JP6668577B1 - 1,3−プロパンジオールの製造方法 - Google Patents
1,3−プロパンジオールの製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6668577B1 JP6668577B1 JP2019529268A JP2019529268A JP6668577B1 JP 6668577 B1 JP6668577 B1 JP 6668577B1 JP 2019529268 A JP2019529268 A JP 2019529268A JP 2019529268 A JP2019529268 A JP 2019529268A JP 6668577 B1 JP6668577 B1 JP 6668577B1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene
- protein
- seq
- reaction
- culture
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 91
- DNIAPMSPPWPWGF-VKHMYHEASA-N (+)-propylene glycol Chemical compound C[C@H](O)CO DNIAPMSPPWPWGF-VKHMYHEASA-N 0.000 title claims abstract description 54
- YPFDHNVEDLHUCE-UHFFFAOYSA-N 1,3-propanediol Substances OCCCO YPFDHNVEDLHUCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 54
- 229920000166 polytrimethylene carbonate Polymers 0.000 title claims abstract description 54
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 286
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 claims abstract description 87
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 86
- 238000005575 aldol reaction Methods 0.000 claims abstract description 54
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 52
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 48
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 48
- 150000004716 alpha keto acids Chemical class 0.000 claims abstract description 27
- 238000006114 decarboxylation reaction Methods 0.000 claims abstract description 26
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 claims abstract description 26
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 claims abstract description 26
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 101
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 66
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 50
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 47
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 45
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 40
- 229940076788 pyruvate Drugs 0.000 claims description 34
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 32
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 claims description 17
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 13
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 claims description 9
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 8
- 241000186254 coryneform bacterium Species 0.000 claims description 7
- PUWWONYMIXRVQF-UHFFFAOYSA-N 4-Hydroxy-2-oxobutanoic acid Chemical compound OCCC(=O)C(O)=O PUWWONYMIXRVQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 241000186031 Corynebacteriaceae Species 0.000 claims description 5
- AKXKFZDCRYJKTF-UHFFFAOYSA-N 3-Hydroxypropionaldehyde Chemical compound OCCC=O AKXKFZDCRYJKTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 42
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 abstract description 13
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 154
- 238000000034 method Methods 0.000 description 100
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 86
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 83
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 81
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 74
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 69
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 69
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 66
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 62
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 61
- 239000000047 product Substances 0.000 description 45
- 229940035437 1,3-propanediol Drugs 0.000 description 44
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 44
- 108010068561 Fructose-Bisphosphate Aldolase Proteins 0.000 description 43
- 102000001390 Fructose-Bisphosphate Aldolase Human genes 0.000 description 43
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 43
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 41
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 41
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 41
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 36
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 36
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 36
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 36
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 33
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 27
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 26
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 25
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 25
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 25
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 25
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 24
- -1 feed Substances 0.000 description 23
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 21
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 21
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 21
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 19
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 19
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 19
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 18
- 101150054405 hpcH gene Proteins 0.000 description 17
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 17
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 17
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 15
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 15
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 14
- 101150058184 rhmA gene Proteins 0.000 description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 13
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 12
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 12
- 101150080950 mdlC gene Proteins 0.000 description 12
- 101150074166 nanA gene Proteins 0.000 description 12
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 12
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 12
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 12
- 108090000489 Carboxy-Lyases Proteins 0.000 description 11
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 11
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 11
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 11
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 11
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 11
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 11
- HSJKGGMUJITCBW-UHFFFAOYSA-N beta-hydroxybutyraldehyde Natural products CC(O)CC=O HSJKGGMUJITCBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 10
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 9
- 101150061843 dhaT gene Proteins 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 8
- 101100132713 Escherichia coli O6:H1 (strain CFT073 / ATCC 700928 / UPEC) nanA1 gene Proteins 0.000 description 8
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 101150014383 adhE gene Proteins 0.000 description 8
- 101150049512 ald gene Proteins 0.000 description 8
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 description 7
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 7
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 7
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 7
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 7
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 7
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 7
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 6
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 6
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 6
- 101150051452 bphI gene Proteins 0.000 description 6
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 6
- 102000054767 gene variant Human genes 0.000 description 6
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 6
- 101150087346 mhpE gene Proteins 0.000 description 6
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 6
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 6
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 6
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 101100106373 Escherichia coli (strain K12) yjhH gene Proteins 0.000 description 5
- 241000192041 Micrococcus Species 0.000 description 5
- 101100297425 Nocardioides sp. (strain KP7) phdJ gene Proteins 0.000 description 5
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 5
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 5
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 5
- 101150002067 dgoA gene Proteins 0.000 description 5
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 101150022753 galc gene Proteins 0.000 description 5
- 101150041530 ldha gene Proteins 0.000 description 5
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 5
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 5
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 5
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 5
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 5
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 5
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 5
- 241001485655 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Species 0.000 description 4
