TWI471418B

TWI471418B - 纖維二糖２－表異構酶與其製造方法及用途

Info

Publication number: TWI471418B
Application number: TW99103017A
Authority: TW
Inventors: Hikaru Watanabe; Masahiro Yagi; Tomoyuki Nishimoto; Hiroto Chaen; Shigeharu Fukuda
Original assignee: Hayashibara Co
Priority date: 2009-02-05
Filing date: 2010-02-02
Publication date: 2015-02-01
Also published as: US9175282B2; EP2395080B1; EP2395080A4; US20120329098A1; JP5677097B2; JPWO2010090095A1; TW201040270A; US20120040407A1; EP2395080A1; WO2010090095A1

Description

纖維二糖2-表異構酶與其製造方法及用途

本發明係關於新穎纖維二糖2-表異構酶與其製造方法以及用途，更詳細為不僅具有2-表異構化反應亦具有醛糖-酮糖變換反應的觸媒之纖維二糖2-表異構酶與其製造方法、編碼該酶之DNA與含有此所成之重組DNA與轉形體、以及進一步使用該酶的異構化糖的製造方法者。

異構酶(isomerase)為催化異構物間之變換的酶之總稱，由Enzyme Nomenclature(美國，Academic Press. Inc.1992年)得知分類為(1)含有催化光學異構化之消旋酶、表異構酶之EC5.1群；(2)催化順-反式幾何異構物間之變換的EC5.2群；(3)催化醛糖-酮糖變換、酮-烯醇基互變異性、在分子內雙鍵之位置移動的EC5.3群；(4)催化分子內基轉位而生成結構異構物之EC5.4群；(5)催化分子內裂合酶反應的EC5.5群；及(6)催化其他異構化反應之EC5.99群的6群。這些異構酶中，作為催化中性糖之異構化的異構酶，例如已知有催化D-木糖與D-木酮糖、D-葡萄糖與D-果糖之相互變換(醛糖-酮糖變換)的木糖異構酶(EC 5.3.1.5)、催化醛糖的α、β首旋異構物之相互變換的醛糖1-表異構酶(EC 5.1.3.3)、將種種酮戊醣及酮己醣的第3位進行表異構化，變換為各對應之表異構物的酮糖3-表異構酶(參照特開平6-125776號公報、國際公開號WO 2007/058086號手冊等)等，廣泛使用於各工業上異構化糖之製造、糖之定量、稀少糖質之調製等。

另一方面，Tyler們的Archives of biochemistry and biophysics(第119卷、363至367頁，1967年)已有報告將產生瘤胃細菌(Ruminococcus albus)的纖維二糖之還原末端葡萄糖的第2位經表異構化後變換為表纖維二糖(4-O-β-D-葡苷基D-甘露糖)之纖維二糖2-表異構酶，該酶於前述酵素命名法中被命名為酶號碼EC 5.1.3.11。Ito們的Biochemical and biophysical research communications(第360卷、640至645頁，2007年)及Ito們的Applied microbiology and biotechnology(第79卷、433至441頁，2008年)中揭示該纖維二糖2-表異構酶之胺基酸序列、編碼該胺基酸序列的DNA之鹼基序列、及該纖維二糖2-表異構酶不僅對於纖維二糖起作用，對於纖維寡醣或乳糖亦起作用，並產生表纖維寡醣或表乳糖(4-O-β-D-半乳糖苷基D-甘露糖)等。且，Taguchi們的FEMS microbiology letters(第287卷、34至40頁2008年)中揭示來自相同厭氣性菌之溶纖維真細菌(Eubacterium cellulosolvens)的纖維二糖2-表異構酶。

又，Nishimukai們的Journal of agricultural and food chemistry(第56卷、10340至10345頁，2008年)中揭示將使用纖維二糖2-表異構酶使乳糖變換而調製之表乳糖使老鼠攝取時，發現增強小腸中的鈣吸收，增加腸內之短鏈脂肪酸量，揮發降低血漿中的膽固醇等生理功能，作為表乳糖之益生菌(Prebiotic)的素材之開發受到期待。

然而，上述公知纖維二糖2-表異構酶中將耐熱性低的表乳糖、表纖維二糖等糖質在工業水準下製造時有著利用困難之問題點。酶的耐熱性於實用化酶反應時係為極重要的因子，耐熱性優良的酶可在少量酶量下進行長小時反應，故酶反應中可減低酶量而於經濟上為有利。又，若考慮到工業上利用性，欲防止雜菌污染可在55℃以上，較佳為60℃以上下進行反應。由如此觀點得知以耐熱性優良的纖維二糖2-表異構酶為佳。

本發明係以提供耐熱性優良的纖維二糖2-表異構酶與其製造方法以及用途為課題。

如此狀況下，欲解決上述課題，本發明者們欲得到耐熱性優良的纖維二糖2-表異構酶而將多數好熱性微生物作為對象進行篩選。其結果，發現熱解纖維素果汁桿菌(Caldicellulosiruptor)屬之微生物熱解纖維素果汁桿菌屬‧解糖菌(Caldicellulosiruptor saccharolyticus)ATCC43494的菌體破碎萃取液中生成使乳糖進行表異構化之表乳糖，又由纖維二糖生成推定為異構化糖之糖質的酶活性。將該表異構酶純化至電泳下顯示單股程度後調查其性質，得知具有至70℃為穩定之耐熱性。然而，所得之純化酶樣品為微量，對於該表異構酶的詳細基質專一性之調查尚未充分。

於此，以該表異構酶的部分胺基酸序列之情報為基準，藉由熱解纖維素果汁桿菌屬‧解糖菌之基因組DNA將編碼該表異構酶的DNA進行複製(cloning)，以含有此之重組DNA將大腸桿菌進行轉形，培養後調製出重組酶。使用該重組酶對基質專一性進行調查，意外地發現該酶不僅可將纖維二糖及乳糖課進行表異構化而各變換為表纖維二糖及表乳糖，在單糖亦對D-葡萄糖及D-半乳糖起作用，在二糖進一步對於麥芽糖，在寡糖作用於聚合度3以上的麥芽寡糖及纖維寡醣而使其表異構化，各轉換為對應之D-甘露糖、D-塔羅糖、表麥芽糖(4-O-α-D-葡苷基D-甘露糖)、聚合度3以上的表麥芽寡糖及表纖維寡醣之具有廣泛基質專一性者。又，本酶若增加酶作用量時，發現不僅可催化2-表異構化反應亦可催化醛糖-酮糖變換反應，作用於D-葡萄糖或D-甘露糖、D-半乳糖或D-塔羅糖、麥芽糖或表麥芽糖、纖維二糖或表纖維二糖、及乳糖或表乳糖，具有轉換為各對應之D-果糖、D-塔格糖、麥芽酮糖(4-O-α-D-葡苷基D-果糖)、cellobiulose(4-O-β-D-葡苷基D-果糖)及乳酮糖(4-O-β-D-半乳糖苷基D-果糖)之作用。即，本酶亦可催化2-表異構化反應與醛糖-酮糖變換反應中任一，其為新穎纖維二糖2-表異構酶。

依據這些見解，本發明者們確立新穎纖維二糖2-表異構酶、編碼該酶的DNA與含有此所成之重組DNA及轉形體、該酶的製造方法，同時確立利用該酶的異構化糖之製造方法而完成本發明。

即，本發明為藉由提供耐熱性優良的纖維二糖2-表異構酶、編碼該酶的DNA與含有此所成之重組DNA、轉形體、及該酶的製造方法、進一步使用該酶之異構化糖的製造方法而解決上述課題者。

本發明的纖維二糖2-表異構酶為耐熱性高，於重組微生物中可大量表現，且亦容易進行重組型酶之純化。就本發明的纖維二糖2-表異構酶，可由D-葡萄糖製造D-甘露糖，由麥芽糖製造表麥芽糖，由纖維二糖製造表纖維二糖或cellobiulose，進一步可由乳糖製造表乳糖或乳酮糖，因其為自便宜的原料以工業水準下製造稀少且加成價值高的糖質。

實施發明的最佳形態

本發明的纖維二糖2-表異構酶係為催化異構化反應，更具體為催化下述2-表異構化反應與醛糖-酮糖變換反應之酶。

(1)2-表異構化反應

使D-葡萄糖及D-半乳糖的第2位進行表異構化，各轉換為D-甘露糖及D-塔羅糖，亦催化該逆反應；使麥芽糖、纖維二糖及乳糖中之還原末端葡萄糖的第2位進行表異構化，各轉換為表麥芽糖、表纖維二糖及表乳糖；使聚合度3以上的麥芽寡糖及纖維寡醣中之還原末端葡萄糖的第2位進行表異構化，各轉換為表麥芽寡糖及表纖維寡醣；

(2)醛糖-酮糖變換反應

將D-葡萄糖或D-甘露糖轉換為D-果糖，將D-半乳糖或D-塔羅糖轉換為D-塔格糖，亦催化該逆反應；將麥芽糖或表麥芽糖轉換為麥芽酮糖，將纖維二糖或表纖維二糖轉換為cellobiulose，將乳糖或表乳糖轉換為乳酮糖。

作為本發明的纖維二糖2-表異構酶之具體例，可舉出具有下述物理化學性質者。

(1)分子量

經SDS-凝膠電泳法得到44,000±5,000道耳頓；

(2)至適溫度

在pH6.0、20分鐘反應的條件下為80℃；

(3)至適pH

在50℃、20分鐘反應的條件下為pH7.8；

(4)溫度安定性

在pH6.0、60分鐘保持的條件下至70℃為穩定；

(5)pH安定性

在4℃、24小時保持的條件下pH4.5至9.5之範圍為穩定。

透過本說明書，纖維二糖2-表異構酶的酶活性為將高純度品且可便宜入手之乳糖作為基質使用，評估將乳糖經表異構化而生成表乳糖之乳糖2-表異構酶活性。乳糖2-表異構酶活性如以下進行測定。作為反應液中之最終濃度，調製出乳糖為35.1mM、乙酸緩衝液(pH6.0)為20mM之基質溶液1000μl中加入酶液200μl作為1200μl之反應液，在50℃進行20分鐘反應後，沸騰水浴中進行10分鐘加熱並使反應停止。將該反應停止液提供於HPLC分析，測定藉由本酶之反應所生成之表乳糖量。且HPLC為使用『MCI GEL CK08EP』管柱(三菱化學股份有限公司製)，在管柱溫度75℃、流速0.6ml/min、溶離液使用水的條件下進行，檢測使用差示折射計『RID-10A』(島津股份公司製作所製)進行。酶活性1單位定義為在上述條件下自乳糖經1分鐘生成1μmol的表乳糖之酶量。

