CN110079514A - 一种制备蛋白酶3重组蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因工程和生物技术领域，具体涉及一种制备蛋白酶3重组蛋白的方法。本发明以家蚕的五龄期幼虫作为生物反应器，通过家蚕‑杆状病毒表达***实现大规模、低成本、高效率地制备具免疫活性的重组人PR3；通过本发明的方法，重组杆状病毒感染五龄家蚕，感染后，PR3融合蛋白在家蚕中表达并被释放到血淋巴中，经分离纯化后，每条家蚕可制备高达2微克左右目的蛋白酶3，具有很高的表达量，有效降低生产成本，便于大规模的工业化生产，具有很好的经济效益。

Description

一种制备蛋白酶3重组蛋白的方法
技术领域
本发明涉及基因工程和生物技术领域，具体涉及一种制备蛋白酶3重组蛋白的方法。
背景技术
蛋白酶3(Proteinase 3，PR3)是中性粒细胞胞浆嗜天青颗粒中的一种丝氨酸蛋白酶，分子量约为29KDa的糖蛋白。它是抗中性粒细胞和单核细胞胞浆抗体（Anti-NeutrophilCytoplasmic Antibodies，ANCA）的主要靶抗原，约占80% - 90%。通过ANCA，利用间接免疫荧光法的两种荧光模式（胞浆型cANCA和核周型pANCA），对自身免疫***性血管炎和炎症性等疾病进行诊断已成为既定工具。例如，由于cANCA 主要识别PR3，通过PR3-cANCA诊断韦格纳氏肉芽肿(WG)的特异性大于95%，通常它也被用于其他多种原发性血管炎的检测。PR3-cANCA在临床上另一重要应用价值在于该抗体效价与病情活动一致，在WG等原发性血管炎患者常被作为判断标准。
为了深入进行PR3-cANCA病理生理的研究和临床诊断应用，获取大量具有免疫反应活性的PR3蛋白作为cANCA靶抗原成为全世界共同努力的目标。临床上用于自身免疫***相关疾病体外诊断的PR3以人天然蛋白（例如中性白细胞来源）为最佳，但天然蛋白的分离纯化困难，得率低，纯化所得产品纯度较低，夹带一定量的杂蛋白；产品的来源各异，批次之间不一致，且成本昂贵，严重制约了自身免疫***相关疾病体外诊断技术的发展。
发明内容
有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种体外制备蛋白酶3重组蛋白的方法，根据本发明的实施例，可以在体外表达***中实现高效、廉价、大规模的制备具有高免疫反应活性的蛋白酶3重组蛋白。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
一种制备蛋白酶3重组蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：
（1）将人蛋白酶3的基因片段PR3-His克隆到含有昆虫分泌信号肽Mel的转移质粒pMelBacA上，合成带有昆虫分泌信号肽Mel和人PR3序列的重组质粒pMelBacA-PR3-His；。
（2）以步骤（1）合成的重组质粒pMelBacA-PR3-His为模板构建含有昆虫分泌信号肽Mel的重组供体载体pFastBac1-Mel-PR3-His：
（3）将步骤（2）构建的重组供体载体pFastBac1-Mel-PR3-His与杆状病毒共同转染家蚕卵巢细胞BmN，制备重组病毒rBm-pFastBac1-Mel-PR3-His；
（4）将步骤（3）中制备的重组病毒rBm-pFastBac1-Mel-PR3-His接种转染家蚕，在家蚕中表达蛋白酶3重组蛋白；
（5）回收转染后家蚕的血淋巴；
（6）分离纯化血淋巴中的蛋白酶3重组蛋白。
优选地，本发明步骤（1）中所述的重组质粒pMelBacA-PR3-His的制备方法为：对人PR3 cDNA为模板进行第一轮PCR扩增反应，所述PCR扩增引物如序列表中SEQ ID NO.1-2所示，扩增出PR3-His片段，以Xho I和Kpn I分别对对PR3-His片段、转移质粒pMelBacA进行双酶切反应；对两种双酶切产物进行纯化、连接，获得带有昆虫分泌信号肽Mel和人PR3序列的重组质粒pMelBacA-PR3-His；