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 101100215028 Escherichia coli (strain K12) mhpF gene Proteins 0.000 description 4
- 101100105449 Escherichia coli (strain K12) yagE gene Proteins 0.000 description 4
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WXSKVKPSMAHCSG-REOHCLBHSA-N L-4-hydroxy-2-oxoglutaric acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(=O)C(O)=O WXSKVKPSMAHCSG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 101100451349 Mycobacterium tuberculosis (strain ATCC 25177 / H37Ra) hsaF gene Proteins 0.000 description 4
- 101100398785 Streptococcus agalactiae serotype V (strain ATCC BAA-611 / 2603 V/R) ldhD gene Proteins 0.000 description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 description 4
- 101100386830 Zymomonas mobilis subsp. mobilis (strain ATCC 31821 / ZM4 / CP4) ddh gene Proteins 0.000 description 4
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 4
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 4
- 101150019000 garL gene Proteins 0.000 description 4
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 4
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 4
- SURQXAFEQWPFPV-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O SURQXAFEQWPFPV-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 101150026107 ldh1 gene Proteins 0.000 description 4
- WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L magnesium sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[O-]S([O-])(=O)=O WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 229940061634 magnesium sulfate heptahydrate Drugs 0.000 description 4
- ISPYRSDWRDQNSW-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate monohydrate Chemical compound O.[Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O ISPYRSDWRDQNSW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 4
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 4
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 4
- 101150023641 ppc gene Proteins 0.000 description 4
- LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N pyridoxine Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 108010011958 1,3-propanediol dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- 108030003175 4-(2-carboxyphenyl)-2-oxobut-3-enoate aldolases Proteins 0.000 description 3
- YRWAMSXHYBBHFL-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxy-4-methyl-2-oxoglutaric acid Chemical compound OC(=O)C(O)(C)CC(=O)C(O)=O YRWAMSXHYBBHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 3
- 235000000638 D-biotin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011665 D-biotin Substances 0.000 description 3
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 3
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 3
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 3
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 3
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 101100462488 Phlebiopsis gigantea p2ox gene Proteins 0.000 description 3
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010053763 Pyruvate Carboxylase Proteins 0.000 description 3
- 102100039895 Pyruvate carboxylase, mitochondrial Human genes 0.000 description 3
- 102000003929 Transaminases Human genes 0.000 description 3
- 241000319304 [Brevibacterium] flavum Species 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 101150001823 alaA gene Proteins 0.000 description 3
- 108010081577 aldehyde dehydrogenase (NAD(P)+) Proteins 0.000 description 3
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 101150033780 ilvB gene Proteins 0.000 description 3
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 3
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 3
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 3
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 3
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 3
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 3
- 101150060030 poxB gene Proteins 0.000 description 3
- 101150096049 pyc gene Proteins 0.000 description 3
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 3
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 3
- 229960000344 thiamine hydrochloride Drugs 0.000 description 3
- 235000019190 thiamine hydrochloride Nutrition 0.000 description 3
- 239000011747 thiamine hydrochloride Substances 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 3
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 3
- GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N (D)-(+)-Pantothenic acid Chemical compound OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 2
- OXIKLRTYAYRAOE-CMDGGOBGSA-N (e)-3-(1-benzyl-3-pyridin-3-ylpyrazol-4-yl)prop-2-enoic acid Chemical compound N1=C(C=2C=NC=CC=2)C(/C=C/C(=O)O)=CN1CC1=CC=CC=C1 OXIKLRTYAYRAOE-CMDGGOBGSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OVPRPPOVAXRCED-WVZVXSGGSA-N 2-dehydro-3-deoxy-6-phospho-D-gluconic acid Chemical compound OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC(=O)C(O)=O OVPRPPOVAXRCED-WVZVXSGGSA-N 0.000 description 2
- 108030003207 2-dehydro-3-deoxy-D-gluconate aldolases Proteins 0.000 description 2
- 108030003135 2-dehydro-3-deoxy-D-pentonate aldolases Proteins 0.000 description 2
- 108010016941 2-keto-3-deoxy-D-glucarate aldolase Proteins 0.000 description 2
- 108030003205 2-keto-3-deoxy-L-rhamnonate aldolases Proteins 0.000 description 2
- 108030003145 3-deoxy-D-manno-octulosonate aldolases Proteins 0.000 description 2
- 108010071258 4-hydroxy-2-oxoglutarate aldolase Proteins 0.000 description 2
- 108030003208 4-hydroxy-2-oxoheptanedioate aldolases Proteins 0.000 description 2
- HFKQINMYQUXOCH-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxy-2-oxopentanoic acid Chemical compound CC(O)CC(=O)C(O)=O HFKQINMYQUXOCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010000700 Acetolactate synthase Proteins 0.000 description 2
- 102000003677 Aldehyde-Lyases Human genes 0.000 description 2
- 108090000072 Aldehyde-Lyases Proteins 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010071778 Benzoylformate decarboxylase Proteins 0.000 description 2
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000186145 Corynebacterium ammoniagenes Species 0.000 description 2
- RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N D-gluconic acid Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N 0.000 description 2
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 2
- 241000186604 Lactobacillus reuteri Species 0.000 description 2
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 2
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001288976 Pseudomonas putida NBRC 14164 Species 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010011939 Pyruvate Decarboxylase Proteins 0.000 description 2
- 108030006096 S-(hydroxymethyl)mycothiol dehydrogenases Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 244000057717 Streptococcus lactis Species 0.000 description 2
- 235000014897 Streptococcus lactis Nutrition 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 241000588902 Zymomonas mobilis Species 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 239000002154 agricultural waste Substances 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- LFYJSSARVMHQJB-QIXNEVBVSA-N bakuchiol Chemical compound CC(C)=CCC[C@@](C)(C=C)\C=C\C1=CC=C(O)C=C1 LFYJSSARVMHQJB-QIXNEVBVSA-N 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 239000008098 formaldehyde solution Substances 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 108010072869 indolepyruvate decarboxylase Proteins 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 2
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940001882 lactobacillus reuteri Drugs 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 2
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 108010038136 phospho-2-keto-3-deoxy-gluconate aldolase Proteins 0.000 description 2
- FGIUAXJPYTZDNR-UHFFFAOYSA-N potassium nitrate Chemical compound [K+].[O-][N+]([O-])=O FGIUAXJPYTZDNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- FGDZQCVHDSGLHJ-UHFFFAOYSA-M rubidium chloride Chemical compound [Cl-].[Rb+] FGDZQCVHDSGLHJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101150025220 sacB gene Proteins 0.000 description 2
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Chemical compound [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940011671 vitamin b6 Drugs 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LGQKSQQRKHFMLI-SJYYZXOBSA-N (2s,3r,4s,5r)-2-[(3r,4r,5r,6r)-4,5,6-trihydroxyoxan-3-yl]oxyoxane-3,4,5-triol Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)CO[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)OC1 LGQKSQQRKHFMLI-SJYYZXOBSA-N 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WURBVZBTWMNKQT-UHFFFAOYSA-N 1-(4-chlorophenoxy)-3,3-dimethyl-1-(1,2,4-triazol-1-yl)butan-2-one Chemical compound C1=NC=NN1C(C(=O)C(C)(C)C)OC1=CC=C(Cl)C=C1 WURBVZBTWMNKQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PKAUICCNAWQPAU-UHFFFAOYSA-N 2-(4-chloro-2-methylphenoxy)acetic acid;n-methylmethanamine Chemical compound CNC.CC1=CC(Cl)=CC=C1OCC(O)=O PKAUICCNAWQPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCN1CCOCC1 DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LGQKSQQRKHFMLI-UHFFFAOYSA-N 4-O-beta-D-xylopyranosyl-beta-D-xylopyranose Natural products OC1C(O)C(O)COC1OC1C(O)C(O)C(O)OC1 LGQKSQQRKHFMLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 241000609240 Ambelania acida Species 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186063 Arthrobacter Species 0.000 description 1
