JP6635939B2 - 多分散液滴を使用するデジタルアッセイを行うための方法及び装置 - Google Patents
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Description
本出願は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、2014年4月8日出願の米国仮出願第61/976,918号、及び2014年9月8日出願の米国仮出願第62/047,570号の利益を主張する。
本発明は、国立衛生研究所(NIH)認可番号R21 GM103459の下で、米国政府の支援と共に成された。
本開示は、ダイナミックレンジの増加を伴う、デジタルアッセイを行うための方法、システム、及びデバイスを提供し、ここでは、多数の異なるサイズの体積が生成される。既存のプラットフォームとは異なり、本開示の方法及びシステムは、離散的ではなく連続的であるサイズ(例えば、体積)の分布の使用を含み得る。いくつかの態様において、可変サイズの液滴は、ランダムに、またはマイクロ流体の制御された適用によって、様々な方法で創出され得る。例えば、T字路またはフローフォーカスデバイスを使用することによる一定体積の液滴のマイクロ流体生成が、当該技術分野で周知である。これらのシステムでは、液滴のサイズは、剪断速度及びチャネル寸法によって制御され得る。所与のT字路形状に対しての場合、剪断速度は連続的に変化し、異なる体積の液滴が生成され得る。これらの方法は、例えば、水相及び油性分散媒の相対的流速を調整する、コンピュータ制御された注射器ポンプまたは調節された空気圧によって実現され得る。
本開示の別の態様は、本開示の方法を実行するためのデバイスを含む。この態様に従うと、本開示は、体積分布を有する複数の多分散液滴を産出するための手段、複数の多分散液滴中の所与の液滴の体積を測定するための手段、液滴中の試料の有無及び複数の多分散液滴中の試料の濃度を決定するための手段を提供する。本方法は、大きいダイナミックレンジに渡るデジタル測定の性能、ならびにダイナミックレンジを増加させるための方法及びシステムを可能にする。具体的には、本デバイスは、とりわけ、異なるサイズの試料体積を創出することによって、試料のデジタル測定のダイナミックレンジを増加させる。
本開示はまた、例えば核酸試料などの試料の増幅のための方法、デバイス、及びシステムを提供する。ある特定の態様において、試料増幅はPCRを含む。更なる態様において、試料増幅はdPCRを含む。
様々な態様において、本開示は、デジタルアッセイを行うための方法を提供する。複数の多分散液滴が産出され得る。液滴の少なくともいくつかは、試料を含んでもよい。試料は増幅されてもよい。試料は、検出可能な薬剤で標識されてもよい。液滴のための画像スタックが取得され得る。液滴の体積が画像スタックから決定され得る。液滴中の検出可能な薬剤の有無は、画像スタックから決定されてもよい。複数の液滴中の試料の濃度は、複数の液滴中の検出可能な薬剤の有無に基づいて決定されてもよい。
デジタルアッセイを行うための組成物及びキット
試験管中で可変体積の液滴を生成するための方法
この実施例は、本開示の一態様に従って可変体積の多分散液滴を産出するための例示的な方法を提供する。この実施例では、PCR試験管を使用するが、任意の好適な容器を本開示に従って使用することができる。
マルチウェルプレート中で可変体積の液滴を生成するための方法
この実施例は、本開示の一態様に従う、可変体積の多分散液滴の産出、ならびに続く修飾及び分析のための方法を提供する。
最良適合の円の決定
この実施例は、多分散液滴システムにおいて液滴に対する最良適合の円を決定するための方法を提供する。この態様では、液滴の境界の一部のまたは全体であると仮定される画素のセットを、既存の最適化アルゴリズムを使用して円に適合させる。この態様では、MATLABに実装されるNelder−Meadアルゴリズムを使用する。このアルゴリズムは、以下の方程式(1)において定義される適合誤差を最小化する。
液滴を特定するためのリバースウォーターシェッド法
この実施例は、本開示の態様に従ってリバースウォーターシェッド法を行うための例示的なプロセスを説明する。
液滴を特定するための円検出法
この実施例は、本開示の態様に従って円検出法を行うための例示的なプロセスを説明する。
液滴を特定するためのリバースウォーターシェッド及び円検出複合法
この実施例は、本開示の態様に従ってリバースウォーターシェッド及び円検出複合法を行うための例示的なプロセスを説明する。
dPCR増幅及び分析
この実施例は、多分散液滴エマルションシステムを使用するヌクレオチド試料のdPCR増幅及び分析のための方法を説明する。
dPCR後の液滴分析のための方法
この実施例は、多分散液滴エマルションシステムにおけるデジタルPCRなどの、連続可変液滴体積を使用するデジタル増幅分析方法を説明する。この方法を使用し、多分散液滴を用いたデジタルアッセイを使用して、標的試料濃度CSを正確に決定することができる。
液滴径変化の特性評価
この実施例は、PCR条件下での多分散液滴エマルションシステムにおける液滴サイズの分布の変化の分析、及びかかる変化の影響を最低限に抑えるための方法を説明する。
最良適合の濃度とUV吸光によって決定した濃度との間の比較
この実施例は、本開示の最良適合法によって決定した試料濃度と、UV吸光によって測定したものとの間で観察された十分な一致を説明する。
最確数法を使用する液滴分析
この実施例は、標的試料の濃度を決定するための最確数(MPN)法の使用を(実施例8に記載の方程式(8)の使用と比べて)説明する。この方法を使用すると、標的試料の濃度CSは、占有されていない液滴の特定、寸定、または列挙なくして正確に決定される。
画像深度を改善するための屈折率整合
この実施例では、エマルションシステムの光学撮影を目的として、2つ以上の非混和性流体の屈折率を整合させることの利益を説明する。
密度及び間隔を制御するための多重エマルション
この実施例は、デジタルアッセイに多重エマルションを使用する利点を説明する。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する。
(項目1)
デジタルアッセイを行うための方法であって、
複数の多分散液滴であって、前記液滴の少なくともいくつかが試料を含む、液滴を産出することと、
前記試料を増幅することと、
前記試料を検出可能な薬剤で標識することと、
液滴のための画像スタックを取得することと、
前記画像スタックから前記液滴の体積を決定することと、
前記画像スタックから前記液滴中の前記検出可能な薬剤の有無を決定することと、
前記複数の液滴中の前記試料の濃度を、前記複数の液滴中の前記検出可能な薬剤の有無に基づいて決定することと、を含む、前記方法。
(項目2)
前記画像スタックを取得することが、光学撮像を含む、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記検出可能な薬剤を検出することが、光学撮像を含む、項目1に記載の方法。
(項目4)
前記光学撮像が、共焦点顕微鏡法、ライン共焦点顕微鏡法、デコンボリューション顕微鏡法、スピニングディスク顕微鏡法、多光子顕微鏡法、平面照明顕微鏡法、ベッセルビーム顕微鏡法、微分干渉顕微鏡法、位相差顕微鏡法、落射蛍光顕微法、明視野撮像法、暗視野撮像法、斜照法、またはこれらの組み合わせによって行われる、項目2または3に記載の方法。
(項目5)
前記画像スタックが、単一の液滴を通した別々の焦点深度から撮られた複数の画像を含む、項目1〜4のいずれか一項に記載の方法。
(項目6)
前記画像スタックが、液滴について別々の焦点深度から撮られた、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、または100枚の画像を含む、項目5に記載の方法。
(項目7)
前記方法が、前記複数の液滴に対して同時に行われる、項目1〜6のいずれか一項に記載の方法。
(項目8)
前記複数の多分散液滴が、1群列の多分散液滴を含む、項目7に記載の方法。
(項目9)
前記群列の多分散液滴が、マルチウェルプレート中に配置される、項目8に記載の方法。
(項目10)