优选地，本发明步骤（2）中所述的重组供体载体pFastBac1-Mel-PR3-His的制备为：以步骤（1）中制备的重组质粒pMelBacA-PR3-His为模板进行第二轮PCR扩增反应得到Mel-PR3-His目的片段；以Xba I和Kpn I对Mel-PR3-His目的片段、供体质粒pFastBac1进行双酶切反应，对两种双酶切产物进行纯化、连接，将连接后的产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，培养后抽提质粒DNA；以Xba I和Kpn I对抽提的质粒DNA进行双酶切鉴定，筛选得到含有昆虫分泌信号肽Mel重组供体载体pFastBac1-Mel-PR3-His。
优选地，本发明步骤（3）中所述重组病毒rBm-pFastBac1-Mel-PR3-His的制备方法为将步骤（2）构建的重组供体载体pFastBac1-Mel-PR3-His转染大肠杆菌，重组供体载体中含有的Tn7转座元件与家蚕BmNPV杆状病毒穿梭载体Bacmid发生转座，抽提发生转座的重组穿梭载体Bacmid DNA并转染家蚕卵巢细胞BmN，制备出重组病毒rBm-pFastBac1-Mel-PR3-His。
优选地，本发明步骤（4）中所述的接种转染为将重组病毒rBm-pFastBac1-Mel-PR3-His皮下注射至家蚕体内。
优选地，本发明步骤（4）中所述的家蚕为五龄期家蚕。
优选地，本发明步骤（5）中所述的血淋巴为家蚕转染后第4-5天产生的血淋巴。
优选地，本发明步骤（6）中所述的分离纯化为将血淋巴稀释后先经过镍柱亲和层析纯化，纯化依次经离子交换柱Mono Q及Mono S纯化后得到高纯度的目的产物蛋白酶3重组蛋白；所述的稀释为用两倍体积的缓冲液稀释血淋巴。
本发明另一方面在于使用本发明方法生产的蛋白酶3重组蛋白。
本发明的有益效果是：
本发明以家蚕幼虫作为生物反应器，通过家蚕-杆状病毒表达***实现大规模、低成本、高效率地制备具免疫活性的重组人PR3 。作为真核表达***的代表，家蚕-杆状病毒表达***具有高表达水平及强大的蛋白质翻译后修饰功能等优点。通过家蚕-杆状病毒***表达的人重组蛋白具有很高的生物活性，其抗原性、免疫原性与人的天然蛋白相似，且家蚕饲养简单方便，成本低。
通过本发明的方法，重组杆状病毒感染五龄期家蚕，感染4-5天后，PR3融合蛋白在家蚕中表达并被释放到血淋巴中，经分离纯化后，每条家蚕可制备高达2微克左右目的蛋白酶3，具有很高的表达量；同时，经过实施例验证，本方法制备的蛋白酶3与人PR3蛋白100%同源，够被PR3-ANCA阳性血清所识别。家蚕可以大规模的商业化无菌饲养，家蚕作为生物反应器制备PR3 避免了AcMNPV杆状病毒－昆虫细胞表达***中细胞培养所需昂贵的培养基和胎牛血清，有效降低生产成本，便于大规模的工业化生产，具有很好的经济效益。
附图说明
图1是实施例1中第一轮PCR扩增反应获得的基因片段PR3-His的琼脂糖凝胶电泳图；M为DNA分子量标准；编号1代表基因片段PR3-His；
图2是对双酶切反应后的转移质粒pMelBacA和PR3-His片段进行琼脂糖凝胶电泳的结果图；M为DNA分子量标准；编号C代表以相同方法制备的含人髓过氧化物酶MPO的重组转移载体双酶切反应的凝胶电泳图；编号1代表转移质粒pMelBacA和PR3-His片段；
图3是实施例1中基因片段Mel-PR3-His的琼脂糖凝胶电泳图；M为DNA分子量标准；编号1代表基因片段Mel-PR3-His；
图4是实施例1中随机挑选的2个双酶切反应后的重组供体载体pFastBac1-Mel-PR3-His的琼脂糖凝胶电泳图；M为DNA分子量标准；编号1~2代表基因片段载体pFastBac1-Mel-PR3-His；
图5是实施例2中重组穿梭载体Bacmid DNA的PCR扩增结果图；M为DNA分子量标准；编号1~2代表发生了转座的白斑重组穿梭载体Bacmid DNA，编号3代表蓝斑非重组Bacmid DNA；
图6是实施例3中家蚕接种病毒后重组人PR3在血淋巴中不同时间的表达量分析图；