又，具有上述物理化學性質之本發明的纖維二糖2-表異構酶之一，不僅具有上述物理化學性質，作為該N末端序列有時具有序列表中之序列號碼1所示胺基酸序列。

本發明的纖維二糖2-表異構酶一般具有特定胺基酸序列，作為其中一例，例如可舉出序列表中之序列號碼10所示胺基酸序列或與此相同的胺基酸序列。作為與序列表中之序列號碼10所示胺基酸序列的相同胺基酸序列，在保持可催化種種異構化反應的上述酶活性之範圍內，可舉出序列表中之序列號碼10所示胺基酸序列中1個以上，未達10個之胺基酸經缺失、取代、或加成的胺基酸序列。

所謂本發明的DNA表示編碼具有上述胺基酸序列的纖維二糖2-表異構酶之DNA。本發明的DNA若為編碼該纖維二糖2-表異構酶者，可為來自天然者、或人工合成者皆可。作為天然供給源，例如可舉出含有熱解纖維素果汁桿菌屬‧解糖菌(Caldicellulosiruptor saccharolyticus)ATCC43494之熱解纖維素果汁桿菌屬的微生物，可得到含有來自這些菌體之本發明的DNA之基因組DNA。即，將該微生物接種於營養培養基，在厭氣條件下進行約1至3天培養後，自培養物取出菌體，在溶菌酶(lysozyme)或β-聚葡萄糖酶等細胞壁溶解酶或超音波下進行處理，可將含有該DNA之基因組DNA溶離於菌體外。此時，可倂用蛋白酶等蛋白質分解酶、或與SDS等界面活性劑共存下進行冷凍融解。於此所得之處理物，例如適用苯酚萃取、醇沈澱、離心分離、核糖核酸水解酶處理等常法可得到目的之基因組DNA。將本發明的DNA以人工方式合成時，例如依據序列表中之序列號碼10所示胺基酸序列的化學合成即可。又，將含有該DNA的基因組DNA作為鑄型，使用成為適當引子之化學合成寡核苷酸進行PCR合成亦可有利於實施。

本發明的DNA有時具有特定鹼基序列，作為其中一例，例如可舉出序列表中之序列號碼9所示鹼基序列或與此等相同之鹼基序列、或與此等之鹼基序列為互補的鹼基序列。作為與序列表中之序列號碼9所示鹼基序列的相同鹼基序列，對於序列表中之序列號碼9所示之鹼基序列，在保持所要編碼之酶的活性之範圍下，可舉出1個以上，未達30個之鹼基的欠缺、取代、或加成之鹼基序列。又，當然本發明的DNA中，對於序列表中序列號碼9所示鹼基序列、或序列表中序列號碼9所示鹼基序列中保持所要編碼之酶的活性之範圍下，1個以上，未達30個的鹼基之欠缺、取代、或加成的鹼基序列，依據遺傳暗號的縮聚，亦含有無改變所要編碼之酶的胺基酸序列，具有鹼基的1個或2個以上由其他鹼基取代的鹼基序列之DNA。

將本發明的DNA***於可自行複製的適當載體作為重組DNA可有利地實施。重組DNA一般由DNA與可自行複製之載體所成，若可以得到DNA，藉由常法重組DNA技術可較容易地調製。作為該載體之例子，可舉出pBR322、pUC18、pBluescript II SK(+)、pUB110、pTZ4、pC194、pCR-Script Cam SK+、pHV14、TRp7、YEp7、pBS7等質體載體或λgt‧λC、λgt‧λB、ρ11、Φ1、Φ105等噬菌體載體。其中，將本發明的DNA表現於大腸桿菌時以pBR322、pUC18、pBluescript II SK(+)、pCR-Script Cam SK+、λgt‧λC及λgt‧λB為佳，另一方面，使其在枯草菌表現時，以pUB110、pTZ4、pC194、ρ11、Φ1及Φ105為佳。pHV14、TRp7、YEp7及pBS7於將重組DNA在二種以上宿主內進行複製時有用。將DNA***於該載體時，可採用此業界的一般方法。具體而言，首先將含有DNA之基因組DNA與可自行複製的載體以限制酶切斷，再將所生成之DNA片段與載體片段進行連結。基因DNA及載體的切斷使用於核苷酸有專一性作用之限制酶，換言之為II型限制酶，詳細為若使用Sau 3AI、Eco RI、Hind III、Bam HI、Sal I、Xba I、Sac I、Pst I、Nde I、Nco I等，可容易連結DNA片段與載體片段。視必要，兩者經退火(annealing)後，僅在活體內或活體外使DNA連接酶作用即可。此所得之重組DNA導入於適宜宿主後成為轉形體，經培養此可無限複製。

將如此所得之重組DNA，藉由導入於大腸桿菌、枯草菌、放線菌、酵母等適宜宿主微生物後可得到轉形體。取得轉形體之方法，可選擇適用菌落雜合法、或經營養培養基的培養調製出粗酶而具有該纖維二糖2-表異構酶活性者。

使用於具有本發明的纖維二糖2-表異構酶產生能之微生物(含有轉形體)的培養之培養基，若為可使微生物生長，並可產生纖維二糖2-表異構酶之營養培養基即可，可為合成培養基及天然培養基任一者。作為碳源，可於微生物成長時利用之物質即可，例如可使用澱粉之部分分解物或葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、糖蜜等糖質、或亦可使用檸檬酸、琥珀酸等有機酸。培養基中之這些碳源濃度可依據碳源種類而適宜選擇。作為氮源，例如可適用銨鹽、硝酸鹽等無機氮化合物、及例如尿素、玉米漿(Corn Steep Liquor)、酪蛋白、腖、酵母萃取物、肉萃取物等含有有機氮之物質。又，作為無機成分，例如可適用鈣鹽、鎂鹽、鉀鹽、鈉鹽、磷酸鹽、錳鹽、鋅鹽、鐵鹽、銅鹽、鉬鹽、鈷鹽等鹽類。且視必要亦可適用胺基酸、維他命等。

培養中可適宜地選擇可良好地生長具有本發明之纖維二糖2-表異構酶產生能的微生物之條件即可。例如使用熱解纖維素果汁桿菌屬的微生物時，培養一般於選自溫度50至80℃，較佳為60至70℃，pH5至8，較佳為pH6.5至7.5之範圍條件下進行厭氣性培養。培養時間為可增殖該微生物的時間即可，較佳為10至72小時。又，微生物為轉形體時，雖取決於該宿主微生物之種類，但培養一般在選自溫度15至37℃，pH5.5至10之範圍，較佳為在溫度20至50℃，pH2至9之範圍條件下，於通氣攪拌好氣條件下進行10小時至150小時即可。又，培養方式可為分批培養或連續培養皆可。

如此培養微生物後，回收含有本發明之纖維二糖2-表異構酶的培養物。本發明的纖維二糖2-表異構酶活性主要於菌體內，將菌體作為粗酶而採收時，亦可將菌體破碎萃取液作為粗酶液使用。由培養物回收菌體可採用公知固液分離法。例如可適宜地採用將培養物本身進行離心分離的方法、或使用預敷過濾器等進行過濾分離之方法、藉由平膜、中空糸膜等膜過濾進行分離之方法等。菌體破碎萃取液可直接使用粗酶液，一般為經濃縮後使用。作為濃縮方法可採用硫酸銨鹽析法、丙酮及醇沈澱法、使用平膜、中空膜等之膜濃縮法等。

本發明的纖維二糖2-表異構酶為重組酶時，依宿主種類有時酶會蓄積於菌體內。如此情況下，可直接使用菌體或培養物，一般於使用前，視必要藉由浸透壓衝擊或界面活性劑由菌體萃取後、或藉由超音波或細胞壁溶解酶使菌體破碎後，經過濾、離心分離等將重組型酶由菌體或菌體破碎物分離後使用亦有利於實施。

如上述，本發明的纖維二糖2-表異構酶可將菌體破碎萃取液等粗酶液直接或濃縮後使用，視必要藉由公知方法，可進一步分離‧純化後利用。例如將菌體破碎萃取液的澄清液在UF膜進行濃縮、或將經硫酸銨鹽析‧透析的酶液以組合陰離子交換層析法、疏水層析法、凝膠過濾層析法等各種純化方法進行純化後，以電泳單一酶的方式得到本發明的纖維二糖2-表異構酶。又，本發明的纖維二糖2-表異構酶係培養轉形體後所得之重組型酶時，利用比一般蛋白質更具優良耐熱性之優點，將菌體破碎萃取液經硫酸銨鹽析並濃縮的粗酶樣品，藉由在約70℃以一定時間進行熱處理使夾雜來自宿主的蛋白質熱變性，經變性而沈澱的蛋白質經離心分離等除去而可簡便地純化。

進一步使用具有本發明的纖維二糖2-表異構酶活性之菌體破碎萃取液、濃縮液或經純化的酶液，可將本發明的纖維二糖2-表異構酶藉由公知方法使其成為固定化酶。作為固定化方法，例如可適用對離子交換體之結合法、與樹脂及膜等之共價鍵法‧吸附法、使用高分子物質之包括法等。

本發明的纖維二糖2-表異構酶具有廣範圍的基質專一性。如後述實驗項所示，單糖中作用於D-葡萄糖、D-半乳糖及D-甘露糖，各轉換為表異構物之D-甘露糖、D-塔羅糖及D-葡萄糖。二糖中作用於麥芽糖、纖維二糖及乳糖，各轉換為表麥芽糖、表纖維二糖及表乳糖。進一步寡糖中作用於纖維寡醣及麥芽寡糖，轉換為各對應之表纖維寡醣及表麥芽寡糖。

又，本發明的纖維二糖2-表異構酶若增加其酶作用量時，不僅可催化2-表異構化反應，亦可催化醛糖-酮糖變換反應。單糖中，可將D-葡萄糖或D-甘露糖轉換為D-果糖，將D-半乳糖或D-塔羅糖轉換為D-塔格糖。二糖中，將纖維二糖或表纖維二糖轉換為cellobiulose，將乳糖或表乳糖轉換為乳酮糖，又將麥芽糖或表麥芽糖轉換為麥芽酮糖。本酶可將醛糖轉換為酮糖，亦可催化該逆反應，對酮糖之醛糖的變換活性較為微弱，變換時需要多量酶。

將本發明的纖維二糖2-表異構酶於基質上起作用時，該基質濃度並無特別限定，例如使用基質濃度0.1%(w/v)的比較低濃度之溶液時，進行本發明的纖維二糖2-表異構酶之反應，生成由特定糖質轉換為該表異構物及/或醛糖-酮糖之異構化糖。工業上基質濃度1%(w/v)以上為佳，該條件下，可有利於生成種種表異構物及/或異構化糖。反應溫度為進行反應之溫度，即進行至80℃附近即可。較佳為使用50至60℃附近之溫度。反應pH一般為調整至5.0至9.0之範圍，較佳為調整至pH6.0至8.0之範圍。酶的使用量與反應時間有著密切關係，可依據目的之酶反應的進行而適宜選擇即可。