- 241000186074 Arthrobacter globiformis Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000589877 Campylobacter coli Species 0.000 description 1
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N Chick antidermatitis factor Natural products OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000909293 Corynebacterium alkanolyticum Species 0.000 description 1
- 241000543365 Corynebacterium casei LMG S-19264 Species 0.000 description 1
- 241001644925 Corynebacterium efficiens Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N D-Cellobiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- RGHNJXZEOKUKBD-UHFFFAOYSA-N D-gluconic acid Natural products OCC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O RGHNJXZEOKUKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- SQNRKWHRVIAKLP-UHFFFAOYSA-N D-xylobiose Natural products O=CC(O)C(O)C(CO)OC1OCC(O)C(O)C1O SQNRKWHRVIAKLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N Fe2+ Chemical compound [Fe+2] CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100331459 Klebsiella pneumoniae dhaT gene Proteins 0.000 description 1
- 241000191948 Kocuria rosea Species 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 240000003433 Miscanthus floridulus Species 0.000 description 1
- 241000186366 Mycobacterium bovis Species 0.000 description 1
- NSTPXGARCQOSAU-VIFPVBQESA-N N-formyl-L-phenylalanine Chemical compound O=CN[C@H](C(=O)O)CC1=CC=CC=C1 NSTPXGARCQOSAU-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000187580 Nocardioides Species 0.000 description 1
- 241001495390 Nocardioides sp. Species 0.000 description 1
- XMEKHKCRNHDFOW-UHFFFAOYSA-N O.O.[Na].[Na] Chemical compound O.O.[Na].[Na] XMEKHKCRNHDFOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 241001520808 Panicum virgatum Species 0.000 description 1
- 241001509383 Paraburkholderia xenovorans Species 0.000 description 1
- 244000130556 Pennisetum purpureum Species 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Propanedioic acid Natural products OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 101100309436 Streptococcus mutans serotype c (strain ATCC 700610 / UA159) ftf gene Proteins 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical group OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000607365 Vibrio natriegens Species 0.000 description 1
- 229930003451 Vitamin B1 Natural products 0.000 description 1
- 235000010724 Wisteria floribunda Nutrition 0.000 description 1
- TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N Xylitol Natural products OCCC(O)C(O)C(O)CCO TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 241001148470 aerobic bacillus Species 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Natural products N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000002528 anti-freeze Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- 239000010905 bagasse Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 101150106154 bphJ gene Proteins 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960003563 calcium carbonate Drugs 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- BKHZIBWEHPHYAI-UHFFFAOYSA-N chloroform;3-methylbutan-1-ol Chemical compound ClC(Cl)Cl.CC(C)CCO BKHZIBWEHPHYAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZYWFEOZQIUMEGL-UHFFFAOYSA-N chloroform;3-methylbutan-1-ol;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.CC(C)CCO.OC1=CC=CC=C1 ZYWFEOZQIUMEGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 229910000361 cobalt sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940044175 cobalt sulfate Drugs 0.000 description 1
- KTVIXTQDYHMGHF-UHFFFAOYSA-L cobalt(2+) sulfate Chemical compound [Co+2].[O-]S([O-])(=O)=O KTVIXTQDYHMGHF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000000911 decarboxylating effect Effects 0.000 description 1
- 238000007872 degassing Methods 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 1
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 1
- 239000000446 fuel Substances 0.000 description 1
- 239000001530 fumaric acid Substances 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000003208 gene overexpression Methods 0.000 description 1
- 239000000174 gluconic acid Substances 0.000 description 1
- 235000012208 gluconic acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000001727 glucose Nutrition 0.000 description 1
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 125000004029 hydroxymethyl group Chemical group [H]OC([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960003350 isoniazid Drugs 0.000 description 1
- QRXWMOHMRWLFEY-UHFFFAOYSA-N isoniazide Chemical compound NNC(=O)C1=CC=NC=C1 QRXWMOHMRWLFEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 1
- 239000011976 maleic acid Substances 0.000 description 1
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 description 1
- WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);methyl n-[[2-(methoxycarbonylcarbamothioylamino)phenyl]carbamothioyl]carbamate;n-[2-(sulfidocarbothioylamino)ethyl]carbamodithioate Chemical compound [Mn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.COC(=O)NC(=S)NC1=CC=CC=C1NC(=S)NC(=O)OC WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000357 manganese(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Chemical class 0.000 description 1
- 101150024975 mhpF gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- MQBCDKMPXVYCGO-FQBKTPCVSA-N mycothiol Chemical compound CC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O MQBCDKMPXVYCGO-FQBKTPCVSA-N 0.000 description 1
- MQBCDKMPXVYCGO-UHFFFAOYSA-N mycothiol Natural products CC(=O)NC(CS)C(=O)NC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O MQBCDKMPXVYCGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010074581 mycothiol Proteins 0.000 description 1
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 1
- 150000002823 nitrates Chemical class 0.000 description 1
- 229910017464 nitrogen compound Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002830 nitrogen compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- HYDZPXNVHXJHBG-UHFFFAOYSA-N o-benzylhydroxylamine;hydron;chloride Chemical compound Cl.NOCC1=CC=CC=C1 HYDZPXNVHXJHBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940055726 pantothenic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019161 pantothenic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011713 pantothenic acid Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 108010025593 phenylalanine (histidine) aminotransferase Proteins 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 239000004323 potassium nitrate Substances 0.000 description 1
- 235000010333 potassium nitrate Nutrition 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RADKZDMFGJYCBB-UHFFFAOYSA-N pyridoxal hydrochloride Natural products CC1=NC=C(CO)C(C=O)=C1O RADKZDMFGJYCBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000008160 pyridoxine Nutrition 0.000 description 1
- 239000011677 pyridoxine Substances 0.000 description 1
- 108700022487 rRNA Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 239000012925 reference material Substances 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 229940102127 rubidium chloride Drugs 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 239000004317 sodium nitrate Substances 0.000 description 1
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 description 1
- ZNJHFNUEQDVFCJ-UHFFFAOYSA-M sodium;2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid;hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+].OCCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 ZNJHFNUEQDVFCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- CSRCBLMBBOJYEX-UHFFFAOYSA-M sodium;2-morpholin-4-ylethanesulfonic acid;hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+].OS(=O)(=O)CCN1CCOCC1 CSRCBLMBBOJYEX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000010907 stover Substances 0.000 description 1
- 239000010902 straw Substances 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002363 thiamine pyrophosphate Drugs 0.000 description 1
- 235000008170 thiamine pyrophosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011678 thiamine pyrophosphate Substances 0.000 description 1
- YXVCLPJQTZXJLH-UHFFFAOYSA-N thiamine(1+) diphosphate chloride Chemical compound [Cl-].CC1=C(CCOP(O)(=O)OP(O)(O)=O)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N YXVCLPJQTZXJLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 235000010374 vitamin B1 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011691 vitamin B1 Substances 0.000 description 1
- 235000019158 vitamin B6 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011726 vitamin B6 Substances 0.000 description 1
- 238000010792 warming Methods 0.000 description 1