图7是实施例4中镍柱亲和层析纯化人PR3蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳分析图；M为标准蛋白Marker，单位为kDa；编号Bc为血淋巴上清液；编号Ft为加入镍柱后没有被结合的杂蛋白馏分；编号W1~W4为清洗下来含杂蛋白的馏分；编号E1~E9为洗脱下来的馏分；
图8是实施例4中Mono Q离子交换柱纯化人PR3蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳分析图， Bc为镍-亲和层析柱纯化后合并的馏分， 8-27为梯度洗脱下来的馏分；M为标准蛋白Marker；
图9是实施例4中Mono S离子交换柱纯化人PR3蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳分析图，Bc为Mono Q柱纯化后合并的第10馏分经透析后预上Mono S柱前的样品；W为清洗的杂蛋白馏分；7-20为梯度洗脱下来的馏分；M为标准蛋白Marker；
图10是实施例4中目的蛋白PR3的Western Blot鉴定图；其中，左图中一抗是抗His-标签的鼠单克隆抗体，右图中一抗是抗人PR3鼠单克隆抗体，图中泳道1均表示纯化后的重组PR3蛋白免疫反应样品，泳道M均表示标准蛋白Marker；
图11是实施例5中PR3-His蛋白的MALDI-TOF鉴定序列覆盖结果图。
具体实施方式
下面结合附图以及具体实施例对本发明进一步说明，但本发明的保护范围并不限于此。下面结合附图以及具体实施例对本发明进一步说明，但本发明的保护范围并不限于此。如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。
以下实施例所用主要仪器和材料：
PCR相关试剂、酶切反应、连接试剂盒等常规试剂均购自PROMEGA公司；LB培养基、昆虫细胞培养相关试剂、CELLFECTIN Reagent等化学试剂为GIBCO BRL公司产品；胶回收试剂盒购自QIAGEN公司；PCR产物回收试剂盒购自OMEGA公司；人源蛋白酶3（PR3）的cDNA来源于已公开的DNA序列 (GenBank: BC096183.1)，购自PROTEINTECH GROUP公司；含有昆虫分泌信号肽Mel的杆状病毒转移质粒pMelBacA、家蚕卵巢细胞BmN、供体质粒pFastBac1以及大肠杆菌BmDH10Bac为INVITROGEN公司产品；大肠杆菌DH5α为Takara公司产品；家蚕为品种306，来源于中国农科院蚕业研究所；His标签蛋白纯化专用缓冲液购自Pierce公司；离子交换柱Mono Q和Mono S均购自GE HEALTHCARE公司；抗His-标签的鼠单克隆抗体（27E8）购自CellSignaling Technology公司；抗人PR3鼠单克隆抗体（D-1）为SANTACRUZ BIOTECHNOLOGY公司产品；人PR3蛋白ELISA检测试剂盒为卡迈舒（上海）生物科技有限公司产品（Cat No.KMS-EL9531c）。
以下实施例中未作具体说明的实验操作方法均参照《分子克隆实验指南》（Sambrook等编著，科学出版社，1992年版）及产品说明书进行。
实施例一：含有昆虫分泌信号肽Mel重组供体载体pFastBac1-Mel-PR3-His的构建
以人PR3 (GenBankNo: X55668.1)的cDNA为模板设计PCR扩增引物，在人PR3基因序列的N-端和C-端分别引入Xho I和Kpn I酶切位点，以便将该片段连接到同样经双酶切之后的质粒载体中；其C-端引入编码6个组氨酸的碱基，以利于表达的蛋白纯化：引物如下：
正向引物-1（SEQ ID NO.1）:AGGAGACTCGAGATCGTGGGCGGGCACGAGGCG；反向引物-1（SEQID NO.2）: TACGGTACCCTAGTGATGGTGATGGTGATGACGGCGCAGCGTGGAACG。
应用以上引物，以人PR3的cDNA为模板进行第一轮PCR扩增反应， 反应体系及条件如表1所示：