又，亦可將具有本發明的纖維二糖2-表異構酶產生能之微生物在含有作為基質的上述醛糖或酮糖所成的營養培養基進行培養，藉由採取於培養液中所生成之各醛糖或酮糖所對應的異構化糖而製造異構化糖。

作為藉由上述反應系所得之異構化糖的純化方法，適宜地採用使用於糖純化之一般方法即可，例如可適當採用藉由活性碳之脫色、藉由H型、OH型離子交換樹脂之脫鹽、藉由離子交換管柱層析法、活性碳管柱層析法、二氧化矽凝膠管柱層析法等管柱層析法之分離、藉由具有適度分離性能之膜的分離，進一步使用未利用目的糖質將夾雜糖質資化、分解的微生物，例如使用藉由酵母等進行發酵處理、或對目的糖質無作用下將原料糖質進行專一性分解的酶之酶處理等1種或2種以上的純化方法。

另外作為工業上純化方法，採用離子交換管柱層析法為佳，例如可使用特開昭58-23799號公報、特開昭58-72598號公報等所揭示的強酸性陽離子交換樹脂而藉由管柱層析法將夾雜糖類除去，可有利地製造提高目的糖質含量的糖組成物。此時可採用固定床方式、移動床方式、疑似移動床方式之任一種方式。

以下藉由實驗對本發明做更具體說明。

<實驗1：藉由熱解纖維素果汁桿菌屬‧解糖菌ATCC43494菌體破碎萃取液的表乳糖及表纖維二糖之生成>

<實驗1-1：熱解纖維素果汁桿菌屬‧解糖菌ATCC43494之培養與菌體破碎萃取液之調製>

調製出『ATCC細菌與噬菌體的目錄、第18版』(American Type Culture Collection發行、1992年)470頁所記載的American Type Culture Collection培養基第1368號，於12ml容積耐壓玻璃瓶中放入12ml並滅菌後，接種熱解纖維素果汁桿菌屬.解糖菌ATCC43494，在溫度70℃下進行約72小時靜置培養。將培養液離心分離所得之菌體進行超音波破碎，將菌體破碎萃取液的離心澄清液作為粗酶液。

<實驗1-2：對粗酶液之乳糖、纖維二糖及表乳糖之作用>

將纖維二糖、乳糖或表乳糖溶解於100mM乙酸緩衝液(pH6.0)至最終濃度3.4%(w/v)，各作為基質溶液。於基質溶液10μl加入實驗1-1的方法所調製之粗酶液10μl，在50℃進行16小時反應。反應終了後，經下述條件提供於薄層層析法(以下簡稱為「TLC」)分析。TLC層析法如圖1所示。

<TLC分析之條件>

薄層片：矽膠鋁片(10×20cm)

(『Kiessel gel60F₂₅₄ 』、Merck公司製、10×20cm)

展開溶劑：n-丁醇：吡啶：水(容量比6：4：1)混液

展開方法及次數：以上昇法進行2次展開

發色方法：噴霧10%硫酸-甲醇溶液，在110℃進行6分鐘加熱

圖1中之符號a至g各表示提供於TLC分析之試料，符號a、b、c、d、e、f及g各表示麥芽寡糖混合物(葡萄糖聚合度之標識物)、纖維二糖標準品、纖維二糖反應液、乳糖標準品、乳糖反應液、表乳糖標準品及表乳糖反應液。如圖1所示，確認出纖維二糖的反應液(圖1中之符號c)中有纖維二糖的分解產物之葡萄糖(相當於圖1的符號a中之G₁ 的位置)與未知糖(相當於圖1的符號a之G₄ 的位置)之點，乳糖的反應液(圖1中之符號e)中有乳糖之分解產物的葡萄糖與半乳糖(相當於圖1的符號a中之G₂ 的位置)之點。另一方面，確認表乳糖的反應液(圖1中之符號g)中有推定為乳糖之異構化物的點(圖1中之符號←)。由確認自表乳糖的異構化物之乳糖的生成得知，纖維二糖與乳糖之反應液中存在分解產物以外的生成物，該點與分解產物的點可能重疊，故對於纖維二糖與乳糖之反應液，進一步將反應液依據常法進行三甲基甲矽烷基化(TMS化)後，以下述條件下供給於氣體層析法(以下簡稱為「GC」)並鑑定生成物。其結果確認由乳糖生成分解產物以外生成推定為表乳糖的未知糖、及由纖維二糖生成分解產物以外生成推定為表纖維二糖之未知糖。由該結果判斷，熱解纖維素果汁桿菌屬‧解糖菌ATCC43494具有使纖維二糖、乳糖及表乳糖進行表異構化之表異構酶(纖維二糖2-表異構酶)產生能。

<GC分析條件>

氣體層析：GC-14A(島津股份公司製作所製)

管柱：2% OV-17 Chromosorb W/AW-DMCS(內徑3mm×長度2m，GL科學股份有限公司製)

載氣體：氮　載氣體流量：40ml/分鐘

燃燒氣體：氫　燃燒氣體流量：40ml/分鐘

助燃氣體：空氣　助燃氣體流量：600ml/分鐘

昇溫過程：160℃→320℃(7.5℃/分鐘)

檢測：FID(氫火焰離子化檢測器)

<實驗2：由熱解纖維素果汁桿菌屬.解糖菌　ATCC43494之纖維二糖2-表異構酶的純化>

欲解明熱解纖維素果汁桿菌屬‧解糖菌ATCC43494所產生之纖維二糖2-表異構酶的物理化學性質為目的進行該酶之純化。

<實驗2-1：粗酶液之調製>

於放有使用於實驗1-1的培養基100ml之8瓶100ml容耐壓玻璃瓶中，接種熱解纖維素果汁桿菌屬‧解糖菌ATCC43494以外，與實驗1-1同樣下進行培養作為種培養。其次，於放有同培養基10L之8瓶11L容耐壓鋼瓶中，將經種培養之培養液接種於每1瓶中進行相同培養，培養後將約80L之培養液進行離心分離得到濕菌體約24g。將菌體懸浮於20mMTris-鹽酸緩衝液(pH7.5)，再經超音波破碎後進行離心分離得到菌體破碎萃取液澄清液。將菌體破碎萃取液澄清液作為粗酶液。測定粗酶液之表異構酶活性，換算為每培養液1ml時為0.009單位/ml。

<實驗2-2：纖維二糖2-表異構酶之純化>

將實驗2-1所得之粗酶液以UF膜進行濃縮後，回收濃縮酶液約40ml。將該濃縮酶液對20mMTris-鹽酸緩衝液(pH7.5)進行一晚透析，進行離心分離除去不溶物後所得之透析液澄清液(38ml)提供於使用『DEAE-TOYOPEARL650S』(Tosoh股份有限公司販賣)凝膠的陰離子交換管柱層析法(凝膠容量380ml)。將吸附於管柱之蛋白質以0至0.5MNaCl的線型梯度(LinearGradient)溶離，調查所得部分之表異構酶活性時得知，表異構酶活性溶離於約0.1M的NaCl濃度之部分。回收該溶離活性部分，對於含有1M硫酸銨之相同緩衝液進行透析，提供於使用『Butyl-TOYOPEARL650M』(Tosoh股份有限公司販賣)凝膠之疏水管柱層析法(凝膠容量50ml)。將吸附於管柱的蛋白質以1M至0M硫酸銨的線型梯度(Linear Gradient)進行溶離後得知，表異構酶活性溶離於約0.8M之硫酸銨濃度的部分。將該活性部分以UF膜進行濃縮，對於含有0.4M NaCl之20mMTris-鹽酸緩衝液(pH7.5)進行透析後，提供於使用在相同緩衝液進行平衡化的『Superdex75』管柱(16mm×60cm、GEhealthcare bioscience股份有限公司製)凝膠過濾層析法，回收表異構酶活性部分。將回收之活性部分對於20mMTris-鹽酸緩衝液(pH7.5)進行一晚透析，提供於以相同緩衝液進行平衡化之『DEAE-5PW』管柱(3.3ml、Tosoh股份有限公司製)的陰離子交換層析法。將吸附於管柱的蛋白質以0M至0.5M的NaCl線型梯度(Linear Gradient)進行溶離，回收溶離於約0.1M之NaCl濃度的部分之表異構酶活性部分。

藉由以上純化所得之純化酶樣品，作為蛋白質為0.9mg，由粗酶液之活性回收率為3.4%。又，本純化酶樣品的活性比為26.9單位/mg-蛋白質。且，蛋白質的定量藉由以牛血清白蛋白作為標準蛋白質的勞立法(Lowry method)進行測定。藉由使用本純化酶樣品之純度由5至20%(w/v)濃度梯度聚丙烯醯胺凝膠之凝膠電泳法進行檢測，得到蛋白質段為單一且純度高之樣品。

<實驗3：來自熱解纖維素果汁桿菌屬.解糖菌ATCC43494之纖維二糖2-表異構酶的各性質>

<實驗3-1：分子量>

將在實驗2的方法所得之纖維二糖2-表異構酶純化樣品提供於使用5至20%(w/v)階段凝膠之SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳法，與同時電泳的分子量標識物(日本Bio-Rad laboratories股份有限公司製)做比較而測定其分子量時，得到分子量為44,000±5,000道耳頓。

<實驗3-2：至適溫度及至適pH>

使用在實驗2的方法所得之纖維二糖2-表異構酶純化樣品，以活性測定方法為準，對影響到表異構酶活性之溫度及pH進行調查。結果如圖3(至適溫度)及圖4(至適pH)所示。本表異構酶的至適溫度為在pH6.0，20分鐘反應下為80℃。至適pH為在50℃，20分鐘反應下為pH7.8。

<實驗3-3：溫度安定性及pH安定性>

使用在實驗2的方法所得之纖維二糖2-表異構酶純化樣品，對影響到表異構酶活性之安定性的溫度及pH做調查。溫度安定性為使用10mM乙酸緩衝液(pH6.0)，將酶溶液於各溫度下保持60分鐘，經水冷後測定殘存酶活性而求得。pH安定性為將酶在各pH之100mM緩衝液中保持4℃、24小時後，將pH再調整至6.0，測定殘存酶活性而求得。這些結果如圖5(溫度安定性)及圖6(pH安定性)所示。如圖5得知本表異構酶至70℃為安定。又，由圖6得知，本表異構酶於pH4.5至9.5之範圍為安定。