前記液滴の体積が、ラインスキャン法、シンプルバウンダリ法、リバースウォーターシェッド法、円検出法、リバースウォーターシェッド及び円検出複合法、またはこれらの組み合わせによって、前記画像スタックから決定される、項目1〜9のいずれか一項に記載の方法。
(項目11)
前記検出可能な薬剤の濃度が、少なくとも3桁のダイナミックレンジに渡って、または少なくとも6桁のダイナミックレンジに渡って決定される、項目1〜10のいずれか一項に記載の方法。
(項目12)
前記複数の多分散液滴が、第1の流体及び第2の流体を含み、前記第1の流体が、前記第2の流体と非混和である、項目1〜11のいずれか一項に記載の方法。
(項目13)
第1の流体及び第2の流体を含む溶液を撹拌することによって多分散液滴のエマルションを形成することを含み、前記第1の流体が、前記第2の流体と非混和である、項目1〜12のいずれか一項に記載の方法。
(項目14)
第2の流体と非混和である第1の流体及び前記第2の流体を含む溶液を撹拌することによって多分散液滴のエマルションを形成することと、
前記エマルションを前記第2の流体と非混和である第3の流体中で撹拌し、それにより二重エマルションを形成することと、を含む、項目1〜12のいずれか一項に記載の方法。
(項目15)
前記撹拌することが、振とう、ボルテックス、超音波処理、磁石による混合、押出、フローフォーカス、またはこれらの組み合わせから選択される、項目13または14に記載の方法。
(項目16)
前記撹拌することが、エマルションを形成するのに十分である、項目15に記載の方法。
(項目17)
前記押出が、前記流体のピペッティングを含み、前記ピペッティングが、エマルションを産出するのに十分である、項目16に記載の方法。
(項目18)
前記撹拌することが、マイクロ流体デバイス中で起きる、項目13〜16のいずれか一項に記載の方法。
(項目19)
前記撹拌することが、ボルテックスを含む、項目13または14に記載の方法。
(項目20)
前記エマルションが、水相及び非水相を含む、項目13〜19のいずれか一項に記載の方法。
(項目21)
前記第1の流体が水を含み、前記第2の流体が油を含む、項目12〜20のいずれか一項に記載の方法。
(項目22)
前記第1の流体が水を含み、前記第2の流体が油を含み、前記第3の流体が水を含む、項目14に記載の方法。
(項目23)
前記複数の多分散液滴が、複数のエマルションを含む、項目1〜22のいずれか一項に記載の方法。
(項目24)
前記複数のエマルションが、3つ以上の非混和性流体を組み合わせることによって調製される、項目23に記載の方法。
(項目25)
前記第1の流体が水性である、項目12〜24のいずれか一項に記載の方法。
(項目26)
前記第1の流体が前記試料を含む、項目25に記載の方法。
(項目27)
前記第2の流体が油である、項目12〜26のいずれか一項に記載の方法。
(項目28)
前記第2の流体が油であり、前記第2の流体が前記第1の流体及び前記第3の流体と非混和である、項目14〜26のいずれか一項に記載の方法。
(項目29)
前記第1の流体が、前記第3の流体とは異なる、項目14〜28のいずれか一項に記載の方法。
(項目30)
前記第3の流体が油であり、前記第3の流体が前記第1の流体及び前記第2の流体と非混和である、項目14〜29のいずれか一項に記載の方法。
(項目31)
前記複数の多分散液滴が、流体界面修飾要素を更に含む、項目1〜30のいずれか一項に記載の方法。
(項目32)
前記流体界面修飾要素が、界面活性剤である、項目31に記載の方法。
(項目33)
前記流体界面修飾要素が、脂質、リン脂質、糖脂質、タンパク質、ペプチド、ナノ粒子、ポリマー、沈殿剤、微粒子、疎水性部分と親水性部分とを持つ分子、またはこれらの組み合わせから選択される、項目31〜32のいずれか一項に記載の方法。
(項目34)
前記非混和性流体のうちの1つ以上をゲルまたは固体に変換することを更に含む、項目1〜33のいずれか一項に記載の方法。
(項目35)
前記非混和性流体が、前記試料を増幅する前、前記試料を増幅する間、または前記試料を増幅した後に、ゲルまたは固体に変換される、項目34に記載の方法
(項目36)
前記検出可能な薬剤が、蛍光性または発光性である、項目1〜35のいずれか一項に記載の方法。
(項目37)
前記検出可能な薬剤が、フルオレセイン、フルオレセインの誘導体、ローダミン、ローダミンの誘導体、または半導体ポリマーである、項目1〜36のいずれか一項に記載の方法。
(項目38)
前記試料がヌクレオチドを含む、項目1〜37のいずれか一項に記載の方法。
(項目39)
前記試料を増幅することが、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、ローリングサークル増幅(RCA)、核酸配列ベース増幅(NASBA)、ループ媒介増幅(LAMP)、またはこれらの組み合わせを行うことを含む、項目1〜38のいずれか一項に記載の方法。
(項目40)
前記試料を増幅することが、ヌクレオチドの等温増幅、またはヌクレオチドの可変温度増幅を含む、項目1〜39のいずれか一項に記載の方法。
(項目41)
液滴径の分布が、液滴中央径の1000%超、500%超、100%超、50%超、30%超、20%超、15%超、10%超、9%超、8%超、7%超、6%超、または5%超の標準偏差を有する、項目1〜40のいずれか一項に記載の方法。
(項目42)
前記液滴径の分布が、液滴平均径の1000%超、500%超、100%超、50%超、30%超、20%超、15%超、10%超、9%超、8%超、7%超、6%超、または5%超の標準偏差を有する、項目1〜40のいずれか一項に記載の方法。
(項目43)
前記多分散液滴における体積が、2倍超で、10倍超で、100倍超で、1000倍超で、10000倍超で、100000倍超で、1000000倍超で、約2倍超で、約10倍超で、約100倍超で、約1000倍超で、約10000倍超で、約100000倍超で、または1000000倍超で、変化する、項目1〜40のいずれか一項に記載の方法。
(項目44)
前記多分散液滴が、100ナノリットル(nL)〜1フェムトリットル(fL)、10nL〜10fL、1nL〜100fL、100nL〜1pL、10nL〜10pL、または1nL〜1pL、約500pL〜約50fL、約100pL〜約100fLの体積分布を有する、項目1〜43のいずれか一項に記載の方法。
(項目45)
前記多分散液滴の平均体積が、前記試料の増幅中に、50%未満、40%未満、35%未満、30%未満、25%未満、20%未満、15%未満、10%未満、5%未満、4%未満、3%未満、2%未満、または1%未満変化する、項目1〜44のいずれか一項に記載の方法。
(項目46)
前記試料を増幅することが、第1の増幅サイクルを含み、前記多分散液滴の50%未満、45%未満、40%未満、35%未満、30%未満、25%未満、20%未満、19%未満、18%未満、17%未満、16%未満、15%未満、14%未満、13%未満、12%未満、11%未満、10%未満、9%未満、8%未満、7%未満、6%未満、5%未満、4%未満、3%未満、2%未満、または1%未満が、前記第1の増幅サイクル後に融合する、項目1〜45のいずれか一項に記載の方法。
(項目47)
前記第1の流体の屈折率が、前記第2の流体の屈折率と、200%未満、100%未満、60%未満、50%未満、45%未満、40%未満、35%未満、30%未満、25%未満、20%未満、19%未満、18%未満、17%未満、16%未満、15%未満、14%未満、13%未満、12%未満、11%未満、10%未満、9%未満、8%未満、7%未満、6%未満、5%未満、4%未満、3%未満、2%未満、または1%未満異なる、項目12〜46のいずれか一項に記載の方法。
(項目48)
デジタルアッセイを行うための方法であって、
少なくともいくつかが試料を含む複数の多分散液滴を産出することと、
前記試料を増幅することと、
前記試料を検出可能な薬剤で標識することと、
前記複数の多分散液滴を、フローサイトメトリーチャネルを通して流すことと、
前記液滴の体積を、前記液滴が前記フローサイトメトリーチャネルを通して流れるときに決定することと、
前記液滴中の前記検出可能な薬剤の有無を決定することと、