表1. PCR扩增反应体系及条件条
组分 体积/μL（50μL）
5×Pfu 缓冲液 10
2.5mM dNTPs 3
Pfu酶 0.5
正向引物（primer F） 1
反向引物（primer R） 1
cDNA 0.3
ddH<sub>2</sub>O 34.2
PCR反应条件：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5min，循环30次后72 ℃再延伸10 min。第一轮PCR扩增后将获得的含His-标签的PR3基因片段PR3-His进行1%琼脂糖凝胶电泳。
图1是基因片段PR3-His的琼脂糖凝胶电泳图，由图1可见，在708 bp左右获得PR3-His的目的片段。用手术刀切割下含PR3-His片段的凝胶，以胶回收试剂盒回收扩增出的PR3-His片段，以Xho I和Kpn I对回收的PR3-His片段进行双酶切反应；同时，以Xho I和KpnI对含有昆虫分泌信号肽Mel（昆虫分泌信号肽Mel基因序列见序列表 SEQ ID NO.3：ATGAAATTCTTAGTCAACGTTGCCCTTGTTTTTATGGTCGTATACATTTCTTACATCTATGCG）的转移质粒pMelBacA进行双酶切反应，再用PCR产物纯化试剂盒分别对上述两种双酶切反应产物进行纯化，将纯化后的PCR产物通过连接试剂盒连接到转移质粒上，获得带有昆虫分泌信号肽Mel和人PR3序列的重组质粒pMelBacA-PR3-His。
图2是对双酶切反应后的转移质粒pMelBacA和PR3-His片段进行琼脂糖凝胶电泳的结果图；M为DNA分子量标准；编号C代表以相同方法制备的含人髓过氧化物酶MPO的重组转移载体双酶切反应的凝胶电泳图；编号1代表双酶切后的转移质粒pMelBacA和PR3-His片段，在708 bp左右获得PR3-His的目的片段，在2277 bp左右获得酶切后的转移质粒pMelBacA的片段。经双酶切鉴定，成功将PR3-His片段克隆到含有昆虫分泌信号肽Mel的转移质粒pMelBacA上。
设计正向引物-2（SEQ ID NO.4）： 5’-CCGTCTAGAATGAAATTCTTAGTCAAC-3’；应用正向引物-2和反向引物1，以上述步骤中制备的重组质粒pMelBacA-PR3-His为模板进行第二轮PCR扩增反应，反应体系及条件同第一轮PCR扩增。
图3是基因片段Mel-PR3-His的琼脂糖凝胶电泳图，图中可见，在792 bp左右获得Mel-PR3-His的目的片段。用PCR回收试剂盒对从凝胶上切割下的含有目的片段Mel-PR3-His的扩增产物进行回收；以Xba I和Kpn I对回收产物进行双酶切反应，同时，以Xba I和Kpn I对供体质粒pFastBac1也进行双酶切反应，再通过PCR产物纯化试剂盒分别对两种双酶切反应产物进行纯化；将纯化后的PCR产物Mel-PR3-His通过连接试剂盒连接到酶切后的pFastBac1上，连接后的产物随后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，并涂板于含100 µg/mL氨苄青霉素的LB培养基平板；挑选37℃倒置培养过夜的单个菌落，经LB液体培养基培养，抽提质粒DNA；以Xba I和Kpn I对抽提的质粒DNA进行双酶切鉴定，筛选出已***Mel-PR3-His基因片段的重组供体质粒，通过DNA序列检测，比对结果得到含有昆虫分泌信号肽Mel重组供体载体pFastBac1-Mel-PR3-His。
图4是随机挑选的2个双酶切反应后的重组供体载体pFastBac1-Mel-PR3-His的凝胶电泳图，图中可见，在792bp左右是Mel-PR3-His的目的片段，在4776 bp左右是质粒pFastBac1的片段。至此，通过测序和双酶切鉴定，获得了含有昆虫分泌信号肽Mel重组供体载体pFastBac1-Mel-PR3-His。
实施例二：重组家蚕杆状病毒rBm-pFastBac1-Mel-PR3-His的制备