<實驗3-4：對酶活性產生影響的金屬離子>

使用在實驗2之方法所得之纖維二糖2-表異構酶純化樣品，對酶活性之金屬離子的影響可藉由1mM各種金屬鹽存在下進行活性測定而調查。結果如表1所示。

如表1所示，判斷出本表異構酶的活性會被Al³⁺ 、Fe²⁺ 、Fe³⁺ 及Pb²⁺ 離子阻礙，且幾乎被Cu²⁺ 、Zn²⁺ 及Hg²⁺ 離子完全阻礙。

<實驗3-5：N末端胺基酸序列>

使用在實驗2的方法所得之纖維二糖2-表異構酶純化樣品，將本酶之N末端胺基酸序列使用Protein Sequencer modle492HT(Applied Biosystems公司製)自N末端分析至15殘基後，得到序列表中之序列號碼1所示胺基酸序列，即具有甲硫胺酸-天冬胺酸-異白胺酸-蘇胺酸-精胺酸-苯基丙胺酸-離胺酸-麩胺酸-天冬胺酸-白胺酸-離胺酸-丙胺酸-組胺酸-白胺酸-麩胺酸。

<實驗3-6：內部部分胺基酸序列>

取出適量之以實驗2的方法所得之纖維二糖2-表異構酶純化樣品，對於10mM Tris‧鹽酸緩衝液(pH9.0)進行於4℃之18小時透析後，加入相同緩衝液，使蛋白質濃度為約0.6mg/ml。取出該溶液約50μ1，加入lysyl and peptidase(和光純藥股份有限公司販賣)1.2μg，在30℃下保持20小時使酶蛋白水解。將水解物預先注入於以0.065%(v/v)三氟乙酸進行平衡化的HPLC用管柱(商品名『MicroRPC C2/C18 SC2.1/10』、直徑2.1mm×長度100mm、GEhealthcare bioscience公司製)，以流速0.1ml/分鐘、室溫的條件下，以由0.065%(v/v)三氟乙酸至0.055%(v/v)三氟乙酸-80%(v/v)乙腈溶液的160分鐘之線型梯度(Linear Gradient)進行通如流液，分離出肽片段。由管柱溶離的肽片段藉由測定波長214nm之吸光度而檢測出。分別取出保持時間約29分鐘、約37分鐘及約39分鐘所溶離之3種肽片段P1、P2及P3，將各胺基酸序列以與實驗3-5相同方法進行分析後，得到各具有序列表中之序列號碼2、3及4所示胺基酸序列。

<實驗4：編碼纖維二糖2-表異構酶之DNA的複製(cloning)及含有此之重組DNA與轉形體之調製>

將編碼纖維二糖2-表異構酶之DNA由熱解纖維素果汁桿菌屬‧解糖菌　ATCC43494複製(cloning)，進行可自行複製之重組DNA的製作、編碼酶之DNA的鹼基序列之決定及轉形體之調製。

<實驗4-1：基因組DNA之調製>

以與實驗1-1相同之方法培養熱解纖維素果汁桿菌屬‧解糖菌　ATCC43494，離心分離培養液約20ml，得到培養菌體10mg。由回收之菌體使用『Dneasy Tissue kit』(QIAGEN公司製)，依據套組中所附的說明書記載方法，調製出1.8mg之基因組DNA。所調製之基因組DNA的濃度為1.8mg/ml。

<實驗4-2：編碼纖維二糖2-表異構酶之DNA的複製(cloning)及鹼基序列之決定>

依據纖維二糖2-表異構酶的N末端胺基酸序列(序列表中之序列號碼1所示胺基酸序列)之第1至第6號的胺基酸序列，作為信息股引子(sense primer)合成具有序列表中之序列號碼5所示鹼基序列的寡核苷酸，依據同表異構酶之內部部分胺基酸序列的序列表中之序列號碼4所示胺基酸序列的第2至第7號之胺基酸序列，作為非訊息股引子(antisense primer)合成具有序列表中之序列號碼6所示鹼基序列的寡核苷酸。使用這些引子，將在實驗4-1所得之基因組DNA作為鑄型，將KOD-plus-DNA聚合酶(東洋紡製)作為PCR酶，使用DNA聚酶鏈鎖反應器(Thermal Cycler)PJ2000(Perkin Elmer公司製)依據常法進行PCR增幅後，增幅至約1,000bp之DNA片段。將該DNA片段於複製(cloning)載體pCR-Script Cam SK+(Stratagene公司製)之限制酶Srf Isite進行複製(cloning)，使用所得之重組DNA將大腸桿菌XL-10Gold進行轉形。由轉形體調製出質體並進行調查後得知，具有目的之約1,000bp的DNA片段。將該重組DNA命名為「pCRCS1」。

將具有重組DNA、pCRCS1之約1,000bp的DNA片段之鹼基序列，藉由一般雙去氧法(dideoxy method)進行解讀後得知，於編碼經解讀的1,004bp之鹼基序列的胺基酸序列中，含有纖維二糖2-表異構酶之內部部分胺基酸序列(序列表中之序列號碼3所示胺基酸序列)。由該結果推測所得之DNA片段為編碼作為目的之纖維二糖2-表異構酶的DNA一部份。

推測為編碼上述纖維二糖2-表異構酶之DNA一部份的DNA片段未被限制酶Pst I切斷於預先確定後，將在實驗4-1所得之基因組DNA以限制酶Pst I進行消化，得到將消化物經自身連接(self-ligation)的環狀化基因組。依據推測為編碼纖維二糖2-表異構酶之DNA一部份的DNA片段之鹼基序列，將各具有序列表中之序列號碼7及8所示鹼基序列的寡核苷酸作為信息股引子及非訊息股引子進行合成，將上述環狀化基因組作為鑄型進行PCR後得到約3,400bp之增幅DNA片段。

將所得之約3,400bp的DNA片段之鹼基序列，藉由直接、常法之雙去氧法(dideoxy method)進行解讀後，以纖維二糖2-表異構酶的N末端胺基酸序列(序列表中之序列號碼1所示胺基酸序列)為始，確認編碼含有所有3種內部部分胺基酸序列(序列表中之序列號碼2至4所示胺基酸序列)的胺基酸序列之開放閱讀框架(open reading frame)，並判斷出於本DNA片段中存在目的基因全長。依據該見解，決定編碼纖維二糖2-表異構酶之DNA的鹼基序列及被編碼之該酶的胺基酸序列。由該結果判斷出編碼來自熱解纖維素果汁桿菌屬‧解糖菌ATCC43494之纖維二糖2-表異構酶的DNA具有序列表中之序列號碼9所示鏈長1,170bp之鹼基序列，且該鹼基序列為編碼序列表中之序列號碼10所示390殘基的胺基酸序列。確認由實驗3-5所判定的纖維二糖2-表異構酶之N末端胺基酸序列(序列表中之序列號碼1所示胺基酸序列)及由實驗3-6所判定之3種內部部分胺基酸序列(序列表中之序列號碼2至4所示胺基酸序列)皆為序列表中之序列號碼10所示胺基酸序列，與各該胺基酸序列中之第1至第15號、第342至第349號、第104至第110號、及第329至第335號之胺基酸序列為完全一致。且，由序列表中之序列號碼10所示胺基酸序列所算出之分子量為46,488，該值與實驗3-1所求得之來自熱解纖維素果汁桿菌屬‧解糖菌ATCC43494之纖維二糖2-表異構酶的分子量44,000±5,000道耳頓約一致。

<實驗4-3：重組型纖維二糖2-表異構酶發現用載體之構築與轉形體之調製>

依據來自熱解纖維素果汁桿菌屬‧解糖菌ATCC43494之纖維二糖2-表異構酶的N末端胺基酸序列(序列表中之序列號碼1所示胺基酸序列)中之第1至第9號的胺基酸序列，又於基因的5' 末端側必須製作限制酶Nco I辨識部位，作為信息股引子合成具有序列表中之序列號碼11所示鹼基序列的寡核苷酸。又，依據序列表中之序列號碼10所示胺基酸序列中之第384至第390號的胺基酸序列，又於基因的3' 末端側必須製造限制酶Bam HI辨識部位，作為非訊息股引子合成具有序列表中之序列號碼12所示鹼基序列的寡核苷酸。使用彼等引子，將在實驗4-1所得之基因組DNA作為鑄型，將KOD-plus-DNA聚合酶(東洋紡製)作為PCR酶，使用DNA聚酶鏈鎖反應器(Thermal Cycler) PJ2000(Perkin Elmer公司製)以常法進行PCR增幅後，增幅約1,200bp之DNA片段。將經增幅的DNA藉由限制酶Nco I及Bam HI進行消化，經苯酚‧氯仿處理後使限制酶失活後，使用該消化物，對於預先以限制酶Nco I及Bam HI進行消化的表現載體、pET-3d(Novagen公司製)使用購得之套組(商品名「Ligation High」、東洋紡製)***。使用該反應物使複製(cloning)用宿主大腸桿菌XL10-Gold(Stratagene公司製)轉形。由轉形體調製質體而進行調查，選擇具有目的之約1,200bp的DNA片段者。將具有選擇之轉形體的重組DNA命名為「pETCS1」。使用重組DNA、pETCS1使表現用宿主大腸桿菌Rosetta(DE3)(Novagen公司製)進行轉形，調製出轉形體『ETCS1』。

<實驗4-4：轉形體中之重組型纖維二糖2-表異構酶的表現與純化>

將在實驗4-3所得之轉形體ETCS1植菌於500ml容積的三角燒瓶中各加入100ml之TB培養基(含有胰化蛋白(tryptone)1.2%、酵母萃取物2.4%、甘油0.4%、磷酸2氫1鉀17mM、磷酸氫2鉀72mM、pH6.8、安比西林(ampicillin)80μg/ml、氯黴素(Chloramphenicol)30μg/ml)者，在27℃進行24小時培養。將所得之培養物依據常法，進行離心分離將培養澄清液與菌體分離並回收。對於菌體，以超音波破碎法調製出由細胞之全萃取物。超音波破碎法為將菌體懸浮於20mM乙酸緩衝液(pH6.5)後，將該菌體懸濁液於冰水中一邊冷卻一邊以超音波均質機(模型UH-600，SMT股份有限公司製)進行細胞破碎而進行，將該破碎物作為全細胞萃取物。

對於如此調製之培養澄清液與全細胞萃取物，測定各纖維二糖2-表異構酶活性(乳糖2-表異構酶活性)，將各活性值換算為每培養物1ml的量。且作為對照組，將保有質體pET-3d之大腸桿菌Rosetta(DE3)於與上述轉形體情況之相同條件下進行培養，調製出由培養物之培養澄清液與全細胞萃取物，同樣地測定酶活性。這些結果如表2所示。