前記複数の液滴中の前記試料の濃度を、前記複数の多分散液滴中の前記検出可能な薬剤の有無に基づいて決定することと、を含む、前記方法。
(項目49)
前記試料の前記濃度を決定することが、前記液滴からの散乱光を検出することを含む、項目48に記載の方法。
(項目50)
デジタルアッセイを行うための組成物であって、
第1の流体と、
第2の流体であって、前記第1の流体及び前記第2の流体が、互いに非混和であり、撹拌時にエマルションを形成することができる、第2の流体と、
界面活性剤と、
増幅試薬と、を含む、前記組成物。
(項目51)
試料を更に含む、項目50に記載の組成物。
(項目52)
前記試料がヌクレオチドである、項目51に記載の組成物。
(項目53)
検出可能な薬剤を更に含み、前記検出可能な薬剤が、試料を標識することができる、項目50〜52のいずれか一項に記載の組成物。
(項目54)
前記試料が、検出可能な薬剤で標識される、項目51〜53のいずれか一項に記載の組成物。
(項目55)
核酸試料に結合することができる検出可能な薬剤を更に含む、項目50に記載の組成物。
(項目56)
前記増幅試薬が、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)試薬、ローリングサークル増幅(RCA)試薬、核酸配列ベース増幅(NASBA)試薬、ループ媒介増幅(LAMP)試薬、またはこれらの組み合わせから選択される、項目50〜55のいずれか一項に記載の組成物。
(項目57)
前記増幅試薬がPCR試薬である、項目50に記載の組成物。
(項目58)
前記PCR試薬が、熱安定性DNAポリメラーゼ、ヌクレオチド、プライマー、プローブ、またはこれらの組み合わせから選択される、項目57に記載の組成物。
(項目59)
第3の流体を更に含み、前記第3の流体が前記第2の流体と非混和である、項目50〜58のいずれか一項に記載の組成物。
(項目60)
前記組成物が、二重エマルションを形成することができる、項目59に記載の組成物。
(項目61)
前記第1の流体が水性である、項目50〜60のいずれか一項に記載の組成物。
(項目62)
前記第1の流体が前記増幅試薬を含む、項目50〜61のいずれか一項に記載の組成物。
(項目63)
前記第2の流体が油である、項目50〜62のいずれか一項に記載の組成物。
(項目64)
前記第2の流体が油であり、前記第2の流体が前記第1の流体及び前記第3の流体と非混和である、項目59〜63のいずれか一項に記載の組成物。
(項目65)
前記第1の流体が、前記第3の流体とは異なる、項目59〜64のいずれか一項に記載の組成物。
(項目66)
前記第3の流体が油であり、前記第3の流体が前記第1の流体及び前記第2の流体と非混和である、項目59〜65のいずれか一項に記載の組成物。
(項目67)
流体界面修飾要素を更に含む、項目50〜66のいずれか一項に記載の組成物。
(項目68)
前記流体界面修飾要素が、界面活性剤を含む、項目67に記載の組成物。
(項目69)
前記流体界面修飾要素が、脂質、リン脂質、糖脂質、タンパク質、ペプチド、ナノ粒子、ポリマー、沈殿剤、微粒子、疎水性部分と親水性部分とを持つ分子、またはこれらの組み合わせから選択される、項目67〜68のいずれか一項に記載の組成物。
(項目70)
前記非混和性流体のうちの1つ以上をゲルまたは固体に変換することができる固化剤またはゲル化剤を更に含む、項目50〜69のいずれか一項に記載の組成物。
(項目71)
項目50〜70のいずれか一項に記載の組成物を含む、デジタルアッセイを行うためのキット。
(項目72)
少なくとも1つの液滴の体積を決定するためのシステムであって、
前記少なくとも1つの液滴を保持するように構成された容器と、
前記容器中の前記少なくとも1つの液滴の画像を取得するように構成された撮像ソースと、
前記撮像ソースを操作するように構成されたコンピューティングデバイスであって、前記コンピューティングデバイスが、プロセッサ及び非一時的有形コンピュータ可読記憶媒体を含み、前記記憶媒体が、前記プロセッサによって実行されるときに、(i)前記撮像ソースに、前記少なくとも1つの液滴の画像スタックを取得させ、(ii)前記プロセッサに、前記試料中の前記少なくとも1つの液滴の体積を前記取得された画像スタックに基づいて決定させる1組の命令を記憶する、コンピューティングデバイスと、を備えるシステム。
(項目73)
前記少なくとも1つの液滴が、複数の液滴を含む、項目72に記載のシステム。
(項目74)
前記複数の液滴が、多分散性である、項目73に記載のシステム。
(項目75)
前記容器が、マルチウェルプレートを含む、項目72に記載のシステム。
(項目76)
前記撮像ソースが、光学撮像ソースを含む、項目72に記載のシステム。
(項目77)
前記光学撮像ソースが、共焦点顕微鏡法、ライン共焦点顕微鏡法、デコンボリューション顕微鏡法、スピニングディスク顕微鏡法、多光子顕微鏡法、平面照明顕微鏡法、ベッセルビーム顕微鏡法、微分干渉顕微鏡法、位相差顕微鏡法、落射蛍光顕微法、明視野撮像法、暗視野撮像法、斜照法、またはこれらの組み合わせを行うように構成される、項目76に記載のシステム。
(項目78)
前記液滴に対する前記画像スタックが、前記少なくとも1つの液滴を通した別々の焦点深度から撮られた複数の画像を含む、項目72に記載のシステム。
(項目79)
前記画像スタックが、前記少なくとも1つの液滴について別々の焦点深度から撮られた、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、または100枚の画像を含む、項目78に記載のシステム。
(項目80)
前記1組の命令が、前記プロセッサによって実行されるときに、前記プロセッサに、(i)前記画像スタックの個々の画像における少なくとも1つの画素セットを特定することと、(ii)前記少なくとも1つの画素セットを、前記少なくとも1つの液滴の少なくとも一部に対応するものとして特定することと、(iii)少なくとも1つの個々の液滴を、前記対応に基づいて、前記少なくとも1つの画素セットから特定することと、(iv)前記特定された少なくとも1つの個々の液滴の体積を、前記少なくとも1つの画素セットに基づいて決定することと、によって、前記少なくとも1つの液滴の体積を決定させる、項目72に記載のシステム。
(項目81)
前記少なくとも1つの液滴の前記少なくとも一部が、単一の液滴、複数の液滴の部分、単一の全液滴、複数の全液滴、またはこれらの組み合わせを含む、項目80に記載のシステム。
(項目82)
前記1組の命令が、前記プロセッサによって実行されるきに、前記プロセッサに、前記取得した画像スタックに基づいて、複数の液滴の複数の体積を決定させる、項目72に記載のシステム。
(項目83)
前記1組の命令が、前記プロセッサによって実行されるきに、更に、前記プロセッサに、前記複数の液滴の少なくともいくつかにおける検出可能な薬剤の有無を決定させる、項目82に記載のシステム。
(項目84)
前記1組の命令が、前記プロセッサによって実行されるときに、更に、前記プロセッサに、前記複数の液滴中の試料の濃度を、前記複数の液滴中の前記検出可能な薬剤の有無、及び前記複数の液滴の決定された複数の体積に基づいて、決定させる、項目83に記載のシステム。
(項目85)
前記試料がヌクレオチドを含む、項目84に記載のシステム。
(項目86)
前記検出可能な薬剤が、蛍光性または発光性である、項目83に記載のシステム。
(項目87)
前記検出可能な薬剤が、フルオレセイン、フルオレセインの誘導体、ローダミン、ローダミンの誘導体、または半導体ポリマーを含む、項目83に記載のシステム。
(項目88)
前記少なくとも1つの液滴が、ヌクレオチドを含む試料を含む、項目72に記載のシステム。
(項目89)
前記少なくとも1つの液滴中の前記試料が増幅されている、項目88に記載のシステム。
(項目90)
前記少なくとも1つの液滴中の前記試料が、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、デジタルポリメラーゼ連鎖反応(dPCR)、ローリングサークル増幅(RCA)、核酸配列ベース増幅(NASBA)、ループ媒介増幅(LAMP)、またはこれらの組み合わせを行うことによって増幅される、項目89に記載のシステム。
(項目91)