将实施例一中所构建的含有昆虫分泌信号肽Mel重组供体载体pFastBac1-Mel-PR3-His转染大肠杆菌BmDH10Bac，载体pFastBac1-Mel-PR3-His中含有的Tn7转座元件与家蚕BmNPV杆状病毒穿梭载体Bacmid发生转座，经蓝白斑筛选后对获得的重组穿梭载体进行鉴定。随机挑选2个白斑重组穿梭载体Bacmid DNA，并以蓝斑非重组Bacmid DNA作为对照，应用特异性通用pUC/M13正向引物（SEQ ID NO.5）：5’-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3’和反向引物（SEQ ID NO.6）：5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’，对重组穿梭载体Bacmid DNA进行PCR反应验证。
图5是重组和非重组穿梭载体Bacmid DNA的PCR扩增结果图；M为DNA分子量标准；编号1~2代表白斑重组穿梭载体Bacmid DNA的PCR结果，编号3代表未发生转座的蓝斑非重组Bacmid DNA的PCR结果；如图5所示，对照组蓝斑非重组Bacmid DNA未发生Tn7转座子转座的PCR反应产物在300 bp左右出现目的条带，而随机挑选的2个白斑重组穿梭载体BacmidDNA均在预期位置3161 bp左右出现条带，表明所挑选的2个白斑均通过Tn7转座子发生了转座， Mel-PR3-His基因片段已成功地通过同源重组被整合到家蚕穿梭载体Bacmid DNA上。
以CELLFECTIN Reagent介导重组穿梭载体Bacmid DNA转染家蚕卵巢细胞BmN，经两轮病毒的扩增，获得含昆虫分泌信号肽Mel和编码人PR3基因序列且带有His-标签的重组家蚕杆状病毒rBm-pFastBac1-Mel-PR3-His，对其进行病毒滴度测定，测定结果可达2×107 PFU/mL，表明病毒的浓度可以用于感染五龄家蚕。
实施例三：重组家蚕杆状病毒rBm-pFastBac1-Mel-PR3-His在五龄期家蚕中的表达情况
将实施例二所制备的重组家蚕杆状病毒rBm-pFastBac1-Mel-PR3-His接种转染至五龄期后第二天的家蚕，每条家蚕皮下注射5 µL重组家蚕杆状病毒rBm-pFastBac1-Mel-PR3-His，即：每头家蚕接种1.0×105 PFU病毒。接种病毒后每隔24小时收集一次家蚕血淋巴，同时将未接种病毒的家蚕作为阴性对照组，与接种病毒后的家蚕一同收集血淋巴，应用人PR3蛋白ELISA检测试剂盒，在不同时间收集5头家蚕的混合血淋巴作为样本，测定血淋巴中所含人PR3蛋白与微孔板上所包被的人PR3抗体的酶联免疫反应活性，计算出接种病毒后重组人PR3在血淋巴中的表达量。
图6是家蚕接种病毒后重组人PR3在血淋巴中不同时间的表达量分析图；横坐标表示感染病毒后收集家蚕血淋巴的时间，纵坐标表示血淋巴中人PR3与人PR3蛋白ELISA检测标准品对比计算得到的浓度；图中可见，病毒接种后48小时能够检测到人PR3蛋白的表达，至96和120小时时达最高值，说明所表达的重组人PR3经由昆虫分泌信号肽介导而被成功地释放到血淋巴中，并能够被人PR3蛋白ELISA检测试剂盒微孔板上所包被的抗人源PR3抗体所识别。
实施例四：在五龄期家蚕中表达并释放到血淋巴中的重组人PR3的分离纯化
根据实施例三中重组人PR3蛋白在五龄期家蚕中的表达可知，表达量在接种病毒后第4和第5天时达最高值。据此，接种600只家蚕，收集接种4－5天的家蚕血淋巴冻存于-800C冰箱备用；取1mL所收集的血淋巴样品，用两倍体积的50mM磷酸缓冲液稀释，高速离心后取血淋巴上清液，经镍-柱分离纯化； 图7是镍-柱亲和层析纯化人PR3蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳分析图；M为标准蛋白Marker，单位为kDa；编号Bc为血淋巴上清液；编号Ft为加入镍柱后没有被结合的杂蛋白馏分；编号W1~W4为清洗下来含杂蛋白的馏分；编号E1~E9为洗脱下来的馏分。图中可见，疑似目的蛋白从第一馏分到第四馏分（E1-E4）被洗脱，但其含较多成分的杂蛋白；合并E1-E4馏分进行透析除盐，然后经离子交换柱Mono Q纯化。