由表2之結果判斷轉形體ETCS1中，纖維二糖2-表異構酶於細胞內產生。宿主之對照組大腸桿菌中的培養澄清液、全細胞萃取物中完全皆無確認出該表異構酶活性。

將上述所得之全細胞萃取物在70℃進行30分鐘熱處理，將經熱變性的不溶化之來自宿主的蛋白質以離心分離除去。將該熱處理液澄清液提供於使用『DEAE-5PW』管柱的使用陰離子交換層析法及『Superdex 200』凝膠之凝膠過濾管柱層析法進行純化，再將該純化酶樣品依據實驗3所示方法進行分析。其結果為藉由SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳法之分子量為44,000±5,000道耳頓，表異構酶活性之至適溫度在pH6.0，20分鐘反應之條件下為80℃，至適pH在50℃於20分鐘反應之條件下為7.8，溫度安定性為在各溫度保持60分鐘之條件下至70℃為安定，pH安定性為，於各pH在4℃保持24小時的條件下4.5至9.5之範圍為安定。重組型表異構酶之彼等物理化學性質與在實驗2所純化之纖維二糖2-表異構酶於實質上為相同。以上結果表示來自熱解纖維素果汁桿菌屬‧解糖菌ATCC43494之纖維二糖2-表異構酶可藉由重組DNA技術而製造。

且，熱解纖維素果汁桿菌屬‧解糖菌ATCC43494之基因組DNA的全鹼基序列已解明，登錄於基因庫『GenBank』(AccessionNo.CP000679)。依據在實驗4-2所判斷的纖維二糖2-表異構酶的全胺基酸序列(序列表中之序列號碼10所示胺基酸序列)，檢索該基因組DNA情報時，意外地發現纖維二糖2-表異構酶的胺基酸序列與熱解纖維素果汁桿菌屬‧解糖菌ATCC43494的基因組DNA中被推定為編碼「N-乙醯葡萄糖胺2-表異構酶」的基因(Csac0294)所編碼之胺基酸序列完全一致。該結果表示，熱解纖維素果汁桿菌屬‧解糖菌ATCC43494的基因組DNA中被推定為編碼「N-乙醯葡萄糖胺2-表異構酶」的基因(Csac0294)正表示編碼纖維二糖2-表異構酶之基因。

<實驗5：纖維二糖2-表異構酶之基質專一性>

將在實驗4-4的方法所得之重組型纖維二糖2-表異構酶純化樣品作用於各種糖質後對基質專一性進行調查。於含有D-葡萄糖、D-木糖、D-阿洛糖、D-核糖、D-半乳糖、D-果糖、D-甘露糖、D-阿洛酮糖、D-塔格糖、L-山梨糖、L-鼠李糖、L-核糖、海藻糖、麴二糖、黑霉糖、異麥芽糖、新海藻糖、龍膽二糖、乳糖、蔗糖、麥芽酮糖、巴拉金糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖、麥芽七糖、纖維二糖、纖維三糖、纖維四糖、卷柏糖(selaginose)、異葡萄糖苷、異麥芽三糖、潘諾糖、異潘諾糖、吡喃葡糖基蔗糖(erlose)、麥芽糖醇、麥芽三糖醇、甲基-α-糖苷、甲基-β-糖苷、D-葡萄糖胺、D-半乳糖胺、D-葡萄糖醛酸、N-乙醯基葡萄糖胺、或N-乙醯基半乳糖胺2%(w/v)，加入MOPS緩衝液(pH8.0)至最終濃度為40mM之各基質溶液中，將在實驗4-4的方法所得之重組型纖維二糖2-表異構酶純化樣品於每基質固體物1g中各加入500單位，在60℃進行24小時作用。將反應液在100℃進行10分鐘加熱使反應停止後，欲對酶反應前後之反應液中的糖質進行調查，提供於與在實驗1-2所進行的相同方法的TLC分析。基質專一性可藉由調查基質糖質以外的反應生成物之點的有無與發色強烈程度而做判斷。結果如表3所示。

如可由表3之結果得知，本酶於試驗基質內對乳糖、纖維二糖、纖維三糖及纖維四糖起強作用，又對D-葡萄糖、D-甘露糖、麥芽糖及麥芽三糖起作用，生成考慮為異構化糖之生成物。且，對於D-半乳糖、D-果糖、D-塔格糖、麥芽酮糖、麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖及麥芽七糖亦稍有作用。

<實驗6：由單糖所生成之異構化糖>

對於將本纖維二糖2-表異構酶作用於D-葡萄糖、D-半乳糖或D-甘露糖時的反應生成物進行調查。將D-葡萄糖、D_- 半乳糖或D-甘露糖溶解於50mM乙酸緩衝液(pH6.0)至最終濃度20%(w/v)，作為各基質溶液。於基質溶液0.1ml中，將在實驗4-4的方法所調製之重組型纖維二糖2-表異構酶純化樣品於D-葡萄糖及D-甘露糖的情況為，於每基質固體物1g時加入130單位(酶液時為0.1ml)，於D-半乳糖的情況為，於每基質固體物1g中加入500單位(酶液時為0.1ml)，在60℃進行48小時反應。酶反應後在100℃進行10分鐘加熱後停止反應。將各反應液提供於欲調查反應液中之生成物的HPLC分析。且，反應液中之生成物的分析藉由欲分離單糖之下述HPLC條件而進行。結果如表4所示。

<HPLC條件>

管柱：MCIgel CK08EC(三菱化學股份有限公司製 )

溶離液：脫離子水　管柱溫度：75℃

流速：0.6ml/分鐘

檢測：差示折射計RID-10A(島津股份公司製作所製)

如可由表4的結果得知，本纖維二糖2-表異構酶可由D-葡萄糖生成D-甘露糖及D-果糖，可由D-半乳糖生成D-塔羅糖及D-塔格糖，又可由D-甘露糖生成D-葡萄糖及D-果糖。本酶對於D-半乳糖之作用與對D-葡萄糖及D-甘露糖之作用相比較為弱。本酶不僅可將D-葡萄糖及D-半乳糖各轉換為表異構物之D-甘露糖及D-塔羅糖，亦生成各D-果糖及D-塔格糖，故可判斷本酶為可催化2-表異構化反應與醛糖-酮糖變換反應兩者之酶。

<實驗7：由乳糖所生成之異構化糖>

以確認藉由本纖維二糖2-表異構酶的作用由乳糖所生成之異構化糖為目的，進行異構化糖之分離與結構解析。

<實驗7-1：由乳糖之異構化糖的調製>

於將乳糖溶解於20mM乙酸緩衝液(pH6.0)至最終濃度為1.1w/v%的基質溶液200ml中，加入每基質固體物1g為130單位(酶液時為20ml)之在實驗4-4的方法所得之重組型纖維二糖2-表異構酶純化樣品，在50℃進行8小時反應。酶反應後在100℃進行10分鐘加熱使反應停止。欲調查反應液中之糖質，進行藉由實驗1-2所記載之條件的TLC分析與藉由下述條件之HPLC分析。

<HPLC條件>

管柱：MCIgel CK08EP(三菱化學股份有限公司製造)

溶離液：脫離子水　管柱溫度：75℃

流速：0.6ml/分鐘

檢測：差示折射計RID-10A(島津股份公司製作所製)

TLC層析法中，確認反應液中有未反應乳糖與2種類異構化糖。TLC中顯示與表乳糖相同Rf值之異構化糖稱為異構化糖A，將與乳糖幾乎不分離的Rf值較低之異構化糖稱為異構化糖B。異構化糖B於二苯基胺-苯胺-磷酸發色中為發色，故被考慮為於結構中含有酮糖之異構化糖。反應液的HPLC層析法如圖6所示。HPLC中，這些異構化糖A及B係與乳糖(圖6中之符號Lac)分離，但異構化糖彼此未分離之混合物狀態下被檢測(圖6中之符號A+B)，反應液的糖組成為乳糖52.7質量%、異構化糖A及B之混合物47.3質量%。

<實驗7-2：異構化糖A及B之分離純化>

如上述，在TLC為異構化糖A與B分離，但異構化糖B為與乳糖分離，另一方面，在HPLC為異構化糖A及B與乳糖分離，但異構化糖A與B未分離。依據此見解，首先藉由HPLC將乳糖除去，取得異構化糖A及B之混合物後，藉由分取TLC分離純化異構化糖A及B。

<實驗7-2-1：藉由分取HPLC之異構化糖A及B的混合物之取得>

將330mg的在實驗7-1所得之反應液的固體物分80次提供於實驗7-1所記載之HPLC，分取出異構化糖A及B之混合物，將分取部分進行濃縮、乾燥固化後，得到作為混合物之含有98.7質量%的糖質樣品(含有單糖1.3質量%)的固體物153mg。

<實驗7-2-2：藉由分取TLC之異構化糖A及B的分離>

將含有在實驗7-2-1所得之異構化糖A及B的糖質樣品57.6mg提供於實驗1-2所記載之TLC，並進行2次展開後，各別取出相當於各異構化糖A及B之Rf值的二氧化矽凝膠，由取出的二氧化矽凝膠將異構化糖A及B依據常法以脫離子水進行萃取、濃縮、乾燥固化，得到異構化糖A樣品之固體物21.9mg、及異構化糖B樣品之固體物17.8mg。將所得之樣品一部份提供於以實驗1-2所記載的方法之GC分析，測定各純度後得到異構化糖A為純度90.2質量%(含有單糖9.8質量%)、異構化糖B為純度97.7質量%(含有單糖2.3質量%)。

<實驗7-3：異構化糖A及B之結構解析>

實驗6中判斷本酶亦可催化2-表異構化反應與醛糖-酮糖變換反應之任一。依據該結果，將異構化糖A推定為基質乳糖的表異構物之表乳糖，又將異構化糖B推定為乳糖之還原末端葡萄糖異構化為果糖的乳酮糖。以下在本實驗中，將異構化糖A及B中販賣的表乳糖標準品及乳酮糖標準品之差異藉由核磁共振(NMR)分析進行調查。

使用在實驗7-2所得之異構化糖A及B的樣品，藉由下述條件進行質子NMR(¹ H-NMR)分析。又，對於販賣的表乳糖及乳酮糖之標準品進行相同分析。將異構化糖A及表乳糖標準品的¹ H-NMR光譜各如圖7及8所示，又異構化糖B及乳酮糖標準品的¹ H-NMR光譜各如圖9及10所示。

<¹ H-NMR測定條件>

核磁共振裝置：JNM-AL300型(日本電子股份有限公司製)

溶劑：D₂ O　試料量：20mg

磁場強度：300.4MHz　累積次數：16次

如由圖7及8得知，異構化糖A的¹ H-NMR光譜與表乳糖標準品幾乎完全一致，又如由圖9及10得知，異構化糖B的¹ H-NMR光譜與乳酮糖標準品幾乎完全一致。由以上結果確認由乳糖所生成之異構化糖A為表乳糖，異構化糖B為乳酮糖。

