质谱获得的肽段与NCBI数据库中的人PR3氨基酸序列相匹配的覆盖率为25.68%。利用Mascot软件与数据库中人PR3蛋白对比得知重组蛋白得分405,根据软件的算法及定义该蛋白与人PR3蛋白100%同源。因此通过质谱分析,进一步确认了经分离纯化后所获得的蛋白为人PR3。
以上仅是本发明的优选实施方式,应当指出的是,上述优选实施方式不应视为对本发明的限制,本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明的精神和范围内,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏大学
<120> 一种制备蛋白酶3重组蛋白的方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aggagactcg agatcgtggg cgggcacgag gcg 33
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<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tacggtaccc tagtgatggt gatggtgatg acggcgcagc gtggaacg 48
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgaaattct tagtcaacgt tgcccttgtt tttatggtcg tatacatttc ttacatctat 60
gcg 63
<210> 4
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<212> DNA
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<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agcggataac aatttcacac agg 23
Claims (10)
1.一种制备蛋白酶3重组蛋白的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将人蛋白酶3的基因片段PR3-His克隆到含有昆虫分泌信号肽Mel的转移质粒pMelBacA上,合成带有昆虫分泌信号肽Mel和人PR3序列的重组质粒pMelBacA-PR3-His;
(2)以步骤(1)合成的重组质粒pMelBacA-PR3-His为模板构建含有昆虫分泌信号肽Mel的重组供体载体pFastBac1-Mel-PR3-His:
(3)将步骤(2)构建的重组供体载体pFastBac1-Mel-PR3-His与大肠杆菌共同转染家蚕卵巢细胞BmN,制备重组病毒rBm-pFastBac1-Mel-PR3-His;
(4)将步骤(3)中制备的重组病毒rBm-pFastBac1-Mel-PR3-His接种转染家蚕,在家蚕中表达蛋白酶3重组蛋白;
(5)回收转染后家蚕的血淋巴;
(6)分离纯化血淋巴中的蛋白酶3重组蛋白。
2.根据权利要求1所述的制备蛋白酶3重组蛋白的方法,其特征在于,步骤(1)中所述的重组质粒pMelBacA-PR3-His的制备方法为:对人PR3 cDNA为模板第一轮PCR扩增得到PR3-His片段,以Xho I和Kpn I分别对对PR3-His片段、转移质粒pMelBacA进行双酶切反应;对两种双酶切产物进行纯化、连接,获得带有昆虫分泌信号肽Mel和人PR3序列的重组质粒pMelBacA-PR3-His。
3.根据权利要求1所述的制备蛋白酶3重组蛋白的方法,其特征在于,步骤(2)中所述的重组供体载体pFastBac1-Mel-PR3-His的制备方法为:以步骤(1)中制备的重组质粒pMelBacA-PR3-His为模板进行第二轮PCR扩增反应得到Mel-PR3-His目的片段;以Xba I和Kpn I对Mel-PR3-His目的片段、供体质粒pFastBac1进行双酶切反应,对两种双酶切产物进行纯化、连接,将连接后的产物转化到大肠杆菌感受态细胞,抽提质粒DNA进行鉴定筛选得到含有昆虫分泌信号肽Mel重组供体载体pFastBac1-Mel-PR3-His。
4.根据权利要求1所述的制备蛋白酶3重组蛋白的方法,其特征在于,步骤(3)中所述重组病毒rBm-pFastBac1-Mel-PR3-His的制备方法为:将步骤(2)构建的重组供体载体pFastBac1-Mel-PR3-His转染大肠杆菌,重组供体载体中的Tn7转座元件与家蚕BmNPV杆状病毒穿梭载体Bacmid发生转座,抽提发生转座的重组穿梭载体Bacmid DNA并转染家蚕卵巢细胞BmN,制备出重组病毒rBm-pFastBac1-Mel-PR3-His。
5.根据权利要求1所述的制备蛋白酶3重组蛋白的方法,其特征在于,步骤(4)中所述的接种转染为将重组病毒rBm-pFastBac1-Mel-PR3-His皮下注射至家蚕体内。
6.根据权利要求1所述的制备蛋白酶3重组蛋白的方法,其特征在于,步骤(4)中所述的家蚕为五龄期家蚕。
7.根据权利要求1所述的制备蛋白酶3重组蛋白的方法,其特征在于,步骤(5)中所述的血淋巴为家蚕转染后第4-5天产生的血淋巴。
8.根据权利要求1所述的制备蛋白酶3重组蛋白的方法,其特征在于,步骤(6)中所述的分离纯化为将血淋巴稀释后先经过镍柱亲和层析纯化,纯化依次经离子交换柱Mono Q及Mono S纯化后得到高纯度的目的产物蛋白酶3重组蛋白。
9.根据权利要求8所述的制备蛋白酶3重组蛋白的方法,其特征在于,所述的稀释为用两倍体积的缓冲液稀释血淋巴。
10.根据权利要求1-9任一项所述方法生产的蛋白酶3重组蛋白。
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