图8是Mono Q离子交换柱纯化人PR3蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳分析图，图中，Bc为镍-柱亲和层析纯化后合并的馏分，即经透析后预加入Mono Q柱前的样品；8-27为梯度洗脱下来的馏分；M为标准蛋白Marker；如图8所示，较纯的目的蛋白在第10馏分被洗脱，而所含杂蛋白在第11馏分开始被分开；合并多批次经Mono Q纯化后的第10馏分，经透析除盐后再通过离子交换柱Mono S进行纯化。图9是Mono S离子交换柱纯化人PR3蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳分析图，如图9箭头所示，高纯度的目的蛋白在第14和15馏分被洗脱，其分子量大约为32 kDa，与昆虫细胞Sf-9中所表达的34kDa重组人PR3蛋白的大小一致。
分别以抗His-标签的鼠单克隆抗体（27E8）和抗人PR3鼠单克隆抗体（D-1）作为一抗，以标记了碱性磷酸酶的抗鼠源IgG作为二抗，对经Mono S柱纯化后的第15号馏分进行Western Blot鉴定，通过碱性磷酸酶试剂盒进行显色反应。图10是目的蛋白PR3的WesternBlot鉴定图，其中，左图是应用抗His-标签的鼠单克隆抗体作为一抗的免疫反应，以α -His表示；右图是应用抗人PR3鼠单克隆抗体作为一抗的免疫反应，以α-PR3（Human）表示；图中泳道1表示纯化后的重组PR3蛋白免疫反应样品，泳道M表示标准蛋白Marker；如图10所示，所制备的分子量约为32 kDa的目的蛋白不但被抗His-标签的抗体所识别，同时也能够被商品化抗人源PR3的抗体所识别，初步验证了所纯化的蛋白为重组人PR3。获得的重组人PR3纯度接近100%、分子量约为32 kDa，经过测定得知，平均每条家蚕可获得约2微克纯化后的重组人PR3目的蛋白。
实施例五：重组人PR3目的蛋白质谱鉴定
对实施例四中所得到的重组人PR3目的蛋白进行一级质谱（MS）和二级质谱（MS/MS）综合分析，应用Mascot 2.2软件，通过NCBI数据库，对所测蛋白进行鉴定。质谱分析条件：仪器型号：5800 MALDI-TOF/TOF（AB SCIEX公司）；检测方式：正离子，反射模式；样品靶：384Opti-TOF 123 mm ╳81 mm ss AB SCIEX；基质：CHCA；分析结果如图11所示，质谱获得的肽段以加深字体表示，质谱获得的肽段与NCBI数据库中的人PR3氨基酸序列相匹配的覆盖率为25.68%。利用Mascot软件与数据库中人PR3蛋白对比得知重组蛋白得分405，根据软件的算法及定义该蛋白与人PR3蛋白100%同源。因此通过质谱分析，进一步确认了经分离纯化后所获得的蛋白为人PR3。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏大学
<120> 一种制备蛋白酶3重组蛋白的方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aggagactcg agatcgtggg cgggcacgag gcg 33
<210> 2
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tacggtaccc tagtgatggt gatggtgatg acggcgcagc gtggaacg 48
<210> 3
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgaaattct tagtcaacgt tgcccttgtt tttatggtcg tatacatttc ttacatctat 60
gcg 63
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccgtctagaa tgaaattctt agtcaac 27