<實驗8：由纖維二糖所生成之異構化糖>

將藉由本纖維二糖2-表異構酶之作用由纖維二糖所生成之異構化糖以特定目的下，進行異構化糖之分離與結構解析。

<實驗8-1：由纖維二糖之異構化糖的調製>

於溶解纖維二糖於20mM乙酸緩衝液(pH6.0)成為10%(w/v)之基質溶液20ml中，加入每基質固體物1g為50單位(酶液時為10ml)的在實驗4-4之方法所得之重組型纖維二糖2-表異構酶生成樣品，在60℃進行23小時反應。酶反應後將反應液在100℃進行10分鐘加熱使反應停止。將反應液之糖組成藉由下述條件以HPLC分析進行調查。HPLC層析法如圖11所示。

<HPLC條件>

管柱：將Shodex SUGAR SP0810(昭和電工股份有限公司製)與MCIgel CK08EP(三菱化學股份有限公司製造)之2根管柱依此順序直列地連結者

溶離液：脫離子水　管柱溫度：75℃

流速：0.6ml/分鐘

檢測：差示折射計RID-10A(島津股份公司製作所製)

如圖11所示，確認反應液中有未反應之纖維二糖的波峰(圖11中之符號Cel)與被認定為異構化糖之2個波峰。對於上述HPLC，將在28.9分鐘溶離的糖質稱為異構化糖C(圖11中之符號C)，又將在27.4分鐘溶離的糖質稱為異構化糖D(圖11中之符號D)。反應液之糖組成為纖維二糖40.5質量%、異構化糖C16.5質量%、及異構化糖D43.0質量%。

<實驗8-2：異構化糖C及D之分離純化>

將在實驗8-1所得之反應液的固體物432mg分100次提供於在實驗8-1所記載之HPLC，各分取出異構化糖C及D並純化。將各分取部分進行濃縮、乾燥固化，得到純度皆為100%之17.9mg的異構化糖C、118mg的異構化糖D。

<實驗8-3：異構化糖C之結構解析>

<實驗8-3-1：質量分析>

對於在實驗8-2所得之異構化糖C使用質量分析裝置『LCQ-Advantage』(Thermofisher公司製)進行質量分析後，顯著檢測出質量數365之鈉加成分子離子，異構化糖C的質量數為342。

<實驗8-3-2：酶分解>

於溶解在實驗8-2所得之異構化糖C於20mM乙酸緩衝液成為濃度2%(w/v)之基質溶液0.3ml中，添加每基質1g為500單位(酶液時為0.3ml)之β-葡萄糖苷酶(Oriental酵母工業股份有限公司製)，在40℃進行16小時反應。在100℃進行10分鐘加熱使反應停止後，欲調查反應生成物提供於在實驗6所使用的HPLC，調查所生成之單糖後，確認D-葡萄糖與D-甘露糖為等莫耳。考慮到該結果與β-葡萄糖苷酶之基質專一性時，判斷異構化糖C為D-甘露糖與D-葡萄糖以β鍵結合的二糖。

<實驗8-3-3：核磁共振分析>

使用在實驗8-2的方法所得之異構化糖C的樣品，依據常法，進行核磁共振(NMR)分析。¹ H-NMR光譜在實驗7-3記載之條件下進行測定，又¹³ C-NMR光譜在下述條件下進行測定。

<¹³ C-NMR測定條件>

核磁共振裝置：JNM-AL300型(日本電子股份有限公司製)

溶劑：D₂ O 試料量：14~30mg

磁場強度：75.45MHz 積算次數：1000次

將異構化糖C樣品的¹ H-NMR光譜如圖12所示，¹³ C-NMR光譜如圖13所示。圖13的¹³ C-NMR光譜中，因D-甘露糖的第C-4位訊息(79.3及78.9ppm、圖13中之符號*)位移至較大低磁場側而得知，D-葡萄糖鍵結於D-甘露糖之第4位。又，圖12的¹ H-NMR光譜中，約4.35ppm的訊息(圖12中之符號↓)歸屬於D-葡萄糖殘基之第1位質子，求得該自旋-自旋結合定數為約7.9Hz，故判斷鍵結於D-甘露糖的第4位的D-葡萄糖殘基之第1位首旋異構物型為β型。且，異構化糖C之¹³ C-NMR光譜中的各碳訊息之化學位移值與烏索們之Agricultural Biological Chemistry,第43卷,863-865頁(1979年)所揭示的表纖維二糖非常一致。

由實驗8-3-1至8-3-3之結果得知，藉由本表異構酶的作用由纖維二糖所生成之異構化糖C為4-O-β-D-葡苷基D-甘露糖，即表纖維二糖。

<實驗8-4：異構化糖D之結構解析>

<實驗8-4-1：質量分析>

對於在實驗8-2所得之異構化糖D進行與實驗8-3-1相同質量分析時，顯著地檢測出質量數365之鈉加成分子離子，判斷異構化糖C之質量數為342。

<實驗8-4-2：酶分解>

取代異構化糖C使用在實驗8-2所得之異構化糖D以外，進行與實驗8-3-2之相同處理，並進行異構化糖D之酶分解。欲調查反應生成物而提供於在實驗6所使用的HPLC，調查所生成之單糖後確認D-葡萄糖與D-果糖為等莫耳。考慮到該結果與β-葡萄糖苷酶之基質專一性，判斷異構化糖D為D-果糖與D-葡萄糖以β鍵結合之二糖。

<實驗8-4-3：核磁共振分析>

與實驗8-3-3同樣下，進行在實驗8-2的方法所得之異構化糖D樣品的NMR分析。¹ H-NMR光譜如圖14所示，¹³ C-NMR光譜如圖15所示。圖15的¹³ C-NMR光譜中，D-果糖的第C-4位訊息(79.9、86.4及87.7ppm、圖15中之符號*)大大地往低磁場側位移，故得知D-葡萄糖鍵結於D-果糖的第4位。又，圖14的¹ H-NMR光譜中，約4.49ppm的訊息、約4.40ppm的訊息、及約4.38ppm的訊息(圖14中之符號↓)為歸屬於D-葡萄糖殘基之第1位質子，求得該自旋-自旋結合定數為約7.9Hz(約4.49ppm之訊息)、約7.7Hz(約4.40ppm之訊息)、及、約6.1Hz(約4.38ppm之訊息)，判斷出鍵結於D-果糖第4位的D-葡萄糖殘基的第1位首旋異構物型為β型。且，異構化糖D的¹³ C-NMR光譜中之各碳訊息的化學位移值與Pfeffer們的Carbohydrate Research,第102卷,11-22頁(1982年)所揭示的cellobiulose非常一致。

由實驗8-4-1至8-4-3的結果判斷出藉由本表異構酶之作用由纖維二糖所生成之異構化糖D為4-O-β-D-葡苷基D-果糖，即cellobiulose。

<實驗9：由麥芽糖所生成之異構化糖>

將藉由本纖維二糖2-表異構酶之作用由麥芽糖所生成之異構化糖作為特定目的下，進行異構化糖之分離與結構解析。

<實驗9-1：由麥芽糖之異構化糖的調製>

將基質由纖維二糖取代為麥芽糖，將在實驗4-4的方法所得之重組型纖維二糖2-表異構酶之酶作用量作為每基質固體物1g為200單位以外，進行與實驗8-1之相同反應後得到反應液。將反應液的HPLC層析法如圖16所示。如圖16所示，於反應液中確認有未反應麥芽糖之波峰(圖16中之符號Mal)與被考慮為異構化糖之2個波峰。將於上述HPLC中之31.6分溶離之糖質稱為異構化糖E(圖16中之符號E)、又將於28.0分鐘溶離的糖質稱為異構化糖F(圖16中之符號F)。反應液的糖組成為麥芽糖70.1質量%、異構化糖E22.2質量%、及、異構化糖F7.7質量%。

<實驗9-2：異構化糖E及F之分離純化>

作為在實驗9-1所得之反應液的固體物191mg分29次提供於在實驗8-1所使用的HPLC，各分取並純化異構化糖E及F。將各分取部分經濃縮、乾燥固化，得到純度99.1質量%之38.1mg的異構化糖E、純度92.3質量%之14.2mg的異構化糖F。

<實驗9-3：異構化糖E之結構解析>

<實驗9-3-1：質量分析>

對於在實驗9-2所得之異構化糖E進行與實驗8-3-1之相同質量分析後判斷出質量數365的鈉加成分子離子顯著地被檢測出，異構化糖E之質量數為342。

<實驗9-3-2：酶分解>

於將在實驗9-2所得之異構化糖E溶解於20mM乙酸緩衝液至濃度2%(w/v)的基質溶液0.3ml，添加每基質1g為500單位(酶液時為0.3ml)之α-葡萄糖苷酶(天野酵素股份有限公司製)，在50℃進行16小時反應。在100℃進行10分鐘加熱使反應停止後，欲調查反應生成物提供於在實驗6所使用的HPLC，調查所生成之單糖後確認D-葡萄糖與D-甘露糖為等莫耳。考慮到該結果與α-葡萄糖苷酶之基質專一性，判斷出異構化糖E為D-甘露糖與D-葡萄糖以α鍵結合的二糖。

<實驗9-3-3：核磁共振分析>

與實驗8-3-3同樣地，進行在實驗9-2的方法所得之異構化糖E樣品的NMR分析。¹ H-NMR光譜如圖17所示，¹³ C-NMR光譜如圖18所示。圖18的¹³ C-NMR光譜中，D-甘露糖的第C-4位訊息(77.7及77.2ppm、圖18中之符號*)大大往低磁場側位移，得知D-葡萄糖鍵結於D-甘露糖的第4位。又，圖17之¹ H-NMR光譜中，約5.22ppm之訊息(圖17中之符號↓)為歸屬於D-葡萄糖殘基的第1位質子，求得該自旋-自旋結合定數為約3.9Hz，故判斷出鍵結於D-甘露糖之第4位的D-葡萄糖殘基之第1位首旋異構物型為α型。且，異構化糖E的¹³ C-NMR光譜中之各碳訊息的化學位移值與特開平10-95794號公報所揭示的4-α-D-葡苷基D-甘露糖非常一致。

由實驗9-3-1至9-3-3的結果判斷出藉由本表異構酶之作用由麥芽糖所生成之異構化糖E為4-O-α-D-葡苷基D-甘露糖，即表麥芽糖。

<實驗9-4：異構化糖F之結構解析>

實驗6中判斷出本酶不僅催化2-表異構化反應，亦催化醛糖-酮糖變換反應，由實驗7中由乳糖生成乳酮糖，實驗8中由纖維二糖生成cellobiulose推定異構化糖F為麥芽糖之還原末端葡萄糖異構化為果糖之麥芽酮糖。以下在本實驗中，與異構化糖F之販賣麥芽酮糖標準品之異同藉由¹ H-NMR分析進行調查。