- 239000000811 xylitol Substances 0.000 description 1
- 235000010447 xylitol Nutrition 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N xylitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N 0.000 description 1
- 229960002675 xylitol Drugs 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960001763 zinc sulfate Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
- C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
- C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
- C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
- C12Y101/01202—1,3-Propanediol dehydrogenase (1.1.1.202)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
- C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
- C12Y401/01007—Benzoylformate decarboxylase (4.1.1.7)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
- C12Y401/02—Aldehyde-lyases (4.1.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
- C12Y401/02—Aldehyde-lyases (4.1.2)
- C12Y401/02023—3-Deoxy-D-manno-octulosonate aldolase (4.1.2.23)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
- C12Y401/03—Oxo-acid-lyases (4.1.3)
- C12Y401/03039—4-Hydroxy-2-oxovalerate aldolase (4.1.3.39)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/90—Isomerases (5.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/15—Corynebacterium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
- C12Y101/05—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with a quinone or similar compound as acceptor (1.1.5)
- C12Y101/05006—Formate dehydrogenase-N (1.1.5.6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
- C12Y102/01—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.2.1)
- C12Y102/01003—Aldehyde dehydrogenase (NAD+) (1.2.1.3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y104/00—Oxidoreductases acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
- C12Y104/01—Oxidoreductases acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.4.1)
- C12Y104/01001—Alanine dehydrogenase (1.4.1.1)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
微生物を用いた化成品の生産は、その生産対象として微生物代謝物に限定されることが一般的である。また、微生物代謝物であっても、微生物代謝系中のエネルギー不足や酸化還元バランスの不均衡によって、生産が困難な微生物代謝物も多く存在する。このような課題を解決するための一つの有効なアプローチとして、形質転換体を作成することが挙げられる。しかし、本発明者らは、この手法のみによって課題解決しようとすると、対象化合物を生産できる菌体の開発に多くの時間がかかる場合があると考えている。一方、今後、微生物代謝物以外の多様な化合物も生物由来原料から生産することが求められてくると考えている。そこで本発明者らは、有用な物質の生産については微生物の形質転換体作成のみに依存しない、新規なプロセス開発を検討した。
以下の遺伝子:
(a)ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒する酵素をコードする第1遺伝子、
(b)α−ケト酸の脱炭酸反応を触媒する酵素をコードする第2遺伝子、および
(c)アルデヒドの還元反応を触媒する酵素をコードする第3遺伝子
を含む微生物を、糖類およびホルムアルデヒドの存在下で培養して、1,3−プロパンジオールを生産することを含む、1,3−プロパンジオールの製造方法が提供される。
以下の遺伝子:
(a)ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒する酵素をコードする第1遺伝子、
(b)α−ケト酸の脱炭酸反応を触媒する酵素をコードする第2遺伝子、および
(c)アルデヒドの還元反応を触媒する酵素をコードする第3遺伝子
を含む微生物を、糖類およびホルムアルデヒドの存在下で培養して、1,3−プロパンジオールを生産することを含む。
(1.1)宿主
宿主としては、任意の微生物を使用することができる。宿主としては、例えば、酵母、細菌、より具体的には、好気性細菌、より具体的には、コリネ型細菌、大腸菌、またはビブリオ ナトリエゲンス(Vibrio natriegens)を使用することができる。好ましくは、宿主はコリネ型細菌である。
第1遺伝子は、「ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒する酵素」をコードする。「ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒する酵素」とは、後述の測定方法に従って、酵素反応液として、精製タンパク質、ピルビン酸(初期基質濃度 1mM)およびアルデヒド(初期基質濃度 1mM)含む酵素反応液を使用して測定した場合に、10mU/mg protein以上の活性を有する酵素をいう。「ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒する酵素」におけるアルデヒドは、例えば、ホルムアルデヒドである。「ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒する酵素」は、例えば、アルドラーゼである。
(a2)2−デヒドロ−3−デオキシ−6−ホスホグルコネートアルドラーゼ(2-dehydro-3-deoxy-6-phosphogluconate aldolase、EC番号4.1.2.55)、
(a3)4−ヒドロキシ−2−オキソグルタレートアルドラーゼ(4-hydroxy-2-oxoglutarate aldolase、EC番号:4.1.3.16)、
(a4)(4S)−4−ヒドロキシル−2−オキソグルタレートアルドラーゼ((4S)-4-hydroxyl-2-oxoglutarate aldolase、EC番号4.1.3.42)、
(a5)2−デヒドロ−3−デオキシ−D−ペントネートアルドラーゼ(2-dehydro-3-deoxy-D-pentonate aldolase、EC番号4.1.2.28)、
(a6)2−デヒドロ−3−デオキシ−D−グルコネートアルドラーゼ(2-dehydro-3-deoxy-D-gluconate aldolase、EC番号4.1.2.51)、
(a7)3−デオキシ−D−マンノ−オクツロソネートアルドラーゼ(3-deoxy-D-manno-octulosonate aldolase、EC番号4.1.2.23)、
(a8)4−ヒドロキシル−2−オキソバレレートアルドラーゼ(4-hydroxyl-2-oxovalerate aldolase、EC番号4.1.3.39)、
(a9)4−(2−カルボキシフェニル)−2−オキソブ−3−エノエートアルドラーゼ(4-(2-carboxyphenyl)-2-oxobut-3-enoate aldolase、EC番号4.1.2.34)、
(a10)4−ヒドロキシ−2−オキソヘプタンジオエートアルドラーゼ(4-hydroxy-2-oxoheptanedioate aldolase、EC番号4.1.2.52)、
(a11)2−デヒドロ−3−デオキシグルカレートアルドラーゼ(2-dehydro-3-deoxyglucarate aldolase、EC番号4.1.2.20)、
(a12)2−ケト−3−デオキシ−L−ラムノネートアルドラーゼ(2-keto-3-deoxy-L-rhamnonate aldolase、EC番号4.1.2.53)、
(a13)4−ヒドロキシル−4−メチル−2−オキソグルタレートアルドラーゼ(4-hydroxyl-4-methyl-2-oxoglutarate aldolase、EC番号4.1.3.17)、および
(a14)4−ヒドロキシ−2−オキソヘキサノネートアルドラーゼ(4-hydroxy-2-oxohexanonate aldolase、EC番号4.1.3.43)。
(a2)に含まれるアルドラーゼとしては、例えば、dgoAタンパク質が挙げられる。好ましくは、dgoAタンパク質は、大腸菌由来である。
(a5)に含まれるアルドラーゼとしては、例えば、yjhHタンパク質が挙げられる。好ましくは、yjhHタンパク質は、大腸菌由来である。
(a6)に含まれるアルドラーゼとしては、例えば、yagEタンパク質が挙げられる。好ましくは、yagEタンパク質は、大腸菌由来である。
(a7)に含まれるアルドラーゼとしては、例えば、nanAタンパク質が挙げられる。好ましくは、nanAタンパク質は、大腸菌由来である。
(a8)に含まれるアルドラーゼとしては、例えば、mhpEタンパク質が挙げられる。好ましくは、mhpEタンパク質は、大腸菌由来である。なお、第1遺伝子がmhpE遺伝子である場合、mhpE遺伝子は、mhpF遺伝子と連結した状態で宿主に導入されてもよい。
(a8)および(a10)に含まれるアルドラーゼとしては、例えば、hpaIタンパク質が挙げられる。好ましくは、hpaIタンパク質は大腸菌由来である。
(a8)および(a14)に含まれるアルドラーゼとしては、例えば、bphIタンパク質が挙げられる。好ましくは、bphIタンパク質は、バークホルデリア ゼノボランス(Burkholderia xenovorans)由来である。なお、第1遺伝子がbphI遺伝子である場合、bphI遺伝子は、bphJ遺伝子と連結した状態で宿主に導入されてもよい。
(a9)に含まれるアルドラーゼとしては、例えば、phdJタンパク質が挙げられる。好ましくは、phdJタンパク質は、ノカルディオイデス属菌(Nocardioides sp.)由来である。
(a11)に含まれるアルドラーゼとしては、例えば、garLタンパク質が挙げられる。好ましくは、garLタンパク質は、大腸菌由来である。
(a12)に含まれるアルドラーゼとしては、例えば、rhmAタンパク質が挙げられる。好ましくは、rhmAタンパク質は、大腸菌由来である。
(a13)に含まれるアルドラーゼとしては、例えば、galCタンパク質が挙げられる。好ましくは、galCタンパク質は、シュードモナス プチダ(Pseudomonas putida)由来である。
(1−1)配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質(すなわち、大腸菌由来のhpaIタンパク質)であって、ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
(1−2)配列番号2において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
(1−3)配列番号4に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質(すなわち、大腸菌由来のrhmAタンパク質)であって、ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
(1−4)配列番号4において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
(1−5)配列番号6に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質(すなわち、大腸菌由来のnanAタンパク質)であって、ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
(1−6)配列番号6において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
上記の1又は数個のアミノ酸の欠失、置換、若しくは付加は、例えば、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、アミノ酸の欠失、置換、若しくは付加には、遺伝子が由来する細菌の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異(mutant又はvariant)によって生じるものも含まれる。
配列番号1に記載の塩基配列からなる、大腸菌由来のhpaI遺伝子、
配列番号3に記載の塩基配列からなる、大腸菌由来のrhmA遺伝子、または
配列番号5に記載の塩基配列からなる、大腸菌由来のnanA遺伝子
である。
第2遺伝子は、「α−ケト酸の脱炭酸反応を触媒する酵素」をコードする。「α−ケト酸の脱炭酸反応を触媒する酵素」とは、後述の測定方法に従って、酵素反応液として、精製タンパク質およびα−ケト酸(初期基質濃度 1mM)を含む酵素反応液を使用して測定した場合に、1mU/mg protein以上の活性を有する酵素をいう。第2遺伝子は、例えば、第1遺伝子がコードするタンパク質が触媒するアルドール反応により得られたα−ケト酸の脱炭酸反応を触媒する酵素をコードする。「α−ケト酸の脱炭酸反応を触媒する酵素」におけるα−ケト酸は、例えば、4−ヒドロキシ−2−オキソ酪酸である。「α−ケト酸の脱炭酸反応を触媒する酵素」は、例えば、脱炭酸酵素である。
(b2)ベンゾイルフォルメートデカルボキシラーゼ(benzoylformate decarboxylase、EC番号4.1.1.7)、および
(b3)インドールピルベートデカルボキシラーゼ(indolepyruvate decarboxylase、EC番号4.1.1.74)。
(b2)に含まれる脱炭酸酵素としては、例えば、mdlCタンパク質が挙げられる。好ましくは、mdlCタンパク質は、シュードモナス プチダ(Pseudomonas putida)由来である。
(b3)に含まれる脱炭酸酵素としては、例えば、kivDタンパク質が挙げられる。好ましくは、kivDタンパク質は、ラクトコッカス ラクティス(Lactococcus lactis)由来である。
(2−1)配列番号8に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質(すなわち、シュードモナス プチダ由来のmdlCタンパク質)であって、α−ケト酸の脱炭酸反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
(2−2)配列番号8において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の脱炭酸反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
第3遺伝子は、「アルデヒドの還元反応を触媒する酵素」をコードする。「アルデヒドの還元反応を触媒する酵素」とは、後述の測定方法に従って、酵素反応液として、精製タンパク質およびアルデヒド(初期基質濃度 1mM)を含む酵素反応液を使用して測定した場合に、10mU/mg protein以上の活性を有する酵素をいう。なお、「アルデヒドの還元反応を触媒する酵素」におけるアルデヒドは、具体的には、第1遺伝子がコードする酵素が触媒するアルドール反応の基質であるアルデヒドとは種類が異なる。第3遺伝子は、例えば、第2遺伝子がコードするタンパク質が触媒する脱炭酸反応により得られたアルデヒドの還元反応を触媒する酵素をコードする。「アルデヒドの還元反応を触媒する酵素」におけるアルデヒドは、例えば、3−ヒドロキシプロピオンアルデヒドである。「アルデヒドの還元反応を触媒する酵素」は、例えば、アルコールデヒドロゲナーゼである。
(3−1)配列番号10に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質(すなわち、クレブシエラ ニューモニエ由来のdhaTタンパク質)であって、アルデヒドの還元反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
(3−2)配列番号10において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、アルデヒドの還元反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
第1、第2、および第3遺伝子は、形質転換のために、適切なプラスミドベクターに組み込むことができる。
形質転換方法は、公知の方法を制限無く使用できる。このような公知の方法として、例えば塩化カルシウム/塩化ルビジウム法、リン酸カルシウム法、DEAE−デキストラン介在トランスフェクション、電気パルス法などが挙げられる。
宿主は、野生株の他に、その変異株や人為的な遺伝子組換え体であってもよい。宿主がコリネ型細菌である場合、宿主は、野生株のコリネ型細菌が本来有する下記遺伝子の少なくとも一つを破壊または欠失させることにより得られた遺伝子破壊株または遺伝子欠失株であることが好ましい:ラクテート(乳酸)デヒドロゲナーゼ(lactate dehydrogenase、例えばldhA)遺伝子、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ(phosphoenolpyrvate carboxylase、例えばppc)遺伝子、ピルビン酸カルボキシラーゼ(pyruvate carboxylase、例えばpyc)遺伝子、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ(pyruvate dehydrogenase、 例えばpoxB)遺伝子、グルタミン酸−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ(glutamate-pyruvate aminotransferase、例えばalaA)遺伝子、アセトラクテートシンターゼ(acetolactate synthase、例えばilvB)遺伝子、N−スクシニルジアミノピメレート(N-succinyldiaminopimelate aminotransferase、例えばcg0931)遺伝子、S-(ヒドロキシメチル)ミコチオールデヒドロゲナーゼ(S-(hydroxymethyl)mycothiol dehydrogenase、例えばadhE)遺伝子、およびアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ(acetaldehyde dehydrogenase、例えばald)遺伝子。このような遺伝子破壊株または遺伝子欠失株を宿主として用いることにより、1,3−プロパンジオールの生産性を向上させたり、副生成物の生成を抑制したりすることができる。