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cccagtcacg acgttgtaaa acg 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agcggataac aatttcacac agg 23

Claims (10)

1.一种制备蛋白酶3重组蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将人蛋白酶3的基因片段PR3-His克隆到含有昆虫分泌信号肽Mel的转移质粒pMelBacA上，合成带有昆虫分泌信号肽Mel和人PR3序列的重组质粒pMelBacA-PR3-His；
（2）以步骤（1）合成的重组质粒pMelBacA-PR3-His为模板构建含有昆虫分泌信号肽Mel的重组供体载体pFastBac1-Mel-PR3-His：
（3）将步骤（2）构建的重组供体载体pFastBac1-Mel-PR3-His与大肠杆菌共同转染家蚕卵巢细胞BmN，制备重组病毒rBm-pFastBac1-Mel-PR3-His；
（4）将步骤（3）中制备的重组病毒rBm-pFastBac1-Mel-PR3-His接种转染家蚕，在家蚕中表达蛋白酶3重组蛋白；
（5）回收转染后家蚕的血淋巴；
（6）分离纯化血淋巴中的蛋白酶3重组蛋白。
2.根据权利要求1所述的制备蛋白酶3重组蛋白的方法，其特征在于，步骤（1）中所述的重组质粒pMelBacA-PR3-His的制备方法为：对人PR3 cDNA为模板第一轮PCR扩增得到PR3-His片段，以Xho I和Kpn I分别对对PR3-His片段、转移质粒pMelBacA进行双酶切反应；对两种双酶切产物进行纯化、连接，获得带有昆虫分泌信号肽Mel和人PR3序列的重组质粒pMelBacA-PR3-His。
3.根据权利要求1所述的制备蛋白酶3重组蛋白的方法，其特征在于，步骤（2）中所述的重组供体载体pFastBac1-Mel-PR3-His的制备方法为：以步骤（1）中制备的重组质粒pMelBacA-PR3-His为模板进行第二轮PCR扩增反应得到Mel-PR3-His目的片段；以Xba I和Kpn I对Mel-PR3-His目的片段、供体质粒pFastBac1进行双酶切反应，对两种双酶切产物进行纯化、连接，将连接后的产物转化到大肠杆菌感受态细胞，抽提质粒DNA进行鉴定筛选得到含有昆虫分泌信号肽Mel重组供体载体pFastBac1-Mel-PR3-His。
4.根据权利要求1所述的制备蛋白酶3重组蛋白的方法，其特征在于，步骤（3）中所述重组病毒rBm-pFastBac1-Mel-PR3-His的制备方法为：将步骤（2）构建的重组供体载体pFastBac1-Mel-PR3-His转染大肠杆菌，重组供体载体中的Tn7转座元件与家蚕BmNPV杆状病毒穿梭载体Bacmid发生转座，抽提发生转座的重组穿梭载体Bacmid DNA并转染家蚕卵巢细胞BmN，制备出重组病毒rBm-pFastBac1-Mel-PR3-His。
5.根据权利要求1所述的制备蛋白酶3重组蛋白的方法，其特征在于，步骤（4）中所述的接种转染为将重组病毒rBm-pFastBac1-Mel-PR3-His皮下注射至家蚕体内。
6.根据权利要求1所述的制备蛋白酶3重组蛋白的方法，其特征在于，步骤（4）中所述的家蚕为五龄期家蚕。
7.根据权利要求1所述的制备蛋白酶3重组蛋白的方法，其特征在于，步骤（5）中所述的血淋巴为家蚕转染后第4-5天产生的血淋巴。
8.根据权利要求1所述的制备蛋白酶3重组蛋白的方法，其特征在于，步骤（6）中所述的分离纯化为将血淋巴稀释后先经过镍柱亲和层析纯化，纯化依次经离子交换柱Mono Q及Mono S纯化后得到高纯度的目的产物蛋白酶3重组蛋白。
9.根据权利要求8所述的制备蛋白酶3重组蛋白的方法，其特征在于，所述的稀释为用两倍体积的缓冲液稀释血淋巴。
10.根据权利要求1-9任一项所述方法生产的蛋白酶3重组蛋白。
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