前記試料が、ヌクレオチドの等温増幅、またはヌクレオチドの可変温度増幅によって増幅される、項目90に記載のシステム。
(項目92)
前記1組の命令が、前記プロセッサによって実行されるときに、前記検出可能な薬剤の濃度を、少なくとも3桁のダイナミックレンジに渡って、または少なくとも6桁のダイナミックレンジに渡って決定されるようにする、項目91に記載の方法。
(項目93)
液滴の体積を決定するための方法であって、
前記液滴の画像スタックを取得することと、
前記画像スタックの個々の画像における少なくとも1つの画素セットを特定することと、
前記少なくとも1つの画素セットを、少なくとも1つの液滴の少なくとも一部に対応するものとして特定することと、
少なくとも1つの個々の液滴を、前記対応に基づいて、前記少なくとも1つの画素セットから特定することと、
前記特定された少なくとも1つの個々の液滴の体積を、前記少なくとも1つの画素セットに基づいて決定することと、を含む、前記方法。
(項目94)
前記少なくとも1つの液滴の前記少なくとも一部が、単一の液滴、複数の液滴の部分、全液滴、複数の全液滴、またはこれらの組み合わせを含む、項目93に記載の方法。
(項目95)
前記液滴の前記画像スタックを取得することが、前記液滴を通した別々の焦点深度から撮られた複数の画像を取得することを含む、項目93に記載の方法。
(項目96)
2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、または100枚の画像が、前記液滴について別々の焦点深度から撮られる、項目94に記載の方法。
(項目97)
前記特定された少なくとも1つの液滴の体積を決定することが、前記特定された少なくとも1つの液滴の直径を決定することを含む、項目93に記載の方法。
(項目98)
前記特定された少なくとも1つの液滴の直径を決定することが、
(i)前記特定された少なくとも1つの液滴を前記画像スタックの複数の画像間で相関させ、前記複数の画像における前記特定された少なくとも1つの液滴の最大径を測定すること、
(ii)曲線を前記特定された少なくとも1つの液滴の境界に適合させ、前記特定された少なくとも1つの液滴の直径を、前記適合させた曲線に基づいて補間すること、
(iii)前記特定された少なくとも1つの液滴を前記画像スタックの複数の画像間で相関させ、各画像における前記特定された少なくとも1つの液滴の直径を決定し、前記特定された少なくとも1つの液滴の直径を、前記画像スタックの前記複数の画像におけるその直径から決定すること、または
(iv)前記特定された少なくとも1つの液滴を前記画像スタックの複数の画像間で相関させ、各画像における前記特定された少なくとも1つの液滴の直径を決定し、前記特定された少なくとも1つの液滴の直径を、前記画像スタックの前記複数の画像におけるその直径、及び前記複数の画像間の画像深度の差異から決定すること、のうちの少なくとも1つを含む、項目97に記載の方法。
(項目99)
複数の液滴の体積を決定することを更に含む、項目93に記載の方法。
(項目100)
前記複数の液滴中の検出可能な薬剤の有無を、前記画像スタックから決定することを更に含む、項目99に記載の方法。
(項目101)
前記複数の液滴中の試料の濃度を、前記複数の液滴中の前記検出可能な薬剤の有無、及び前記決定された複数の液滴の体積に基づいて、決定することを更に含む、項目100に記載の方法。
(項目102)
前記試料がヌクレオチドを含む、項目101に記載の方法。
(項目103)
前記複数の液滴中の前記試料を増幅することを更に含む、項目101に記載の方法。
(項目104)
前記試料を増幅することが、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、ローリングサークル増幅(RCA)、核酸配列ベース増幅(NASBA)、ループ媒介増幅(LAMP)、またはこれらの組み合わせを行うことを含む、項目103に記載の方法。
(項目105)
前記試料を増幅することが、ヌクレオチドの等温増幅、またはヌクレオチドの可変温度増幅を含む、項目103に記載の方法。
(項目106)
前記検出可能な薬剤の濃度が、少なくとも3桁のダイナミックレンジに渡って、または少なくとも6桁のダイナミックレンジに渡って決定される、項目100に記載の方法。
(項目107)
前記検出可能な薬剤が、蛍光性または発光性である、項目100に記載の方法。
(項目108)
前記検出可能な薬剤が、フルオレセイン、フルオレセインの誘導体、ローダミン、ローダミンの誘導体、または半導体ポリマーを含む、項目100に記載の方法。
(項目109)
前記画像スタックを取得することが、光学撮像を含む、項目93に記載の方法。
(項目110)
前記光学撮像が、共焦点顕微鏡法、ライン共焦点顕微鏡法、デコンボリューション顕微鏡法、スピニングディスク顕微鏡法、多光子顕微鏡法、平面照明顕微鏡法、ベッセルビーム顕微鏡法、微分干渉顕微鏡法、位相差顕微鏡法、落射蛍光顕微法、明視野撮像法、暗視野撮像法、斜照法、またはこれらの組み合わせによって行われる、項目109に記載の方法。
(項目111)
前記少なくとも1つの液滴の前記画像スタックを取得することが、複数の多分散液滴に対する前記画像スタックを取得することを含む、項目93に記載の方法。
(項目112)
前記複数の多分散液滴が、第1の流体及び第2の流体を含み、前記第1の流体が、前記第2の流体と非混和である、項目111に記載の方法。
(項目113)
第1の流体及び第2の流体を含む溶液を撹拌することによって多分散液滴のエマルションを形成することを更に含み、前記第1の流体が、前記第2の流体と非混和である、項目111に記載の方法。
(項目114)
前記画像スタックを取得することが、前記形成されたエマルションを撮像することを含む、項目113に記載の方法。
(項目115)
前記第1の流体が水を含み、前記第2の流体が油を含む、項目113に記載の方法。
(項目116)
前記第2の流体と非混和である第1の流体及び第2の流体を含む溶液を撹拌することによって多分散液滴のエマルションを形成することと、
前記エマルションを前記第2の流体と非混和である第3の流体中で撹拌し、、それにより二重エマルションを形成することと、を更に含む、項目111に記載の方法。
(項目117)
前記第1の流体が水を含み、前記第2の流体が油を含み、前記第3の流体が水を含む、項目116に記載の方法。
(項目118)
前記撹拌することが、振とう、ボルテックス、超音波処理、磁石による混合、押出、フローフォーカス、またはこれらの組み合わせから選択される、項目113または116に記載の方法。
(項目119)
前記撹拌することが、エマルションを形成するのに十分である、項目118に記載の方法。
(項目120)
前記押出が、前記流体のピペッティングを含み、前記ピペッティングが、エマルションを産出するのに十分である、項目119に記載の方法。
(項目121)
前記撹拌することが、マイクロ流体デバイス中で起きる、項目116〜118のいずれか一項に記載の方法。
(項目122)
前記エマルションが、水相及び非水相を含む、項目113または116に記載の方法。
(項目123)
前記多分散液滴が、複数のエマルションを含む、項目113または116に記載の方法。
(項目124)
前記多分散液滴が、複数のエマルションを含む、項目111に記載の方法。
(項目125)
前記複数のエマルションが、3つ以上の非混和性流体を組み合わせることによって調製される、項目124に記載の方法。
(項目126)
前記3つ以上の非混和性流体が、第1の流体、第2の流体、及び第3の流体を含む、項目125に記載の方法。
(項目127)
前記第1の流体が水性である、項目126に記載の方法。
(項目128)
前記第2の流体が油である、項目127に記載の方法。
(項目129)
前記第2の流体が前記第1の流体及び前記第3の流体と非混和である、項目127に記載の方法。
(項目130)
前記非混和性の第1、第2、または第3の流体のうちの少なくとも1つを、ゲルまたは固体に変換することを更に含む、項目127に記載の方法。
(項目131)
前記第1の流体が、前記第3の流体とは異なる、項目126に記載の方法。
(項目132)
前記第3の流体が油であり、前記第3の流体が前記第1の流体及び前記第2の流体と非混和である、項目126に記載の方法。