1,3−プロパンジオール生産微生物(例えば、上述した形質転換体)を、糖類およびホルムアルデヒドの存在下で培養して、1,3−プロパンジオールを生産することができる。「糖類およびホルムアルデヒドの存在下で培養すること」は、糖類およびホルムアルデヒドを含む培養液中で培養することにより行うことができる。好ましくは、「糖類およびホルムアルデヒドの存在下で培養すること」は、糖類およびホルムアルデヒドを添加した培養液中で培養することにより行うことができる。
あるいは、増殖培養とその後の生産培養は、増殖培養の後、形質転換体を含有する増殖用培養液に糖類およびホルムアルデヒドを添加し、好気的条件を嫌気的条件または微好気的条件に変更することにより、培養液の交換を行うことなく生産培養を行うことができる。このように、増殖培養と生産培養とを連続的に行うこともできる。
増殖用培養液は、形質転換体の培養に通常使用される培地、例えば、炭素源、窒素源および無機塩類等を含有する公知の培地を用いることができる。
生産用培養液としては、糖類、ホルムアルデヒド、及びその他必要な成分を含有する培養液を用いることができる。その他必要な成分として、例えば、無機塩類、糖類以外の炭素源、又は窒素源を用いることができる。本明細書に記載される、培養液中の各成分の濃度は、各成分が添加された時点における培養液中の最終濃度を指す。
また、生産用培養液としては、増殖培養で用いた増殖用培養液と同じ組成のベース培養液に、糖類とホルムアルデヒドとを添加して得られる培養液を用いることもできる。なお、上述のベース培養液中に十分な量で糖類が存在する場合、糖類を添加しなくてもよい。
生産培養における培養温度は、1,3−プロパンジオールの生産に適した温度であれば、任意の温度であってもよい。生産培養における培養温度は、約20〜50℃が好ましく、約25〜47℃がより好ましい。上記温度範囲であれば、効率良く1,3−プロパンジオールを製造できる。生産用培養液のpHは、1,3−プロパンジオールの生産に適したpHであれば、任意のpHであってもよい。生産用培養液のpHは、約6〜8の範囲内に維持することが好ましい。生産用培養液のpHの調整は、例えば、水酸化カリウム水溶液を用いて行うことができる。生産培養中も必要に応じて生産用培養液のpHは、適宜調整することができる。生産培養における培養時間は、形質転換体が1,3−プロパンジオールを生産するのに十分な時間であれば、任意の時間であってもよい。生産培養における培養時間は、約3時間〜7日間が好ましく、約1〜3日間がより好ましい。
生産培養は、好気的条件の下で行われてもよく、嫌気的条件または微好気的条件の下で行われてもよい。これは、上述した形質転換体が、好気的条件の下でも嫌気的条件または微好気的条件の下でも働く、1,3−プロパンジオールを生産する経路を有しているためである。1,3−プロパンジオールを生産する経路は、後述の「(3.)作用および効果」の欄で述べる。
生産培養は、好ましくは、嫌気的条件または微好気的条件の下で行われる。
生産培養は、好ましくは、形質転換体を生産用培養液中に高密度に懸濁させた状態で行われる。このような状態で形質転換体を培養すると、一層効率的に1,3−プロパンジオールを生産することができる。
上述のとおり、第1、第2および第3遺伝子を含む形質転換体を生産用培養液中で培養すると、生産用培養液中に1,3−プロパンジオールが生産される。生産用培養液を回収することにより1,3−プロパンジオールを回収できるが、さらに、公知の方法で1,3−プロパンジオールを生産用培養液から分離精製することもできる。そのような公知の方法として、蒸留法、濃縮法、イオン交換樹脂法、活性炭吸着溶離法、溶媒抽出法、晶析法等が挙げられる。
1,3−プロパンジオール生産微生物が1,3−プロパンジオールを生産するプロセスを模式的に図1に示す。図1に示すプロセスにおいては、糖類がグルコースである場合を例として説明する。
以下に、本発明の好ましい実施形態をまとめて示す。
[1] 以下の遺伝子:
(a)ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒する酵素をコードする第1遺伝子、
(b)α−ケト酸の脱炭酸反応を触媒する酵素をコードする第2遺伝子、および
(c)アルデヒドの還元反応を触媒する酵素をコードする第3遺伝子
を含む微生物を、糖類およびホルムアルデヒドの存在下で培養して、1,3−プロパンジオールを生産することを含む、1,3−プロパンジオールの製造方法。
[2] 前記培養が、前記糖類およびホルムアルデヒドを含む培養液中で前記微生物を培養することにより行われる[1]に記載の方法。
[3] 前記培養液は、前記糖類およびホルムアルデヒドを添加した培養液である[2]に記載の方法。
[4] 前記糖類は、前記培養液中で0.1〜40(w/v)%、好ましくは、1〜20(w/v)%の濃度になるように添加される[3]に記載の方法。
[5] ホルムアルデヒドは、前記培養液中で0.001〜10(w/v)%、好ましくは、0.01〜1(w/v)%の濃度になるように添加される[3]または[4]に記載の方法。
[6] 前記糖類は、単糖、例えばフルクトースもしくはグルコース;二糖、例えばスクロース;多糖、例えば構成単糖としてグルコースを含む多糖;または植物(例えば非可食農産廃棄物またはエネルギー作物)を糖化酵素で処理することにより得られた糖化液である[1]〜[5]の何れか1に記載の方法。
[7] 前記糖類は、グルコースである[1]〜[6]に記載の方法。
[8] 前記培養が、嫌気的条件または微好気的条件の下で行われる[1]〜[7]の何れか1に記載の方法。
[9] 前記培養が、前記糖類およびホルムアルデヒドを含む培養液中で前記微生物を培養することにより行われる[8]に記載の方法。
[10] 前記嫌気的条件または前記微好気的条件は、前記培養液中の溶存酸素濃度が0〜2ppmの範囲内にあり、好ましくは0〜1ppmの範囲内にあり、より好ましくは0〜0.5ppmの範囲内にある条件である[9]に記載の方法。
[11] 前記培養が、前記微生物を培養液中に高密度に懸濁させた状態で行われる[1]〜[10]の何れか1に記載の方法。
[12] 前記培養が、前記糖類およびホルムアルデヒドを含む培養液中で前記微生物を培養することにより行われる[11]に記載の方法。
[13] 前記微生物を前記培養液中に高密度に懸濁させた前記状態は、前記微生物を前記培養液中に、前記微生物の湿菌体重量%が1〜50(w/v)%の範囲内になるように懸濁させた状態、好ましくは、前記微生物を前記培養液中に、前記微生物の湿菌体重量%が3〜30(w/v)%の範囲内になるように懸濁させた状態である[12]に記載の方法。
[14] 前記第1遺伝子は、アルドラーゼをコードする[1]〜[13]の何れか1に記載の方法。
[15] 前記第1遺伝子は、タイプIのアルドラーゼをコードする[1]〜[14]の何れか1に記載の方法。
[16] 前記第1遺伝子は、タイプIIのアルドラーゼをコードする[1]〜[14]の何れか1に記載の方法。
[17] 前記第1遺伝子は、以下からなる群より選択されるアルドラーゼをコードする:
(a1)2−デヒドロ−3−デオキシ−ホスホグルコネートアルドラーゼ(2-dehydro-3-deoxy-phosphogluconate aldolase)、
(a2)2−デヒドロ−3−デオキシ−6−ホスホグルコネートアルドラーゼ(2-dehydro-3-deoxy-6-phosphogluconate aldolase)、
(a3)4−ヒドロキシ−2−オキソグルタレートアルドラーゼ(4-hydroxy-2-oxoglutarate aldolase)、
(a4)(4S)−4−ヒドロキシル−2−オキソグルタレートアルドラーゼ((4S)-4-hydroxyl-2-oxoglutarate aldolase)、
(a5)2−デヒドロ−3−デオキシ−D−ペントネートアルドラーゼ(2-dehydro-3-deoxy-D-pentonate aldolase)、
(a6)2−デヒドロ−3−デオキシ−D−グルコネートアルドラーゼ(2-dehydro-3-deoxy-D-gluconate aldolase)、
(a7)3−デオキシ−D−マンノ−オクツロソネートアルドラーゼ(3-deoxy-D-manno-octulosonate aldolase)、
(a8)4−ヒドロキシル−2−オキソバレレートアルドラーゼ(4-hydroxyl-2-oxovalerate aldolase)、
(a9)4−(2−カルボキシフェニル)−2−オキソブ−3−エノエートアルドラーゼ(4-(2-carboxyphenyl)-2-oxobut-3-enoate aldolase)、
(a10)4−ヒドロキシ−2−オキソヘプタンジオエートアルドラーゼ(4-hydroxy-2-oxoheptanedioate aldolase)、
(a11)2−デヒドロ−3−デオキシグルカレートアルドラーゼ(2-dehydro-3-deoxyglucarate aldolase)、
(a12)2−ケト−3−デオキシ−L−ラムノネートアルドラーゼ(2-keto-3-deoxy-L-rhamnonate aldolase)、
(a13)4−ヒドロキシル−4−メチル−2−オキソグルタレートアルドラーゼ(4-hydroxyl-4-methyl-2-oxoglutarate aldolase)、および
(a14)4−ヒドロキシ−2−オキソヘキサノネートアルドラーゼ(4-hydroxy-2-oxohexanonate aldolase);
[1]〜[16]の何れか1に記載の方法。
[18] 前記第1遺伝子は、edaタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のedaタンパク質;dgoAタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のdgoAタンパク質;yjhHタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のyjhHタンパク質;yagEタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のyagEタンパク質;nanAタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のnanAタンパク質;mhpEタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のmhpEタンパク質;hpaIタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のhpaIタンパク質;bphIタンパク質、好ましくは、バークホルデリア ゼノボランス由来のbphIタンパク質;phdJタンパク質、好ましくは、ノカルディオイデス属菌由来のphdJタンパク質;garLタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のgarLタンパク質;rhmAタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のrhmAタンパク質;およびgalCタンパク質、好ましくは、シュードモナス プチダ由来のgalCタンパク質;からなる群より選択されるアルドラーゼをコードする[1]〜[17]の何れか1に記載の方法。
[19] 前記第1遺伝子は、nanAタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のnanAタンパク質;hpaIタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のhpaIタンパク質;およびrhmAタンパク質、好ましくは、大腸菌由来のrhmAタンパク質;からなる群より選択されるアルドラーゼをコードする[1]〜[18]の何れか1に記載の方法。
[20] 前記第1遺伝子は以下からなる群より選択される:
(1−1)配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
(1−2)配列番号2において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
(1−3)配列番号4に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
(1−4)配列番号4において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
(1−5)配列番号6に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
(1−6)配列番号6において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子;
[1]〜[19]の何れか1に記載の方法。
[21] 前記第1遺伝子は以下からなる群より選択される:
配列番号1に記載の塩基配列からなる、大腸菌由来のhpaI遺伝子、
配列番号3に記載の塩基配列からなる、大腸菌由来のrhmA遺伝子、および
配列番号5に記載の塩基配列からなる、大腸菌由来のnanA遺伝子;
[1]〜[20]の何れか1に記載の方法。
[22] 前記第2遺伝子は、前記アルドール反応により得られたα−ケト酸の脱炭酸反応を触媒する前記酵素をコードする[1]〜[21]の何れか1に記載の方法。
[23] 前記第2遺伝子は、脱炭酸酵素をコードする[1]〜[22]の何れか1に記載の方法。
[24] 前記第2遺伝子は、以下からなる群より選択される脱炭酸酵素をコードする:
(b1)ピルベートデカルボキシラーゼ(pyruvate decarboxylase)、
(b2)ベンゾイルフォルメートデカルボキシラーゼ(benzoylformate decarboxylase)、および
(b3)インドールピルベートデカルボキシラーゼ(indolepyruvate decarboxylase);
[1]〜[23]の何れか1に記載の方法。
[25] 前記第2遺伝子は、pdcタンパク質、好ましくは、ザイモモナス モビリス由来のpdcタンパク質;mdlCタンパク質、好ましくは、シュードモナス プチダ由来のmdlCタンパク質;kivDタンパク質、好ましくは、ラクトコッカス ラクティス由来のkivDタンパク質;からなる群より選択される脱炭酸酵素をコードする[1]〜[24]の何れか1に記載の方法。
[26] 前記第2遺伝子は、mdlCタンパク質、好ましくは、シュードモナス プチダ由来のmdlCタンパク質をコードする[1]〜[25]の何れか1に記載の方法。
[27] 前記第2遺伝子は以下からなる群より選択される:
(2−1)配列番号8に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の脱炭酸反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
(2−2)配列番号8において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の脱炭酸反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子;
[1]〜[26]の何れか1に記載の方法。
[28] 前記第2遺伝子は、配列番号7に記載の塩基配列からなる、シュードモナス プチダ由来のmdlC遺伝子である[1]〜[27]の何れか1に記載の方法。
[29] 前記第3遺伝子は、前記第1遺伝子がコードする前記酵素が触媒する前記アルドール反応の基質であるアルデヒドとは種類が異なるアルデヒドの還元反応を触媒する前記酵素をコードする[1]〜[28]の何れか1に記載の方法。
[30] 前記第3遺伝子は、前記脱炭酸反応により得られたアルデヒドの還元反応を触媒する前記酵素をコードする[1]〜[29]の何れか1に記載の方法。
[31] 前記第3遺伝子は、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする[1]〜[30]の何れか1に記載の方法。
[32] 前記第3遺伝子は、1,3−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ(1,3-propanediol dehydrogenase)をコードする[1]〜[31]の何れか1に記載の方法。
[33] 前記第3遺伝子は、dhaTタンパク質、好ましくは、クレブシエラ ニューモニエ由来のdhaTタンパク質;およびlpoタンパク質、好ましくは、ラクトバチルス ロイテリ由来のlpoタンパク質;からなる群より選択される1,3−プロパンジオールデヒドロゲナーゼをコードする[1]〜[32]の何れか1に記載の方法。
[34] 前記第3遺伝子は以下からなる群より選択される:
(3−1)配列番号10に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、アルデヒドの還元反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
(3−2)配列番号10において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、アルデヒドの還元反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子;
[1]〜[33]の何れか1に記載の方法。
[35] 前記第3遺伝子は、配列番号9に記載の塩基配列からなる、クレブシエラ ニューモニエ由来のdhaT遺伝子である[1]〜[34]の何れか1に記載の方法。
[36] 前記第1遺伝子は以下からなる群より選択され:
(1−1)配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
(1−2)配列番号2において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
(1−3)配列番号4に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
(1−4)配列番号4において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
(1−5)配列番号6に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
(1−6)配列番号6において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子;
前記第2遺伝子は以下からなる群より選択され:
(2−1)配列番号8に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の脱炭酸反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
(2−2)配列番号8において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の脱炭酸反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子;および
前記第3遺伝子は以下からなる群より選択される:
(3−1)配列番号10に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、アルデヒドの還元反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
(3−2)配列番号10において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、アルデヒドの還元反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子;
[1]〜[35]の何れか1に記載の方法。
[37] 前記微生物は、好気性細菌、好ましくは、コリネ型細菌、より好ましくは、コリネバクテリウム属(Corynebacterium)菌、より好ましくは、コリネバクテリウム グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)である[1]〜[36]の何れか1に記載の方法。
[38] 前記微生物は、前記第1遺伝子、前記第2遺伝子および前記第3遺伝子によって形質転換された微生物である[1]〜[37]の何れか1に記載の方法。