使用在實驗9-2所得之異構化糖F樣品，在與實驗7-3之相同條件下進行¹ H-NMR分析。又，對於販賣的麥芽酮糖標準品亦進行相同分析。異構化糖F及麥芽酮糖標準品之¹ H-NMR光譜各如圖19及20所示。

由圖19及20得知，異構化糖F的¹ H-NMR光譜與麥芽酮糖標準品完全一致。由該結果可鑑定由麥芽糖所生成之異構化糖F為麥芽酮糖。

<實驗10：由麥芽三糖所生成之異構化糖>

將藉由本纖維二糖2-表異構酶的作用由麥芽三糖所生成之異構化糖字為特定目的下，進行異構化糖之分離與結構解析。

<實驗10-1：由麥芽三糖之異構化糖的調製>

將基質由麥芽糖取代為麥芽三糖以外，進行與實驗9-1之相同反應後得到反應液。將反應液的HPLC層析法如圖21所示。如圖21所示，於反應液中確認有未反應麥芽三糖的波峰(圖21中之符號G₃ )與被考慮為異構化糖之1個波峰。將上述HPLC中於29.9分鐘溶離的糖質稱為異構化糖G(圖21中之符號G)。反應液的糖組成為麥芽三糖73.8質量%、異構化糖G23.3質量%、及其他未知糖2.9質量%。

<實驗10-2：異構化糖G之分離純化>

作為在實驗10-1所得之反應液的固體物475mg分80次提供於在實驗8-1所使用的HPLC，分取並純化異構化糖G。分取部分經濃縮、乾燥固化，得到113mg的純度99.4質量%之異構化糖G。

<實驗10-3：異構化糖G之結構解析>

<實驗10-3-1：質量分析>

對於在實驗10-2所得之異構化糖G進行與實驗8-3-1之相同質量分析後，判斷出質量數527的鈉加成分子離子顯著被檢測出，異構化糖G的質量數為504。

<實驗10-3-2：酶分解>

將異構化糖E樣品取代為在實驗10-2所得之異構化糖G樣品以外，與實驗9-3-2同樣地以α-葡萄糖苷酶進行酶分解，調查將反應液提供於HPLC所生成之單糖後確認D-葡萄糖與D-甘露糖為2：1之莫耳比。考慮到該結果與α-葡萄糖苷酶之基質專一性，可判斷異構化糖G係由存在於還原末端之D-甘露糖1分子與D-葡萄糖2分子所成之三糖。

<實驗10-3-3：核磁共振分析>

與實驗8-3-3同樣地，進行在實驗10-2的方法所得之異構化糖G樣品的NMR分析。¹ H-NMR光譜如圖22所示，¹³ C-NMR光譜如圖23所示。圖23的¹³ C-NMR光譜中，D-甘露糖的第C-4位訊息(77.9及77.3ppm、圖23中之符號*)大大往低磁場側位移，故得知D-葡萄糖鍵結於D-甘露糖的第4位。又，D-葡萄糖1分子的第C-4位訊息(79.2ppm、圖23中之符號#)亦大大地往低磁場側位移，故得知D-葡萄糖1分子鍵結於D-葡萄糖的第4位。且，圖22之¹ H-NMR光譜中，約5.20ppm的訊息(圖22中之符號↓)歸屬於鍵結於D-甘露糖的D-葡萄糖殘基之第1位質子，求得該自旋-自旋結合定數為約3.9Hz，故判斷出於D-甘露糖的第4位所鍵結的D-葡萄糖殘基的第1位首旋異構物型為α型。又進一步約5.26ppm的訊息(圖22中之符號x)歸屬於鍵結於D-葡萄糖之D-葡萄糖殘基的第1位質子，求得該自旋-自旋結合定數為約3.7Hz，故判斷鍵結於D-葡萄糖的第4位之D-葡萄糖殘基的第1位首旋異構物型亦為α型。

由實驗10-3-1至10-3-3的結果得知，藉由本表異構酶之作用由麥芽三糖所生成之異構化糖G為4-O-α-D-葡苷基-4-O-α-葡苷基D-甘露糖，即表麥芽三糖。

<實驗11：由各種糖質之異構化糖的生成-酶作用量之影響->

由實驗5至10之結果可判斷出本纖維二糖2-表異構酶對D-葡萄糖、D-半乳糖、D-果糖、D-甘露糖、D-塔格糖等單糖、麥芽糖、纖維二糖、乳糖等二糖、及、麥芽寡糖、纖維寡醣等寡糖起作用，可催化2-表異構化反應與醛糖-酮糖變換反應。對於本實驗中之各種基質的異構化反應的酶作用量之影響做調查。

將單糖之D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-塔羅糖、D-果糖及D-塔格糖的6種、將二糖之麥芽糖、纖維二糖及乳糖的3種、將三糖之麥芽三糖的1種各作為基質使用，各溶解於20mM乙酸緩衝液(pH6.0)，添加在實驗4-4的方法所得之重組型纖維二糖2-表異構酶純化樣品，在基質濃度10%(w/v)、60℃下進行72小時反應。酶作用量在基質為單糖時，每基質1g下為130或500單位，在基質為二糖及三糖時，每基質1g下為1及/或130單位。各反應液在100℃下進行10分鐘加熱並使反應停止，提供於HPLC分析，測定反應液之固體物的異構化糖含量。且，對於基質乳糖之反應液中的表乳糖及乳酮糖含量則藉由在實驗1-2所使用的GC分析進行測定。結果如表5所示。

由表5可得知，本纖維二糖2-表異構酶可良好地作用於纖維二糖及乳糖，酶作用量為每基質1g時1單位的比較低的情況下，亦可催化2-表異構化反應，生成表纖維二糖及表乳糖。又，若增加酶作用量時，藉由醛糖-酮糖變換反應的cellobiulose及乳酮糖可顯著地生成。本酶對於單糖或三糖之作用，與對於纖維二糖及乳糖之情況比較時較為弱，於異構化上需要多量的酶。

將至今實驗所得之來自熱解纖維素果汁桿菌屬‧解糖菌ATCC43494之纖維二糖2-表異構酶的物理化學性質及基質專一性與公知來自瘤胃細菌(Ruminococcus albus)之纖維二糖2-表異構酶(由非專利文獻3取得)及來自溶纖維真細菌(Eubacterium cellulosolvens)之纖維二糖2-表異構酶(由非專利文獻4取得)之物理化學性質及基質專一性同時歸納表示於表6。

由表6得知，來自熱解纖維素果汁桿菌屬‧解糖菌ATCC43494之纖維二糖2-表異構酶與來自瘤胃細菌(Ruminococcus albus)及來自溶纖維真細菌(Eubacterium cellulosolvens)之各公知纖維二糖2-表異構酶做比較，至適溫度為較高之45至50℃，溫度安定性為較高之30℃程度，其為耐熱性優良之酶。又，來自熱解纖維素果汁桿菌屬‧解糖菌ATCC43494之纖維二糖2-表異構酶，其為對於報告(參照非專利文獻3及4)指出來自公知瘤胃細菌(Ruminococcus albus)及來自溶纖維真細菌(Eubacterium cellulosolvens)之纖維二糖2-表異構酶並未起作用之D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖等單糖、或麥芽糖亦可作用之新穎酶。

以下藉由實施例對本發明做更詳細說明。然而，本發明並非限定於這些實施例。

[實施例1]

<D-甘露糖之調製>

於D-葡萄糖10%(w/v)水溶液(pH6.5)中，加入每D-葡萄糖1g為130單位(乳糖2-表異構酶活性)的比率之在實驗4-4的方法所純化之重組型纖維二糖2-表異構酶，在60℃進行48小時反應後，糖組成中生成21質量%的D-甘露糖。反應後，將反應液依據常法，使用活性碳進行脫色，再使用H型離子交換樹脂(商品名「DIAION SK1B」、三菱化學股份有限公司製)及OH型離子交換樹脂(商品名「DIAION WA30」、三菱化學股份有限公司製)進行脫鹽，經減壓濃縮後得到含有D-甘露糖之透明糖漿。將本糖漿藉由使用鹽型強酸性陽離子交換樹脂(DIAIONUBK-530、Ca型、三菱化學股份有限公司製)的管柱層析法進行分離純化、濃縮後得到固體產率約18%之糖漿狀D-甘露糖。

[實施例2]

<表乳糖之調製>

於乳糖的10%(w/v)水溶液(pH6.5)中，加入每乳糖1g為2單位(乳糖2-表異構酶活性)之比率的在實驗4-4的方法所純化之重組型纖維二糖2-表異構酶，在60℃進行72小時反應。將反應液在100℃加熱15分鐘後使反應停止，冷卻後將反應液之糖組成以HPLC及GC進行測定後，得到固體物中含有未反應乳糖69質量%、表乳糖28質量%、乳酮糖3質量%。將該糖漿之pH調製成4.5後，添加每基質1g為25單位之乳糖酶劑(商品名「乳糖酶Y-AO」、Yakult藥品工業股份有限公司販賣)，在40℃進行16小時反應，將糖漿中之乳糖及乳酮糖優先地水解、並反應後，將反應液與實施例1同樣地，進行脫色、脫鹽，並減壓濃縮後得到含有表乳糖之透明糖漿。將本糖漿以與實施例1同樣下藉由使用鹽型強酸性陽離子交換樹脂之管柱層析法，進行分離純化並濃縮後得到固體物產率約23%之糖漿狀表乳糖。

[實施例3]

<含有表纖維二糖之糖漿的調製>

於纖維二糖的10%(w/v)水溶液(pH6.5)中，添加每纖維二糖1g為2單位(乳糖2-表異構酶活性)之比率的在實驗4-4的方法所純化之重組型纖維二糖2-表異構酶，在60℃進行72小時反應。將反應液在100℃進行10分鐘加熱並使反應停止、冷卻後，將反應液的糖組成以HPLC及GC進行測定後，得知固體物中含有未反應的纖維二糖69質量%、表纖維二糖28質量%、cellobiulose3質量%。將反應液與實施例1同樣地進行脫色、脫鹽，並減壓濃縮後得到固體物產率約97%之透明含有表纖維二糖之糖漿。

[實施例4]

<含有表麥芽糖的糖漿之調製>

於麥芽糖的10%(w/v)水溶液(pH7.3)中，加入每麥芽糖1g為200單位(乳糖2-表異構酶活性)的比率之在實驗4-4的方法所純化之重組型纖維二糖2-表異構酶，在60℃進行23小時反應。將反應液在100℃進行10分鐘加熱使反應停止，經冷卻後，將反應液的糖組成以HPLC進行測定後得知，固體物含有未反應麥芽糖70質量%、表麥芽糖22質量%、麥芽酮糖8質量%。將反應液與實施例1同樣地，進行脫色、脫鹽，並減壓濃縮後得到固體物產率約96%之透明含有表麥芽糖之糖漿。