(項目133)
前記非混和性の第3の流体を固体またはゲルに変換することを更に含む、項目132に記載の方法。
(項目134)
前記第1の流体が、検出のための試料を含む、項目126に記載の方法。
(項目135)
前記第1の流体の屈折率が、前記第2の流体の屈折率と、200%未満、100%未満、60%未満、50%未満、45%未満、40%未満、35%未満、30%未満、25%未満、20%未満、19%未満、18%未満、17%未満、16%未満、15%未満、14%未満、13%未満、12%未満、11%未満、10%未満、9%未満、8%未満、7%未満、6%未満、5%未満、4%未満、3%未満、2%未満、または1%未満異なる、項目126に記載の方法。
(項目136)
前記複数の多分散液滴が、流体界面修飾要素を更に含む、項目111に記載の方法。
(項目137)
前記流体界面修飾要素が、界面活性剤を含む、項目136に記載の方法。
(項目138)
前記流体界面修飾要素が、脂質、リン脂質、糖脂質、タンパク質、ペプチド、ナノ粒子、ポリマー、沈殿剤、微粒子、疎水性部分と親水性部分とを持つ分子、またはこれらの組み合わせのうちの少なくとも1つを含む、項目136に記載の方法。
(項目139)
液滴径の分布が、液滴中央径の1000%超、500%超、100%超、50%超、30%超、20%超、15%超、10%超、9%超、8%超、7%超、6%超、または5%超の標準偏差を有する、項目111に記載の方法。
(項目140)
液滴径の分布が、液滴平均径の1000%超、500%超、100%超、50%超、30%超、20%超、15%超、10%超、9%超、8%超、7%超、6%超、または5%超の標準偏差を有する、項目111に記載の方法。
(項目141)
前記多分散液滴における体積が、2倍超で、10倍超で、100倍超で、1000倍超で、10000倍超で、100000倍超で、1000000倍超で、約2倍超で、約10倍超で、約100倍超で、約1000倍超で、約10000倍超で、約100000倍超で、または1000000倍超で、変化する、項目111に記載の方法。
(項目142)
前記多分散液滴が、100ナノリットル(nL)〜1フェムトリットル(fL)、10nL〜10fL、1nL〜100fL、100nL〜1pL、10nL〜10pL、または1nL〜1pL、約500pL〜約50fL、約100pL〜約100fLの体積分布を有する、項目111に記載の方法。
(項目143)
試料を前記複数の多分散液滴における検出のために増幅することを更に含む、項目111に記載の方法。
(項目144)
前記多分散液滴の平均体積が、前記試料の増幅中に、50%未満、40%未満、35%未満、30%未満、25%未満、20%未満、15%未満、10%未満、5%未満、4%未満、3%未満、2%未満、または1%未満変化する、項目143に記載の方法。
(項目145)
前記試料を増幅することが、第1の増幅サイクルを含み、前記多分散液滴の50%未満、45%未満、40%未満、35%未満、30%未満、25%未満、20%未満、19%未満、18%未満、17%未満、16%未満、15%未満、14%未満、13%未満、12%未満、11%未満、10%未満、9%未満、8%未満、7%未満、6%未満、5%未満、4%未満、3%未満、2%未満、または1%未満が、前記第1の増幅サイクル後に融合する、項目143に記載の方法。
(項目146)
前記画像スタックの前記個々の画像中の前記少なくとも1つの画素セットを特定することが、前記個々の画像内で複数のスキャンを取得することと、閾値レベルを設定することと、前記閾値レベル外の前記複数のスキャン中のエリアを前記画素セットとして特定することと、を含む、項目93に記載の方法。
(項目147)
前記少なくとも1つの画素セットを、少なくとも1つの液滴の少なくとも一部に対応するものとして特定することが、前記少なくとも1つの画素セットのアスペクト比を決定することを含む、項目93に記載の方法。
(項目148)
前記少なくとも1つの画素セットが、前記少なくとも1つの画素セットの前記アスペクト比が閾値以下であるときに、少なくとも1つの液滴の少なくとも一部に対応するものとして特定される、項目147に記載の方法。
(項目149)
前記閾値が、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、または2である、項目148に記載の方法。
(項目150)
前記閾値が、前記試料の少なくとも一部を含まない液滴を除外するのに十分である、項目148に記載の方法。
(項目151)
前記画素セットを少なくとも1つの液滴の少なくとも一部に対応するものとして特定することが、リバースウォーターシェッド法を行うことを含む、項目93に記載の方法。
(項目152)
前記リバースウォーターシェッド法を行うことが、
前記画像スタックの前記個々の画像の画素強度に基づいて、マップを生成することと、
前記マップ中の1つ以上の画素セットを特定することと、
個々の画素セットを目的領域として特定することと、
前記目的領域の境界を少なくとも1つの最良適合の円と適合させることと、を含む、項目151に記載の方法。
(項目153)
前記少なくとも1つの最良適合の円を少なくとも1つの液滴として特定することを更に含む、項目152に記載の方法。
(項目154)
前記画像スタックの前記個々の画像を、前記マップを生成する前に平滑化することを更に含む、項目152に記載の方法。
(項目155)
前記画像スタックの前記個々の画像の画素強度に基づいて生成された前記マップが、位相マップを含む、項目152に記載の方法。
(項目156)
前記1つ以上の画素セットを特定することが、個々の画素が、前記個々の画素の前記画素強度及び1つ以上の閾値に基づいて、背景画素を含むか、または液滴画素を含むかを決定することを含む、項目152に記載の方法。
(項目157)
前記個々の画素セットが必要最低限のエリアを上回るエリアを有するときに、前記個々の画素セットが目的領域として特定される、項目152に記載の方法。
(項目158)
前記個々の画素セットが複数の目的領域を含むか否かを決定することと、前記複数の目的領域を単一の目的領域へと組み合わせることと、を更に含む、項目152に記載の方法。
(項目159)
前記画素セットを少なくとも1つの液滴の少なくとも一部として特定することが、円検出法を行うことを含む、項目93に記載の方法。
(項目160)
前記円検出法を行うことが、
閾値外の前記画像スタックの前記個々の画像の1つ以上のエリアを特定することと、
複数の円を前記特定された1つ以上のエリア上に重ね合わせることと、
前記重ね合わせた複数の円のうちの1つ以上の円を、前記1つ以上の円が少なくとも1つの所定の基準を満たさないときに拒否することと、
1つ以上の残りの円を、少なくとも1つの液滴の前記少なくとも一部に対応するものとして特定することと、を含む、項目159に記載の方法。
(項目161)
前記少なくとも1つの画素セットを少なくとも1つの液滴の少なくとも一部に対応するものとして特定することが、リバースウォーターシェッド及び円検出複合法を行うことを含む、項目93に記載の方法。
(項目162)
前記リバースウォーターシェッド及び円検出複合法を行うことが、
前記画像スタックの前記個々の画像の画素強度に基づいて、マップを生成することと、
前記生成されたマップ中の1つ以上の画素セットを特定することと、
個々の画素を目的領域として特定することと、
複数の円を前記目的領域上に重ね合わせることと、
前記重ね合わせた複数の円のうちの1つ以上の円を、前記1つ以上の円が少なくとも1つの所定の基準を満たさないときに拒否することと、
1つ以上の残りの円を、少なくとも1つの液滴の前記少なくとも一部に対応するものとして特定することと、を含む、項目161に記載の方法。
(項目163)
前記画像スタックの前記個々の画像を、前記マップを生成する前に平滑化することを更に含む、項目162に記載の方法。
(項目164)
前記画像スタックの前記個々の画像の画素強度に基づいて生成された前記マップが、位相マップを含む、項目162に記載の方法。
(項目165)
前記1つ以上の画素セットを特定することが、個々の画素を、前記個々の画素の前記画素強度及び1つ以上の閾値に基づいて、背景画素または液滴画素として特定することを含む、項目162に記載の方法。