[39] 前記微生物は、ラクテート(乳酸)デヒドロゲナーゼ(lactate dehydrogenase)遺伝子、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ(phosphoenolpyrvate carboxylase)遺伝子、ピルビン酸カルボキシラーゼ(pyruvate carboxylase)遺伝子、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ(pyruvate dehydrogenase)遺伝子、グルタミン酸−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ(glutamate-pyruvate aminotransferase)遺伝子、アセトラクテートシンターゼ(acetolactate synthase)遺伝子、N−スクシニルジアミノピメレート(N-succinyldiaminopimelate aminotransferase)遺伝子、S-(ヒドロキシメチル)ミコチオールデヒドロゲナーゼ(S-(hydroxymethyl)mycothiol dehydrogenase)遺伝子、およびアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ(acetaldehyde dehydrogenase)遺伝子からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の欠損株である[1]〜[38]の何れか1に記載の方法。
[40] 前記培養の前に、前記微生物を好気的条件下で培養することを更に含む[1]〜[39]の何れか1に記載の方法。
[41] 生産された1,3−プロパンジオールを回収することを更に含む[1]〜[40]の何れか1に記載の方法。
(1−1)培地
試薬は特に指示がなければ富士フィルム和光純薬株式会社より購入した。
尿素2.0g、硫酸アンモニウム7.0g、リン酸二水素カリウム0.50g、リン酸水素二カリウム0.50g、硫酸マグネシウム七水和物0.50g、酵母エキス(ディフコ社製)2.0g、カサミノ酸 ビタミンアッセイ(ディフコ社製)7.0g、硫酸鉄(II)七水和物6.0mg、硫酸マンガン(II)一水和物4.2mg、D(+)−ビオチン0.20mg、塩酸チアミン0.20mgを0.92Lの水に溶解し、pHを5M水酸化カリウム水溶液を用いて7.0に調整した。これを121℃にて20分間オートクレーブ滅菌し、室温まで冷却した後に、オートクレーブ滅菌済みの50%(w/v)のグルコース水溶液80mLを加えることにより調製された液体培地。
尿素2.0g、硫酸アンモニウム7.0g、リン酸二水素カリウム0.50g、リン酸水素二カリウム0.50g、硫酸マグネシウム七水和物0.50g、酵母エキス(ディフコ社製)2.0g、カサミノ酸 ビタミンアッセイ(ディフコ社製)7.0g、硫酸鉄(II)七水和物6.0mg、硫酸マンガン(II)一水和物4.2mg、D(+)−ビオチン0.20mg、塩酸チアミン0.20mg、寒天15gを0.92Lの水に溶解、懸濁し、pHを5M水酸化カリウム水溶液を用いて7.0に調整した。これを121℃にて20分間オートクレーブ滅菌し、50℃まで冷却した後に、オートクレーブ滅菌済みの50%(w/v)のグルコース水溶液80mLを加え、ペトリ皿に分注後、冷却固化することで調製された固体培地。
尿素2.0g、硫酸アンモニウム7.0g、リン酸二水素カリウム0.50g、リン酸水素二カリウム0.50g、硫酸マグネシウム七水和物0.50g、酵母エキス(ディフコ社製)2.0g、カサミノ酸 ビタミンアッセイ(ディフコ社製)7.0g、硫酸鉄(II)七水和物6.0mg、硫酸マンガン(II)一水和物4.2mg、D(+)−ビオチン0.20mg、塩酸チアミン0.20mg、4−モルホリノプロパンスルホン酸21gを0.92Lの水に溶解し、pHを5M水酸化カリウム水溶液を用いて7.0に調整した。これを121℃にて20分間オートクレーブ滅菌し、室温まで冷却した後に、オートクレーブ滅菌済みの50%(w/v)のグルコース水溶液80mLを加えることにより調製された液体培地。
バクトトリプトン(ディフコ社製)10g、酵母エキス(ディフコ社製)5.0g、塩化ナトリウム10gを1Lの水に溶解し、pHを5M水酸化ナトリウム水溶液を用いて7.0に調整した後、121℃にて20分間オートクレーブ滅菌することで調製された液体培地。
バクトトリプトン(ディフコ社製)10g、酵母エキス(ディフコ社製)5.0g、塩化ナトリウム10g、寒天15gを1Lの水に溶解、懸濁し、pHを5M水酸化ナトリウム水溶液を用いて7.0に調整した後、121℃にて20分間オートクレーブ滅菌し、50℃まで冷却した後に、ペトリ皿に分注し、冷却固化することで調製された固体培地。
バクトトリプトン(ディフコ社製)10g、酵母エキス(ディフコ社製)5.0g、塩化ナトリウム10g、寒天15gを0.5Lの水に溶解、懸濁し、pHを5M水酸化ナトリウム水溶液を用いて7.0に調整した。これを121℃にて20分間オートクレーブ滅菌し、50℃まで冷却した後に、オートクレーブ滅菌済みの20%(w/v)のスクロース水溶液0.5Lを加え、ペトリ皿に分注後、冷却固化することで調製された固体培地。
ブレインハートインフュージョン(ディフコ社製)36g、ソルビトール91gを1Lの水に溶解し、pHを5M水酸化ナトリウム水溶液を用いて7.0に調整した後、121℃にて20分間オートクレーブ滅菌することで調製された液体培地。
ブレインハートインフュージョン(ディフコ社製)36g、グリシン8.0g、イソニアジド1.3g、Tween80 3mL、ソルビトール91gを1Lの水に溶解し、pHを5M水酸化ナトリウム水溶液を用いて7.0に調整した後、121℃にて20分間オートクレーブ滅菌することで調製された液体培地。
トリスヒドロキシメチルアミノメタン1.2g、エチレンジアミン−N,N,N’,N’−四酢酸二ナトリウム塩二水和物0.37gを1Lの水に溶解し、pHを6M塩酸を用いて8.0に調整した後、121℃にて20分間オートクレーブ滅菌することで調製された緩衝液。
トリスヒドロキシメチルアミノメタン0.12g、グリセロール10gを1Lの水に溶解し、pHを6M塩酸を用いて7.5に調整した後、121℃にて20分間オートクレーブ滅菌することで調製された緩衝液。
グリセロール100gを1Lの水に溶解した後、121℃にて20分間オートクレーブ滅菌することで調製された水溶液。
リン酸二水素カリウム0.50g、リン酸水素二カリウム0.50g、硫酸マグネシウム七水和物0.50g、硫酸鉄(II)七水和物6.0mg、硫酸マンガン(II)一水和物4.2mgを1.0Lの水に溶解し、pHを5M水酸化カリウム水溶液を用いて7.0に調整することでえられた緩衝液。
NucleoSpin(登録商標) Gel and PCR Clean−up(マッハライ・ナーゲル社製)をその指示書通りに用いてDNA断片の抽出、精製を行った。
NucleoSpin(登録商標) Plasmid EasyPure(マッハライ・ナーゲル社製)をその指示書通りに用いてプラスミドの抽出、精製を行った。
以下のいずれかのDNAポリメラーゼおよびそれに付属する試薬を用いて、その指示書に従いPCRを行った:PrimeSTAR(登録商標) HS DNA Polymerase(タカラバイオ社製)、PrimeSTAR(登録商標) Max DNA Polymerase(タカラバイオ社製)、Tks GflexTM DNA Polymerase(タカラバイオ社製)。
島津製作所製の以下の機器より構成される有機酸分析システムを用いた。システムコントローラ:CBM−20A、送液ユニット:LC−20AB、オンライン脱気ユニット:DGU−20A3R、オートインジェクタ:SIL−20AC、カラムオーブン:CTO−20AC、フォトダイオードアレイ検出器:SPD−M20A。
ガードカラム:TSKgel OApak−P(東ソー社製)
分析カラム:TSKgel OApak−A(東ソー社製)
カラムオーブン温度:40℃
移動相:0.75mM硫酸
流速:1.0mL/min。
島津製作所製の以下の機器より構成される糖分析システムを用いた。システムコントローラ:CBM−20A、送液ユニット:LC−20AB、オンライン脱気ユニット:DGU−20A3R、オートインジェクタ:SIL−20AC、カラムオーブン:CTO−20AC、屈折率検出器:RID−10A。
前処理:脱塩カートリッジ(バイオラッド社製)
分析カラム:アミネックス HPX−87P(バイオラッド社製)
カラムオーブン温度:85℃
移動相:水
流速:0.6mL/min。
入手元の指示書通りに液体培養した微生物を遠心分離により回収し、−80℃で凍結した。菌体ペレットを室温で解凍し、10mg/mLリゾチーム水溶液537μLを加えて37℃で1時間振盪した。次に0.5M EDTA水溶液30μL、10%SDS水溶液30μL、20mg/mLプロテイナーゼK水溶液3μLを加えて、37℃で1時間振盪した。その後さらに5M塩化ナトリウム水溶液100μLと10%臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム水溶液(0.7M塩化ナトリウム中)80μLを加えて、65℃で10分間加熱した。室温まで冷却した後、クロロホルム−イソアミルアルコール(24:1)780μL加えて、穏やかに混和した。15000xg、4℃にて5分間遠心分離して、水層を600μL回収した。これにフェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール(25:24:1)600μLを加えて、穏やかに混和した。15000xg、4℃にて5分間遠心分離して、水層を500μL回収した。これにイソプロパノール300μLを加えて、15000xg、4℃にて5分間遠心分離した後、上清を取り除いた。沈殿物として得られたゲノムDNAを70%エタノール500μLを加えて洗浄し、15000xg、4℃にて5分間遠心分離した。この洗浄を2度繰り返し、室温にて乾燥させた後、得られたゲノムDNAをTEバッファー100μLに溶解した。
形質転換を行うコリネバクテリウム グルタミカムATCC13032由来株のグリセロールストックをA寒天培地に無菌条件下で接種し、33℃にて培養した。寒天培地上に生育した菌体を10mLのA培地に接種し、33℃にて振盪培養を行い種培養液とした。この種培養液を濁度が0.2となるように500mLフラスコ中に用意された100mLのBHIS培地に接種した。33℃にて振盪を行い濁度が0.5〜0.7になるまで培養した。この培養液を4℃、5500xgにて20分間遠心分離を行い、上澄み液を除去した。回収した菌体を10mLのTGバッファーで洗浄し、4℃、5500xgにて5分間遠心分離を行い、上澄み液を除去した。この洗浄を2度行った後、10mLの10%グリセロール水溶液で洗浄し、4℃、5500xgにて5分間遠心分離を行い、上澄み液を除去した。得られた菌体ペレットを1mLの10%グリセロール水溶液に懸濁させ、150μLずつ滅菌済みの1.5mLチューブに分注後、液体窒素を用いて凍結し、コンピテントセルとして−80℃で保存した。
目的のDNA配列を増幅できるプライマーの組み合わせを用いてTaKaRa Ex Taq(登録商標)(タカラバイオ社製)の指示書通りに鋳型DNA以外の試薬を混合した。これに寒天培地に生じた菌株のコロニーを少量懸濁させ、これに内在するDNAを鋳型とし、指示書通りにPCRを行った。PCR産物をアガロース・ゲル電気泳動により分析し、目的のプラスミドを保持していること、または、ゲノム上の該当するDNA配列が欠失または置換していることを確認した。
大腸菌およびコリネバクテリウム グルタミカムの培養液の濁度は、Ultrospec 8000(GEヘルスケア社製)を用いて610nmの波長で測定を行った。
プライマーDNA、菌体およびプラスミドの詳細は、以下の表11〜表31に記載した。
(2−1)遺伝子欠失編
2−1−(1)遺伝子破壊用プラスミドの構築
pNIC28−Bsa4(Source BioScience社製)を鋳型とし、GEP007(配列番号11)とGEP008(配列番号12)で示される塩基配列のDNAを用いて、Bacillus subtilis由来sacB遺伝子を含むDNA断片〔Mol.Microbiol., 6, 1195(1992)〕をPCR法により増幅した。このPCR産物をBamHIおよびPstIで処理し、アガロース・ゲル電気泳動後に、DNA断片の抽出、精製を行った。また、カナマイシンに対する耐性を付与する遺伝子を有するプラスミドpHSG299(タカラバイオ社製)をBamHIおよびPstIで処理し、アガロース・ゲル電気泳動後に、DNA断片の抽出、精製を行った。これら2つのDNA断片をDNA Ligation Kit< Mighty Mix >(タカラバイオ社製)をその指示書通りに用いて連結し、プラスミドpGE015を得た。
コリネバクテリウム グルタミカムATCC13032株は独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンターからNBRC12168株として入手し、添付の指示書通りに培養を行った後に、ゲノムDNA抽出を行った。
pGE020を用い、電気穿孔法によりコリネバクテリウム グルタミカムATCC13032株を形質転換し、33℃にて25μg/mlのカナマイシンを含むA培地上でカナマイシン耐性株を選択した。次に、得られたカナマイシン耐性株をSuc寒天培地上に塗布し、33℃で培養した。生育したコロニーをさらにA培地で培養し、コロニーPCRによりppc遺伝子が欠失している株を選択した。これをGES007と命名した。
ATCC13032株のゲノムDNAを鋳型とし、GEP169(配列番号19)とGEP170(配列番号20)で示される塩基配列のDNAの組み合わせ、およびGEP215(配列番号21)とGEP216(配列番号22)で示される塩基配列のDNAの組み合わせを用いて、PCR法により2種類のPCR産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。さらに、pGE015をEcoRIで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの3つのDNA断片を混和し、pGE020作成時と同様な操作により得られたプラスミドをpGE033とした。
pGE033を用い、電気穿孔法によりGES007を形質転換し、GES007作成時と同様な操作により選択した株をGES048と命名した。
ATCC13032株のゲノムDNAを鋳型とし、GEP615(配列番号23)とGEP616(配列番号24)で示される塩基配列のDNAの組み合わせ、およびGEP617(配列番号25)とGEP618(配列番号26)で示される塩基配列のDNAの組み合わせを用いて、PCR法により2種類のPCR産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。さらに、pGE015をEcoRIで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの3つのDNA断片を混和し、pGE020作成時と同様な操作により得られたプラスミドをpGE177とした。
pGE177を用い、電気穿孔法によりGES048を形質転換し、GES007作成時と同様な操作により選択した株をGES385と命名した。
ATCC13032株のゲノムDNAを鋳型とし、GEP406(配列番号27)とGEP407(配列番号28)で示される塩基配列のDNAの組み合わせ、およびGEP698(配列番号29)とGEP409(配列番号30)で示される塩基配列のDNAの組み合わせを用いて、PCR法により2種類のPCR産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。さらに、pGE015をEcoRIで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの3つのDNA断片を混和し、pGE020作成時と同様な操作により得られたプラスミドをpGE191とした。
pGE191を用い、電気穿孔法によりGES385を形質転換し、GES007作成時と同様な操作により選択した株をGES388と命名した。
ATCC13032株のゲノムDNAを鋳型とし、GEP810と(配列番号31)GEP811(配列番号32)で示される塩基配列のDNAの組み合わせ、およびGEP812(配列番号33)とGEP813(配列番号34)で示される塩基配列のDNAの組み合わせを用いて、PCR法により2種類のPCR産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。さらに、pGE015をEcoRIで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの3つのDNA断片を混和し、pGE020作成時と同様な操作により得られたプラスミドをpGE210とした。
pGE210を用い、電気穿孔法によりGES388を形質転換し、GES007作成時と同様な操作により選択した株をGES393と命名した。
ATCC13032株のゲノムDNAを鋳型とし、GEP956(配列番号35)とGEP957(配列番号36)で示される塩基配列のDNAの組み合わせ、およびGEP958(配列番号37)とGEP959(配列番号38)で示される塩基配列のDNAの組み合わせを用いて、PCR法により2種類のPCR産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。さらに、pGE015をEcoRIで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの3つのDNA断片を混和し、pGE020作成時と同様な操作により得られたプラスミドをpGE228とした。
pGE228を用い、電気穿孔法によりGES393を形質転換し、GES007作成時と同様な操作により選択した株をGES405と命名した。
ATCC13032株のゲノムDNAを鋳型とし、GEP1132(配列番号39)とGEP1133(配列番号40)で示される塩基配列のDNAの組み合わせ、およびGEP1134(配列番号41)とGEP1135(配列番号42)で示される塩基配列のDNAの組み合わせを用いて、PCR法により2種類のPCR産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。さらに、pGE015をEcoRIで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの3つのDNA断片を混和し、pGE020作成時と同様な操作により得られたプラスミドをpGE253とした。
pGE253を用い、電気穿孔法によりGES405を形質転換し、GES007作成時と同様な操作により選択した株をGES435と命名した。
ATCC13032株のゲノムDNAを鋳型とし、GEP2606(配列番号43)とGEP2607(配列番号44)で示される塩基配列のDNAの組み合わせ、およびGEP2608(配列番号45)とGEP2609(配列番号46)で示される塩基配列のDNAの組み合わせを用いて、PCR法により2種類のPCR産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。さらに、pGE209をKpnIとBamHIで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの3つのDNA断片を混和し、pGE020作成時と同様な操作により得られたプラスミドをpGE1171とした。
pGE1171を用い、電気穿孔法によりGES048を形質転換し、GES007作成時と同様な操作により選択した株をGES1041と命名した。
ATCC13032株のゲノムDNAを鋳型とし、GEP2610(配列番号49)とGEP2611(配列番号50)で示される塩基配列のDNAの組み合わせ、およびGEP2612(配列番号51)とGEP2613(配列番号52)で示される塩基配列のDNAの組み合わせを用いて、PCR法により2種類のPCR産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。さらに、pGE209をKpnIとBamHIで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの3つのDNA断片を混和し、pGE020作成時と同様な操作により得られたプラスミドをpGE1172とした。
pGE1172を用い、電気穿孔法によりGES1041を形質転換し、GES007作成時と同様な操作により選択した株をGES1070と命名した。
(2−2)遺伝子置換編
2−2−(1)pGE409の構築
pHSG298(タカラバイオ社製)を鋳型とし、GEP433(配列番号55)とGEP434(配列番号56)で示される塩基配列のDNAの組み合わせ、およびGEP437(配列番号57)とGEP438(配列番号58)で示される塩基配列のDNAの組み合わせを用いて、PCR法によりPCR産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらはそれぞれカナマイシン耐性遺伝子および大腸菌用複製起点pUCoriを含むDNA断片である。