[實施例5]

<cellobiulose之調製>

將在實驗4-4的方法所純化之重組型纖維二糖2-表異構酶以每纖維二糖1g為130單位(乳糖2-表異構酶活性)下使其作用以外，與實施例3同樣下作用於纖維二糖。將反應停止後之反應液的糖組成藉由HPLC進行調查後得知，固體物含有未反應纖維二糖33質量%、表纖維二糖13質量%、cellobiulose54質量%。將反應液與實施例3同樣地進行脫色、脫鹽，並減壓濃縮得到透明糖漿後，將本糖漿與實施例1同樣地使用鹽型強酸性陽離子交換樹脂藉由管柱層析法進行分離純化，並濃縮後得到固體物產率約45%之糖漿狀cellobiulose。

[實施例6]

<固定化纖維二糖2-表異構酶>

以實驗4-4的方法培養轉形體『ETCS1』，離心分離培養液後得到表現纖維二糖2-表異構酶活性之濕菌體100g。再將該濕菌體混煉於溶解於20mM Tris-鹽酸緩衝液(pH7.5)之2.5%褐藻酸鈉(和光純藥工業股份有限公司販賣)100ml。將所得之含有菌體之漿料，離水面約20cm之高度下連續滴入於以磁攪棒進行攪拌之0.1M的CaCl₂ 水溶液，調製出直徑約2mm的球狀凝膠化物。將此在0.1M的CaCl₂ 水溶液中放置約2小時後，經吸引過濾回收褐藻酸固定化菌體。該固定化菌體因可表現纖維二糖2-表異構酶活性，故填充於管柱等作為固定化纖維二糖2-表異構酶時可有利地被應用。

產業上可利用性

本發明的纖維二糖2-表異構酶具有與過去公知纖維二糖2-表異構酶相比更優良耐熱性，又可催化新穎糖異構化反應，故其對於由D-葡萄糖製造D-甘露糖、由麥芽糖製造表麥芽糖、由纖維二糖製造表纖維二糖或cellobiulose、或由乳糖製造表乳糖或乳酮糖等可自便宜原料以工業水準製造出更高加成價值的糖質上為非常有利的酶。本發明為可達成更顯著作用效果之發明，於產業上之貢獻實具有極大意義。

<110>　林原生物化學硏究所股份有限公司

<120>　纖維二糖2-表異構酶與其製造方法及用途

<130>　10120901

<160>　12

<210>　1

<211>　15

<212>　PRT

<213>　熱解纖維素果汁桿菌屬‧解糖菌

<400>　1

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<212>　PRT

<213>　熱解纖維素果汁桿菌屬.解糖菌

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<212>　PRT

<213>　熱解纖維素果汁桿菌屬‧解糖菌

<400>　3

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<213>　熱解纖維素果汁桿菌屬‧解糖菌

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<212>　DNA

<213>　人工序列

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<213>　人工序列

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<213>　熱解纖維素果汁桿菌屬‧解糖菌

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<213>　熱解纖維素果汁桿菌屬‧解糖菌

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<400>　11

<210>　12

<211>　38

<212>　DNA

<213>　人工序列

<400>　12

圖1中，

a．．．麥芽寡糖混合物(葡萄糖聚合度之標識物)

b．．．纖維二糖標準品

c．．．纖維二糖反應液

d．．．乳糖標準品

e．．．乳糖反應液

f．．．表乳糖標準品

g．．．表乳糖反應液

←．．．乳糖(異構化糖)

G₁ ．．．葡萄糖

G₂ ．．．麥芽糖

G₃ ．．．麥芽三糖

G₄ ．．．麥芽四糖

圖6中，

Lac．．．乳糖

A+B．．．異構化糖A及B之混合物

圖11中，

Cel．．．纖維二糖

C．．．異構化糖C

D．．．異構化糖D

圖12、14及17中，

↓．．．D-葡萄糖的第1位質子之訊息

圖13、18及23中，

*．．．D-甘露糖的第C-4位之訊息

圖15中，

*．．．D-果糖的第C-4位之訊息

圖16中，

Mal．．．麥芽糖

E．．．異構化糖E

F．．．異構化糖F

圖21中，

G₃ ．．．麥芽三糖

G．．．異構化糖G

圖22中，

↓．．．鍵結於D-甘露糖之D-葡萄糖的1質子之訊息

x．．．鍵結於D-葡萄糖之D-葡萄糖的1質子之訊息

圖23中，

#．．．D-葡萄糖所鍵結的D-葡萄糖之第C-4位之訊息

[圖1]　表示將熱解纖維素果汁桿菌屬‧解糖菌ATCC43494的菌體破碎萃取液澄清液於纖維二糖、乳糖或表乳糖起作用時的反應液TLC層析法。

[圖2]　表示對於本發明的纖維二糖2-表異構酶之酶活性的溫度影響圖。

[圖3]　表示對於本發明的纖維二糖2-表異構酶之酶活性的pH影響圖。

[圖4]　表示對於本發明的纖維二糖2-表異構酶之安定性的溫度影響圖。

[圖5]　表示對於本發明的纖維二糖2-表異構酶之安定性的pH影響圖。

[圖6]　表示將本發明的纖維二糖2-表異構酶作用於乳糖所得之反應液的HPLC層析法。

[圖7]　表示將本發明的纖維二糖2-表異構酶作用於乳糖並分離後之異構化糖A的¹ H-NMR光譜。

[圖8]　表示販賣的表乳糖標準品之¹ H-NMR光譜。

[圖9]　表示將本發明的纖維二糖2-表異構酶作用於乳糖並分離後的異構化糖B的¹ H-NMR光譜。

[圖10]　表示販賣的乳酮糖標準品之¹ H-NMR光譜。

[圖11]　表示將本發明的纖維二糖2-表異構酶作用於纖維二糖所得之反應液的HPLC層析法。

[圖12]　表示將本發明的纖維二糖2-表異構酶作用於纖維二糖並分離後的異構化糖C之¹ H-NMR光譜。

[圖13]　表示將本發明的纖維二糖2-表異構酶作用於纖維二糖並分離後的異構化糖C之¹³ C-NMR光譜。

[圖14]　表示將本發明的纖維二糖2-表異構酶作用於纖維二糖並分離後的異構化糖D之¹ H-NMR光譜。

[圖15]　表示將本發明的纖維二糖2-表異構酶作用於纖維二糖並分離後的異構化糖D之¹³ C-NMR光譜。

[圖16]　表示將本發明的纖維二糖2-表異構酶作用於麥芽糖所得之反應液的HPLC層析法。

[圖17]　表示將本發明的纖維二糖2-表異構酶作用於麥芽糖並分離後的異構化糖E之¹ H-NMR光譜。

[圖18]　表示將本發明的纖維二糖2-表異構酶作用於麥芽糖並分離後的異構化糖E之¹³ C-NMR光譜。

[圖19]　表示將本發明的纖維二糖2-表異構酶作用於麥芽糖並分離後的異構化糖F之¹ H-NMR光譜。

[圖20]　表示販賣的麥芽酮糖標準品之¹ H-NMR光譜。

[圖21]　表示將本發明的纖維二糖2-表異構酶作用於麥芽三糖所得之反應液的HPLC層析法。

[圖22]　表示將本發明的纖維二糖2-表異構酶作用於麥芽三糖並分離後之異構化糖G的¹ H-NMR光譜。

[圖23]　表示將本發明的纖維二糖2-表異構酶作用於麥芽三糖並分離後的異構化糖G之¹³ C-NMR光譜。

Claims

一種異構化糖的製造方法，其特徵為含有於選自D-葡萄糖、D-半乳糖、麥芽糖、纖維二糖、乳糖、聚合度3以上之麥芽寡糖、及聚合度3以上之纖維寡醣的糖質中，使具有序列表中之序列號碼10所示胺基酸序列、或於保持酶活性的範圍下該胺基酸序列中1個以上，未達10個胺基酸殘基經取代、欠缺或加成的胺基酸序列之纖維二糖2-表異構酶起作用，生成選自各對應的D-甘露糖、D-塔羅糖、表麥芽糖、表纖維二糖、表乳糖、聚合度3以上之表麥芽寡糖、及聚合度3以上之表纖維寡醣的異構化糖之步驟、及收集所生成之異構化糖的步驟所成者。
一種異構化糖的製造方法，其特徵為含有在含有選自D-葡萄糖、D-半乳糖、麥芽糖、纖維二糖、乳糖、聚合度3以上之麥芽寡糖、及聚合度3以上之纖維寡醣的糖質所成之營養培養基，培養具有具有序列表中之序列號碼10所示胺基酸序列、或於保持酶活性的範圍下該胺基酸序列中1個以上，未達10個胺基酸殘基經取代、欠缺或加成的胺基酸序列之纖維二糖2-表異構酶產生能的微生物之步驟、及收集於培養液中所生成之選自各對應的D-甘露糖、D-塔羅糖、表麥芽糖、表纖維二糖、表乳糖、聚合度3以上之表麥芽寡糖、及聚合度3以上之表纖維寡醣的異構化糖之步驟所成者。
一種異構化糖的製造方法，其特徵為含有於選自D-葡萄糖或D-甘露糖、D-半乳糖或D-塔羅糖、麥芽糖或表麥芽糖、纖維二糖或表纖維二糖、及乳糖或表乳糖的糖質，使具有序列表中之序列號碼10所示胺基酸序列、或於保持酶活性的範圍下該胺基酸序列中1個以上，未達10個胺基酸殘基經取代、欠缺或加成的胺基酸序列之纖維二糖2-表異構酶起作用，生成選自各對應之D-果糖、D-塔格糖、麥芽酮糖、cellobiulose及乳酮糖的異構化糖之步驟、及收集所生成之異構化糖的步驟所成者。
一種異構化糖的製造方法，其特徵為含有在含有選自D-葡萄糖或D-甘露糖、D-半乳糖或D-塔羅糖、麥芽糖或表麥芽糖、纖維二糖或表纖維二糖、及乳糖或表乳糖的糖質所成之營養培養基，培養具有具有序列表中之序列號碼10所示胺基酸序列、或於保持酶活性的範圍下該胺基酸序列中1個以上，未達10個胺基酸殘基經取代、欠缺或加成的胺基酸序列之纖維二糖2-表異構酶產生能的微生物之步驟、及收集於培養液中所生成之選自各對應的D-果糖、D-塔格糖、麥芽酮糖、cellobiulose及乳酮糖的異構化糖之步驟所成者。