(項目166)
前記個々の画素セットが必要最低限のエリアを上回るエリアを有する場合に、前記個々の画素セットが目的領域を含むことが決定される、項目162に記載の方法。
(項目167)
前記少なくとも1つの所定の基準が、(i)前記目的領域の外部境界画素の最大部分を含む1つ以上の円を選択すること、(ii)前記目的領域のエリアの最大部分を含む1つ以上の円を選択すること、(iii)前記目的領域とは異なる画素グループからの画素を含む1つ以上の円を拒否すること、(iv)実質的な複数のグループ外の画素を含む1つ以上の円を拒否すること、または(v)円の円周の実質的な一部が前記画素グループの内部にある、1つ以上の円を判別すること、のうちの1つ以上を含む、項目162に記載の方法。
(項目168)
前記1つ以上の円を拒否することが、前記複数の対で重なり合った円を検査することを含む、項目162に記載の方法。
(項目169)
前記検査した円が、第1の円及び第2の円を含み、前記第1の円または第2の円のうちの1つを、票に基づいて拒否することを更に含む、項目168に記載の方法。
(項目170)
前記票が、ユーザによって定義される、項目169に記載の方法。
(項目171)
前記1つ以上の残りの円を少なくとも1つの液滴の前記少なくとも一部に対応するものとして特定することが、前記1つ以上の残りの円を少なくとも1つの液滴の前記少なくとも一部に割り当てることを含む、項目162に記載の方法。
(項目172)
前記1つ以上の円が、(i)前記目的領域を、少なくとも1つの液滴に対する最良の適合度統計を持つ円を有する前記少なくとも1つの液滴に割り当てること、または(ii)前記目的領域を、エリアにおける前記1つ以上の円との最大の重複を有する前記少なくとも1つの液滴に割り当てること、のうちの1つ以上に基づいて、前記少なくとも1つの液滴に割り当てられる、項目171に記載の方法。
(項目173)
前記特定された少なくとも1つの個々の液滴の体積を前記少なくとも1つの画素セットに基づいて決定することが、前記1つ以上の特定された円の1つ以上の直径を前記特定された少なくとも1つの個々の液滴に対応するものとして決定することを含む、項目162に記載の方法。
(項目174)
デジタルアッセイを行うためのシステムであって、
複数の多分散液滴を保持するように構成された容器であって、前記液滴の少なくともいくつかが、検出可能な薬剤で標識された試料を含む、容器と、
前記容器中に保持された前記複数の多分散液滴の画像スタックを取得するように構成された撮像ソースと、
前記撮像ソースを操作するように構成されたコンピューティングデバイスであって、プロセッサ及び非一時的有形コンピュータ可読記憶媒体を含み、前記記憶媒体が、前記プロセッサによって実行されるときに、
(i)前記撮像ソースに、前記容器中に保持された前記複数の多分散液滴の前記画像スタックを取得させ、
(ii)前記プロセッサに、前記複数の多分散液滴の体積を前記取得した画像スタックに基づいて決定させ、
(iii)前記プロセッサに、前記複数の多分散液滴中の前記検出可能な薬剤の有無を決定させ、
(iv)前記プロセッサに、前記複数の液滴中の前記試料の濃度を、前記複数の多分散液滴中の前記検出可能な薬剤の有無、及び前記複数の多分散液滴の体積に基づいて決定させる1組の命令を記憶する、コンピューティングデバイスと、を備える、システム。
(項目175)
前記容器が、マルチウェルプレートを含む、項目174に記載のシステム。
(項目176)
前記撮像ソースが、光学撮像ソースを含む、項目174に記載のシステム。
(項目177)
前記光学撮像ソースが、共焦点顕微鏡法、ライン共焦点顕微鏡法、デコンボリューション顕微鏡法、スピニングディスク顕微鏡法、多光子顕微鏡法、平面照明顕微鏡法、ベッセルビーム顕微鏡法、微分干渉顕微鏡法、位相差顕微鏡法、落射蛍光顕微法、明視野撮像法、暗視野撮像法、斜照法、またはこれらの組み合わせのうちの1つ以上を行うように構成される、項目176に記載のシステム。
(項目178)
前記取得された画像スタックが、単一の液滴を通した別々の焦点深度から撮られた複数の画像を含む、項目174に記載のシステム。
(項目179)
前記画像スタックが、前記単一の液滴について別々の焦点深度から撮られた、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、または100枚の画像を含む、項目178に記載のシステム。
(項目180)
前記1組の命令が、前記プロセッサによって実行されるときに、前記プロセッサに、(i)前記画像スタックの少なくとも1つの個々の画像における少なくとも1つの画素セットを特定することと、(ii)前記少なくとも1つの画素セットを、少なくとも1つの液滴の少なくとも一部に対応するものとして特定することと、(iii)少なくとも1つの個々の液滴を、前記対応に基づいて特定することと、(iv)前記特定された少なくとも1つの個々の液滴の体積を、前記少なくとも1つの画素セットに基づいて決定することと、によって、前記複数の多分散液滴の体積を決定させる、項目174に記載のシステム。
(項目181)
少なくとも1つの液滴の前記少なくとも一部が、単一の液滴、複数の液滴の部分、全液滴、複数の全液滴、またはこれらの組み合わせを含む、項目180に記載のシステム。
(項目182)
前記試料がヌクレオチドを含む、項目175に記載のシステム。
(項目183)
前記試料が増幅されている、項目175に記載のシステム。
(項目184)
前記検出可能な薬剤が、蛍光性または発光性である、項目175に記載のシステム。
(項目185)
前記複数の多分散液滴が、第1の流体及び第2の流体を含み、前記第1の流体が、前記第2の流体と非混和である、項目174に記載のシステム。
(項目186)
前記光学撮像が補償光学によって行われる、項目1〜47または109〜110のいずれか一項に記載の方法。
(項目187)
前記光学撮像ソースが補償光学撮像ソースである、項目76〜77または176〜177のいずれか一項に記載のシステム。
(項目188)
液滴の体積を、前記液滴が試料を含む場合にのみ測定することを含む、項目1〜49、92〜173、または186のいずれか一項に記載の方法。
(項目189)
前記試料を含まないと決定されたあらゆる液滴を測定から除外することを含む、項目188に記載の方法。
Claims (44)
- デジタルアッセイを行うための方法であって、
複数の多分散液滴であって、前記液滴の少なくともいくつかが標的分子を含む、液滴を産出することと、
前記標的分子を増幅して増幅産物を産出することと、
前記増幅産物を検出可能な薬剤と関連させることと、
液滴についての画像スタックであって、前記液滴を通した別々の焦点深度から撮られた複数の画像を含む、画像スタックを取得することと、
前記画像スタックの画像から前記液滴の体積を決定することと、
前記液滴中の前記検出可能な薬剤の有無を決定することと、
前記複数の液滴中の前記標的分子の濃度を、前記複数の液滴中の前記検出可能な薬剤及び前記増幅産物の有無、及び前記液滴の体積に基づいて決定することと、を含む、方法。 - 前記画像スタックを取得すること及び前記検出可能な薬剤の有無を決定することのうちの少なくとも1つが、共焦点顕微鏡法、ライン共焦点顕微鏡法、デコンボリューション顕微鏡法、スピニングディスク顕微鏡法、多光子顕微鏡法、平面照明顕微鏡法、ベッセルビーム顕微鏡法、微分干渉顕微鏡法、位相差顕微鏡法、落射蛍光顕微法、明視野撮像法、暗視野撮像法、斜照法、またはこれらの組み合わせによって行われる光学撮像を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記方法が、前記複数の液滴に対して同時に行われる、請求項1〜2のいずれか一項に記載の方法。