ECOSTM Competent E. coli BL21(DE3)(ニッポンジーン社製)を購入し、これをLB寒天培地に無菌条件下で接種し、37℃にて培養した。寒天培地上に生育した菌体を10mLのLB培地に接種して生育した菌体を回収し、ゲノムDNA抽出を行った。BL21(DE3)株のゲノムDNAを鋳型とし、GEP2268(配列番号65)とGEP2269(配列番号66)で示される塩基配列のDNAの組み合わせを用いて、PCR法によりPCR産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これは大腸菌BL21(DE3)株hpaI遺伝子(Ec_hpaI)を含むDNA断片である。さらに、pET−15b(ノバジェン社製)をNdeIで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの2つのDNA断片を混和し、In−Fusion(登録商標) HD Cloning Kitをその指示書通りに用いてDNA断片の結合反応を行った。反応産物を用い、E.coli DH5α Competent Cells(タカラバイオ社製)をその指示書通りに形質転換した。目的の形質転換株は、100μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地上で培養することで選択した。この形質転換株を100μg/mlのアンピシリンを含むLB培地で培養し、得られた培養懸濁液を用いてプラスミド抽出を行った。こうしてEc_hpaIがpET−15bへとクローニングされたプラスミドpGE1031を得た。
pGE1143を鋳型とし、GEP2639(配列番号71)とGEP2640(配列番号72)で示される塩基配列のDNAの組み合わせを用いて、PCR法によりPCR産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これはPgapA−hpaI−TrrnBを含むDNA断片である。さらに、pGE1172をXhoIで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの2つのDNA断片を混和し、pGE1185作成時と同様な操作により得られたプラスミドをpGE1186とした。
pGE1186を用い、電気穿孔法によりGES1041を形質転換し、33℃にて25μg/mlのカナマイシンを含むA培地上でカナマイシン耐性株を選択した。次に、得られたカナマイシン耐性株をSuc寒天培地上に塗布し、33℃で培養した。生育したコロニーをさらにA培地で培養し、コロニーPCRによりald遺伝子がPgapA−hpaI−TrrnBに置換している株を選択した。これをGES1052と命名した。さらに、pGE1185を用い、電気穿孔法によりGES1052を形質転換し、GES1052作成時と同様な操作によりadhE遺伝子の位置にPgapA−hpaI−TrrnBが挿入した株を選択した。これをGES1063と命名した。
E. coli DH5α Competent Cells(タカラバイオ社製)を購入し、これをLB寒天培地に無菌条件下で接種し、37℃にて培養した。寒天培地上に生育した菌体を10mLのLB培地に接種して生育した菌体を回収し、ゲノムDNA抽出を行った。DH5α株のゲノムDNAを鋳型とし、GEP2765(配列番号73)とGEP2766(配列番号74)で示される塩基配列のDNAの組み合わせを用いて、PCR法によりPCR産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これは大腸菌DH5α株rhmA遺伝子(Ec_rhmA)を含むDNA断片である。さらに、pGE409をNdeIとBamHIで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの2つのDNA断片を混和し、pGE1143作成時と同様な操作によりEc_rhmAがpGE409へとクローニングされたプラスミドpGE1258を得た。
pGE1258を鋳型とし、GEP2637(配列番号69)とGEP2638(配列番号70)で示される塩基配列のDNAの組み合わせを用いて、PCR法によりPCR産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これはPgapA−rhmA−TrrnBを含むDNA断片である。さらに、pGE1218をXhoIで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの2つのDNA断片を混和し、pGE1185作成時と同様な操作により得られたプラスミドをpGE1304とした。
pGE1258を鋳型とし、GEP2639(配列番号71)とGEP2640(配列番号72)で示される塩基配列のDNAの組み合わせを用いて、PCR法によりPCR産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。さらに、pGE1221をXhoIで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これはPgapA−rhmA−TrrnBを含むDNA断片である。これらの2つのDNA断片を混和し、pGE1185作成時と同様な操作により得られたプラスミドをpGE1302とした。
pGE1302を用い、電気穿孔法によりGES1041を形質転換し、GES1052作成時と同様な操作によりald遺伝子がPgapA−rhmA−TrrnBに置換している株を選択した。これをGES1215と命名した。さらに、pGE1304を用い、電気穿孔法によりGES1215を形質転換し、GES1052作成時と同様な操作によりadhE遺伝子の位置にPgapA−rhmA−TrrnBが挿入した株を選択した。これをGES1242と命名した。
E. coli DH5α Competent Cells(タカラバイオ社製)を購入し、これをLB寒天培地に無菌条件下で接種し、37℃にて培養した。寒天培地上に生育した菌体を10mLのLB培地に接種して生育した菌体を回収し、ゲノムDNA抽出を行った。DH5α株のゲノムDNAを鋳型とし、GEP2722(配列番号75)とGEP2723(配列番号76)で示される塩基配列のDNAの組み合わせを用いて、PCR法によりPCR産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これは大腸菌DH5α株nanA遺伝子(Ec_nanA)を含むDNA断片である。さらに、pGE409をNdeIとBamHIで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの2つのDNA断片を混和し、pGE1143作成時と同様な操作によりEc_nanAがpGE409へとクローニングされたプラスミドpGE1226を得た。
pGE1226を鋳型とし、GEP2639(配列番号71)とGEP2640(配列番号72)で示される塩基配列のDNAの組み合わせを用いて、PCR法によりPCR産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。さらに、pGE1221をXhoIで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これはPgapA−nanA−TrrnBを含むDNA断片である。これらの2つのDNA断片を混和し、pGE1185作成時と同様な操作により得られたプラスミドをpGE1273とした。
pGE1273を用い、電気穿孔法によりGES1041を形質転換し、GES1052作成時と同様な操作によりald遺伝子がPgapA−nanA−TrrnBに置換している株を選択した。これをGES1188と命名した。さらに、pGE1272を用い、電気穿孔法によりGES1188を形質転換し、GES1052作成時と同様な操作によりadhE遺伝子の位置にPgapA−nanA−TrrnBが挿入した株を選択した。これをGES1223と命名した。
(2−3)過剰発現用プラスミド編
2−3−(1)pGE411の構築
pHSG298(タカラバイオ社製)を鋳型とし、GEP433(配列番号55)とGEP434(配列番号56)で示される塩基配列のDNAの組み合わせ、およびGEP437(配列番号57)とGEP438(配列番号58)で示される塩基配列のDNAの組み合わせを用いて、PCR法によりPCR産物を得、これらをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらはそれぞれカナマイシン耐性遺伝子および大腸菌用複製起点pUCoriを含むDNA断片である。
pCR8/GW/TOPO(インビトロジェン社製)を鋳型とし、GEP435(配列番号81)とGEP436(配列番号82)で示される塩基配列のDNAの組み合わせを用いて、PCR法によりPCR産物を得、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。また、pHSG298(タカラバイオ社製)を鋳型とし、GEP437(配列番号57)とGEP438(配列番号58)で示される塩基配列のDNAの組み合わせを用いて、PCR法によりPCR産物を得、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらはそれぞれスペクチノマイシン耐性遺伝子および大腸菌用複製起点pUCoriを含むDNA断片である。
シュードモナス プチダNBRC14164株は独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンターから入手し、添付の指示書通りに培養を行った後に、ゲノムDNA抽出を行った。NBRC14164株のゲノムDNAを鋳型とし、GEP2550(配列番号84)とGEP2551(配列番号85)で示される塩基配列のDNAの組み合わせを用いて、PCR法によりPCR産物を得、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これはシュードモナス プチダNBRC14164株mdlC遺伝子(Pp_mdlC)を含むDNA断片である。さらに、pET−15b(ノバジェン社製)をNdeIで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの2つのDNA断片を混和し、pGE1031作成時と同様な操作によりPp_mdlCがpET−15bへとクローニングされたプラスミドpGE1161を得た。
クレブシエラ ニューモニエ由来の遺伝子(DDBJアクセッション番号:LC412902)を含むプラスミドpHA12−dhaBTを広島大学田島誉久博士より供与を頂いた。これを鋳型とし、GEP2529(配列番号88)とGEP2530(配列番号89)で示される塩基配列のDNAの組み合わせを用いて、PCR法によりPCR産物を得、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これはクレブシエラ ニューモニエdhaT遺伝子(Kp_dhaT)を含むDNA断片である。さらに、pET−15b(ノバジェン社製)をNdeIで処理し、これをアガロース・ゲル電気泳動の後、抽出、精製を行った。これらの2つのDNA断片を混和し、pGE1161作成時と同様な操作によりKp_dhaTがpET−15bへとクローニングされたプラスミドpGE1150を得た。
(3−1)Pp_mdlCおよびKp_dhaT過剰発現プラスミド導入株の作成
pGE1197とpGE1190を用い、電気穿孔法によりGES1070を形質転換し、33℃にて25μg/mlのカナマイシンと100μg/mlのスペクチノマイシンを含むA寒天培地上でカナマイシン・スペクチノマイシン耐性株を選択した。これをGES1206と命名した。
pGE1197とpGE1190を用い、電気穿孔法によりGES1223を形質転換し、33℃にて25μg/mlのカナマイシンと100μg/mlのスペクチノマイシンを含むA寒天培地上でカナマイシン・スペクチノマイシン耐性株を選択した。これをGES1253と命名した。
4.物質生産実験
(4−1)4−ヒドロキシ−2−オキソ酪酸(HOB)の生産
4−1−(1)GES1077の培養
GES1077のグリセロールストックをカナマイシン25μg/mLおよびスペクチノマイシン100μg/mLを含むA寒天培地に無菌条件下で接種し、33℃にて培養した。寒天培地上に生育した菌体をカナマイシン25μg/mLおよびスペクチノマイシン100μg/mLを含む10mLのBA培地に接種し、33℃にて振盪培養を行い種培養液とした。この種培養液を濁度が0.1となるように2Lフラスコ中に用意されたカナマイシン25μg/mLおよびスペクチノマイシン100μg/mLを含む500mLのBA培地に接種した。33℃にて振盪を行い終夜培養した。この本培養液を4℃、5500xgにて15分間遠心分離を行い、上澄み液を除去した。このようにして得られた湿菌体を以下の反応に用いた。
前記の通り調製された湿菌体を10%(w/v)となるようにBRバッファーに懸濁した。この菌体懸濁液に50%(w/v)のグルコース水溶液および1.2Mのホルムアルデヒド水溶液をそれぞれ50mM、40mMとなるように加え、1.0M水酸化カリウム水溶液を用いてpHを6.0に維持しながら33℃にて培養を行った。培養においては、水酸化カリウム水溶液を効率的に混和するように撹拌を行い、かつ、通気を行わなかった。なお、この操作によって、当該湿菌体濃度では、嫌気的条件または微好気的条件は達成されている。3時間後、反応液の上清を有機酸分析用液体クロマトグラフィーにより分析したところ、HOBが0.65mM生成していた。
前記の通り調製された湿菌体を10%(w/v)となるようにBRバッファーに懸濁した。この菌体懸濁液に50%(w/v)のグルコース水溶液を50mMとなるように加え、1.0M水酸化カリウム水溶液を用いてpHを6.0に維持しながら33℃にて培養を行った。3時間後、反応懸濁液の上清を有機酸分析用液体クロマトグラフィーにより分析したところ、HOBは検出されなかった。
GES1206について、前記4−1−(1)および4−1−(2)と同様の実験を行った。反応3時間後、反応懸濁液の上清を有機酸分析用液体クロマトグラフィーにより分析したところ、HOBは検出されなかった。
GES1282のグリセロールストックから4−1−(1)と同様に培養し得られた湿菌体を以下の反応に用いた。
前記の通り調製された湿菌体を4−1−(2)と同様に培養を行った。培養においては、水酸化カリウム水溶液を効率的に混和するように撹拌を行い、かつ、通気を行わなかった。なお、この操作によって、当該湿菌体濃度では、嫌気的条件または微好気的条件は達成されている。3時間後、反応液の上清を有機酸分析用液体クロマトグラフィーにより分析したところ、HOBが0.36mM生成していた。
前記の通り調製された湿菌体を4−1−(3)と同様に培養を行った。培養においては、水酸化カリウム水溶液を効率的に混和するように撹拌を行い、かつ、通気を行わなかった。なお、この操作によって、当該湿菌体濃度では、嫌気的条件または微好気的条件は達成されている。3時間後、反応懸濁液の上清を有機酸分析用液体クロマトグラフィーにより分析したところ、HOBは検出されなかった。
GES1253のグリセロールストックから4−1−(1)と同様に培養し得られた湿菌体を以下の反応に用いた。
前記の通り調製された湿菌体を4−1−(2)と同様に培養を行った。培養においては、水酸化カリウム水溶液を効率的に混和するように撹拌を行い、かつ、通気を行わなかった。なお、この操作によって、当該湿菌体濃度では、嫌気的条件または微好気的条件は達成されている。3時間後、反応液の上清を有機酸分析用液体クロマトグラフィーにより分析したところ、HOBが0.34mM生成していた。
前記の通り調製された湿菌体を4−1−(2)と同様に培養を行った。培養においては、水酸化カリウム水溶液を効率的に混和するように撹拌を行い、かつ、通気を行わなかった。なお、この操作によって、当該湿菌体濃度では、嫌気的条件または微好気的条件は達成されている。3時間後、反応懸濁液の上清を有機酸分析用液体クロマトグラフィーにより分析したところ、HOBは検出されなかった。
GES1068およびGES1254のグリセロールストックから4−1−(1)と同様に培養し得られた湿菌体を以下の反応に用いた。
前記の通り調製された湿菌体を4−1−(2)と同様に培養を行った。培養においては、水酸化カリウム水溶液を効率的に混和するように撹拌を行い、かつ、通気を行わなかった。なお、この操作によって、当該湿菌体濃度では、嫌気的条件または微好気的条件は達成されている。3時間後、反応液の上清を有機酸分析用液体クロマトグラフィーにより分析したところ、HOBがGES1068を用いた反応では1.2mM、GES1254を用いた反応では0.42mM生成していた。
4−1−(12)の結果から、GES1068およびGES1254のようなGES1077およびGES1253とは異なる遺伝子型の微生物であっても、クラス2アルドラーゼをコードする遺伝子を持つ菌体であれば、糖類およびアルデヒド存在下に培養することで、糖類からピルビン酸を生成し、これとアルデヒドの間のアルドール反応を当該酵素が触媒することで、HOBに代表されるようなアルドール化合物を生成することがわかった。
4−2−(1)GES1077、GES1068の培養
GES1077、GES1068のグリセロールストックをカナマイシン25μg/mLおよびスペクチノマイシン100μg/mLを含むA寒天培地に無菌条件下で接種し、33℃にて培養した。寒天培地上に生育した菌体をカナマイシン25μg/mLおよびスペクチノマイシン100μg/mLを含む10mLのBA培地に接種し、33℃にて振盪培養を行い種培養液とした。この種培養液を濁度が0.1となるように2Lフラスコ中に用意されたカナマイシン25μg/mLおよびスペクチノマイシン100μg/mLを含む500mLのBA培地に接種した。33℃にて振盪を行い終夜培養した。この本培養液を4℃、5500xgにて15分間遠心分離を行い、上澄み液を除去した。このようにして得られた湿菌体を以下の反応に用いた。
前記の通り調製された湿菌体を10%(w/v)となるようにBRバッファーに懸濁した。この菌体懸濁液に50%(w/v)のグルコース水溶液および1.2Mのホルムアルデヒド水溶液をそれぞれ50mM、40mMとなるように加え、1.0M水酸化カリウム水溶液を用いてpHを6.0に維持しながら33℃にて培養を行った。培養においては、水酸化カリウム水溶液を効率的に混和するように撹拌を行い、かつ、通気を行わなかった。なお、この操作によって、当該湿菌体濃度では、嫌気的条件または微好気的条件は達成されている。3時間後、反応液の上清を糖分析用液体クロマトグラフィーにより分析したところ、PDOがGES1077を用いた反応では7.4mM、GES1068を用いた反応では11.4mM生成していた。
GES1282のグリセロールストックから4−2−(1)と同様に培養し得られた湿菌体を以下の反応に用いた。
前記の通り調製された湿菌体を4−2−(2)と同様に培養を行った。培養においては、水酸化カリウム水溶液を効率的に混和するように撹拌を行い、かつ、通気を行わなかった。なお、この操作によって、当該湿菌体濃度では、嫌気的条件または微好気的条件は達成されている。6時間後、反応液の上清を糖分析用液体クロマトグラフィーにより分析したところ、PDOが11.4mM生成していた。
GES1253、GES1254のグリセロールストックから4−2−(1)と同様に培養し得られた湿菌体を以下の反応に用いた。
前記の通り調製された湿菌体を4−2−(2)と同様に培養を行った。培養においては、水酸化カリウム水溶液を効率的に混和するように撹拌を行い、かつ、通気を行わなかった。なお、この操作によって、当該湿菌体濃度では、嫌気的条件または微好気的条件は達成されている。6時間後、反応液の上清を糖分析用液体クロマトグラフィーにより分析したところ、PDOがGES1253を用いた反応では4.1mM、GES1254を用いた反応では5.8mM生成していた。
Claims (6)
- 以下の遺伝子:
(a)ピルビン酸とホルムアルデヒドとのアルドール反応を触媒する酵素をコードする第1遺伝子、
(b)4−ヒドロキシ−2−オキソ酪酸の脱炭酸反応を触媒する酵素をコードする第2遺伝子、および
(c)3−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの還元反応を触媒する酵素をコードする第3遺伝子
を含むコリネ型細菌を、糖類およびホルムアルデヒドの存在下で培養して、1,3−プロパンジオールを生産することを含む、1,3−プロパンジオールの製造方法。 - 前記培養が、嫌気的条件または微好気的条件の下で行われる請求項1に記載の1,3−プロパンジオールの製造方法。