- 前記液滴の体積が、ラインスキャン法、シンプルバウンダリ法、リバースウォーターシェッド法、円検出法、リバースウォーターシェッド及び円検出複合法、またはこれらの組み合わせによって、前記画像スタックから決定される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的分子の濃度が、少なくとも3桁のダイナミックレンジに渡って、または少なくとも6桁のダイナミックレンジに渡って決定される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の多分散液滴が、第1の流体及び第2の流体を含み、前記第1の流体が、前記第2の流体と非混和である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の多分散液滴が、界面活性剤、脂質、リン脂質、糖脂質、タンパク質、ペプチド、ナノ粒子、ポリマー、沈殿剤、微粒子、疎水性部分と親水性部分とを持つ分子、またはこれらの組み合わせから選択される流体界面修飾要素を更に含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記非混和性流体のうちの1つ以上をゲルまたは固体に変換することを更に含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法であって、前記非混和性流体が、増幅して増幅産物を産出する前、増幅して増幅産物を産出する間、または増幅して増幅産物を産出した後に、ゲルまたは固体に変換される、方法。
- 増幅して増幅産物を産出することが、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、ローリングサークル増幅(RCA)、核酸配列ベース増幅(NASBA)、ループ媒介増幅(LAMP)、またはこれらの組み合わせを行うことを含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 増幅して増幅産物を産出することが、ヌクレオチドの等温増幅、またはヌクレオチドの可変温度増幅を含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記多分散液滴における体積が、2倍超で、10倍超で、または100倍超で変化する、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記多分散液滴が、100ナノリットル(nL)〜1フェムトリットル(fL)、10nL〜10fL、1nL〜100fL、100nL〜1pL、10nL〜10pL、1nL〜1pL、500pL〜50fL、または100pL〜100fLの体積分布を有する、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的分子が試料中に存在する、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 標的分子を含む少なくとも1つの液滴の体積を決定するためのシステムであって、
前記少なくとも1つの液滴を保持するように構成された容器と、
前記容器中の前記少なくとも1つの液滴の画像を取得するように構成された撮像ソースと、
前記撮像ソースを操作するように構成されたコンピューティングデバイスであって、前記コンピューティングデバイスが、プロセッサ及び非一時的有形コンピュータ可読記憶媒体を含み、前記記憶媒体が、前記プロセッサによって実行されるときに、(i)前記撮像ソースに、前記少なくとも1つの液滴の画像スタックを取得させ、ここで、前記液滴の前記画像スタックが、前記少なくとも1つの液滴を通した別々の焦点深度から撮られた複数の画像を含み、(ii)前記プロセッサに、前記少なくとも1つの液滴の体積を前記取得された画像スタックの画像に基づいて決定させる1組の命令を記憶する、コンピューティングデバイスと、を備えるシステム。 - 前記撮像ソースが、共焦点顕微鏡法、ライン共焦点顕微鏡法、デコンボリューション顕微鏡法、スピニングディスク顕微鏡法、多光子顕微鏡法、平面照明顕微鏡法、ベッセルビーム顕微鏡法、微分干渉顕微鏡法、位相差顕微鏡法、落射蛍光顕微法、明視野撮像法、暗視野撮像法、斜照法、またはこれらの組み合わせを行うように構成される光学撮像ソースを含む、請求項14に記載のシステム。
- 前記1組の命令が、前記プロセッサによって実行されるときに、前記プロセッサに、(i)前記画像スタックの個々の画像における少なくとも1つの画素セットを特定することと、(ii)前記少なくとも1つの画素セットを、前記少なくとも1つの液滴の少なくとも一部に対応するものとして特定することであって、前記少なくとも1つの液滴の前記少なくとも一部が、単一の液滴、複数の液滴の部分、単一の全液滴、複数の全液滴、またはこれらの組み合わせを含む、ことと、(iii)少なくとも1つの個々の液滴を、前記対応に基づいて、前記少なくとも1つの画素セットから特定することと、(iv)前記特定された少なくとも1つの個々の液滴の体積を、前記少なくとも1つの画素セットに基づいて決定することと、によって、前記少なくとも1つの液滴の体積を決定させる、請求項14〜15のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記1組の命令が、前記プロセッサによって実行されるきに、前記プロセッサに、前記取得した画像スタックに基づいて、複数の液滴の複数の体積を決定させる、請求項14〜16のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記標的分子がヌクレオチドを含む、請求項14〜17のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記標的分子が、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、デジタルポリメラーゼ連鎖反応(dPCR)、ローリングサークル増幅(RCA)、核酸配列ベース増幅(NASBA)、ループ媒介増幅(LAMP)、またはこれらの組み合わせを行うことによって増幅され、増幅産物が産出されている、請求項18に記載のシステム。
- 増幅して増幅産物を産出することが、ヌクレオチドの等温増幅、またはヌクレオチドの可変温度増幅を含む、請求項18〜19のいずれか一項に記載のシステム。
- デジタルアッセイを行うためのシステムであって、
複数の多分散液滴を保持するように構成された容器であって、前記液滴の少なくともいくつかが、増幅されて増幅産物を産出することができる標的分子を含み、前記液滴の少なくともいくつかが、検出可能な薬剤及び前記増幅産物を含む、容器と、
前記容器中に保持された前記複数の多分散液滴の画像スタックを取得するように構成された撮像ソースと、
前記撮像ソースを操作するように構成されたコンピューティングデバイスであって、プロセッサ及び非一時的有形コンピュータ可読記憶媒体を含み、前記記憶媒体が、前記プロセッサによって実行されるときに、
(i)前記撮像ソースに、前記容器中に保持された前記複数の多分散液滴の前記画像スタックを取得させ、ここで、前記取得された画像スタックが、単一の液滴を通した別々の焦点深度から撮られた複数の画像を含み、
(ii)前記プロセッサに、前記複数の多分散液滴の体積を前記取得した画像スタックの画像に基づいて決定させ、
(iii)前記プロセッサに、前記複数の多分散液滴中の前記検出可能な薬剤の有無を決定させ、
(iv)前記プロセッサに、前記複数の液滴中の前記標的分子の濃度を、前記複数の多分散液滴中の前記検出可能な薬剤及び前記増幅産物の有無、及び前記複数の多分散液滴の体積に基づいて決定させる1組の命令を記憶する、コンピューティングデバイスと、を備える、システム。 - 前記撮像ソースが、共焦点顕微鏡法、ライン共焦点顕微鏡法、デコンボリューション顕微鏡法、スピニングディスク顕微鏡法、多光子顕微鏡法、平面照明顕微鏡法、ベッセルビーム顕微鏡法、微分干渉顕微鏡法、位相差顕微鏡法、落射蛍光顕微法、明視野撮像法、暗視野撮像法、斜照法、またはこれらの組み合わせのうちの1つ以上を行うように構成される光学撮像ソースを含む、請求項21に記載のシステム。
- 前記1組の命令が、前記プロセッサによって実行されるときに、前記プロセッサに、(i)前記画像スタックの少なくとも1つの個々の画像における少なくとも1つの画素セットを特定することと、(ii)前記少なくとも1つの画素セットを、少なくとも1つの液滴の少なくとも一部に対応するものとして特定することであって、少なくとも1つの液滴の前記少なくとも一部が、単一の液滴、複数の液滴の部分、1つの全液滴、複数の全液滴、またはこれらの組み合わせを含む、ことと、(iii)少なくとも1つの個々の液滴を、前記対応に基づいて特定することと、(iv)前記特定された少なくとも1つの個々の液滴の体積を、前記少なくとも1つの画素セットに基づいて決定することと、によって、前記複数の多分散液滴の体積を決定させる、請求項21〜22のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記光学撮像が補償光学によって行われる、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記光学撮像ソースが補償光学撮像ソースである、請求項14〜23のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記液滴が前記標的分子を含む場合にのみ液滴の体積を測定することを含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 液滴の体積を決定するための方法であって、
前記液滴の画像スタックを取得することであって、前記液滴を通した別々の焦点深度から撮られた複数の画像を取得することを含む、前記液滴の画像スタックを取得することと、
前記画像スタックの個々の画像における少なくとも1つの画素セットを特定することと、
前記少なくとも1つの画素セットを、少なくとも1つの液滴の少なくとも一部に対応するものとして特定することであって、前記少なくとも1つの液滴の前記少なくとも一部が、単一の液滴の部分、複数の液滴の部分、1つの全液滴、複数の全液滴、またはこれらの組み合わせを含む、ことと、
少なくとも1つの個々の液滴を、前記対応に基づいて、前記少なくとも1つの画素セットから特定することと、
前記特定された少なくとも1つの個々の液滴の体積を、前記少なくとも1つの画素セットに基づいて決定することと、を含む、前記方法。 - 前記特定された少なくとも1つの液滴の体積を決定することが、前記特定された少なくとも1つの液滴の直径を決定することを含み、前記特定された少なくとも1つの液滴の直径を決定することが、
(i)前記特定された少なくとも1つの液滴を前記画像スタックの複数の画像間で相関させ、前記複数の画像における前記特定された少なくとも1つの液滴の最大径を測定すること、
(ii)曲線を前記特定された少なくとも1つの液滴の境界に適合させ、前記特定された少なくとも1つの液滴の直径を、前記適合させた曲線に基づいて補間すること、
(iii)前記特定された少なくとも1つの液滴を前記画像スタックの複数の画像間で相関させ、各画像における前記特定された少なくとも1つの液滴の直径を決定し、前記特定された少なくとも1つの液滴の直径を、前記画像スタックの前記複数の画像におけるその直径から決定すること、または
(iv)前記特定された少なくとも1つの液滴を前記画像スタックの複数の画像間で相関させ、各画像における前記特定された少なくとも1つの液滴の直径を決定し、前記特定された少なくとも1つの液滴の直径を、前記画像スタックの前記複数の画像におけるその直径、及び前記複数の画像間の画像深度の差異から決定すること、のうちの少なくとも1つを含む、請求項27に記載の方法。 - 複数の液滴の体積を決定することを更に含む、請求項27〜28のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の液滴中の検出可能な薬剤の有無を決定することを更に含む、請求項29に記載の方法。
- 前記複数の液滴中の標的分子の濃度を、前記複数の液滴中の前記検出可能な薬剤の有無、及び前記決定された複数の液滴の体積に基づいて、決定することを更に含む、請求項30に記載の方法。
- 前記複数の液滴中の前記標的分子を増幅して増幅産物を産出することを更に含む、請求項31に記載の方法であって、増幅して前記増幅産物を産出することが、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、ローリングサークル増幅(RCA)、核酸配列ベース増幅(NASBA)、ループ媒介増幅(LAMP)、またはこれらの組み合わせを行うことを含む、方法。
- 増幅して前記増幅産物を産出することが、ヌクレオチドの等温増幅、またはヌクレオチドの可変温度増幅を含む、請求項32に記載の方法。
- 前記画像スタックを取得することが、共焦点顕微鏡法、ライン共焦点顕微鏡法、デコンボリューション顕微鏡法、スピニングディスク顕微鏡法、多光子顕微鏡法、平面照明顕微鏡法、ベッセルビーム顕微鏡法、微分干渉顕微鏡法、位相差顕微鏡法、落射蛍光顕微法、明視野撮像法、暗視野撮像法、斜照法、またはこれらの組み合わせによって行われる光学撮像を含む、請求項27〜33のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの液滴の前記画像スタックを取得することが、複数の多分散液滴に対する前記画像スタックを取得することを含む、請求項27〜34のいずれか一項に記載の方法。
- 第1の流体及び第2の流体を含む溶液を撹拌することによって多分散液滴のエマルションを形成することを更に含み、前記第1の流体が、前記第2の流体と非混和である、請求項35に記載の方法。
- 前記複数の多分散液滴が、界面活性剤、脂質、リン脂質、糖脂質、タンパク質、ペプチド、ナノ粒子、ポリマー、沈殿剤、微粒子、疎水性部分と親水性部分とを持つ分子、またはこれらの組み合わせのうちの少なくとも1つを含む流体界面修飾要素を更に含む、請求項35〜36のいずれか一項に記載の方法。
- 前記多分散液滴における体積が、2倍超で、10倍超で、または100倍超で変化する、請求項35〜37のいずれか一項に記載の方法。
- 前記多分散液滴が、100ナノリットル(nL)〜1フェムトリットル(fL)、10nL〜10fL、1nL〜100fL、100nL〜1pL、10nL〜10pL、1nL〜1pL、500pL〜50fL、または100pL〜100fLの体積分布を有する、請求項35〜38に記載の方法。
- 前記複数の多分散液滴において標的分子を増幅して増幅産物を産出することを更に含む、請求項35〜36に記載の方法。
- 前記画像スタックの前記個々の画像中の前記少なくとも1つの画素セットを特定することが、前記個々の画像内で複数のスキャンを取得することと、閾値レベルを設定することと、前記閾値レベル外の前記複数のスキャン中のエリアを前記画素セットとして特定することと、を含む、請求項27〜40のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの画素セットを、少なくとも1つの液滴の少なくとも一部に対応するものとして特定することが、前記少なくとも1つの画素セットのアスペクト比を決定することを含む、請求項27〜41のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの画素セットが、前記少なくとも1つの画素セットの前記アスペクト比が閾値以下であるときに、少なくとも1つの液滴の少なくとも一部に対応するものとして特定される、請求項42に記載の方法。
- 前記画素セットを少なくとも1つの液滴の少なくとも一部に対応するものとして特定することが、リバースウォーターシェッド法を行うこと、円検出法を行うこと、またはこれらの任意の組み合わせのうちの少なくとも1つを含み、
前記リバースウォーターシェッド法を行うことが、
前記画像スタックの前記個々の画像の画素強度に基づいて、マップを生成することと、
前記マップ中の1つ以上の画素セットを特定することと、
個々の画素セットを目的領域として特定することと、
前記目的領域の境界を少なくとも1つの最良適合の円と適合させることと、を含み;そして、
前記円検出法を行うことが、
閾値外の前記画像スタックの前記個々の画像の1つ以上のエリアを特定することと、
複数の円を前記特定された1つ以上のエリア上に重ね合わせることと、
前記重ね合わせた複数の円のうちの1つ以上の円を、前記1つ以上の円が少なくとも1つの所定の基準を満たさないときに拒否することと、
1つ以上の残りの円を、少なくとも1つの液滴の前記少なくとも一部に対応するものとして特定することと、を含む、請求項27〜43のいずれか一項に記載の方法。
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