- 前記培養が、前記コリネ型細菌を培養液中に高密度に懸濁させた状態で行われる請求項1または2に記載の1,3−プロパンジオールの製造方法。
- 前記コリネ型細菌がコリネバクテリウム属(Corynebacterium)菌である請求項1〜3の何れか1項に記載の1,3−プロパンジオールの製造方法。
- 前記コリネ型細菌がコリネバクテリウム グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)である請求項1〜4の何れか1項に記載の1,3−プロパンジオールの製造方法。
- 前記第1遺伝子は以下からなる群より選択され:
(1−1)配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
(1−2)配列番号2において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
(1−3)配列番号4に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、
(1−4)配列番号4において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
(1−5)配列番号6に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
(1−6)配列番号6において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ピルビン酸とアルデヒドとのアルドール反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子;
前記第2遺伝子は以下からなる群より選択され:
(2−1)配列番号8に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の脱炭酸反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
(2−2)配列番号8において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−ケト酸の脱炭酸反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子;および
前記第3遺伝子は以下からなる群より選択される:
(3−1)配列番号10に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、アルデヒドの還元反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子、および
(3−2)配列番号10において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、アルデヒドの還元反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子;
請求項1〜5の何れか1項に記載の1,3−プロパンジオールの製造方法。
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
PCT/JP2018/040416 WO2020090017A1 (ja) | 2018-10-30 | 2018-10-30 | 1,3-プロパンジオールの製造方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP6668577B1 true JP6668577B1 (ja) | 2020-03-18 |
JPWO2020090017A1 JPWO2020090017A1 (ja) | 2021-02-15 |
Family
ID=70000673
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2019529268A Active JP6668577B1 (ja) | 2018-10-30 | 2018-10-30 | 1,3−プロパンジオールの製造方法 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US11390889B2 (ja) |
JP (1) | JP6668577B1 (ja) |
CN (1) | CN111386345B (ja) |
WO (1) | WO2020090017A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112625994B (zh) * | 2021-01-05 | 2022-04-15 | 清华大学 | 一种重组需钠弧菌及其应用 |
CN116694591B (zh) * | 2023-06-28 | 2024-06-21 | 江南大学 | 一种1,3-丙二醇脱氢酶突变体及产1,3-丙二醇的克雷伯氏菌 |
Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH07107968A (ja) * | 1993-10-14 | 1995-04-25 | Toyobo Co Ltd | N−アシルノイラミン酸アルドラーゼの製造法 |
JPH10507082A (ja) * | 1995-05-12 | 1998-07-14 | イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー | 混合微生物培養物を用いて炭水化物から1,3−プロパンジオールを製造する方法 |
JP2001504338A (ja) * | 1996-11-13 | 2001-04-03 | イー・アイ・デユポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー | 組み換え生物による1,3―プロパンジオールの生産方法 |
JP2013529924A (ja) * | 2010-07-05 | 2013-07-25 | メタボリック エクスプローラー | スクロースから1,3−プロパンジオールを調製する方法 |
WO2014112627A1 (ja) * | 2013-01-21 | 2014-07-24 | 積水化学工業株式会社 | 組換え細胞、並びに、1,4-ブタンジオールの生産方法 |
JP2014525239A (ja) * | 2011-08-16 | 2014-09-29 | イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー | 細菌中でより迅速なスクロース利用ができるようにする変種スクロース輸送ポリペプチド |
WO2015017721A1 (en) * | 2013-07-31 | 2015-02-05 | Novozymes A/S | 3-hydroxypropionic acid production by recombinant yeasts expressing an insect aspartate 1-decarboxylase |
US20160257976A1 (en) * | 2013-05-06 | 2016-09-08 | Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology | Biological Synthesis of 6-Aminocaproic Acid and Transgenic Microorganism Therefor |
JP2018519829A (ja) * | 2015-07-21 | 2018-07-26 | ガバニング カウンシル オブ ザ ユニバーシティ オブ トロント | 1,3−ブタンジオールの産生のための方法および微生物 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8455239B2 (en) | 2007-12-23 | 2013-06-04 | Gevo, Inc. | Yeast organism producing isobutanol at a high yield |
MY187676A (en) * | 2009-06-04 | 2021-10-08 | Genomatica Inc | Microorganisms for the production of 1,4-butanediol and related methods |
CN102639691B (zh) | 2009-11-30 | 2014-04-16 | 味之素株式会社 | 生产l-半胱氨酸的细菌以及生产l-半胱氨酸的方法 |
EP2607340B1 (en) * | 2010-07-26 | 2017-09-06 | Genomatica, Inc. | Microorganisms and methods for the biosynthesis of aromatics, 2,4-pentadienoate and 1,3-butadiene |
SG11201400466TA (en) | 2011-09-08 | 2014-04-28 | Genomatica Inc | Eukaryotic organisms and methods for producing 1,3-butanediol |
WO2014071286A1 (en) * | 2012-11-05 | 2014-05-08 | Genomatica, Inc. | Microorganisms for enhancing the availability of reducing equivalents in the presence of methanol, and for producing 1,2-propanediol |
CN104109651B (zh) * | 2014-07-23 | 2016-11-16 | 中国科学院微生物研究所 | 利用l-乳酸合成s-1,2-丙二醇的重组大肠杆菌及其构建方法 |
-
2018
- 2018-10-30 CN CN201880052719.6A patent/CN111386345B/zh active Active
- 2018-10-30 US US16/620,881 patent/US11390889B2/en active Active
- 2018-10-30 WO PCT/JP2018/040416 patent/WO2020090017A1/ja active Application Filing
- 2018-10-30 JP JP2019529268A patent/JP6668577B1/ja active Active
Patent Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH07107968A (ja) * | 1993-10-14 | 1995-04-25 | Toyobo Co Ltd | N−アシルノイラミン酸アルドラーゼの製造法 |
JPH10507082A (ja) * | 1995-05-12 | 1998-07-14 | イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー | 混合微生物培養物を用いて炭水化物から1,3−プロパンジオールを製造する方法 |
JP2001504338A (ja) * | 1996-11-13 | 2001-04-03 | イー・アイ・デユポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー | 組み換え生物による1,3―プロパンジオールの生産方法 |
JP2013529924A (ja) * | 2010-07-05 | 2013-07-25 | メタボリック エクスプローラー | スクロースから1,3−プロパンジオールを調製する方法 |
JP2014525239A (ja) * | 2011-08-16 | 2014-09-29 | イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー | 細菌中でより迅速なスクロース利用ができるようにする変種スクロース輸送ポリペプチド |
WO2014112627A1 (ja) * | 2013-01-21 | 2014-07-24 | 積水化学工業株式会社 | 組換え細胞、並びに、1,4-ブタンジオールの生産方法 |
US20160257976A1 (en) * | 2013-05-06 | 2016-09-08 | Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology | Biological Synthesis of 6-Aminocaproic Acid and Transgenic Microorganism Therefor |
WO2015017721A1 (en) * | 2013-07-31 | 2015-02-05 | Novozymes A/S | 3-hydroxypropionic acid production by recombinant yeasts expressing an insect aspartate 1-decarboxylase |
JP2018519829A (ja) * | 2015-07-21 | 2018-07-26 | ガバニング カウンシル オブ ザ ユニバーシティ オブ トロント | 1,3−ブタンジオールの産生のための方法および微生物 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
FERENCI, T. ET AL. 'PREDICTED 2,4-DIHYDROXYHEPT-2-ENE-1,7-DIOIC ACID ALDOLASE [ESCHERICHIA COLI BW29, JPN6019001804, ISSN: 0004187846 * |
METABOLIC ENGINEERING, vol. 46, JPN6019001802, 23 February 2018 (2018-02-23), pages 51 - 59, ISSN: 0004187845 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2020090017A1 (ja) | 2020-05-07 |
CN111386345A (zh) | 2020-07-07 |
JPWO2020090017A1 (ja) | 2021-02-15 |
US11390889B2 (en) | 2022-07-19 |
US20210324424A1 (en) | 2021-10-21 |
CN111386345B (zh) | 2023-05-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11697810B2 (en) | Adenylosuccinate synthetase and method for producing purine nucleotides using the same | |
JP4451393B2 (ja) | コリネ型細菌形質転換体及びそれを用いるジカルボン酸の製造方法 | |
KR102093172B1 (ko) | 2,4-다이하이드록시부티레이트의 제조 방법 | |
CN113227381B (zh) | L-谷氨酸生产能力得到提高的突变株及利用其的l-谷氨酸的制造方法 | |
WO2009131040A1 (ja) | イソプロパノール生産能を有するコリネ型細菌の形質転換体 | |
JP5960701B2 (ja) | コリネ型細菌形質転換体及びそれを用いるバリンの製造方法 | |
EP2591091B1 (en) | Method for the preparation of 1,3-propanediol from sucrose | |
JP7372329B2 (ja) | プリンヌクレオチドを生産する微生物及びそれを用いたプリンヌクレオチドの生産方法 | |
KR102143964B1 (ko) | 신규한 분지쇄 아미노산 아미노트랜스퍼라제 변이체 및 이를 이용한 류신 생산방법 | |
JP6894650B2 (ja) | 有機化合物の製造方法およびコリネ型細菌 | |
JP6668577B1 (ja) | 1,3−プロパンジオールの製造方法 | |
JP5034630B2 (ja) | 有機酸生産微生物の菌体の調製法及び有機酸の製造法 | |
JP5698655B2 (ja) | コリネ型細菌形質転換体及びそれを用いるイソブタノールの製造方法 | |
EP2904104B1 (en) | Recombinant microorganisms for producing organic acids | |
EP3102675B1 (en) | Improved microorganisms for succinic acid production | |
JP7370587B2 (ja) | 有機化合物の製造方法およびコリネ型細菌 | |
US20200224227A1 (en) | Putrescine-producing microorganism and method of producing putrescine using the same | |
JP7350994B2 (ja) | 新規なプロモーター及びそれを用いた標的物質生産方法 | |
JP4294373B2 (ja) | エタノールの新規製造方法 | |
JP2023540518A (ja) | L-リジン生産能が向上したコリネバクテリウムグルタミクム変異株およびこれを用いたl-リジンの生産方法 | |
EP3470512A1 (en) | Mutant phosphoserine aminotransferase for the conversion of homoserine into 4-hydroxy-2-ketobutyrate | |
WO2023038066A1 (ja) | 芳香族化合物の製造方法 | |
US20210292716A1 (en) | D-xylose dehydrogenase from coryneform bacteria and process for preparing d-xylonate |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20190530 |
|
A871 | Explanation of circumstances concerning accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A871 Effective date: 20190530 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20190530 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190618 |
|
RD01 | Notification of change of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7426 Effective date: 20190618 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20190618 |
|
A975 | Report on accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971005 Effective date: 20190704 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20190716 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190903 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20191105 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20191218 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20200107 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20200203 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6668577 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |